LT4012B - Process for the preparation of polipeptides - Google Patents
Process for the preparation of polipeptides Download PDFInfo
- Publication number
- LT4012B LT4012B LTIP1836A LTIP1836A LT4012B LT 4012 B LT4012 B LT 4012B LT IP1836 A LTIP1836 A LT IP1836A LT IP1836 A LTIP1836 A LT IP1836A LT 4012 B LT4012 B LT 4012B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- erythropoietin
- polypeptide
- dna sequence
- dna
- sequence
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Šis išradimas priskiriamas manipuliacijai genetinėmis medžiagomis ir, dalinai, rekombinantinėm metodikom, įgalinančiom gauti polipeptidus, pilnai ar dalinai pasižyminčius pirmine struktūrine konformacija ir/arba viena ar daugiau laisvai sutinkamo eritropoetino biologinių savybių.The present invention relates to the manipulation of genetic materials and, in part, to recombinant techniques for the production of polypeptides having all or part of the parent structural conformation and / or one or more of the biological properties of free erythropoietin.
A. Manipuliacija genetinėmis medžiagomisA. Manipulation with genetic materials
Plačiaja prasme genetines medžiagas galima apibrėžti kaip chemines medžiagas, kurios programuoja ir valdo ląstelių bei virusų komponentų gamybą ir apsprendžia ląstelių bei virusų atsakus. Ilgos grandinės polimerinis junginys, žinomas kaip dezoksiribonukleininė rūgštis (DNR), turi savyje visų gyvų ląstelių ir virusų genetinę medžiagą, išskyrus kai kuriuos virusus, programuojamus ribonukleinine rūgštimi (RNR). Struktūrinėmis grandimis DNR-polimeruose yra keturi skirtingi nukleotidai, kurių kiekvienas sudarytas arba iš purino (adeninas ir guaninas), arba iš pirimidino (timinas ir citozinas), surištų su dezoksiribozo-cukrumi, prie kurio prijungta fosfatinė grupė. Nukleotidų prisijungimas linijinio polimero pavidalu vyksta susijungiant vieno nukleotido 5'fosfatui su kito nukleotido 31-hidroksilo grupe. Funkcionalinė DNR sutinkama stabilių dvisiūlių sanplakų, sudarytų iš atskirų nukleotidų siūlų (žinomų kaip dezoksioligonukleotidai) pavidalu, kurių sanplakos susidaro vandenilinės jungties tarp purininių ir pirimidininių bazių dėka, t.y. komplementarinės sanplakos, egzistuojančios arba tarp adenino (A) ir timino (T), arba tarp guanino (G) ir citozino (C). Nukleotidus priimta vadinti pagal juos sudarančių purininių arba pirimidininių bazių pavadinimus, o nukleotidų komplementarines sanplakas dvisiūlėje DNR (t.y. A-T ir G-C) minėti kaip azotinių bazių poras. Ribonukleinine rūgštis yra polinukleotidas, turintis dažniau adeniną, guaniną, citoziną ir uracilą (U), nei timiną, surištą su riboze arba fosfatinė grupe.In a broad sense, genetic materials can be defined as chemicals that program and control the production of cellular and viral components and determine cellular and viral responses. The long-chain polymeric compound known as deoxyribonucleic acid (DNA) contains the genetic material of all living cells and viruses except for some viruses programmed with ribonucleic acid (RNA). The structured DNA polymers contain four different nucleotides, each consisting of either purine (adenine and guanine) or pyrimidine (thymine and cytosine) bound to a deoxyribose-sugar to which a phosphate group is attached. Nucleotide binding in the form of a linear polymer occurs by coupling one nucleotide 5'-phosphate with another nucleotide's 3 1 -hydroxyl group. Functional DNA is found in the form of stable double-stranded strands consisting of single nucleotide strands (known as deoxyoligonucleotides) formed by a hydrogen bond between purine and pyrimidine bases, that is, a complementary strand existing either between adenine (A) and thymine (A). guanine (G) and cytosine (C). Nucleotides are commonly referred to by the names of their purine or pyrimidine bases, and complementary nucleotides in double-stranded DNA (ie, AT and GC) are referred to as pairs of nitrogenous bases. Ribonucleic acid is a polynucleotide containing more often adenine, guanine, cytosine and uracil (U) than thymine bound to ribose or phosphate group.
Trumpiau kalbant, DNR programuojanti funkcija dažniausiai realizuojama procesu, kurio metu DNR nukleotidų specifinės sekos (genai) transkribuojasi į santykinai nestabilius informacinės RNR (iRNR) polimerus. Savo ruožtu iRNR tampa struktūrinių, reguliatorinių ir katalitinių baltymų susidarymo iš aminorūgščių matrica. Šis iRNR transliacijos procesas apima smulkių RNR siūlų (tRNR) funkcionavimą. kurie transportuoja ir išlygina individualias aminorūgštis išilgai iRNR siūlų, leisdami reikiama aminorūgščių seka susidaryti nukleotidams. iRNR informacija, gaunama iš DNR ir sukuria galimybę tRNR padavimui bei bet kurios iš dvidešimties amino rūgščių orientacijai polipeptido ekspresijai, yra tripletinių kodonų (trijų nukleotidinių bazių tam tikro eiliškumo grupuočių) pavidale. Tam tikra prasme baltymo susidarymas yra galutinė genetinė informacija (apsprendžiama geno nukleotidiniu eiliškumu) programuojama ekspresijos forma.In short, DNA programming function is usually accomplished by the process of transcribing specific nucleotide sequences (genes) into relatively unstable polymers of information RNA (iRNA). In turn, iRNA becomes a matrix for the formation of structural, regulatory, and catalytic proteins from amino acids. This process of iRNA translation involves the functioning of small RNA strands (tRNAs). which transport and align individual amino acids along the strands of the iRNA, allowing nucleotides to form the required amino acid sequence. The iRNA information obtained from the DNA, which enables the tRNA to be delivered and the orientation of any of the twenty amino acids to express the polypeptide, is in the form of triplet codons (three nucleotide bases of particular order). In a sense, protein formation is the programmed expression of the final genetic information (determined by the nucleotide sequence of the gene).
DNR promotorinės sekos paprastai atsiranda anksčiau nei genas DNR-polimere ir paruošia vietą transkripcijos į RNR inicijavimui. DNR reguliatorinės sekos taip pat dažniau yra aukščiau prieš tėkmę (t.y. anksčiau) nei genas šiame DNRpolimere, suriša baltymus, apsprendžiančius transkripcinio inicijavimo dažnį (arba greitį). Kolektyviai įvardijamos “promotorine/reguliatorine arba valdančiąja DNR seka, šios anksčiau nei konkretus genas (ar genų grupės) atsirandančios funkcionaliniame DNR-polimere sekos apsprendžia ar įvyks transkripcija ir, galų gale, geno ekspresija. DNR sekos, lydinčios geną DNR-polimere ir užtikrinančios komandą baigti transkripciją į iRNR, įvardijamos kaip transkribavimo terminatorinės sekos.DNA promoter sequences typically occur earlier than a gene in a DNA polymer and prepare the site for initiation of transcription into RNA. DNA regulatory sequences are also more often upstream (i.e., earlier) than the gene in this DNA polymer that binds proteins that determine the frequency (or rate) of transcriptional initiation. Collectively referred to as “promoter / regulatory or regulatory DNA sequences, these sequences, which occur before a particular gene (or group of genes) in a functional DNA polymer, determine whether transcription and, ultimately, gene expression will occur. DNA sequences that accompany a gene in a DNA polymer and provide a command to terminate transcription into an iRNA are referred to as transcription terminator sequences.
Paskutinio dešimtmečio mikrobiologinės technologijos dėmesio centre yra bandymai pagaminti industrijai bei farmacijai svarbias medžiagas, panaudojant mikroorganizmus, kurie arba neturi iš anksto genetiškai koduotos informacijos, skirtos įterptam į jų DNR pageidaujamam produktui, arba (žinduolių ląstelėms kultūroje) įprastu keliu neišreiškia pastebimame lygmenyje chromosominio geno. Paprasčiau kalbant, genas, apsprendžiantis pageidaujamo polipeptidinio produkto struktūrą yra arba izoliuotas nuo donorinio mikroorganizmo, arba chemiškai susintetintas ir stabiliai introdukuotas į kitą mikroorganizmą (geriausiai save reguliuojantį vienaląstį mikroorganizmą), kaip antai bakterijas, mieles arba žinduolių ląsteles kultūroje. Egzistuojanti genų ekspresijos į transformuotas ar transfektuotas šeimininko mikrobines ląsteles įranga, kurdama pageidaujamą produktą dirba panaudodama ekzogeninę DNR kaip iRNR transkripcijos matricą, kuri po to pertransliuojama į nesibaigiančią amino rūgščių liekanų seką.Microbiological technology of the last decade has focused on attempts to produce industrial and pharmaceutical materials using microorganisms that either do not have pre-genetically encoded information embedded in their DNA desired product or (mammalian cells in culture) do not express detectable levels of the chromosomal gene in the usual way. Simply put, the gene that determines the structure of the desired polypeptide product is either isolated from the donor microorganism or chemically synthesized and stably introduced into another microorganism (preferably self-regulating single-cell microorganism), such as bacteria, yeast or mammalian cells in culture. Existing equipment for gene expression in transformed or transfected host microbial cells works by utilizing exogenous DNA as an transcription matrix of iRNA, which is then translated into an endless sequence of amino acid residues.
Ši technikos sritis dažnai sutinkama patentinėse ir literatūrinėse publikacijose, susijusiose su rekombinantines RNR metodikomis, . skirtomis genetinių medžiagų (naudojamų atrinktų šeimininko mikroorganizmų transformacijai) išskyrimui , sintezei, valymui bei amplifikacijai. JAV patentas Nr. 4237224, išduotas Cohen et ai., pavyzdžiui, skirtas vienaląsčių šeimininko mikroorganizmų su hibridine virusine ar žiedine plazmidine DNR transformacijai, apjungiančiai rinktines ekzogenines DNR sekas. Cohen et ai. patento metodikose pirmą kartą panaudota transformacijos vektoriaus gamyba, besiremianti fermentiškai atskeliamos virusinės arba žiedinės plazmidinės DNR, reikalingos linijinės DNR siūlams formuoti. Atrinkti svetimi (“egzogeniniai” arba heterologiniai) DNR siūlai, paprastai turintys pageidaujamą produktą koduojančias sekas, gaunami linijiniame pavidale panaudojus panašius fermentus. Tiesinė virusinė arba plazmidine DNR auginama su svetima DNR dalyvaujant susiuvantiems fermentams, sugebantiems realizuoti atstatymo procesą, o hibridiniai vektoriai susidaro turėdami atrinktą ekzogenines DNR segmentą, supintą į virusinės ar žiedinės DNR plazmidę.This field of technology is often found in patent and literary publications relating to recombinant RNA methodologies, -. for the isolation, synthesis, purification and amplification of genetic material (used for transformation of selected host microorganisms). U.S. Pat. No. 4,237,224 to Cohen et al., For example, is directed to the transformation of single-cell host microorganisms with hybrid viral or annular plasmid DNA combining selected exogenous DNA sequences. Cohen et al. The patent procedures for the first time utilize the production of a transformation vector based on enzymatically cleaved viral or circular plasmid DNA, which is required to form linear DNA strands. Selected foreign ("exogenous" or heterologous) DNA strands, usually having the coding sequences of the desired product, are obtained in a linear fashion using similar enzymes. Linear viral or plasmid DNA is raised with foreign DNA in the presence of stitching enzymes capable of carrying out the repair process, and hybrid vectors are formed by having a selected exogenous DNA segment wrapped in a viral or circular DNA plasmid.
Suderinamų šeimininko vienaląsčių mikroorganizmų transformacija hibridiniu vektoriumi baigiasi daugkartiniu ekzogenines DNR kopijų šeimininko ląstelių populiacijoje susidarymu. Kai kuriais atvejais pageidaujamu rezultatu yra tiesiog svetimos DNR amplifikacija, o išaugintu produktu yra DNR. Dažniau transformacijos tikslu yra ekspresija, realizuojama šeimininko ląstelių ekzogenines DNR, kaip plataus masto pramonei svarbių baltymo fragmentų arba polipeptido, koduojamų svetimos DNR, sintezė. Žiūrėti, taip pat, pavyzdžiui JAV patentus: Nr.4264731 (išduotas Shine), Nr.4273875 (išduotas Manis), Nr.4293652 (išduotas Cohen), bei Europos patentinę paraišką Nr.093619, publikuotą 1983 metų spalio 9d.Transformation of compatible host single-cell microorganisms with a hybrid vector results in multiple generation of exogenous copies of DNA in the host cell population. In some cases, the desired result is simply amplification of the foreign DNA, and the grown product contains DNA. More commonly, the purpose of transformation is expression realized by the exogenous DNA of host cells as large-scale commercially important protein fragments or polypeptide encoded by foreign DNA. See also, for example, U.S. Patents No. 4264731 (issued to Shine), No. 4273875 (issued to Manis), No. 4293652 (issued to Cohen), and European Patent Application No. 093619, published October 9, 1983.
Specifinių DNR sekų išvystymas iki supynimo į DNR vektorius pasiekiamas panaudojant eilę techninių priemonių, žymia dalimi priklausančių nuo donoro svetimumo projektuojamam šeimininkui laipsnio, bei nuo šeimininko formuojamo polipeptido dydžio. Bijant pernelyg didelio supaprastinimo, galima tvirtinti, jog egzistuoja trys pagrindiniai alternatyvūs būdai: 1) dvisiūlės DNR sekos “išskyrimas” nuo donoro genominės DNR; 2) DNR sekos, sukuriančios dominančio polipeptido kodą, cheminė sintezė; 3) dvisiūlės DNR sekos sintezė in vitro. naudojantis iRNR, išskirtos iš donoro ląstelių, fermentine atvirkštine transkripcija. Minėti būdai, kuriuose naudojamas DNR-iRNR komplemento susidarymas, paprastai įvardijami kaip kDNRbūdai.The development of specific DNA sequences prior to splicing into DNA vectors is accomplished by a number of techniques, which are largely dependent on the degree of foreignness of the donor to the designed host and the size of the polypeptide formed by the host. Fear of over-simplification, it can be argued that there are three main alternatives: 1) "isolation" of the double-stranded DNA sequence from the donor genomic DNA; 2) chemical synthesis of the DNA sequence generating the code of the polypeptide of interest; 3) in vitro DNA sequence synthesis. using enzymatic reverse transcription of iRNAs isolated from donor cells. The aforementioned techniques involving the use of DNA-iRNA complement formation are commonly referred to as cDNA techniques.
DNR sekų gavimas dažnai yra pasirinkimo metodu, kuomet žinoma pilna pageidaujamo polipeptido aminorūgščių liekanų seka. DNR gavimo metodikos aprašytos lygiagrečiai peržiūrimoje paraiškoje JAV patentui Nr.483451 (paduotoje 1983m. balandžio 15d. ir, atitinkamai, paraiškoje PCT US 83/0085, publikuotoje 1983m. lapkričio 24d. numeriu W083/04053), pavyzdžiui, sukuria priemones tokių ypatingai laukiamų rezultatų pasiekimui, kaip:Obtaining DNA sequences is often the method of choice when the full amino acid sequence of the desired polypeptide is known. Methods for obtaining DNA are described in the co-pending U.S. Patent No. 4,834,451 (filed April 15, 1983 and, respectively, PCT US 83/0085, published November 24, 1983, under No. WO83 / 04053), for example, providing tools for such highly anticipated results. achievement as:
1) numatymas besikaitaliojančių kodonu, paprastai stebimų šeimininko mikroorganizme, atrinktame ekspresijai (pvz., geriausių kodonu numatymas mielėse arba E.Coli); 2) netransliuojamų introninių sekų išvengimas (paprastai sutinkamų žinduolių genominėse DNR sekose, bei jų RNR matricose), kurios yra be vargo apdorojamos šeimininko ląstelių; 3) nepageidaujamų polipeptidinių sekų išvengimas (paprastai koduojamų genominėmis DNR ir kDNRsekomis tačiau dažnai sunkiai atskiriamomis, naudojant bakterines ar mielines šeimininko ląsteles, nuo dominančio polipeptido); 4) numatymas lengvo DNR įmontavimo į tinkamus ekspresyvinius vektorius samplakose su pageidaujamomis promotorinėmis/reguliatorinėmis ir terminatorinėmis sekomis; 5) numatymas lengvo genų sumontavimo, kurie koduotų polipeptidinius fragmentus bei pageidaujamų polipeptidų analogus.(1) prediction of alternating codons commonly observed in the host microorganism selected for expression (eg, prediction of the best codon in yeast or E. coli); 2) avoidance of untranslated intronic sequences (typically found in mammalian genomic DNA sequences and their RNA arrays) that are readily processed by host cells; 3) avoidance of unwanted polypeptide sequences (usually encoded by genomic DNA and cDNA sequences but often difficult to distinguish, using bacterial or yeast host cells, from the polypeptide of interest); 4) predicting easy insertion of DNA into suitable expression vectors in templates with desired promoter / regulatory and terminator sequences; 5) predicting easy assembly of genes encoding polypeptide fragments and analogs of desired polypeptides.
Kuomet pilna pageidaujamo polipeptido aminorūgščių liekanų seka nėra žinoma, betarpiškas DNR sekų gavimas yra neįmanomas. DNR sekų, koduojančių polipeptidus kDNR metodu, izoliavimas tampa parinkimo metodu, nežiūrint į galimus ekspresijos vektorių (sugebančių užtikrinti aukštą, kaip minėta anksčiau, mikrobinio ekspresyvumo lygį) montavimo sunkumus. Tarp standartinių kDNR sekų izoliavimo metodikų yra plazmidinių kDNR-bibliotekų, atsirandančių dėka atbulinės kDNR transkripcijos, dažnai sutinkamos donoro ląstelėse, atrinktose atsakingomis už genų aukšto lygio ekspresiją (pvz. kDNR bibliotekos, atsiradusios iš ląstelių, išskiriančių santykinai didelius augimo hormonų produktų kiekius). Kuomet žinomos didelės polipeptidų amino rūgščių sekos dalys, tuomet žymėtas, zondines vienasiūles DNR sekas, dubliuojančias seką, spėjamai esančią planinėje kDNR, galima panaudoti metodikose, aprašytose JAV patente Nr.439443, išduotame VVeissman et ai. Ilgų oligonukleotidinės hibridizacijos zondų panaudojimas aptariamas šiuose darbuose: VVallace et ai., Nucl. Acids Res., 6, p.3543-3557(1979), Reyes et ai. P.N.A.S. (USA), 79, p.3270-3274( 1982) ir Iaye et ai., Nucl. Acids Res., 11, p.2325-2335(1983). Taip pat žiūrėkite JAV patentą Nr.435835, išduotą Falkow et ai. ir aprašantį DNR/DNR-hibridizacijų (diagnostikos metu) metodikas; publikuotas Europos patentines paraiškas Nr.0070685 ir Nr.0070687, priskirtinas šviesą skleidžiančiom žymėm vienasiūliuose polinukleotidiniuose zonduose; darbą: Davis et ai. Manual for Genetic Engineering anoanced Bacteriae Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. p.55-58 ir p.174-176(1980), skirtą hibridizacijos metodikoms bei epideminiams susirgimams ir New England Nuclear (Boston, Mass), Gene. Screen Hybridization Transfer membrane materials.When the complete amino acid residue sequence of the desired polypeptide is not known, direct DNA sequencing is not possible. Isolation of DNA sequences encoding polypeptides by the cDNA method becomes a method of selection, despite the potential difficulties of fitting expression vectors (capable of providing a high level of microbial expression as mentioned above). Standard methods for isolating cDNA sequences include plasmid cDNA libraries resulting from reverse transcription of cDNAs, often found in donor cells selected for high levels of gene expression (e.g., cDNA libraries derived from cells expressing relatively high levels of growth hormone products). When large portions of the amino acid sequence of polypeptides are known, then labeled probe single-stranded DNA sequences that duplicate the sequence presumed in the target cDNA can be used in the methods described in Weissman et al., U.S. Patent No. 4,394,443. The use of long oligonucleotide hybridization probes is discussed in Wallace et al., Nucl. Acids Res., 6, 3543-3557 (1979), Reyes et al. P.N.A.S. (USA), 79, pp.3270-3274 (1982) and Iaye et al., Nucl. Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). See also U.S. Patent No. 4,358,335 to Falkow et al. and descriptive methodologies for DNA / DNA hybridization (during diagnostics); European Patent Applications Nos. 0070685 and 0070687, assigned to light emitting tags in single-stranded polynucleotide probes; work: Davis et al. Manual for Genetic Engineering anoanced Bacteriae Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. p.55-58 and p.174-176 (1980) for hybridization techniques and epidemic diseases and New England Nuclear (Boston, Mass), Gene. Screen Hybridization Transfer membrane materials.
Vienas svarbiausių nesenų pasiekimų metodikose, skirtose rekombinantiniu klonų ekranavimo hibridizacijai, yra žymėtų mišrių oligonukleotidinių zondų panaudojimas, kurių kiekvienas potencialiai yra specifinės DNR sekos, apimančios heterogeninį vienasiūlių DNR ir RNR mišinį, pilnu komplementu. Šios metodikos pripažintos ypatingai naudingomis išaiškinant kDNRklonus, gautus iš šaltinių, sukuriančių labai mažus dominančio polipeptido iRNR sekų kiekius. Trumpiau kalbant, griežtų hibridizacijos sąlygų naudojimas (siekiant išvengti nespecifinių sujungimų), kartais klonoautoradiografinę vizualizacij ą pabaigoje tam vieninteliam mišinio zondui, kuris yra jos pilnu komplementu. Daugiausiai žiūrėkite: Wallace et ai., Nuc. Acids, Res., 9, p.879-897(1981); Suggs et ai., P.N.A.S. (USA), 78, p.6613-6617(1981); Choo et ai., Nature, 299, p. 178180(1982); Kurachi et ai., P.N.A.S. (USA),79, p.64616464(1982); Ohkubo et ai.,P.N.A.S. (USA), 80, p.2196-2200 (1983); Kornblihtt et ai., P.N.A.S. (USA), 80, p.32183222(1983).One of the most important recent advances in techniques for recombinant clone screening hybridization is the use of labeled hybrid oligonucleotide probes, each of which is a complete complement of a specific DNA sequence comprising a heterogeneous mixture of single-stranded DNA and RNA. These methodologies have been found to be particularly useful for the detection of cDNA clones obtained from sources that generate very small amounts of the polypeptide iRNA sequences of interest. In short, the use of stringent hybridization conditions (to avoid nonspecific fusions) sometimes clonautoradiographic visualization at the end of a single mixture probe that is in its full complement. Mostly see: Wallace et al., Nuc. Acids, Res., 9, pp. 879-897 (1981); Suggs et al., P.N.A.S. (USA), 78, pp. 6613-6617 (1981); Choo et al., Nature, 299, p. 178180 (1982); Kurachi et al., P.N.A.S. (USA), 79, p.64616464 (1982); Ohkubo et al., P.N.A.S. (USA), 80, pp. 2196-2200 (1983); Kornblihtt et al., P.N.A.S. (USA), 80, p.32183222 (1983).
Aplamai, darbo: VVallace et ai. (1981) mišrių zondų metodikos įvairių autorių buvo išplėstos iki momento, kuomet buvo pranešama apie gautus patikimus rezultatus izoliuojant kDNR klonus, panaudojant mišrų 32-narių oligonukleotidinių zondų įgalina specifinio kDNR hibridizacijosIn general, work: Wallace et al. (1981) mixed probe techniques have been extended by various authors to the point where reliable results were reported for the isolation of cDNA clones using hybrid 32-membered oligonucleotide probes to enable specific cDNA hybridization.
Ί pulą, kurių ilgis 16 pagrindų (16-men), tolygiai besikeičiančių DNR sekų kartu su vienetiniu 11-men, skirtų dvipoziciniam teigiamam dominančio kDNR patvirtinimui. Žiūrėkite darbą Singer-Sam et ai., P.N.A.S. (USA), 80, p.802806(1983).Ί a pool of 16 bases (16-men) of uniformly fluctuating DNA sequences, together with a unit of 11-men for two-way positive confirmation of the cDNA of interest. See the work in Singer-Sam et al., P.N.A.S. (USA), 80, p.802806 (1983).
Genominės DNR izoliatų panaudojimas iš trijų anksčiau minėtų būdų yra mažiausiai paplitęs specifinių sekų, naudojamų rekombinantinėse metodikose, išvystymui. Tai ypatingai teisinga rekombinantinėm metodikom, skirtom žinduolių polipeptidų mikrobinio ekspresyvumo užtikrinimui, ir daugiausia apsprendžiama žinduolių genominės DNR sudėtingumu. Tuo būdu, nors ir egzistuoja patikimos metodikos žmogaus bei kitų žinduolių genominės DNR vystymui [ žiūrėkite, pavyzdžiui, darbą Lown et ai., 15, p.1157-1174(1978), skirtą žmogaus genominės bibliotekos (paprastai įvardinamos kaip Maniatis biblioteka) generavimo metodikoms; darbą Karn et ai.,The use of genomic DNA isolates from the three methods mentioned above is the least common for the development of specific sequences used in recombinant techniques. This is particularly true for recombinant methodologies for the microbial expression of mammalian polypeptides, and is largely determined by the complexity of mammalian genomic DNA. Thus, although reliable methodologies exist for the development of human and other mammalian genomic DNA [see, for example, Lown et al., 15, pp.1157-1174 (1978), for methodologies for generating a human genomic library (commonly referred to as Maniatis library). ; work by Karn et al.,
P.N.A.S. (USA), 77, p.5172-5176(1980), nagrinėjantį žmogaus genominę biblioteką endonukleazinės fragmentacijos alternatyvaus apribojimo metodu; darbą Blatnes et ai., Science, 196, p.161-169(1977), aprašantį jaučio genominės bibliotekos struktūrą ], atlikta keletas gana sėkmingų bandymų panaudojant hibridizacijos įzoliuotoje genominėje DNR metodikas, nesant perspektyvinio amino rūgščių ar DNR sekų numatymo. Kaip pavyzdį galima pateikti darbą Fiddes et ai. J. Mol. and App. Genetics, 1, p.3-18(1981), kuriame pranešama apie sėkmingai izoliuotą geną, koduojantį alfa-subvienetą žmogaus hipofizarinių glikoproteidinių hormonų, panaudojant maksimaliai ilgą zondą, apimantį pilną 621 azotinių bazių porų (iš prieš tai alfa-subvienetui izoliuotos kDNR sekos) fragmentą. Kitame darbe Das et ai., P.N.A.S. (USA), 80, p.1531-1535(1983) pranešama apie žmogaus genominių klonų izoliavimą HLA-DR žmogui, panaudojant 175 poras azotinių bazių turintį sintetinį oligonukleotidą. Ir, pagaliau, darbe Anderson et ai., P.N.A.S. (USA), 80, p.6838-6842(1983) pranešama apie jaučio genominio klono pankreatino tripsininio inhibitoriaus (BPTI) izoliaciją panaudojant vienetinį zondą, turintį 86 azotinių bazių ilgį bei sumontuotą pagal žinomą BPTI amino rūgščių seką. Autoriai pažymi prastas perspektyvas izoliuojant iRNR, tinkamos kDNR bibliotekos sintezei, nes stebimi akivaizdžiai žemi iRNR lygmenys pirminiai pasirinktuose šaltiniuose: paausinėje liaukoje ir plaučio audiniuose. Po to išreiškiama viltis, jog pavyks genominės bibliotekos zondavimas panaudojant žymėtų zondų mišinį ir konstatuojama: Mišrių sekų oligodezoksinukleotidiniai zondai daugiausiai buvo naudojami nežinomos sekos baltyminių genų išskyrimui iš kDNR bibliotekų. Tokie zondai paprastai yra 8-32 oligonukleotidų mišinys, turintis 14-17 nukleotidų ilgį ir yra kiekvienos imamos nedidelio ilgio (5-6 liekanos) aminorūgščių sekos kodonų kombinacijos tipiški atstovai. Griežtomis hibridizacijos sąlygomis, kuomet susidaro prasta situacija neteisingai suporuotų azotinių liekanų zondams, šie mišiniai sugeba lokalizuoti genų specifinės sekas nedidelio sudėtingumo klonalinėse bibliotekose. Nežiūrint to, dėl savo menko ilgio bei nevienalytiškumo, mišrūs zondai dažnai netenka specifiškumo, reikalingo zonduojant tokias sudėtingas sekas, kaip žinduolių genomas. Dėl to šis būdas tampa nepraktišku izoliuojant žinduolių baltyminius genus, kuomet atitinkamos iRNR yra nepasiekiamos.” (Nuorodų nėra).P.N.A.S. (USA), 77, pp. 5172-5176 (1980), which deals with the human genomic library by an alternative restriction method of endonuclease fragmentation; Blatnes et al., Science, 196, p.161-169 (1977), describing the structure of a bovine genomic library], have undergone some relatively successful attempts using hybridization in isolated genomic DNA techniques without the prospective prediction of amino acids or DNA sequences. An example is Fiddes et al. J. Mol. and App. Genetics, 1, pp. 3-18 (1981), which reports a successfully isolated gene encoding an alpha subunit of human pituitary glycoprotein hormones using a maximally long probe comprising 621 complete pairs of nitrogenous bases (cDNA sequences previously isolated to the alpha subunit). ). In another work, Das et al., P.N.A.S. (USA), 80, pp. 1531-1535 (1983) reported the isolation of human genomic clones in a HLA-DR human using 175 pairs of nitrogen-based synthetic oligonucleotides. And finally, in the work of Anderson et al., P.N.A.S. (USA), 80, pp. 6838-6842 (1983) reported the isolation of a bovine genomic clone pancreatin trypsin inhibitor (BPTI) using a single probe having a length of 86 nitrogen bases and assembled according to a known amino acid sequence of BPTI. The authors note the poor prospects for isolation of iRNAs suitable for synthesis of the cDNA library, since apparently low levels of iRNAs in primary sources, parotid gland and lung tissue, are observed. Thereafter, the hope is expressed that the probe of the genomic library using a mixture of labeled probes will be successful and it is stated: Mixed sequence oligodeoxynucleotide probes were mainly used to isolate protein sequences of unknown sequence from cDNA libraries. Such probes are typically a mixture of 8-32 oligonucleotides having a length of 14-17 nucleotides and are representative of each of the sampled small length (5-6 residues) amino acid sequence codon combinations. Under stringent hybridization conditions, where the poor situation for mismatched nitrogen residue probes is created, these mixtures are capable of localizing gene-specific sequences in low-complexity clonal libraries. Nevertheless, due to their short length and heterogeneity, hybrid probes often lose the specificity needed to probe complex sequences such as the mammalian genome. As a result, this approach becomes impractical for the isolation of mammalian protein genes when the corresponding iRNAs are unavailable. ”(No references).
