JPH01148181A

JPH01148181A - グルタチオンの菌体内蓄積法

Info

Publication number: JPH01148181A
Application number: JP62307415A
Authority: JP
Inventors: Keiichiro Watanabe; 恵市郎渡辺; Noriaki Kato; 典昭加藤; Norie Yoshida; 吉田　典江
Original assignee: JGC Corp
Current assignee: JGC Corp
Priority date: 1987-12-07
Filing date: 1987-12-07
Publication date: 1989-06-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】イ０発明の目的の生体内の生理に関与するグルタチオンはアルコール性脂
肪肝の解毒、健康増進剤（妊婦、乳幼児への経口投与）
等に使用されている。

本発明はこのグルタチオンを効率よく菌体内に蓄積させ
る方法に関するものである。

え１立且遣グルタチオンはグルタミン酸、システィン、グリシンよ
り構成されるトリペプチドであり、その製造法には、［
株］微生物を増殖して微生物の菌体内に蓄積させる培養
法、■酵素反応により製造する酵素法、■化学合成によ
る方法がある０本発明は■の培養法に属する。

■特開昭４８−９２５７９号には、酵母を糖質含有培地
で培養するに際して、培地中に、グリシン、Ｌ−グルタ
ミン酸、ＤＬ−メチオニン、Ｌ−システィンのうちの１
種以上のアミノ酸を添加して培養することによりＬ−グ
ルタチオン高含有酵母を製造する方法が開示されている
。これらのアミノ酸の培地への添加濃度は各々Ｏ，ｊ〜
１．０％とし、アミノ酸の培地への添加時期については
培養開始時でもよく、また対数増殖期ならば途中添加で
もよいとしている。実施例では培養開始時または増殖期
の添加により大きな違いはなく、また両時期に添加した
例はない、１記アミノ酸を添加した場合、無添加の場合
に比ベグルタチオン量は１．１〜５倍となっている。

■特公昭５３−１４６３１号には、酵母な好気培養する
に際し、培養基にＮ−アセチルシスティン、グルコース
システィンのうちの１種以上のシスティン誘導体を添加
するグルタチオン高含有酵母の製造法が開示されている
。システィン誘導体の添加濃度は０．１〜３．５％で、
システィン誘導体、の添加時期は培養初期が望ましいと
されており、システィン誘導体の添加によりグルタチオ
ン量は無添加の場合に比べ１．２〜２倍となっている。

これらはいずれも特定のアミノ酸又はアミノ酸誘導体を
比較的高濃度で用いるものである。

培養培地の窒素源として、あるいは生育促進物質として
、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカーなどの有機窒素源が用いられているが、これを培
養開始時だけでなく、さらに対数増殖相後期〜安定相前
期に添加することにより菌体内蓄積グルタチオン量が大
幅に増加することは知られていない。

が　　　　しよ　　と　　　　。

本発明は比較的安価に入手できる複合アミノ酸物質を使
用して微生物培養法でグルタチオンを高濃度で菌体内に
蓄積させ、効率よく製造する方法を提供することを目的
とする。

口０発明の構成ｐ　　　占　　　　　　　　　　か　　の本発明のグル
タチオンの菌体内蓄積法は、グルタチオン生産性酵母を
培養するに際し、複合アミノ酸物質を培養開始時期に培
地に添加し、さらに対数増殖相後期から安定相前期の間
で添加することを特徴とする。

使用する酵母としては、グルタチオンを生産するいずれ
の酵母も用いることができ１例えばチゾサッカロミセス
（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サツカ
ロミコシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｓｉｓ）、ハン
セヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サツカロマイセス（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トＪレロプシス（Ｔｏｒ
ｕｌｏｐｓｉｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロ
ドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）などの属に属する
菌、或は俗にビール酵母、パン酵母、清酒酵母と称され
ているもの等が挙げられるが、特にサツカロマイセス・
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）が好適である。

培養培地の炭素源としては糖類（単Ｗ類、二糖類、澱粉
、ＩＩｓ蜜等）や有ａｌｊｌ（乳酸、醋酸等）が用いら
れ、窒素源としては無機窒素源（硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム等）が用いられ。

さらに無機塩としてはリン酸塩、硫酸塩、マグネシウム
塩、カリウム塩等が用いられる。

また必要により、有機栄養源などを添加する。

本発明においては、これらの成分からなる培地に複合ア
ミノ酸物質を培養開始時に添加すると共に、対数増殖相
後期から安定相前期の間で添加する。

本発明で使用する複合アミノ酸物質とは、ポリペプトン
、肉エキス、酵母エキス、魚肉エキス、コーンステイー
プリカー、ホエー、大豆粉等の如く種々のアミノ酸をそ
れぞれ少量ず、つ含むものであり、この複合アミノ酸物
質を培地に対して５％以下の濃度で用いる。

培養条件は、使用する菌体により異なるが、通常の培養
条件でよく、例えば培養温度２０〜３５℃、ｐＨ３〜８
で振盪１通気攪拌などの手段により好気的培養を行う、
培養時間は２〜３日が好適である。

