WO2022137357A1 - ペプチド、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法 - Google Patents
ペプチド、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法 Download PDFInfo
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
Definitions
- the present invention relates to peptides.
- the present invention relates to a novel tripeptide suitable for animal cell culture, a cell growth promoter containing the peptide, a protein production promoter, a medium, a cell proliferation method using the peptide, and a protein production method using the peptide. ..
- mammalian-derived extracts such as fetal bovine serum are added in an amount of about 5% to 20% with respect to the medium, accounting for 75% to 95% of the cost of the medium, and lots of quality due to animal origin. There was a problem that there was a difference. Furthermore, since there is concern about correlation with mad cow disease, bovine spongiform encephalopathy, infectious spongiform encephalopathy, Kreuzfeld-Jakob disease, etc., a medium containing no animal-derived extract such as bovine fetal serum has been tried. However, the cell viability was significantly reduced in the early stage of culture, and another problem that long-term culture and mass culture were difficult occurred.
- An object of the present invention is to provide a synthetic medium containing no animal-derived components.
- it is an object to provide a medium containing a peptide that promotes cell proliferation and contributes to the promotion of protein production even if it does not contain animal-derived components.
- the present inventors have found a peptide that promotes cell proliferation and contributes to the promotion of protein production, a cell proliferation promoting agent containing the peptide, and protein production containing the peptide.
- a medium containing the accelerator, the peptide was found.
- the peptides of the present invention are Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro ( It is characterized by being selected from the group consisting of GGP), Ala-Glu-Lys (AEK), Ala-Gly-Gly (AGG), Ala-Ser-Asn (ASN), and Glu-Gly-Lys (EGK). And.
- the cell proliferation promoter of the present invention is characterized by containing one or more of the above peptides.
- the protein production promoter of the present invention is characterized by containing one or more of the above peptides.
- the medium of the present invention is characterized by containing the cell proliferation promoter or the protein production promoter.
- the cell proliferation method of the present invention is characterized by using one or more of the above peptides.
- the protein production method of the present invention is characterized in that one or more of the above peptides are used.
- the peptide of the present invention can provide a cell proliferation promoter, a protein production promoter, a medium, a cell proliferation method, and a protein production method containing a chemically synthesized substance that does not contain animal-derived components. .. That is, it is possible to provide a cell proliferation promoting agent, a protein production promoting agent, and a medium having stable quality by having no concern about correlation with mad cow disease, cost reduction, and clarifying the component details. ..
- the relationship between the concentration of GEK and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of DGP and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of AGK and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of GPP and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of GGP and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of AEK and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of AGG and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of ASN and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of EGK and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the relationship between the concentration of GGG and the number of living cells (absorbance) in the cell proliferation test is shown.
- the number of living cells (absorbance) of each tripeptide in the cell proliferation test is shown.
- the time course of the viable cell number (absorbance) of each tripeptide in the cell proliferation test is shown.
- the number of viable cells of each tripeptide in the cell proliferation test for 3 days is shown.
- the cell viability of each tripeptide in the cell proliferation test for 3 days is shown. The number of viable cells of each tripeptide in the cell proliferation test for 5 days is shown. The cell viability of each tripeptide in the cell proliferation test for 5 days is shown. The number of living cells of each tripeptide in the cell proliferation test of one tripeptide is shown. The cell viability of each tripeptide in the cell proliferation test of one tripeptide is shown. The amount of protein produced by each tripeptide in the cell proliferation test of one tripeptide is shown. The number of viable cells of each tripeptide combination in the cell proliferation test of two kinds of tripeptides is shown. The cell viability of each tripeptide combination in the cell proliferation test of two tripeptides is shown.
- the amount of protein produced by each tripeptide combination in the cell proliferation test of two tripeptides is shown.
- the number of viable cells of each tripeptide combination in the cell proliferation test of 3 kinds of tripeptides is shown.
- the cell viability of each tripeptide combination in the cell proliferation test of three tripeptides is shown.
- the amount of protein produced by each tripeptide combination in the cell proliferation test of three tripeptides is shown.
- the number of viable cells of AGK and the amount of protein produced in the cell proliferation test to which vitamins and nucleic acids were added are shown.
- the relationship between the concentration of GEK and the number of living cells in the cell proliferation test using the fully synthetic medium is shown.
- the relationship between the concentration of GEK and the cell viability in the cell proliferation test using the fully synthetic medium is shown.
- the relationship between the concentration of GEK and the amount of protein produced in a cell proliferation test using a fully synthetic medium is shown.
- the number of viable cells of each tripeptide in the cell proliferation test using a fortified medium such as vitamin is shown.
- the cell viability of each tripeptide in the cell proliferation test using a fortified medium such as vitamin is shown.
- the amount of protein produced by each tripeptide in a protein production test using a reinforced medium such as vitamin is shown.
- the amount of protein produced by each tripeptide in a protein production test using a reinforced medium such as vitamin is shown.
- the peptides of the present invention are Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro (GGP). , Ala-Glu-Lys (AEK), Ala-Gly-Gly (AGG), Ala-Ser-Asn (ASN), and Glu-Gly-Lys (EGK).
- the peptide can be a pharmaceutically acceptable salt, and amino acids having the same activity of the peptide can be chemically modified.
- Gly-Glu-Lys Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), and Gly-Gly-Pro (GGP) preferable.
- “Pharmaceutically acceptable salts” include inorganic acid salts such as hydrochlorides, phosphates and sulfates, inorganic base salts such as sodium salts, potassium salts and calcium salts, sulfonates, succinates and oxalic acids. Examples thereof include organic acid salts such as salts and organic base salts such as alkylammonium salts.
- “Chemically modifying an amino acid whose peptide activity does not change” means chemically modifying an amino acid whose peptide activity does not change significantly even if the amino acid is chemically modified, and is a C-terminal with an amide, an ester, an acyl group, or the like. Modification, modification of the N-terminal with an acetyl group, and the like are exemplified.
- the proline (Pro (P)) may be hydroxyproline (Hyp) into which a hydroxyl group has been introduced.
- tripeptides are mainly composed of hundreds of peptides of various lengths contained in fish meat extracts and their enzymatic degradation products, and various peptides that promote animal cell proliferation and protein production. It was enthusiastically searched by fractionating and identifying under the conditions and confirming the effect for each peptide.
- the peptide can be obtained by a method such as fractionation from an extract of fish meat or an enzymatic decomposition product thereof, a chemical synthesis method including a peptide synthesis method, or an expression by a recombinant DNA method.
- a method of fractionating from an extract of fish meat or an enzymatic decomposition product thereof various conditions of gel filtration chromatography and normal-phase / reverse-phase HPLC are adjusted for fractionation and isolation.
- a synthesized amino acid or a chemically modified amino acid can be synthesized by a chemical reaction to obtain a peptide having a specific sequence.
- a recombinant protein containing a plurality of peptide sequences can be produced by a recombinant, and the protein can be purified and then degraded by enzymatic treatment, chemical treatment, or the like to obtain the desired peptide. can.
- the cell growth promoter of the present invention is Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro. (GGP), Ala-Glu-Lys (AEK), Ala-Gly-Gly (AGG), Ala-Ser-Asn (ASN), and Glu-Gly-Lys (EGK) selected from the group 1 Contains more than a species of peptide. In addition, it promotes cell proliferation as compared with the case where the peptide of one or more kinds is not contained.
- the above peptide can be a pharmaceutically acceptable salt, and further, amino acids having the same peptide activity can be chemically modified.
- the proline (Pro (P)) may be hydroxyproline (Hyp) into which a hydroxyl group has been introduced.
- Peptides are selected by appropriately combining one or more of the above peptides.