Tuo būdu šioje technikos srityje išliko poreikis tobulinti greitos ir efektyvios kDNR klonų izoliacijos metodus ypač tais atvejais, kuomet mažai žinoma apie aminorūgščių sekas bei įsodrinti iRNR audinio šaltiniai nelabai pasiekiami kDNR bibliotekų montavimui. Tokie patobulinti metodai būtų ypatingai naudingi, jei galėtų būti panaudojami žinduolių genominių klonų izoliavimui, kuomet informacija apie amino rūgštines polipeptido (koduojamas ieškomo geno) sekas būtų nepilna.Thus, there remains a need in the art to develop methods for rapid and efficient isolation of cDNA clones, especially when little is known about amino acid sequences and enriched iRNA tissue sources are not readily available for cDNA library assembly. Such improved methods would be particularly useful if they could be used to isolate mammalian genomic clones when information on the amino acid sequences of the polypeptide (encoded by the gene being searched for) was incomplete.
B. Eritropoetinas, kaip dominantinis polipeptidasB. Erythropoietin as the dominant polypeptide
Eritropoezė (raudonųjų kraujo kūnelių gamyba) vyksta visą žmogaus gyvenimą tam, kad kompensuotų suirusias ląsteles. Eritropoezė - tai labai tiksliai reguliuojamas fiziologinis mechanizmas, kuris leidžia kraujuje pasigaminti pakankamam kiekiui raudonųjų kraujo kūnelių, reikalingų teisingai organizmo oksigenacijai, bet ne tokiai didelei, kad ląstelės trukdytų kraujotakai. Raudonųjų kraujo kūnelių gamyba vyksta kaulų čiulpuose kontroliuojant hormonui eritropoetinui.Erythropoiesis (production of red blood cells) occurs throughout human life to make up for the disruption of cells. Erythropoiesis is a highly regulated physiological mechanism that allows the blood to produce a sufficient number of red blood cells, which are needed for proper oxygenation in the body, but not so high that the cells interfere with blood flow. The production of red blood cells occurs in the bone marrow under the control of the hormone erythropoietin.
Eritropoetinas - rūgštus glikoproteidas, kurio molekulinė masė apie 34000 Daltonų, gali būti sutinkamas trijose formose:^ , fi> ir asialo. ir [2> formos nežymiai skiriasi angliavandeniniais komponentais, tačiau turi vienodą potenciją, biologinį aktyvumą bei molekulinę masę. Asialo forma - tai ck ir β> forma be galinio angliavandenio (sialo rūgšties). Kai organizmas yra sveikas ir audiniai gauna pakankamą oksigenaciją iš esančio eritrocitų kiekio, eritropoetino koncentracijos plazmoje yra labai žemos. Ši normaliai žema koncentracija yra pakankama, kad vyktų normali raudonųjų kraujo kūnelių, kurie paprastai žūva oksidacijos procese, kaita.Erythropoietin, an acidic glycoprotein with a molecular weight of about 34,000 Daltons, can be found in three forms: ^, fi> and asial. and [2> forms differ slightly in carbohydrate components, but have the same potency, biological activity and molecular weight. The form of asial is the form of ck and β> without terminal carbohydrate (sialic acid). Plasma concentrations of erythropoietin are very low when the body is healthy and the tissues receive sufficient oxygenation from the red blood cells. This normally low concentration is sufficient for normal red blood cell turnover, which is usually killed by oxidation.
Eritropoetino kiekis kraujo plazmoje didėja hipoksijos sąlygomis, kai sumažėja kraujotakoje deguonies pernešimas kraujo ląstelėmis. Hipoksija gali būti dėl prarasto didelio kraujo kiekio kraujuojant, yrant raudoniesiems kraujo kūneliams radiacinio spinduliavimo pasėkoje, sumažėjus deguonies gavimui aukštumose ar ilgai užtrukus būklei be sąmonės, o taip pat prie įvairių anemijos formų.Plasma erythropoietin levels increase with hypoxia, resulting in a reduction of blood oxygenation. Hypoxia can be due to the loss of high blood volume during bleeding, the erosion of red blood cells due to radiation, decreased oxygen uptake or prolonged unconsciousness, and various forms of anemia.
Veikiant hipoksijos paveiktiems audiniams, eritropeptinas padidina raudonųjų kraujo kūnelių gamybą, stimuliuojant pirminių kraujodaros ląstelių virtimą proeritroblastais kaulų čiulpuose, kur palaipsniui subręsta, sintezuoja hemoglobiną ir realizuojasi kraujotakoje kaip raudonieji kraujo kūneliai. Kai raudonųjų kraujo kūnelių kiekis kraujuje didesnis, negu būtina, kad aprūpinti audinius deguonimi, eritropoetino kiekis kraujotakoje sumažėja.In hypoxia-exposed tissues, erythropeptin increases the production of red blood cells by stimulating the conversion of primary hematopoietic cells to pro-erythroblasts in the bone marrow, where it gradually matures, synthesizes hemoglobin, and is released into the bloodstream as red blood cells. Erythropoietin blood flow is reduced when red blood cells exceed the levels needed to provide oxygen to the tissues.
Žiūrėkite daugiausia šiuos darbus: Testą et ai., Exp. Hematol, 8(Supp.8), 144-152(1980); Tong et ai., J. Biol Chem, 256 (24), 12666-12672(1981); Goldvvasser, J.,Cell Plupiol, 110(Supp.I), 133-135(1982); Finch, Blood., 60(6), 12411246(1982); Sytowski et ai., Exp. Hemat., 8(Supp.8), 5264(1980); Naughton, Cenn, Clin. Lab. Sec, 13(5), 432438(1983); VVeiss et ai., Am. J.,Vet Res, 44(10), 18321835(1983); Lappin et ai., Exp.Hematol, 11(7), 661-666(1983); Murphy et ai., Actą Hematologica Japonica 46(7), 13801396(1983); Dessypris et ai., Brit. J· Haematol, 56, 295306(11984); ir Enumananael et ai., Am. J.Physiol, 247(1 ptSee mainly the following works: Test et al., Exp. Hematol, 8 (Supp.8), 144-152 (1980); Tong et al., 1981, J. Biol Chem. 256 (24): 12666-12672; Goldvasser, J., Cell Plupiol, 110 (Supp.I), 133-135 (1982); Finch, Blood., 60 (6), 12411246 (1982); Sytowski et al., Exp. Hemat., 8 (Supp.8), 5264 (1980); Naughton, Cenn, Clin. Lab. Sec., 13 (5), 432438 (1983); Weiss et al., Am. J., Vet Res, 44 (10), 18321835 (1983); Lappin et al., Exp. Hematol, 11 (7), 661-666 (1983); Murphy et al., Act Hematologica Japonica 46 (7), 13801396 (1983); Dessypris et al., Brit. J · Haematol, 56, 295306 (11984); and Enumananael et al., Am. J.Physiol, 247 {1 pt
2),168-76(1984).2), 168-76 (1984).
Kadangi eritropoetinas yra svarbus susidarant raudoniesiems kraujo kūneliams, hormonas turi potencialiai naudingą panaudojimą kaip diagnostikoje, taip ir gydant kraujo pakitimus, susijusius su mažu ar nepakankamu raudonųjų kraujo kūnelių kiekiu. Žiūrėkite šiuos darbus: Penathur-Das et ai., Blood, 63 (5), 1168-1171 (1984) ir Haddy, Asn. Yuor. Ped. Hematol./Oncol., 4, 191 -196 (1982) apie eritropoetiną gydant ligas, o taip pat Eschbach et ai., J. Clin. Invest., 74 (2), 434-441 (1984), kur aprašytas terapinis režimas ureminei airai, remiantis reakcija in vivo, į plazmos, praturtintos eritropoetinu, įpylimą, ir pasiūlyta dozė 10 V EPO/kg per dieną, kuri koreguoja tokio tipo, susijusią su lėtiniu inkstų funkcijos nepakankamumu, anemiją 15-40 d. bėgyje. Taip pat žiūrėkite darbus Krane, Henry Ford, Hosp. Med. J., 31 (3), 177-181 (1983). Neseniai buvo nustatyta, kad pakankamų eritropoetino kiekių buvimas vien JAV per metus išgydys nuo anemijos 1600000 žmonių. Žiūrėkite, pvz., Morrison, “Bioprocessing in Space on Overvievv”, psl. 557-571 in the World Biotech. Report 1984, Volume 2: USA, Online Publications, New York, N.Y. (1984). Paskutiniai tyrimai sudarė pagrindą numatytos eritropoetino terapijos efektyvumą hematologinių susirgimų, sutrikimų ir būklių įvairovei: Vedaoto et ai., Actą Haematol., 71, 211-213 (1984) (beta-talasemija); Oichinsky et ai., J. Pediatr., 105(1), 15-21 (1984) (cistinė fibrozė); Cotes et ai., Brit. J. Obstet. Gyneacol., 94(4), 304311 (1983) (nėštumas, menstruacijų ciklo sutrikimai); Haga et ai., Actą Pediatr. Scand., 72, 827-831 (1983) (ankstyvoji neišnešiotumo anemija); Claus-Walker et ai., Arch. Phys. Med. Rehabil., 65, 370-374 (1984) ( stuburo smegenų pažeidimai); Dunn et ai., Eur. J. Appl. Physiol., 52, 178-182 (1984) (kosminis skrydis); Miller et ai., Brit. J. Haematol., 52, 545-590 (1982) (ūmus kraujo netekimas); Udupe et ai., J. Lab. Clin. Med., 103(4), 574-580 ir 581-588 (1984); Lipschitz et ai., Blood, 63(3), 502-509 (1983) (senėjimas); Dainiah et ai., Cancer, 51(6), 1101 -1106 (1983) ir Schvvartz et ai., Otolaryngol., 109, 269-272 (1983) (įvairios noeplastinių būklių ligos, lydimos nenormalios eritropoezės).Because erythropoietin is important for the production of red blood cells, the hormone has potentially beneficial uses both in diagnostics and in the treatment of blood disorders associated with low or insufficient red blood cell counts. See the following works: Penathur-Das et al., Blood, 63 (5), 1168-1171 (1984) and Haddy, Asn. Yuor. Ped. Hematol./Oncol., 4, 191-196 (1982) on erythropoietin in the treatment of diseases, and Eschbach et al., J. Clin. Invest., 74 (2), 434-441 (1984), which describes a therapeutic regimen for uremic oestrus based on an in vivo response to infusion of plasma enriched with erythropoietin, and proposes a dose of 10 U EPO / kg / day that corrects for this type of , associated with chronic renal failure, anemia for 15-40 days. on the track. See also works at Crane, Henry Ford, Hosp. Med. J., 31 (3), 177-181 (1983). Recently, it has been estimated that the presence of sufficient amounts of erythropoietin in the US alone will cure 1600,000 people a year. See, e.g., Morrison, "Bioprocessing in Space on Overviev", p. 557-571 in World Biotech. Report 1984, Volume 2: USA, Online Publications, New York, N.Y. (1984). Recent studies have provided the basis for the efficacy of proposed erythropoietin therapy in a variety of hematologic disorders, disorders and conditions: Vedaoto et al., 1984, Acta Haematol., 71, 211-213 (beta-thalassemia); Oichinsky et al., J. Pediatr., 105 (1), 15-21 (1984) (cystic fibrosis); Cotes et al., Brit. J. Obstet. Gyneacol., 94 (4), 304311 (1983) (pregnancy, menstrual disorders); Haga et al., Act. Pediatr. Scand., 72, 827-831 (1983) (early anemia of prematurity); Claus-Walker et al., Arch. Phys. Med. Rehabil., 65, 370-374 (1984) (spinal cord injury); Dunn et al., Eur. J. Appl. Physiol., 52, 178-182 (1984) (space flight); Miller et al., Brit. J. Haematol., 52, 545-590 (1982) (acute blood loss); Udupe et al., J. Lab. Clin. Med., 103 (4), 574-580 and 581-588 (1984); Lipschitz et al., Blood, 63 (3), 502-509 (1983) (aging); Dainiah et al., Cancer, 51 (6), 1101-1106 (1983) and Schvvartz et al., Otolaryngol., 109, 269-272 (1983) (various diseases of noeplastic conditions accompanied by abnormal erythropoiesis).
Ankstesni bandymai gauti eritropoetiną su gera išeiga iš kraujo plazmos ar šlapimo yra santykinai nesėkmingi. Sudėtinga ir reikalaujančia tikslumo laboratorine technika paprastai gaunami maži užterštų ir nestabilių ekstraktų, turinčių eritropoetino, kiekiai.Previous attempts to obtain erythropoietin with good plasma or urinary yield have been relatively unsuccessful. Small amounts of contaminated and unstable extracts containing erythropoietin are usually obtained with sophisticated and demanding laboratory techniques.
išskyrimo iš ligonių, sergančių būdas aprašytas Miyake et ai., J. rugpjūčio 10) p.5558-5564 darbe. Ši apima jonų mainų chromatografiją, gelio filtraciją, adsorbcinę kurio aktyvumas 70400the method of isolation from diseased patients is described in Miyake et al., J. August 10) pp.5558-5564. This includes ion exchange chromatography, gel filtration, adsorbent activity 70400
JAV patente Nr.3033758 aprašytas būdas kaip dalinai išvalyti eritropoetiną iš avino plazmos, kai gaunama mažai bepriemaišinio eritropoetino ekstrakto, turinčio eritropoetino. Pirminiuose bandymuose išskirti eritropoetiną iš šlapimo gauti nestabilūs, biologiškai neaktyvūs hormono preparatai. JAV patente Nr.3865801 aprašytas būdas kaip stabilizuoti išskirtos iš šlapimo medžiagos, turinčios eritropoetino, biologinį aktyvumą. Gaunamas eritropoetino preparatas, pasižymintis 90 % eritropoetino aktyvumo ir yra stabilus.U.S. Patent No. 3033758 describes a method for partially purifying erythropoietin from plasma of lambs when a low amount of an impure erythropoietin-containing erythropoietin is obtained. Initial tests have shown the release of unstable, biologically inactive hormone erythropoietin from urine. U.S. Patent No. 3,865,801 describes a method for stabilizing the biological activity of an urinary substance containing erythropoietin. Erythropoietin is obtained with 90% erythropoietin activity and stability.
Kitas eritropoetino aplastine anemija, šlapimo Biol. Chem., 252, 15 (1977 septynių stadijų metodika nusodinimą etanoliu, chromatografiją. Gaunamas eritropoetinas,Another erythropoietin in aplastic anemia, urinary Biol. Chem., 252, 15 (1977, Seven-Step Ethanol Deposition, Chromatography. Erythropoietin is obtained.
V/mg baltymo, esant 21 % išeigai.V / mg protein at 21% yield.
JAV patente Nr.4397840, išduotame Takezavvra et ai., aprašyti “eritropoetininio produkto gavimo” iš sveikų žmonių su skausmingais katijonitais šlapime būdai ir tvirtinama, kad gauti mažos molekulinės masės produktai “neturi inhibuojančio poveikio eritropoetinui”.U.S. Patent No. 4,379,740 to Takezavvra et al., Describes methods of "obtaining an erythropoietin product" from urine in healthy individuals with painful cations. It is stated that low molecular weight products "have no inhibitory effect on erythropoietin".
Paraiškoje Didžiosios Britanijos patentui Nr.2085887, Sigimoto et ai., išspausdintame 1982 m. gegužės 6 d., aprašytas būdas, kaip gauti hibridines limfoblastoidines žmogaus ląsteles ir pranešama, kad eritropoetino produkavimo lygis yra 3-420 vienetų/ml ląstelių suspensijos (paskirstytų kultūroje po dauginimo šeimininke-žinduolyje, koncentracij ai).In British Patent Application No. 2085887, Sigimoto et al. A method for obtaining hybrid lymphoblastoid human cells is described on May 6, 2005 and the production level of erythropoietin is reported to be 3-420 units / ml of cell suspension (distributed after culture in host-mammalian concentrations).
Esant pačiai aukščiausiai tvirtinama, turi būti pasiekta, greitis sudaro nuo 40 iki 4000 vienetų/106 ląstelių per 48 vai. in vitro kultūroje su vėlesniu ląstelių perkėlimu į dauginimo sistemas in vivo. (Žiūrėkite atitinkamą ekvivalentišką JAV patentą Nr.4377513).At the highest fitting, must be achieved, speeds of 40 to 4000 units / 106 cells per 48 hours. in vitro culture with subsequent cell translocation to proliferation systems in vivo. (See the corresponding equivalent U.S. Patent No. 4,375,713).
Buvo daug pasiūlymų, kaip išskirti eritropoetiną iš audininių šaltinių, tačiau jo išeiga buvo labai maža. Žiūrėkite, pvz., darbus Jekman et ai., Exp. Hematol., 11(7), 581-588 (1983); Tambaurin et ai., P.N.A.S. (USA), 80, 6269-6273(1983); Katsuoka et ai., Gann, 74, 534-541 (1983); Hagiwara esant 107 ląstelių/ml kuri kaip produkavimo produkcijai, eritropoetino et ai., Blood, 63(4), 828-835 (1984); ir Choppin et ai., Blood, 64(2), 341-347 (1984).There have been many suggestions for the elimination of erythropoietin from tissue sources, but its yield has been very low. See, e.g., Jekman et al., Exp. Hematol., 11 (7): 581-588 (1983); Tambaurin et al., PNAS (USA), 80, 6269-6273 (1983); Katsuoka et al., Gann, 74, 534-541 (1983); Hagiwara at 10 7 cells / ml which is a product of production, erythropoietin et al., Blood, 63 (4), 828-835 (1984); and Choppin et al., Blood, 64 (2), 341-347 (1984).
Kitos išskyrimo technologijos, naudojamos gauti išvalytą eritropoetiną, apėmė imunologines metodikas. Poliklonas, esantis plazmos antikūnų dariniu, nukreiptu prieš eritropoetiną, vystosi injekuojant į žiurkę ar triušį žmogaus eritropoetiną. Injekuotas žmogaus eritropoetinas bus atpažintas kaip antigeninis svetimkūnis gyvulio imuninėje sistemoje ir sukels antikūnų gamybą prieš antigeną.Other isolation techniques used to obtain purified erythropoietin included immunoassays. The polyclonal, a derivative of a plasma antibody directed against erythropoietin, develops by injection into human or erythropoietin rats or rabbits. The injected human erythropoietin will be recognized as an antigenic foreign body in the animal's immune system and will trigger the production of antibodies against the antigen.
Skirtingos ląstelės, reaguodamos į stimuliavimą antigenine medžiaga, gamina ir paskleidžia kraujotakoje antikūnus, šiek tiek besiskiriančius nuo tų, kuriuos gamina kitos reaguojančios ląstelės. Kuomet gyvūno kraujas yra ekstrahuojamas, antikūnų aktyvumas jo plazmoje išlieka. Ir nors nevalyta plazma arba antikūnų preparatai, išvalyti kaip imunoglobulino G plazmos frakcija, po to gali būti panaudoti nustatant kompleksų susidarymą su žmogaus eritropoetinu, tai nėra patogu. Šis plazmos antikūnas, sudarytas iš įvairių skirtingų antikūnų, gaminamų atskirų ląstelių, pagal savo prigimtį yra polikloninis ir bendruose ekstraktuose su komponentais sudaro kompleksus kitaip negu vienetinis eritropoetinas.Different cells respond to antigenic stimulation to produce and circulate antibodies in the bloodstream that are slightly different from those produced by other reactive cells. When an animal's blood is extracted, its activity in the plasma remains. And although crude plasma or antibody preparations purified as the plasma fraction of immunoglobulin G can subsequently be used to detect complexation with human erythropoietin, it is not convenient. This plasma antibody, made up of a variety of different antibodies produced by individual cells, is polyclonal in nature and forms complexes in its constituent extracts in a manner different from single-unit erythropoietin.
Kuriant šį išradimą, domino naujausi pasiekimai tokių nepažeistų ląstelių kultūrų išauginimo srityje, kurios sugeba gaminti vienetinę antikūnų rūšį, specifiškai imunologiškai aktyvią pasirinkto antigeno vienetinės antigenines determinantės atžvilgiu. Žiūrėkite darbą: Chisholm, High Technology, 3 t., Nr.1, p.57-63 (1983). Buvo mėginama panaudoti ląstelių susiliejimą bei hibridizacijos metodikas, skirtas “monokloninių” antikūnų vystymui į eritropoetiną bei šių antikūnų panaudojimui izoliavimui ir kiekybiniam žmogaus eritropoetino nustatymui. Kaip pavyzdį galima paminėti pranešimą, esantį anotacijos pavidale, darbe: Leo-Huang, Abstract Nr.1463, Fed. Proc., 41, p.520 (1982), kuriame kalbama apie sėkmingą ląstelių linijos pelė-pelė hibridomos sukūrimą, sugebančios išskirti žmogaus eritropoetinui monokloninius antikūnus. Kitu pavyzdžiu galėtų būti nuoseklus monokloninio priešpoetininio antikūno gavimo ir panaudojimo aprašymas darbe: Weiss et ai., P.N.A.S. (USA), 79, 5465-5469 (1982). Taip pat žiūrėkite darbus: Sasaki, Biomed.The present invention has been of interest in recent developments in the cultivation of intact cell cultures that are capable of producing a unit type of antibody that is specifically immunologically active against the unit antigenic determinant of a selected antigen. See work: Chisholm, High Technology, Vol 3, No.1, pp.57-63 (1983). Attempts have been made to use cell fusion and hybridization techniques for the development of "monoclonal" antibodies to erythropoietin and for the isolation and quantification of human erythropoietin. An example is a report in the form of an annotation at work: Leo-Huang, Abstract No.1463, Fed. Proc., 41, p.520 (1982), which refers to the successful generation of a mouse-mouse hybridoma cell line capable of secreting human erythropoietin monoclonal antibodies. Another example would be a step-by-step description of the preparation and use of a monoclonal anti-poetic antibody in Weiss et al., P.N.A.S. (USA), 79, 5465-5469 (1982). See also works: Sasaki, Biomed.
Biochim. Actą, 42/11/12. p.202-206(1983); Yanagawa et ai., Blood, 64(2), 357-364(1984); Yanagawa et ai., J.Biol.Chem.Biochim. Act, 11/11/12. p. 202-206 (1983); Yanagawa et al., Blood, 64 (2), 357-364 (1984); Yanagawa et al., J. Biol. Chem.
259(5), 2707-2710(1984) bei JAV patentą Nr.4456624.259 (5), 2707-2710 (1984) and U.S. Patent No. 4,456,624.
Kuriant išradimą taip pat domino pranešimai apie sintetinių peptidų imunologinį aktyvumą, kurie iš esmės dubliuoja aminorūgštinę seką, išlikusią laisvai randamuose baltymuose, glikoproteiduose bei nukleoproteiduose. Konkrečiau, polipeptidai su santykinai mažesne molekuline mase parodyti dalyvaujančiais imuninėse reakcijose, pagal trukmę artimoms fiziologiškai svarbių baltymų (kaip antai virusiniai antigenai, polipeptidiniai hormonai ir t.t.) imuninėms reakcijoms. Tarp tokių polipeptidų imuninių reakcijų yra ir specifinių antikūnų pas imunologiškai aktyvius gyvūnus susidarymo provokavimas. Žiūrėkite, pavyzdžiui, darbus: Lerner et ai., Cell, 23,309-310(1981); Ross et ai., Nature, 294, 654656(1981); Walter et ai., P.N.A.S. (USA), 77,5197-5200(1980); Learner et ai., P.N.A.S. (USA), 78, 3403-3407(1981); VValter et ai., P.N.A.S. (USA), 78, 4882-4886(1981); VVangetal, P.N.A.S. (USA), 78,7412-7416(1981); Breen et ai., Cell, 28, 477487(1982); Niggetac et ai.; P.N.A.S. (USA), 79,53225326(1982); Baron et ai., Cell, 28, 395-404(1982); Dresman et ai., Nature, 295, 158-160(1982); Lerner, Scientific American, 248, Nr.2, 66-74(1983). Taip pat žiūrėkite darbą: Kaiser et ai., Science, 223, p. 249-255(1984), liečiantį sintetinių peptidų imunologinį bei biologinį aktyvumą, kurie apytikriai atitinka antrines peptidiniu hormonų struktūras, tačiau gali turėti skirtingą pirminę struktūrinę konformaciją. Žinoma, šie tyrinėjimai liečia kitų nei eritropoetinas baltymų aminorūgštines sekas, nes apie pastarojo aminorūgštinę seką nebuvo paskelbta jokios esminės informacijos. Bendroje paraiškoje JAV patentui Nr.463724, pateiktoje J.Egrie 1983m. vasario 4d., bei publikuotoje 1984m. rugpjūčio 22d. Europos paraiškoje patentui Nr.0116446, aprašyta hibridomos pelė-pelė ląstelių linija (A.T.C.C. ΝΓ.ΗΒ8209), kuri gamina labai specifinį monokloninį priešeritropoetininį antikūną, beje imunoneaktyvų polipeptidui, turinčiam šią aminorūgščių seką: NH2-Ala- Pro - Pro -Arg-Leu-Thr-Cys-Asp-Ser-Arg-Vai-Leu-Glu-ArgTyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.Also of interest in the present invention are reports on the immunological activity of synthetic peptides, which essentially duplicate the amino acid sequence retained in freely found proteins, glycoproteins, and nucleoproteins. Specifically, polypeptides with relatively lower molecular weights are shown to be involved in immune responses, with time-dependent immune responses to physiologically relevant proteins (such as viral antigens, polypeptide hormones, etc.). Such polypeptide immune responses include the provocation of specific antibodies in immunologically active animals. See, for example, Lerner et al., Cell, 23,309-310 (1981); Ross et al., Nature, 294, 654656 (1981); Walter et al., PNAS (USA), 77.5197-5200 (1980); Learner et al., PNAS (USA), 78, 3403-3407 (1981); Walter et al., PNAS (USA), 78, 4882-4886 (1981); Wangetal, PNAS (USA), 78.7412-7416 (1981); Breen et al., Cell, 28, 477487 (1982); Niggetac et al .; PNAS (USA) 79,53225326 (1982); Baron et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dresman et al., Nature 295: 158-160 (1982); Lerner, Scientific American, 248, no.2, 66-74 (1983). See also work: Kaiser et al., Science, 223, p. 249-255 (1984) concerning the immunological and biological activity of synthetic peptides, which approximate secondary peptide hormone structures but may have different primary structural conformations. Of course, these studies concern the amino acid sequences of proteins other than erythropoietin, since no substantial information has been published on the latter. United States Patent Application No. 4,637,224 to J.Egrie, 1983; February 4, 1984, August 22 European Patent Application No. 0116446 describes a hybridoma mouse-mouse cell line (ATCC ΝΓ.ΗΒ20209) that produces a highly specific monoclonal anti-erythropoietin antibody, incidentally, to an immuno-inactive polypeptide having the following amino acid sequence: NH 2 -Ala-Pro-Pro -Arg-Leu -Thr-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-ArgTyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.
