KR101362805B1 - 개선된 세포 배양 배지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 락트산, 아디프산 및 이들의 혼합물 그리고 이들 산의 염, 유도체 또는 복합체를 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 함유하는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 관련된다. 또한, 본 발명은 상기 세포 배양 배지의 용도와 생산 방법, 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서 세포 배양물의 배양 방법 및 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포에 관련된다.
영양 배지, 세포 배양 배지

Description

개선된 세포 배양 배지{IMPROVED CELL CULTURE MEDIUM}
본 발명은 적어도 하나의 세포의 배양을 위한 그리고/또는 유기체, 특히 세포 또는 세포 배양물로부터 폴리펩티드, 단백질 및/또는 백신을 얻기 위한 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 관련되며, 유기체는 본 발명에 따른 영양 배지에서 배양되고, 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 백신은 유기체 및/또는 배양 상등액으로부터 얻어진다.
놀랍게도, 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산을 포함하는 군에서 선택되는 유기산 또는 염, 유기산의 유도체 또는 복합체를 영양 배지에 첨가함으로써, 세포의 성장 및/또는 생산성이 증가하고 그리고/또는 독성 대사 산물의 생성이 감소하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따른 물질이 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 단독으로 첨가되거나, 서로 조합되거나, 다른 탄수화물과 조합될 경우, 특히 상기 물질이 글루타민을 거의 함유하지 않는 배지에 첨가되거나, 글루타민 치환체를 함유하는 배지와 함께 사용될 경우, 본 발명의 상기 태양에 따라 발생하는 생산성 증가 및/또는 부산물의 생성 감소는 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 물질은 세포 대사의 조절자로 사용된다. 이는 부가적인 에너지 및/또는 탄수화물 원으로 작용한다. 이와 관련하여 물질은 탄수화물 및/또는 글 루타민을 함유하는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상응하는 고 농도로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 물질은 탄수화물 및/또는 글루타민을 함유하지 않는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에도 사용될 수 있다.
동물 세포, 특히 포유류 세포는 백신, 예를 들어 바이러스 또는 폴리펩티드의 제조 시에 숙주 세포로서 사용이 증가하고 있다. 계속해서 성장하는 세포는 일반적으로 이를 위해, 즉 불멸화 세포 또는 종양 세포인 세포주를 위해 사용된다. 몇몇 적용을 위해, 예를 들어 인간 또는 동물로부터 직접 취해진 1차 세포가 사용된다. 이들이 생체 외에서 배양될 때, 1차 세포와 세포주 사이에는 큰 차이가 있다. 1차 세포는 단지 몇 번만 분열할 수 있는 반면에, 세포주는 실제로 무한히 분열할 수 있다. 또한, 1차 세포와 영구 세포주 사이의 세포 대사, 예를 들어 포도당 소모율, 락테이트 생성률 및 글루타민 소모율에서 차이가 있을 수 있다.
세포, 특히 포유류 세포의 사용에 있어서 공정 최적화의 목적은 배양 시스템에서 생 세포 농도의 적분, 즉 생 세포 농도 곡선과 시간 곡선으로부터의 적분을 증가시키려는 것이며, 이는 생 세포 농도의 적분이 산물 농도, 예를 들어 폴리펩티드 농도와 명확한 상관관계를 가지기 때문이다(Renard, J.M. 등, Biotechnology Letters, 1988, 10(2): 91-96). 생 세포 농도의 적분은 생 세포 농도를 증가시키거나 공정 시간을 길게 함으로써 증가할 수 있다.
공정 시간은 세포가 생물 반응기에서 장시간 동안 살아남을 경우, 즉 세포의 활력이 장시간 동안 높게 남아 있을 경우, 또는 선택적으로 정체기가 길어질 경우, 연장될 수 있다. 활력이 낮을 경우, 배양물에는 많은 죽은 세포가 있어서, 발효 중 용해를 겪고 세포-특이적인 단백질을 방출한다. 배양물에서의 높은 전체 특이적-단백질 함량은 원하는 폴리펩티드의 정제를 더욱 어렵게 만든다. 활력 감소 및 이에 따른 짧은 공정 시간에 대한 몇몇 설명이 있다: 영양 배지에서, 특히 세포 배양 배지에서, 기질은 제한 효과를 가질 수 있고, 세포는 물리적 발효 조건 때문에 세포 사멸로 진입할 수 있으며, 또는 대사의 부산물이 배지에서 축적되어 세포에 독성 작용을 가할 수 있다.
세포 활력이 장시간 동안 높게 남아 있는, 즉 정체기가 길어져서, 가장 높은 생 세포 농도가 정체기에 이미 달성되는 영양 배지 또는 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다. 정체기의 연장은 생 세포 농도의 적분 증가 및 산물 생성 증가를 유도한다. 생 세포 농도의 적분을 증가시키기 위한 또 다른 변수는 최고 세포 밀도에서의 증가이다. 최고 세포 밀도는 더 좋은 영양 배지 및 더 좋은 배양 방법에 의해 더 증가할 수 있다.
최고 세포 밀도 또는 세포 활력은 세포 대사의 함수이다. 세포가 비효율적인 대사를 가질 경우, 이들은 락테이트와 같은 에너지가 풍부한 중간 대사 산물을 배지로 분비한다. 또한, 세포는 암모늄과 같은 독성 중간 대사 산물을 배지로 분비할 수 있다. 암모늄은 세포 성장, 생산성 및 산물 품질, 예를 들어 당화에 불리하게 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 높은 당 분해 활성을 가진 세포가 포도당을 대사할 때, 당 분해 중간물의 세포 내 농도에 변화가 있다. 이는 스트레스 안정성, 생산성 및 성장에 필요한 다양한 유전자의 발현 프로파일에 영향을 줄 수 있 다(Verstrepen, K.J. 등, Trends Biotechnol., 2004, 22 (10): 531-537). 이러한 조건에서 생 세포 농도의 적분은 낮고, 산물 생성은 감소한다.
1차 세포와 비교하여, 영구 세포주는 퇴화된 세포 대사를 갖는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여, 1차 대사의 다수의 효소가 세포주와 1차 세포 사이에서 비교되었다. 당 분해를 시트레이트 회로와 연결하는 효소의 활성이 시험한 세포주에서 검출될 수 없었던 반면에, 이들은 1차 세포에 존재하였다(Neerman, J. 및 Wagner, R., J. Cell. Physiol., 1996, 166 (1): 152-169). 많은 계대 포유류 세포에서 포도당으로부터 락테이트의 전환 속도는 높은 반면에, 피루베이트에서 시트레이트 회로로의 전환 속도는 낮다. 포도당은 세포에 의해 락테이트로 많이 전환되고 에너지가 풍부한 락테이트는 영양 배지로, 특히 세포 배양 배지로 분비된다. 포도당과는 별개로, 세포주는 에너지원으로서 글루타민을 고속으로 대사한다. 따라서 두 기질인, 포도당과 글루타민은 계대 포유류 세포용 영양 배지에서 가장 중요한 기질 중 하나이다.
영구 세포주의 세포 대사를 개선하려는 몇몇 시도가 있었다. 공정에서 포도당과 글루타민의 제한이 당 분해 속도를 제한하는 수단으로서 시도되었다. 기질 제한은 세포의 과잉 대사를 억제해서 세포가 락테이트와 암모늄을 적게 생산할 것으로 추정되었다(US 2004-0048368 A1; Europa, A.F. 등, Biotechnol. Bioeng., 2000, 67(1): 25-34). 성장과 CHO 세포의 사멸에 미치는 글루타민 제한의 영향이 면밀히 조사되었다. 글루타민 제한으로 인해 세포 성장 속도는 감소하지만, 세포 사멸로 진입하는 세포의 비율은 낮은 것으로 밝혀졌다(Sanfeliu, A. 및 Stephanopoulus, G., Biotechnol. and Bioeng., 1999, 64(1): 46-53). WO 98/41611에서 포도당과 글루타민 농도를 낮은 값으로 조절하는 것이 제안되었다. 이는 산소 소모율과 포도당 또는 글루타민 농도의 결합을 통해 일어나야 한다. 이 과정을 위한 필요 조건은 기질의 복합 조절과 보충이어서, 이 공정은 특히 대규모 조건에서 제어하기가 어렵다. 발효기 고장의 위험 및 관련된 재정적 위험이 크다. 다른 한편, EP 0435911 B1은 세포 성장 개선과 산물 생성 증가를 달성하기 위해서는, 특히 글루타민이 표준 세포 배양 배지에서 증가해야 함을 교시한다. 유사하게, 동물 세포에 글루타민의 보충이 생물 약물의 제조를 위한 유가 또는 관류 배양에서 필요한 것으로 고려된다(Duvar, S. 등, Transkript, 2004, 5(1): 34-36). 따라서, 세포 대사에 대한 글루타민의 역할에 관한 문헌에서 모순된 진술이 있다.
Chen, K. 등(Biotechnol. Bioeng., 2001, 72: 55-62)은 상동 재조합에 의해 락테이트 생성을 억제하려고 시도하였다. 락테이트 탈수소 효소 유전자의 복제가 불활성화되었고 결과적으로 세포-특이적인 락테이트 생성률이 50%로 감소하였다. Irani, N. 등(J. Biotechnol., 1999, 66: 238-246)은 피루베이트 탈탄산 효소 유전자를 세포주에 클론화하였다. 세포가 시트레이트 회로로 더 많은 피루베이트를 전달해서 락테이트를 적게 생산할 것으로 기대되었다. EP 0 338 841 A1에 따르면, 글루타민 합성효소 유전자가 선택 표지로서 세포에 클론화되었다. 이는 외부 글루타민이 영양 배지에 첨가되지 않아도 되는 이점을 갖는다. 세포는 글루타민을 스스로 생산하고 암모늄을 적게 분비한다.
Altamirano, C. 등(Biotechnol. Progress, 2000, 16(1): 69-75)은 회분 조건 으로 저-단백질 배지에서 포도당과 글루타민을 대사되기 어려운 대체물로, 이 경우 갈락토스와 글루타메이트로 대체하였다. 그 결과, 세포는 실제로 대사 부산물을 적게 생산했지만, 세포 성장과 산물 생성 모두 대조군보다 낮았다. 2-단계 공정의 개발이 또한 제안되었다: 세포는 초기에는 포도당으로 성장한 후, 생산 단계에서는 탄수화물원으로서 갈락토스를 이용해야 한다(Altamirano, C. 등, Biotechnol. Bioeng., 2001, 76(4): 351-60; Altamirano, C. 등, J. Biotechnology, 2004, 110(2): 171-9).
US 4,049,494는 무-혈청의, 화학적으로 특정되고 고압 증기 멸균가능한 영양 배지를 기술한다. 배지는 무-글루타민이고 동시에 포도당과 피루베이트를 함유하는 특성을 지닌다. 배지는 아기 햄스터 신장 세포를 이용한 바이러스 생산을 위해 특별히 개발되었다. 유사하게, WO 03/106661 A2는 포유류 세포의 배양을 위한 기질 조합을 기술한다. 이 조합은 무-글루타민이고 동시에 피루베이트를 함유하는 영양 배지를 포함한다. 이 기질 조합은 락테이트 및/또는 암모늄의 생성을 감소시킨다고 했다. 영양 배지에서 5.5 mM 포도당과 1 mM 피루베이트의 조합은 난구세포로 둘러싸인 마우스 난모세포의 성숙을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 세포의 성숙에 미치는 글루타민의 영향은 거의 증명될 수 없었다(Downs, S.M. 및 Hudson, E.D., Zygote, 2000, 8(4): 339-51). Hassel, T. 및 Butler, M.(J. Cell Science, 1990, 96(Pt3): 501-8)은 영양 배지에서 글루타민을 글루타메이트 또는 2-옥소글루타레이트로 대체하여 이 배지에 세포를 적응시켰다. 적응 단계 이후, 사용된 맥코이(McCoy) 세포는 락테이트와 암모늄을 적게 생산하였다. 이 경우에 세포가 미세 담체에서 성장하였고 지수 성장 단계 후반 또는 정체 단계에 있었음이 강조되어야 한다. 세포는 성장 단계에서 변형된 대사 프로파일을 갖는다. 또한, 무-글루타민 배지에 대한 세포의 예비-적응이 필요했다.
특정 영양 배지에서, 글루타민은 영양 배지에서 제거되었다. 세포 적응 없이, 조사 중의 클론은 특정 영양 배지에서 단순 성장하였다. 그 결과 암모늄 생성이 감소하였고 산물 생성이 증가하였다(Deer, F., 및 Cunningham, M., Genetic Eng. News, 2000, 20(7): 42). Kurano, N. 등(Journal of Biotechnology, 1990, 15(1-2): 113-28)은 글루타민을 아스파라긴으로 대체하였다. CHO 배양에 유가 조건 및 무-글루타민 조건에서 아스파라긴이 보충되었고 암모늄 생성이 감소하였다.
또한, 글루타민은 영양 배지에서 디펩티드, 알라닐-글루타민(Ala-Gln) 또는 글리실-글루타민(Gly-Gln)으로 대체되었다. 이 방법으로 인해 세포는 암모늄을 적게 생산하는 것으로 밝혀졌다(Roth, E. 등, In vitro cellular & developmental biology, 1988, 24(7): 696-698; Christie, A. 및 Butler, M., J. Biotechnology, 1994, 37(3): 277-90). 글루타민 제한의 영향을 조사하기 위해 글루타민은 안정한 글루타민 대체물 L-알라닐-글루타민(Glutamax)으로 대체되었다(Sanfeliu, A. 및 Stephanopoulus, G., Biotechnol. and Bioeng., 1999, 64(1): 46-53).
포도당 소모와 락테이트 생성을 감소시키기 위한 물질의 또 다른 조합이 EP 1 342 780 A1에 개시되었다. 이에 따르면, 자유 미결합 시트레이트가 착화제에 결합한 철 시트레이트와 조합하여 영양 배지에 첨가되어야 한다.
영양 배지(관류액)에서, 10:1 비율의 락테이트와 피루베이트가 쥐 심장 세포 에 기질로서 공급되었다. 락테이트가 심장 세포의 바람직한 기질이기 때문에 락테이트가 사용되었다. 당 분해 속도가 락테이트의 첨가를 통해 억제되는 것으로 밝혀졌다(Depre, C. 등, Acta Cardiologica, 1993, 48(1): 147-64; Ovchinnikov, I.V. 및 Kim, N.P., Ukrainskii Biokhimicheskii Zhurnal, 1985, 57(4): 72-5).
햄스터 배아에 대한 숙시네이트, 말레이트, 락테이트 및 피루베이트의 작용이 화학적으로 특정된, 무-단백질 배지에서 조사되었다. 영양 배지에서 숙시네이트와 말레이트는 배반포의 발생을 지원하는 것으로 밝혀졌다(Ain, R. 및 Seshagiri, P.B., Molecular Reproduction & Development, 1997, 47(4): 440-7). 이 연구에서 초점은 발생 생물학, 특히 배반포(1차 세포)의 발생에 있었다.
CHO(chinese hamster ovary) 세포는 리보스, 유당, 자당, 글리세롤, 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 푸마레이트 또는 말레이트를 에너지원으로 이용할 수 없다고 보고되었다(Faik, P. 및 Morgan, M.J., Cell Biol. Int. Reports, 1977, 1(6): 555-62). 놀랍게도, 본 발명에 따라 정확한 농도가 선택되고 또한 아미노산(글루타민, 글루타메이트, 아스파라긴)과 탄수화물 원의 정확한 농도가 선택될 경우, 정확히 이 물질들이 세포, 특히 CHO 세포에 의해 기질로서 이용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
아세테이트는 부티레이트와 비교하여 세포의 생산성 성능을 증가시킨다는 것을 기초로 하여 영양 배지에 첨가되었다(WO 03/064630). 유전적으로 변형된 효모 균주를 선택할 수 있도록 포도당이 또 다른 C2-탄소 원과 조합되었다(WO 2004/099425). 그러나, 이 연구에서, 초점은 새로운 효모 균주를 선택하는 방법에 있고 유기체의 배양을 위한 것은 아니다.
본 발명의 기초를 형성하는 기술적 과제는 세포 배양물의 생 세포 농도의 적분이 증가하고, 따라서 대량의 바람직한 생물 산물이 공정의 전체 기간 동안 얻어질 수 있는, 세포 또는 세포 배양물의 배양을 위한, 특히 세포 또는 세포 배양물로부터 생물 산물의 생산을 위한, 개선된 생산 영양 배지, 특히 세포 배양 배지, 세포 배양물 및 방법을 제공하는 것이다. 또한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지가 당화 경로 또는 에너지 대사 경로, 특히 시트레이트 회로 또는 당 분해에서 정확히 국소화 되지는 않는다 하더라도 하나 또는 그 이상의 가능한 대사 차단을 갖거나, 배지에서 세포로, 그리고/또는 세포기관 사이의 세포 내부에서 대사 산물의 수송을 차단하는 세포에 이용될 수 있는 것이 더욱 바람직하다.
