NO326180B1

NO326180B1 - Medium for dyrking av dyreceller og fremgangsmate for fremstilling av protein ved anvendelse av de samme

Info

Publication number: NO326180B1
Application number: NO20006096A
Authority: NO
Inventors: Kazushi Shibuya; Masaru Atsumi; Shigeyuki Tsunakawa; Kaneo Nogaki
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2008-10-13
Also published as: NO20006096D0; IL139974A; KR100430447B1; DK1085083T3; US6537782B1; CN1309698A; DE69935978T2; NO2009012I1; CA2333966C; HK1037678A1; CN1187441C; ES2285840T3; EP1085083A4; WO1999063058A1; CA2333966A1; JP3510858B2; EP1085083B1; IL139974A0; NO20006096L; US6962812B2

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, og en fremgangsmåte for å fremstille et protein ved anvendelse av denne. Mere spesielt vedrører oppfinnelsen et dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, idet dyrkingsmediet inneholder en fiskekjøttekstrakt eller et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt, men inneholder ikke en pattedyr-avledet komponent slik som et protein eller dets nedbrytningsprodukt, og oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av et protein ved anvendelse av dyrkingsmediet.

Fra US-A 3 85662 er det kjent å anvende hydrolyserte fiske-proteiner i et medium for dyrking av bakterier.

Fra WO 95/23212 er det kjent å erstatte pattedyravledet serum med serum fra fisk i et medium for dyrking av pattedyrceller.

Ved dyrking av en dyrecelle for å oppnå et naturlig protein fremstilt ved hjelp av dyrecellen, eller ved dyrking av en dyrecelle som innlemmer et gen som koder for et ønsket protein for å fremstille ønskede proteiner osv., tilsettes essensielle næringsstoffer, som baser, sukkere, aminosyrer og vitaminer til et dyrkingsmedium. Videre blir en pattedyr-avledet ekstrakt, mere nøyaktig serum slik som føtalt bovint serum, vanligvis tilsatt i et område fra 5 til 20% for proliferasjon av dyrecellen. Et slikt pattedyr-avledet serum har imidlertid en rekke ulemper. Det står for 75 til 95% av omkostningene i forbindelse med dyrkingsmediet, og på grunn av at det eksisterer kvalitetsforskjeller mellom de forskjellige partier oppnås ikke stabil proliferasjon. Pattedyr-avledet serum kan dessuten ikke steriliseres i en autoklav eller lignende, og kan således være kontaminert med viruser eller mykoplasma. Skjønt de fleste av disse viruser eller mykoplasma er ikke-patogene, kan de bli til ytterligere ukjente faktorer med hensyn til stabil produksjon. Videre inneholder serumet mere enn 500 typer proteiner, noe som således kompliserer isolering og rensing av det ønskede protein, celleproduktet, fra dyrkingsmediet. For å løse slike problemer med stabil produksjon, utføres fremgangsmåter ved anvendelse av et serum-avledet renset protein som fetuin, insulin eller transferrin i stedet for serum. Metoder som anvender dyrkingsmediumkomponenter ekstrahert fra pattedyr er også blitt forsøkt sett på bakgrunn av produksjonskostnader.

I de senere år har man uttrykt bekymring for forbindelsen mellom pattedyr-avledede komponenter og kugalskap, bovin spongiform encefalopati(BSE), overførbar spongiform ence-falopati (TSE) og Creutzfeldt-Jakobs sykdom (CJD9). Utvik-lingen av et dyrkingsmedium for å dyrke en dyre celle, hvor dyrkingsmediet er fri for disse pattedyr-avledede komponenter har vært etterspurt ut fra et sikkerhetsmessig synspunkt.