Polipeptidinė seka - tai tokia seka, kuri pririšta prie pirmųjų dvidešimties žmogaus subrendusio eritropoetino amino rūgščių liekanų, išskirta pagal metodiką, aprašytą darbe: Meyake et ai., J. Biol. Chem., 252, 5558-5564 (1974), kuriai atlikta aminorūgščių analizė dujų faziniu sekvenseriu (Applied Biosystems) pagal metodiką: Hevvik M., J.Biol. Chem., 256, 79907997 (1981). Taip pat žiūrėkite darbą: Sue et ai., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 80, 3651 -3655 (1983), aprašantį, polikloninių antikūnų (prieš sintetinį 26-men besiskiriančio aminorūgščių seka pagrindu) vystymąsi, bei darbą: Sytowski et ai., J. Immun. Methods, 69, 181-186 (1984).A polypeptide sequence is a sequence that binds to the first twenty amino acid residues of a mature human erythropoietin isolated according to the procedure described in Meyake et al., J. Biol. Chem., 252, 5558-5564 (1974), which was subjected to amino acid analysis by gas phase sequencer (Applied Biosystems) according to the procedure: Hevvik M., J. Biol. Chem., 256, 79907997 (1981). See also work: Sue et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 80, 3651-3655 (1983) describing the development of polyclonal antibodies (against a synthetic 26-amino acid amino acid sequence basis) and the work of: Sytowski et al., J. Immun. Methods, 69, 181-186 (1984).
Nors monokloniniai ir polikloniniai antikūnai, kaip aprašyta anksčiau, turi labai naudingų medžiagų imuniniams tyrimams, siekiant atrasti bei kiekybiškai nustatyti eritropoetiną, ir gali būti naudingi gryninant eritropoetiną, atrodo mažai tikėtina, kad šios stambaus masto išskyrimui skirtos medžiagos gali užtikrinti žinduolių kilmės eritropoetino kiekius, pakankamus tolimesnei analizei, klinikiniams tyrimams ir galimai plačiam medžiagos terapiniam panaudojimui, gydant, pavyzdžiui, chroniškas inkstų ligas, kuomet pažeisti audiniai nebegali užtikrinti eritropoetino gamybos. Todėl spėjama, kad pilnai žinduolių eritropoetino charakteristikai bei didelių jo kiekių gamybai (galimai diagnostikai ir klinikiniam vartojimui) perspektyviausios yra rekombinantines junginio stambaus masto mikrobinės sintezės metodikos.Although monoclonal and polyclonal antibodies, as described above, contain very useful substances for immunoassays for the discovery and quantification of erythropoietin and may be useful in the purification of erythropoietin, it appears unlikely that these large-scale secretory substances can provide sufficient amounts of erythropoietin of mammalian origin. for further analysis, clinical trials, and possible widespread therapeutic use in the treatment of, for example, chronic kidney disease, where erythropoietin production is no longer guaranteed by damaged tissue. Therefore, recombinant techniques for the large-scale microbial synthesis of the compound are expected to be the most promising for the full characterization of mammalian erythropoietin and for the production of large amounts (possibly for diagnostic and clinical use).
Nors bandant išskirti DNR sekas, koduojančias žmogaus ir kitų žinduolių eritropoetiną, buvo nemažai stengiamasi, nė vienas bandymas nebuvo sėkmingas. Tai apsprendžiama trūkumu audinių (ypatingai žmogaus) , tiek turtingų iRNR, kad būtų galima sumontuoti kDNR biblioteką, iš kurios (panaudojus žinomas metodikas) būtų galima išskirti eritropoetiną koduojančias DNR sekas. Be to, mažai žinoma apie nenutrūkstančias eritropoetino aminorūgščių liekanų sekas, ko pasėkoje negalima, pavyzdžiui, sumontuoti ilgų polinukleotidinių zondų, tinkamų patikimam DNR/DNR-hibridizuotai kDNR ir ypač DNR genominių bibliotekų atrinkimui. Dvidešimties aminorūgščių seka, naudojama anksčiau minėto monokloninio antikūno, generuoto A.T.C.C. Nr.HB8209, neleido sukonstruoti vienareikšmio šešiasdešimties bazių oligonukleotidinio zondo tokiu būdu, kuris aprašytas Anderson et ai., Supra. Nustatyta, jog žmogaus eritropoetiną koduojanti genetinė medžiaga, matyt sudaro mažiau nei 0,00005% bendros žmogaus genominės DNR, kuri turi būti genominėje bibliotekoje.Although considerable efforts have been made to isolate the DNA sequences encoding erythropoietin in humans and other mammals, no attempt has been made. This is due to the scarcity of tissues (particularly human) and the presence of iRNA rich enough to assemble a cDNA library from which DNA sequences encoding erythropoietin can be isolated (using known methodologies). In addition, little is known about the uninterrupted amino acid residue sequences of erythropoietin, which cannot, for example, result in the installation of long polynucleotide probes suitable for reliable selection of DNA / DNA-hybridized cDNAs and especially DNA genomic libraries. The twenty amino acid sequence used for the aforementioned monoclonal antibody generated by A.T.C.C. No. HB8209, did not allow the construction of an unambiguous sixty-base oligonucleotide probe as described by Anderson et al., Supra. The genetic material encoding human erythropoietin is estimated to represent less than 0.00005% of the total human genomic DNA that must be in the genomic library.
Sėkmingiausi šiai dienai žinomi bandymai sukonstruoti DNR sekas rekombinantiniais būdais, tinkančiais žinduolių eritropoetino izoliuojamų kiekių mikrobinei ekspresijai nė iš tolo nepasiekė tikslo. Pavyzdžiui galima paminėti darbą: Farber et ai., Exp. Hematol, 11, Supp. 14, Abstract, 101(1983), kuriame pranešama apie iRNR ekstrakciją iš babuinų inkstų audinių, apdorotų fenilhidrazinu, bei iRNR injekcionavimu į Xenopus Laevis oocitus su gana laikinu transliacinių produktų'1, kurie turėjo išreikštas eritropoetino biologines savybes, mišinio gavimui in vitro. Visai neseniai Farber et ai., Blood, 62, Nr.5, Sapp. Nr.1, Abstract 392, p.122a(1983) pranešė apie žmogaus inkstų iRNR transliaciją in vitro varlės oocitais. Gautas transliacijos produkto mišinys buvo įvertintas, kaip turintis maždaug 220 mg transliacijos produkto, turinčio aktyvumą eritropoetino mikrogramui įvestos iRNR. Ir nors ekzogenines iRNR, koduojančios eritropoetiną transliacijos in vitro lygmenys buvo pripažinti visiškai žemais (netgi palyginus su anksčiau paskelbtais babuino iRNR transliacijos į ieškomą produktą lygmenimis), nuspręsta, jog rezultatai patvirtina, kad žmogaus inkstas yra eritropoetino ekspresyvumo sritis, įgalinanti sumontuoti sodrintą žmogaus inksto kDNR-biblioteką, iš kurios galima išskirti norimą geną. [Žiūrėkite taip pat Farber, Clin. Res., 31(4), 769A(1983).]The most successful attempts known to date to construct DNA sequences by recombinant methods suitable for the microbial expression of isolated amounts of erythropoietin in mammals have by no means succeeded. For example, see Farber et al., Exp. Hematol, 11, Supp. 14, Abstract, 101 (1983), which reports the extraction of iRNA from baboon kidney tissues treated with phenylhydrazine and injection of iRNA into Xenopus Laevis oocytes with a relatively transient mixture of translational products' 1 that have expressed erythropoietin biological properties. More recently, Farber et al., Blood, 62, no.5, Sapp. No.1, Abstract 392, p.122a (1983) reported the translation of human renal iRNA in frog oocytes in vitro. The resulting translation product mixture was evaluated to contain approximately 220 mg of the translation product having activity per ml of erythropoietin iRNA introduced. And while exogenous levels of exogenous translation of exogenous iRNAs encoding erythropoietin have been found to be completely low (even compared to previously published levels of baboon's iRNA translation into the target product), the results suggest that the human kidney is an expression domain of erythropoietin - a library from which the desired gene can be extracted. [See also Farber, Clin. Res., 31 (4), 769A (1983).]
Nuo to laiko, kai buvo paduotos paraiškos JAV patentams Nr.561024 ir Nr.582185, publikuotas tik vienintelis pranešimas apie to, kas pripažinta kaip žmogaus eritropoetino kDNR, klonavimą ir ekspresiją į E.Coli. Trumpiau kalbant, visa eilė kDNR klonų buvo įnešta į E.Coli plazmides, ir j2> -laktamazės susiliejimo produktai buvo pripažinti imunoreaktyviais (su monokloniniu ·. antikūnu) žmogaus eritropoetino nenustatyto epitopo atžvilgiu. Žiūrėkite Lee-Huang, P. Nat. Acad. Sci.(USA), 81, p.2708-2712(1984).Since filing U.S. Patent Nos. 561024 and 582185, only one report has been published on the cloning and expression of what is recognized as human erythropoietin cDNA into E. coli. In short, a number of cDNA clones were introduced into E. coli plasmids, and the β2-lactamase fusion products were recognized as immunoreactive (with a monoclonal antibody) to an unidentified epitope on human erythropoietin. See Lee-Huang, P. Nat. Acad. Sci. (USA), 81, pp.2708-2712 (1984).
TRUMPAS DĖSTYMASSHORT TERM
Pirmą sykį siūlomi nauji išgryninti bei išskirti polipeptidiniai produktai, pilnai arba dalinai turintys laisvai sutinkamo eritropoetino bei jo alelinių variantų konformaciją (t.y. nenutrūkstančią aminorūgštinių liekanų seką) ir vieną ar daugiau jo biologinių savybių (pvz., imunologinės savybės ir biologinis aktyvumas in vivo bei in vitro). Šie polipeptidai taipogi vienareikšmiai skiriasi tuo, jog yra prokariotinio arba eukariotinio šeimininko (pvz., bakterijų, mielių ar žinduolių ląstelės kultūroje) egzogeniniųj DNR sekų, gautų genominio ar kDNR-klonavimo arba genų inžinerijos būdu, ekspresijos produktas. Mikrobinės ekspresijos produktai stuburinių (pvz., žinduolių ir paukščių) ląstelėse gali skirtis kartu patekusiais baltymais ir kitais teršalais nuo žmogaus ir kurie gali asocijuotis su eritropoetinu jo natūralioje žinduolių ląstelių aplinkoje arba tokiose terpėse kaip kraujo plazma ar šlapimas. Tipiškų mielinių (pvz., Saccaromyces arevisial) arba prokariotinių (pvz., E.Coli) šeimininko ląstelių produktai nesusiję su jokiais žinduolių baltymais. Priklausomai nuo oasirinkto šeimininko, siūlomi polipeptidai gali būti glikozilinti arba neglikozilinti žinduolių ar kitų eukariotinių angliavandeniais. Siūlomi polipeptidai taip pat gali turėti pradinio metionino aminorūgštinę liekaną (1 padėtyje).For the first time, novel purified and isolated polypeptide products are proposed which have all or part of the conformation (ie, a continuous amino acid residue sequence) of free erythropoietin and its allelic variants and one or more of its biological properties (eg, immunological and in vivo biological activity). ). These polypeptides are also uniquely characterized by being a product of expression of exogenous DNA sequences obtained by genomic or cDNA cloning or genetic engineering of a prokaryotic or eukaryotic host (e.g., bacterial, yeast, or mammalian cells in culture). Microbial expression products in vertebrate (eg, mammalian and avian) cells may differ from human proteins and other contaminants and may be associated with erythropoietin in its natural mammalian cellular environment or in media such as blood plasma or urine. The products of typical yeast (e.g., Saccaromyces arevisial) or prokaryotic (e.g., E.Coli) host cells do not bind to any mammalian protein. Depending on the host selected, the proposed polypeptides may be glycosylated or non-glycosylated with mammalian or other eukaryotic carbohydrates. The proposed polypeptides may also have an amino acid residue (at position 1) of the parent methionine.
Siūlomi nauji glikoproteininiai produktai apima tuos, kurie turi pirminę struktūrinę konformaciją, pakankamai dubliuojančią laisvai sutinkamo (pavyzdžiui žmogaus) eritropoetino konformaciją tam, kad būtų perimta viena ar daugiau pastarojo biologinių savybių, bei tuos, kurie turi besiskiriančią nuo laisvai sutinkamo (pvz., žmogaus) eritropoetino angliavandeninę kompoziciją. Stuburinių ląstelės (pvz., COS-I ir CHO) siūlomos šiame išradime, kaip nustatyta radioimuniniais tyrimais, gali be perstojo daugintis in vitro ir auginami kultūroje gali savo augimo terpėje produkuoti virš 1000 V (pageidautina virš 5000 V, o geriausiai virš 1000-5000 oThe proposed novel glycoprotein products include those having a primary structural conformation sufficiently duplicating the conformation of free-form (e.g., human) erythropoietin to adopt one or more of the latter's biological properties, and those that differ from the free-form (eg, human). a carbohydrate composition of erythropoietin. The vertebrate cells (e.g., COS-I and CHO) of the present invention, as determined by radioimmunoassay, are capable of continuous proliferation in vitro and when cultured can produce above 1000 V (preferably above 5000 V, preferably above 1000-5000) in their growth medium. o
V) eritropoetino per 48 valandas, skaičiuojant 10 ląstelių.V) erythropoietin over 48 hours per 10 cells.
Taip pat siūlomi sintetiniai polipeptidai, pilnai arba dalinai dubliuojantys nenutrūkstančias eritropoetino aminorūgštinių liekanų sekas. Šios sekos,, atskiriant pirmines, antrines arba tretines struktūrines ir konformacines charakteristikas, su laisvai sutinkamu eritropoetinu gali pasižymėti biologiniu aktyvumu ir/arba imunologinėmis savybėmis ir gali būti naudojamos kaip biologiškai aktyvūs arba imunologiniai eritropoetino pakaitalai terapiniuose ir imunologiniuose procesuose. Atitinkamai siūlomi monokloniniai ir polikloniniai antikūnai (gaminami standartiniais būdais), kurie yra imunoreaktyvūs tokiems peptidams ir, geriausiai, imunoreaktyvūs laisvai sutinkamam eritropoetinui.Also provided are synthetic polypeptides that completely or partially duplicate the continuous amino acid residues of erythropoietin. These sequences, by distinguishing primary, secondary or tertiary structural and conformational characteristics, may have biological activity and / or immunological properties with free erythropoietin and may be used as biologically active or immunological substitutes for erythropoietin in therapeutic and immunological processes. Accordingly, monoclonal and polyclonal antibodies (produced by standard techniques) that are immunoreactive to such peptides and, preferably, immunoreactive to free-form erythropoietin are proposed.
Šį išradimą iliustruoja žmogaus ir beždžionės rūšinių pagrindų klonuotos DNR sekos, bei iš jų išskirtos polipeptidinės sekos ir, atitinkamai, atstovaujančios žmogaus ir beždžionės rūšinių pagrindų pirminę struktūrinę konformaciją.The present invention is illustrated by cloned DNA sequences of human and monkey species bases, and polypeptide sequences derived therefrom and, respectively, representing the parent structural conformation of human and monkey species bases.
Taip pat siūlomi nauji, biologiškai funkcionalūs virusinės ir žiedinės plazmidinės DNR vektoriai, apimantys išradimo DNR sekas, bei šių vektorių stabiliai transformuojami arba transfektuojami šeimininko mikrobiniai (pvz., bakterinės, mielinės bei žinduolių ląstelės) organizmai. Taigi siūlomi nauji naudingų polipeptidų gavimo būdai, apimantys tokių transformuojamų arba transfektuojamų mikrobinių šeimininkų kultivuojamą auginimą sąlygose, palengvinančiose egzogeninių vektorinių DNR sekų plataus masto ekspresiją bei pageidaujamų polipeptidų išskyrimą iš maitinančios terpės, ląstelinių lizatų ar ląstelinių membranų frakcijų.Novel, biologically functional viral and circular plasmid DNA vectors comprising the DNA sequences of the invention are also proposed and stably transformed or transfected with host microbial (e.g., bacterial, yeast, and mammalian) organisms. Thus, novel methods of producing useful polypeptides are proposed comprising culturing such transformed or transfected microbial hosts under conditions facilitating large-scale expression of exogenous vector DNA sequences and isolation of desired polypeptides from media, cellular lysates or cell membrane fractions.
Mikrobinių polipeptidų išskyrimą ir gryninimą, siūlomus šiame išradime, galima realizuoti tradiciniais būdais, apimančiais, pavyzdžiui, preparatyvinius chromatografinius bei imunologinius atskyrimus, turinčius monokloninių ir/arba polikloninių antikūnų preparatus.The isolation and purification of microbial polypeptides provided by the present invention may be accomplished by conventional techniques involving, for example, preparative chromatographic and immunological separations containing monoclonal and / or polyclonal antibody preparations.
Išsiaiškinęs eritropoetino aminorūgščių liekanų seką, išradimo autorius siūlo pilną ir/arba dalinę struktūrą DNR sekų, koduojančių eritropoetiną ir turinčių tokias palankias charakteristikas, kaip kodonų, atrinktų “pageidaujamų” šeimininkų-nežinduolių ekspresijai, išskaidymo vietų paruošimą, naudojant ribojančius endonukleazinius fermentus, bei parūpinimą papildomų pradinių, galinių ar tarpinių DNR sekų, padedančių konstruoti lengvai išreiškiamus vektorius. Taigi siūlomas konstravimas (bei vystymas specifinės kDNR ir genominės DNR mutagenezės būdu) DNR sekų, koduojančių mikrobinę ekspresiją tokių polipeptidinių analogų arba eritropoetino darinių, kurie skiriasi nuo laisvai sutinkamų formų vienos ar kelių aminorūgštinių liekanų skaičiumi arba vieta (t.y. analogų, turinčių mažesnį visų liekanų kiekį, rastą EPO, ir/arba pakeitimo analogų, kuriuose viena ar daugiau liekanų pakeistos kitomis, ir/arba papildomų analogų, kuriuose viena ar daugiau aminorūgštinių liekanų pridėta prie galinės ar vidurinės polipeptido dalies); ir kurie turi dalį arba visas laisvai sutinkamų formų savybes.Having elucidated the amino acid residue sequence of erythropoietin, the present inventor proposes a complete and / or partial structure of DNA sequences encoding erythropoietin with favorable characteristics such as preparation of cleavage sites for codons selected for "desirable" host-mammalian expression, restriction endonuclease enzymes, starter, terminal, or intermediate DNA sequences that help to construct easily expressed vectors. Thus, construction (as well as development by specific cDNA and genomic DNA mutagenesis) of DNA sequences encoding microbial expression of polypeptide analogs or erythropoietin derivatives that differ from the free form in one or more amino acid residues (i.e., analogs with less total residues) is proposed. EPO, and / or substitution analogs wherein one or more residues are substituted with other and / or additional analogs wherein one or more amino acid residues are attached to the back or middle portion of the polypeptide); and which have some or all of the properties of freely available forms.
Siūlomos naujos DNR sekos apima visas sekas, tinkamas užtikrinti ekspresiją polipeptidinių produktų šeimininko prokariotinėse arba eukariotinėse ląstelėse, kurie turi bent dalį pirminės struktūrinės konformacijos ir vieną ar daugiau eritropoetino biologinių savybių, kurios apima: a) DNR sekas, pateiktas 5 ir 6 lentelėse, arba jų komplementarinius siūlus;The proposed novel DNA sequences encompass all sequences suitable for expression in host prokaryotic or eukaryotic cells of polypeptide products which have at least a portion of the primary structural conformation and one or more of the biological properties of erythropoietin, which include: (a) the DNA sequences shown in Tables 5 and 6; complementary threads;
b) DNR sekas, kurios hibridizuojamos (iliustruojamose čia, arba griežtesnėmis hibridizacijos sąlygomis) į (a) apibrėžtas DNR sekas ar jų fragmentus; c) DNR sekas, kurios genetinio kodo degeneracijos pasėkoje turi hibridizuotis į (a) arba (b) apibrėžtas DNR sekas. Ypač apima (b) dalies genomines DNR sekas, koduojančias beždžionės ir žmogaus eritropoetino alelinių variantų formas ir/arba koduojančias kitų žinduolių eritropoetiną. Ypač apima (c) dalyje sumontuotas DNR sekas, koduojančias EPO, EPO fragmentus ir EPO analogus, kurių DNR sekos gali apimti kodonus, padedančius transliuoti informacinę RNR bestuburiuose šeimininkuose.b) DNA sequences which are hybridized (as illustrated herein, or under more stringent hybridization conditions) to DNA sequences or fragments thereof as defined in (a); (c) DNA sequences which must hybridize to the DNA sequences defined in (a) or (b) as a result of the degeneracy of the genetic code. In particular, it includes (b) the genomic DNA sequences encoding the allele variants of monkey and human erythropoietin and / or encoding erythropoietin of other mammals. In particular, it includes the DNA sequences encoding EPO, EPO fragments and EPO analogs assembled in part (c), the DNA sequences of which may include codons to aid in the transcription of the RNA information in invertebrates.
Siūlomame išradime apimama ta polipeptidų klasė, kuri koduojama DNR komplemento dalimis į viršutinę genominės DNR dalį, pateiktą 6 lentelėje, t.y. komplementariškai invertuoti baltymai, kaip aprašyta darbe Tpamontano et ai., Nucleic Acids Research, 12, p.5048-5059(1984).The present invention encompasses that class of polypeptides encoded by the complement of DNA into the upper portion of genomic DNA shown in Table 6, i.e. complementary inverted proteins as described in Tpamontano et al., Nucleic Acids Research, 12, pp. 5048-5059 (1984).
Išradimas taip pat apima farmacines kompozicijas, turinčias veiklius šio išradimo polipeptidinių produktų kiekius kartu su tinkamais skiedikliais, stimuliatoriais ir/arba nešikliais, įgalinančiais sukurti eriptropoetino terapiją, ypač gydant aneminius ligų stovius ir, labiausiai, tokius aneminius stovius, kurie sukelia chronišką inkstų nepakankamumą.The invention also encompasses pharmaceutical compositions containing effective amounts of the polypeptide products of the present invention together with suitable diluents, stimulants and / or carriers to provide eriptropoietin therapy, in particular for the treatment of anemic conditions and, most importantly, for the treatment of chronic renal failure.
Siūlomus polipeptidinius produktus galima “pažymėti“ kovalentine asociacija su nustatoma žyminčia medžiaga (pvz., 1 9^ radiožymėtas I), kad būtų galima identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti eritropoetiną kietame audinyje ar skystuose pavyzdžiuose, kaip antai kraujyje ar šlapime. DNR produktus taip pat galima pažymėti nustatomais žymekliais (pvz., radiožymės ir neizotopinės žymės, kaip antai biotinas) ir panaudoti DNR hibridizacijos procesuose lokalizuojant eritropoetininio geno padėtį ir/arba bet kurios giminingos geninės šeimos padėtį žmogaus, beždžionės ar kitų žinduolių chromosominiame žemėlapyje. Juos taip pat galima panaudoti identifikuojant eritropoetininio geno pažeidimus DNR lygmenye bei panaudoti kaip geninį žymeklį identifikuojant kaimyninius genus ir jų pažeidimus.Proposed polypeptide products may be "labeled" by covalent association with a detectable marker (e.g., 19-labeled I) to identify and quantify erythropoietin in solid tissue or fluid samples such as blood or urine. DNA products can also be labeled with detectable markers (eg, radiolabel and non-isotope tags such as biotin) and used in DNA hybridization processes to localize the position of the erythropoietin gene and / or the position of any related genetic family on a human, monkey, or other mammalian chromosomal map. They can also be used to identify lesions at the DNA level of the erythropoietic gene, and to be used as a genetic marker to identify neighboring genes and their lesions.
Kaip smulkiai aprašyta anksčiau, šis išradimas užtikrina esminius aptikimo būdų patobulinimus specifiniams vienasiūliams nežinomos sekos polinukleotidams, esantiems heterogeniniame ląsteliniame arba virusiniame pavyzdyje (apimančiame kartotinius vienasiūlius polinukleotidus), kuriame:As described in detail above, the present invention provides substantial improvements in detection methods for specific single-stranded polynucleotides of unknown sequence present in a heterogeneous cellular or viral sample (comprising repeat single-stranded polynucleotides) in which:
a) gauna žymėtų vienasiūlių polinukleotidų su tolygiai kintančiomis bazių ' sekomis zondų mišinį, be to kiekvienas iš nurodytų zondų yra potencialiai specifiškai komplementarus bazių sekai, kuri spėjamai unikali apatiniam polinukleotidui;(a) obtains a mixture of probes of labeled single-stranded polynucleotides with uniformly variable base sequences, and each of the indicated probes is potentially specifically complementary to a base sequence that is presumably unique to the lower polynucleotide;
b) suriša pavyzdį su standžių substratu;b) binding the sample to a rigid substrate;
c) apdoroja substratą (turintį surištą su juo pavyzdį), siekiant apsunkinti tolimesnį polinukleotidų surišimą;c) treating the substrate (having a sample bound thereto) to prevent further polynucleotide binding;
d) apdorotą substratą (turintį surištą su juo pavyzdį) laikinai suliečia su minėtu žymėtų zondų mišiniu tokiomis sąlygomis, kurios skatina hibridizaciją tik tarp pilnai komplementarių polinukleotidų;d) transiently contacting the treated substrate (containing the sample bound thereto) with said labeled probe mixture under conditions which promote hybridization only between fully complementary polynucleotides;
e) specifinį polinukleotidą aptinka pagal hibridizacijos reakcijos tarp jo ir pilnai komplementaraus zondo (esančio minėtame žymėtų zondų mišinyje) buvimą. Tai stebima žymėtosios medžiagos kiekio padidėjimu substrate su specifiniu polinukleotidų, lyginant su žymėtosios medžiagos kiekiu substrate be šio nukleotido.e) detecting the specific polynucleotide by the presence of a hybridization reaction between it and the fully complementary probe (contained in said mixture of labeled probes). This is observed by an increase in the amount of labeled material in the substrate with a specific polynucleotide compared to the amount of labeled material in the substrate without this nucleotide.
Šios metodikos ypač efektyvios situacijose, kurios reikalauja naudoti 64, 128, 256, 512, 1024 ar daugiauThese methodologies are particularly effective in situations that require the use of 64, 128, 256, 512, 1024 or more
Kaip metodikos beždžionių beždžionių tolygiai patobulintos koduojančius iš anemiškų sumaišytų polinukleotidinių zondų, kurių ilgis DNR/DNR, RNR/RNR arba DNR/RNR hibridizacijose yra nuo 17 iki 20 bazių.Methods for monkey monkeys have been steadily improved by coding from anemic mixed polynucleotide probes with 17 to 20 bases in DNA / DNA, RNA / RNA or DNA / RNA hybridizations.
aprašyta infra, anksčiau minėtos įgalino identifikuoti kDNR-klonus, eritropoetiną bibliotekos (gautos inkstų ląstelių iRNR) ribose. Konkrečiau 128 kintančių 20-men zondų mišinys, paremtų aminorūgštinės sekos informacija, gauta iš besikaitaliojančių žmogaus eritropoetino frakcijų, panaudota kolonijų hibridizacijos metodikose identifikuojant septynis teigiamus eritropoetino kDNR klonus 200000 kolonijų. Netgi daugiau, šio išradimo patobulintų metodikų panaudojimo praktika įgalino greitai išskirti iš žmogaus genominę biblioteką sudarančių 1500000 sterilių dėmių ekranavimo ribų tris teigiamus klonus. Tai buvo atlikta panaudojant anksčiau minėtą 128 20-men zondų mišinį kartu su antru 128 17-men zondų rinkiniu remiantis aminorūgštine analize, pasižyminčia nenutrūkstančia žmogaus eritropoetino seka.infra, the foregoing enabled the identification of cDNA clones, erythropoietin, within the library (obtained by renal cellular iRNAs). Specifically, a mixture of 128 variable 20-probes based on amino acid sequence information derived from alternating fractions of human erythropoietin was used in colony hybridization techniques to identify seven positive erythropoietin cDNA clones in 200,000 colonies. Even more, the practice of using the improved methodologies of the present invention has enabled the rapid isolation of three positive clones from the screening threshold of 1,500,000 sterile spots of the human genomic library. This was done using the aforementioned mixture of 128 20-probes in combination with a second set of 128 17-m probes based on amino acid analysis of the continuous human erythropoietin sequence.