따라서, 본 발명은 세포 성장이 개선되거나, 대산 부산물이 감소하며, 따라서 대량의 바람직한 생물 산물이 공정의 전체 기간 동안 얻어질 수 있는, 세포 또는 세포 배양물, 또한 당화 경로 또는 에너지 대사 경로, 예를 들어 시트레이트 회로 또는 당 분해에서 대사 차단을 갖는 세포, 또는 배지에서 세포로, 그리고/또는 세포기관 사이의 세포 내부에서 대사 산물의 수송을 차단하는 세포의 배양을 위한 영양 배지를 제공하는 기술적 과제에 기초한다.
또한, 본 발명은 특정 세포, 특히 유전적으로 변형된 그리고/또는 대사적으로 변형된, 특히 최적화된 세포의 선택 방법을 제공하는 기술적 과제에 기초한다.
놀랍게도, 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산을 포함하는 군에서 선택되는 유기산 또는 염, 유기산의 유도체 또는 복합체를 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 첨가함으로써, 세포의 성장 및/또는 생산성이 증가하고 그리고/또는 독성 대사 산물의 생성이 감소하는 것으로 밝혀졌다. 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 및 락트산을 포함하는 군에서 선택되는 유기산 또는 염 또는 유기산의 복합체가 본 발명에 따라 바람직하다.
본 발명에 따른 물질이 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 단독으로 첨가되거나, 서로 조합되거나, 탄수화물과 조합되거나, 탄수화물 없이 배지에 첨가될 경우, 특히 상기 물질이 글루타민을 함유하거나 글루타민을 함유하지 않는 배지에 첨가되거나, 글루타민 치환체를 함유하거나 글루타민 치환체를 함유하지 않거나, 고농도의 아스파라긴을 갖거나, 아스파라긴 치환체를 함유하거나, 고농도의 글루타메이트를 갖거나, 글루타메이트 치환체를 함유하는 배지에 사용될 경우, 본 발명의 상기 태양에 따라 발생하는 생산성 증가 및/또는 부산물의 생성 감소는 달성될 수 있다.
본 발명은 특허 청구항에 따른 영양 배지, 특히 세포 배양 배지, 세포 배양물 및 방법을 제공함으로써 그에 기초하는 기술적 과제를 해결한다.
특히, 본 발명은 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물의 배양을 위한 영양 배지, 특히 세포 배양 배지를 제공함으로써 그에 기초하는 기술적 과제를 해결하며, 여기서 영양 배지, 특히 세포 배양 배지는 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산과 이들의 혼합물 및 이들 산의 염, 유도체 또는 복합체를 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 함유한다. 본 발명에 따르면, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지는 바람직하게는 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산과 이들의 혼합물 및 이들 산의 염 또는 복합체를 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 함유한다.
본 발명에 따라 사용되는 산의 염은 특히 숙시네이트, 말레이트, α-케토-글루타레이트, 푸마레이트, 옥살아세테이트, 이소시트레이트, 옥살로숙시네이트, 타르트레이트, 아디페이트, 또는 락테이트를 의미한다. 시트르산의 염은 시트레이트를 의미한다.
본 발명에 따른 영양 배지, 특히 세포 배양 배지는 바람직하게는 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산과 이들의 혼합물 및 이들 산의 염 또는 복합체를 포함하는 군에서 선택되는 적어도 두 물질을 함유하며, 또한 상술한 산 중 하나 또는 그 이상은 염 또는 복합체의 형태일 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 군은 시트르산을 포함하도록 확장된다.
바람직하게는 영양 배지는 락트산을 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 락테이트를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 적어도 하나의 락트산 복합체를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 락트산 유도체를 함유한다.
바람직하게는 영양 배지는 락트산 유도체로서 알라닌 및/또는 적어도 하나의 알라닌-함유 펩티드를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 알라닌 및/또는 적어도 하나의 알라닌-함유 펩티드를 0.1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 락트산 유도체로서 피루베이트 및/또는 적어도 하나의 피루베이트 유도체를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 피루베이트 및/또는 적어도 하나의 피루베이트 유도체를 0.1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직한 태양에서 상세한 설명에 기재된 농도는 최종 농도이다. 바람직한 태양에서 상세한 설명에 기재된 농도는 각 물질의 전체 농도이다.
바람직하게는 영양 배지는 락트산, 락테이트, 적어도 하나의 락트산 복합체 및/또는 적어도 하나의 락트산 유도체를 0.1 g/ℓ 이상, 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 25 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직하게는 영양 배지는 숙신산을 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 숙시네이트를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 숙신산 유도체를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 숙시네이트 유도체를 함유한다.
본 발명의 바람직한 태양에서 영양 배지, 특히 세포 배양 배지는 본 발명에 따라 기재된 모든 산 또는 물질을 가지며, 산 대신에 대응하는 염 또는 복합체를 사용하는 것도 가능하다. 특히 이러한 조성에서, 특히 예를 들어 당화 경로 또는 에너지 대사 경로, 예를 들어 시트레이트 회로 또는 당 분해에서 차단 위치가 정확히 국부화될 수 없거나 세포가 배지에서 세포로, 그리고/또는 세포기관 사이의 세포 내부에서 대사 산물의 수송을 차단할 때, 대사적으로 차단된 세포를 배양하는 것이 가능하다. 따라서 바람직하게는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지는 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산 및 락트산을 함유하며, 또한 상술한 산 중 하나 또는 그 이상은 염 또는 복합체의 형태일 수 있다. 특히 바람직하게는, 상기 군은 시트르산을 포함하도록 확장된다. 본 발명에 따른 물질은 유기체의 장기간 배양, 특히 동물 세포의 배양, 특히 포유류 세포의 배양에 적합하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 본 발명에 따른 적어도 하나의 물질을 적어도 15 ㎎/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 30 ㎎/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 100 ㎎/ℓ, 특히 적어도 300 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 1000 ㎎/ℓ의 농도로 함유한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 본 발명에 따른 적어도 하나의 물질을 0.03 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 0.1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다. 더욱 바람직한 태양에서 본 발명에 따른 영양 배지는 피드 배지(feed medium)이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 피드 배지는 본 발명에 따른 적어도 하나의 물질을 0.2 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 매우 바람직하게는 25 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 적어도 100 g/ℓ의 농도로 함유한다.
바람직한 태양에서 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 적어도 하나의 탄수화물, 특히 바람직하게는 단당류 또는 이당류를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 하나의 탄수화물을 함유한다. 바람직하게는 탄수화물은 포도당, 갈락토스, 과당, 만노스, 리보스, 글루코사민, 자당, 유당 및 이들의 혼합물을 포함하는 군에서 선택된다.
바람직하게는 영양 배지는 적어도 하나의 탄수화물을 0.1 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 100 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직하게는 영양 배지는 갈락토스를 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 갈락토스와 제2탄수화물을 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 갈락토스를 0.1 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 100 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직하게는 영양 배지는 포도당을 100 g/ℓ 이하, 더욱 바람직하게는 25 g/ℓ 이하, 더욱 바람직하게는 5 g/ℓ 이하, 특히 바람직하게는 1 g/ℓ 이하, 가장 바람직하게는 0.1 g/ℓ 이하의 농도로 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 무포도당이다.
더욱 바람직한 태양에서 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지에는 탄수화물이 없다.
바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 글루타민을 8 mmol/ℓ 이하, 바람직하게는 5 mmol/ℓ 이하, 특히 바람직하게는 3 mmol/ℓ 이하, 가장 바람직하게는 2 mmol/ℓ 이하의 농도로 함유한다. 그러나, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지는 바람직하게는 무-글루타민일 수도 있다.
더욱 바람직한 변형 예에서 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 적어도 하나의 글루타민 유도체, 따라서 적어도 하나의 글루타민-함유 글루타민 치환체, 특히 바람직하게는 글루타민-함유 디펩티드를 함유한다. 바람작히게는 적어도 하나의 글루타민 유도체는 글루타민-함유 펩티드이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 글루타민 유도체를 30 ㎎/ℓ 이상, 바람직하게는 150 ㎎/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 750 ㎎/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 2000 ㎎/ℓ 이상의 전체 농도로 함유한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 글루타민 유도체를 0.05 g/ℓ 이상, 바람직하게는 0.2 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 0.8 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 3.2 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다. 그러나, 바람직한 변형 예에서 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에는 글루타민 유도체가 없을 수도 있다.
바람직하게는 영양 배지는 아스파라긴을 함유한다. 바람직하게는 영양 배지는 적어도 하나의 아스파라긴 치환체, 특히 적어도 하나의 아스파라긴 유도체를 함유한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 아스파라긴 또는 적어도 하나의 아스파라긴 치환체, 특히 바람직하게는 적어도 하나의 아스파라긴 유도체를 고농도로, 즉 0.05 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 0.15 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 0.3 g/ℓ 이상, 특히 0.6 g/ℓ 이상의 농도로, 특히 전체 농도로 함유한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 글루타메이트 또는 적어도 하나의 글루타메이트 치환체, 바람직하게는 적어도 하나의 글루타메이트 유도체를 고농도로, 즉 0.05 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 0.3 g/ℓ 이상, 특히 0.6 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
특히 바람직한 태양에서 본 발명은 락트산과 갈락토스 그리고 상술한 고농도의 아스파라긴을 함유하지만, 동시에 무-글루타민인 세포 배양 배지에 관련된다.
더욱 바람직한 태양에서 본 발명은 락트산, 갈락토스 및 아스파라긴을 상술한 고농도로 함유하고 동시에 무-글루타민이지만, 적어도 하나의 글루타민-함유 펩티드를 갖는 세포 배양 배지에 관련된다.
더욱 바람직한 태양에서 본 발명은 락트산과 갈락토스를 갖고, 또한 상기 농도로 고농도의 글루타메이트를 갖지만, 동시에 무-글루타민인 세포 배양 배지에 관련된다.
더욱 바람직한 태양에서 본 발명은 숙신산과 고농도의 아스파라긴 또는 상기 농도의 아스파라긴 치환체를 갖지만, 동시에 무-글루타민인 세포 배양 배지에 관련된다.
본 발명에 따르면 영양 배지는 바람직하게는 무-포도당 및 무-글루타민이고 아스파라긴을 0.05 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 0.3 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 0.6 g/ℓ 이상의 농도로, 그리고 락트산과 갈락토스를 함유한다. 본 발명에 따르면 영양 배지는 바람직하게는 무-포도당 및 무-글루타민이고 글루타메이트를 0.05 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 0.3 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 0.6 g/ℓ 이상의 농도로, 그리고 락트산과 갈락토스를 함유한다. 본 발명에 따르면 영양 배지는 바람직하게는 무-포도당이고 글루타민-함유 펩티드, 락트산 및 갈락토스를 함유한다.
더욱 바람직한 태양에서 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 피드 배지이다.
바람직하게는 피드 배지는 락트산, 락테이트, 적어도 하나의 락트산 복합체 및/또는 적어도 하나의 락트산 유도체를 1 g/ℓ 이상, 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 25 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 100 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직하게는 피드 배지는 갈락토스를 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 100 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 바람직하게는 피드 배지는 글루타민 유도체를 0.2 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 10 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 피드 배지는 아스파라긴 또는 적어도 하나의 아스파라긴 치환체, 특히 바람직하게는 적어도 하나의 아스파라긴 유도체를 0.2 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 2 g/ℓ 이상, 특히 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 10 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 피드 배지는 글루타메이트 또는 적어도 하나의 글루타메이트 치환체, 특히 바람직하게는 적어도 하나의 글루타메이트 유도체를 0.2 g/ℓ 이상, 바람직하게는 1 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 2 g/ℓ 이상, 특히 5 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 10 g/ℓ 이상의 농도로 함유한다.
바람직한 변형 예에서 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 기본 배지, 바람직하게는 240 내지 360 mOsmol/kg H2O의 오스몰랄 농도를 갖는 기본 배지이다. 바람직한 변형 예에서 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 기본 배지, 더욱 바람직하게는 280 내지 350 mOsmol/kg H2O의 오스몰랄 농도를 갖는 기본 배지, 가장 바람직하게는 280 내지 320 mOsmol/kg H2O의 오스몰랄 농도를 갖는 기본 배지이다.
더욱 바람직한 변형 예에서 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 피드 배지, 바람직하게는 150 내지 1500 mOsmol/kg H2O의 오스몰랄 농도를 갖는 피드 배지이다.
본 발명에 따르면, 영양 배지는 바람직하게는 무-혈청이다. 본 발명에 따르면, 영양 배지는 바람직하게는 혈청을 함유한다.
영양 배지는 특히 세포 배양 배지이다. 본 발명에 따르면, 영양 배지는 바람직하게는 액체 영양 배지, 특히 액체 세포 배양 배지이다.
이 분야의 당업자에게, 선택될 성분의 농도 범위, 또한 선택될 성분의 최대 농도는 영양 배지에서 기술한 성분의 농도에 대해 기술한 바람직한 최소 수치로부터 특별한 노력 없이 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용된 유기산의 농도는 바람직하게는 최대 200 g/ℓ, 특히 바람직하게는 100 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 50 g/ℓ, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ이다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용될 락테이트 및/또는 락트산 유도체, 특히 알라닌 및/또는 피루베이트의 농도는 바람직하게는 최대 200 g/ℓ, 특히 바람직하게는 100 g/ℓ, 특히 50 g/ℓ, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ이다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용될 글루타민 유도체의 농도는 바람직하게는 최대 60 g/ℓ, 특히 바람직하게는 30 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 10 g/ℓ, 매우 바람직하게는 5 g/ℓ, 특히 1.2 g/ℓ, 가장 바람직하게는 1.1 g/ℓ이다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용될 아스파라긴 또는 아스파라긴 유도체의 농도는 바람직하게는 최대 60 g/ℓ, 특히 바람직하게는 30 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 5 g/ℓ, 특히 1.2 g/ℓ, 가장 바람직하게는 1.1 g/ℓ이다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용될 글루타메이트 또는 글루타메이트 유도체의 농도는 바람직하게는 최대 60 g/ℓ, 특히 바람직하게는 30 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 5 g/ℓ, 특히 1.2 g/ℓ, 가장 바람직하게는 1.1 g/ℓ이다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용될 갈락토스의 농도는 바람직하게는 최대 200 g/ℓ, 특히 바람직하게는 100 g/ℓ, 특히 50 g/ℓ, 가장 바람직하게는 25 g/ℓ이다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물의 배양을 위한, 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 용도에 관련된다.
또한, 본 발명은 세포 또는 세포 배양물을 제공함으로써 그에 기초하는 기술적 과제를 해결한다. 본 발명에 따르면, 세포 또는 세포 배양물은 본 발명에 따른 배양 배지 및 방법으로 배양될 수 있을 정도로 바람직하게는 대사적으로 최적화된다.
본 발명에 따르면, 세포 또는 세포 배양물은 바람직하게는 세포 배양물이 본 발명에 따른 물질을 갖는 배지에서 생존할 수 있거나 분열할 수 있거나 최고 세포 밀도가 높거나, 정체 단계가 길거나, 사멸 단계가 느리거나, 세포-대사 부산물, 예를 들어 암모늄 또는 락테이트의 생성이 감소하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 락트산과 염(락테이트) 또는 락트산의 복합체, 또는 락트산 치환체의 염을 대사할 수 있는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 생존할 수 있고, 바람직하게는 분열할 수 있으며, 특히 바람직하게는 높은 생 세포의 적분(IVC)에 도달할 수 있고, 가장 바람직하게는 대사 부산물, 특히 락테이트 또는 암모늄을 적게 생산하는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 무-포도당 배지에서 생존할 수 있고, 바람직하게는 분열할 수 있으며, 특히 바람직하게는 높은 생 세포의 적분(IVC)에 도달할 수 있고, 가장 바람직하게는 대사 부산물, 특히 락테이트 또는 암모늄을 적게 생산하는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 생존할 수 있고, 락테이트를 대사할 수 있으며, 바람직하게는 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 분열할 수 있고, 특히 바람직하게는 높은 생 세포의 적분(IVC)에 도달할 수 있으며, 가장 바람직하게는 대사 부산물, 특히 락테이트 또는 암모늄을 적게 생산하는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 생존할 수 있고, 락테이트를 대사할 수 있으며 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 높은 아스파라긴 소모율을 갖고, 바람직하게는 이러한 배지에서 분열할 수 있으며, 특히 바람직하게는 높은 생 세포의 적분(IVC)에 도달할 수 있고, 가장 바람직하게는 대사 부산물, 특히 락테이트 또는 암모늄을 적게 생산하는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 생존할 수 있고, 락테이트를 대사할 수 있으며 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 높은 글루타메이트 소모율을 갖고, 바람직하게는 이러한 배지에서 분열할 수 있으며, 특히 바람직하게는 높은 생 세포의 적분(IVC)에 도달할 수 있고, 가장 바람직하게는 대사 부산물, 특히 락테이트 또는 암모늄을 적게 생산하는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 생존할 수 있고, 락테이트를 대사할 수 있으며 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 갈락토스를 대사할 수 있고, 바람직하게는 이러한 배지에서 분열할 수 있으며, 특히 바람직하게는 높은 생 세포의 적분(IVC)에 도달할 수 있고, 가장 바람직하게는 대사 부산물, 특히 락테이트 또는 암모늄을 적게 생산하는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 생존할 수 있고, 락테이트를 대사할 수 있으며 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 갈락토스를 대사할 수 있고, 높은 아스파라긴 소모율 또는 높은 글루타메이트 소모율을 가지며, 바람직하게는 이러한 배지에서 분열할 수 있고, 특히 바람직하게는 높은 생 세포의 적분(IVC)에 도달할 수 있으며, 가장 바람직하게는 대사 부산물, 특히 락테이트 또는 암모늄을 적게 생산하는 세포 또는 세포 배양물이 바람직하다.