Ved dyrking av en dyrecelle vil det å unnlate tilsetning av de ovenfor angitt pattedyr-avledede komponenter til dyrkingsmediet bevirke et markert fall i cellenes overlevelsesrate, og et fall i levedyktig antall celler i dyrkingsmediet, på et tidlig stadium av dyrkingen. Disse hendelser gjør langtids-dyrking eller dyrking i stor målestokk umulig. Den foreliggende oppfinnelse har til formål å tilveiebringe et dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, hvor dyrkingsmediet ikke inneholder pattedyr-avledede komponenter og det er således uten de ovennevnte problemer, samt en fremgangsmåte for fremstilling av et protein ved anvendelse av dyrkingsmediet.

For å oppnå det ovennevnte formål har man i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse fjernet de pattedyr-avledede komponenter fra konvensjonelle dyrkingsmedier for dyrking av dyreceller. Man har tilsatt forskjellige substanser til de resulterende dyrkingsmedier og gjennomført et omfattende studium ved anvendelse av en CHO celle transformert med et gen som koder for et antistoffprotein. Formålet med studiet var å oppnå en substans som ville stimulere proliferasjonen av CHO cellen for derved å danne en høy konsentrasjon av antistoffproteinet. Studiet førte til det funn at formålet kunne oppnås ved å tilsette en fiskekjøttekstrakt eller et enzymatisk nedbrytningsprodukt av fiskekjøtt, og på grunnlag av dette funn har man fullført den foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen vedrører således et dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, idet dyrkingsmediet inneholder en fiske-kjøttekstrakt eller et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å fremstille et ønsket protein ved dyrking av en dyrecelle, hvor dyrkingen gjennomføres ved anvendelse av et dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, hvor dyrkingsmediet er kjennetegnet ved at det inneholder et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiske-kjøtt eller en fiskekjøttekstrakt.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 er et diagram som viser levende-celle densitet for CHO celler dyrket i dyrkingsmedier som henholdsvis inneholder Brix 1% og Brix 2% av et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt, og 10 g/l av et storfekjøtthydrolysat. Fig. 2 er et diagram som viser overlevelsesgrader (%) for CHO celler dyrket i dyrkingsmedier som inneholder henholdsvis Brix 1% og Brix 2% av et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt, og 10 g/l av et storfekjøtthydrolysat. Fig. 3 er et diagram som viser konsentrasjonene (mg/l) av et antistoffprotein dannet i dyrkingsmedier ved hjelp av CHO celler som ble dyrket i dyrkingsmediene inneholdende henholdsvis Brix 1% og Brix 2% av et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt, og 10 g/l av et storfekjøtthydro-lysat . Fig. 4 viser resultatene fra celledyrking ved anvendelse av

en celledyrkingsanordning av typen rystekolbe ifølge eksempel 5. De vertikale akser i feltene i fig. 4 representerer henholdsvis densiteten av levedyktige celler, celleoverlevelsesgraden og mengden av et dannet antistoffprotein. De horison-tale akser representerer hver antall døgn med dyrking etter dyrkingsstart ved anvendelse av dyrkingsmedium B.

Den foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives mere detaljert i det etterfølgende.

Dyrkingsmediet ifølge oppfinnelsen er et dyrkingsmedium for å dyrke en dyrecelle, idet dyrkingsmediet inneholder en fiske-kjøttekstrakt eller et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt. I overensstemmelse med oppfinnelsen kan en dyrecelle dyrkes tilfredsstillende uten tilsetning av pattedyr-avledede komponenter i et dyrkingsmedium som generelt er blitt anvendt som et dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle .

Eksempler på fiskekjøttet som anvendes ved den foreliggende oppfinnelse er fiskekjøtt fra fisk med rødt kjøtt, slik som pelamider, auxan, tunfisk, makrell, makrellgjedde fra Stillehavet, sardin, taggmakrell og laks, og fiskekjøtt fra fisk med hvitt kjøtt som torsk, japansk havabbor, "right-eyed" flyndre, "left-eyed" flyndre og pagell. Foretrukne eksempler er pelamider, auxan, torsk, makrell, laks og sardin.