Anksčiau minėtos iliustracinės metodikos yra pirmasis žinomas pavyzdys, kuomet panaudojami mišrūs kartotiniai oligonukleotidiniai zondai DNR/DNR hibridizacijos procesuose, skirtuose žinduolių genominių klonų izoliavimui ir pirmasis žinomas pavyzdys, kuomet izoliuojant kDNR klonus panaudojamas daugiau nei 32 oligonukleotidinių zondų mišinys.The foregoing illustrative techniques are the first known example of using hybrid repeat oligonucleotide probes in DNA / DNA hybridization processes for the isolation of mammalian genomic clones and the first known example of using a mixture of more than 32 oligonucleotide probes for the isolation of cDNA clones.
Daugelis išradimo aspektų bei privalumų specialistams taps akivaizdūs peržiūrėjus žemiau pateikiamą nuodugnų išradimo aprašymą, suteikiantį išradimo praktinio panaudojimo pavyzdį geriausiuose jo realizavimo variantuose.Many aspects and advantages of the invention will become apparent to those skilled in the art upon reading the following detailed description of the invention, which exemplifies the practical use of the invention in the best embodiments thereof.
NUODUGNUS IŠRADIMO APRAŠYMASDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Sutinkamai su šiuo išradimu buvo izoliuotos ir charakterizuotos DNR sekos, dalinai arba pilnai koduojančios žmogaus ir beždžionės eritropoetino polipeptidinę seką (toliau EPO). Be to, žmogaus ir beždžionės DNR tapo eukariotinės ir prokariotines ekspresijos objektu, sukuriančios išskiriamus kiekius tokių polipeptidų, kurie pasižymi laisvai sutinkamo EPO biologinėmis (pvz., imuninėmis) savybėmis, bei EPO biologiniu aktyvumu in vivo ir in vitro.In accordance with the present invention, isolated and characterized DNA sequences have been isolated that partially or fully encode the human and monkey erythropoietin polypeptide sequence (hereinafter EPO). In addition, human and monkey DNA have become the subject of eukaryotic and prokaryotic expression, producing secreted amounts of polypeptides having the biological (e.g., immune) properties of free EPO and the biological activity of EPO in vivo and in vitro.
Beždžionės rūšinių pagrindų DNR buvo išskirta iš kDNR bibliotekos, sumontuotos iRNR, kuri gauta iš chemiškai sukelto aneminio būvio beždžionės inkstų audinio ir kurio serumas (kaip nustatyta imunologiniu būdu) turėjo aukštesnius EPO lygius nei normalios beždžionės serumas. Reikalingų kDNR klonų, turinčių EPO koduojančią DNR, izoliavimas buvo realizuotas panaudojant DNR/DNR hibridizacijos kolonijas bei rinkinį iš 128 sumaišytų, radiopažymėtų 20-men oligonukleotidinių zondų ir apėmė greitą 200000 kolonijų ekranavimą. Oligonukleotidinių zondų skaičiavimas rėmėsi aminorūgštinės sekos informacija, gauta iš fermentinės fragmentacijos ir nedidelio bandinio žmogaus EPO sekos nustatymo.Monkey species-based DNA was isolated from a cDNA library assembled with iRNA derived from chemically induced monkey kidney tissue, which serum (as determined by immunoassay) had higher EPO levels than normal monkey serum. Isolation of the required cDNA clones containing EPO-encoding DNA was accomplished using DNA / DNA hybridization colonies and a set of 128 mixed, radiolabeled 20-mer oligonucleotide probes, and included rapid screening of 200,000 colonies. The calculation of the oligonucleotide probes was based on the amino acid sequence information obtained from enzymatic fragmentation and sequencing of a small sample of human EPO.
Žmogaus DNR buvo išskirta iš genominės žmogaus DNR bibliotekos. Klonų, turinčių EPO koduojančią DNR, izoliavimas realizuotas panaudojant DNR/DNR hibridizacijos dėmes bei anksčiau minėtus 128 mišrius 20-men oligonukleotidinius zondus ir antrą 128 radiožymėtų 17-men zondų rinkinį, kurių sekos rėmėsi aminorūgštinės sekos (gautos iš besiskiriančio fermentinio žmogaus EPO fragmento) informacija.Human DNA was isolated from the genomic human DNA library. Isolation of clones containing EPO-encoding DNA was accomplished using DNA / DNA hybridization spots and the aforementioned 128 mixed 20-mer oligonucleotide probes and a second set of 128 radiolabeled 17-mer probes based on amino acid sequences (derived from a different enzymatic human EPO fragment). .
Teigiamos kolonijos ir dėmės buvo patikrintos klonalinės DNR sekos dideoksi - nustatymu, panaudojant 16 sekų rinkinį 20-men zondų pulo ribose, o atrinktų klonų nukleotidinė seka analizuojama su EPO polipeptidų pirminės struktūrinės konformacijos galutine dedukcija, koduojančia juos. Dedukuotos polipeptidinės sekos demonstravo aukštą homologiškumo laipsnį tiek viena kitos atžvilgiu, tiek ir dalinei sekai, generuotai žmogaus EPO fragmentų aminorūgštinės analizės būdu.Positive colonies and spots were screened for dideoxy clonal DNA sequencing using a set of 16 sequences within a pool of 20 probes, and the nucleotide sequence of selected clones analyzed with the final deduction of the primary structural conformation of the EPO polypeptides encoding them. The deduced polypeptide sequences exhibited a high degree of homology to each other as well as to the partial sequence generated by amino acid analysis of human EPO fragments.
Atrinktas teigiamas beždžionės kDNR klonas bei atrinktas teigiamas žmogaus genominis klonas buvo perkelti į šaudiklinį DNR vektorių, kurį amilifikavo į E.Coli ir panaudojo žinduolių ląstelių kultūroje transfekcijai. Kultūrinis transfektuotų šeimininko šeimininko ląstelių augimas atsispindėjo preparatuose, plaukiojančiuose kultūrinės terpės paviršiuje ir turinčiuose iki 3000 V EPO vienam kultūrinio skysčio ml.The selected positive monkey cDNA clone and the selected positive human genomic clone were transferred to a shuttle DNA vector, which was amylated into E. coli and used for transfection in mammalian cell culture. The culture growth of the transfected host-host cells was reflected in preparations floating on the culture medium and containing up to 3000 U EPO per ml of culture medium.
Kiti pavyzdžiai pateikiami išradimo iliustravimui ir ypač akcentuojant metodikas, anksčiau realizuotas EPO identifikavimui, kurios koduoja beždžionės kDNR klonus ir žmogaus genominius klonus, bei imunologinį EPO ekspresijos tokiose sistemose patvirtinimą.Other examples are provided to illustrate the invention, and in particular to emphasize the methodologies previously realized for the identification of EPO which encode monkey cDNA clones and human genomic clones, and immunological confirmation of EPO expression in such systems.
Konkrečiau, 1 pavyzdys skirtas žmogaus EPO fragmentų aminorūgštinės sekos nustatymui ir, remiantis šio sekų nustatymo rezultatais, radiožymėtų zondų mišinių montavimui. 2 pavyzdys daugiausia skirtas metodikoms, panaudotoms identifikuojant beždžionių teigiamus kDNR klonus ir padeda gauti informaciją apie gyvūnų gydymą bei jų serumo radioimunotyrimo (RIA) preliminarią analizę. 3 pavyzdys skirtas kDNR bibliotekos gavimui, hibridizacijos kolonijų ekranavimui ir teigiamų klonų patikrinimui, teigiamo kDNR klono DNR sekos nustatymui, o taip pat beždžionės EPO polipeptidų pirminės struktūrinės konformacijos (aminorūgštinės sekos) informacijos generavimui. 4 pavyzdys skirtas metodikoms, panaudotoms identifikuojant žmogaus teigiamus genominius klonus ir, tokiu būdu, užtikrina informaciją apie genominės bibliotekos šaltinį, dėmių hibridizacijos metodikas bei teigiamų klonų patikrinimą. 5 pavyzdys skirtas teigiamo genominio klono DNR sekos nustatymui ir informacijos apie žmogaus EPO polipeptidų aminorūgštinę seką generavimui (įskaitant palyginimą su beždžionės EPO seka). 6 pavyzdys skirtas metodikoms, įgalinančioms sumontuoti vektorių, apimantį EPO koduojančią DNR (kilusią iš beždžionės teigiamo kDNR klono), vektoriaus panaudojimui transfektuojant COS-I ląsteles bei transfektuotų ląstelių kultūriniam augimui. 7 pavyzdys skirtas metodikoms, įgalinančioms sumontuoti vektorių, apimantį EPO koduojančią DNR (kilusią iš žmogaus teigiamo genominio klono) vektoriaus panaudojimui transfektuojant COS-I ląsteles bei transfektuotų ląstelių kultūriniam augimui. 8 pavyzdys skirtas imuninių tyrimų metodikoms, realizuojamoms virš nuosėdų esančiose skystose terpėse, gautose transfektuotų ląstelių kultūrinio auginimo metu (pagal 6 ir 7 pavyzdžius). 9 pavyzdys skirtas mikrobiškai išreikšto EPO (6 ir 7 pavyzdžiai) biologiniam aktyvumui in vitro ir in vivo. 10 pavyzdys skirtas beždžionių EPO kDNR bei žmogaus genominės DNR ir žinduolių šeimininko ekspresijos sistemų vystymuisi, įskaitant kinietiško žiurkėno kiaušinėlių ląsteles (CHO) ir imunologiniam bei biologiniam šių ekspresijos sistemų produktų aktyvumui, o taip pat tokių produktų charakteristikai. 11 pavyzdys skirtas genų, kurie koduoja žmogaus EPO, EPO analogų, kurių genai turi eilę pageidautinų kodonų ekspresijai E.Coli ir mielinėse šeimininko ląstelėse, gavimui, o taip pat tokios ekspresijos sistemoms.More specifically, Example 1 is for the determination of the amino acid sequence of human EPO fragments and, based on the results of this sequencing, for the assembly of radiolabeled probe mixtures. Example 2 focuses on the techniques used to identify monkey positive cDNA clones and provides information on treatment of animals and preliminary analysis of their serum radioimmunoassay (RIA). Example 3 is for obtaining a cDNA library, screening hybridization colonies and screening for positive clones, DNA sequencing of a positive cDNA clone, as well as generating information on the primary structural conformation (amino acid sequence) of monkey EPO polypeptides. Example 4 addresses the methodologies used to identify human positive genomic clones and thus provides information on the source of the genomic library, staining hybridization techniques, and screening of positive clones. Example 5 is for DNA sequencing of a positive genomic clone and for generating information on the amino acid sequence of human EPO polypeptides (including comparison with the monkey EPO sequence). Example 6 is for methods for constructing a vector comprising EPO-encoding DNA (derived from a monkey-positive cDNA clone) for use in vector transfection of COS-I cells and for culture growth of transfected cells. Example 7 is for methods for constructing a vector comprising the use of an EPO-encoding DNA (derived from a human positive genomic clone) vector for transfection of COS-I cells and for culture growth of transfected cells. Example 8 is for immunoassay procedures carried out in supernatant liquid media obtained during culture of transfected cells (according to Examples 6 and 7). Example 9 is for in vitro and in vivo biological activity of microbially expressed EPO (Examples 6 and 7). Example 10 is devoted to the development of monkey EPO cDNA and human genomic DNA and mammalian host expression systems, including Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, and the immunological and biological activity of the products of these expression systems, as well as the characterization of such products. Example 11 is for the generation of genes encoding human EPO, EPO analogs having genes for the expression of desirable codons in E. coli and yeast host cells, as well as systems for such expression.
pavyzdys priklauso imunologinio ir biologinio aktyvumo profiliams 11 pavyzdyje pateiktų sistemų produktuose.Example 11 belongs to the immunological and biological activity profiles in the products of the systems of Example 11.
PAVYZDYSEXAMPLE
A.Žmogaus EPO fragmento aminorūgštinės sekos nustatymasA. Determination of the amino acid sequence of the human EPO fragment
Žmogaus EPO išskiriamas iš šlapimo, kurį skaldo tripsinu ir gauna ir išskiria 17 atskirų fragmentų. Jų kiekiai yra apytiksliai 100-150 pikomolių.Human EPO is excreted from the urine, which is digested with trypsin and obtained and excreted by 17 individual fragments. Their quantities are approximately 100-150 picomoles.
Fragmentams laisvai priskiriami numeriai ir analizuojama jų aminorūgštinė seka naudojant dujinį sekvenserį (Applied Biosystems). Gauta aminorūgštinė seka, pateikta 1 lentelėje, kur panaudoti raidiniai kodai ir X reiškia vienareikšmiškai neapibrėžtą liekaną.The fragments are numbered freely and their amino acid sequence analyzed using a gas sequencer (Applied Biosystems). The resulting amino acid sequence is shown in Table 1, where the alphabetic codes used and X represent an unspecified residue.
Sekos analizės rezultatasResult of sequence analysis
LENTELĖTABLE
Fermento NrEnzyme no
T4a T4b T9 T13 T16T4a T4b T9 T13 T16
T18T18
T21 T25 T26a T26bT21 T25 T26a T26b
T27T27
T128 T130T128 T130
T31T31
T33T33
T35 T38T35 T38
A-P-P-RA-P-P-R
G-K-L-KG-K-L-K
A-L-G-A-O-KA-L-G-A-O-K
V-L-E-RV-L-E-R
A-V-S-G-L-RA-V-S-G-L-R
L-F-RL-F-R
K-L-F-RK-L-F-R
Y-L-L-E-A-KY-L-L-E-A-K
L-I-C-D-S-RL-I-C-D-S-R
L-Y-T-G-E-A-C-RL-Y-T-G-E-A-C-R
T-I-T-A-D-T-F-RT-I-T-A-D-T-F-R
E-A-I-S-P-P-D-A-A-M-A-A-P-L-R Ε-Α-Ε-Χ-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-LN-E-X-I-T-V-PE-A-I-S-P-P-D-A-A-M-A-A-P-L-R Ε-Α-Ε-Χ-I-T-T-G-X-A-E-H-X-S-LN-E-X-I-T-V-P
V-Y-S-N-F-L-RV-Y-S-N-F-L-R
S-L-T-T-L-L-RS-L-T-T-L-L-R
V-N-F-Y-A-VV-KV-N-F-Y-A-VV-K
G-Q-A-L-L-V-X-S-S-Q-P-WE-P-L-O-L-H-V-D-KG-Q-A-L-L-V-X-S-S-Q-P-WE-P-L-O-L-H-V-D-K
B.Oligonukleotidinių zondų mišinių skaičiavimas ir montavimasB. Calculation and Installation of Oligonucleotide Probe Mixtures
Aminorūgštinės sekos, pateiktos 1 lentelėje, nagrinėjamos genetinio kodo degeneracijos aspektu siekiant išsiaiškinti mišrių zondų metodikos panaudojimo galimybes DNR/DNR hibridizacijai kDNR ir/arba DNR genominėse bibliotekose. Ši analizė parodo, jog fragmento Nr.T-35 ribose egzistuoja 7 aminorūgštinių liekanų eilė (Val-Asn-Phe-Typ-Ala-Trp-Lys), kurią vienareikšmiškai galima charakterizuoti kaip koduojamą vieną iš 128 galimų DNR sekų, apimančia 20 azotinių bazių porų. Todėl sintetinamas pirmas rinkinys iš 128 20-men oligonukleotidų, panaudojant standartinius fosfoamidinius būdus (žiūrėkite, pavyzdžiui, darbą Beaucage et ai., Tetrahedron Letters, 22, p.1859-1862(1981), panaudojant kietą nešiklį ir sutinkamai su 2 lentelėje pateikiama seka.The amino acid sequences in Table 1 are examined in the context of genetic code degeneration to explore the potential of hybrid probe techniques for DNA / DNA hybridization in cDNA and / or DNA genomic libraries. This analysis demonstrates the existence of a sequence of 7 amino acid residues (Val-Asn-Phe-Typ-Ala-Trp-Lys) within fragment No.T-35, which can be uniquely characterized as one of the 128 possible DNA sequences comprising 20 nitrogen bases. pairs. Therefore, a first set of 128 20-mer oligonucleotides is synthesized using standard phosphoamidine techniques (see, e.g., Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, p. 1859-1862 (1981)) using a solid support and according to the sequence in Table 2. .
LENTELĖTABLE
Liekana - Vai - Asn Phe Typ Ala Trp LysResidue - Vai - Asn Phe Typ Ala Trp Lys
3*3 *
CAA TT AAG ATCAA TT AAG AT
TA A A GTA A A G
CC
CGA ACC TT T C cCGA ACC TT T C c
5'5 '
Papildoma analizė atskleidžia, jog fragmento Nr.T-38 ribose egzistuoja 6 aminorūgštinių liekanų eilė (Gln-PnO-TnpGlu-PrO-Leu), kurios pagrindu galima gauti 128 mišrių oligonukleotidinių 17-men zondų pulą, kaip parodyta 3 lentelėje.Further analysis reveals that a sequence of 6 amino acid residues (Gln-PnO-TnpGlu-PrO-Leu) exists within the framework of fragment No.T-38, which can be used to obtain a pool of 128 mixed oligonucleotide 17-probes as shown in Table 3.
LENTELĖTABLE
Liekana - GlnRemnant - Gln
Pno Tnp Glu Pro LeuPno Tnp Glu Pro Leu
GTTGTT
CC
GGA ACC CTT GGA GAGGA ACC CTT GGA GA
CC
Oligonukleotidinius zondus 5' gale pažymi gama -32p-ATP, 7500-8000 Cį (mmol/JCN), panaudojant polinukleotidinę kinazę T4 (NEN).Oligonucleotide probes at the 5 'end are labeled with gamma -32p-ATP, 7500-8000 Ci (mmol / JCN) using polynucleotide kinase T 4 (NEN).
PAVYZDYSEXAMPLE
A. Beždžionių apdorojimo metodikos ir RIA-analizėA. Monkey Processing Methods and RIA-Analysis
Beždžionių Macaca fasicularias pateles Cynomologus (2,5-3 kg, 1,5-2 metai) apdoroja poodinėmis fenilhidrazino chiorhidrato tirpalo (pH 7,0) injekcijomis, dozuojant 12,5 mg/kg 1,3 ir 5 dieną. Prieš kiekvieną injekciją kontroliuojamas hematokritas. 7-tą dieną (arba kai tik hematokrito lygis nukrenta žemiau 25% pirminio lygio), suleidžiamas ketamino chlorhidratas (dozuojant 25 mg/kg) ir paimamas serumas bei inkstai, kurie iš karto užšaldomi skystu azotu ir laikomi -70° C temperatūroje.Female Macaca fasicularias female Cynomologus (2.5-3 kg, 1.5-2 years) is treated with subcutaneous injections of phenylhydrazine chiorhydrate (pH 7.0) at a dose of 12.5 mg / kg on days 1.3 and 5. Hematocrit is monitored prior to each injection. On day 7 (or as soon as hematocrit falls below 25% of baseline), ketamine chlorohydrate (25 mg / kg) is injected and serum and kidneys are immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
B. RIA - analizėB. RIA - Analysis
Kiekybiniam EPO nustatymui pavyzdžiuose naudojami radioimuniniai tyrimai pagal šias metodikas:For the quantification of EPO in samples, radioimmunoassays are used according to the following procedures:
Eritropoetino standartas arba nežinomas pavyzdys dvi valandas inkubuojamas kartu su antiserumu 37° C temperatūroje.The erythropoietin standard or unknown sample is incubated with antiserum at 37 ° C for two hours.
Po to mėgintuvėliai su pavyzdžiais atšaldomi ledu, pridedama “1The sample tubes are then chilled with ice and added '1
I pažymėto eritropoetino, ir inkubuojama ne mažiau 15 valandų 0° C temperatūroje. Kiekviename tiriamame mėgintuvėlyje yra 500 mkl inkubacinio mišinio, kuriame yra 125 praskiesta: 50 mkl imuninio serumo, 10000 cp Ieritropoetino, 5 mkl trasilolio ir 0-250 mkl EPO standarto (arba nežinomo pavyzdžio), o taip pat PBS, turinčio 0,1% BSA, likusio tūrio užpildymui. Naudojamu serumu yra antrame mėginyje nuleistas triušio kraujas, imunizuotas 1% gryno žmogaus šlapimo eritropoetino preparatu. Galutinis antiserumo 125praskiedimas yra reguliuojamas, kad I-entropoetino, surišto su antikūnui, kiekis neviršytų 10-20% bendro kiekio. Aplamai, tai atitinka galutinį, antiserumo praskiedimą nuo 1:50000 iki 1: 100000.Erythropoietin I and incubated for at least 15 hours at 0 ° C. Each test tube contains 500 µl of incubation mixture containing 125 dilutions: 50 µl immune serum, 10,000 cp Ieritropoietin, 5 µl trasilol and 0-250 µl EPO standard (or unknown), as well as PBS containing 0.1% BSA , to fill the remaining volume. The serum used contains the second sample of rabbit blood, immunized with 1% pure human urine erythropoietin. The final dilution of antiserum 125 is adjusted so that the amount of I-entropoietin bound to the antibody does not exceed 10-20% of the total amount. In general, this corresponds to a final dilution of antiserum from 1: 50000 to 1: 100000.
-eritropoetiną, surištą su antikūnu , nusodina pridėjus 150 mkl Staph A. Po 40 minučių inkubavimo pavyzdžiai centrifuguojami, atskirtos nuosėdos du kartus plaunamos 0,75 ml 10 mM Tris-HCl tirpalo (pH 8,2), turinčio 0,15 M NaCl, 2 mM 125- Erythropoietin bound to antibody is added with 150 µl of Staph A. After incubation for 40 minutes, the samples are centrifuged and the separated pellet is washed twice with 0.75 ml of 10 mM Tris-HCl, pH 8.2 containing 0.15 M NaCl, 2 mM 125
EDTA ir 0,05% Triton Χ-100. Nustatant I-eritropoetino ryšio procentą, matuojamas išplautų nuosėdų gama spinduliavimo intensyvumas. Nespecifinio nusodinimo korekcijai, kiekiai, surišti pre-imuninių serumų yra išskaičiuojami iš rezultatų. Nežinomuose pavyzdžiuose esantis eritropoetinas nustatomas lyginant su standartine kreive.EDTA and 0.05% Triton Χ-100. Determine the percentage of I-erythropoietin binding by measuring the gamma radiation intensity of the washed sediment. For correction of nonspecific deposition, the amounts of pre-immune sera bound are subtracted from the results. Erythropoietin in unknown samples is determined versus standard curve.
Šioje metodikoje naudojamas beždžionių serumas gautas pagal A dalyje aprašytą būdą. Normalaus serumo lygmenys, kaip nustatyta, apytiksliai yra 36 mV/ml, tuo tarpu apdorotų beždžionių serumas siekia nuo 1000 iki 1700 mV/ml.The monkey serum used in this procedure was obtained according to the method described in Part A. Normal serum levels are estimated to be approximately 36 mV / ml, whereas the serum of treated monkeys ranges from 1000 to 1700 mV / ml.
PAVYZDYSEXAMPLE
A.Beždžionių kDNR bibliotekos montavimasInstallation of A.Beždionis cDNA library
Informacinę DNR išskiria iš normalių ir anemiškų beždžionių inkstų panaudojant guanidino tiocianatą pagal metodiką, aprašytą darbe Chirgvvin et ai., Biochemistry, 18, p.5294(1979), ir poli/A/ iRNR valo du kartus praleidžiant per chromatografinę kolonėlę, užpildytą oligo /dT/-celiulioze, kaip aprašyta 197-198 psl. darbo Maniatis et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs, Harbor, N.Y., 1982). kDNR biblioteka montuojama pagal šiek tiek pakeistas pagrindines metodikas, aprašytas darbe Okayma et ai., Mol. and Cell.Biol., 2, p.161-170(1982). Šiuo metu pripažintų metodikų esminiai momentai yra: 1) pVC8 naudojamas pagrindo vektoriumi, perpjaunama Pst1 ir po to, naudojantis oligo dT, sukuriama 60-80 bazių ilgio uodega; 2) HindiI išskaidymas naudojamas atkabinant oligo dT uodegą nuo vieno vektoriaus galo; 3) pirmo siūlo sintezė ir uodegos prijungimas, naudojant oligo, realizuojamas pagal publikuotą metodiką; 4) BamHI išskaidymas naudojamas atkabinant oligo dCuodegą nuo vieno vektoriaus galo; 5) RNR siūlo pakeitimas į DNR realizuojamas dalyvaujant dviem rišančioms grandims (GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCC ir ACGGTCTTTA) su trigubu moliariniu pertekliumi, lyginant su oligo dG-uodegą turinčiu vektoriumi.The reference DNA is isolated from normal and anemic monkey kidneys using guanidine thiocyanate according to the method described by Chirgvvin et al., Biochemistry, 18, p.5294 (1979), and the poly / A / iRNA is purified by double passage through an oligo / dT / -cellulose as described on pages 197-198. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs, Harbor, N.Y., 1982). The cDNA library is assembled according to slightly modified basic procedures described in Okayma et al., Mol. and Cell Biol., 2, pp. 161-170 (1982). The key moments of the currently accepted methodologies are: 1) pVC8 is used as a backbone vector, cut with Pst1 and then generated with a 60-80 base tail using oligo dT; 2) HindiI cleavage is used to unlock the oligo dT tail from one end of the vector; 3) synthesis of the first filament and tail attachment using an oligo are performed according to published methodology; 4) BamHI digestion is used to uncouple the oligo dCode from one end of the vector; 5) The conversion of RNA to DNA is accomplished in the presence of two binding units (GATCTAAAGACCGTCCCCCCCCC and ACGGTCTTTA) with triple molar excess compared to the oligo dG-tailed vector.
B.Kolonijų hibridizavimo metodikos, skirtos beždžionių kDNR bibliotekos skryninguiB. Colonial hybridization techniques for monkey cDNA library screening
Į 10x10 cm dydžio lėkšteles su maitinančia terpe, turinčia 50 mkg/ml ampicilino, tolygiai išbarstoma 9000 kolonijų transformuotų E.Poli. Genesoreen filtrus (New England Nuclear Catalog - 1972) iš anksto sudrėkina BHJ-CAM lėkštelėje (37 g/1 baktoekstrakto smegenys/širdis, 2 g/1 Casamino rūgščių ir 15 g/1 agaro, turinčio 500 mkg/ml chloramfenikolo) ir naudoja lėkštelėse esančių kolonijų maitinimui. Kolonijos auginamos toje pačioje terpėje 12 ar daugiau valandų, siekiant amplifikuoti plazmidinių kolonijų skaičių. Amplifikuotas kolonijas (jų šonus) apdoroja, patalpinus filtrus virš dviejų 3 mm storio vatmano gabaliukų, įmirkytų šiuose tirpaluose:9000 colonies of transformed E.Poli are evenly spread on 10x10 cm plates with nutrient medium containing 50 mcg / ml ampicillin. Genesoreen filters (New England Nuclear Catalog - 1972) are pre-wetted in a BHJ-CAM dish (37 g / l bactoextract brain / heart, 2 g / l Casamic acids and 15 g / l agar containing 500 mcg / ml chloramphenicol) and used in the dishes nourishing existing colonies. Colonies were grown in the same medium for 12 hours or more to amplify the number of plasmid colonies. Amplified colonies (flanks) are treated by placing filters over two 3 mm thick Watman slices soaked in the following solutions:
1) 50 mM gliukozės, 25 mM Tris-HCl(pH8,0), 10 mM1) 50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH8.0), 10 mM
EDTA(pH8,0) - 5 minutesEDTA (pH8.0) - 5 minutes
2) 0,5 M NaOH - 10 minučių2) 0.5 M NaOH for 10 minutes
3) 1,0 M Tris-HCl(pH7,5) - 3 minutes.3) 1.0 M Tris-HCl (pH 7.5) for 3 minutes.
Vėliau filtrai 2 valandas džiovinami vakuume 80° C temperatūroje. Po to filtrai skaidomi proteinazę K, apdorojant tirpalu, turinčiu 50 mkg/ml proteazinio fermento buferyje K[0,1 M Tris-HCl(pH8,0) - 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA(pH8,2) 0,2% SDS]. Konkrečiai, ant kiekvieno filtro užlašinami 5 ml tirpalo ir skaidymą tęsia 30 minučių 55° C temperatūroje, o po to tirpalą pašalina.The filters were subsequently dried under vacuum at 80 ° C for 2 hours. The filters are then digested with proteinase K by treatment with 50 µg / ml protease enzyme buffer K [0.1 M Tris-HCl (pH8.0) - 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA (pH8.2) 0.2 % SDS]. Specifically, apply 5 ml of the solution to each filter and continue decomposition at 55 ° C for 30 minutes and then remove the solution.
Vėliau filtrai apdorojami 4 ml parengtinės hibridizacijos buferiu (5xSSPE - 0,5%, SDS - 100 mkg/ml SS, E.Coli DNR 5xBFP).The filters are then treated with 4 ml pre-hybridization buffer (5xSSPE 0.5%, SDS 100mg / ml SS, E. coli DNA 5xBFP).