또한, 본 발명은 세포 배양물이 영양 배지에 투입되고 배양되며 배양 시간 중 적어도 1/5 동안에 영양 배지의 pH 값이 pH 7.2 이상의 염기인, 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물의 배양을 위한 방법을 제공함으로써 그에 기초하는 기술적 과제를 해결한다.
또한, 본 발명은 세포 배양물이 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지에 투입되고 배양되는, 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물의 배양을 위한 방법을 제공함으로써 그에 기초하는 기술적 과제를 해결한다.
본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지에 투입되는, 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물은 바람직하게는 생물 산물의 생산을 위해 사용된다.
생물 산물은 바람직하게는 적어도 하나의 폴리펩티드, 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 바이러스 성분, 적어도 하나의 바이러스 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 특히 바람직하게는 생물 산물은 적어도 하나의 백신이다.
생물 산물은 바람직하게는 세포 배양물 및/또는 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지로부터 얻어진다.
바람직하게는 적어도 하나의 세포는 생물 산물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 함유한다.
본 발명에 따르면, 세포 배양물은 배지, 바람직하게는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에서 살아 있고, 바람직하게는 그 배지에서 분열하거나 세포 분열을 겪도록 유도되는 적어도 하나의 세포를 의미한다. 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 특히 바람직하게는 균류 세포, 특히 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포, 예를 들어 곤충 세포 또는 포유류 세포, 특히 인간 또는 설치류 세포, 햄스터 세포 또는 골수종 세포, 예를 들어 CHO, NS0, PERC6, HEK293 또는 BHK21 세포이다. 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포는 바람직하게는 상술한 세포 중 하나의 자손이다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포는 바람직하게는 세포주, 특히 불멸화된 세포주 및/또는 종양 세포주로부터 기원한다. 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포는 바람직하게는 1차 세포이다. 본 발명에 따른 세포의 예는 이후 설명된다.
본 발명에 따른 세포 배양물은 바람직하게는 세포 집단이다. 선택적으로는, 본 발명에 따른 세포 배양물은 바람직하게는 세포 클론이다. 본 발명에 따른 세포 배양물은 몇몇 세포 종류 또는 세포종을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 세포 배양물은 몇몇 세포 종류 또는 세포종으로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포 배양물은 바람직하게는 세포의 결합체로 구성되거나 세포의 결합체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 회분 방법, 분할-회분 방법, 유가 방법, 연속 방법 또는 관류 방법이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양의 말기에 영양 배지의 pH 값은 7.2 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 7.3 이상의 염기, 특히 바람직하게는 7.4 이상의 염기, 가장 바람직하게는 7.5 이상의 염기, 매우 특히 바람직하게는 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 7.7 이상의 염기이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양 시간 중 적어도 1/5 동안에, 더욱 바람직하게는 적어도 2/5 동안에, 가장 바람직하게는 적어도 3/5 동안에, 특히 적어도 4/5 동안에 영양 배지의 pH 값은 pH 7.2 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 7.3 이상의 염기, 특히 바람직하게는 7.4 이상의 염기, 가장 바람직하게는 7.5 이상의 염기, 매우 특히 바람직하게는 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 7.7 이상의 염기이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양 공정 중에 영양 배지의 pH 값은 pH 7.2 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 7.3 이상의 염기, 특히 바람직하게는 7.4 이상의 염기, 특히 바람직하게는 7.5 이상의 염기, 매우 특히 바람직하게는 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 7.7 이상의 염기이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양 공정 중에 영양 배지의 pH 값은 적어도 pH 6.6 내지 최대 pH 7.9, 더욱 바람직하게는 적어도 pH 6.7 내지 최대 pH 7.9, 가장 바람직하게는 적어도 pH 6.8 내지 최대 pH 7.9이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양 공정 중에 영양 배지의 pH 값은 적어도 pH 6.6 내지 최대 pH 7.5, 더욱 바람직하게는 적어도 pH 6.7 내지 최대 pH 7.5, 가장 바람직하게는 적어도 pH 6.8 내지 최대 pH 7.5이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양 공정 중에 영양 배지의 pH 값은 적어도 pH 6.6 내지 최대 pH 7.2, 더욱 바람직하게는 적어도 pH 6.7 내지 최대 pH 7.2, 가장 바람직하게는 적어도 pH 6.8 내지 최대 pH 7.2이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양 공정 중에 영양 배지의 pH 값은 pH 9.0 이상, 매우 바람직하게는 pH 8.5 이상, 더욱 바람직하게는 pH 8.0 이상, 특히 바람직하게는 pH 7.8 이상, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상이 되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법의 배양 공정 중에 pH 값은 pH 7.2 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.3 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.4 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 이상의 염기, 특히 바람직하게는 pH 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상의 염기이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법의 배양 공정 중에 본 발명에 따른 방법의 전체 배양 시간 중 적어도 4/5에서 pH 값은 pH 7.2 이상의 염기, 바람직하게는 pH 7.3 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.4 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 이상의 염기, 특히 바람직하게는 pH 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상의 염기이다. 본 발명에 따른 방법의 전체 배양 시간은 배양 용기가 생산 단계에서 세포로 접종될 때 시작된다. 따라서, 생산 단계를 위해 세포를 늘리는 세포 배양의 중간 단계는 전체 배양 시간에서 계산하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법의 배양 공정의 말기에 pH 값은 pH 7.2 이상의 염기, 바람직하게는 pH 7.3 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.4 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 이상의 염기, 특히 바람직하게는 pH 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상의 염기이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법의 pH 값은 최대 7.8, 더욱 바람직하게는 최대 8.0이다.
또한, 본 발명은 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산 및 이들의 혼합물 그리고 이들 산의 염, 유도체 또는 복합체를 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 물 또는 세포 배양 용매 또는 영양 배지 용매, 특히 세포 배양 배지 용매, 또는 통상의 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 녹이는, 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 제조 방법에 관련된다.
또한, 본 발명은 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산 및 이들의 혼합물 그리고 이들 산의 염 또는 복합체를 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 물 또는 세포 배양 용매 또는 영양 배지 용매, 특히 세포 배양 배지 용매, 또는 통상의 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 녹이는, 본 발명에 따른 영양 배지, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 제조 방법에 관련된다.
또한, 본 발명은 a) 세포 배양물을 본 발명에 따른 영양 배지에서 세포 집단으로서 적어도 1주일 동안 배양, 특히 바람직하게는 적어도 4주 동안 배양한 후, b) 세포를 분리하는, 세포 집단으로부터 유전적으로 변형된, 특히 대사적으로 최적화된 세포의 선택을 위해, 세포 배양물의 배양을 위한 본 발명에 따른 방법에 관련된다. 분리된 세포는 살아있는 세포이다. 본 발명에 따르면, 배양은 바람직하게는 본 발명에 따른 배양 방법에 따라 수행된다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 영양 배지에서 배양 중에, 유전적으로 변형된 신규 세포가 선택 및 분리될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 유전적 변형은 예를 들어 세포 대사의 변화, 특히 개선으로 나타난다. 특히, 변형된 세포 대사를 갖는 세포는 통상의 세포와 비교하여, 본 발명에 따른 배지에서 특히 잘 또는 어쨌든 성장한다. 변형된 세포 대사는 유전적 변형을 통해 일어난다. 따라서 본 발명에 따른 영양 배지에서 세포 집단을 배양함으로써 유전적으로 변형된 세포를 분리하는 것이 가능하다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, b) 단계에서 분리된 적어도 하나의 세포는 부가적인 c) 단계에서 새로운 배양 배지로 옮겨진다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 새로운 영양 배지는 신선한 영양 배지이다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 새로운 영양 배지는 본 발명에 따른 영양 배지이다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 새로운 영양 배지는 본 발명에 따른 영양 배지가 아니며, 즉 종래 상태의 영양 배지이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, b) 단계에서 분리된 적어도 하나의 세포는 c) 단계에서 증식한다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법을 수행할 때 영양 배지는 pH 7.2 이상의 염기, 바람직하게는 pH 7.3 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.4 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 이상의 염기, 특히 바람직하게는 pH 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상의 염기의 pH 값을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법을 수행할 때, 전체 배양 시간 중 적어도 4/5에서 영양 배지는 pH 7.2 이상의 염기, 바람직하게는 pH 7.3 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.4 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 이상의 염기, 특히 바람직하게는 pH 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상의 염기의 pH 값을 갖는다. 본 발명에 따른 방법의 전체 배양 시간은 배양 용기가 생산 단계에서 세포로 접종될 때 시작된다. 따라서, 생산 단계를 위해 세포를 늘리는 세포 배양의 중간 단계는 전체 배양 시간에서 계산하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양 공정의 말기에서 영양 배지는 pH 7.2 이상의 염기, 바람직하게는 pH 7.3 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.4 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.5 이상의 염기, 특히 바람직하게는 pH 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상의 염기의 pH 값을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, pH 값은 최대 7.8, 더욱 바람직하게는 최대 8.0이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포는 적어도 1계대, 특히 바람직하게는 적어도 2계대, 가장 바람직하게는 적어도 5계대 동안 계대 배양된다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포는 1:4 이상의 분할 비율이 도달될 때까지 계대 배양된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로부터 얻을 수 있는 선택된 세포에 관련된다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포는 탄소 원으로서 락테이트를 대사할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포는 유일한 탄소 원으로서 갈락토스를 이용하여 적어도 1:4의 분할 비율을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 세포는 적어도 1:4의 분할 비율을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포의 성장 속도(μ)는 24시간 이하, 특히 바람직하게는 20시간 이하, 특히 바람직하게는 18시간 이하이다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 세포를 함유하는 세포 배양물에 관련된다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포 배양물은 탄소 원으로서 락테이트를 대사할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포 배양물은 유일한 탄소 원으로서 갈락토스를 이용하여 적어도 1:4의 분할 비율을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 세포 배양물은 적어도 1:4의 분할 비율을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 분리된 세포 배양물의 성장 속도(μ)는 24시간 이하, 특히 바람직하게는 20시간 이하, 특히 바람직하게는 18시간 이하이다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포를 본 발명에 따른 방법에 의해 배양하고 생물 산물을 그로부터 얻는, 적어도 하나의 세포로부터 생물 산물을 얻는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 상기 태양에 따라 발견된 물질은 특히 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산 및 락트산이다. 본 발명에 따르면, 이 물질은 매우 바람직하게는 시트르산도 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 태양에 따라 필요한 물질은 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 특히 개별적으로 첨가될 수 있고, 바람직하게는 이들은 단독 또는 모두 함께 조합된다. 그러나, 다른 탄수화물과의 조합 또한 바람직하다. 적절한 탄수화물은 바람직하게는 포도당, 갈락토스, 글루코사민, 과당, 리보스, 만노스, 자당, 유당과 같은 단- 및 이당류 중에서 선택된다. 이들 탄수화물 중에서 하나 또는 그 이상이 탄수화물 원으로서 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 태양에 따라 필요한 물질은 글루타민을 함유하거나, 무-글루타민이거나, 저농도, 예를 들어 8 mM 이하의 글루타민을 함유하는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지, 또는 글루타민 치환체, 예를 들어 알라닐-글루타민 또는 글리실-글루타민을 함유할 수 있는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지, 또는 몇몇 글루타민-함유 펩티드의 혼합물을 함유할 수 있는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 태양에 따라 필요한 물질은 바람직하게는 아스파라긴 또는 아스파라긴 치환체를 함유하는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 사용될 수 있다. 아스파라긴 또는 아스파라긴 치환체의 농도는 바람직하게는 예를 들어 0.05 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 0.3 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 0.6 g/ℓ 이상일 수 있다. 아스파라긴 치환체는 바람직하게는 예를 들어 아스파라긴-함유 펩티드, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, Leu-Asn(Sigma, 카탈로그 번호: L0641), 또는 Ile-Asn(Sigma, 카탈로그 번호: I3635), 또는 Glu-Asn-Gly(Sigma, 카탈로그 번호: P5148)일 수 있다. 펩티드는 바람직하게는 기본적으로 2개의 아미노산 또는 2개 아미노산 이상, 특히 3개 또는 4개의 아미노산을 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 태양에 따라 필요한 물질은 바람직하게는 글루타메이트 또는 글루타메이트 치환체를 함유하는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 사용될 수 있다. 글루타메이트 또는 글루타메이트 치환체의 농도는 바람직하게는 예를 들어 0.05 g/ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 0.3 g/ℓ 이상, 가장 바람직하게는 0.6 g/ℓ 이상일 수 있다. 글루타메이트 치환체는 바람직하게는 예를 들어 글루타메이트-함유 펩티드, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, Asp-Glu(Sigma, 카탈로그 번호: A1916-250MG), Glu-Glu(Sigma, 카탈로그 번호: G3640-25MG), Glu-His(Sigma, 카탈로그 번호: G6882-100MG), Glu-Leu(Sigma, 카탈로그 번호: G7007-10MG), Glu-Lys(Sigma, 카탈로그 번호: G5136-25MG)일 수 있다. 펩티드는 바람직하게는 기본적으로 2개 아미노산 또는 2개 아미노산 이상, 특히 3개 또는 4개 아미노산을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질을 첨가함으로써 세포 성장이 개선되며, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에서 바람직하게는 본 발명에 따른 수계에서 공정시간, 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물의 세포 성장을 개선 또는 연장하기 위한 영양 배지, 세포 배양물 또는 방법을 제공함으로써 그에 기초하는 과제를 해결한다. 특히 본 발명은 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 유기산을 첨가함으로써 세포 성장이 개선되며, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에서 바람직하게는 본 발명에 따른 수계에서 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물의 큰 세포 성장을 얻거나, 세포 활력을 연장하거나, 대사 부산물의 생성을 감소하는 영양 배지, 세포 배양물 및 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 영양 배지는 바람직하게는 유기산 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 물질을 첨가함으로써, 세포 성장 및/또는 산물 생성이 증가하거나, 배양 시간이 연장되고 그리고/또는 대산 부산물의 생성이 감소한다.
본 발명에 따르면, 세포 배양물은 배지가 바람직하게는 저농도의 글루타민 또는 무 글루타민을 함유할 수 있고, 고농도의 아스파라긴을 함유할 수 있으며, 포도당 또는 다른 탄수화물을 함유할 수 있고, 특히 무-포도당이거나 갈락토스를 함유하며, 세포 배양물이 본 발명에 따른 물질을 갖는 배지에서 생존 또는 분열할 수 있거나 최고 세포 밀도가 증가하거나, 정체 단계가 길어지거나, 사멸 단계가 느리거나, 세포 대사 부산물, 예를 들어 암모늄 또는 락테이트의 생성이 감소하는 것을 특징으로 한다. 고농도의 아스파라긴 대신에, 바람직하게는 고농도의 글루타메이트가 함유될 수도 있다.
세포 성장은 본 발명에 따르면 적어도 하나의 세포의 적어도 하나의 세포 분열에 의해 주로 그러나 그 뿐만은 아니게 않게 야기되는 세포 배양물의 성장이다. 세포 성장이 증가하면, 이는 세포 분열의 회수(세포 성장 속도, 소위 μ) 증가에 의해 주로 야기된다.
세포 배양물의 정체 단계는 이 분야의 당업자에게 잘 알려진, 세포 배양물의 성장 곡선의 전형적인 성장 단계이다. 이 성장 곡선은 지연 단계, 지수 성장 단계(대수 증식 단계), 정체 단계 및 사멸 단계를 포함한다. 이들 단계의 진행 과정은 변할 수 있다. 이들 단계의 진행 과정과 지속 시간은 예를 들어 본 발명에 따른 물질을 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 첨가함으로써 영향을 받을 수 있다.
"생 세포 농도의 적분"은 특정된 시간에 걸친 생 세포 농도를 의미한다(Renard, J.M., 등, Biotechnology Letters, 1988, 10(2): 91-96). 따라서 생 세포 농도의 적분은 공정의 지속 시간 동안, 특히 세포 배양의 지속 시간 동안 모든 살아있는 세포의 수이다. 생 세포 농도의 적분은 세포의 수 또는 공정의 지속 시간에 의해 변경될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 생 세포 농도의 적분은 본 발명에 따른 영양 배지 또는 방법에 의해 증가한다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포 성장이 개선되거나 최고 세포 밀도가 증가하거나, 정체 단계가 길어지거나 사멸 단계가 느려지거나, 세포 대사의 부산물, 예를 들어 암모늄 또는 락테이트의 생성이 감소한다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 회분 방법, 분할-회분 방법(반복 회분 운전), 유가 방법, 연속 방법 또는 관류 방법이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 방법에서 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포 배양물은 생물 산물의 생산을 위해 사용된다. 본 발명에 따르면, 생물 산물은 바람직하게는 적어도 하나의 폴리펩티드, 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 바이러스 성분, 적어도 하나의 바이러스 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 본 발명에 따르면, 생물 산물은 바람직하게는 적어도 하나의 백신이다.