- Gly-Glu-Lys Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro (GGP) is more preferred.
- Asp-Gly-Pro DGP
- Ala-Gly-Lys AGK
- Gly-Pro-Pro Gly-Glu-Lys
- AGK Asp-Gly-Pro
- Gly-Glu-Lys Gly-Pro-Pro (GPP) and Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Glu-Lys (GEK) and the like are preferred combinations. Illustrated.
- the protein production promoter of the present invention is Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro. (GGP), Ala-Glu-Lys (AEK), Ala-Gly-Gly (AGG), Ala-Ser-Asn (ASN), and Glu-Gly-Lys (EGK) selected from the group 1 Contains more than a species of peptide. In addition, it promotes protein production as compared with the case where it does not contain the one or more kinds of peptides.
- the above peptide can be a pharmaceutically acceptable salt, and further, amino acids having the same peptide activity can be chemically modified.
- the proline (Pro (P)) may be hydroxyproline (Hyp) into which a hydroxyl group has been introduced.
- Peptides are selected by appropriately combining one or more of the above peptides.
- Gly-Glu-Lys Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro (GGP) is exemplified as a preferred peptide.
- Asp-Gly-Pro DGP
- Ala-Gly-Lys AGK
- Gly-Glu-Lys GEK
- Ala-Gly-Lys AGK
- Asp-Gly-Pro DGP
- Gly-Glu-Lys Gly-Pro-Pro (GPP) and Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Glu-Lys (GEK) and the like are preferred combinations. Illustrated.
- the medium of the present invention contains the cell proliferation promoter containing the peptide or the protein production promoter containing the peptide.
- the concentration of peptide in the medium is appropriately set depending on the cells and culture conditions. That is, the lower limit of the amount of peptide in the medium is the concentration at which cells can maintain survival, and the amount of cell proliferation and protein production is the largest as compared with the medium to which no cell proliferation promoter or protein production promoter is added. Is the preferred concentration, and the maximum concentration that is not harmful to the composition of the medium is the upper limit concentration.
- An example of the concentration per peptide is 0.1 mM to 50 mM, preferably 0.2 mM to 10 mM, more preferably 0.5 mM to 5 mM with respect to the medium.
- Other components used in the animal cell culture medium can be appropriately added to the medium.
- examples thereof include vitamins, nucleic acids, amino acids, inorganic salts, sugars, polyamines, carbohydrates, proteins, fatty acids, lipids, pH adjusters, zinc, copper, selenium and the like.
- vitamins include choline chloride, niacinamide, D-pantothenic acid hemicalcium salt, folic acid, cyanocobalamin, pyridoxal hydrochloride, riboflavin, biotin, myo-inositol, ascorbic acid, thiamine hydrochloride, vitamin B12 and the like.
- nucleic acid examples include xanthine, hypoxanthine, uridine, guanine hydrochloride, inosine, guanosine, cytidine, thymidine, adenine and the like.
- Amino acids include glycine, L-alanine, L-arginine hydrochloride, L-aspartin-monohydrate, L-aspartic acid, L-cysteine hydrochloride-monohydrate, L-cystine dihydrochloride, L.
- -Glutamic acid L-glutamine, L-histidine hydrochloride-monohydrate, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine hydrochloride, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L- Examples thereof include treonine, L-tryptophan, L-tyrosine disodium salt, L-valine, arginine and the like.
- the inorganic salt include calcium chloride, magnesium sulfate, potassium chloride, sodium hydrogen carbonate, sodium chloride, sodium dihydrogen phosphate-monohydrate and the like.
- Other components include D-glucose, ⁇ -lipoic acid, phenol sulfonphthaline (phenol red), sodium pyruvate, AlbuMax® II, human transferase (holo), ammonium metavanadate, copper sulfate, manganese chloride, Examples thereof include sodium selenate, ethanolamine, glutathione, methotrexate, and insulin.
- serum components such as fetal bovine serum may be contained, but if there is an intention to remove the animal-derived components from the medium, they are not contained.
- Cell proliferation method and protein production method The cell proliferation method and the protein production method of the present invention are carried out by blending the peptide of the present invention with the above-mentioned medium and culturing various animal cells.
- the cell proliferation method and the protein production method are exemplified below, but are not limited thereto.
- Basis medium is used to acclimate animal cells to serum-free suspension.
- Gly-Glu-Lys Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro (GGP), Ala-Glu-Lys (AEK), Ala-Gly-Gly (AGG), Ala-Ser-Asn (ASN), and one or more peptides selected from the group consisting of Glu-Gly-Lys (EGK) are added to the basal medium. do.
- vitamins, nucleic acids, sugars, polyamines, and amino acids, which are components that reinforce the basal medium may be added.
- animal cells conditioned in the basal medium are seeded in the basal medium to which the peptide has been added, and cell proliferation and protein production are performed.
- Gly-Glu-Lys Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly-Pro (GGP), Ala-Glu-Lys (AEK), Ala-Gly-Gly (AGG), Ala-Ser-Asn (ASN), Glu-Gly-Lys (EGK), and Gly-Gly-Gly (GGG) sequences were synthesized to synthesize peptides. Peptide solutions were prepared so as to have 10 times the concentration shown in Tables 1 to 10.
- CHO-K1 (RIKEN BioResource Research Center, model number RCB2330) was inoculated on a 96-well plate at a cell suspension prepared at 3x10 4 cells / mL so as to be 100 ⁇ L / well, and 37 ° C., CO 25 %. The cells were cultured in an incubator for 24 hours. As the medium, a MEM ⁇ medium (gibco) containing 10% FBS was used. After removing the medium of each well and washing out with MEM ⁇ medium (100 ⁇ L), 90 ⁇ L of new MEM ⁇ medium was dispensed, and each peptide solution (10 ⁇ L) was added (total 100 ⁇ L / well), 0 mM to 5 mM.
- MEM ⁇ medium gibco
- the final concentrations shown in Tables 1 to 10 within the range of 1) were set, and the cells were cultured for 5 days.
- a similar culture test was performed in a system containing neither peptide nor FBS as a comparative sample. After culturing for 5 days, 10 ⁇ L / well of the viable cell number measuring reagent SF (nacalai tesque) was added, and the color reaction was carried out in an incubator at 37 ° C. and CO 25% for 2 hours, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader. ..
- the reference wavelength was 630 nm. It has been confirmed that the absorbance at 450 nm correlates with the number of cells.
- the peptide sequences are Gly-Glu-Lys (GEK), Asp-Gly-Pro (DGP), Ala-Gly-Lys (AGK), Gly-Pro-Pro (GPP), Gly-Gly.
- -Pro GGP
- Ala-Glu-Lys AEK
- Ala-Gly-Gly AGG
- Ala-Ser-Asn ASN
- Glu-Gly-Lys EGK
- Peptides having the sequences of Gly-Pro-Pro (GPP), Asp-Gly-Pro (DGP), Gly-Glu-Lys (GEK), and Ala-Gly-Lys (AGK) were synthesized and within the range of 0 mM to 5 mM. Peptide solutions were prepared so as to have the concentration that increases the number of cells most.
- Gly-Pro-Pro was prepared at 11 mM, Asp-Gly-Pro (DGP) at 22 mM, Gly-Glu-Lys (GEK) at 21 mM, and Ala-Gly-Lys (AGK) at 20 mM.