Parengtinė hibridizacija vykdoma 55° C temperatūroje 4 arba daugiau valandų, o po to tirpalas pašalinamas.The pre-hybridization is carried out at 55 ° C for 4 hours or more and then the solution is removed.
Hibridizacijos procesas vykdomas tokiu būdu. Į kiekvieną filtrą pridedama po 3 ml hibridizacinio buferio (5xSSPE 0,5%, SDS - 100 mkg/ml SS, mielių tRNR), turinčio po 0,025 pikomolius kiekvienos iš 128 zondų sekos, pateiktų 2 lentelėje (pilnas mišinys pažymėtas EPY), o filtrai 20 valandų laikomi 48° C temperatūroje. Ši temperatūra 2° žemesnė, nei bet kurio iš zondų disociacijos temperatūra (Td).The hybridization process is carried out as follows. To each filter was added 3 ml hybridization buffer (5xSSPE 0.5%, SDS 100 mkg / ml SS, yeast tRNA) containing 0.025 picomoles of each of the 128 probe sequences in Table 2 (complete mixture labeled EPY), and the filters were added. Store at 48 ° C for 20 hours. This temperature is 2 ° lower than the dissociation temperature (Td) of any of the probes.
Pasibaigus hibridizacijai, filtrai tris kartus po 10 minučių plaunami 6xSSC-0,1% SDS tirpalu kambario temperatūroj e, o po to 2-3 kartus 6xSSC-0,1% SDS tirpalu hibridizacijos temperatūroje (48° C).At the end of hybridization, the filters were washed three times for 10 minutes with 6xSSC-0.1% SDS solution at room temperature, and then 2-3 times with 6xSSC-0.1% SDS solution at hybridization temperature (48 ° C).
Tarp pasėtų 200000 kolonijų filtrų autoradiografijos būdu randami septyni teigiami klonai.Among the 200,000 colony filters sown, seven positive clones are found by autoradiography.
Vieno iš menamų beždžionės kDNR klonų (pažymėti - klonas 83) pradinės sekos analizė atliekama taikinių patikrinimui pakoreguota metodika, aprašyta Wallace et ai., Gene, 16, p.2126(1981). Trumpiau, DNR-plazmidę iš beždžionės kDNR klono 83 linearizuoja skaidydami EcoRI ir denatūruoja kaitindami vonioje su verdančiu vandeniu. Nukleotidinę seką nustato dideoksi - būdu, aprašytu Sanger et ai., P.N.A.S.(USA), 74, p.5463-5467(1977). EPV-mišinio zondų rinkinys, sudarytas iš 16 sekų, naudojamas sekų reakcijų inicijavimui.Initial sequence analysis of one of the putative monkey cDNA clones (designated clone 83) is performed using a modified screening technique as described by Wallace et al., Gene, 16, p.2126 (1981). Briefly, DNA-plasmid from monkey cDNA clone 83 is linearized by digestion with EcoRI and denatured by heating in boiling water. The nucleotide sequence is determined by the dideoxy method described by Sanger et al., P.N.A.S. (USA), 74, pp.5463-5467 (1977). An EPV-mix probe set of 16 sequences is used to initiate sequence reactions.
C.Beždžionės EPO kDNR sekos nustatymasC. Sequencing of monkey EPO cDNA
Klono 83 nukleotidinių sekų analizė atliekama pagal metodikas, aprašytas Messing, Methods in Enzymology, 101, p.20-78 (1983). 4 lentelėje pateikti parengtinio ribojimo žemėlapio analizės rezultatai, nustatyti EcoRI/HindlII klono 83 klonuotam fragmentui, turinčiam maždaug 1600 paramiazotinių bazių. Nukleotidinė seka nustatoma randant atskirų ribojančių fragmentų sekas, siekiant suporuoti persiklojančius fragmentus. Pavyzdžiui, sekos informacijos persiklojimas, pateiktas ribojančio fragmento nukleotidų analizėje, žymimas CII3 (Sau 3A prie - III/SmaI prie 324), o sekos su priešinga tvarka nustatymas žymimas C73 (Alui prie -424/BstFII prie -203).Analysis of the nucleotide sequences of clone 83 is performed according to the methods described in Messing, Methods in Enzymology, 101, pp. 20-78 (1983). Table 4 shows the results of the pre-restriction map analysis of the 83 cloned fragment of EcoRI / HindIII clone containing approximately 1600 paramyazotic bases. The nucleotide sequence is determined by finding the sequences of individual restriction fragments in order to pair the overlapping fragments. For example, the sequence information overlap presented in the restriction fragment nucleotide analysis is designated CII3 (Jan 3A at - III / SmaI at 324), and the reverse order sequence is designated C73 (Al at -424 / BstFII at -203).
LENTELĖTABLE
Apribojančio fermento indentifikavimo sritisArea of restriction enzyme identification
EcoRIEcoRI
Sau3AJan3A
Sroa ISroa I
BstEIIBstEII
Sma ISma I
KpnIKpnI
RsaIRsaI
AluiAlui
PstIPstI
Alui įįpąlFor beer
AluiAlui
PstIPstI
PvuIIPvuII
AluiAlui
AluiAlui
AluiAlui
Rsa IRsa I
PstIPstI
A] uiA] ui
U uiU ui
Nes IBecause I
SsujASsujA
AluiAlui
AluiAlui
AluiAlui
PstIPstI
RsaIRsaI
AluiAlui
HindlIIHindlII
AluiAlui
HindlIIHindlII
Apytikris radimas(ai) .1Approximate Find (s) .1
111111
180180
203203
324324
371371
372 424 426 430 4 66 54 6 601372,424,426,430 4,666,56,601
604604
605 762 786 792 807 841 927 946605,762,786,792,807,841,927,946
1014 1072 1115 1223 1301 1343 1384 14 49 1450 15851014 1072 1115 1223 1301 1343 1384 14 49 1450 1585
Maždaug 1342 azotinių bazių (ribose nuo 3' iki EcoRI bei HindlII) sekos nustatymas ir visų galimų nuskaitymo sistemų analizė padeda vystyti DNR ir 5 lentelėje pateiktos aminorūgštinės sekos informaciją. Lentelėje subrendusio EPO aminogalūnės menama pirminė aminorūgštinė liekana (kaip patikrinta dvidešimties amino-galūnių liekanų sekos anksčiau minėtos analizės koreliacijos būdu) žymima skaitmeniu 41. Apsprendžiančio metionin-ATC kodono (pažymėtas - 27) buvimas, nukreipto prieš tėkmę pirminio amino galutinės alanininės liekanos, kaip pirmos liekanos, pažymėtos subrendusio baltymo aminorūgštinei sekai, yra tikroviškumo rodiklis to, kad EPO pradžioje išreikštas citoplazmoje pirmtako pavidale, apimančiame lemiamą 27 aminorūgštinių liekanų sritį, kuri išpjaunama prieš patenkant subrendusiam EPO į kraujotaką. Potencialaus glikozidavimo sritys polipeptido ribose pažymėtos žvaigždutėmis. Transliavimo srityje apskaičiuota molekulinė masė yra 21117 Daltonų, o 165 polipeptido liekanų, sudarančių beždžionės subrendusį EPO, molekulinė masė yra 18236 Daltonai.Sequencing of approximately 1342 nitrogenous bases (ranging from 3 'to EcoRI and HindIII) and analysis of all available scanning systems assist in the development of DNA and the amino acid sequence information in Table 5. In the table, the putative primary amino acid residue of the mature EPO amino acid residue (as verified by the twenty amino acid residue sequence correlation in the above assay) is represented by the numeral 41. Presence of the deciding methionine-ATC codon (designated 27) as the downstream primary amino acid residue of the primary amine. residues labeled for the amino acid sequence of the mature protein are an indicator of the fact that EPO is initially expressed in the cytoplasm in the form of a precursor comprising a crucial region of 27 amino acid residues, which is cleaved before the mature EPO enters the bloodstream. Areas of potential glycosidation at the polypeptide are indicated by asterisks. In the translational domain, the calculated molecular weight is 21,117 Daltons and the molecular weight of the 165 polypeptide residues forming the monkey's mature EPO is 18,236 Daltons.
B) raB) ra
N<N <
PN<PN <
H·H ·
OO
P ra* to te) te)P ra * to te) te)
O <+O <+
PP
P toP to
I—*I— *
H·H ·
PP
OO
H· e_i.H · e_i.
P isj (-3 te) fP isj (-3 te) f
te)·you) ·
LENTELĖ (tęsinys)TABLE (cont'd)
AGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTTAGGATGGGGGCTGGCCTCTGGTTCTCGTGGGGTCCAAGCTT
HindlIIHindlII
LENTELĖ (tęsinys)TABLE (cont'd)
5-tos lentelės polipeptidinė seka gali būti nesunkiai analizuojama, ieškant ypatingai hidrofilinių sričių ir/arba antrinių konformacinių charakteristikų (kurios yra potencialiai labai imunogeninių sričių rodiklis) būdais, pasiūlytais Hopp et ai., P.N.A.S. (USA), 78, p. 3824-3828 (1981), Kute et ai., J. Mol. Biol., 157, p. 105-132 (1982) ir/arba Chou et ai.,The polypeptide sequence of Table 5 can be readily analyzed for particularly hydrophilic regions and / or secondary conformational characteristics (which are indicative of potentially highly immunogenic regions) by the methods proposed by Hopp et al., P.N.A.S. (USA), 78, p. Kute et al., J. Mol. Biol., 157, p. 105-132 (1982) and / or Chou et al.
Biochem., 13, p. 222-245 (1974) bei Advances in Enzymology, 47, p.45-47 (1976). Analizės kompiuterizacija Hopp et ai., būdu tampa galima, naudojant programą, pažymėtą PEP Reference Section 6,7, pateiktą Intelligenetics, Ine., 124 University Avenue, Palo Alto, California.Biochem., 13, p. 222-245 (1974) and Advances in Enzymology, 47, pp. 45-47 (1976). Computerization of the assay by Hopp et al., Is possible using a program labeled PEP Reference Section 6.7 at Intelligenetics, Ine., 124 University Avenue, Palo Alto, California.
PAVYZDYSEXAMPLE
A. žmogaus genominė bibliotekaA. human genomic library
Žmogaus fetalinių kepenų genominę biblioteką (turinčią AhC4A fagą), gautą pagal Lown et ai., Cell, 18, p.533-543 (1979) metodikas, išsaugo dėmių hibridizacijos tyrimams.The human fetal liver genomic library (containing the AhC4A phage) obtained according to the methodologies of Lown et al., Cell, 18, p. 533-543 (1979), is preserved for hybridization assays.
B. Dėmių hibridizacijos metodikos, skirtos žmogaus genominės bibliotekos pasėjimuiB. Stain hybridization techniques for human genomic library seeding
Fagų daleles lizuoja ir DNR fiksuoja ant filtrų (50000 dėmių ant filtro) pagal metodikas, aprašytas Woo, Methods in Enzimology, 68, p.389-395 (1979), su išimtimi, kad naudojami Gene Screen Plūs filtrai (New England Nuclear Catalog Nr.NET976) bei NZYAM lėkštelės (NaCl - 5 g/1, MgCl2.6H20 - 2 g/1, NZAminA - 10 g/1, mielių ekstraktas - 5 g/1, casamino rūgštys - 2 g/1, maltozė - 2 g/1, agaras - 15 g/1).Phage particles are lysed and DNA is fixed on filters (50,000 spots per filter) according to the methods described in Woo, Methods in Enzimology, 68, pp. 389-395 (1979), with the exception that Gene Screen Plasma Filters (New England Nuclear Catalog no. .NET976) and NZYAM plates (NaCl - 5 g / l, MgCl 2 .6H 2 0 - 2 g / l, NZAminA - 10 g / l, yeast extract - 5 g / l, casino acids - 2 g / l, maltose) - 2 g / l, agar - 15 g / l).
Ore išdžiovintus filtrus pakaitina 1 valandą 80 °C temperatūroje, o po to skaido proteinaze K, kaip aprašyta 3 pavyzdžio B dalyje. Parengiamoji hibridizacija vykdoma 55 °C temperatūroje, naudojant 1 M NaCl - 1 % SDS buferį, 4 arba daugiau valandų, o po to buferis pašalinamas. Hibridizaciniai ir pohibridizaciniai perplovimai vykdomi kaip ir 3 pavyzdžio B dalyje. Naudojamas tiek 128 20-men zondų mišinys (pažymėtas EPO), tiek ir 3 lentelės 128 17-men zondų mišinys (pažymėtasThe air-dried filters are heated for 1 hour at 80 ° C and then decomposed with proteinase K as described in Example 3B. Preliminary hybridization was performed at 55 ° C using 1 M NaCl - 1% SDS buffer for 4 hours or more and then the buffer was removed. Hybridization and bottom hybridization washes were performed as in Example 3B. Both the 128 20M probe mixture (EPO labeled) and the 128 17M probe mixture (Table 3) in Table 3 are used
EPQ). Naudojant EPV zondų mišinį, hibridizacija vyksta 48° C temperatūroje, o naudojant EPO zondų mišinį - 46° C temperatūroje, t.y. 4 0 žemiau apskaičiuotos mišinio komponentams Td. Pakartotinei hibridizacijai pašalinami hibridizuoti zondai virinant 1xSSC - 0,1% SDS terpėje 2 minutes. Filtrų autoradiografija atranda tarp pasėtų 150000 faginių dėmių tris teigiamus klonus (aktyvius su abiem zondų mišiniais). Teigiamų klonų patikrinimas EPO-kodavimui realizuojamas DNR sekų nustatymu bei heterodupleksinės formacijos su 3 pavyzdžio beždžionės kDNR elektronine mikrografine vizualizacija. Ši metodika taip pat įrodo kartotinių intronų buvimą DNR sekoje.EPQ). Hybridization takes place at 48 ° C with the EPV probe mixture and 46 ° C with the EPO probe mixture, i.e. 4 0 below the calculated Td for the mixture components. For re-hybridization, hybridized probes are removed by boiling in 1xSSC - 0.1% SDS for 2 minutes. Filters autoradiography discovers three positive clones (active with both probe mixtures) among 150,000 phage spots sown. Screening of positive clones for EPO-coding is accomplished by DNA sequencing and electron micrographic imaging of the heteroduplex formation with Example 3 monkey cDNA. This technique also proves the presence of repeat introns in the DNA sequence.
PAVYZDYSEXAMPLE
Atliekama teigiamų klonų nukleininių sekų (žymimų hE1) analizė ir rezultatai, gauti iki šios dienos, pateikiami 6 lentelėje.The nucleic sequences of the positive clones (designated hE1) are analyzed and the results obtained to date are presented in Table 6.
AAGCTTCTGGGCTTCCAGACCCAGCTACTTTGCGGAACTCAGCAACCCAGGCATCTCTGAGTCTCCGCCCAAAGCTTCTGGGCTTCCAGACCCAGCTACTTTGCGGAACTCAGCAACCCAGGCATCTCTGAGTCTCCGCCCA
GTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCTGTGAGTACTCGCGGGCTGGGCGCTCCCGGCGGCCGGGTTCCTGTTTGAGCGGGGATTTAGCGCCCCGGCT
3«3 «
CCAGGAACCTGGCACTTGGTTTGGGGTGGAGΤΓGGGAAGCTAGACACTGCCCCCCTACATAAGAATAAGTCCCAGGAACCTGGCACTTGGTTTGGGGTGGAGΤΓGGGAAGCTAGACACTGCCCCCCTACATAAGAATAAGTC
LENTELĖ (tęsinys)TABLE (cont'd)
TGGTGGCCCCAAACCATACCTGAAACTAGGCAAGGAGCAAAGCCAGCAGATCCTACGCCTGTGGGCCAGGGTGGTGGCCCCAAACCATACCTGAAACTAGGCAAGGAGCAAAGCCAGCAGATCCTACGCCTGTGGGCCAGGG
TTTGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCACACCACTGCACTCCAGCCTCAGTGACAGAGTGAGGCCCTGTCTCA iTTTGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCACACCACTGCACTCCAGCCTCAGTGACAGAGTGAGGCCCTGTCTCA i
40A40A
LENTELE (tęsinys)TABLE (continued)
lentelėje pirminė nepertraukiama DNR seka pažymi viršutinę 620 bazių grandinę taip, kad, matyt, yra netransliuojama seka, po kurios tuoj pat seka transliuojama žmogaus EPO geno dalis. Tiksliau, seka susideda iš 5 galų geno, kuris veda prie transliuojamos DNR dalies, koduojančios pirmas 4 aminorūgštis (nuo -27 iki -24) “lyderio” sekoje (“pre-seka”). Keturios azotinių bazių poros sekoje, einančioje prieš pastarąją, koduoja lyderio pradžią, tačiau dar nenustatytos vienareikšmiai ir todėl žymimos “X”. Po to seka intronas, susidedantis maždaug iš 639 porų azotinių bazių (439 bazių poroms nustatyta seka, o kitoms 200 bazių porų žymima “I.S.”), už kurio tuoj pat seka glutamino kodonas, kuris vaizduojamas kaip -23 transliuoto peptido liekana. Toliau einanti egzono seka koduoja aminorūgščių liekanas per adenino liekanas (žymimas kaip subrendusio EPO geno +1 aminorūgščių liekana) iki kodono, nusakančio treoniną +26 padėtyje, po to seka antras intronas, susidedantis iš 256 bazių, kas specifiškai ir pažymėta. Sekanti už šio introno egzono seka 27-55 aminorūgščių liekanoms, tęsiasi trečiu intronu, susidedančiu iš 612 porų azotinių bazių. Toliau einantis egzonas koduoja 56-115 žmogaus EPO liekanas. Po jo eina ketvirtasis intronas iš 134 porų azotinių bazių, kurias pratęsia egzonas, koduojantis 116-166 liekanas, ir “sustabdymo” kodonas (TGA). Galiausiai 6 lentelėje identifikuojama 568 porų azotinių bazių seka taip, kad susideda iš netransliuojamos srities 3’ žmogaus EPO geno. Dviejų azotinių bazių porų (“X”) eiliškumas nėra vienareikšmiškai nustatytas.In Table 1, the primary continuous DNA sequence maps to the upper 620 base chain such that it appears to be an untranslated sequence followed immediately by the transposed portion of the human EPO gene. Specifically, the sequence consists of a 5-terminal gene that leads to a portion of the translated DNA encoding the first 4 amino acids (-27 to -24) in the "leader" sequence ("pre-sequence"). The four pairs of nitrogenous bases in the sequence preceding the latter encode the leader start, but are not yet uniquely identified and are therefore denoted by "X". This is followed by an intron consisting of approximately 639 pairs of nitrogenous bases (439 base pairs are identified and the other 200 base pairs are designated "I.S."), immediately followed by a glutamine codon depicted as the -23 residue of the translated peptide. The following exon sequence encodes the amino acid residue via an adenine residue (designated as the + 1 amino acid residue of the mature EPO gene) to a codon that expresses threonine at the +26 position, followed by a second intron consisting of 256 bases, specifically and designated. The sequence behind this exon exon sequence for amino acid residues 27-55 extends to a third intron consisting of 612 pairs of nitrogenous bases. The following exon encodes the residues of 56-115 human EPO. It is followed by a fourth intron of 134 pairs of nitrogenous bases, which is extended by an exon encoding residues 116-166 and a "stop" codon (TGA). Finally, Table 6 identifies the sequence of 568 pairs of nitrogenous bases consisting of the 3 'human EPO gene of the untranslated region. The order of the two nitrogen base pairs (“X”) is not unambiguously determined.
lentelė leidžia identifikuoti subrendusio žmogaus EPO konformacijos (aminorūgščių sekos) pirminę struktūrą, kuri susideda iš 166 nustatytų aminorūgščių liekanų (su nustatyta molekuline mase = 18399). Lentelėje taip pat pavaizduota DNR seka, koduojanti lyderio seką iš 27 liekanų kartu su DNR seka 5’ ir 3’, kuri gali būti reikšminga promotoriaus/operatoriaus funkcijai, vykdomai geno operatoriaus. Segmentai potencialiam žmogaus EPO polipeptido glikozidinimui lentelėje pažymėti žvaigždutėmis. Būtina pažymėti, kad 6 lentelėje specifinė aminorūgščių seka, tikriausiai, sudaro laisvai randamos žmogaus eritropoetino alelinės formos seką. Pagrindimas tokiam teigimui yra nenutrūkstamų bandymų rezultatai, gauti nustatant žmogaus šlapimo eritropoetino izoliatų seką, kuri leidžia disponuoti tokia informacija, kad žymi eritropoetino molekulių dalis turi metioniną 126-je liekanoje kaip priešpriešą serinui, kas pavaizduota lentelėje.the table allows the identification of the parent structure of the mature human EPO conformation (amino acid sequence), which consists of 166 identified amino acid residues (with an established molecular weight = 18399). The table also shows the DNA sequence encoding the leader sequence of the 27 residues along with the DNA sequence 5 'and 3', which may be significant for the promoter / operator function performed by the gene operator. Segments for potential glycosidation of the human EPO polypeptide are marked with asterisks in the table. It should be noted that in Table 6, the specific amino acid sequence probably represents the free-form allele form of human erythropoietin. The rationale for such a statement is the results of continuous testing of human urinary erythropoietin isolates, which allows for information that a significant portion of the erythropoietin molecules contain methionine in residue 126 as opposed to serine, as shown in the table.
lentelė iliustruoja homologijos laipsnį tarp žmogaus ir beždžionės polipeptidinės sekos. Viršutinėje nepertraukiamoje lentelės linijoje raidiniai žymėjimai panaudoti tam, kad žmogaus EPO dedukuotas ir transliuotas sekas, pradedant nuo 27 liekanos. Apatinė nepertraukiama linija vaizduoja beždžionės EPO dedukuotą polipeptidinę seką, prasidedančią nuo 27-to skaičiaus, reiškiančio liekaną. Žvaigždutės naudojamos sekų homologijai pažymėti. Reikia pažymėti, kad žmogaus ir beždžionės EPO dedukuotas polipeptidinės sekos išryškina papildomą lizino (k) liekaną 116 padėtyje (žmogui). Nuoroda į 6 lentelę, reiškia, kad ši liekana yra gale įsivaizduojamo iRNR ir genominės grandinės junginio. Lizino liekanos buvimas žmogaus polipeptidinėje grandinėje tikrinamas nustatant žmogaus kDNR klono (kuris gautas iš iRNR), išskirto iš COS-I ląstelių, kurios transformuotos su žmogaus genomine DNR 7 pavyzdyje, infra, seką.the table illustrates the degree of homology between the human and monkey polypeptide sequences. In the top continuous line of the table, the alphanumeric notations are used to deduce and translate human EPO sequences starting with 27 residues. The bottom continuous line depicts the monkey EPO deduced polypeptide sequence, starting with the number 27 representing the residue. Asterisks are used to denote sequence homology. It should be noted that human and monkey EPO deduced polypeptide sequences reveal an additional lysine (k) residue at position 116 (human). Reference to Table 6 means that this residue is at the end of an imaginary iRNA and genomic chain compound. The presence of a lysine residue in the human polypeptide chain is verified by infra-sequencing a human cDNA clone (derived from iRNA) isolated from COS-I cells transformed with human genomic DNA in Example 7.
Beždžionė AISLPDAA5AAPLRTITADTFCKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRRGORMonkey AISLPDAA5AAPLRTITADTFCKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRRGOR
®·® ·
I XI X
LENTELĖTABLE
PAVYZDYSEXAMPLE
Pirminės mikrobiologinės sintezės bandymuose gauti izoliuotų kiekių polipeptidinę eritropoetino medžiagą, koduojamą beždžionės kDNR, gautos, kaip aprašyta 3 pavyzdyje, būdu, parinkta ekspresijos sistema yra sistema, kurioje yra žinduolio ląstelė-šeimininkė (pvz., COS-I ląstelė, A.T.C.C. Nr.CPL-1650). Nurodytos ląstelės vykdo transfekciją šaudyklinio vektoriaus pagalba, kuris turi sugebėjimą spontaniškai replikuotis E.Coli ląstelėje (dėka DNR derivatų iš pBP322 plazmidžių buvimo) ir žinduolių šeimininkuose (dėka DNR derivatų iš virusų SV-40 buvimo).For primary microbiological synthesis assays, the selected expression system for the isolated amounts of the polypeptide erythropoietin material encoded by the monkey cDNA obtained as described in Example 3 is a mammalian host cell (e.g., COS-I cell, ATCC No..CPL- 1650). The indicated cells carry out transfection with the shuttle vector which has the ability to spontaneously replicate in E. coli (thanks to the presence of DNA derivatives from pBP322 plasmids) and in mammalian hosts (thanks to the presence of SV-40 DNA derivatives).
Konkrečiau, ekspresijos vektorius sudaromas pagal žemiau nurodytas metodikas. 83 plazmidžių klonas, gautas 3-me pvz., amplifikuojamas į E.Coli bakterijas ir, pervirinant EcoRI ir HindlII, izoliuoja apytikriai 1.4 kbeždžionės DNR, koduojančią eritropoetiną. Iš pBR322 plazmidžių atskirai išskirta 4.0 kb fragmento HindlII/SalI. Iš DNR, kurios turi M13mp10 pasikartojimus R-DNR (R ir I laboratorijos) gauta apie 30 porų azotinių bazių (bp) jungiančios grandies EcoRI/SalI fragmento. Nurodyta jungianti grandis nuosekliai susideda iš EcoRI lipnaus galo, po kurio seka atpažinimo zonos SStI, SmaI, BamHI ir Xbal ir lipnus Salį galas. Trys ankščiau nurodyti fragmentai susiuvami su gautu maždaug 5.4 kb tarpinės plazmidės (pERs) EPO-DNR, kuris iš vienos pusės ribojamas naudojant naudingų sričių bloką ribojantį endonukleozės atpažinimą. Po to PERs plazmidė transformuojama HindlII ir Salį bakterijų, gaunant eritropoetiną iš DNR ir EcoRI į jungiančią grandį Salį (M13mp10).More specifically, the expression vector is constructed according to the following procedures. The 83 plasmid clone obtained in Example 3 is amplified into E. coli and, by digestion with EcoRI and HindIII, has isolated approximately 1.4 kB of the monkey DNA encoding erythropoietin. The 4.0 kb HindIII / SalI fragment was isolated from pBR322 plasmids separately. About 30 pairs of the nitrogen base (bp) linking EcoRI / SalI fragment were obtained from R13 DNA (Labs R and I) from DNAs with M13mp10 repeats. The indicated linker consisted sequentially of the EcoRI adhesive end followed by the recognition zones SStI, SmaI, BamHI and Xbal and the self-adhesive SalI end. The above three fragments are stitched together with the resulting approximately 5.4 kb intermediate plasmid (pERs) EPO-DNA, which on the one hand is restricted by the use of endonucleosis recognition by the block of useful regions. The PERs plasmid is then transformed with HindIII and SalI to produce erythropoietin from DNA and EcoRI into the SalI binding linkage (M13mp10).