원하는 생물 공학 산물, 특히 폴리펩티드, 단백질 또는 백신의 생산을 위해, 산물에 따라 원핵 세포, 예를 들어 박테리아, 또는 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포 또는 식물 세포, 특히 동물 세포, 바람직하게는 포유류 세포가 사용된다. 생산될 산물의 유전자는 자연적으로 또는 숙주 세포에서 재조합 수단에 의해 발생할 수 있다. 산물 범위는 몇 개의 아미노산을 갖는 펩티드부터 전체 바이러스까지 변할 수 있다. 번역 후공정에서 번역이 변경된 후, 특히 당화된 복합 단백질의 경우에서 특히, 바람직하게는 동물 세포가 사용된다. 또 다른 변형 예에서 다른 진핵 세포, 예를 들어 효모의 사용도 관찰된다.
본 발명에 따르면, 생물 산물은 바람직하게는 세포 배양물 및/또는 세포 배양물 상등액, 또는 세포 자체(세포 내부적으로)로부터 얻어진다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 생물 산물은 세포 그 자체일 수 있고, 예를 들어 1차 세포, 줄기 세포, 1차 세포의 결합체, 조직 성분, 또는 완전한 조직일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포는 생물 산물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 함유한다. 유전자는 외래 유전자, 즉 생산 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 유전자일 수 있으며 또는 유전자는 생산 세포에서 자연적으로 발생하는 세포-특이적 유전자일 수 있다. 세포-특이적 유전자는 예를 들어 생산 세포에서 활성적으로 또는 불활성적으로 존재할 수 있다. 세포-특이적 유전자가 불활성되었을 때, 유전자는 외부 개입을 통해 활성화될 수 있다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포를 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에서 배양하고, 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 세포 성장을 본 발명에 따른 방법에 의해 자극하는, 세포 배양물로서 적어도 하나의 세포의 배양을 위한 방법이 또한 제공된다.
본 발명에 따르면, 적어도 하나의 세포를 본 발명에 따른 방법에 의해 배양하고 생물 산물을 그로부터 얻는, 적어도 하나의 세포로부터 생물 산물을 얻는 방법이 또한 제공된다.
놀랍게도, 이들 특정의 유기산(시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산)은 특히 고농도로 사용될 때, 세포 성장 및/또는 폴리펩티드 생산을 촉진하고 그리고/또는 대사 부산물의 생성을 억제한다. 특히, 이들 성분은 무-글루타민 또는 저농도의 글루타민 영양 배지에 사용되거나, 고농도의 아스파라긴 또는 아스파라긴 치환체를 갖는 배지에 사용되거나, 고농도의 글루타메이트 또는 글루타민 치환체를 갖는 배지에 사용되거나, 포도당을 갖거나 갖지 않는 배지에 사용되거나, 갈락토스와 함께 사용된다. 이와 관련하여 본 발명은 EP 0 435 911 B1에 따른 교시와 다르다. 인용된 특허 명세서에서는 배지에서 고농도(8 mM 이상)의 글루타민을 사용하는 것이 제안된 반면에, 본 발명은 바람직하게는 감소한 글루타민 농도, 특히 무-글루타민 영양 배지를 청구한다.
EP 0 435 911 B1(8쪽, 14줄 및 14쪽)에서, 숙시네이트, 말레이트, α-케토-글루타레이트, 푸마레이트 및 시트레이트 성분이 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에서 금속 이온에 대한 킬레이트제로서 시험되었다. 수행된 실험에 기초하여, 시트레이트가 금속 이온에 대한 좋은 킬레이트제인 것이 밝혀졌다(22쪽, 청구항 5). 시트레이트 이외에, 시험된 다른 유기산은 만족할만한 결과를 나타낸 것으로 보이지 않았다. EP 0 435 911 B1에서, 목적은 좋은 금속 킬레이트제를 발견하는 것이므로, 시험된 유기산의 매우 저농도가 사용되었다(말레이트=10.7 ㎎/ℓ, α-케토-글루타레이트=5.9 ㎎/ℓ, 숙시네이트=0.96 ㎎/ℓ, 푸마레이트=0.88 ㎎/ℓ). 또한, EP 0 435 911 B1에서 이들 물질은 명백하게 8 mM 이상의 글루타민 농도를 갖는 배지에 사용되며, 그것은 그 명세서의 발명이기 때문이다. EP 0 435 911 B1과 본 발명의 교시 사이의 또 다른 차이점은 본 발명에 따른 물질이 대사의 조절자로서 사용된 것이다. 이와 관련하여, 물질은 바람직하게는 탄수화물 및/또는 글루타민을 함유하는 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 사용될 수 있다. 그러나, 유기산은 또한 바람직하게는 어떠한 탄수화물도 함유하지 않고 그리고/또는 어떠한 글루타민도 함유하지 않은 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 사용될 수 있다. EP 0 435 911 B1에서 세포의 주요 에너지 및 탄소 원은 포도당과 글루타민이어서, 저농도의 물질은 대사 조절자로서 중요하지 않다.
놀랍게도, 실제로 세포의 가장 잘 알려진 대사 부산물 중 하나, 즉 락테이트가 세포 성장 및 생 세포 농도의 적분을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 락테이트가 대사 부산물이고 세포에 유독하다고 수많은 연구에서 기술되었다. 놀랍게도, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지가 글루타민을 함유하지 않거나 저농도의 글루타민을 함유할 때, 예를 들어 8 mM 이하의 글루타민 농도를 함유할 때, 또는 글루타민이 글루타민-함유 글루타민 치환체로 대체되었을 때, 또는 배지가 아스파라긴을 함유할 때, 특히 아스파라긴이 고농도로 존재할 때, 예를 들어 아스파라긴 농도가 0.3 g/ℓ 이상일 때, 또는 아스파라긴이 아스파라긴-함유 치환체로 대체되었을 때, 또는 배지가 글루타메이트를 함유할 때, 특히 글루타메이트 농도가 0.3 g/ℓ 이상일 때, 또는 글루타메이트가 글루타메이트-함유 치환체로 대체되었을 때, 또는 배지가 포도당을 갖거나 갖지 않도록 조성되었을 때, 특히 배지가 무-포도당일 때, 특히 배지가 갈락토스를 함유할 때, 락테이트가 세포 성장에 긍정적인 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 락테이트의 긍정적인 효과는 배지가 어떠한 글루타민을 함유하지 않고 탄소 원으로서 포도당 이외의 다른 탄수화물을 함유할 때, 특히 배지가 갈락토스를 함유할 때 특히 분명하다.
따라서 본 발명의 바람직한 태양은 유기체가 적절한 배지에서 배양되고 원하는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 백신이 유기체 및/또는 배양 상등액으로부터 얻어질 경우, 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산 및 이들의 혼합물 그리고 이들 산의 염 또는 복합체를 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 첨가함으로써 세포 성장이 자극되는 것을 특징으로 하는, 세포의 배양을 위한, 또는 유기체, 특히 세포 또는 세포 배양물, 바람직하게는 진핵 세포 또는 세포 배양물로부터 폴리펩티드, 단백질 또는 백신(예를 들어 바이러스)을 얻기 위한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 관련된다.
본 발명의 제2의 바람직한 태양은 유기체가 적절한 배지에서 배양되고 원하는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 백신이 유기체 및/또는 배양 상등액으로부터 얻어질 경우, 유기체가 시트르산, 숙신산, 말산, α-케토-글루타르산, 푸마르산, 옥살아세트산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 타르타르산, 아디프산, 락트산 및 이들의 혼합물 그리고 이들 산의 염 또는 복합체 중 적어도 하나의 물질을 함유하는 영양 배지와 접촉하는 것을 특징으로 하는, 세포의 배양을 위한, 또는 유기체, 특히 세포 또는 세포 배양물, 바람직하게는 진핵 세포 또는 세포 배양물로부터 폴리펩티드, 단백질 또는 백신(예를 들어 바이러스)을 얻기 위한 방법에 관련된다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지가 낮은 글루타민 함량, 예를 들어 8 mM 이하, 바람직하게는 5 mM 이하, 특히 바람직하게는 3 mM 이하, 가장 바람직하게는 2 mM 이하의 글루타민 농도를 갖기 때문에 달성된다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지 및/또는 피드 배지가 무-글루타민이기 때문에 달성된다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지가 글루타민-함유 글루타민 치환체를 함유하기 때문에 달성된다. 영양 배지에서 글루타민-함유 글루타민 치환체의 농도는 바람직하게는 적어도 50 ㎎/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 250 ㎎/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 500 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 1000 ㎎/ℓ이다. 또한, 영양 배지에서 글루타민-함유 글루타민 치환체의 농도는 바람직하게는 적어도 0.05 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 0.2 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 0.8 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 3.2 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지가 아스파라긴 또는 아스파라긴 치환체를 함유하기 때문에 달성된다. 영양 배지에서 아스파라긴 또는 아스파라긴 치환체의 농도는 바람직하게는 적어도 0.05 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 0.15 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 0.3 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 0.6 g/ℓ이다. 본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지가 글루타메이트 또는 글루타메이트 치환체를 함유하기 때문에 달성된다. 영양 배지에서 글루타메이트 또는 글루타메이트 치환체의 농도는 바람직하게는 적어도 0.05 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 0.15 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 0.3 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 0.6 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지가 무-포도당이기 때문에 달성된다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지가 갈락토스를 함유하기 때문에 달성된다. 갈락토스 농도는 적어도 0.1 g/ℓ, 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 25 g/ℓ이다. 본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지가 락테이트를 함유하기 때문에 달성된다. 락테이트 농도는 적어도 0.1 g/ℓ, 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 25 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 영양 배지 및/또는 피드 배지에 글루타민 또는 글루타민-함유 치환체가 없기 때문에 달성된다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 피드 배지가 글루타민-함유 글루타민 치환체를 함유하기 때문에 달성된다. 피드 배지에서 글루타민-함유 글루타민 치환체의 농도는 바람직하게는 적어도 0.2 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 10 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 피드 배지가 아스파라긴 또는 아스파라긴 치환체를 함유하기 때문에 달성된다. 피드 배지에서 아스파라긴 또는 아스파라긴 치환체의 농도는 바람직하게는 적어도 0.2 g/ℓ, 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 10 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 피드 배지가 글루타메이트 또는 글루타메이트 치환체를 함유하기 때문에 달성된다. 피드 배지에서 글루타메이트 또는 글루타메이트 치환체의 농도는 바람직하게는 적어도 0.2 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 10 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 피드 배지가 락테이트 또는 락테이트 유도체를 함유하기 때문에 달성된다. 피드 배지에서 락테이트 또는 락테이트 유도체의 농도는 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 25 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 100 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 피드 배지가 무-포도당이기 때문에 달성된다. 피드 배지에서 포도당 농도는 바람직하게는 최대 100 g/ℓ, 바람직하게는 최대 25 g/ℓ, 특히 바람직하게는 최대 5 g/ℓ, 가장 바람직하게는 최대 1 g/ℓ이다.
본 발명의 상기 태양에 따라 특히 바람직한, 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 상술한 물질의 첨가를 통한 성장 자극은 피드 배지가 갈락토스를 함유하기 때문에 달성된다. 피드 배지에서 갈락토스 농도는 바람직하게는 적어도 1 g/ℓ, 바람직하게는 적어도 5 g/ℓ, 특히 바람직하게는 적어도 25 g/ℓ, 가장 바람직하게는 적어도 100 g/ℓ이다.
본 발명의 제3태양은 세포 배양물이 본 발명에 따른 물질을 갖는 배지에서 생존할 수 있거나 분열할 수 있거나 최고 세포 밀도가 증가하거나, 또는 정체 단계가 길어지거나 사멸 단계가 느려지거나, 또는 세포 대사의 부산물, 예를 들어 암모늄 또는 락테이트의 생성이 감소하는 것을 특징으로 하는, 세포 또는 세포 배양물에 관련된다.
본 발명에 따른 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 본 발명에 따른 물질의 첨가를 통한 성장의 자극으로 인해, 바람직하게는 고-세포-밀도 발효(발효 중에 도달되는 최고 총 세포 농도가 대규모 조건(작업 부피 ＞1 ℓ, 예를 들어 30-20000 ℓ)에서 예를 들어 특히 ＞1×105 세포/㎖, 바람직하게는 ＞1×106 세포/㎖)에서 최고 세포 밀도가 증가할 수 있거나, 정체 단계가 길어질 수 있는 동시에, 세포 활력은 오래동안 높게 남고, 즉 생 세포 농도의 적분이 증가하고 따라서 산물 수율이 증가한다.
본 발명에 따른 방법은 기본적으로 폴리펩티드, 단백질 또는 백신의 생산, 예를 들어 바이러스 생산에 적합하다. 그러나, 당화될 수 있거나 당화될 수 없는 폴리펩티드가 바람직하다. 폴리펩티드는 예를 들어 천연, 인간 폴리펩티드 또는 인간 폴리펩티드의 재조합 변형체일 수 있다.
본 발명에 따른 영양 배지는 바람직하게는 번역 후 수식을 갖는 폴리펩티드의 생산, 특히 당단백질의 생산에 적합하다. 영양 배지, 특히 세포 배양 배지에 본 발명에 따른 물질의 첨가는 특정한 당화 경로를 촉진 또는 억제할 수 있고 따라서 원하는 폴리펩티드 또는 백신의 원하는 당 구조의 생성에 유리할 수 있다. 본 발명에 따른 물질은 개별적으로 또는 서로 조합하여, 세포에서 특정한 번역 후 수식을 촉진 또는 억제할 수 있으며, 그 결과 원하는 폴리펩티드 변형체 또는 백신 변형체가 생산 시에 발현된다. 예를 들어 본 발명에 따른 물질은 단백질 시알화 또는 단백질 갈락토스화를 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 물질과 영양 배지의 사용을 통해, 세포 배양 공정의 pH 값 변화는 요구된 값의 상단에서 매우 비전형적이다. 세포 배양 공정에서 공정의 pH 값은 pH 7.0 내지 pH 7.1로 시작되고, 세포가 대사 활동의 결과로서 산, 특히 락테이트를 배양물로 분비하는 것이 보통이다. 따라서 정상적으로 산 영역 쪽으로 배양물의 pH 값의 변화가 있다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 세포 배양 공정을 이용할 때 세포의 변경된 대사 때문에 pH 값이 염기성 pH 값으로 변하는 것으로 밝혀졌다. 이론에 얽매임이 없이, 이는 세포가 더 나은 대사를 갖고 더 이상 배양물로 산을 분비하지 않는 사실과 관련될 수 있다. 거꾸로 말하면, 이들은 산을 대사한다. 이것은 본 발명에 따른 물질과 방법으로 인해 세포가 다른 대사를 갖는다는 증거이다. 그 결과, 배양물의 pH 값은 7.2 이상의 pH 값에 있다(pH 7.2 이상 또는 pH 7.2 이상의 염기). 이는 단백질 당화, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질 갈락토스화 또는 단백질 시알화에 이롭다. 어떤 세포 내 당화 효소는 7.2 이상의 염기성 pH 값에서 더 활성적이서, 단백질의 더 많은 당화가 일어나도록 한다. 이것은 중요한 공정 특성으로, 본 발명에 따른 물질의 대사에 기인한다.
따라서 본 발명의 제4태양은 세포 배양 공정의 pH 값이 바람직하게는 pH 7.2 이상의 염기, 특히 pH 7.3 이상의 염기, 더욱 바람직하게는 pH 7.4 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.5 이상의 염기, 매우 바람직하게는 pH 7.6 이상의 염기, 가장 바람직하게는 pH 7.7 이상의 염기인, 상술한 배양 배지를 이용한 배양 방법이다.
본 발명에 따른 방법은 원핵 세포, 예를 들어 박테리아, 또는 진핵 세포, 예를 들어 효모 또는 동물 세포의 배양에 기본적으로 적합하다. "동물 세포"란 말은 비포유류 세포와 포유류 세포를 포함한다. 비포유류 세포의 예는 스포도프테라 프루지페르다(밤나방과), 에이디즈 애집티(이집트 숲 모기), 에이디즈 알보픽투스(흰줄 숲 모기)의 세포이다. 그러나, 본 발명에 대한 바람직한 유기체는 포유류 세포이다. 포유류 세포는 1차 세포일 수 있지만, 영구 세포주가 바람직하다. 적절한 영구 세포주는 예를 들어 인간 유래, 예를 들어 PER-C6, 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 자궁경부암 세포(HeLa, ATCC CCL 2)일 수 있다. 그러나, 영구 세포주는 또한 동물 유래, 예를 들어 마우스 또는 햄스터 유래, 예를 들어 SV-40 불멸화 원숭이 신장 세포(COS-7, ATCC CRL 1651), 개과 신장 세포(MDCK), 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-DG44, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77: 4216, 또는 CHO-DUKX, 또는 ATCC CCL 61의 ATCC-번호를 갖는 CHO-K1), 림프구 세포(Jurkat T-세포주), 버펄로 쥐 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442), 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL 51), SP2/0 세포, 골수종 세포(예를 들어 NS0), 잡종 세포 및 트리오마 세포일 수 있다. 잡종 세포주는 인간과 마우스를 포함하여 어떠한 종에서도 유래할 수 있다. 상술한 세포의 자손 또한 본 발명에 따른 영양 배지와 본 발명에 따른 방법에서 배양에 적합하다.