Fiskekjøttekstrakten som anvendes ved den foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved å skjære fiskekjøttet i passende

stykker eller ved å male fiskekjøttet til en pastaaktig form og ekstrahere de oppløselige komponentene fra stykkene eller pastaen med varmt vann, for eksempel varmt vann med en temperatur fra 90 til 95°C, i flere titalls minutter til flere titalls timer. Konkrete eksempler er kraft fremstilt fra kokt pelamider for fremstillingen av tørkede pelamider, og kokevann fra fremstillingen av hermetikk.

Enzymnedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt kan for eksempel oppnås ved å tilsette en passende mengde vann til kokt fiske-kjøtt som sådan, eller til fiskekjøtt som er finhakket til en pasta, eller til den ovennevnte fiskekjøttekstrakt etterfulgt, om nødvendig, av oppvarming for proteindenaturering, hvorpå materialet behandles med en protease og med sentrifugering eller filtrering av det behandlede materialet som ønsket for å fjerne olje og uoppløselige substanser. Den oppnådde fiskekjøttekstrakt eller det enzymatiske nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt innstilles ønskelig til pH 7 til 7,4 for bruk.

Proteasen som anvendes i forbindelse med oppfinnelsen er for eksempel en proteinase og/eller en peptidase. For oppfinnelsen refererer betegnelsen proteinase til et enzym som hydro-lyserer et protein som et substrat, mens betegnelsen peptidase refererer til en peptidbindingshydrolase for et peptid som et substrat. Det vil si at aktiviteten av proteasen overfor proteinsubstratet kan skjelnes som proteinaseakti-vitet, mens aktiviteten av proteasen overfor peptidsubstratet kan skjelnes som peptidaseaktivitet. Ved katalysering av spaltingen av en peptidbindingskjede, i intermediær-setet derav, ved hjelp av aktiviteten til protease overfor proteinsubstratet, anvendes betegnelse proteinase. Følgelig anvendes endopeptidase heri som en av proteinasene.

Eksempler på enzymer for anvendelse er enzymer av planteopp-rinnelse, som papain, kymopapain, bromelain og ficin, og enzymer fra mikroorganismer som mugg, bakterier og gjær. De inkluderer endopeptidase, eksopeptidase, aminopeptidase, kar-boksypeptidase og dipeptidase. Disse enzymer kan anvendes alene eller i kombinasjon. Når de kombineres kan de tilsettes samtidig eller påfølgende.

Det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt er foretrukket et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt oppnådd ved behandling med proteinasen etterfulgt av behandling med peptidasen.

Betingelsene for behandling med enzymet varierer i henhold til den anvendte type enzym. Vanligvis utføres enzymbehand-lingen i 30 minutter til 72 timer, foretrukket fra 3 til 24 timer ved pH 2 til 12, foretrukket pH 4 til 8, ved 3 0 til 90°C, foretrukket 40 til 65°C. Enzymet anvendes i en mengde-andel på omtrent 0,01 til 10%, foretrukket 0,5 til 5%, mere foretrukket 1 til 3%, basert på proteinet som substratet. Enzymet i det oppnådde enzymatiske nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt inaktiveres ved oppvarming eller lignende, og med gjennomføring av sentrifugering eller filtrering om ønsket for å fjerne olje og uoppløselige substanser, hvorved den enzymatiske nedbrytningsprodukt kan fremstilles.

Som andre komponenter i dyrkingsmediet ifølge oppfinnelsen kan forskjellige komponenter som vanligvis anvendes i dyrecelle-dyrkingsmedier om ønsket anvendes. Disse inkluderer aminosyrer, vitaminer, lipidfaktorer, energikilder, osmotiske regulatorer, jernkilder og pH regulerende midler. I tillegg til disse komponenter kan spormetallelementer, surfaktanter, vekst-kofaktorer og nukleosider tilsettes.