Anksčiau nurodytos 1.4 kb ilgio DNR fragmentas susiuvamas su plazmidės pBP322 BamHI/Sall sritimi, kurios ilgis apie 4.0 kb ir kitomis fragmento M13mp10 HindlII/BabIHI jungiančiomis grandimis. Jungiančios grandies M13mp10 fragmentas yra HindlII-lipnusis galas, po kurio seka atpažinimo fragmentai PstI, Salį, Xbal ir BamHI lipnusis galas. Susiuvimo produktu vėl gaunama naudinga tarpinė plazmidė pBR-EPO turinti savyje EPO-DNR, kuri iš abiejų pusių ribojama ribojančios zonos kaupiančiomis eilėmis.The above 1.4 kb DNA fragment is stitched into the BamHI / SalI region of plasmid pBP322, which is about 4.0 kb in length, and other HindIII / BabI1 linking fragments of the M13mp10 fragment. The M13mp10 linking fragment is the HindIII-adhesive end followed by the recognition fragments PstI, SalI, XbaI and BamHI. The stitching product again yields a useful intermediate plasmid pBR-EPO containing EPO-DNA, which is flanked on both sides by the restriction region sequences.
savybės, prie autoduplikuotis ekspresij ai sugebėj imasfeatures that are capable of autoduplication expression
Parinktas EPO-DNR ekspresijai COS-I (pDSVL.1) ląstelėse vektorius pagaminamas iš anksto, tam, kad būtų galima vykdytiSelected EPO-DNA for expression in COS-I (pDSVL.1) cells is pre-engineered for
E.Coli atranką ir autoduplikaciją. Nurodytos charakteristikos pasiekiamos dėka replikacijos pradžios ir DNR genų sekos, atsparių ampicilino veikimui, kuris yra zonoje vykdančioje pBP322 plazmidės nukleotidų 2448 ir 4362 suartinimą. Nurodyta eilės seka struktūriškai modifikuojama dėka ''jungiančių zonų įvedimo, kurios užtikrina HIndlII atpažinimą iškart kai tik 2448 nukleotidas prisiglaudžia dar nespėjus jam įsitraukti nurodytą vektorių. Šalia vektoriaus parinkimo EPO-DNR naudingų savybių priskiriama COS-I ląstelėse ir eiliškumo buvimas, kuris veikia sustiprinančiai virusą žinduolio ląstelėse. Nurodytos charakteristikos pasiekiamos dėka replikacinės DNR eilės pradžios ir vėlyvojo DNR geno eiliškumo, kuris yra viruso sustiprintojas, dalyvaujantis grandinėje, susidedančioje iš 342 bazių porų, sutraukiančiu SV40 genomo nukleotidus nuo S170 iki 270. Unikali ribojanti sritis (BamHI) susidaro ant vektoriaus, tuoj pat priglusdama prie viruso sustiprintojo eilės dėka sustiprintojo standartinės sekos buvimo naudojant jungiančios grandies seką esančią rinkoje (Collaborative Research). Papildomai į vektorių įvesta 23 azotinių porų seka (kaip viruso SV40 nukleotidų skaičiaus nuo 2553 iki 2770 išvestinė) turinti virusinės iRNR vėlyvojo geno poliadenilinimo signalą (paprastai žinomas kaip transkripcijos terminatorius). Nurodytas fragmentas išsidėsto vektoriuje atitinkama tvarka vėlyvojo geno viruso sustiprintojo atžvilgiu per unikalią BamHI sritį. Nurodytame vektoriuje atstovaujamas taip pat kitas žinduolio genas, esantis nematerkalinėje padėtyje galimos geno transkripcijos atžvilgiu, kuris išsidėstys nurodytoje unikalioje srityje tarp viruso sustiprintojo eilės ir terminatoriaus. [Nurodytas žinduolio genas turi savyje maždaug 2500 bp dihidrofoliat- reduktozės (DHFR)-pelės minigeno, išskirto iš pMG-I, Gresser plazmidės ir kt., P.N.A.S. (USA), 79, p.6522-6526, 1982m.] Ir vėlgi dauguma veikiančios plazmidės pDSVLI komponentų susideda iš 2448-4362 nukleotidų iš pBR322 plazmidės kartu su 5/A1-270 (342 bp) ir 2353-2770 (273 bp) nukleotidais viruso DNR, turinčiai SV40 virusą.E.Coli screening and autoduplication. The above characteristics are achieved thanks to the initiation of replication and the DNA gene sequence resistant to the action of ampicillin, which is located in the region of pBP322 plasmid nucleotide 2448 and 4362 approximation. The indicated sequence is structurally modified by the introduction of '' linking regions, which provide recognition of HIndlII as soon as 2448 nucleotides flank it before it can incorporate the specified vector. In addition to vector selection, useful properties of EPO-DNA include COS-I cells and the presence of a queue that acts to amplify the virus in mammalian cells. The above characteristics are achieved thanks to the start of the replicative DNA sequence and the late sequence of the DNA gene, which is a viral enhancer involved in a 342-base pair that constructs the SV40 genome nucleotides S170 to 270. A unique Bounding Region (BamHI) is formed on the vector to the viral enhancer sequence due to the presence of the standard amplifier sequence using the linker sequence commercially available (Collaborative Research). In addition, a sequence of 23 nitrogen pairs (as a derivative of nucleotide numbers 2553 to 2770 of the SV40 virus) containing a polyadenylation signal of the viral iRNA late gene (commonly known as a transcription terminator) was introduced into the vector. The indicated fragment is located in the vector in the appropriate order relative to the late gene virus enhancer through the unique BamHI region. The specified vector also represents another mammalian gene located in an immaterial position with respect to possible gene transcription, which will be located within the specified unique region between the viral enhancer and the terminator. [The indicated mammalian gene contains approximately 2500 bp of dihydrofolia-reductose (DHFR) - mouse minigene isolated from pMG-I, Gresser plasmid, etc., P.N.A.S. (USA), 79, p.6522-6526, 1982] And again, most components of the active plasmid pDSVLI consist of 2448-4362 nucleotides from pBR322 together with 5 / A1-270 (342 bp) and 2353-2770 (273 bp). nucleotides of viral DNA containing SV40 virus.
Pagal anksčiau aprašytas metodikas, pvz., Maniatis et ai., eritropoetiną koduojančią DNR išskiria iš pBP-ERO plazmidės BamHI fragmento pavidalu ir įsiuva į pDSVLI plazmidę, išpjautą BamHI. Norint įsitikinti, ar teisingai įvestas EPO-genas, dviejuose iš gautų kloninių vektorių (duplikuoti H ir L vektoriai) vykdoma analizė, naudojant ribojantį fragmentą (žiūr. fig.2, iliustruojančią pDSVL1-MEE plazmidę). Neteisingos orientacijos EPO-genų vektorius palikome kaip neigiamų dydžių reguliatorius transfekcijos eksperimentuose, skirtuose EPO ekspresijos lygio pagalba nustatymui šeimininkuose, kurie transformuojami vektorių su teisinga EPO-DNR orientacija pagalba.According to the previously described procedures, e.g., Maniatis et al., The erythropoietin-encoding DNA is isolated from the pBP-ERO plasmid in the form of the BamHI fragment and sewn into the pDSVLI plasmid cut in BamHI. Two of the resulting clonal vectors (duplicated H and L vectors) are analyzed by the restriction fragment (see Figure 2 for an illustration of pDSVL1-M E E) to confirm the correct insertion of the EPO gene. We left the misaligned EPO-gene vectors as regulators of negative sizes in transfection experiments for the determination of EPO expression levels in hosts transformed with vectors with the correct EPO-DNA orientation.
M, L, X, G vektorius sujungiame DNR nešikliu (pelių kepenų ir blužnies DNR). Transfekcijai naudojamos 60 mm plokštelės, naudojant mikronusodinimo kalcio fosfatu metodus. Dvigubas 60 mm plokšteles transfektavo DNR nešikliu, kaip negatyvių dydžių transformacijos valdymo “imitacija”. Po 5 dienų nauja kultūrinė terpė buvo tirta nustatant polipeptidų buvimą, kurie turi imunologines gamtinio eritropoetino savybes.We combine the M, L, X, G vectors with DNA carrier (mouse liver and spleen DNA). 60 mm plates were used for transfection using calcium phosphate micron precipitation methods. Double 60 mm plates were transfected with DNA carrier as an "imitation" of negative size transformation control. After 5 days, the new culture medium was assayed for the presence of polypeptides which possess the immunological properties of natural erythropoietin.
PAVYZDYS išskirta is ėriuko geną, pervirinamaEXAMPLE Isolated from lamb gene, boiled
A. Pradinio EPO ekspresijos sistema, naudojant COS-I ląstelesA. Initial EPO expression system using COS-I cells
Parinkti pirminiame etape mikrobiologinės sintezės veikiami izoliuoti polipeptidinio žmogaus eritropoetino kiekiai, koduojami DNR genomo EPO klonų būdu, be to, sistema apima žinduolio ląstelių-šeimininkių požymių ekspresiją (pvz., COS-I ląstelės, A.T.C.C. Nr.CL-1650). Pradžioje žmogaus EPO-geną subklonuoja (suskaldo) į “šaudyklinį” vektorių, kuris turi sugebėjimą autonomiškai replikuotis abiejose šeimininko E.coli (dėka DNR, išvestos iš pBR322 plazmidės) ir COS-I linijos žinduolių ląstelėje (dėka buvimo SV40 viruso viruso-išvestos DNR). “Šaudyklinis vektorius”, turintis EPO polipeptidinę medžiagą, susidaro transfektuotose ląstelėse ir ji išskiriama į ląstelinę kultūrinę terpę. Konkrečiau, požymių ekspresijos vektorius kuriamas pagal žemiau nurodytas metodikas. DNR hEl klono, turinčioSelected primary levels of microbial synthesis are exposed to isolated amounts of the polypeptide human erythropoietin encoded by the DNA genome EPO clones, and the system comprises expression of host mammalian cell traits (e.g., COS-I cells, A.T.C.C. No..CL-1650). Initially, the human EPO gene is subcloned (cleaved) into a "shuttle" vector that has the ability to autonomously replicate in both host E.coli (thanks to DNA derived from pBR322) and the COS-I lineage in a mammalian cell (thanks to the presence of SV40 virus-derived DNA). ). The "shuttle vector" containing the EPO polypeptide material is produced in transfected cells and secreted into the cell culture medium. More specifically, the trait expression vector is constructed according to the methodologies outlined below. DNA hEl clone containing
BamHI ir HindlII genominį EPOriboj ančios endonukleazės pagalba ir izoliuojąs! 5.6 DNR-fragmentu, kaip nustatyta, turinčiu pilną EPO geną. Nurodytą DNR fragmentą sumaišo ir susiuva su bakterijos pVCB plazmidė (Bethesda Research Laboratories, Ine.) ; kuri analogiškai perdirbama, sukuriant tarpinę puC8-EVE plazmidę, sukuriant tokiu būdu, tinkamą organinio fragmento šaltinį.BamHI and HindIII genomic by EPObinding endonuclease and isolating! 5.6 DNA fragment found to contain the complete EPO gene. The indicated DNA fragment was mixed and ligated with the bacterial pVCB plasmid (Bethesda Research Laboratories, Ine.); which is similarly processed to generate the intermediate plasmid puC8-EVE, thereby generating a suitable source of the organic fragment.
Parinkti EPO-DNR ekspresijai vektoriai COS-I ląstelėje sukuriami iš anksto. pSV4SEt plazmidė, turinti DNR seką, suteikia pasirinkimo ir autoduplikacijos galimybę E.Coli bakterijoje. Nurodytos charakteristikos pasiekiamos dėka replikacijos pradžios ir DNR geno sekos tvarkos, atsparios ampicilinui, kuris yra toje srityje, suartinančioje nukleotidus nuo 2442 iki 4332 pBR322 bakterinės plazmidės. Nurodyta seka keičia struktūrą dėka jungiančios grandies įvedimo, kuris aprūpina atpažinimo sritį tuoj pat, kai ji prisiliečia prie 2443 nukleotido. pSV4SEt plazmidė taip pat gali autoduplikuotis COS-I ląstelėse. Nurodytos charakteristikos pasiekiamos dėka 342 bp fragmento panaudojimo, kuris turi viruso replikacijos pradžią SV40 viruso pagalba (nukleotidų skaičius nuo 5171 iki 370). Nurodytas fragmentas modifikuojamas įvedant jungiančią grandį, kuri aprūpina EcoRI atpažinimo sritį, kuri yra šalia 270 nukleotido ir įvedant specialią grandį, aprūpinančią sritį, esančią prie 5171 nukleotido. Šiame vektoriuje yra SV40 viruso 1061 bp fragmentas (nukleotidų skaičius nuo 1711 iki 2772) su papildoma jungiančia grandimi, kuri aprūpina Salį atpažinimo sritį, esančią prie 2772 nukleotido.Selected vectors for expression of EPO-DNA are pre-generated in the COS-I cell. The plasmid pSV4SEt, which contains the DNA sequence, offers the possibility of selection and autoduplication in E. coli. These characteristics are achieved thanks to the initiation of replication and the sequence of the DNA gene that is resistant to ampicillin, which is located in the region approximating nucleotides 2442 to 4332 of the bacterial plasmid pBR322. The given sequence changes structure due to the introduction of a linking strand which provides the recognition region as soon as it touches nucleotide 2443. The pSV4SEt plasmid can also autoduplicate in COS-I cells. The above characteristics are achieved thanks to the use of the 342 bp fragment, which has the origin of viral replication with the help of SV40 virus (nucleotides 5171 to 370). The above moiety is modified by introducing a linker that provides an EcoRI recognition region that is adjacent to 270 nucleotides, and by introducing a specific linker that delivers a region close to nucleotide 5171. This vector contains a 1061 bp fragment (nucleotide number 1711 to 2772) of the SV40 virus with an additional linker that provides the SalI recognition region at nucleotide 2772.
Nurodyto fragmento ribose yra unikali atpažinimo BamHI seka. Apibendrinant tai, kas pasakyta, pV4SEt plazmidė turi savyje unikalias atpažinimo sritis BamHI ir Hindlll, kas leidžia įvesti žmogaus EPO geną. Nurodytos sekos suteikia galimybę vykdyti replikaciją ir selektyvų parinkimą E.Coli bakterijoje ir replikaciją COS-I ląstelėse.Within the given fragment is a unique recognition BamHI sequence. In conclusion, the pV4SEt plasmid contains unique recognition regions BamHI and HindIII that allow for the introduction of the human EPO gene. The indicated sequences allow replication and selective selection in E. coli and replication in COS-I cells.
Tam, kad įvesti EPO geną į pSV4SEt plazmidę, p40-HuE plazmidė pervirinama BamHI ir Hindlll pagalba iki ribojančios endonukleazės ir yra izoliuojami 5,6 kb EPO, koduojančio DNR fragmentą. pSV4SEt plazmidė t.p. pervirinama BamHI ir Hindlll pagalba ir pagrindinė fragmento dalis, susidedanti iš 2513 porų bazių, izoliuojama, (išlaikant visas būtinas funkcijas). Nurodyti fragmentai sumaišomi ir susiuvami, sudarydami galutinį vektorių pSVgHu EPO“ (žiūr. 3 pav.). Šis vektorius skiedžiamas E.Coli ląstelėje, o IIIKt vektorius izoliuojamas. Tam, kad įsitikinti, ar įvestas EPO genas, vykdoma ribojančio fermento analizė.To introduce the EPO gene into the pSV4SEt plasmid, the p40-HuE plasmid is digested with BamHI and HindIII to the limiting endonuclease, and the 5.6 kb EPO encoding the DNA fragment is isolated. pSV4SEt plasmid m.p. digested with BamHI and Hindlll, and the main portion of the fragment consisting of 2513 pairs of bases is isolated (retaining all necessary functions). The indicated fragments are mixed and stitched to form the final vector pSVgHu EPO '(see Figure 3). This vector is diluted in E. coli and the IIIKt vector is isolated. A restriction enzyme analysis is performed to confirm that the EPO gene has been introduced.
DNR pSVgHu EPO plazmidė naudojama tam, kad išryškinti EPO-polipeptidinės medžiagos požymius COS-I ląstelėse. Detaliai aprašant, DNR pSVgHu EPO plazmides susijungia su DNR nešikliu ir transportuojama į COS-I ląstelių triplikatines 60 mm plokšteles.DNR nešiklio kontrolei vienas transfektuoj amas COS-I ląstelėse.The DNA pSVgHu EPO plasmid is used to express the features of the EPO-polypeptide substance in COS-I cells. In detail, the DNA pSVgHu EPO plasmids bind to the DNA carrier and transported to COS-I cell triplicate 60 mm plates. For control of the DNA carrier, one transfected into COS-I cells.
Ląstelių kultūrinė terpė atrenkama praėjus 5-7 vai. ir yra ištiriama dėl polipeptidų buvimo, kurie turi imunologines savybes, būdingas laisvai sutinkamai žmogaus EPO.The culture medium of the cells is selected 5-7 hours later. and is tested for the presence of polypeptides that have immunological properties specific for free human EPO.
B.Antroji EPO požymių ekspresijos sistema COS-I ląstelėseB. Second expression system of EPO traits in COS-I cells
Dar viena ekspresijos sistema naudojama gauti geresnius žmogaus eritropoetin-polipeptidinės medžiagos produktus, koduojamus žmogaus genominės DNR klono pagalba, sudaranti EPO COS-I ląstelėse (A.T.C.C. Nr. CRL-1650).Another expression system is used to obtain improved products of human erythropoietin polypeptide material encoded by the human genomic DNA clone forming EPO in COS-I cells (A.T.C.C. No. CRL-1650).
Ankstesnėje sistemoje EPO požymiai COS-I ląstelėse pasireiškia naudojant ten esantį stiprintuvą, kuris yra ribojančio fragmento BamHI srityje, atitinkamai pagal HindlII, ir yra 5,6 kb ilgio. Kitoje struktūroje EPO genas keičiasi gaunant požymių ekspresiją, naudojant vėlyvąjį viruso SV40 stiprintuvą. Konkrečiau, žmogaus genominio EPO ribojantis fragmentas, t.y. klonuotas 5,6 kb BamHI atitinkantis HindlII modifikuojamas pagal šią metodiką. Kaip aprašyta anksčiau, pVC8-HuE plazmidė suskaldoma dalyvaujant BamHI ir ribojančiai endonukleazei BStEII. Ribojanti endonukleazė BStEII suskaldo 5,6 kb ribose EPO geną toje vietoje, kurioje yra 44 poros bazių 5' iki pradinių ATG, koduodama peptidą-pirmtaką ir apytiksliai 680 porų bazių 3' iki ribojančios srities HindlII. Po to atsiskiria fragmentas, kuriame yra apie 4900 porų bazių. DNR fragmentas su sintetine jungiančia grandimi, kurią sudaro Salį ir BStEII lipnūs galai ir vidinė BamHI atpažinimo sritis, sintezuojama ir išvaloma. Abu nurodyti fragmentai susimaišo ir susijungia su plazmidė pB322, kuri iškerpama Salį ir BamHI pagalba, kad gauti tarpinę plazmidę pBRgHe. Žmogaus EPO genominį geną galima iš jos izoliuti kaip fragmentą Barnį su 4900 porų bazių, kuriame yra pilna geno struktūra su vienetine ATG 4.4 bp 3' atitinkančią BamHI sritį, kuri yra greta koduotos aminogrupės srities galo.In the previous system, the EPO traits in COS-I cells are expressed using an enhancer present there, which is in the BamHI region of the restriction fragment, according to HindIII, respectively, and is 5.6 kb long. In another structure, the EPO gene changes upon expression of traits using the late viral SV40 enhancer. More specifically, a restriction fragment of the human genomic EPO, i.e. the cloned 5.6 kb BamHI corresponding HindIII is modified by this procedure. As described previously, the pVC8-HuE plasmid is cleaved in the presence of BamHI and the limiting endonuclease BStEII. The restriction endonuclease BStEII cleaves the 5.6 kb EPO gene at a site 44 pairs of bases 5 'to the original ATG encoding the peptide precursor and approximately 680 pairs of bases 3' to the HindIII restriction site. This is followed by a fragment containing about 4900 pairs of bases. A DNA fragment with a synthetic linker consisting of SalI and BStEII adhesive ends and an internal BamHI recognition region is synthesized and purified. Both of these fragments are fused and linked to plasmid pB322, which is cleaved with SalI and BamHI to give the intermediate plasmid pBRgHe. The human EPO genomic gene can be isolated from it as a fragment of Barnis with 4900 pairs of bases, which contains the complete gene structure with a unitary ATG 4.4 bp 3 'corresponding BamHI region adjacent to the end of the coded amino group.
Gautą fragmentą izoliuoja ir įveda kaip fragmentą BamHI į plazmidę pDSVLI išskaidyto ekspresijos vektoriaus BamHI (žiūr. 6 pavyzdį). Gauta plazmidė pSVLgHu EPO, kaip parodyta fig.4., naudojama išryškinti EPO polipeptidinės medžiagos požymius iš COS-I ląstelių, kaip aprašyta 6 ir 7a pavyzdyje.The resulting fragment is isolated and introduced as a BamHI fragment into the plasmid pDSVLI-cleaved expression vector BamHI (see Example 6). The resulting plasmid pSVLgHu EPO, as shown in Fig. 4, is used to highlight the features of the EPO polypeptide from COS-I cells as described in Examples 6 and 7a.
PAVYZDYSEXAMPLE
Kultūrinė terpė, išauginta iš 6 transfektuotų COS-I ląstelių kultūrų 6 pavyzdyje išanalizuota radioimunine analize pagal metodiką, nurodytą 2 pavyzdyje, B dalyje. Kiekvienas pavyzdys buvo analizuojamas esant alikvotinio mėginio reikšmėms 250, 125, 50, 25 mkl. Sluoksniai iš augančių ląstelių tariamai transfektuotų vektorių pagalba su neteisinga EPO genų orentacija, turėjo neigiamą imunoreaktyvumo reikšmę. Kiekvienam dviejų skysčio sluoksnių pavyzdžiui, gautam iš COS-I ląstelių, kurios transfektuotos vektoriais (H ir L) su teisinga EPO DNR orentacija, R5I-EP0 inhibicijos procentas, sujungto su antikūniu, svyruoja nuo 72 iki 88%, kurie sutalpina visas reikšmes į viršutinę standartinės kreivės dalį. Todėl negalima tiksliai apskaičiuoti tikros eritropoetino koncentracijos plaukiojančiuose kultūros sluoksniuose. Buvo atlikti nedideli apskaičiavimai, lygūs 300 mv/ml, tačiau skaičiavimai buvo atlikti esant pačiam didžiausiam alikvotiniam mėginiui (250 mkl).Culture medium grown from 6 transfected COS-I cell cultures in Example 6 was analyzed by radioimmunoassay according to the procedure outlined in Example 2, Part B. Each sample was analyzed at an aliquot of 250, 125, 50, 25 μl. Layers of growing cells with the help of putatively transfected vectors with the wrong orientation of EPO genes had negative immunoreactivity. For each sample of two fluid layers derived from COS-I cells transfected with vectors (H and L) with the correct orientation of EPO DNA, the percentage of R5I-EP0 inhibition coupled to the antibody ranges from 72 to 88%, which fits all values into the supernatant. part of the standard curve. Therefore, the true concentration of erythropoietin in floating culture layers cannot be accurately estimated. Small calculations of 300 mv / ml were made, but the calculations were made with the largest aliquot sample (250 mkl).
Kultūrinio skysčio pavyzdys, gautas pagal 6 pavyzdį ir 57 dienų kultūriniai skysčiai, aprašyti pavyzdyje 7a buvo analizuojami radioimunologiniu metodu, kad palyginti beždžionės ir žmogaus rekombinantiniu EPO medžiagų aktyvumą su laisvai sutinkamu žmogaus EPO, kuris atitinka standartą. Gauti rezultatai pateikti fig.1 grafike.The culture fluid sample obtained in Example 6 and the 57-day culture fluids described in Example 7a were analyzed by radioimmunoassay to compare the activity of monkey and human recombinant EPO with the free human EPO standard. The results obtained are plotted in FIG.
Trumpiau tariant, gauti rezultatai netikėtai parodė, kad rekombinantinis beždžionės EPO iš esmės konkuruoja dėl antikūnio, surišto su žmogaus anti-EPO, kurio nepavyko pilnai inhibuoti bandymų metu.In short, the results obtained unexpectedly showed that recombinant monkey EPO competed substantially for antibody bound to human anti-EPO, which could not be completely inhibited in the assays.
Maksimalus inhibicijos reikšmių procentas žmogaus rekombinantiniam eritropoetinui vis tiek yra artimas standartiniams rodikliams. Dozės-efekto kreivės paralelinis tipas parodo sekų (epitopų) imunologinį identiškumą. Prieš skaičiuojant beždžionės EPO koncentracijas kultūriniuose skysčiuose buvo atlikti pakartotiniai įvertinimai, esant didelėms nurodyto praskiedimo reikšmėms. Buvo nustatyta, kad jos svyruoja intervale nuo 2,91 iki 9,12 V/ml. Suskaičiuoti žmogaus EPO produkcijos lygiai nustatyti atitinkamai 392 V/ml pavyzdyje, kuris buvo kultivuotas 5 dienas ir 567 mV/ml pavyzdyje, kuris buvo kultivuotas 7 dienas. Apskaičiuoti beždžionės EPO produkavimo lygiai 7B pavyzdyje ekspresijos sistemos, buvo analogiški arba geresni.The maximum percentage inhibition values for recombinant human erythropoietin are still close to standard values. The parallel type of the dose-effect curve shows the immunological identity of the sequences (epitopes). Prior to calculating monkey EPO concentrations in culture fluids, reassessments were made at high values of the indicated dilution. They have been found to range from 2.91 to 9.12 U / ml. The calculated levels of human EPO production were determined in 392 U / ml of sample cultured for 5 days and 567 mV / ml in sample cultured for 7 days, respectively. Monkey EPO production levels calculated in Example 7B expression systems were comparable or better.
PAVYZDYSEXAMPLE
Kultūriniai skysčiai, gauti pagal 6 ir 7 pavyzdį buvo analizuoti in vitro, kad nustatyti EPO aktyvumą pagal Goldvvasser et ai., Endocrinology, 97, 2 p. 315-313(1975) metodiką. Paskaičiuotos beždžionės EPO reikšmės tiriamuose kultūriniuose skysčiuose svyravo nuo 3,2 iki 4,3 V/ml. Žmogaus EPO kultūriniai skysčiai taip pat buvo aktyvūs gautuose apskaičiavimuose in vitro tyrime ir be to nurodytą aktyvumą galima neutralizuoti veikiant antikūnu anti-EPO. Rekombinantinio beždžionės EPO kultūriniai skysčiai 6 pavyzdyje taip pat buvo tiriami kiekybiniu biologinio aktyvumo nustatymu in vitro. pagal bendrą metodiką Cotes et ai., Nature, 191, p. 1065-1067(1967) ir Hammand et ai., Ann. N.Y. Acad. Sci., t. 149, p. 516-527(1968). Nurodyti aktyvumo lygiai svyravo nuo 0,94 iki 1,24 V/ml.The culture fluids obtained in Examples 6 and 7 were analyzed in vitro to determine EPO activity according to Goldvasser et al., Endocrinology, 97, p.2. 315-313 (1975). Monkey EPO values in the culture fluids tested ranged from 3.2 to 4.3 U / ml. Human EPO culture fluids were also active in the resulting calculations in an in vitro assay, and furthermore, the activity reported can be neutralized by treatment with anti-EPO antibody. Culture fluids of recombinant monkey EPO in Example 6 were also assayed for quantitative in vitro bioactivity. according to the general methodology of Cotes et al., Nature, 191, p. 1065-1067 (1967) and Hammand et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 149, p. 516-527 (1968). The indicated activity levels ranged from 0.94 to 1.24 U / ml.
PAVYZDYSEXAMPLE
Ankstesniuose pavyzdžiuose rekombinantinio žmogaus arba beždžionės EPO medžiaga gaunama iš vektorių, kurie naudojami transfektuoti COS-I ląstelėms. Nurodyti vektoriai atlieka replikaciją COS-I ląstelėse dėl viruso SV40 T antigeno buvimo ląstelės viduje, prasidedant replikacijai nurodytuose vektoriuose.In the foregoing examples, recombinant human or monkey EPO material is derived from vectors used for transfection into COS-I cells. The indicated vectors replicate in COS-I cells due to the presence of SV40 T antigen within the cell, starting with replication in the indicated vectors.
Nors gauti vektoriai atgamina gerąsias EPO savybes COS-I ląstelėse, šios savybės yra laikinos (7-14 dienų) dėl galimo vektoriaus praradimo. Be to tik nedidelis procentas atgamintų COS-I tampa produktyviai transfektuotomis nurodytais vektoriais. Šis pavyzdys aprašo požymių ekspresijos sistemas, naudojančias kinietiško žiurkėno kiaušidės DHFR ląsteles (CHO) ir selektuojamą markerį, DHFR.Although the resulting vectors reproduce the good properties of EPO in COS-I cells, these properties are transient (7-14 days) due to possible loss of the vector. In addition, only a small percentage of the reproduced COS-I becomes productively transfected with the indicated vectors. This example describes trait expression systems using Chinese hamster ovary DHFR cells (CHO) and a selectable marker, DHFR.
Giminingų ekspresijos sistemų apsvarstymą rasite JAV patente Nr. 4.399.216 ir paraiškoje išduoti Europatentui Nr. 117058 1/7059 ir 117060, išleistuose rugpjūčio 29d. 1984 metais.For consideration of related expression systems, see U.S. Pat. No. 4,399,216; 117058 1/7059 and 117060 issued August 29. In 1984.
CHO DHFP ląstelėse (Dux-Bll) CHO KI, Urlaub et ai., Proc. Nat. Acad. Sci.(JAV), t.77, p. 4461(1980) dėl mutacijų, kurios vyksta struktūriniuose genuose, trūksta enzim-dihidrofoliatreduktazės (DHFR), ir todėl būtinas glicinas, hipoksantinas ir timidinas kultūrinėje terpėje.CHO in DHFP cells (Dux-Bll) CHO KI, Urlaub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), vol.77, p. 4461 (1980), due to mutations in structural genes, lack of enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) and therefore necessitating glycine, hypoxanthine and thymidine in culture media.