그러나, 본 발명에 따라 바람직한 세포는 포유류 세포주이고 잡종 세포가 아니다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 세포주는 CHO, NS0, PERC-6 및 BHK-21 세포주의 모든 변형체이며, 세포주는 외인성 핵산으로 형질 변환되고, 외인성 핵산은 중요한 폴리펩티드를 암호화한다. "외인성 핵산"은 숙주 세포에는 존재하지 않는 핵산 서열을 의미한다. 외인성 핵산은 또한 숙주 세포의 핵산과 일치할 수 있지만, 숙주 세포에서 이 위치에서는 정상적으로 발생하지 않는다.
본 발명에 따라 바람직한 세포는 본 발명에 따른 물질을 갖는 배지 및 방법에서 생존 또는 분열할 수 있거나 최고 세포 밀도가 증가하거나, 또는 정체 단계가 길어지거나 사멸 단계가 느려지거나, 또는 세포 대사의 부산물, 예를 암모늄 또는 락테이트의 생성이 감소한다. 세포의 대사는 본 발명에 따른 물질을 갖는 배지 또는 본 발명에 따른 방법에서 적응될 수 있다. 이 적응은 세포의 표적화된 분자-생물학적 변경을 통해 또는 본 발명에 따른 배지와 방법에서 세포의 적응을 통해 일어날 수 있다.
"클론"이란 말은 부모 세포, 예를 들어 위에서 열거한 세포주 중 하나의 자손을 의미한다. 클론은 세포가 다른 세포 성질을 소유하고 그래서 원래 부모 세포와는 다를 때 발생할 수 있다. 일반적으로 클론은 부모 세포의 유전자 도입 후, 예를 들어 형질감염(transfection)을 통해 발생할 수 있다.
"대사 최적화"란 말은 원하는 조건으로 세포 대사의 적응 또는 변화를 의미한다. 세포 대사의 적응 또는 변화는 숙주 세포에서 표적화된 유전자 개입을 통해, 특정 유전자를 세포에 클론화하거나, 특정 유전자를 스위치-오프시켜 달성될 수 있다. 세포가 원하는 공정 조건 및/또는 영양 배지에서 배양될 때 세포 대사의 적응 또는 변화가 달성될 수 없다면, 세포는 스스로 변경된 조건에 적응한다. 새로운 조건에서의 배양을 통해, 선택되고 분리될 수 있으며, 유전적으로 변형된 신규 세포가 발생할 수 있다. 유전자 변형은 예를 들어 세포 대사의 변화, 특히 개선으로서 나타난다. 특히, 변경된 세포 대사를 갖는 세포는 그들의 대사가 최적화되었기 때문에, 원하는 조건에서 통상의 세포와 비교하여 특히 잘 성장한다.
본 발명에 따른 산물은 세포에서 발현되고 배양 시스템, 즉 세포 및/또는 세포 배지로부터 채취되는 폴리펩티드, 단백질 또는 바이러스이다. 그것은 중요한 어떠한 단백질일 수 있다. 그것은 예를 들어 항체 또는 항체 단편뿐만 아니라, 인터루킨, 효소, 다중 결합 단백질 또는 다중 결합 단백질의 서브유닛과 같은 진단 또는 치료 단백질일 수 있다. 중요한 단백질에 대한 재조합 유전자는 숙주 세포로부터 중요한 단백질의 분리에 원인이 되는 신호 서열을 함유할 수 있다. 단백질은 잡종 세포에서 유전자 도입 촉진제 또는 그의 자연적 활성 유전자 좌, 및 면역 글로불린 항체 유전자 좌로부터 발현될 수 있다. 단백질은 또한 숙주-특이적 촉진제로부터 발현될 수 있으며, 예를 들어 CHO 세포가 단백질 생산에 사용될 때, CHO 촉진제로부터 외래 유전자가 발현될 수 있다. 그러나, 산물은 또한 숙주 세포의 도움으로 복제 가능한 백신, 예를 들어 바이러스 또는 바이러스-유사 입자일 수 있다.
배양될 세포는 미세 담체에 부착할 수 있거나 성장할 수지만, 세포가 현탁액에서 성장하는 것이 바람직하다. 또한, 세포는 혈청-함유 배양 배지(예를 들어 태아 소 혈청, FBS, 또한 FCS라 불림)에서 성장할 수 있지만, 혈청을 함유하지 않는, 즉 "무-혈청" 배지가 바람직하다. 무-혈청 배지에서 세포는 최적 성장을 위해 인슐린과 트랜스페린을 필요로 할 수 있다. 트랜스페린은 적어도 부분적으로 대체물, 예를 들어 철 시트레이트로 대체될 수 있다. 대부분의 세포주는 성장 인자로서 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 하나 또는 그 이상의 성장 인자를 필요로 한다. 배지는 폴리펩티드를 함유할 수 있지만, 저-폴리펩티드 또는 무-폴리펩티드 또는 무-단백질 배지가 바람직하다. 배지가 폴리펩티드를 함유할 때, 재조합 수단에 의해 생산된 폴리펩티드가 바람직하다. 배지는 동물 유래일 수 있는 펩톤을 함유할 수 있지만, 효모 유래의 펩톤이 바람직하고, 식물 유래의 펩톤이 특히 바람직하다. 무-펩톤 및 완전히 화학적으로 특정된 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
이 분야의 당업자에게 "배양 배지" 또는 "세포 배양 배지"로도 알려진, "영양 배지"는 세포 배양물 또는 적어도 하나의 세포의 저장 및/또는 배양에 사용되는 배지를 의미한다. 배양액으로도 불리는 액체 영양 배지는 본 발명에 따른 영양 배지로서 바람직하다. "영양 배지"란 말은 여기서 모든 배지에 대한 일반적인 말로 사용된다. 영양 배지는 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, "기본 배지", "피드 배지" 및 "관류 배지"란 말을 포함한다. 따라서 영양 배지는 세포를 위한 영양물을 함유하는 유체이다. 본 발명에 따른 물질은 영양 배지에서 다른 세포 영양물과 함께 존재할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 물질이 영양 배지에 존재하지 않고, 대신에 다른 용액, 예를 들어 스톡 용액으로부터 배양물 외부의 세포가 있거나 없는 영양 배지에 첨가되는 것이 가능하다. 이런 식으로 본 발명에 따른 물질은 영양 배지, 특히 세포 배양 배지를 통해 직접 세포와 접촉하지 않고 간접적으로 접촉한다. 그러한 면에서 세포를 본 발명에 따른 물질과 접촉시키는 방법 또한 본 발명의 일부이다. "영양 배지", "배양 배지" 또는 "기본 배지"는 세포 성장 및/또는 세포 활력 및/또는 산물 생성을 촉진하는 배지 특히 배양액을 의미한다. 배양 배지는 바람직하게는 액체이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르면, 배양의 특정 기간에서 적어도 1×105/㎖, 바람직하게는 적어도 1×106/㎖의 생 세포 농도에 도달하기 위해 필요한 영양물을 동물 세포의 집단에 공급하도록, 고-세포-밀도 세포 배양 배지가 사용된다. 이러한 고 세포 밀도에 영양물을 공급하는 배양 배지는 예를 들어 다음의 물질로 보충된다: 적어도 하나의 아미노산, 통상적으로 몇몇 아미노산 및 시스틴을 포함하는 모든 아미노산; 적어도 하나의 에너지원, 통상적으로 탄수화물 원, 예를 들어 포도당, 무기 염, 비타민, 예를 들어 비타민 C 및/또는 비타민 E; 마이크로 몰 농도로 존재하는 무기 성분으로 특정되는 미량 원소; 4개의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 산화방지제 및 글루타티온에 이르는 완충제; 지질, 예를 들어 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 또는 지질 전구체 예를 들어 콜린 또는 이노시톨. 고-세포-밀도 배지는 바람직하게는 그에 첨가되는 위에서 열거한 성분 중 적어도 하나를 갖고, 위에서 열거한 성분을 고농도로 함유할 수 있다.
영양 배지, 특히 세포 배양 배지는 선택적으로는 다음 종류 중 하나 또는 그 이상 또는 모든 성분으로 보충될 수 있다:
a) 호르몬 및 다른 성장 인자, 예를 들어 IGF-1, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자
b) 염 및 완충제, 예를 들어 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트
c) 뉴클레오시드 및 염기, 예를 들어 아데노신, 티미딘, 하이포크산틴
d) 단백질 및 조직 가수 분해물
본 발명에 따른 물질이 첨가될 수 있는 배양 배지의 조성은 바람직하게는 공개된 조성 중 하나에 해당할 수 있다. 배지의 조성은 바람직하게는 공개된 방식으로 사용될 수 있지만, 이는 자주 변경되고 사용된 세포의 요건에 적응된다. 배양 배지의 적절한 공개된 조성의 예는: 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지, L-15 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 이글 최소 필수 배지(MEM), 햄 F12 배지, 또는 이스코브 변형 DMEM이다. 이 공개된 배지 조성은 기본 배지 분말로서 단독 또는 일정 비율로 혼합될 수 있다. 본 발명에 따른 물질이 첨가될 수 있는 배양 배지의 조성은 특히 바람직하게는 그 처방이 공개되지 않은 상업용 영양 배지, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, GIBCO의 CD-CHO 배지, Sigma의 Ex-Cell 325 PF CHO 배지(Cat. No.: 14340C)일 수 있다.
"피드 배지(feed medium)"는 세포 배양 중 배양 시스템에 첨가되는 배지이며, 즉 피드 배지는 세포가 다른 배지, 예를 들어 배양 배지(기본 배지)와 접촉한 후 배양 시스템에 첨가된다. 피드 배지는 세포 성장 및/또는 세포 활력 및/또는 산물 생성을 촉진하는 물질을 함유한다. 피드 배지를 첨가함으로써, 세포 활력이 오랫동안 높게 남을 수 있기 때문에, 공정 시간은 연장될 수 있다. 피드 배지는 하나 또는 그 이상의 에너지원, 예를 들어 탄수화물, 예를 들어 포도당을 함유할 수 있다. 포도당은 피드 배지에 함유될 수 있거나 다른 스톡 용액으로부터 배양 시스템으로 따로 공급될 수 있다. 피드 배지는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 함유할 수 있다. 피드 배지는 필수 아미노산 단독 또는 비필수 아미노산 단독, 또는 이 2개 군의 아미노산의 혼합물을 함유할 수 있다. 피드 배지는 글루타민을 함유할 수 있거나, 무-글루타민일 수 있거나 글루타민 치환체를 함유할 수 있거나, 글루타민-함유 글루타민 치환체를 함유할 수 있거나 글루타민과 글루타민-함유 글루타민 치환체의 혼합물을 함유할 수 있다. 따라서 글루타민은 다른 물질과 함께 피드 배지에 조합될 수 있거나, 단일 물질로서 스톡 용액으로부터 배양 시스템으로 따로 공급될 수 있다. 피드 배지는 기본 배지의 1배 농축물일 수 있지만, 기본 배지의 1배 이상으로 농축된, 예를 들어 2배 또는 고도로 농축된 형태인 피드 배지가 바람직하다. 피드 배지 처방은 기본 배지 처방과 유사하며, 즉 일반적으로 피드 배지는 기본 배지에 존재하는 물질의 동일 또는 일정 비율을 함유한다. 피드 배지는 무기 성분에 있어서 기본 배지와 다를 수 있다. 이들은 예를 들어 염이 없는 기본 배지, 또는 기본 배지의 저-염 변형체일 수 있다. 그러나, 피드 배지는 또한 기본 배지 처방에 존재하지 않는 물질을 포함할 수 있다.
"글루타민-함유 물질", "글루타민 유도체" 또는 "글루타민-함유 글루타민 치환체"는 분자에서 D- 또는 L-글루타민, 특히 L-글루타민을 함유하는 물질을 의미한다. 이 분자는 매우 다양한 방식으로 D- 또는 L-글루타민을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 글루타민은 다른 물질과 공유 결합할 수 있다. 특히, "글루타민-함유 물질", "글루타민 유도체" 또는 "글루타민-함유 글루타민 치환체"는 D- 또는 L-글루타민으로부터의 펩티드 또는 올리고펩티드를 의미한다(Roth, E. 등, In vitro cellular & developmental biology, 1988, 24(7): 696-698). 예를 들어, 글루타민은 글루타민-계 디펩티드, 예를 들어 알라닐-글루타민(Ala-Gln) 또는 글리실-글루타민(Gly-Gln)으로 대체될 수 있다(Christie, A. 및 Butler, M., Journal of Biotechnology, 1994, 37(3): 277-90; Sanfeliu, A. 및 Stephanopoulus, G., Biotechnol. and Bioeng., 1999, 64(1): 46-53; Kurano, N., 등, J. Biotechnology, 1990, 15: 113-128). "글루타민-함유 물질"이란 말은 WO 03/106661에서도 기술되었다(7쪽, 1줄).
"아스파라긴 치환체", "아스파라긴 유도체" 또는 "아스파라긴-함유 아스파라긴 치환체"는 분자에서 D- 또는 L-아스파라긴, 특히 L-아스파라긴을 함유하는 물질을 의미한다. 이 분자는 매우 다양한 방식으로 D- 또는 L-아스파라긴을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아스파라긴은 다른 물질과 공유 결합할 수 있다. 특히, "아스파라긴 치환체", "아스파라긴 유도체" 또는 "아스파라긴-함유 아스파라긴 치환체"는 D- 또는 L-아스파라긴으로부터의 펩티드 또는 올리고펩티드를 의미한다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, Leu-Asn(Sigma, 카탈로그 번호: L0641), 또는 Ile-Asn(Sigma, 카탈로그 번호: I3635), 또는 Glu-Asn-Gly(Sigma, 카탈로그 번호: P5148). 펩티드는 기본적으로 2개 또는 2개 이상의 아미노산을 함유할 수 있다.
"글루타메이트 치환체", "글루타메이트 유도체" 또는 "글루타메이트-함유 글루타메이트 치환체"는 분자에서 D- 또는 L-글루타메이트, 특히 L-글루타메이트를 함유하는 물질을 의미한다. 이 분자는 매우 다양한 방식으로 D- 또는 L-글루타메이트를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 글루타메이트는 다른 물질과 공유 결합할 수 있다. 특히, "글루타메이트 치환체", "글루타메이트 유도체" 또는 "글루타메이트-함유 글루타메이트 치환체"는 D- 또는 L-글루타메이트로부터의 펩티드 또는 올리고펩티드를 의미한다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, Asp-Glu(Sigma, 카탈로그 번호: A1916-250MG), Glu-Glu(Sigma, 카탈로그 번호: G3640-25MG), Glu-His(Sigma, 카탈로그 번호: G6882-100MG), Glu-Leu(Sigma, 카탈로그 번호: G7007-10MG), Glu-Lys(Sigma, 카탈로그 번호: G5136-25MG). 펩티드는 기본적으로 2개 또는 2개 이상의 아미노산을 함유할 수 있다.
"락테이트 치환체", "락테이트-함유 락테이트 치환체" 또는 "락테이트 유도체"는 분자에서 D- 또는 L-락테이트를 함유하는 물질, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 철(II) 락테이트 수화물(Sigma, 카탈로그 번호: 44953), 또는 마그네슘(II) 락테이트 삼수화물(Sigma, 카탈로그 번호: 13227) 또는 락토스를 의미한다. 분자는 매우 다양한 방식으로 D- 또는 L-락테이트를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 락테이트는 다른 물질, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, (+) 에틸 D-락테이트(Sigma, 카탈로그 번호: 69796)와 공유 결합할 수 있다. 락테이트 유도체는 세포 내에서 락테이트로 쉽게 전환될 수 있는 분자, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 피루베이트 또는 알라닌이다. 이 경우 피루베이트는 영양 배지에 첨가될 수 있다. 세포 외 피루베이트는 세포에 쉽게 운반되고 피루베이트 탈수소 효소에 의해 락테이트로 전환된다. 알라닌의 경우, 세포 외 알라닌은 세포에 운반되고 피루베이트 중간 단계를 거쳐 알라닌 아미노기 전이효소에 의해 락테이트로 전환될 수 있다. 이는 알라닌-함유 펩티드에도 적용되며, 따라서 알라닌-함유 펩티드는 "락테이트 유도체"로서도 정의된다.