- DGP Asp-Gly-Pro
- Gly-Glu-Lys Gly-Glu-Lys
- AGK Ala-Gly-Lys
- CHO-K1 (RIKEN BioResource Research Center, model number RCB2330) was seeded on a 96-well plate at a cell suspension prepared at 3x10 4 cells / mL so as to be 100 ⁇ L / well, and 37 ° C., CO 25 %. The cells were cultured in an incubator for 24 hours. As the medium, a MEM ⁇ medium (gibco) containing 10% FBS was used. After removing the medium of each well and washing out with MEM ⁇ medium (100 ⁇ L), 90 ⁇ L of new MEM ⁇ medium was dispensed, and each peptide solution (10 ⁇ L) was added (total 100 ⁇ L / well), 0 to 5. Cultured for days.
- Poly-L-lysine (Peptide Institute, Poly-L-lysine hydrochloride, model number 3075) was prepared at 0.1 mg / mL, 200 ⁇ L was dispensed into each well of a 24-well plate, and incubator at 37 ° C. for 2 hours. It was left still. After removing the residual liquid with an aspirator, it was rinsed with distilled water, irradiated with a UV lamp in a clean bench without a lid, dried overnight and sterilized.
- CHO-K1 (RIKEN BioResource Research Center, model number RCB2330) was seeded on a 24-well plate at 500 ⁇ L / well of a cell suspension prepared at 4x10 4 cells / mL at 37 ° C.
- the cells were cultured in an incubator for 24 hours.
- a MEM ⁇ medium (gibco) containing 10% FBS was used.
- MEM ⁇ medium 500 ⁇ L
- 450 ⁇ L of new MEM ⁇ medium was dispensed, and each peptide solution (50 ⁇ L) was added (total 500 ⁇ L / well) and cultured for 3 days. did.
- the cells were collected and the number of cells was counted.
- a similar culture test was performed in a system containing neither peptide nor FBS as a comparative sample.
- the medium in each well was collected in a 1.5 mL tube, rinsed with 200 ⁇ L of MEM ⁇ , and the rinsed solution was also collected in the same 1.5 mL tube. Then, 100 ⁇ L of trypsin was added and the incubation was carried out for 3 minutes. Rinse was performed with 300 ⁇ L of MEM ⁇ containing 10% FBS, and the rinsed liquid was also collected in the same 1.5 mL tube. Rinse again with 200 ⁇ L of MEM ⁇ containing 10% FBS, and the rinsed liquid was also collected in the same 1.5 mL tube.
- the cells collected in a 1.5 mL tube were centrifuged. Centrifugal conditions were 1000 rpm, 10 minutes and 4 ° C. The supernatant was removed, 300 ⁇ L of Cold PBS (phosphate buffered saline) was added, and centrifugation was performed under the same conditions. This operation was repeated twice.
- the suspension was suspended in 100 ⁇ L of Binding Buffer, 2 ⁇ L of PI (propidium iodide) was added, the tube was stirred, and the mixture was reacted at room temperature and light shielding for 15 minutes. Then, the number of viable cells and the survival rate were measured with a flow cytometer.
- Poly-L-lysine (Peptide Institute, Poly-L-lysine hydrochloride, model number 3075) was prepared at 0.1 mg / mL, 200 ⁇ L was dispensed into each well of a 24-well plate, and incubator at 37 ° C. for 2 hours. It was left still. After removing the residual liquid with an aspirator, it was rinsed with distilled water, irradiated with a UV lamp in a clean bench without a lid, dried overnight and sterilized.
- CHO-K1 (RIKEN BioResource Research Center, model number RCB2330) was inoculated into each well of a 24-well plate at 500 ⁇ L / well of a cell suspension prepared at 4x10 4 cells / mL, and CO 2 at 37 ° C. The cells were cultured in a 5% incubator for 24 hours. As the medium, a MEM ⁇ medium (gibco) containing 10% FBS was used. After removing the medium of each well and washing out with MEM ⁇ medium (500 ⁇ L), 450 ⁇ L of new MEM ⁇ medium was dispensed, and each peptide solution (50 ⁇ L) was added (total 500 ⁇ L / well) and cultured for 5 days. did. The cells were collected and the number of cells was counted. A similar culture test was performed in a system containing neither peptide nor FBS as a comparative sample.
- the medium in each well was collected in a 1.5 mL tube, rinsed with 200 ⁇ L of MEM ⁇ , and the rinsed solution was also collected in the same 1.5 mL tube. Then, 100 ⁇ L of trypsin was added and the incubation was carried out for 3 minutes. Rinse was performed with 300 ⁇ L of MEM ⁇ containing 10% FBS, and the rinsed liquid was also collected in the same 1.5 mL tube. Rinse again with 200 ⁇ L of MEM ⁇ containing 10% FBS, and the rinsed liquid was also collected in the same 1.5 mL tube.
- the cells collected in a 1.5 mL tube were centrifuged. Centrifugal conditions were 1000 rpm, 10 minutes and 4 ° C. The supernatant was removed, 300 ⁇ L of Cold PBS (phosphate buffered saline) was added, and centrifugation was performed under the same conditions. This operation was repeated twice.
- the suspension was suspended in 100 ⁇ L of Binding Buffer, 2 ⁇ L of PI (propidium iodide) was added, the tube was stirred, and the mixture was reacted at room temperature and light shielding for 15 minutes. Then, the number of living cells and the cell viability were measured with a flow cytometer.
- Peptides having the sequences of Gly-Pro-Pro (GPP), Asp-Gly-Pro (DGP), Gly-Glu-Lys (GEK), and Ala-Gly-Lys (AGK) were synthesized and within the range of 0 mM to 5 mM. Peptide solutions were prepared so as to have the concentration that increases the number of cells most.
- Gly-Pro-Pro was prepared at 11 mM, Asp-Gly-Pro (DGP) at 22 mM, Gly-Glu-Lys (GEK) at 21 mM, and Ala-Gly-Lys (AGK) at 20 mM.
- DGP Asp-Gly-Pro
- Gly-Glu-Lys Gly-Glu-Lys
- AGK Ala-Gly-Lys
- Poly-L-lysine (Peptide Institute, Poly-L-lysine hydrochloride, model number 3075) was prepared at 0.1 mg / mL, 200 ⁇ L was dispensed into a 24-well plate, and the mixture was allowed to stand in an incubator at 37 ° C. for 2 hours. .. After removing the residual liquid with an aspirator, it was rinsed with distilled water, irradiated with a UV lamp in a clean bench without a lid, dried overnight and sterilized.
- CHO DP-12 (ATCC, model number CRL-12445) was seeded on a 24-well plate with a cell suspension prepared to 2x10 4 cells / well ⁇ 500 ⁇ L and incubated at 37 ° C.
- DMEM basal medium containing 200 nM methotrexate and 2 ⁇ g / mL insulin in DMEM medium (gibco) containing 10% FBS was used. After removing the medium of each well and washing out with DMEM basal medium (500 ⁇ L), 450 ⁇ L of new DMEM basal medium is dispensed and each peptide solution (50 ⁇ L) is added (total 500 ⁇ L / well) for 5 days. It was cultured.
- GPP + GEK As the peptide, a combination of GPP + GEK, GPP + AGK, DGP + GEK, GEK + AGK, DGP + AGK, GPP + GEK + AGK, GPP + DGP + AGK, and GPP + DGP + GEK was used in addition to the simple substance of GPP, DGP, GEK, and AGK.
- a similar culture test was performed in a system containing neither peptide nor FBS as a comparative sample.
- the medium in each well was collected in a 1.5 mL tube, rinsed with 200 ⁇ L of DMEM basal medium, and the rinsed solution was also collected in the same 1.5 mL tube. Then, 100 ⁇ L of trypsin was added and the incubation was carried out for 3 minutes. Rinse with 300 ⁇ L of DMEM basal medium containing 10% FBS, and the rinsed solution was also collected in the same 1.5 mL tube. Rinse again with 200 ⁇ L of DMEM basal medium containing 10% FBS, and the rinsed solution was also collected in the same 1.5 mL tube.