Plazmidės pDSVL-MKE (6 pavyzdys) pDSLV-gH4EP0 (7B pavyzdys) transfektuojamos kartu su DNR nešikliu į DHFR CHO ląsteles, kurias išaugina terpėje, turinčioje hipoksantino, timidino ir glicino 60 mm kultūrinėse plokštėse. Plazmidę pSVgH4EP0 (7a pavyzdys) sumaišo su plazmidė pMG2, kurioje yra pelės genas dihidrofoliat-reduktazės pagrindu, klonuotas į vektorių bakterinės plazmidės pRR 322 (pagal Gasser et ai., Supra). Plazmidžių ir DNRnešiklio mišinį transfektuoja į DNRCHO ląsteles (ląstelės, kurios paima vieną plazmidę, paprastai taip pat paims ir antrą plazmidę). Po 3 dienų gautos ląstelės disperguojamos tripsinizavimo būdu keliose 100 mm kultūrinėse plokštelėse, terpėje, kurioje trūksta hipoksantino ir timidino. Tiktai tos ląstelės, kurios transformuojasi į stabilią būseną, veikiant genui DHFR, parodo EPO geno išlikimą toje terpėje. Po 7-21 dienos tampa matomos gyvų ląstelių kolonijos. Nurodytos transformantų kolonijos po dispergavimo tripsinizavimo^ būdu gali nenutrūkstamai daugintis terpėje, kurioje trūksta hipoksantino ir timidino, sukurdamos naujus ląstelių kamienus (pvz., CHO pDSVL-MKEPO, CHO pSVgH4EP0, CHO pDSVL-9B4EP0).Plasmid pDSVL-MKE (Example 6) pDSLV-gH 4 EP0 (Example 7B) was co-transfected into DHFR CHO cells grown in medium containing hypoxanthine, thymidine and glycine in 60 mm culture plates. Plasmid pSVgH 4 EP0 (Example 7a) was mixed with plasmid pMG 2 , which contains a mouse gene based on dihydrofolate reductase, cloned into the bacterial plasmid pRR 322 (according to Gasser et al., Supra). The plasmid-DNA mixture is transfected into DNA-CHO cells (cells that take one plasmid will usually also take the second plasmid). After 3 days, the resulting cells are dispersed by trypsinization in several 100-mm culture plates in medium lacking hypoxanthine and thymidine. Only cells that are transformed to a stable state under the influence of the DHFR gene show the survival of the EPO gene in that medium. After 7-21 days, colonies of living cells become visible. Specified colonies of transformants, following dispersion by trypsinization, can continue to proliferate in media lacking hypoxanthine and thymidine to form new cell strains (e.g., CHO pDSVL-MKEPO, CHO pSVgH 4 EP0, CHO pDSVL-9B 4 EP0).
Kultūriniai skysčiai, gauti iš aukščiau minėtų ląstelių kamienų, tiriami radioimuniniu metodu, ieškant beždžionės ar žmogaus rekombinantinio EPO. Terpė kamienams CHO pDSVL-MKEPO turi EPO su tokiomis pat imuninėmis savybėmis, kaip ir EPO, gautas iš ląstelių COS-I, transfektuotų plazmidė pDSVL-MKEPO. 65 valandų kultūrinio skysčio pavyzdys turi beždžionės EPO 0,6 v/ml.Culture fluids from the above cell strains are assayed by radioimmunoassay for monkey or human recombinant EPO. Strain medium CHO pDSVL-MKEPO contains EPO with the same immune properties as EPO derived from COS-I cells transfected with plasmid pDSVL-MKEPO. A 65-hour culture fluid sample has a monkey EPO of 0.6 v / ml.
Kultūriniai skysčiai, gauti iš CHO pSVgH4EP0 ir CHO pDSVLgH4EP0, turi rekombinantinį žmogaus EPO, kuris pasižymi tokiomis pat imunologinėmis savybėmis, kaip ir EPO, gautas iš ląstelių COS-I, transfektuotų plazmidė pSVgH4EP0 arba pDSVL-gH4EPO. 3 dienų kultūrinio skysčio pavyzdys, gautas iš CHO pSVgH4EP0, turi 2,99 v/ml žmogaus EPO, o pavyzdys, išlaikytas 5,5 dienas, gautas iš CHO pDSVL-gH4EP0, turi 18,2 V/ml žmogaus EPO, kaip rodo radioimuninės analizės rezultatai,Culture fluids derived from CHO pSVgH 4 EP0 and CHO pDSVLgH 4 EP0 have recombinant human EPO having the same immunological properties as EPO derived from COS-I cells transfected with pSVgH 4 EP0 or pDSVL-gH 4 EPO. A 3-day culture fluid sample derived from CHO pSVgH 4 EP0 contains 2.99 U / ml human EPO, and a sample maintained 5.5 days obtained from CHO pDSVL-gH 4 EP0 contains 18.2 U / ml human EPO as shown by radioimmunoassay results,
EPO kokybę, gautą iš aukščiau minėtų, galima padidinti sustiprinant genus, sukuriant naujus ląstelių kamienus, kurių efektyvumas būtų didesnis. Fermentas dihidrofoliatreduktazė (DHFR), kuri yra DHFR geno koduojamas produktas, gali būti inhibuota metotreksatu (ΜΤΧ). Ląstelės, kurios dauginasi terpėje, kurioje nepakanka hipoksantino ir timidino, inhibuojamos arba užmušamos metotreksatu. Tam tikrose sąlygose (pvz., esant minimaliai metotreksato koncentracijai) galima gauti ląstelių atsparumą ir jų galimybę augti metotreksate (ΜΤΧ). Nustatyta, kad nurodytos ląstelės tampa atsparios ΜΤΧ dėl to, kad sustiprėja eilė jų DHFR genų, dėl to padidėja fermento produkcija. Gyvas ląsteles, savo ruožtu, galima apdoroti padidintomis metotreksato koncentracijomis, ko pasėkoje ląstelių kamienuose padidės DHFR genų kiekis. “Prabėgantys genai” (pvz. EPO) pernešami ekspresijos vektoriaus kartu su DHFR genu arba transformuojami su juo, kaip dažnai nustatoma, padidina savo reprodukcijų skaičių.The quality of EPO derived from the above can be enhanced by amplifying genes, creating new cell strains with greater efficiency. The enzyme dihydrofolate reductase (DHFR), which is a product encoded by the DHFR gene, can be inhibited by methotrexate (ΜΤΧ). Cells that reproduce in media lacking hypoxanthine and thymidine are inhibited or killed by methotrexate. Under certain conditions (eg, minimal methotrexate concentration), cell resistance and their ability to grow on methotrexate (ΜΤΧ) can be obtained. These cells have been shown to become resistant ΜΤΧ due to the enhancement of a number of their DHFR genes, resulting in increased enzyme production. Live cells, in turn, can be treated with elevated concentrations of methotrexate, resulting in increased levels of DHFR genes in cell strains. "Passing genes" (eg, EPO) carry the expression vector along with or transform it with the DHFR gene, as it is often found, to increase its number of reproductions.
Amplifikacinės sistemos praktinės realizacijos pavyzdys yra ląstelių CHO pDSVL-MKE kamienas, apdorotas metotreksatu didinant jo koncentraciją (0 nM, 30 nM, 100 nM). Pavyzdžiai, kultivuoti 65 valandas kiekviename amplifikacijos etape, radioimuninės analizės duomenimis turi eritropoetino, kurio kiekiai yra atitinkamai 0,60, 2,45 ir 6,10 V/ml. CHO pDSVL-9H4EP0 ląstelių kamienai apdorojami metotreksatu, didinant jo koncentraciją serijose: 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1 mkM ir 5 mkM. Pavyzdys, kuriame yra 3 dienų viršnuosėdinis skystis jį apdorojant 100 nM metotreksato (ΜΤΧ) koncentracija radioimuninio tyrimo duomenimis turi žmogaus eritropoetino 3089±129 V/ml. Pavyzdžiai, kuriuose buvo 48 valandų kultūrinė terpė, apdoroti metotreksatu, kurio koncentracija 100 nM ir 1 mkM turi žmogaus eritropoetino radioimuninės analizės duomenimis atitinkamai 466 ir 1352 V/ml (tai vidutinė reikšmė gauta 3 kartus tiriant pavyzdžius). Pagal nurodytą metodiką 60An example of a practical implementation of an amplification system is the CHD pDSVL-MKE cell strain treated with methotrexate at increasing concentrations (0 nM, 30 nM, 100 nM). Samples cultured for 65 hours at each amplification step contain erythropoietin in amounts of 0.60, 2.45 and 6.10 U / ml, respectively, as determined by radioimmunoassay. CHO pDSVL-9H 4 EP0 cell strains were treated with methotrexate at increasing concentrations in the series: 30 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 1 mkM and 5 mkM. Sample containing 3 days supernatant fluid treated with 100 nM methotrexate (ΜΤΧ) contains 3089 ± 129 U / ml human erythropoietin in a radioimmunoassay. Samples containing 48 hours culture medium treated with methotrexate at 100 nM and 1 mKM contained 466 and 1352 U / ml, respectively, in human erythropoietin radioimmunoassay (mean value 3 times for the specimens). According to the methodology given 60
O mm Petri lėkštelėje, kurioje yra 5 ml terpės išsėjama po 1x10 ląstelių. Po 24 valandų terpė pašalinama ir pakeičiama nauja terpe (5 ml), kurioje nėra serumo DMEM su dideliu gliukozės kiekiu į kurią papildomai pridedama 0,1 M ne pagrindinių aminorūgščių ir L-glutamino'. Eritropoetinas kaupiasi 48 valandas terpėje, kurioje nėra serumo. Po to terpė tiriama radioimuniniu metodu, o ląstelės tripsinizuojamos ir po to suskaičiuojamos. Vidutinės eritropoetino reikšmės pavyzdžiuose tiriant radioimuniniu metodu yra apie 467 ir 1352 V/ml ląstelėms, išaugintoms apdorojant 100 nM ir 1 mkM metotreksato koncentracijomis. Faktinis eritropoetino kiekis Petri lėkštelėje buvo 2335 ir 6750 V. Vidutinis ląstelių kiekis lėkštelėje buvo atitinkamai 1.94*10® ir 3.12*10®.O mm in a Petri dish containing 5 ml of medium and inoculated 1x10 cells. After 24 hours, the medium is removed and replaced with a new medium (5 ml) containing no high serum DMEM with the addition of 0.1 M non-essential amino acids and L-glutamine. Erythropoietin accumulates in serum-free media for 48 hours. The medium is then assayed by radioimmunoassay and the cells are trypsinized and then counted. The mean values for erythropoietin in radioimmunoassay in the samples are approximately 467 and 1352 U / ml for cells grown at concentrations of 100 nM and 1 mMM methotrexate. The actual amount of erythropoietin in the Petri dish was 2335 and 6750 V. The average cells in the dish were 1.94 * 10® and 3.12 * 10®, respectively.
Tokiu būdu, efektyvaus produkavimo greitis nurodytose sąlygose turi reikšmes 1264 ir 2167 V/10® ląstelių per 48 valandas.Thus, the effective production rate under the given conditions is 1264 and 2167 V / 10® cells within 48 hours.
Anksčiau aprašytos ląstelių kultūros yra genetiškai įvairi produkcija. Tam, kad izoliuoti genetiškai negyvus klonus, kurie turi didžiausias produkcijos galimybes, naudojami standartiniai atrinkimo metodai, (žiūr. A skyrių, 2 dalį Points to Consider in Characterisation of Cell Lines Used to Produce Biologics, liepos 1d. 1984 m., JAV biopreparatų mokslinio patikrinimo skyrius, vaistinių preparatų ir biopreparatų centras, maisto produktų ir vaistų valdyba).The cell cultures described above are genetically diverse products. Standard screening methods are used to isolate the genetically dead clones that have the highest production potential, (see Section A, Part 2, June 1, 1984, US Biological Preparations Science). screening unit, Center for Medicines and Biopreparations, Food and Drug Board).
Anksčiau aprašytas CHO ląstelių linijų, produkuojančių eritropoetiną, produktyvumas gali būti padidintas naudojant atitinkamas ląstelių kultivavimo metodikas. Žinduolių ląstelių dauginimuisi kultūrinėje terpėje paprastai reikalingas serumas. Eritropoetino gavimo iš CHO ląstelių terpėje, kurioje nėra serumo būdas palengvina eritropoetino rektifikaciją iš kultūrinės terpės. Žemiau aprašytu būdu galima gauti didelius eritropoetino kiekius terpėje be serumo, kurių pakanka gamybai.The productivity of the CHO cell lines producing erythropoietin described above may be increased using appropriate cell culture techniques. Serum is usually required for the growth of mammalian cells in culture media. The method of obtaining erythropoietin from CHO cells in serum-free medium facilitates the rectification of erythropoietin from the culture medium. Serious amounts of erythropoietin in serum-free media, sufficient for production, can be obtained as described below.
CHO pDSVL-gH4EP0 linijas ląstelės, išaugintos standartinėse ląstelių kultivavimo sąlygose, pasėliui naudojami flakonai su pasėjama ląsteline kultūra. Nurodytos ląstelės dauginasi flakonuose kaip suspensinė ląstelinė linija, kurioje yra persėta ląstelių kultūra, terpėje, kuri sudaryta 50:50 DHEM su dideliu gliukozės kiekiu ir F12Ham, į kurį pridėta 5% karvės embriono serumo, L-glutamino1, penicilino, streptomicino 0,05 mM nepagrindinių aminorūgščių ir atitinkamos koncentracijos metotreksato mišinio.For CHO pDSVL-gH 4 EP0 lines, cells grown under standard cell culture conditions were seeded with cell culture vials. The indicated cells reproduce in vials as a suspension cell line inoculated with 50:50 DHEM in high-glucose medium and F12Ham supplemented with 5% cow embryo serum, L-glutamine 1 , penicillin, streptomycin 0.05. mM of a mixture of non-essential amino acids and the corresponding concentration of methotrexate.
Suspensijos pavidalo ląstelinėse kultūrose yra galimybė greitai daugintis eritropoetinui, kuris gaunamas iš CHO ląstelių. CHO ląstelės, kurios auginamos suspensijos pavidalu, naudojamos ląstelėms pasėti į besisukančius indus. Pirminis 7 2 pasėlio tankis 1,5*10 gyvybingų ląstelių 850 cm nurodyto indo, kuriame yra 200 ml terpės.Suspended cell cultures have the potential to rapidly replicate erythropoietin, which is derived from CHO cells. CHO cells, grown in suspension, are used to seed cells in rotating vessels. Initial 7 2 culture density 1.5 * 10 viable cells in a 850 cm designated vessel containing 200 ml medium.
dienas nurodytos ląstelės auginamos iki monosluoksnio susidarymo, santykinai tankiai prisišliejusių ląstelių linijų. Naudojama šioje fazėje ląstelių auginimo terpė yra analogiška terpei, kuri naudojama ląstelių kultivavimui suspensijoje. 3 dienų ląstelių augimo periodo pabaigoje terpę, kurioje yra serumas, atskiria ir pakeičia ją į 100 ml terpę, kurioje nėra serumo. Šioje terpėje yra 50:50 mišinys DHEM su dideliu gliukozės kiekiu ir F12Ham, į kurį papildomai pridėta 0,05 mM nepagrindinių aminorūgščių ir L-glutaminas·. Besisukančius indus su paruošta terpe patalpina 2-3 valandoms į inkubatorių. Po to terpė pašalinama ir pakeičiama į 100 ml naujos, neturinčios serumo terpės. Po 1-3 valandų inkubacijos terpėje be serumo sumažėja baltymų užteršimo serumu koncentracija. Po to besisukančius indus vėl patalpina 7 dienoms į inkubatorių. Tuo periodu kultūrinėje terpėje be serumo kaupiasi eritropoetinas. Po to senoji terpė pašalinama ir pakeičiama į naują, neturinčią serumo terpę, kuri yra reikalinga antram produkavimo ciklui. Praktinis nurodytos sistemos realizavimo pavyzdys, laikytas 7 dienas terpėje be serumo, radioimuninio tyrimo duomenimis turėjo 3892-409 V/ml eritropoetino. Atsižvelgiant į ląstelių tankio paskaičiavimus apie 0,91,8*1O5 ląstelių cm2, kiekviename besisukančiame inde, kurio plotas 850 cm2 yra nuo 0,75 iki 1,5*108 ląstelių. Tada eritropoetino produkcijos greitis per 7 dienas 100 ml kultūros yra ribose tarp 750 ir 1470 V/106 ląstelių per 48 valandas.days, cells are cultured to monolayer formation with relatively dense cell lines. The cell culture medium used in this phase is analogous to the medium used for cell culture in suspension. At the end of the 3-day cell growth period, serum-containing medium is separated and replaced with 100 ml serum-free medium. This medium contains a 50:50 mixture of high-glucose DHEM and F12Ham, supplemented with 0.05 mM of non-essential amino acids and L-glutamine. Rotating dishes with prepared medium are placed in the incubator for 2-3 hours. The medium is then removed and replaced with 100 ml of new serum-free medium. After 1-3 hours of incubation in serum-free medium, the concentration of serum protein contamination decreases. The rotating dishes are then placed in the incubator for 7 days. During this period, erythropoietin accumulates in serum-free culture media. The old medium is then removed and replaced with the new serum-free medium required for the second production cycle. A practical example of the realization of the given system, stored in serum-free medium for 7 days, contained 3892-409 U / ml erythropoietin in a radioimmunoassay. Based on cell density calculations of about 0.91.8 * 10 5 cells per cm 2 , each rotating dish of 850 cm 2 area contains between 0.75 and 1.5 * 10 8 cells. The rate of erythropoietin production over 7 days in 100 ml culture is then between 750 and 1470 U / 10 6 cells in 48 hours.
Viršnusėdiminiai skysčiai iš ląstelinės linijos CHO pDSVL-MKEPO, amplifikuoti metotreksate esant 10 nM koncentracijai buvo tirti radioimuniniu metodu bandant eritropoetino aktyvumą . in vitro ir in vivo. Ištirtas radioimuniniu metodu pavyzdys, pagamintas koncentruotoje terpėje turi 41,2+1,4 V/ml eritropoetino; 41,2+0,064 V/ml nustatytas biologinis aktyvumas in vitro, o 42,5+5 V/ml tiriant biologinį aktyvumą in vivo. Nustatant aminorūgščių liekanų polipeptidinių produktų sekas, aptinkama eritropoetininių produktų, kurių dominantinis tipas turi 3 liekanas pirmaujančios sekos, kuri prijungiama prie numanomų aminogrupių, kurios baigiasi alaninu. Šiuo metu neaišku ar tai yra CHO ląstelių polipeptido branduolio neteisingo apdorojimo rezultatas, ar tai žmogaus ir beždžionės eritropoetinų struktūros skirtumai aminogrupių pabaigose.The supernatant fluids from the cell line CHO pDSVL-MKEPO amplified with methotrexate at 10 nM were assayed by radioimmunoassay for erythropoietin activity. in vitro and in vivo. A radioimmunoassayed sample prepared in concentrated medium contains 41.2 + 1.4 U / ml erythropoietin; Biological activity was determined at 41.2 + 0.064 U / ml in vitro and 42.5 + 5 U / ml in vivo. In the sequencing of polypeptide products of amino acid residues, erythropoietin products of the dominant type have 3 residues in the leading sequence, which are linked to putative amino groups terminating in alanine. It is currently unclear whether this is the result of improper processing of the CHO cell polypeptide nucleus or whether the structure of the human and monkey erythropoietins is different at the amino terminus.
Viršnusėdiminį skystį, paruoštą iš CHO ląstelių linijos pDSVL-gH4EP0 tyrė 3 bandymais. Radioimuninio tyrimo duomenimisThe supernatant fluid prepared from the CHO cell line pDSVL-gH 4 EP0 was tested in 3 assays. By radioimmunoassay
5,5 V/ml rekombinantinio žmogaus eritropoetino tyrime in vitro - 15,8+4,6 V/ml, tyrime in vivo 16,8±3,0 V/ml.5.5 U / ml in the recombinant human erythropoietin assay: 15.8 + 4.6 U / ml, in the in vivo assay: 16.8 ± 3.0 U / ml.
Paruoštą iš CHO ląstelių linijos pDSVL-gH4EP0 ir laipsniškai amplifikuoj amą 100 nM metotreksatu tyrė 3 bandymais. Radioimuninės analizės duomenimis 3 dienų pavyzdys turi 3089+129 V/ml rekombinantinio žmogaus eritropoetino; tyrime in vitro - 2589+71,5 V/ml, o tyrime in vivo - 2040+160 V/ml. Aiminorūgščių seka demonstruoja atitikimą 4 lentelėje pateiktiems duomenims.Prepared from CHO cell line pDSVL-gH 4 EP0 and incrementally amplified with 100 nM methotrexate was assayed in 3 assays. Radioimmunoassay for 3 days contains 3089 + 129 U / ml recombinant human erythropoietin; 2589 + 71.5 U / ml in the in vitro study and 2040 + 160 U / ml in the in vivo study. The acetic acid sequence demonstrates consistency with the data in Table 4.
Kondicionuotą ląstelinę terpę, paruoštą iš CHO ląstelių ir transfektuotą plazmidė pDSV-MKE 10 nM metotreksate, sujungia ir metotreksatą dializuoja kelių dienų bėgyje, ko pasėkoje susidaro kultūra su eritropoetino aktyvumu maždaug 221±5,1 V/ml (eritropoetinas - kondicionuota ląstelių terpė) (EPO-CCM). EPO-CCM poveikio paprastos dalelės hematokritui linijoje Balb/c įvertinimui atliktas toks eksperimentas. Kondicionuotą ląstelinę terpę, paruoštą iš netransfektuotų CHO(CCM) ląstelių ir EPO-CCM reguliuoja naudojant standartinį buferinį tirpalą retikulocitams (PB). Kondicionuotą ląstelinę terpę panaudoja kontrolinei gyvūnų grupei (3 pelytės), o eksperimentinėms grupėms (2 pelytės grupei) naudoja 2 EPO-CCM dozavimo lygius: 4 vienetai injekcijai ir 44 vienetai injekcijai. 5 savaičių kurso bėgyje 7 pelytėm po 3 kartus savaitėje suleidžiamos injekcijos į pilvą. Buvo nustatyta, kad kontrolinėje grupėje po 8-tos injekcijos vidutiniai hematokrito rodikliai buvo 50,5%, 4 vienetus EPO-CCM gaunančioje grupėje 55,1%, o 44 vienetus -67,9%.The conditioned cell medium prepared from CHO cells and transfected with the pDSV-MKE plasmid pDSV-MKE in 10 nM methotrexate is combined and dialyzed against methotrexate over several days, resulting in a culture with erythropoietin activity of approximately 221 ± 5.1 U / ml (erythropoietin - conditioned media). EPO-CCM). The following experiment was performed to evaluate the effect of EPO-CCM on the hematocrit of a single particle in the Balb / c line. Conditioned cell media prepared from untransfected CHO (CCM) cells and EPO-CCM was regulated using standard buffer for reticulocytes (PB). The conditioned cell medium is used for the control group of animals (3 mice) and for the experimental groups (2 mice group) 2 dosage levels of EPO-CCM are used: 4 units for injection and 44 units for injection. During the 5-week course, 7 mice were injected 3 times per week into the abdomen. In the control group, after the 8th injection, the mean hematocrit was 50.5%, in the 4-unit EPO-CCM group 55.1% and in the 44-unit 67.9%.
Gana grynus žinduolių ląstelių ekspresijos produktus be sunkumų galima išskirti iš kultūrinės terpės naudojant HPLC(C4) su etaloniniu gradientu, pageidautina esant pH7.Pretty pure mammalian cell expression products can be readily isolated from the culture medium using HPLC (C 4 ) with a reference gradient, preferably at pH7.
Atliktas išankstinis mėginimas nustatyti rekombinantiniu glikoproteininių produktų, gautų iš kondicionuotos COS-I ląstelių ir eritropoetino (iš žmogaus šlapimo) CHO geno ekspresijos terpės, savybes, naudojant tiek VVestern blot (nuspalvinimo), tiek ir SDS-PAGE analizes. Minėti tyrimai parodė, jog eritropoetininė medžiaga, gaminama CHO ląstelių, turi šiek tiek didesnę molekulinę masę, nei COS-I ląstelių ekspresijos produktai, kurių savo ruožtu, truputį didesnė, nei žmogaus šlapimo ekstrakto. Tam tikru laipsniu visi produktai yra heterogeniški. Sialo rūgšties pašalinimui panaudotas fermentas - neiraminidazė sukelia tai, jog rekombinantiniai ląstelių COS-I ir CHO produktai turi maždaug vienodą molekulinę masę, ir kurios (tiek viena, tiek ir kita) yra didesnės nei žmogaus šlapimo ekstrakto, turinčio azialo grupes, molekulinė masė. Apdorojimas fermentu endogliukozidaze (EC 3.2.1) CHO ląstelių rekombinantinį produktą bei šlapimo ekstrakto produktą (pilnam angliavandenių pašalinimui) įgalina gauti beveik homogeniškus produktus, kurių molekulinės masės beveik vienodos.A preliminary attempt was made to determine the properties of recombinant glycoprotein products derived from conditioned COS-I cells and erythropoietin (from human urine) CHO gene expression medium by both Western blot and SDS-PAGE analyzes. The aforementioned studies showed that erythropoietin produced by CHO cells has slightly higher molecular weight than COS-I cell expression products, which in turn are slightly higher than human urine extract. To some degree, all products are heterogeneous. Neuraminidase, an enzyme used to remove sialic acid, causes recombinant cellular COS-I and CHO products to have approximately the same molecular weight and (both) higher molecular weight than human urine extract containing azial groups. Endogenous glucosidase enzyme treatment (EC 3.2.1) allows the recombinant CHO cell product and the urine extract product (for complete carbohydrate removal) to produce nearly homogeneous products of almost identical molecular weights.
Išgrynintą eritropoetiną, gautą iš žmogaus šlapimo, bei rekombinantinį, gautą iš CHO ląstelių, eritropoetiną pagal šį išradimą, analizuoja ieškodami angliavandeninės sudėties pagal metodiką (Zedcen et ai., Methods in Enzymology, t.83, p.139191(1982)), kuri modifikuota, panaudojant hidrolizės metodą, aprašytą Nesser et ai., Anai. Biochem., t.142, p.58-67(1984). Eksperimentiškai nustatyti šlapimo izoliato angliavandeninės sudėties rodikliai (išreikšti moliniais santykiais) yra šie: heksozė - 1.73, acetilgliukozaminas - 1, neizamininės rūgšties acetilas - 0.93, fukozė - 0, acetilgalaktozaminas - 0.Purified erythropoietin from human urine and recombinant CHO cells from erythropoietin according to the present invention are analyzed for carbohydrate composition according to the method (Zedcen et al., Methods in Enzymology, vol. 83, p.139191 (1982)). modified by the hydrolysis method described in Nesser et al., Anai. Biochem., Vol. 142, pp. 58-67 (1984). Experimentally determined carbohydrate content of urine isolate (expressed in molar ratios) is as follows: hexose - 1.73, acetylglucosamine - 1, non - amino acid acetyl - 0.93, fucose - 0, acetylgalactosamine - 0.
Atitinkami rekombinantinių produktų (ląstelių linijos CHO pDVSL-gH ir EPO darinių) rodikliai (po 3 dienų kultūrinėje terpėje, sustiprintoje 100 nM metotreksatu) turi šias reikšmes: heksozė - 15.09, N-acetilgliukozaminas - 1, neizamininės rūgšties acetilas - 0.998, fukozė - 0, Nacetilgalaktozaminas - 0. Gauti rezultatai sutampa su anksčiau minėtų analizių (Western blot ir SDS-PAGE) rezultatais.Corresponding values of recombinant products (cell line CHO pDVSL-gH and EPO derivatives) (after 3 days in culture medium supplemented with 100 nM methotrexate) have the following values: Hexose 15.09, N-acetylglucosamine 1, Non-amino acid acetyl 0.998, Fucose 0 , Nacetylgalactosamine - 0. The results are in agreement with the above assays (Western blot and SDS-PAGE).
Glikoproteininių produktų, gautų pagal šį išradimą, pirminė struktūrinė konformacija pakankamu lygiu atkartoja laisvai sutinkamo eritropoetino konformaciją, kad įgytų vieną ar daugiau jo biologinių savybių, tačiau jų angliavandenių kiekybinė sudėtis skirtinga.The primary structural conformation of the glycoprotein products of the present invention mimics the free-form erythropoietin to a sufficient degree to obtain one or more of its biological properties, but their carbohydrate content varies.
PAVYZDYSEXAMPLE
Siūlomas pavyzdys apima visą eritropoetinų gavimo ciklą, montuojant nukleotidines dviejų struktūrinių genų, koduojančių žmogaus eritropoetino seką bazes, pateiktų 6 lentelėje ir turinčių požymių ekspresijos kodonus E.Coli ir mielinėse ląstelėse (S. Cerevisiai).The proposed example covers the complete cycle of erythropoietin production by fitting the nucleotide bases of two structural genes encoding the human erythropoietin sequence presented in Table 6 and having expression codons in E. coli and yeast cells (S. Cerevisiai).