"희석률"로도 불리는 "분할 비율"은 두 액체의 분할 비율을 표현하는 기준이다. 두 액체가 함께 혼합될 때, 목표 농도에 도달하기 위해서, 용액은 분할 비율에 비례하여 혼합된다. 분할 비율은 다음 예로 설명될 것이다: 세포 배양물이 2×105/㎖의 세포 농도로 배양 용기에서 접종되고 3일 동안 성장하도록 두었다. 3일째에 20×105/㎖의 세포 농도가 측정되었다. 이 배양물은 새로운 배지로 희석되어서, 2×105/㎖의 세포 농도의 목표 접종 농도가 다시 도달된다. 이 경우 완전히 자란 배양물(접종물)은 새로운 배지를 이용하여 1:10으로 희석되어야 한다. 1 L의 작업 부피가 새로운 배양에 필요할 경우, 100 ㎖ 접종물과 900 ㎖ 새로운 배지를 사용하는 것이 필요하다. 이 경우 1:10의 분할 비율일 것이다.
원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 원하는 백신을 생산하기 위해 세포가 배양되는 모든 공정 변형은 기본적으로 본 발명의 적용에 적합하다. 그러나, 본 발명에 따라 바람직한 방법은 고-세포-밀도 방법이다. 고-세포-밀도 세포 배양 방법은 특정 배양기간에서 적어도 1×105/㎖, 바람직하게는 적어도 1×106/㎖의 생 세포 농도가 달성되는 방법으로 정의되며, 이 경우 배양물은 단일 세포 또는 다른 세포 배양물 또는 접종물로 증식될 수 있다. 본 발명에 따라 바람직한 작업 방식은 연속 배양, 유가, 회분, 관류, 또는 분할-회분 공정이다.
배양은 바람직하게는 세포 배양을 위한 모든 성분이 공정의 시작시에 배양 용기에 놓인 회분 공정으로 수행된다. 회분 공정에서 세포는 적절한 배지에 접종되고 특정 배양 시간 후에 채취된다. 이후 원하는 산물, 예를 들어 폴리펩티드가 배양물로부터 분리된다.
본 발명에 따라 특히 바람직한 방법은 세포가 접종과 공정의 마지막 사이에 다른 영양 배지, 예를 들어 피드 배지와 접촉하게 되는 유가 공정이다. 유가 공정은 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 기본 배지로 시작된다. 세포는 기본 배지에 접종된다. 특정 시간, 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 접종 후 1-4일 후에, 배양물은 다른 영양 배지와 접촉하며, 예를 들어 이 영양 배지는 피드 배지일 수 있다. 피드 배지는 일괄적으로, 간헐적으로 또는 연속적으로 세포 배양물에 설정된 양으로 첨가될 수 있다. 따라서 배양물의 부피는 배양 중에 증가한다.
본 발명에 따라 적합한 또 다른 배양 방법은 세포가 배양 배지에서 성장 단계 후에, 추가적인 새로운 배지, 예를 들어 관류 배지를 공급받는 반면에, 소비된 배지는 세포와 함께 또는 세포 없이 공정으로부터 회수되는 관류 방법이다. 관류 배지는 배양 배지(기본 배지)와 다를 수 있거나, 동일한 기본 배지가 관류 배지로서 사용될 수도 있다. 관류 방법에서 세포는 먼저 기본 배지에 접종된다. 세포 배양의 과정에서, 세포(생물)는 세포 배양물(세포 현탁액)로부터 분리되고 한편 소비된 배지는 공정으로부터 회수되며, 다른 한편 새로운 영양물이 새로운 배지를 통해 세포에 이용 가능하게 된다. 세포가 공정 중에 배양 시스템에서 유지된다면, 이는 "관류"로 불린다. 세포가 공정 중에 소비된 배지와 함께 시스템으로부터 제거된다면, 이는 "연속 방법"으로 불린다. 관류 공정에서, 세포는 최대 세포 농도를 유지할 수 있기 위해, 특정된 시간 간격을 두고 배양 시스템으로부터 제거될 수 있다. 이 분야의 당업자에게, 이 작업은 "블리딩"으로 알려져 있다. 세포 분리는 다양한 기술, 세포 분리를 간접적으로 촉진하는 몇몇 기술로 수행된다. 세포 분리의 몇몇 가능한 방법의 예는 여과, 세포 캡슐화, 미세 담체로의 세포 부착, 세포 침전 또는 원심분리이다.
본 발명에 따른 또 다른 적합한 방법은 세포의 공급이 있거나 없는 분할-회분 공정(반복 회분 작업)이다. 이 방법에서, 성장 단계 이후 세포 현탁액의 일 부분이 채취되고 나머지 세포 현탁액이 다음 회분 작업의 접종물로서 발효기에 남는다. 이후 이 접종물과 함께, 발효기는 원하는 작업 부피까지 새로운 배지로 다시 채워지고 두 번째 회분 작업이 시작된다.
상술한 작업 방식 중에 오프라인 측정을 위한 배양 시스템으로부터의 샘플의 제거는 기술된 배양 방법과 상관없다. 그것의 유일한 목적은 공정의 더 나은 이해 또는 제어이다.
"채취" 또는 "세포 채취"란 말은 상류 공정에서 회분 생산의 마지막의 표시이다. 회분 및 유가 공정에서, 상류 공정은 한 번의 채취로만 종료될 수 있는 반면에, 분할-회분, 관류 및 연속 방법에서 여러 번의 채취가 있을 수 있다. 선택된 작업 방식에 따라, 세포 배양 공정(상류 공정)은 지연 단계, 지수 성장 단계, 정체 단계 및 사멸 단계를 포함할 수 있다. 발효 공정은 이러한 성장 단계들 중 하나에서 종료될 수 있다. 바람직하게는 발효 공정은 정체 단계 또는 사멸 단계에서 종료된다. 상류 공정의 마지막에서 세포는 현탁액으로부터 분리된다. 이 세포 분리 공정은 여기서는 "채취" 또는 "세포 채취"라 불린다. 세포 채취는 다른 정제 단계로 이어져서 산물이 분리될 수 있다.
"접종"이라 말은 세포를 이용한 새로운 배양 시스템(예를 들어 생물 반응기 및 적절한 영양 배지, 특히 세포 배양 배지)의 접종을 의미한다. 접종물, 즉 세포 또는 세포 현탁액이 이 목적을 위해 미리 준비된다. 일반적으로 접종될 세포는 실제 생산 공정 이전에 증식되어서, 새로운 배양 시스템에 원하는 세포 농도로 접종시킬 수 있을 만큼 충분한 세포를 얻는다.
"세포 성장"은 배양 단계 중 적어도 하나에서 생 세포 농도의 증가를 의미한다. "세포 활력"이란 말은 죽은 세포도 포함하는 총 세포 농도에 대한 생 세포 농도의 비율로 표현된다. 이 비율은 어떠한 방법 또는 수단으로도 계산될 수 있다. 하나의 방법은 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 염료로 세포를 표시하는 것이다. 세포와 죽은 세포를 구별하는 하나의 예는 트립판 청색 염료의 사용이다. 표시된 세포가 계산된 후 죽은 세포와 살아있는 세포의 수가 결정된다. 세포 활력은 총 세포 수에 대한 살아 있는 세포 수의 비율을 밝혀냄으로써 계산된다.
"오스몰랄 농도"란 말은 수용액에서 용해된 입자의 삼투압의 계량 단위이다. 용해된 입자는 이온과 이온화되지 않은 분자를 모두 포함한다. 오스몰랄 농도는 1 kg의 물에 용해된 삼투압적으로 활성 입자의 농도로서 표현된다(38℃에서 1 mOsmol/kg H2O는 19 mmHg의 삼투압에 상당한다). "오스몰 농도"란 말은 1 L의 용액에 용해된 입자의 수를 의미한다. 배양 배지에 존재하고 용액의 오스몰랄 농도를 증가시키는 물질은 예를 들어 단백질, 펩티드, 아미노산, 대사 불가능한 고분자, 비타민, 이온, 염, 당, 대사물질, 유기산, 지질 등이다.
"pH 값"이란 말은 몰 수소 이온 활성 aH +(pH= -log aH +)의 수치 값의 음의 상용로그이다. 중성인 7.0의 pH 값에 대하여, 7.0 이하의 pH 값을 갖는 용액은 산 반응을 갖는다. 7.0 이상의 pH 값을 갖는 용액은 염기 반응을 갖는다. 두 용액의 pH 값을 비교할 때, 높은 pH 값을 갖는 용액이 낮은 pH 값을 갖는 용액에 대하여 "염기"로서 정의되며, 예를 들어 용액 1은 6.8의 pH 값을 갖고, 용액 2는 7.0의 pH 값을 갖는다. 이 경우 용액 2는 용액 1과 비교하여 염기이다. 생산 공정의 pH 값은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니지만, 생물 반응기의 pH 값은 pH-전극을 이용하여 온라인으로 측정될 수 있다. 배양물의 pH 값을 결정하는 다른 방법은 오프라인 샘플링 및 외부 pH-전극을 이용한 pH 값의 검출이다.
다른 이로운 태양은 종속항에 주어져 있다.
본 발명은 다음의 실시예로 더욱 상세하게 설명될 것이다.
도 1은 통상의 계통 유지 하에 포도당과 글루타민이 없는 본 발명에 따른 영양 배지에서 대사적으로 최적화된 CHO 세포의 성장 데이터이다.
도 2는 유가 공정에서 대조군과 비교한 본 발명에 따른 영양 배지에서 세포의 성장 곡선이다.
도 3은 유가 배양 중에 락테이트 농도의 변화이다.
도 4는 유가 배양 중에 암모늄 생성이다.
도 5는 배양 공정의 pH 값의 변화이다. pH 값은 오프라인으로 측정되었고 공정의 pH 값은 배양 중에 조절되지 않았다.
도 6은 본 발명에 따른 기본 배지와 피드 배지의 다양한 조합을 갖는 유가 배양에서 (대사적으로 최적화되지 않은) 야생-타입 세포의 성장 거동이다.
도 7은 본 발명에 따른 기본 배지와 2개의 다른 피드 배지를 이용한 유가 배양에서 대사적으로 최적화된 세포의 성장 거동이다.
도 8은 숙신산 나트륨이 있고 없는 본 발명에 따른 영양 배지를 이용한 유가 배양에서 대사적으로 최적화된 세포의 성장 거동이다.
도 9는 유가 배양에서 숙신산 나트륨이 있고 없는 본 발명에 따른 영양 배지에서 락테이트 농도의 변화이다.
재료 및 방법
세포 배양 조건
세포는 액체 질소의 기상에서 저장하였다. 하나 내지 두 개의 앰플을 37℃로 예비 가열한 영양 배지에 녹이고 스피너 병, 진탕 플라스크 또는 T-병에 옮겼다. 배양의 처음 며칠에 배지를 클론에 따라 바꾸었다.
클론에 따라, 매 2일마다 또는 매 3일마다 또는 2 및 3일 후에 교대로 세포를 새로운 배지에 분할하였고, 즉 세포 현탁액의 일 부분을 배양물로부터 제거하고 세포 현탁액의 적은 일 부분을 다음 배양을 위한 접종물로서 재사용하였다. 이 접종물을 미리 데운 새로운 영양 배지로 보충하였다. 세포를 CO2 대기의 배양기에서 37℃로 배양하였다. 세포를 배양하는 대안은 37℃에서 배양실에서의 배양이었으며, 이런 식으로 세포를 여러 계대 동안 배양으로 유지하였다. 계대는 2 내지 3일의 배양 시간을 의미한다. 다양한 시간 지점에서, 세포 현탁액을 계통 유지 중에 취해서 실험을 위한 접종물로서 사용하였다. 실험은 다양한 배양 시스템, 예를 들어 스피너 병, T-병, 진탕 플라스크, 배양 튜브 또는 제어된 생물 반응기에서 수행하였다.
항체를 발현하는 CHO 세포주를 실험용으로 사용하였다. 세포 상등액에서의 산물 농도(항체 농도)는 ELISA로 측정하였다.
시그마 회사의 CHO 배지(CR 1020, Lot: 64K2403)를 실험용 영양 배지(기본 배지)로 사용하였다. 이는 무-혈청, 무-단백질 영양 배지이다. 이는 기성품으로, 여과-멸균된 영양 배지이다.
실험은 회분 방식 또는 유가 방식으로 수행하였다. 공정을 유가 방식으로 수행할 때, 공정은 상술한 기본 배지에서 회분 방식으로 먼저 시작하고 1-4일 동안 이 방식으로 세포를 배양하였다. 1-4일 후에 세포를 피드 배지로 보충하였고, 즉 공정을 유가 방식으로 전환하였다. 공급은 규칙적인 간격으로 이루어졌다. 유가 실험에서, HyQ 회사의 무-단백질 및 무-혈청 피드 배지(R05.2 보충, Cat. No.: SH30584.04, Lot No.: APF21457G)를 사용하였다.
본 발명에 따라 사용된 모든 물질(화학물질)은 시그마 회사로부터 얻었고 이로부터 스톡 용액을 준비하였다. 스톡 용액으로부터, 물질을 원하는 최종 농도로 배양 튜브에 넣었다. 이런 식으로 준비한 다양한 배양 튜브는 최종적으로 항체-생산 CHO- 클론으로 목표 접종 세포 농도(1-3×105/㎖)로 접종하였다. 이를 위해, 접 종 세포의 해당량을 계산하고 필요한 양의 접종 세포 현탁액을 원심분리하였다. 세포 펠릿을 최종적으로 본 발명에 따른 물질이 없는 새로운 영양 배지(CR 1020, Lot: 64K2403)의 해당 부피에 넣었다. 이런 식으로 원하는 접종 세포 농도를 조사되는 세포 현탁액에서 조절하였다. 이와 같이 준비한 세포 현탁액을 본 발명에 따른 물질을 미리 넣은 배양 튜브에 배분하였다. 배양 튜브는 37℃ 및 8% CO2 대기에서 진탕 배양하였다. 배양 튜브는 회분 방식 또는 유가 방식으로 8-11일 동안 배양하였다. 변수의 오프라인 측정을 위한 샘플을 규칙적인 간격, 예를 들어 매일 또는 매 3일마다 배양 용기로부터 취했다. 샘플의 대사 변수와 세포 농도를 측정하였다. 세포 농도와 세포 활력은 CeDex 장치로 측정하였다. 대사 변수(포도당, 락테이트, 글루타민 및 암모늄)는 분석기(BioProfile 100)로 측정하였다.
실시예 1: 본 발명에 따른 물질을 이용한 회분 실험
본 발명에 따른 물질의 다음 최종 농도가 접종 후 영양배지에서 수립되었다:
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 숙신산 나트륨
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 말산
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 α-케토-글루타레이트
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 푸마르산 나트륨
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 타르타르산
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 아디프산
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 락트산 나트륨
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 오르니틴
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 시트룰린
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 피루브산 나트륨
본 발명에 따른 물질을 회분 방식으로 시험하였다. 영양 배지 또는 기본 배지(무-혈청, 무-단백질 CHO 배지, 시그마 회사 CR 1020, Lot: 64K2403)는 4.7 g/ℓ의 포도당 농도와 1.5 mM의 글루타민 농도를 가졌다(표 1).