Eksempler er aminosyrer slik som L-alanin, L-arginin, L-asparagin, L-asparaginsyre, L-cystein, L-cystin, L-glutamin, L-glutaminsyrer, glycin, L-histidin, L-isoleucin, L-leucin, L-lysin, L-metionin, L-ornitin, L-fenylalanin, L-prolin, L-serin, L-treonin, L-tryptofan, L-tyrosin og L-valin, foretrukket L-alanin, L-arginin, L-asparagin, L-asparaginsyre, L-cystin, L-glutamin, L-glutaminsyre, glycin, L-histidin, L-isoleucin, L-leucin, L-lysin, L-metionin, L-fenylalanin, L-prolin, L-serin, L-treonin, L-tryptofan, L-tyrosin og L-valin; vitaminer slik som i-inositol, biotin, folinsyre, liponsyre, nikotinamid, nikotinsyre, p-aminobenzosyre, kalsiumpantotenat, pyridoksalhydroklid, pyridoksinhydro-klorid, riboflavin, tiaminhydroklorid, vitamin B12°9 askorbinsyre, foretrukket biotin, folinsyre, liponsyre, nikotinamid, kalsiumpantotenat, pyridoksalhydroklorid, riboflavin, tiaminhydroklorid, vitamin B12 og askorbinsyre; lipidfaktorer slik som kolinklorid, kolintartrat, linolsyre, oleinsyre og kolesterol, foretrukket kolinklorid; energikilder slik som glukose, galaktose, mannose og fruktose, foretrukket glukose; osmotiske regulatorer slik som natriumklorid, kaliumklorid og kaliumnitrat, foretrukket natriumklorid; jernkilder slik som jern EDTA, ferricitrat, ferroklorid, ferriklorid, ferro-sulfat, ferrisulfat og ferrinitrat, foretrukket ferriklorid, jern EDTA og ferricitrat; og pH regulerende midler slik som natriumbikarbonat, kalsiumklorid, natriumfosfat-monobasisk, HEPES og MOPS, foretrukket natriumbikarbonat. Dyrkingsmedier som inneholder hvilken som helst av disse komponenter kan angis som eksempler.

Foruten de ovennevnte komponenter kan man tilsette spormetallelementer slik som koppersulfat, mangansulfat, zink-sulfat, magnesiumsulfat, nikkelklorid, tinnklorid, magnesium-klorid og natriumsubsilikat, foretrukket koppersulfat, zink-sulfat og magnesiumsulfat; surfaktanter slik som Tween 80 og Pluronic F68; vekst-kofaktorer slik som rekombinant insulin, rekombinant IGF, rekombinant EGF, rekombinant FGF, rekombinant PDGF, rekombinant TFG-a, etanolaminhydroklorid, natriumselenitt, retinolsyre og putrescindihydroklorid, foretrukket natriumselenitt, etanolaminhydroklorid, rekombinant IGF og putrescindihydroklorid; og nukleosider slik som deoksyadenosin, deoksycytidin, deoksyguanosin, adenosin, cytidin, guanosin og uridin. I foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse kan antibiotika som streptomycin, penicillin-G-kalium, og gentamicin og pH-indikatorer som fenolrødt være inneholdt deri.

For å fremstille dyrkingsmediet ifølge oppfinnelsen kan fiskekjøttekstrakten eller det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt tilsettes, i stedet for de pattedyr-avledede komponenter, til et kommersielt tilgjengelig dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, for eksempel BME medium, MEM medium, DMEM medium, F10 medium eller F12 medium.

I forbindelse med oppfinnelsen tilsettes fiskekjøttekstrakten eller det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt til dyrkingsmediet til en konsentrasjon som er omtrent Brix 5% eller lavere, foretrukket Brix 0,5 til 3%, særlig foretrukket Brix 1 til 2%, i dyrkingsmediet. Denne konsentra-sjonen er en konsentrasjon bestemt ved de oppløselige fast-stoffer, som en indeks, målt med et refraktometer for sukker-innhold.