- the cells collected in a 1.5 mL tube were centrifuged. Centrifugal conditions were 1000 rpm, 10 minutes and 4 ° C. The supernatant was removed, 300 ⁇ L of Cold PBS (phosphate buffered saline) was added, and centrifugation was performed under the same conditions. This operation was repeated twice.
- the suspension was suspended in 100 ⁇ L of Binding Buffer, 2 ⁇ L of PI (propidium iodide) was added, the tube was stirred, and the mixture was reacted at room temperature and light shielding for 15 minutes. Then, the number of living cells and the cell viability were measured with a flow cytometer.
- n 3
- the number of viable cells in each peptide solution is shown in Table 17, FIG. 17, Table 20, FIG. 20, Table 23, and FIG. 23, and the cell viability in each peptide solution is shown. It is shown in Table 18, FIG. 18, Table 21, FIG. 21, Table 24, and FIG. 24, and the amount of protein produced in each peptide solution is shown in Table 19, FIG. 19, Table 22, FIG. 22, Table 25, and FIG. 25.
- DMEM basal medium containing 200 nM methotrexate and 2 ⁇ g / mL insulin in DMEM medium (gibco) containing 10% FBS was used.
- the medium of each well was removed, washed out with DMEM basal medium (500 ⁇ L), and then each peptide solution (500 ⁇ L) was dispensed into each well (total 500 ⁇ L / well) and cultured for 5 days.
- compositions of the above vitamins and nucleic acids are shown in Table 26.
- the cells adhering to the well after collection of the medium are exfoliated by trypsin treatment, suspended again in DMEM basal medium containing 10% FBS, and the number of viable cells and survival rate are determined by the trypan blue staining method at the cell counter. It was measured.
- Peptides having the sequence of Gly-Glu-Lys were synthesized, peptide solutions having concentrations of 0 mM, 2.6 mM, 5.1 mM, 10 mM, 20.5 mM, and 41 mM were prepared, and each well was prepared immediately before the cell culture test. The final concentrations were 0 mM, 0.26 mM, 0.51 mM, 1.0 mM, 2.05 mM, and 4.1 mM, respectively, by adding 1/10 of the total medium volume of.
- Gly-Glu-Lys peptide solutions having concentrations of 0 mM, 2.6 mM, 5.1 mM, 10 mM, 20.5 mM, and 41 mM were prepared, and each well was prepared immediately before the cell culture test. The final concentrations were 0 mM, 0.26 mM, 0.51 mM, 1.0 mM, 2.05 mM, and 4.1 mM, respectively, by adding 1/10 of the total medium volume of.
- CHO DP-12 (ATCC, model number CRL-12445) was added to ASF104 basal medium containing 200 nM methotrexate and 2 ⁇ g / mL insulin in ASF104 medium (Ajinomoto), which is a completely synthetic medium for CHO. used.
- ASF104 basal medium containing 200 nM methotrexate and 2 ⁇ g / mL insulin in ASF104 medium (Ajinomoto), which is a completely synthetic medium for CHO.
- the medium in each well was collected in a 1.5 mL tube, rinsed with 200 ⁇ L PBS, and the rinsed solution was also collected in the same 1.5 mL tube. Then, 0.25% trypsin / EDTA 100 ⁇ L was added and the incubation was carried out for 1 minute. 100 ⁇ L of trypsin inhibitor was added and collected in the same 1.5 mL tube. The rinse was performed with 200 ⁇ L of PBS, and the rinsed solution was also collected in the same 1.5 mL tube and then centrifuged. The cells were suspended in 100 ⁇ L of PBS, and the number of viable cells and the cell viability were measured by the trypan blue staining method on a cell counter.
- n 3
- the number of viable cells in each peptide solution is shown in Table 28 and FIG. 27
- the cell viability in each peptide solution is shown in Table 29 and FIG. 28, and the amount of protein produced is shown. It is shown in Table 30 and FIG. 29.
- DMEM / F12 basal medium, vitamin-reinforcing medium (DMEM / F12 basal medium + vitamin-reinforcing component), and peptide solutions are added to each well of the 24-well (Deep well) cassette of the Micro-24 bioreactor system (manufactured by Nippon Paul Co., Ltd.). 5 mL each was added, and the cells were cultured overnight at 37 ° C., pH 7, and a stirring speed of 650 rpm. The next day, pH calibration was performed, and then 2 mL of the cell suspension prepared to 3.5x10 5 cells / mL was added to each well of the 24-well (Deep well) cassette, and the cell density of the floating cells was 1x10 5 cells / mL.
- the cells were sown at (7 mL / well), cultured at 37 ° C., pH 7, stirring speed 650 rpm, culture conditions of 30% dissolved oxygen, and cultured in the following evaluation medium.
- the medium was 200 nM methotrexate, 10 ⁇ g / mL insulin, 5.5 ⁇ g / mL transferase, 6.7 ng / mL sodium selenate, 10 ⁇ L / mL Anti-Clumping Agent, 10 ⁇ L / in DMEM / F12 medium (gibco).
- DMEM / F12 basal medium containing 10% Pluronic F68 in mL was used.
- CHO DP-12 (ATCC, model number CRL-12445) was acclimatized to serum-free suspension, and a shaking type culture device (Custom Bio Shaker CO2-BR-43FL, Titec) was used to measure 100 mL. Using an Erlenmeyer flask, serum-free suspended CHO DP-12 subcultured under the culture conditions of 37 ° C., CO 25 %, and stirring speed of 125 rpm was used.
- Table 31 shows the reinforcing components such as vitamins.
- the cells were sown at (7 mL / well), cultured at 37 ° C., pH 7, 650 rpm, under culture conditions of 30% dissolved oxygen, and cultured in the following evaluation medium.
- the medium is DMEM / F12 medium (gibco) with 200 nM methotrexate, 10 ⁇ g / mL insulin, 5.5 ⁇ g / A basal medium containing mL transferase, 6.7 ng / mL sodium selenate, 10 ⁇ L / mL Anti-Clumping Agent, and 10 ⁇ L / mL 10% Pluronic F68 was used.
- CHO DP-12 (ATCC, model number CRL-12445) was acclimatized to serum-free suspension, and a shaking type culture device (Custom Bio Shaker CO2-BR-43FL, Titec) was used to measure 100 mL. Using an Erlenmeyer flask, serum-free suspended CHO DP-12 subcultured under the culture conditions of 37 ° C., CO 25 %, and stirring speed of 125 rpm was used.
- CHO cells were suspended without serum. First, cell culture was performed using only the serum medium, and then cell culture was performed using the serum medium and the serum-free medium in half. Finally, the cells may be cultivated using only a serum-free medium for acclimatization.
- the medium containing the peptide of the present invention is also applied to cell lines such as hybridoma, HEK293, COS, and Sf9 used for producing other substances. It is possible.
- the method for producing a protein using the peptide of the present invention may include a step of fed-batch culture in which a medium is added during production.