본 발명에 따른 물질을 이용한 회분 실험의 결과
시간
[d]		 생세포밀도(VCD),[E5/㎖] 총세포밀도(TCD),[E5/㎖] 생존율
[%]		 포도당
[g/ℓ]		 락테이트
[g/ℓ]		 NH4
[mM]		 글루타민
[mM]		 비포도당소모율[포도당/VCD] 비락테이트생산율[락테이트/VCD] 비암모니아생산율[NH4/VCD] 비글루타민소모율[글루타민/VCD]
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 숙신산나트륨
3 8.2 8.3 99 3.82 0.86 1.84 0.76 0.47 0.10 0.22 0.09
6 48.1 49.1 98 2.4 1.19 2.25 0.31 0.05 0.02 0.05 0.01
8 25.6 29.8 86 1.44 1.14 2.33 0.36 0.06 0.04 0.09 0.01
11 16.3 32.8 50 0.22 1.59 3 0.52 0.01 0.10 0.18 0.03
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 말산
3 7.6 7.8 97 3.9 0.85 1.9 0.67 0.51 0.11 0.25 0.09
6 42.2 43.4 97 2.65 1.14 2.42 0.28 0.06 0.03 0.06 0.01
8 23.2 26.1 89 1.76 0.94 2.4 0.37 0.08 0.04 0.10 0.02
11 17.5 28.5 61 0.47 1.2 2.75 0.44 0.03 0.07 0.16 0.03
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 α-케토-글루타레이트
3 7.1 7.2 99 4.24 0.56 1.81 0.73 0.60 0.08 0.25 0.10
6 36.7 37.4 98 3.27 0.71 2.56 0.24 0.09 0.02 0.07 0.01
8 22.2 23.9 93 2.19 0.62 2.65 0.36 0.10 0.03 0.12 0.02
11 16.4 25.5 64 0.8 0.87 2.99 0.51 0.05 0.05 0.18 0.03
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 푸마르산나트륨
3 7 7.1 99 3.98 0.85 1.84 0.72 0.57 0.12 0.26 0.10
6 40.6 41.5 98 2.61 1.19 2.49 0.24 0.06 0.03 0.06 0.01
8 19.1 22.3 86 1.68 1.08 2.58 0.37 0.09 0.06 0.14 0.02
11 14.3 26.2 55 0.46 1.46 3.06 0.47 0.03 0.10 0.21 0.03
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 타르타르산
3 5.4 5.5 98 4.53 0.41 1.84 0.9 0.84 0.08 0.34 0.17
6 40 41.3 97 3.56 0.6 2.89 0.19 0.09 0.02 0.07 0.00
8 10.5 12.1 87 2.65 0.64 3.42 0.27 0.25 0.06 0.33 0.03
11 8.7 18 48 1.71 0.79 3.87 0.42 0.20 0.09 0.44 0.05
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 아디프산
3 7.1 7.2 99 4.28 0.62 1.81 0.86 0.60 0.09 0.25 0.12
6 40.6 41.6 98 2.95 0.93 2.67 0.22 0.07 0.02 0.07 0.01
8 14.9 17.1 87 1.94 0.95 3 0.32 0.13 0.06 0.20 0.02
11 10.6 23 46 0.89 1.28 3.38 0.49 0.08 0.12 0.32 0.05
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 피루브산나트륨
3 7.7 7.8 99 4.55 0.38 1.72 1.02 0.59 0.05 0.22 0.13
6 44 45 98 2.81 1.32 1.91 0.25 0.06 0.03 0.04 0.01
8 21.6 24.5 88 1.79 1.34 2.23 0.38 0.08 0.06 0.10 0.02
11 10.3 24.2 43 0.63 1.93 3.06 0.49 0.06 0.19 0.30 0.05
0 1.03 1.07 96 4.69 1 1.22 1.53 4.55 0.97 1.18 1.49 락트산나트륨
3 6 6 100 4.44 1.15 1.65 1.12 0.74 0.19 0.28 0.19
6 40.6 41 99 2.82 1.49 2.07 0.31 0.07 0.04 0.05 0.01
8 21.3 23.7 90 1.79 1.47 2.63 0.35 0.08 0.07 0.12 0.02
11 11.4 24.5 47 0.55 1.04 3.12 0.5 0.05 0.09 0.27 0.04
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 오르니틴
3 6.3 6.5 97 4.24 0.71 1.82 0.92 0.67 0.11 0.29 0.15
6 43.8 44.6 98 2.7 1.04 2.52 0.11 0.06 0.02 0.06 0.00
8 19.8 22.3 89 1.82 0.97 2.72 0.37 0.09 0.05 0.14 0.02
11 14.8 24.6 60 0.53 1.26 3.26 0.46 0.04 0.09 0.22 0.03
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 시트룰린
3 7.5 7.7 97 4.14 0.83 1.87 0.82 0.55 0.11 0.25 0.11
6 37.9 39.6 96 2.62 1.16 2.66 0.27 0.07 0.03 0.07 0.01
8 14.6 17.8 82 1.7 1.12 2.86 0.37 0.12 0.08 0.20 0.03
11 8.2 21.3 38 0.7 1.48 3.26 0.51 0.09 0.18 0.40 0.06
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 대조군1
3 7.9 8 99 4.32 0.79 1.84 0.92 0.55 0.10 0.23 0.12
6 43.4 44.8 97 2.7 1.15 2.61 0.26 0.06 0.03 0.06 0.01
8 16.8 19.6 86 1.74 1.11 2.83 0.37 0.10 0.07 0.17 0.02
11 8.6 21.2 41 0.65 1.48 3.32 0.5 0.08 0.17 0.39 0.06
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 대조군2
3 7.2 7.4 97 4.34 0.76 1.83 0.94 0.60 0.11 0.25 0.13
6 38.2 39.3 97 2.73 1.15 2.62 0.25 0.07 0.03 0.07 0.01
8 16.9 19.6 86 1.76 1.11 2.84 0.36 0.10 0.07 0.17 0.02
11 9.1 21.4 43 0.65 1.47 3.32 0.51 0.07 0.16 0.36 0.06
0 1.03 1.07 96 4.69 0 1.22 1.53 4.55 0.00 1.18 1.49 평균값대조군
3 7.55 7.7 98 4.33 0.775 1.84 0.93 0.57 0.10 0.24 0.12
6 40.8 42.05 97 2.715 1.15 2.62 0.255 0.07 0.03 0.06 0.01
8 16.85 19.6 86 1.75 1.11 2.84 0.365 0.10 0.07 0.17 0.02
11 8.85 21.3 42 0.65 1.475 3.32 0.505 0.07 0.17 0.38 0.06
실시예 2: 본 발명에 따른 물질을 이용한 유가 실험
본 발명에 따른 물질의 다음 최종 농도가 접종 후 영양 배지에서 수립되었다:
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 숙신산 나트륨
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 말산
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 α-케토-글루타레이트
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 푸마르산 나트륨
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 타르타르산
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 아디프산
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 락트산 나트륨
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 오르니틴
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 피루브산 나트륨
실시예 1과 반대로, 본 발명에 따른 물질을 유가 방식으로 시험하였고 2개의 독립적인 배양 튜브를 각 시험 물질로부터 접종하였다(n=2).
영양 배지(무-혈청, 무-단백질 CHO 배지, 시그마 회사 CR 1020, Lot: 64K2403)는 4.7 g/ℓ의 포도당 농도와 0.7 mM의 글루타민 농도를 가졌다(표 1). 사용된 피드 배지는 HyQ 회사(R05.2 보충, Cat. No.: SH30584.04, Lot No.: APF21457G)로부터 구입했다. 피드 배지는 무-글루타민이었다(표 2).
본 발명에 따른 물질을 이용한 유가 실험의 결과
시간
[d]		 생세포밀도(VCD),[E5/㎖] 총세포밀도(TCD),[E5/㎖] 생존율
[%]		 포도당
[g/ℓ]		 락테이트
[g/ℓ]		 NH4
[mM]		 글루타민
[mM]		 비포도당소모율[포도당/VCD] 비락테이트생산율[락테이트/VCD] 비암모니아생산율[NH4/VCD] 비글루타민소모율[글루타민/VCD]
0 1.37 1.50 91 4.65 0.00 1.04 0.70 3.39 0.00 0.76 0.51 대조군평균값
2 4.15 4.30 97 4.33 0.48 1.45 0.37 1.04 0.11 0.35 0.09
5 12.70 13.20 96 6.97 1.10 2.01 0.00 0.55 0.09 0.16 0.00
8 37.30 40.45 92 9.97 1.33 2.71 0.00 0.27 0.04 0.07 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0.00 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 숙신산나트륨
2 4.1 4.2 98 3.91 0.46 1.36 0.42 0.95 0.11 0.33 0.10
5 측정에러 - 6.27 1.15 1.89 0 - - - -
8 55.7 62.2 90 8.44 1.34 2.41 0 0.15 0.02 0.04 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 숙신산나트륨
2 4.3 4.4 98 4.04 0.47 1.41 0.38 0.94 0.11 0.33 0.09
5 17.5 18.1 97 6.63 1.18 1.92 0 0.38 0.07 0.11 0.00
8 58.8 64.1 92 8.98 1.42 2.5 0 0.15 0.02 0.04 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 말산
2 3.8 3.9 97 4.09 0.45 1.41 0.38 1.08 0.12 0.37 0.10
5 13.7 14.1 97 6.6 1.1 1.98 0 0.48 0.08 0.14 0.00
8 44.9 49.1 91 9.2 1.32 2.63 0 0.20 0.03 0.06 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 말산
2 4.1 4.2 98 4.1 0.45 1.42 0.37 1.00 0.11 0.35 0.09
5 12.5 12.8 98 6.7 1.09 1.98 0 0.54 0.09 0.16 0.00
8 41.6 45.3 92 9.38 1.32 2.63 0 0.23 0.03 0.06 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 α-케토-글루타레이트
2 3.8 3.9 97 4.25 0.34 1.4 0.34 1.12 0.09 0.37 0.09
5 오염 - - - - - - - - - -
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 α-케토-글루타레이트
2 3.3 3.4 97 4.26 0.33 1.41 0.34 1.29 0.10 0.43 0.10
5 11.4 11.8 97 7.15 0.76 1.91 0 0.63 0.07 0.17 0.00
8 46.9 49.4 95 9.75 1.06 2.62 0 0.21 0.02 0.06 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 푸마르산나트륨
2 3.5 3.6 97 4.14 0.44 1.39 0.36 1.18 0.13 0.40 0.10
5 13.4 13.9 96 6.79 1.13 1.95 0 0.51 0.08 0.15 0.00
8 40.3 43.9 92 9.46 1.39 2.71 0 0.23 0.03 0.07 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 푸마르산나트륨
2 3.5 3.6 97 4.17 0.44 1.4 0.38 1.19 0.13 0.40 0.11
5 12.8 13.2 97 6.75 1.12 1.95 0 0.53 0.09 0.15 0.00
8 40.2 43.8 92 9.32 1.38 2.68 0 0.23 0.03 0.07 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 타르타르산
2 3.9 4 98 4.37 0.32 1.46 0.38 1.12 0.08 0.37 0.10
5 9.7 10.4 93 7.69 0.51 2.13 0 0.79 0.05 0.22 0.00
8 23.7 26.6 89 11.22 0.69 2.98 0 0.47 0.03 0.13 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 타르타르산
2 3.8 3.9 97 4.39 0.3 1.45 0.38 1.16 0.08 0.38 0.10
5 9.1 9.6 95 7.34 0.5 2.12 0 0.81 0.05 0.23 0.00
8 25 27.7 90 10.34 0.68 2.93 0 0.41 0.03 0.12 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 아디프산
2 4.3 4.4 98 4.2 0.42 1.46 0.34 0.98 0.10 0.34 0.08
5 11.7 12 98 7.33 0.88 2.04 0 0.63 0.08 0.17 0.00
8 36.4 40 91 10.89 1.1 2.81 0 0.30 0.03 0.08 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 아디프산
2 4.3 4.4 98 4.22 0.42 1.44 0.35 0.98 0.10 0.33 0.08
5 11.2 11.8 95 7.26 0.88 2.03 0 0.65 0.08 0.18 0.00
8 33.5 36.3 92 10.65 1.12 2.82 0 0.32 0.03 0.08 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 피루브산나트륨
2 3.1 3.2 97 4.4 0.27 1.42 0.4 1.42 0.09 0.46 0.13
5 13.5 13.7 99 7.02 1.2 1.66 0 0.52 0.09 0.12 0.00
8 41.5 46 90 9.44 1.8 2.43 0 0.23 0.04 0.06 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 1 1.04 0.7 3.39 0.73 0.76 0.51 락트산나트륨
2 4.5 4.6 98 4.32 0.93 1.34 0.43 0.96 0.21 0.30 0.10
5 12.8 13.1 98 7.03 1.47 1.85 0.05 0.55 0.11 0.14 0.00
8 50.2 52.4 96 9.52 1.75 2.43 0.07 0.19 0.03 0.05 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 1 1.04 0.7 3.39 0.73 0.76 0.51 락트산나트륨
2 3.8 4 95 4.34 0.93 1.35 0.43 1.14 0.24 0.36 0.11
5 14 14.3 98 7.02 1.45 1.84 0.03 0.50 0.10 0.13 0.00
8 52 54.7 95 9.45 1.73 2.41 0.05 0.18 0.03 0.05 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 오르니틴
2 3.9 4 98 4.24 0.46 1.44 0.37 1.09 0.12 0.37 0.09
5 11.9 12.4 96 6.96 1.03 2.01 0 0.58 0.09 0.17 0.00
8 42.8 45.4 94 9.85 1.23 2.63 0 0.23 0.03 0.06 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 오르니틴
2 3.8 3.9 97 4.26 0.45 1.44 0.38 1.12 0.12 0.38 0.10
5 13.2 13.7 96 6.9 1.03 2 0 0.52 0.08 0.15 0.00
8 36.8 39 94 9.72 1.23 2.63 0 0.26 0.03 0.07 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 무첨가대조군1
2 4.1 4.3 95 4.32 0.48 1.45 0.36 1.05 0.12 0.35 0.09
5 13.8 14.4 96 7.05 1.09 2 0 0.51 0.08 0.14 0.00
8 37.5 40.4 93 10.03 1.31 2.69 0 0.27 0.03 0.07 0.00
0 1.37 1.5 91 4.65 0 1.04 0.7 3.39 0.00 0.76 0.51 무첨가대조군2
2 4.2 4.3 98 4.33 0.47 1.45 0.37 1.03 0.11 0.35 0.09
5 11.6 12 97 6.89 1.11 2.02 0 0.59 0.10 0.17 0.00
8 37.1 40.5 92 9.91 1.35 2.73 0 0.27 0.04 0.07 0.00
선택된 샘플로부터, 상등액에서의 산물 농도(항체 농도)를 ELISA로 측정하였다(표 3).
선택된 물질에 대한 산물 측정의 결과. 대조군의 절대 값을 100%로 설정하였다.
항체 농도[%]
무첨가 대조군 100
숙신산 나트륨 B 127
락트산 나트륨 B 124
실시예 3: 본 발명에 따른 물질을 이용하고 사용된 모든 배양 배지에서 글루타민이 없는 유가 실험
본 발명에 따른 물질의 다음 최종 농도가 접종 후 영양 배지에서 수립되었다:
대조군, 무첨가
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 숙신산 나트륨
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 α-케토-글루타레이트
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 락트산 나트륨
본 발명에 따른 물질을 유가 조건에서 시험하였다. 영양 배지(무-혈청, 무-단백질 CHO 배지, 시그마 회사 CR 1020, Lot: 64K2403)는 4.7 g/ℓ의 포도당 농도를 가졌고 무-글루타민이었다. 사용된 피드 배지는 HyQ 회사(R05.2 보충, Cat. No.: SH30584.04, Lot No.: APF21457G)로부터 구입했다. 피드 배지는 무-글루타민이었다(표 4).
무-글루타민 배양 배지에서 본 발명에 따른 물질을 이용한 유가 실험의 결과
시간
[d]		 VCD
[대조군의 %]		 TCD
[대조군의 %]		 생존율
[%]		 비 포도당
농도		 비 락테이트 생산율
[대조군의 %]		 비 NH4 생산율
[대조군의 %]
0 100 100 94 100 100 100 대조군
무글루타민
3 100 100 89 100 100 100
5 100 100 91 100 100 100
7 100 100 88 100 100 100
9 100 100 93 100 100 100
0 100 100 94 95 - 98 숙신산
나트륨
무글루타민
3 132 124 95 74 75 72
5 111 108 95 88 93 90
7 117 118 87 78 89 85
9 136 134 94 69 78 74
0 100 100 94 94 - 100 α-케토-글루타레이트
무글루타민
3 103 94 96 98 70 94
5 104 103 93 98 72 94
7 99 96 90 95 72 95
9 92 92 93 109 79 103
0 100 100 94 93 - 98 락트산
나트륨
무글루타민
3 148 140 94 66 72 63
5 136 128 97 74 66 72
7 147 136 95 62 57 66
9 133 131 95 71 65 73
실시예 4: 본 발명에 따른 물질 및 글루타민-함유 글루타민 치환체를 이용한 유가 실험
본 발명에 따른 물질의 다음 최종 농도가 접종 후 영양 배지에서 수립되었다:
대조군, 무첨가
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 숙신산 나트륨
영양 배지에서 1 g/ℓ 최종 농도의 α-케토-글루타레이트
영양 배지에서 0.5 g/ℓ 최종 농도의 락트산 나트륨
본 발명에 따른 물질을 유가 조건에서 시험하였다. 영양 배지(무-혈청, 무-단백질 CHO 배지, 시그마 회사 CR 1020, Lot: 64K2403)는 4.7 g/ℓ의 포도당 농도와 4 mM의 글루타민 농도를 가졌다. 사용된 피드 배지는 HyQ 회사(R05.2 보충, Cat. No.: SH30584.04, Lot No.: APF21457G)로부터 구입했다. 3 g/ℓ 알라닐-글루타민(Ala-Gln) 및 3 g/ℓ 글리실-글루타민(Gly-Gln)을 피드 배지에 첨가하였다. 피드 배지는 무-글루타민이었다(표 5).
본 발명에 따른 물질 및 글루타민 유도체를 이용한 유가 실험의 결과
시간
[d]		 생세포밀도
(VCD),[E5/㎖]		 총세포밀도
(TCD),[E5/㎖]		 생존율
[%]
0 1.0 1.1 96 대조군
3 7.9 8.2 96
5 40.4 41.7 97
7 21.0 37.2 56
9 13.6 33.2 41
0 1.0 1.1 96 숙신산 나트륨
3 8.8 9.3 95
5 54.3 56.7 96
7 34.5 42.0 82
9 26.7 35.9 74
0 1.0 1.1 96 α-케토-글루타레이트
3 7.1 7.6 93
5 38.5 40.1 96
7 30.2 36.0 84
9 21.0 31.2 67
0 1.0 1.1 96 락트산 나트륨
3 7.6 7.9 96
5 43.3 45.2 96
7 34.3 41.1 83
9 25.2 34.7 73
실시예 5: 무-포도당 및 무-글루타민 영양 배지(기본 배지)에서 본 발명에 따른 물질을 이용한 계통 유지 중의 대사적으로 최적화된 세포의 통상 배양
무-포도당 및 무-글루타민 상업용 영양 배지를 얻었다. 이 배지는 최종 영양 배지를 제공하기 위해 본 발명에 따른 물질과 함께 표 6에 따라 보충하였다. 표 6에서 나타난 물질의 농도는 배지에서 각 물질의 최종 농도이다. 이 영양 배지는 본 발명에 따른 물질을 갖는 무-혈청, 무-단백질, 무-펩톤 배지에 해당한다. 따라서 세포 배양용 최종 영양 배지는 무-포도당, 무-글루타민이고 갈락토스와 락테이트를 함유한다.