Mengden av de andre komponenter i dyrkingsmediet er 0,05 til 1500 mg/l aminosyrer, 0,001 til 10 mg/l vitaminer, 0 til 200 mg/l lipidfaktorer, 1 til 20 g/l energikilder, 0,1 til 10000 mg/l osmotiske regulatorer, 0,1 til 500 mg/l jernkilder, 1 til 10000 mg/l pH buffere, 0,00001 til 200 mg/l spormetallelementer, 0 til 5000 mg/l surfaktanter, 0,05 til 10000 /xg/1 vekst-kofaktorer og 0,001 til 50 mg/l nukleosider. Deres mengder kan bestemmes, som påkrevd, i henhold til den typen av dyreceller som skal dyrkes, og typen av det ønskede produkt.

pH i dyrkingsmediet varierer i henhold til den cellen som skal dyrkes, men er generelt pH 6,8 til 7,6 eller pH 7,2 til 7,4 i en rekke tilfeller.

Dyrkingsmediet ifølge oppfinnelsen kan anvendes, uten noen begrensninger, for dyrking av forskjellige dyreceller. Man kan for eksempel dyrke en COS celle eller CHO celle som har et gen for det ønskede antistoff eller fysiologisk aktiv substans innlemmet ved hjelp av en genetisk manipulerings-prosedyre, eller en antistoffproduserende fusjonert celle som eksemplifisert ved hjelp av et hybridom, som mus-human, mus-mus eller mus-rotte. Dyrkingsmediet er særlig foretrukket for dyrking av en CHO celle. Det skulle være unødvendig å si at dyrkingsmediet for dyrking av en dyrecelle i henhold til oppfinnelsen kan anvendes ved dyrking av en dyrecelle for å oppnå et naturlig protein dannet ved hjelp av dyrecellen. Dyrkingsmediet kan anvendes for å dyrke en BHK celle og en HeLa celle så vel som de ovenfor angitte celler.

Dyrkingsbetingelsene varierer i henhold til den anvendte celletype og foretrukne betingelser kan bestemmes som ønsket. CHO cellen dyrkes for eksempel vanligvis i fra 1 til 14 dager i en atmosfære med en C02 konsentrasjon i en gassfase fra 0 til 40%, foretrukket fra 2 til 10%, ved 30 til 39°C, foretrukket omtrent 37°C.

Dyrking kan gjennomføres ved anvendelse av forskjellige dyrk-ingsanordninger for dyrking av dyreceller, for eksempel en dyrkingsanordning av typen fermentortank, en dyrkingsanordning av trykkluft-type, en dyrkingsanordning av dyrkings-kolbe-type, en dyrkingsanordning av typen roterende kolbe, en dyrkingsanordning av mikrobærer-typen, en dyrkingsanordning med fluidisert sjikt, en dyrkingsanordning av hulfiber-type, en dyrkingsanordning av rulleflaske-type og en dyrkingsanordning av typen pakket sj ikt.

Ved å utføre dyrking i dyrkingsmediet for dyrking av en dyrecelle i overensstemmelse med oppfinnelsen, kan et protein dannet ved hjelp av dyrecellen oppnås i dyrkingsmediet. For å danne proteinet fra dyrecellen, kan kun dyrking være til-strekkelig, eller det kan være nødvendig med en spesialpro-sedyre. Prosedyren, betingelsene osv. kan, som påkrevd, bestemmes i overensstemmelse med dyrecellen som skal dyrkes. I tilfellet av en CHO celle transformert med en vektor inneholdende et gen som koder for et mus-humant kimært antistoff ved hjelp av en genetisk manipuleringsoperasjon, utføres for eksempel dyrking under de ovennevnte betingelser, hvorved det ønskede protein kan oppnås i dyrkingsmediet i løpet av omtrent 1 til 14 dager, foretrukket i løpet av omtrent 7 til 10 dager. Dyrkingsmediet underkastes deretter isolasjon og rensing ved hjelp av vanlig anvendte metoder (se for eksempel Introduction to Antibody Engineering, Chijin Sho Kan publishing company, side 102-104; Affinity Chromatography Principles & Methods, Amersham Pharmacia Bitech, side 56-60), hvorved det ønskede protein kan oppnås.