培養法により菌体内へ蓄積されたグルタチオンは、常法
、例えば遠心分離した菌体より熱水や過塩素酸などで抽
出処理することにより得られる。

１　′よ　　　　１市販パン酵母よりスラント培養したサツカロマイセス・
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）を白金耳で第１表に示す組成の前培養培地
に植菌し、培養温度３０℃、培養時間約２０時間で振盪
培養した。

第１表における酵母エキスおよびポリペプトンの組成を
第２表に示す。

ついで前培養液を１０％（Ｖ／Ｖ）の植菌量で第１表に
示す組成の本培養培地に植菌し、培養温度３０℃、培養
時間約４８時間で振盪培養することで菌体内にグルタチ
オンを蓄積させた。

他の培養条件は、振盪は５００ｍｊＬ坂ロフラスコを用
い、振盪数は約１２０往復／分とし、ＰＨは特に制御し
なかった。

第１表第２表培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を回収し、菌体
内に蓄積されたグルタチオンを過塩素酸抽出し、高速液
体クロマトグラフィ−にて分離定量した。

抽出されたグルタチオンは、「農芸化学実験歯（増補）
」第２巻（昭和５２年５月６日；産業図書■発行）のヨ
ード法に従い同定した。また市販グルタチオン（酸化型
および還元型）を標準試料として、高速液体クロマトグ
ラフィー（カラム：Ｂｉｏｐｈａｓｅ−ＯＤＳＩＩ　）
で分離した後、電気化学検出器（旧ｏａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ　Ｓｙｓ＋ｔｅ＋＋ｖ　Ｉｎｃ）て定量した。

以上の方法で、栄養源の添加時期を培養初期のみとした
場合（比較例１）、および添加時期を培養初期および培
養２４時間目（安定相前期）とした場合（実施例１）の
結果を第３表に示す。

なお培養２４時間目（安定相前期）に新たに添加される
栄養源は、培地に対して第１表に示す濃度になるように
した。

実施例１の場合は比較例１の３倍のグルタチオンが蓄積
された。

第３表市販パン酵母よりスラント培養したサツカロマイセス争
セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｇｉａｅ）を第１表に示した組成の前培養培地に植
菌し、培養温度３０℃、培養時間約２０時間で振盪培養
した。

次いで、この前培養液を約８％（ｖ　／　ｖ　）の植菌
量で第４表に示す組成の本培養培地に植菌し、。

培養温度３０℃で、培地に対して第１表に示す濃度とな
るように栄養源を培養開始後的１２時開目（対数増殖相
後期から遷移相）に添加し、培養時間約２４時間でジャ
ー培養することにより菌体内にグルタチオンを蓄積させ
た。

第　　４　　表その他の培養条件は、機械的攪拌数的３００〜５００ｒ
ｐｍ、空気通気量１ｖｖｍとしたｅＰＨは特に制御しな
かった。

培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を回収し、菌体
内に蓄積されたグルタチオンを過塩素酸抽出し、高速液
体クロマトグラフィーにて分離定量した。結果を第５表
に示す。

支ム皇Ｊ本培養開始後、約１２時間口および２４時間目（安定相
前期）に培地に対して第１表に示す濃度となるように栄
養源を添加し、培養時間を約４８時間とした以外は実施
例２と同様にして前培養および本培養を行った。結果を
第５表に示す。

止Ｊ口１１前培養液を第４表に示す本培養培地に約ｌθ％（Ｖ／Ｖ
）の植菌量でで植菌し、栄養源の添加を培養初期のみと
した以外は実施例３と同様にして前培養および本培養を
行った。その結果を第５表に示す。

第５表＊培養２４時間後のもの、それ以外は４８時間培養後の
もの。

３およ　４アミノ酸源として、複合アミノ酸物質を用いずに、Ｌ−
グルタミン酸ナトリウム、ＤＬ−メチオニンおよびグリ
シンを各０．１２５％の濃度て用いた試験を行りた。

サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＦＯ−００２１）を第
６表に示した組成の前培養培地に植菌し、培養温度３０
℃、培養時間約２０時間で振盪培養した。

第　　６　　表次に前培養液を約３％（ｖ　／　ｖ　）の植菌量で第７
表に示す組成の本培養培地に植菌し、培養温度３０℃１
機械的攪拌数３００へ３５Ｏｒｐｍ、空気通気量１ｖｖ
ｍ、培養時間５０時間のジャー培養で菌体内にグルタチ
オンを蓄積させた。なお。

ＰＨは初期培地で７．０とした。

栄養源を培養開始時のみに添加した場合（比較例３）と
、培養開始時、培養開始後約１２時間口（対数増殖相談
期）および３３時間開目安定相）に添加した場合（比較
例４）の結果を第９表に示す。

なお添加栄養源組成は第８表のとおりである。

第　　７　　表第　　８　　表第９表グルタチオン蓄積量は培養開始時のみに添加し　・た場
合も培養開始時十対数増殖相後期および安定相に添加し
た場合も同程度であった。

ハ０発明の効果菌体内のグルタチオン蓄積量を増加させると共に、安価
なアミノ酸源を用いるのでグルタチオンの製造価格の低
減につながる。

Claims

【特許請求の範囲】

グルタチオン生産性酵母を培養するに際し、複合アミノ
酸物質を培養開始時期に培地に添加し、さらに対数増殖
相後期から安定相前期の間で添加することを特徴とする
グルタチオンの菌体内蓄積法。