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Abstract
動物由来の成分を含まない、合成培地を提供することを課題とする。特に、動物由来の成分が含まれなくとも、細胞増殖を促進し、又、タンパク質産生の促進に寄与するペプチドを含む培地を提供することを課題とする。 Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択されるペプチドを含む培地を提供する。
Description
本発明は、ペプチドに関する。特に、動物細胞培養用に適した新規なトリペプチド、該ペプチドを含む細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、該ペプチドを用いた細胞増殖方法、及び、該ペプチドを用いたタンパク質産生方法に関する。
動物細胞を培養して該動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合、あるいは所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞を培養して所望のタンパク質等を製造する場合、ビタミン類、アミノ酸類、塩類、糖類等の栄養成分の他に、動物細胞の増殖の目的で、牛胎児血清等の哺乳動物由来の抽出物や、魚肉関連成分が添加される（特許文献１、２）。
しかしながら、牛胎児血清等の哺乳動物由来の抽出物は、培地に対し５％～２０％程度で添加され、培地のコストの７５％～９５％を占めることや、動物由来のために品質にロット差があるという問題があった。さらに、狂牛病、ウシ海綿状脳症、感染性海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病等との相関が懸念されるため、牛胎児血清等の哺乳動物由来の抽出物を含有しない培地も試みられたが、培養の早期に細胞生存率の著しい低下を生じ、長期培養や大量培養を行うことが困難であるという別の課題が発生した。
また、魚肉抽出物や魚肉の酵素分解物である魚肉関連成分が添加されることにより、コスト面や、培養早期での細胞生存率低下の面の課題は解決された。しかしながら、動物由来に伴う品質にロット差があることには変わりはないという問題が残った。さらには、該魚肉関連成分の成分詳細が不明であり、また対象となる魚の種類、部位、酵素分解条件によって成分が変動するため、培地として使用する際にさまざまな未知のリスクを伴い、安全に使用しづらいという問題があった。
本発明は、動物由来の成分を含まない、合成培地を提供することを課題とする。特に、動物由来の成分が含まれなくとも、細胞増殖を促進し、又、タンパク質産生の促進に寄与するペプチドを含む培地を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意検討した結果、細胞増殖を促進し、又、タンパク質産生の促進に寄与するペプチドを見出し、該ペプチドを含む細胞増殖促進剤、該ペプチドを含むタンパク質産生促進剤、該ペプチドを含む培地を見出した。
すなわち、本発明のペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択されることを特徴とする。
本発明の細胞増殖促進剤は、上記ペプチドを１種以上含むことを特徴とする。
本発明のタンパク質産生促進剤は、上記ペプチドを１種以上含むことを特徴とする。
本発明の培地は、上記細胞増殖促進剤、又は、上記タンパク質産生促進剤を含むことを特徴とする。
本発明の細胞増殖方法は、上記ペプチドを１種以上用いることを特徴とする。
本発明のタンパク質産生方法は、上記ペプチドを１種以上用いることを特徴とする。
本発明のペプチドにより、動物由来成分を含まず、化学的に合成した物質を配合した、細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地、細胞増殖方法、及び、タンパク質産生方法を提供することができる。すなわち、狂牛病等との相関の懸念もなく、コストも抑えられ、かつ、成分詳細が明確となることにより品質の安定した細胞増殖促進剤、タンパク質産生促進剤、培地を提供することができる。
本発明の実施形態について、以下に具体的に説明する。
（ペプチド）
本発明のペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される。また、上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。なかでも、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましい。
「薬学上許容される塩」としては、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、スルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、アルキルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が例示される。
「ペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾する」とは、アミノ酸が化学修飾されても大きくペプチドの活性が変わらないもので化学修飾することであり、アミド、エステル、アシル基等によるＣ－末端の修飾、アセチル基によるＮ－末端の修飾等が例示される。
なお、上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
本発明のペプチドは、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される。また、上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。なかでも、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましい。
「薬学上許容される塩」としては、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基塩、スルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩等の有機酸塩、アルキルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が例示される。
「ペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾する」とは、アミノ酸が化学修飾されても大きくペプチドの活性が変わらないもので化学修飾することであり、アミド、エステル、アシル基等によるＣ－末端の修飾、アセチル基によるＮ－末端の修飾等が例示される。
なお、上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
上記トリペプチドは、主に魚肉の抽出物やその酵素分解物に含まれる数百種類のさまざまな長さのペプチドを中心に、動物細胞増殖を促進するもの及びタンパク質産生を促進するものをさまざまな条件で分画して同定し、その効果をペプチドごとに確認することにより、鋭意探索されたものである。
上記ペプチドは、魚肉の抽出物やその酵素分解物から分画する方法や、ペプチド合成法を含む化学合成法、あるいは、組換えＤＮＡ法による発現のような手段によって、得ることができる。
魚肉の抽出物やその酵素分解物等から分画する方法では、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相／逆相ＨＰＬＣの各種条件を調整して分画、単離する。化学合成法では、合成されたアミノ酸もしくは化学修飾されたアミノ酸を化学反応により合成し、特定の配列を有するペプチドを得ることができる。組換えＤＮＡ法では、ペプチド配列を複数含む組換えタンパク質を組換え体により生成させ、それらのタンパク質を精製後、酵素処理、あるいは化学処理等により分解することにより、目的とするペプチドを得ることができる。
魚肉の抽出物やその酵素分解物等から分画する方法では、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相／逆相ＨＰＬＣの各種条件を調整して分画、単離する。化学合成法では、合成されたアミノ酸もしくは化学修飾されたアミノ酸を化学反応により合成し、特定の配列を有するペプチドを得ることができる。組換えＤＮＡ法では、ペプチド配列を複数含む組換えタンパク質を組換え体により生成させ、それらのタンパク質を精製後、酵素処理、あるいは化学処理等により分解することにより、目的とするペプチドを得ることができる。
（細胞増殖促進剤）
本発明の細胞増殖促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、細胞増殖を促進するものである。
本発明の細胞増殖促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、細胞増殖を促進するものである。
上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
ペプチドの選択は、上記ペプチドから１種以上から適宜組み合わせることにより行われる。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）がより好ましい。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）がより好ましい。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
（タンパク質産生促進剤）
本発明のタンパク質産生促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、タンパク質産生を促進するものである。
本発明のタンパク質産生促進剤は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを含む。また、該１種以上のペプチドを含まない場合に比べ、タンパク質産生を促進するものである。
上記ペプチドは薬学上許容される塩とすることができ、さらにはペプチドの活性の変わらないアミノ酸を化学修飾することができる。上記プロリン（Ｐｒｏ（Ｐ））は、ヒドロキシル基が導入されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）となっていてもよい。
ペプチドの選択は、上記ペプチドから１種以上から適宜組み合わせることにより行われる。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましいペプチドとして例示される。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
なかでも、１種の場合は、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）が好ましいペプチドとして例示される。
２種の場合は、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）及びＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）等が好ましい組み合わせとして例示される。
３種の場合は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）＋Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）＋Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の組み合わせ等が、好ましい組み合わせとして例示される。
（培地）
本発明の培地は、上記ペプチドを含む上記細胞増殖促進剤、又は、上記ペプチドを含む上記タンパク質産生促進剤を含む。
本発明の培地は、上記ペプチドを含む上記細胞増殖促進剤、又は、上記ペプチドを含む上記タンパク質産生促進剤を含む。
培地中のペプチドの濃度は、細胞や培養条件により適宜設定される。すなわち、培地中のペプチドの量は、細胞が生存維持できる濃度が下限濃度であり、細胞増殖促進剤やタンパク質産生促進剤が添加されていない培地に比べて細胞増殖の量やタンパク質産生量が最大となる濃度が好適濃度であり、培地の組成として有害とならない最大濃度が上限濃度である。ペプチド１種あたりの濃度の一例は、培地に対し０．１ｍＭ～５０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ～１０ｍＭ、より好ましくは０．５ｍＭ～５ｍＭである。
培地には、動物細胞培養用培地で使用される他の成分を適宜配合することができる。ビタミン類、核酸、アミノ酸、無機塩、糖、ポリアミン、炭水化物、タンパク質、脂肪酸、脂質、ｐＨ調整剤、亜鉛、銅、セレン等が例示される。
ビタミン類としては、塩化コリン、ナイアシンアミド、Ｄ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、葉酸、シアノコバラミン、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、ビオチン、ミオ－イノシトール、アスコルビン酸、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２等が例示される。
核酸としては、キサンチン、ヒポキサンチン、ウリジン、グアニン塩酸塩、イノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、アデニン等が例示される。