De ovennevnte fremstillingsmetoder kan gi gen-rekombinante proteiner, slik som rekombinante antistoffer som anti-humant IL-6 reseptor antistoff (inkluderende kimære antistoffer, humaniserte antistoffer, humane antistoffer), granulocytt-koloni-stimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-makrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), erytropoietin, inter-feron, interleukiner (for eksempel IL-1 og IL-6), t-PA, urokinase, serumalbumin og blodkoagulasjonsfaktor VIII.

Dyrkingsmediet for dyrking av en dyrecelle i overensstemmelse med oppfinnelsen inneholder en fiskekjøttekstrakt eller et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt, noe som gjør det mulig å dyrke en dyrecelle på stabil måte, uten anven-deise av et kostbart protein som varierer i stor grad med hensyn til kvalitet, slik som føtalt bovint serum. Videre, ved dyrking av en dyrecelle i dyrkingsmediet i overensstemmelse med oppfinnelsen, det vil si dyrkingsmediet som inneholder en fiskekjøttekstrakt eller et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt, kan risikoen for kontami-nering med unormale prioner eller viruser, det vil si det problem som har oppstått i de senere år, elimineres, og sikre bioteknologiske produkter kan produseres og tilveiebringes.

EKSEMPLER

Eksempler for å beskrive den foreliggende oppfinnelse mere detaljert er angitt i det etterfølgende.

Eksempel 1: Fremstilling av fiskekjøtt(sardin)ekstrakt

En kommersielt tilgjengelig sardin ble anvendt som fiske-kjøtt. Til 500 g finhakket fiskekjøtt ble det tilsatt 2500 g vann og fiskekjøttet ble ekstrahert i 90 minutter ved en temperatur på 95°C.

Deretter ble ekstrakten sentrifugert og filtrert for å fjerne uoppløselige substanser og oljer. Resten ble konsentrert for å oppnå 64 g av en fiskekjøtt(sardin)ekstrakt.

Eksempel 2: Fremstilling av et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt (pelamider)

En kommersielt tilgjengelig pelamid ble anvendt som fiske-kjøtt. Til 1000 g av en finhakket pelamid ble det tilsatt 1500 g vann. Blandingen ble inkubert i 1 time sammen med 4 g plante-avledet papain ved pH 6,0 og 50°C for enzymatisk ned-brytning. Deretter ble den enzymatiske nedbrytningen gjen-nomført videre med 4 g mugg-avledet eksopeptidase i 20 timer under de ovennevnte betingelser hvoretter systemet ble oppvarmet til 95°C for å inaktivere enzymene. Deretter ble systemet sentrifugert og filtrert for å fjerne de uoppløse-lige substanser og oljer. Resten ble konsentrert til å gi 500 g av et enzymatisk nedbrytningsprodukt av fiskekjøtt (pelamid).

Eksempel 3: Fremstilling av dyrkingsmedium

Tymidin og hypoksantin ble fjernet fra et kommersielt tilgjengelig DMEM/F12 medium (GIBCO BRL Products and Reference Guide, side 357-358). Til det oppnådde medium ble de etter-følgende komponenter tilsatt (blandingen vil heretter beskrives som dyrkingsmedium A), og blandingen ble anvendt som et basalmedium for dyrking av en dyrecelle.

Tymidin og hypoksantin ble fjernet fra et kommersielt tilgjengelig DMEM/F12 medium og de etterfølgende komponenter ble tilsatt:

3 0 mg/l askorbinsyre

10 mg/l deoksyadenosin (1H20)

10 mg/l deoksycytidin

10 mg/l deoksyguanosin

5 mg/l adenosin

5 mg/l cytidin

5 mg/l guanosin

5 mg/l uridin

4 mg/l etanolamin (HC1)

1000 mg/l Pluronic F-68

18,9 mg/l ferriklorid (6H20)

Til ovennevnte dyrkingsmedium A ble det enzymatiske nedbrytningsproduktet fremstilt i eksempel 2 tilsatt til en sluttkonsentrasjon på Brix 1% eller Brix 2%, og blandingen ble sterilisert ved filtrering.