계통 유지 중의 CHO 세포의 통상 배양을 위한 본 발명에 따른 물질을 갖는 영양 배지(기본 배지)의 조성
포도당
[g/ℓ]		 갈락토스
[g/ℓ]		 락테이트
[g/ℓ]		 글루타민
[g/ℓ]		 글루타메이트[g/ℓ] 아스파라긴[g/ℓ] Na-숙시네이트[g/ℓ]
MEL 기본배지 0 3 2.5 0 0.8 0.23 0
대사적으로 최적화된 CHO 세포를 계통 유지를 위한 회분 조건 하에 진탕 플라스크에서 배양하였다. 세포를 상술한 영양 배지에 ㎖당 1-2×105 생 세포의 접종 세포 농도로 접종하였다. 배양물을 37℃ 및 7.5% pCO2 대기에서 2일 동안 배양하고 2일째에 계대 배양하였다. 이를 위해, 2일째에 세포 농도를 계산하고 배양 용기를 동일한 새로운 배지에서 동일한 접종 세포 농도로 접종하였다. 2일의 배양기간을 1 계대로 정의하였다. 이런 식으로 여러 계대 동안 배양물을 배양하고 각 계대 마다 계대 배양 직전에 생 세포 농도를 측정하였다. 측정값은 도면(도 1)에 플롯하였다. 도 1에서 알 수 있듯이, 세포는 본 발명에 따른 배지에서 잘 성장할 수 있다. 세포는 본 발명에 따른 배지에서 17.9 시간의 2배 증가 시간을 갖는다. 세포는 2일의 배양 방식에서 1:6.3의 높은 분할 비율을 갖는다. 계통 유지 중의 세포를 매 3일마다 분할한다면, 이들은 1:10 이상의 분할 비율을 갖는다. 이러한 높은 분할 비율 또는 낮은 2배 증가 시간은 무-혈청, 무-단백질, 무-펩톤, 무-포도당 및 무-글루타민 배지에서 달성된다.
다음, 제2군의 유가 실험을 수행하였다. 다음의 재료와 방법을 여기서부터 시작하여 모든 실험에서 사용하였다(실시예 6-9).
사용된 제1영양 배지는 상업용 영양 배지(기본 배지)이다. 이 기본 배지는 그 처방이 알려지지 않은 무-포도당 및 무-글루타민 기본 배지이다. 이 기본 배지는 각 실시예에서 본 발명에 따른 물질로 보충하였다. 실시예에서 물질의 기재된 농도는 기본 배지에서 각 물질의 최종 농도이다. 따라서, 필요할 경우, 영양 배지는 기재된 최종 농도에 도달될 때까지 본 발명에 따른 물질로 보충하였다. 보충 후, 기본 배지의 pH 값을 7.1±0.1로 조절하였다. 기본 배지의 오스몰랄 농도는 310±20 mOsmol/kg H2O로 조절하였다. 이와 같이, 최종 기본 배지를 준비하고 여과-멸균하였다. 이런 식으로 준비된 기본 배지는 무-혈청, 무-단백질 및 무-펩톤 기본 배지에 해당한다.
사용된 제2영양 배지는 피드 배지이다. 이는 무-혈청, 무-단백질 피드 배지이다. 피드 배지는 특히 아미노산, 염 및 비타민으로 구성되는, 본 발명 고유의 조성으로 이루어진다. 이 피드 배지는 각 실시예에서 본 발명에 따른 물질로 보충하였다. 실시예에서 물질의 기재된 농도는 피드 배지에서 각 물질의 최종 농도이다. 최종 피드 배지는 6.0 내지 7.8의 pH 값 및 460-750 mOsmol/kg H2O의 오스몰랄 농도를 가졌다.
모든 실험은 유가 조건에서 수행하였다.
CHO 세포를 기본 배지에 접종함으로써 실험을 시작하였다. 접종 세포 농도는 1-3×105/㎖이었다. 배양물을 7일까지 동안 두고 배양 중에 규칙적인 간격으로 해당 피드 배지를 공급하였다.
실험에 사용된 용어는 다음 예로 설명된다.
예를 들어, 실험명 S4: MEL-St-MEL.
S4: 실험의 번호. 이는 S1 내지 S6로 변한다.
제1약어(MEL): 사용된 세포의 설명. 이는 MEL(대사적으로 처리함) 또는 St(표준, 야생-타입)일 수 있다.
제2약어(St): 사용된 기본 배지의 설명. 이는 MEL(본 발명에 따른 기본 배지) 또는 St(표준 기본 배지)일 수 있다.
제3약어(MEL): 사용된 피드 배지의 설명. 이는 MEL(본 발명에 따른 피드 배지) 또는 St(표준 피드 배지)일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 탄수화물 원으로서 락테이트를 필요로 하기 때문에, 세포에 락테이트를 공급하는 것이 필요하였다. 별도의 락테이트를 공급한 이 피드 배지 또는 배양물은 "별도 사료"란 주석으로 배지 표에 적어두었다. 이유는 락테이트가 피드 배지에 속하기 때문이다. 그러나, 용해성 문제를 피하기 위해, 락테이트를 피드 배지에 첨가하지 않았다. 대신, 락테이트 농도를 매일 측정하고 필요할 경우 (락테이트 제한 전) 배양물의 별도 스톡 용액으로부터 첨가하였다.
실시예 6: 영양 배지에서 포도당과 글루타민이 없고, 본 발명에 따른 물질을 이용한 유가 실험
다음 조성의 배지를 이 유가 실험에 사용하였다:
사용된 영양 배지에서 물질의 최종 농도
포도당
[g/ℓ]		 갈락토스
[g/ℓ]		 락테이트
[g/ℓ]		 글루타민
[g/ℓ]		 글루타메이트[g/ℓ] 아스파라긴[g/ℓ]
대조군의 기본 배지
S1: St-St-St		 3.4 0 0 0.8 0.15 0.23
대조군의 피드 배지
S1: St-St-St		 60 0 0 13 0.15 0.15
실시예의 기본 배지
S1: MEL-MEL-MEL		 0 3 2.5 0 0.8 0.23
실시예의 피드 배지
S1: MEL-MEL-MEL		 0 60 별도 사료 0 7.15 0.15
S1: St-St-St=표준 세포(야생-타입 세포), 표준 기본 배지, 표준 피드 배지
S1: MEL-MEL-MEL=대사적으로 최적화된 세포, 본 발명에 따른 기본 배지, 본 발명에 따른 피드 배지
본 발명에 따른 영양 배지에서 대사적으로 최적화된 세포는 대조군과 비슷한 세포 성장을 나타냈다(도 2). 대조군과 대조적으로, 이들은 암모늄을 적게 생산했고(도 4) 락테이트를 대사한 반면에, 대조군은 락테이트를 생산하였다(도 3). 본 발명에 따른 물질을 갖는 배양물의 pH 값은 염기성 pH 값(높은 pH 값)으로 변하거나 일정하게 유지되었다. 대조군(종래 방법)의 pH 값은 산성 pH 값(낮은 pH 값)으로 변하였다(도 5).
실시예 7:
표준 세포(야생-타입 세포, 유전적으로 변형되지 않음)를 다음의 배지 조성을 갖는 유가 조건에서 시험하였다.
이 실시예에 사용된 영양 배지에서 물질의 최종 농도
포도당
[g/ℓ]		 갈락토스
[g/ℓ]		 락테이트
[g/ℓ]		 글루타민
[g/ℓ]		 글루타메이트[g/ℓ] 아스파라긴[g/ℓ]
실시예의 기본 배지
S6: St-St-MEL		 3.4 0 0 0.8 0.15 0.23
실시예의 피드 배지
S6: St-St-MEL		 0 35 별도 사료 0 5.15 6.15
실시예의 기본 배지
S6: St-MEL-MEL		 0 3 2.5 0 0.8 0.23
실시예의 피드 배지
S6: St-MEL-MEL		 0 35 별도 사료 0 5.15 6.15
실시예의 기본 배지
S6: St-MEL-St		 0 3 2.5 0 0.8 0.23
실시예의 피드 배지
S6: St-MEL-St		 60 0 0 13 0.15 0.15
S6: St-St-MEL = 표준 세포(야생-타입 세포), 표준 기본 배지, 본 발명에 따른 피드 배지
S6: St-MEL-MEL = 표준 세포(야생-타입 세포), 본 발명에 따른 기본 배지, 본 발명에 따른 피드 배지
S6: St-MEL-St = 표준 세포(야생-타입 세포), 본 발명에 따른 기본 배지, 표준 피드 배지
종래 기술에서, 몇몇 조합의 탄수화물이 기본 배지 및 피드 배지에서 시험되었다. 모든 조합은 포도당을 함유하는 기본 배지에서 세포의 접종을 하였다. 이후 피드 배지가 예를 들어 갈락토스를 함유하는 유가 공정이 시작되었다. 이러한 형태의 공정을 사용한 이유는 세포가 갈락토스-함유 기본 배지에서 낮은 성장 속도를 갖거나, 전혀 성장하지 못하기 때문이고, 따라서 포도당-함유 기본 배지로 시작하는 것이 필요하였다(Altamirano, C. 등, Biotechnol. Bioeng., 2001, 76(4): 351-60; Altamirano, C. 등, J. Biotechnology, 2004, 110(2): 171-9; Altamirano, C. 등, Biotechnol. Progress, 2000, 16(1): 69-75). 그러나, 본 발명에 따르면, 갈락토스-함유 배지에서 세포 성장 속도가 포도당-함유 배지에서의 속도와 비슷해서, 본 발명에 따른 물질을 갖는 기본 배지는 세포 배양에 대한 완전히 새로운 가능성을 제공한다. 따라서 본 발명에 따른 기본 배지는 다양한 피드 배지와 조합되었다.
결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 피드 배지는 본 발명에 따른 기본 배지와 더 잘 조합될 수 있다(도 6, S6: St-St-MEL 대 S6: St-MEL-MEL 비교). 그러나, 피드 배지가 갈락토스 이외의 탄수화물, 예를 들어 포도당을 함유하기 때문에, 본 발명에 따른 기본 배지는 표준 피드 배지와 잘 조합될 수 있다. 특히 기본 배지가 본 발명에 따른 물질을 함유하고 피드 배지가 포도당을 함유할 경우, 세포는 고 세포 농도로 성장한다(도 6, S6: St-MEL-MEL 대 S6: St-MEL-St 비교).
실시예 8:
유사한 실험을 대사적으로 최적화된 세포로도 수행하였다(도 7). 대사적으로 최적화된 세포를 이용한 유가 실험의 영양 배지는 다음과 같다:
이 실시예에서 사용된 영양 배지에서 물질의 최종 농도
포도당
[g/ℓ]		 갈락토스
[g/ℓ]		 락테이트
[g/ℓ]		 글루타민
[g/ℓ]		 글루타메이트[g/ℓ] 아스파라긴[g/ℓ]
실시예의 기본 배지
S1: MEL-MEL-MEL		 0 3 2.5 0 0.8 0.23
실시예의 피드 배지
S1: MEL-MEL-MEL		 0 60 별도 사료 0 7.15 0.15
실시예의 기본 배지
S2: MEL-MEL-St		 0 3 2.5 0 0.8 0.23
실시예의 피드 배지
S2: MEL-MEL-St		 60 0 0 13 0.15 0.15
S1: MEL-MEL-MEL = 대사적으로 최적화된 세포, 본 발명에 따른 기본 배지, 본 발명에 따른 피드 배지
S2: MEL-MEL-St = 대사적으로 최적화된 세포, 본 발명에 따른 기본 배지, 표준 피드 배지
실시예 9: 영양 배지에서 본 발명에 따른 두 물질을 이용한 유가 실험
이 실시예에서, 본 발명에 따른 2개 물질(락테이트 및 숙시네이트)을 유가 실험에서 함께 조합하였다. 다음의 영양 배지 조합을 이 유가 실험을 위해 사용하였다:
이 실시예에서 영양 배지에 사용된 물질의 최종 농도
포도당
[g/ℓ]		 갈락토스[g/ℓ] 락테이트[g/ℓ] 글루타민[g/ℓ] 글루타메이트[g/ℓ] 아스파라긴[g/ℓ] Na-숙시네이트[g/ℓ]
실시예의 기본 배지
S5: MEL-MEL-MEL		 0 3 2 0 0.8 0.23 0
실시예의 피드 배지
S5: MEL-MEL-MEL		 0 35 별도
사료		 0 5 6.15 0
실시예의 기본 배지
S5: MEL-MEL-MEL-S		 0 3 2 0 0.8 0.23 0.5
실시예의 피드 배지
S5: MEL-MEL-MEL-S		 0 35 별도
사료		 0 5 6.15 5
S5: MEL-MEL-MEL = 대사적으로 최적화된 세포, 락테이트를 포함하는 본 발명에 따른 기본 배지, 락테이트를 포함하는 본 발명에 따른 피드 배지
S5: MEL-MEL-MEL-S = 대사적으로 최적화된 세포, 락테이트와 숙시네이트를 포함하는 본 발명에 따른 기본 배지, 락테이트와 숙시네이트를 포함하는 본 발명에 따른 피드 배지
도 8은 숙신산 나트륨이 있고 없는 본 발명에 따른 영양 배지에서 대사적으로 최적화된 세포의 성장 거동을 나타낸다. 도 9는 숙신산 나트륨이 있고 없는 본 발명에 따른 영양 배지에서 락테이트 농도의 변화를 나타낸다.
본 발명의 영양 배지를 사용하면 세포 성장이 개선되거나, 대산 부산물이 감소하며, 따라서 대량의 바람직한 생물 산물이 공정의 전체 기간 동안 얻어질 수 있다.

Claims (46)

  1. CHO 세포의 배양을 위한 세포주 영양 배지에 있어서, 영양 배지가 숙신산, 락트산 및 이들 산의 염으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 0.2 g/ℓ 내지 100 g/ℓ의 농도로 포함하고, 영양 배지가 글루타민을 0 내지 8 mmol/ℓ 미만의 농도로 포함하고, 영양 배지가 무-단백질인 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 숙신산, 락트산 및 이들 산의 염으로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 0.3 g/ℓ 내지 50 g/ℓ의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  4. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 락트산을 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 적어도 하나의 탄수화물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 탄수화물이 포도당, 갈락토스, 과당, 만노스, 리보스, 글루코사민, 자당, 유당 및 이들의 혼합물을 포함하는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  9. 제 7 항에 있어서, 적어도 하나의 탄수화물이 갈락토스인 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  10. 삭제
  11. 제 7 항에 있어서, 영양 배지가 포도당을 0 내지 25 g/ℓ의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  12. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 무-포도당인 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 무-글루타민인 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 아스파라긴을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  20. 삭제
  21. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 글루타메이트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  22. 삭제
  23. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 무-포도당 및 무-글루타민이고, 영양 배지가 아스파라긴을 0.05 g/ℓ 내지 60 g/ℓ의 농도로, 그리고 락트산과 갈락토스를 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  24. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 무-포도당 및 무-글루타민이고, 영양 배지가 글루타메이트를 0.05 g/ℓ 내지 60 g/ℓ의 농도로, 그리고 락트산과 갈락토스를 포함하는 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  25. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 액체 영양 배지인 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  26. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 240 내지 360 mOsmol/kg H2O의 오스몰랄 농도를 갖는 기본 배지인 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  27. 제 1 항에 있어서, 영양 배지가 150 내지 1500 mOsmol/kg H2O의 오스몰랄 농도를 갖는 피드 배지(feed medium)인 것을 특징으로 하는 영양 배지.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. CHO 세포 배양물을 제 1 항에 따른 세포주 영양 배지에 넣고 배양하는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 세포를 포함하는 CHO 세포 배양물의 배양 방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. CHO 세포를 제 30 항의 방법에 따라 배양하고, 적어도 하나의 폴리펩티드, 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 바이러스 성분, 적어도 하나의 바이러스 또는 이들의 혼합물을 세포 배양물 또는 세포주 영양 배지로부터 얻는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 세포를 포함하는 CHO 세포 배양물에서 적어도 하나의 폴리펩티드, 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 바이러스 성분, 적어도 하나의 바이러스 또는 이들의 혼합물의 생산 방법.
  38. 삭제
  39. a) CHO 세포 배양물을 세포 집단으로서 제 1 항에 따른 세포주 영양 배지에서 제 30 항의 방법에 따라 적어도 1주일 동안 배양하고;
    b) 그로부터 세포를 분리하는 것을 특징으로 하는,
    CHO 세포 집단으로부터 유전적으로 변형되고 대사적으로 최적화된 세포의 선택 방법.
  40. 제39항에 있어서, b) 단계에서 분리된 세포를 또 다른 c) 단계에서 새로운 영양 배지에 옮기는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, c) 단계에서 분리된 세포를 증식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
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