アミノ酸としては、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－アスパラギン－一水和物、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン酸塩酸塩－一水和物、Ｌ－シスチン二塩酸塩、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩－一水和物、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リシン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩、Ｌ－バリン、アルギニン等が例示される。
無機塩としては、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム－一水和物等が例示される。
その他の成分として、Ｄ－グルコース、α－リポ酸、フェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）、ピルビン酸ナトリウム、ＡｌｂｕＭａｘ（登録商標）ＩＩ、ヒトトランスフェリン（ホロ）、メタバナジン酸アンモニウム、硫酸銅、塩化マンガン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、グルタチオン、メトトレキサート、インスリン等があげられる。さらには、目的に応じ、ウシ胎児血清等の血清成分が含まれてもよいが、培地から動物由来の成分を除く意図がある場合は含有させない。
ビタミン類としては、塩化コリン、ナイアシンアミド、Ｄ－パントテン酸ヘミカルシウム塩、葉酸、シアノコバラミン、ピリドキサール塩酸塩、リボフラビン、ビオチン、ミオ－イノシトール、アスコルビン酸、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２等が例示される。
核酸としては、キサンチン、ヒポキサンチン、ウリジン、グアニン塩酸塩、イノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、アデニン等が例示される。
アミノ酸としては、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－アスパラギン－一水和物、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン酸塩酸塩－一水和物、Ｌ－シスチン二塩酸塩、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩－一水和物、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リシン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩、Ｌ－バリン、アルギニン等が例示される。
無機塩としては、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム－一水和物等が例示される。
その他の成分として、Ｄ－グルコース、α－リポ酸、フェノールスルホンフタレイン（フェノールレッド）、ピルビン酸ナトリウム、ＡｌｂｕＭａｘ（登録商標）ＩＩ、ヒトトランスフェリン（ホロ）、メタバナジン酸アンモニウム、硫酸銅、塩化マンガン、セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、グルタチオン、メトトレキサート、インスリン等があげられる。さらには、目的に応じ、ウシ胎児血清等の血清成分が含まれてもよいが、培地から動物由来の成分を除く意図がある場合は含有させない。
（細胞増殖方法及びタンパク質産生方法）
本発明の細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、上記培地に本発明のペプチドを配合し、様々な動物細胞を培養することによって行うものである。
細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、以下に例示するが、これに限定されるものではない。
本発明の細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、上記培地に本発明のペプチドを配合し、様々な動物細胞を培養することによって行うものである。
細胞増殖方法及びタンパク質産生方法は、以下に例示するが、これに限定されるものではない。
基礎培地を用いて、動物細胞を無血清浮遊化に馴化させる。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを基礎培地に添加する。このとき、基礎培地を補強する成分である、ビタミン、核酸、糖、ポリアミン、アミノ酸を添加してもよい。
バイオリアクターを用いて、ペプチドが添加された基礎培地に、基礎培地で馴化した動物細胞を播種し、細胞増殖及びタンパク質産生を行う。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、１種以上のペプチドを基礎培地に添加する。このとき、基礎培地を補強する成分である、ビタミン、核酸、糖、ポリアミン、アミノ酸を添加してもよい。
バイオリアクターを用いて、ペプチドが添加された基礎培地に、基礎培地で馴化した動物細胞を播種し、細胞増殖及びタンパク質産生を行う。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
（各ペプチド溶液の濃度と生細胞数の関係の測定）
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、表１～表１０に記載の１０倍濃度となるように、ペプチド溶液をそれぞれ調製した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内の表１～表１０に記載の終濃度とし、５日間培養した。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。５日間の培養後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、表１～表１０に記載の１０倍濃度となるように、ペプチド溶液をそれぞれ調製した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内の表１～表１０に記載の終濃度とし、５日間培養した。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。５日間の培養後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各ペプチド溶液の濃度における吸光度を表１～表１０、図１～図１０に示した。
表１～表１０、図１～図１０より、試験したペプチドにおいては、ＧＧＧを除き、ペプチド溶液を添加することにより、添加しない場合に比べ、細胞数が増えることが分かった。また、ペプチドの種類により、細胞数が最も増えるペプチド溶液の濃度は異なることが分かった。
さらに、ペプチド溶液の濃度を最適化した場合の細胞増殖促進の程度を比較して示すため、試験した各ペプチドについて、細胞数が最も増えるペプチド溶液の濃度における吸光度について、表１１及び図１１にまとめた。
上記試験条件においては、ペプチドの配列が、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）の順に細胞増殖が促進されることが分かった。
（各ペプチドの細胞増殖日数と細胞数の関係の測定）
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０～５日間培養した。１日毎に、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートへ１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（１００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を９０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（１０μＬ）をそれぞれ添加して（合計１００μＬ／ｗｅｌｌ）、０～５日間培養した。１日毎に、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２時間呈色反応させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。参照波長は６３０ｎｍとした。なお、４５０ｎｍの吸光度は細胞数と相関することが確認されている。比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、１日毎の各ペプチド溶液の吸光度及び標準偏差を表１２、図１２に示した。
表１２及び図１２より、上記試験条件においては、ペプチド溶液を添加することにより、添加しない系に比べ、日数が経過するに従い細胞数が増えることが分かった。
（各ペプチドのコート剤上での細胞増殖試験－３日間－）
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．１ｍＭ、２．２ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、３日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．１ｍＭ、２．２ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、３日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＭＥＭα２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、トリプシン１００μＬを添加して３分間インキュベートを行った。１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα３００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。再度、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
１．５ｍＬチューブに回収した細胞に対し、遠心操作を行った。遠心条件は、１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び生存率を測定した。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び生存率を測定した。
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各ペプチド溶液における生細胞数を表１３、図１３に示し、各ペプチド溶液における細胞生存率を表１４、図１４に示した。
表１３、表１４、図１３、図１４より、上記試験条件のコート剤上での３日間のペプチド培養において、ペプチドを添加しない系に比べ、生細胞数も増加し、細胞生存率も高いことが分かった。
（各ペプチドのコート剤上での細胞増殖試験－５日間－）
Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）は２５ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．２ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．５ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、及び、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＧＧＧ）は２５ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を２．２ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．５ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ－Ｋ１（理化学研究所バイオリソース研究センター、型番ＲＣＢ２３３０）を、４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌへ５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させた、ＭＥＭα培地（ｇｉｂｃｏ社）を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＭＥＭα培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＭＥＭα培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。細胞を回収し細胞数をカウントした。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＭＥＭα２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、トリプシン１００μＬを添加して３分間インキュベートを行った。１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα３００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。再度、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
１．５ｍＬチューブに回収した細胞に対し、遠心操作を行った。遠心条件は、１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各ペプチド溶液における生細胞数を表１５、図１５に示し、各ペプチド溶液における細胞生存率を表１６、図１６に示した。