Eksempel 4: Effekt på mengden av dannet antistoff

En test ble utført ved anvendelse av en CHO cellestamme som produsert humanisert PM-1 antistoff (anti-human IL-6 reseptor antistoff) som var fremstilt i overensstemmelse med metoden beskrevet i referanseeksempel 2 i Japansk Patentpublikasjon nr. 99 902/1996 ved anvendelse av human elongeringsfaktor Ia promoter beskrevet i eksempel 10 i Internasjonal Patentsøknad med publikasjonsnummer WO 92/19 759.

De ovennevnte CHO celler (1,5 x IO<5> celler/ml) ble tilsatt til dyrkingsmedium A inneholdende det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt, som var blitt fremstilt i eksempel 2 heri, i en sluttkonsentrasjon på Brix 1% til Brix 2%. Systemet ble dyrket i 10 dager under inkubatorbetingelser på 37°C, 5% C02, ved hjelp av en celledyrkingsanordning av typen rystekolbe.

Deretter ble densitet av levedyktige celler, celleoverlevelsesgraden og produksjonsmengden av et antistoffprotein oppnådd fra dyrkingsmediet målt. Produksjonsmengden ble målt ved anvendelse av revers-fase høytrykksvæskekromatografi.

Som kontroll ble et dyrkingsmedium inneholdende 10 g/l av et storfekjøtthydrolysat (Primatone: Quest, United States) i stedet for enzymnedbrytningsproduktet fra eksempel 2 fremstilt og CHO celler ble dyrket på den samme måte.

De oppnådde resultater er vist i fig. 1. Sammenlignet med kontrollen viste CHO celler dyrket i dyrkingsmediet inneholdende Brix 1% av det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra pelamid en cellevekst som var sammenlignbar med celleveksten til kontrollen. CHO celler dyrket i dyrkingsmediet inneholdende Brix 2% av det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra pelamid ga en større mengde dannet antistoffprotein enn kontrollen.

Eksempel 5: Virkning av dyrkingsmedier ved anvendelse av enzymatiske nedbrytningsprodukter fra forskjellige fiskekjøtt på mengden av antistoffproduksjon

Enzymatiske nedbrytningsprodukter fra fiskekjøtt fra pelamid, sardin, laks, auxan, torsk og makrell ble tilsatt til et dyrkingsmedium av ikke-pattedyropprinnelse, og mengden produsert antistoffprotein ble undersøkt.

Fremstilling av enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt Et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra det ovennevnte fiske-kjøtt ble fremstilt ved hjelp av metoden beskrevet i eksempel 2. Det vil si at fiskekjøtt ble finhakket og nedbrutt enzymatisk med papain, en plante-avledet endopeptidase. Deretter ble materialet videre nedbrutt enzymatisk med mugg-avledet eksopeptidase hvoretter systemet ble oppvarmet for å inaktivere enzymene. Deretter ble systemet sentrifugert og filtrert for å fjerne uoppløselige substanser og oljer. Resten ble konsentrert for å fremstille et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøttet.

Fremstilling av dyrkingsmedium og testmetode

dhfr (-) CHO celler transformert med et gen som koder for det humaniserte PM-1 antistoffet (anti-human IL-6 reseptor antistoff) beskrevet i eksempel 4 og et dhfr selektivt markørgen ble tilsatt til dyrkingsmedium B inneholdende det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra pelamid, sardin, laks, auxan, torsk eller makrell i en sluttkonsentrasjon på 10 g/l (BRIX 1%) eller 15 g/l (Brix 1,5%). Systemet ble dyrket i 10 dager under inkubatorbetingelser på 37°C, 5% C02, ved hjelp av en celledyrkingsanordning av typen rystekolbe. Deretter ble densiteten av levedyktige celler, celleoverlevelsesgraden og produksjonsmengden av et antistoffprotein målt. Komponentene i dyrkingsmedium B er vist i det etterfølgende.