表１５、表１６、図１５、図１６より、上記試験条件のコート剤上での５日間のペプチド培養において、ＧＧＧを除き、ペプチドを添加しない系に比べ、細胞数も増加し、細胞生存率も高いことが分かった。
（各ペプチド及びペプチドを組み合わせた、コート剤上での細胞増殖試験及びタンパク質産生試験）
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・５００μＬとなるように調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＤＭＥＭ基礎培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
ペプチドはＧＰＰ、ＤＧＰ、ＧＥＫ、ＡＧＫの単体の他、ＧＰＰ＋ＧＥＫ、ＧＰＰ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＧＥＫ、ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＧＥＫの組み合わせを用いた。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ～５ｍＭの範囲内で最も細胞数が増える濃度となるようにペプチド溶液をそれぞれ調製した。すなわち、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）は１１ｍＭ、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）は２２ｍＭ、Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）は２１ｍＭ、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）は２０ｍＭにそれぞれ調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加し、それぞれ終濃度を１．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．１ｍＭ、２．０ｍＭとした。
ポリ－Ｌ－リシン（ペプチド研究所、ポリ－Ｌ－リシン塩酸塩、型番３０７５）を０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌプレートに２００μＬずつ分注し、３７℃のインキュベーターで２時間静置した。アスピレーターで残液を除去後、蒸留水でリンスし、蓋をせずにクリーンベンチ内でＵＶランプを照射し、一晩乾燥、滅菌した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ・５００μＬとなるように調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、さらに新しいＤＭＥＭ基礎培地を４５０μＬずつ分注し、各ペプチド溶液（５０μＬ）をそれぞれ添加して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
ペプチドはＧＰＰ、ＤＧＰ、ＧＥＫ、ＡＧＫの単体の他、ＧＰＰ＋ＧＥＫ、ＧＰＰ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＧＥＫ、ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＧＥＫ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＡＧＫ、ＧＰＰ＋ＤＧＰ＋ＧＥＫの組み合わせを用いた。なお、比較試料としてペプチドもＦＢＳも含有しない系にて、同様な培養試験を行った。
産生タンパク質量を測定するために、培地上清１００μＬを１．５ｍＬチューブに回収し、希釈し、ＥＬＩＳＡ法により産生タンパク質量を定量した。
細胞を回収するため、各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＤＭＥＭ基礎培地２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、トリプシン１００μＬを添加して３分間インキュベートを行った。１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ基礎培地３００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。再度、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ基礎培地２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
１．５ｍＬチューブに回収した細胞に対し、遠心操作を行った。遠心条件は、１０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
上清を取り除き、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３００μＬを添加し、同じ条件で遠心操作を行った。本操作を２回繰り返した。
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁させ、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）２μＬを添加してチューブを攪拌し、室温・遮光で１５分間反応させた。その後、フローサイトメーターで生細胞数及び細胞生存率を測定した。
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各ペプチド溶液における生細胞数を表１７、図１７、表２０、図２０、表２３、図２３に示し、各ペプチド溶液における細胞生存率を表１８、図１８、表２１、図２１、表２４、図２４に示し、各ペプチド溶液における産生タンパク質量を表１９、図１９、表２２、図２２、表２５、図２５に示した。
表１７～表２５、図１７～図２５より、上記試験条件において、ペプチド単体及びペプチド２種以上を組み合わせて添加することにより、細胞増殖を促進させ、タンパク質産生を促進させることが分かった。
（各ペプチドの細胞増殖試験及びタンパク質産生試験－ビタミン及び核酸の添加効果－）
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、１．０ｍＭ及び２．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を、１ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５００μＬ）となるように２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、各ペプチド溶液（５００μＬ）をそれぞれのｗｅｌｌに分注して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）の配列を有するペプチドを合成し、１．０ｍＭ及び２．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。
ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を、２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を、１ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５００μＬ）となるように２４ｗｅｌｌプレートに播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、１０％ＦＢＳを含有させたＤＭＥＭ培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＤＭＥＭ基礎培地を用いた。
各ｗｅｌｌの培地を除去し、ＤＭＥＭ基礎培地（５００μＬ）で洗い出した後、各ペプチド溶液（５００μＬ）をそれぞれのｗｅｌｌに分注して（合計５００μＬ／ｗｅｌｌ）、５日間培養した。
以下の試験区の評価培地にそれぞれ培地交換した後、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで５日間培養した。
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ビタミン及び核酸補強培地（ＤＭＥＭ基礎培地＋ビタミン＋核酸）
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ＤＭＥＭ基礎培地
・ビタミン及び核酸補強培地（ＤＭＥＭ基礎培地＋ビタミン＋核酸）
・ＡＧＫ（１ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
・ＡＧＫ（２ｍＭ）＋ビタミン及び核酸補強培地
培養５日後、２４ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌの培地を全量回収し、遠心操作（５０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を別途回収して産生タンパク質量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
上記ビタミン及び核酸の組成は、表２６に示した。
培地回収後のｗｅｌｌに接着している細胞は、トリプシン処理により剥離し、再度１０％ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ基礎培地に懸濁させ、セルカウンターにてトリパンブルー染色法により生細胞数及び生存率を測定した。
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各評価培地における生細胞数、細胞生存率、産生タンパク質量を表２７に示し、生細胞数と産生タンパク質量を図２６に示した。
表２７、図２６より、上記試験条件においては、基礎培地に対し、ペプチドを添加すると、生細胞数、産生タンパク質量ともに多くなるが、さらにビタミンと核酸を添加すると細胞増殖もタンパク質産生もより促進されることが分かった。
（完全合成培地にペプチドを添加した場合の細胞増殖試験及びタンパク質産生試験）
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）の配列を有するペプチドを合成し、０ｍＭ、２．６ｍＭ、５．１ｍＭ、１０ｍＭ、２０．５ｍＭ、４１ｍＭの濃度のペプチド溶液を調製し、細胞培養試験直前に各ｗｅｌｌの総培地容量の１／１０量を添加して、それぞれ終濃度を０ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．５１ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０５ｍＭ、４．１ｍＭとした。本試験には、ＣＨＯ用の完全合成培地であるＡＳＦ１０４培地（味の素）に、２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＡＳＦ１０４基礎培地に馴化させたＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を使用した。細胞濃度が４ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌプレートへ４５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、ＣＯ2５％のインキュベーターで２４時間培養した。培地は、ＣＨＯ用の完全合成培地であるＡＳＦ１０４培地（味の素）に、２００ｎＭメトトレキサート、２μｇ／ｍＬインスリンを配合したＡＳＦ１０４基礎培地を用いた。
２４時間後、調製したペプチド溶液を５０μＬずつ添加し、５日間培養した。培養後に細胞を回収して生細胞数をカウントした。
＜評価培地＞
・ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．２６ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．５１ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（１．０ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（４．１ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
＜評価培地＞
・ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．２６ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（０．５１ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（１．０ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ＡＳＦ１０４基礎培地
・ＧＥＫ（４．１ｍＭ） ＋ＡＳＦ１０４基礎培地
産生タンパク質量を定量するために、培地上清１００μＬを１．５ｍＬチューブに採取した。該上清を希釈し、ＥＬＩＳＡ法により産生タンパク質量を測定した。
細胞を解析するために、各ｗｅｌｌ中の培地を１．５ｍＬチューブに回収し、ＰＢＳ２００μＬでリンスし、リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した。その後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ１００μＬを添加して１分間インキュベートを行った。トリプシンインヒビター１００μＬを添加して同じ１．５ｍＬチューブに回収した。