12,5 mg/l askorbinsyre

2,5 mg/l deoksyadenosin (1H20)

2,5 mg/l deoksycytidin

2,5 mg/l deoksyguanosin

2,5 mg/l adenosin

2,5 mg/l cytidin

2,5 mg/l guanosin

5,0 mg/l uridin

0,2 mg/l putrescin (2HC1)

0,975 mg/l etanolamin (HC1)

500 mg/l Pluronic F-68

10 mg/l ferricitrat

Resultater

De oppnådde resultater er vist i fig. 4. Der var forskjeller i mengden av et antistoffprotein dannet ved hjelp av fiske-kjøtthydrolysatet. Det vil si at når enzymnedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt ble tilsatt i en sluttkonsentrasjon på Brix 1% (10 g/l), var de dannede mengder, i avtagende rekkefølge, som følger: pelamid > auxan > torsk > laks > makrell > sardin. Når enzymnedbrytningsproduktet fra fiske-kjøtt ble tilsatt i en sluttkonsentrasjon på Brix 1,5% (15 g/l), var de dannede mengder, i avtagende rekkefølge, som følger: pelamid > auxan > torsk > makrell > laks > sardin.

De ovennevnte forsøk viser at det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt viser forskjellige effekter på mengden av antistoffproteinproduksjon i forhold til den typen fiskekjøtt som anvendes, men er effektiv for vekst av dhfr(-) CHO celler transformert med et gen som koder for antistoffprotein og et dhfr selektivt markørgen, og er også effektivt for produksjon av antistoffproteinet.

Claims

1. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, karakterisert ved at det inneholder et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt eller en fiske-kjøttekstrakt .

2. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i krav 1, som er et dyrkingsmedium for fremstilling av et ønsket protein ved dyrking av dyrecellen, idet dyrkingsmediet inneholder fiskekjøttekstrakten.

3 . Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i krav 1, som er et dyrkingsmedium for fremstilling av et ønsket protein ved dyrking av dyrecellen, idet dyrkingsmediet inneholder det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt.

4. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i krav 3, hvori det enzymatiske nedbrytningsproduktet av fiskekjøtt er blitt oppnådd ved å behandle fiskekjøttet eller fiskekjøttekstrakten med en protease.

5. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i krav 4, hvori proteasen er en proteinase og/eller en peptidase.

6. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i krav 4, hvori det enzymatiske nedbrytningsproduktet fra fiskekjøtt er blitt oppnådd ved å behandle fiskekjøttet eller fiskekjøttekstrakten med en proteinase og deretter med en peptidase.

7. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 6, som er et medium uten komponenter avledet fra et pattedyr.

8. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 7, som inneholder aminosyrer, vitaminer, lipidfaktorer, energikilder, osmoseregu-lerende midler, jernkilder og pH regulerende midler.

9. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i ett eller flere av karvene 1 til 8, hvori dyrecellen er en dyrecelle inn i hvilken et gen som koder for et ønsket protein er blitt transdusert.

10. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i krav 9, hvori det ønskede protein er et antistoff eller en fysiologisk aktiv substans.

11. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 10, hvori dyrecellen er en CHO celle.

12. Dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 11, hvori fiskekjøttet er avledet fra ett eller flere av medlemmene valgt fra gruppen som omfatter pelamider, auxan, torsk, makrell, laks og sardin.

13. Fremgangsmåte for å fremstille et ønsket protein ved dyrking av en dyrecelle, hvor dyrkingen gjennomføres ved anvendelse av et dyrkingsmedium for dyrking av en dyrecelle, hvor dyrkingsmediet er kjennetegnet ved at det inneholder et enzymatisk nedbrytningsprodukt fra fiskekjøtt eller en fiske-kjøttekstrakt .