ＰＢＳ２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した後、遠心操作を行った。ＰＢＳ１００μＬで懸濁させ、セルカウンターにてトリパンブルー染色法により生細胞数及び細胞生存率を測定した。
ＰＢＳ２００μＬでリンスし、該リンス済みの液も同じ１．５ｍＬチューブに回収した後、遠心操作を行った。ＰＢＳ１００μＬで懸濁させ、セルカウンターにてトリパンブルー染色法により生細胞数及び細胞生存率を測定した。
以上の調製、培養、測定をｎ＝３で行い、各ペプチド溶液における生細胞数を表２８、図２７に示し、各ペプチド溶液における細胞生存率を表２９、図２８に示し、産生タンパク質量を表３０、図２９に示した。
表２８～表３０、図２７～図２９より、上記試験条件において、市販の完全合成培地を用いた基礎培地に比べ、ＧＥＫのペプチドを添加した場合、生細胞数は増加し、細胞生存率は同等に高く、産生タンパク質量も増加傾向がみられ、細胞増殖を促進し、タンパク質産生を促進することが分かった。
（浮遊細胞系におけるＧＥＫ及びＤＧＰの細胞増殖試験及びタンパク質産生試験）
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、２．８７ｍＭのＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、１．５５ｍＭのＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）のペプチド溶液を調製した。
Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）及びＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）の配列を有するペプチドを合成し、２．８７ｍＭのＧｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、及び、１．５５ｍＭのＡｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）のペプチド溶液を調製した。
Ｍｉｃｒｏ－２４バイオリアクターシステム（日本ポール社製）の２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌにＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地やビタミン等補強培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地＋ビタミン等補強成分）、各ペプチド溶液を５ｍＬずつ加え、３７℃、ｐＨ７、撹拌速度６５０ｒｐｍの条件で一晩培養した。翌日にｐＨキャリブレーションを行い、その後、３．５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ加え、浮遊細胞の細胞密度が１ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（７ｍＬ／ｗｅｌｌ）となるように播種し、３７℃、ｐＨ７、撹拌速度６５０ｒｐｍ、溶存酸素３０％の培養条件、以下の評価培地で培養した。
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＤＧＰ（１．１１ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合したＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地を用いた。
＜評価培地＞
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＧＥＫ（２．０５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＤＧＰ（１．１１ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合したＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地を用いた。
使用する浮遊細胞には、ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を無血清浮遊化に馴化し、振とう型培養装置（Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｉｏ Ｓｈａｋｅｒ ＣＯ２－ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック社）で、１００ｍＬ容三角フラスコを用いて、３７℃、ＣＯ2５％、撹拌速度１２５ｒｐｍの培養条件で継代培養をしている無血清浮遊化ＣＨＯ ＤＰ－１２を用いた。
上記ビタミン等補強成分を、表３１に示す。
培養３日目以降、２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌから培地２００μＬを１．５ｍＬのチューブに回収した。うち、５０μＬを別の１．５ｍＬのチューブに取り、トリパンブルー５０μＬを加えて十分に懸濁させた後、セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により生細胞数及び生存率を測定した。
以上の調製、培養、測定をｎ＝２又は３で行い、各評価培地における生細胞数を表３２、図３０に示した。また、各評価培地における生存率を表３３、図３１に示した。
表３２、図３０、表３３、図３１より、上記試験条件において、基礎培地、あるいは、ビタミン等補強培地に対し、ペプチドを添加すると、生細胞数及び生存率ともに多くなることが分かった。
培養３日目以降、２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌから回収した培地２００μＬのうち、１５０μＬを１．５ｍＬのチューブで遠心操作（５０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を別途回収して産生タンパク質量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
表３４、図３２に、測定された産生タンパク質量を示した。
表３４、図３２に、測定された産生タンパク質量を示した。
表３４、図３２より、基礎培地、あるいは、ビタミン等強化培地に対し、ペプチドを添加すると、産生タンパク質量は多くなることが分かった。
（浮遊細胞系におけるＡＧＫ及びＧＰＰのタンパク質産生試験）
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）及びＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）の配列を有するペプチドを合成し、５．５３ｍＭのＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、及び、６．１６ｍＭのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）のペプチド溶液を調製した。
Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）及びＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）の配列を有するペプチドを合成し、５．５３ｍＭのＡｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、及び、６．１６ｍＭのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）のペプチド溶液を調製した。
Ｍｉｃｒｏ－２４バイオリアクターシステム（日本ポール社製）の２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌに基礎培地やビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）、各ペプチド溶液を５ｍＬずつ加え、３７℃、ｐＨ７、６５０ｒｐｍの条件で一晩培養した。翌日にｐＨキャリブレーションを行い、その後、３．５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌに２ｍＬずつ加え、浮遊細胞の細胞密度が１ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（７ｍＬ／ｗｅｌｌ）となるように播種し、３７℃、ｐＨ７、６５０ｒｐｍ、溶存酸素３０％の培養条件、以下の評価培地で培養した。
＜評価培地＞
・基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＡＧＫ（３．９５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＧＰＰ（４．４０ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合した基礎培地を用いた。
＜評価培地＞
・基礎培地
・ビタミン等補強培地（基礎培地＋ビタミン等補強成分）
・ＡＧＫ（３．９５ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
・ＧＰＰ（４．４０ｍＭ）＋ビタミン等補強培地
なお、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｇｉｂｃｏ社）に２００ｎＭメトトレキサート、１０μｇ／ｍＬインスリン、５．５μｇ／ｍＬトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、１０μＬ／ｍＬのＡｎｔｉ－Ｃｌｕｍｐｉｎｇ Ａｇｅｎｔ、１０μＬ／ｍＬの１０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８を配合した基礎培地を用いた。
使用する浮遊細胞には、ＣＨＯ ＤＰ－１２（ＡＴＣＣ、型番ＣＲＬ－１２４４５）を無血清浮遊化に馴化し、振とう型培養装置（Ｃｕｓｔｏｍ Ｂｉｏ Ｓｈａｋｅｒ ＣＯ２－ＢＲ－４３ＦＬ、タイテック社）で、１００ｍＬ容三角フラスコを用いて、３７℃、ＣＯ2５％、撹拌速度１２５ｒｐｍの培養条件で継代培養をしている無血清浮遊化ＣＨＯ ＤＰ－１２を用いた。
上記ビタミン等補強成分は表３１に示したものである。
培養３日目以降、２４ｗｅｌｌ（Ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）カセットの各ｗｅｌｌから培地１５０μＬを１．５ｍＬのチューブに回収し、遠心操作（５０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を回収して産生タンパク質量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
表３５、図３３に、測定された産生タンパク質量を示した。
表３５、図３３に、測定された産生タンパク質量を示した。
表３５、図３３より、上記試験条件において、基礎培地、あるいは、ビタミン等補強培地に対し、ペプチドを添加すると、産生タンパク質量は多くなることが分かった。
なお、上記浮遊細胞系でのタンパク質産生において、ＣＨＯ細胞を無血清浮遊化したが、まず血清培地のみを用いて細胞培養を行い、その後、血清培地と無血清培地を半々にして細胞培養を行い、最後に無血清培地のみを用いて細胞培養を行うことにより、馴化させてもよい。
また、上記浮遊細胞系におけるタンパク質産生試験において、ＣＨＯ細胞を用いたが、本発明のペプチドを含む培地は、その他の物質産生に利用されるハイブリドーマ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓｆ９等の細胞株にも適用可能である。
本発明のペプチドによるタンパク質産生方法は、上記バッチ培養の他、産生中に培地を継ぎ足すフェドバッチ培養の工程を含んでもよい。
Claims (7)
- Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＧＥＫ）、Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＤＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＡＧＫ）、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＧＰＰ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（ＧＧＰ）、Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（ＡＥＫ）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＡＧＧ）、Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ（ＡＳＮ）、及び、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ（ＥＧＫ）からなる群より選択される、ペプチド。
- 請求項１記載のペプチドを１種以上含む、細胞増殖促進剤。
- 請求項１記載のペプチドを１種以上含む、タンパク質産生促進剤。
- 請求項２記載の細胞増殖促進剤、又は、請求項３記載のタンパク質産生促進剤を含む、培地。
- 請求項１記載のペプチド１種以上を用いた、細胞増殖方法。
- 請求項１記載のペプチド１種以上を用いた、タンパク質産生方法。
- バッチ培養又はフェドバッチ培養を含む、請求項６に記載のタンパク質産生方法。
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