Šiame pavyzdyje papildomai aprašyta genų, koduojančių eritropetino analogus, konstrukcija. Trumpiau kalbant, naudoti protokolai pateikti anksčiau minėtame aprašyme Alton et ai. (WO 83/04053). Minėti genai sukonstruoti pirminiam sudėtingo diploido oligonukleotidų dedamųjų montavimui, kurie savo ruožtu sumontuoti trijose diskretiškose sekcijose (blokuose). Šie blokai sumontuoti amplifikacijai, o pašalinant iš amplifikacijos sistemos gali būti sumontuoti nuosekliai arba per sudėtingos struktūros fragmentą- ligatūrą į tinkamą ekspresijos vektorių.This example further describes the construction of genes encoding erythropoietin analogs. Briefly, the protocols used are described in Alton et al., Supra. (WO 83/04053). These genes are engineered for the initial assembly of complex diploid oligonucleotide components, which are in turn assembled in three discrete sections (blocks). These blocks are assembled for amplification and, when removed from the amplification system, can be mounted sequentially or through a fragment of complex structure-ligation to a suitable expression vector.
8-14 lentelėse parodyta schema ir konstravimas geno, koduojančio eritropoetino transliacijos produktą, kuriame nėra jokios prieš tai einančios sekos ar sekos-lyderio, tačiau yra pradinis metionino likutis padėtyje - 1. Dar daugiau, įvestas į pagrindinę ląstelės E.Coli dalį genas teikia pirmenybę kodonams, o minėta konstrukcija vadinama ECEPO genu.Tables 8-14 show the scheme and construction of a gene encoding an erythropoietin translational product that has no upstream sequence or sequence leader but has an initial methionine residue at position 1. Further, the gene introduced into the major part of the E. coli cell prefers codons, and said construct is called the ECEPO gene.
LENTELĖ dalies ECEPO oligonukleotidaiTABLE TABLE ECEPO oligonucleotides
1. AATTCTAGAAACCATGAGGGTAATAAAATA1. AATTCTAGAAACCATGAGGGTAATAAAATA
2. CCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG2. CCATTATTTTATTACCCTCATGGTTTCTAG
3. ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC ii. CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG3. ATGGCTCCGCCGCGTCTGATCTGCGAC ii. CTCGAGTCGCAGATCAGACGCGGCGGAG
5. TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG5. TCGAGAGTTCTGGAACGTTACCTGCTG
6. ClICCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT6. ClICCAGCAGGTAACGTTCCAGAACT
7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC
8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG
9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC9. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC
10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA10. CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA
11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG
12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT12. GATCCGGTACCGTAATGTTTTCGTT
LENTELĖTABLE
ECEPO 1 dalisPart 1 of ECEPO
Xba IXba I
EcoRI - 1 t 3 aattciag aaacsatgag ggtaataaaa taĮįtggctcc GČCGCGTCTGEcoRI - 1 t 3 aattciag aaacsatgag ggtaataaaa taćtggctcc GČCGCGTCTG
GATC TTTGGTACTC CCATTAT1TT ATTAČSgaGG CGGCGCAGAC 2 4GATC TTTGGTACTC CCATTAT1TT RETURNGG CGGCGCAGAC 2 4
ATClGCGAck CGAGAGTTCT TAGACGCTGA GCTCfrCAAGAATClGCGAck CGAGAGTTCT TAGACGCTGA GCTCfrCAAGA
TGAAAACATCTGAAAACATC
ACTTTTGTAGACTTTTGTAG
S tS t
CCACTGGTtCCACTGGTt
GGTG[ĮCCAAGGTG [INCCAA
GGAACGTTACGGAACGTTAC
CCTTGCAATGCCTTGCAATG
G1GCTGAACAG1GCTGAACA
CACGACTTGTCACGACTTGT
CTGCTgĮgAĄGCTGCTgGuage
GACGACCTTČj ctgttcĮtttgGACGACCTTČj ctgttcĮtttg
GACAAGAAAČ]GACAAGAAAČ]
CTAAAGAAGCCTAAAGAAGC
GATTTCTTCGGATTTCTTCG
IĮIEA
AACGAAAACAAACGAAAACA
TTGCTTTTGTTTGCTTTTGT
KpnI BamHI TTACGGTACC G AATGCCATGG CCTAGKpnI BamHI TTACGGTACC G AATGCCATGG CCTAG
LENTELĖ dalies ECEPO oligonukleotidaiTABLE TABLE ECEPO oligonucleotides
1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT
2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG
3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT
4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA4. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA
5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT
6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC6. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC
7. TTGGCAGGGTCIGGCACTGCTGAGCG7. TTGGCAGGGTCIGGCACTGCTGAGCG
8. GCCTCGCTCAGCAGIGCCAGACCCTG8. GCCTCGCTCAGCAGIGCCAGACCCTG
9. AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGC’A9. AGGCTGTACTGCGTGGCCAGGC'A
10. GCAGTGCCTGGCCACGCAGTACft10. GCAGTGCCTGGCCACGCAGTACft
11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT11. CTGCTGGTAAACTCCTCTCAGCCGT
12. TTCCCACGGCT-GAGAGGAGTTTACCA12. TTCCCACGGCT-GAGAGGAGTTTACCA
13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTtGAC13. GGGAACCGCTGCAGCTGCATGTtGAC
14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG14. GCTTTGTCAACATGCAGCTGCAGCGG
15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG15. AAAGCAGTATCTGGCCTGAGATCTG
16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT w16. GATCCAGATCTCAGGCCAGATACT w
PP
E-l &Email &
HH
P rHP rH
PP
OO
Ph (3Ph (3
OO
H ra ra •HH ra ra • H
PP
S) •OS) • O
OJOJ
et H-et H-
uu
CJCJ
CJ uCJ u
CJ να:CJ να:
oo
CJCJ
CJCJ
C cų t—· μα: >old oC c t - · μα:> old o
UI dUI d
LENTELĖTABLE
ECEEO 3 daliaECEEO 3 divides
1. GATCCAGATCTCTGACTACTCTGC1. GATCCAGATCTCTGACTACTCTGC
2. ACGCAGCAGAGTAGTCAGAGATCTG2. ACGCAGCAGAGTAGTCAGAGATCTG
5. TGCGTGC.TCTGGGTGCACAGAAAGAGG ii. GATAGCCTCTTTCTGTGCACCCAGAGC5. TGCGTGC.TCTGGGTGCACAGAAAGAGG ii. GATAGCCTCTTTCTGTGCACCCAGAGC
5. CTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCT5. CTATCTCTCCGCCGGATGCTGCATCT
6. CAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGA6. CAGCAGATGCAGCATCCGGCGGAGA
7. GCTGCACCGCTGCG.TACCATCACT.G7. GCTGCACCGCTGCG.TACCATCACT.G
8. ATCAGCAGTGATGGTACGCAGCGGTG8. ATCAGCAGTGATGGTACGCAGCGGTG
9. CTGATACCTTCCGCAAACTGTTTCG9. CTGATACCTTCCGCAAACTGTTTCG
10. ATACACGAAACAGTTTGCGGAAGGT10. ATACACGAAACAGTTTGCGGAAGGT
11. TGTATACTCTAACHCCTGCGTGGTA11. TGTATACTCTAACHCCTGCGTGGTA
12. CAGTTTACCACG.C.AGGAAGTTAGAGT12. CAGTTTACCACG.C.AGGAAGTTAGAGT
13. AACTGAAACTGTATACTGGCGAAGC13. AACTGAAACTGTATACTGGCGAAGC
1Δ. GGCATGCTTCGCCAGTATACAGTTT1Δ. GGCATGCTTCGCCAGTATACAGTTT
15. ATGCCGTACTGGTGACCGCTAATAG15. ATGCCGTACTGGTGACCGCTAATAG
16. TCGACTATTAGCGGTCACCAGTAC16. TCGACTATTAGCGGTCACCAGTAC
LENTELĖTABLE
EOETO 3 daliaEOETO 3 divides
BaniH I B g 111BaniH I B g 111
GA TCCAGATCTCTG GTCTAGAGACGA TCCAGATCTCTG GTCTAGAGAC
LENTELĖTABLE
ECEPO GenasECEPO Gene
Xba I CTAGXba I CTAG
AAACCA7GAGAAACCA7GAG
TTTGGTACTCTTTGGTACTC
GGTAATAAAAGGTAATAAAA
CCATTATTTTCCATTATTTT
-1 1 MetAla-1 1 MetAla
TAATGGCTCCTAATGGCTCC
ATTACCGAGGATTACCGAGG
GCCGCGTCTGGCCGCGTCTG
CGGCGCAGACCGGCGCAGAC
ATCTGCGACT CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC TAGACGCTGA GCTCTCAAGA CCTTGCAATG GACGACCTTC GATTTCTTCGATCTGCGACT CGAGAGTTCT GGAACGTTAC CTGCTGGAAG CTAAAGAAGC TAGACGCTGA GCTCTCAAGA CCTTGCAATG GACGACCTTC GATTTCTTCG
TGAAAACA7Č ACCACTGGTT GTGCTGAACA CTGITCTTTG AACGAAAACA ACITTTGTAG TGGTGACCAA CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT jr. 7TACGGTACC AGACACOAAG GTTAACTTCT ACCCTTGGAA ACGTATGGAA AAIGCCATGG TCTGTGdTTC CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTTTGAAAACA7Č ACCACTGGTT GTGCTGAACA CTGITCTTTG AACGAAAACA ACITTTGTAG TGGTGACCAA CACGACTTGT GACAAGAAAC TTGCTTTTGT jr. 7TACGGTACC AGACACOAAG GTTAACTTCT ACCCTTGGAA ACGTATGGAA AAIGCCATGG TCTGTGdTTC CAATTGAAGA TGCGAACCTT TGCATACCTT
GTTGGICAAC aagcagi)tga agtttggcag ggtctggcac tgctgagcga CAACCAGTTG TTCGTCA'ACT TCAAACCGTC CCAGACCGTG ACGACTCGCT ggctgtactg CGTGGCCAGG cactggtggt aaactcctct cagccgtggg CCGACATGAC GCACCGGTCC GTGACGACCA TTTGAGGAGA GTCGGCACCCGTTGGICAAC aagcagi) tga agtttggcag ggtctggcac tgctgagcga CAACCAGTTG TTCGTCA'ACT TCAAACCGTC CCAGACCGTG ACGACTCGCT ggctgtactg CGTGGCCAGG cactggtggt aaactcctct cagcCGGGGGGGGGGAC
AACCGCTGCA GCTGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTCTG TIGGCGACGT CGACGTACAA CTGTTTCGTC ATAGACCGGA CTCTAGAGACAACCGCTGCA GCTGCATGTT GACAAAGCAG TATCTGGCCT GAGATCTCTG TIGGCGACGT CGACGTACAA CTGTTTCGTC ATAGACCGGA CTCTAGAGAC
ACTACTC1GC TGCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC TGATGAGACG ACGCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AGAGAGGCC-GACTACTC1GC TGCGTGCTCT GGGTGCACAG AAAGAGGCTA TCTCTCCGCC TGATGAGACG ACGCACGAGA CCCACGTGTC TTTCTCCGAT AGAGAGGCC-G
GGATGCTGCA TCTGCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCT GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGACGTG GCGACGCAIG GTAGTGACGA CTATGGAAGGGGATGCTGCA TCTGCTGCAC CGCTGCGTAC CATCACTGCT GATACCTTCC CCTACGACGT AGACGACGTG GCGACGCAIG GTAGTGACGA CTATGGAAGG
GCAA'ACTGTT TCGTGTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAA ACTGAAACTG CG777GACAA AGCACATA7G AGAT7GAAGG ACGCACCATT 7GAC777GACGCAA'ACTGTT TCGTGTATAC TCTAACTTCC TGCGTGGTAA ACTGAAACTG CG777GACAA AGCACATA7G AGAT7GAAGG ACGCACCATT 7GAC777GAC
SalįHall
7A7AC7GGCG7A7AC7GGCG
A7A7GACCGCA7A7GACCGC
AAGCATGCCGAAGCATGCCG
TTCGTACGG'CTTCGTACGG'C
TAC7GG7GACTAC7GG7GAC
ATGACCAC7GATGACCAC7G
CGC.TAATAG GCGATTATCA GC7CGC.TAATAG GCGATTATCA GC7
Tiksliau 8 lentelė iliustruoja oligonukleotidų panaudojimą ECEPO geno galinės liekanos I-mos dalies, koduojančios galines žmogaus polipeptido liekanas, generavimui. Oligonukleotidai ; sujungiami po du (1 ir 2, 3 ir 4 ir t.t.), kuriuos vėliau susiuva tam, kad gautų I ECEPO dalį, kaip 9 lentelėje. Reikia pažymėti, kad surinkta dalis turi EcoRI ir BamHI lipnieji galūnių galai, be to pagal lipnaus galo EcoRI srovę nukreipta ribojančio fermento Xbal atpažinimo sritis, o prieš lipnaus galo BamlI srovę nukreipta KpnI atpažinimo sritis.Specifically, Table 8 illustrates the use of oligonucleotides to generate the I-terminal portion of the ECEPO gene's terminal residue, which encodes the terminal human polypeptide residue. Oligonucleotides; two (1 and 2, 3 and 4 and so on) are joined together and then stitched together to form part I of ECEPO as in Table 9. It should be noted that the assembled portion has EcoRI and BamHI adhesive limb ends, furthermore, the EcoRI current of the adhesive end is directed by the restriction enzyme XbaI recognition region, and the KpnI recognition site is directed against the BamHI site of the adhesive end.
dalį galima lengvai amplikuoti, naudojant fago MI3 fagą, naudojamą dalies eiliškumui patikrinti. Kai kurių sunkumų netikėtai kyla išskiriant dalį fragmento XbaIKpnI iš DNRPF, generuojamo E.Coli. tikriausiai, dėl atpažinimo srities KpnI bazių metilinimo šeimininko zonoje. Todėl DNR fagą izoliuoja ir atgamina dvispiralinėje formoje in vitro pradmens prailginimo būdu ir po to izoliuoja reikiamą dvispiralinį fragmentą.the portion can be easily amplified using the phage MI3 phage used to verify the order of the portion. Some difficulties unexpectedly arise in extracting a portion of the XbaIKpnI fragment from DNAPF generated by E. coli. probably due to the recognition region of methylation of KpnI bases in the host zone. Therefore, the DNA phage is isolated and reproduced in bipedal form by in vitro primer extension and subsequently isolated to the required bipartite fragment.
ir 3-čia ECEPO geno dalys (9 ir 13 lentelės) sukuriamos tokiu pat būdu iš oligonukleotidų atitinkamai 10 ir 12 lentelėse. Kiekvieną dalį amplifikuoja MI3 vektoriuje, kuris naudojamas sekos patikrinimui ir išskiria iš DNR fago. Kaip aišku iš 11 lentelės, 2-ra ECEPO dalis sudaroma su lipniais galais BamlII ir Salį ir gali būti išskirta iš DNR PF kaip BglII/Sall fragmentas. Tokiu būdu gautas tris dalis galima lengvai surinkti į DNR pirminę seką (14 lentelė), koduojančią pilną žmogaus EPO polipeptidą su metionino galūnės kodonu (ATG) inicijuoti transliacinei E.Coli pradžiai. Reikia pažymėti, kad prieš pirminės ATG srovę nukreipta eilė azoto bazių, pakankamai duplikuojančių fragmento seką surišančios ribosomos stipriai išreikšto OMP-f geno E.Coli.and 3 portions of the ECEPO gene (Tables 9 and 13) are generated in the same manner from oligonucleotides in Tables 10 and 12, respectively. Each part is amplified in the MI3 vector which is used for sequence screening and isolated from the DNA phage. As can be seen from Table 11, the second portion of ECEPO is composed of the BamII and SalI sticky ends and can be isolated from the DNA PF as a BglII / SalI fragment. The three moieties thus obtained can be readily assembled into a DNA primary sequence (Table 14) encoding a complete human EPO polypeptide with a methionine terminal codon (ATG) to initiate the translational start of E. coli. It should be noted that there is a series of nitrogen bases upstream of the primary ATG current, sufficiently duplicating the E. coli of the OMP-f gene, strongly expressed by the fragment sequence-binding ribosome.
ECEPO pernešimui galima panaudoti bet kokį tinkamą ekspresijos vektorių. Specifinis vektorius ECEPO geno ekspresijai kaip jautri temperatūrai plazmidė pCFM536 yra plazmidės pCFM414 [A.T.C.C. 40076] - kaip aprašyta tuo pačiu laiku peržiūrimoje paraiškoje JAV patentui 636727, pateiktoje 1984m. rugpjūčio 6d.Any suitable expression vector can be used for ECEPO transfer. A specific vector for ECEPO gene expression as a temperature sensitive plasmid pCFM536 is the plasmid pCFM414 [A.T.C.C. 40076], as described in co-pending U.S. Patent Application No. 636727, filed April 4, 1984. August 6
Konkrečiau - pCFM536 skaido su Xbal ir HindlII; didelį fragmentą izoliuoja ir naudoja dvipusiam susiuvimui su genu ECEPO. Dalis I/XbAI/KpnI/, 2/KpnI/Bgl/ ir 3/BglII/Salį/ preliminariai surenka teisinga tvarka į MI3 ir EPO geną išskiria iš ten kaip atskirą fragmentą XbaI/HindIII. Į šį fragmentą įjungia dalį polisurišančios grandies iš MI3 Mp9•fago, sutraukiančio jame fragmentus Salį ir Hindlll.More specifically, pCFM536 cleaves with Xbal and HindIII; large fragment is isolated and used for double-sided stitching with the ECEPO gene. Part I / XbAI / KpnI /, 2 / KpnI / Bgl / and 3 / BglII / Salle / are pre-assembled into the MI3 and EPO gene in the correct order from there as a separate fragment XbaI / HindIII. This fragment incorporates a portion of the polysynthetic linkage from the MI3 Mp9 • phage, which constructs SalI and Hindlll fragments therein.
Ekspresijos kontrolė gautoje ekspresijos plazmidėje, p536, vykdo pagalba promotoriaus liambda PL, kuris pats gali kontroliuotis represeriniu genu C-į857 (tokiu, kaip tas, kuris gautas KI2 Htrp grandinės E.Coli).Expression control in the resulting expression plasmid, p536, is effected by the promoter lobe P L , which can itself control the repressor gene C- 857 (such as that produced by the KI2 Htrp chain E. coli).
Pagamintas ECEPO genas gali būti modifikuotas įvairiais metodais eritropoetino analogų, tokių, kaip aukščiau aprašyti, [ASn 2,des-Pro2 pagal ILe6]hEP0 ir [His7]hEP0 kodavimui.The produced ECEPO gene can be modified by various methods for encoding erythropoietin analogs such as [AS n 2 , des-Pro 2 according to ILe 6 ] hEP0 and [His 7 ] hEP0 as described above.
A. [ASn 2,des-Pro2 pagal ILe6]hEP0A. [AS n 2 , des-Pro 2 by ILe 6 ] hEP0
Plazmidė 536, nešanti pagamintą ECEPO geną, lentelė XIV, kaip intarpą Xbal į Hindlll skaido su Hindlll ir Xhol. Pastarojo endonukleazė perpjauna ECEPO geną universaliame atpažinimo fragmente, turinčiame 6 poras azoto bazių, v 3 sutraukdama paskutinę kodono bazę, koduojančią Asp , su antraPlasmid 536 carrying the produced ECEPO gene, Table XIV, cleaves with Hindlll and Xhol as an insert of Xbal into Hindlll. The latter endonuclease cuts the ECEPO gene in a universal recognition fragment containing 6 pairs of nitrogen bases, v 3 collapsing the last codon base encoding Asp with a second
Surišančią grandį Xbal/Xhol ir geno ECEPO fragmentą Xhol/HindIII įstato į didelį fragmentą, gautą skaidant Xbal ir Hindlll plazmidės pCFM526 - plazmidės pCFM414 (A.T.C.C. 40076) darinio - kaip aprašyta tuo pačiu metu peržiūrimoje paraiškoje JAV patentui Nr.636727, pateiktai 1984m. rugpjūčio 6d. Charles P.Morris, generavimui plazmidės, nešančios DNR seką, koduojančią E.Coli ekspresiją, Met'1 norimo analogo formos.The Xbal / Xhol binding site and the Xhol / HindIII fragment of the ECEPO gene are inserted into a large fragment resulting from the cleavage of Xbal and HindIII plasmid pCFM526, a derivative of plasmid pCFM414 (ATCC 40076), as described in co-pending U.S. Patent No. 636727. August 6 Charles P. Mororr, for the generation of a plasmid carrying the DNA sequence encoding E. coli expression in the form of the desired analog of Met ' 1 .
B. [His7]hEP0B. [His 7 ] hEP0
Plazmidę 536 skaido su Hindlll ir Xbal, kaip A dalyje. Surišant! grandis Xbal/Xhal pagaminta tokia seka:Plasmid 536 is cleaved with Hindlll and Xbal as in Part A. Tying! chain Xbal / Xhal is made in the following sequence:
po to įterpia į pCFM plazmidę nešančios DNR generacijai, koduojančiai ekspresiją E.Coli formos Met'1 pageidaujamo analogo ,then inserted into the pCFM plasmid for generation of the DNA encoding expression of the desired analog of Met ' 1 form E. coli,
Ekspresija geno ·· (SCEPO), turinčio savyje mielių dominantinius kodonus, vyksta, kaip aprašyta lentelėse XV-XXI. Taip pat kaip ir geno ECEPO atveju, pilna struktūra turi trijų rinkinių oligonukleotidų darinių (lentelės 15, 17 ir 19), kurie sudaro dupleksus ir susirinko į sekcijas (lentelės 16, 18 ir 20). Reikia pažymėti, kad sintezė iš dalies palengvinama, panaudojant kai kuriuos suboptimalius kodonus abejose EPO ir ECEPO struktūrose, t.y. oligonukleotidai 7-12 I sekcijos abiems genams buvo identiškos, taip pat, kaip buvo identiški 1-6 2 sekcijos oligonukleotidai kiekviename gene.Expression of the gene ·· (SCEPO) containing yeast dominant codons occurs as described in Tables XV-XXI. As with the ECEPO gene, the complete structure contains three sets of oligonucleotide derivatives (Tables 15, 17, and 19) that form duplexes and assemble into sections (Tables 16, 18, and 20). It should be noted that the synthesis is partially facilitated by the use of some suboptimal codons in both EPO and ECEPO structures, i. oligonucleotides 7-12 of Section I were identical for both genes, just as oligonucleotides 1-6 of Section 2 in each gene were identical.
6?6?
LENTELĖ dalies SCEPO oligonukleotidaiTABLE TABLE SCEPO oligonucleotides
1. AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT1. AATTCAAGCTTGGATAAAAGAGCT
2. GIGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG2. GIGGAGCTCTTTTATCCAAGCTTG
3. CCACCAAGAT.TGATCTGTGACTC3. CCACCAAGAT.TGATCTGTGACTC
A. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTGA. TCTCGAGTCACAGATCAATCTTG
5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTIG5. GAGAGTTTTGGAAAGATACTTGTIG
6. CITCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC6. CITCCAACAAGTATCTTTCCAAAAC
7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC7. GAAGCTAAAGAAGCTGAAAACATC
8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG8. GTGGTGATGTTTTCAGCTTCTTTAG
°. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC°. ACCACTGGTTGTGCTGAACACTGTTC
10. ' CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA10. 'CAAAGAACAGTGTTCAGCACAACCA
11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG11. TTTGAACGAAAACATTACGGTACCG
12. GATCCGGTACC.GTAATGTTTTCGTT12. GATCCGGTACC.GTAATGTTTTCGTT
LENTELĖTABLE
SCEPO' 1· dalisSCEPO '1 · Part
EcoRl HindlII Į AATTCA AGCTTGGATAEcoRl HindlII TO AATTCA AGCTTGGATA
GT TCGAACCTAT 2GT TCGAACCTAT 2
AAAGAGCTbc ACCAAGATTG ATCTGTGACT cbAGAGTTTT TTTCTCGAGG TGjGTTCTAAC TAGACACTGA GCTČljCAAAAAAAGAGCTbc ACCAAGATTG ATCTGTGACT cbAGAGTTTT TTTCTCGAGG TGjGTTCTAAC TAGACACTGA GCTČljCAAAA
GGAAAGATACGGAAAGATAC
CCTTTCTATGCCTTTCTATG
GTGCTGAACA CACGACTT G T ttgt.tgĮsaag aa'caacctTc] ctgttcĮtttgGTGCTGAACA CACGACTT G T ttgt.tgĮsaag aa'caacctTc] ctgttcĮtttg
GACAAGAAACjGACAAGAAACj
CTAAAGAAGCCTAAAGAAGC
GATTTGTTCGGATTTGTTCG
ĮLON
AACGAAAACA UGCTT T T GTAACGAAAACA UGCTT T T GT
TGAAAACATCTGAAAACATC
ACTTTTGTAGACTTTTGTAG
KpnIKpnI
TTACGGTACCTTACGGTACC
AATGCCATGG hCCACTGGTTAATGCCATGG hCCACTGGTT
TGGTGįACCAATGGTGąACCAA
BamHIBamHI
GG
CCT AGCCT AG
6č6ch
LENTELĖ dalies SCEPO oligonukleotidaiTABLE TABLE SCEPO oligonucleotides
1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT1. AATTCGGTACCAGACACCAAGGT
2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG2. GTTAACCTTGGTGTCTGGTACCG
3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT3. TAACTTCTACGCTTGGAAACGTAT
а. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAAа. TTCCATACGTTTCCAAGCGTAGAA
5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT5. GGAAGTTGGTCAACAAGCAGTTGAAGT
б. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAACб. CCAAACTTCAACTGCTTGTTGACCAAC
7. TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCTG '8. GCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG7. TTGGCAAGGTTTGGCCTTGTTATCTG '8. GCTTCAGATAACAAGGCCAAACCTTG
9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT9. AAGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCCT
10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA10. AACAAGGCTTGACCTCTCAAAACA
11. TGTTGGTTAACTCTT-CTCAACCATGGG11. TGTTGGTTAACTCTT-CTCAACCATGGG
12. TGGTTCCCATGGT.TGAGAAGAGTTAACC12. TGGTTCCCATGGT.TGAGAAGAGTTAACC
13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT13. AACCATTGCAATTGCACGTCGAT
1ύ. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA1ύ. CTTTATCGACGTGCAATTGCAA
15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG15. AAAGCCGTCTCTGGTTTGAGATCTG
16. ga· CCAGATCTCAAACCAGAGACGG16. ga · CCAGATCTCAAACCAGAGACGG
LENTELĖTABLE
SCELO 2 dalisPart 2 of the SCELO
KpnIKpnI
EcoRI 1 TT^TTCGGTKCCEcoRI 1 TT ^ TTCGGTKCC
GCCATGGGCCATGG
AGACACCAAGAGACACCAAG
TCTGTGGTTC gt|taacttct caaūg^aga agt{ttggcaaTCTGTGGTTC gt | taacttct caaūg ^ aga agt {ttggcaa
TCAAAČČjjTTTCAAAČČjjTT
CC tĮt GT T GGT ggaačaaĮgcaCC TTI GT T GGT ggaačaaGAgca
GATHAAGCCGGATHAAGCCG
CTAirTČpGCCTAirTČpGC
ACGCTTGGAAACGCTTGGAA
TGCGAACCTTTGCGAACCTT
4_4_
GGTTTGGCCTGGTTTGGCCT
CCAAACCGGACCAAACCGGA
ĮĮSO
TAACTCTTCTTAACTCTTCT
ATTGAGAAGA acgtatLgaa tgcatacčTtt]ATTGAGAAGA acgtatLgaa tgcatacčTtt]
GTTGGTCAACGTTGGTCAAC
CAACCAGTTG aagctgttgaCAACCAGTTG aagctgttga
TTCGACAACTTTCGACAACT
TGTTATCTGh ACAATAGACTTGTTATCTGh ACAATAGACT
CAACCATGGGCAACCATGGG
GTTGGTAČCCGTTGGTAČCC
AGCTGTTTTGAGCTGTTTTG
TčŠĮacaaaacTčŠĮacaaaac
Į {aaccattgca uggiĮaacgt . BglII BamHITo {aaccattgca uggiĮaacgt. BglII BamHI
TCTCTGGTTT GAGATCTG AGAGACCAAA CTCTAGACCTA GTCTCTGGTTT GAGATCTG AGAGACCAAA CTCTAGACCTA G
............
agaggtcaagagaggtcaag
TCTCCAGTTCTCTCCAGTTC
ATTGCACGTCATTGCACGTC
TAACGTGCAGTAACGTGCAG
LENTELĖ dalies SCEPO oligonukleotidaiTABLE TABLE SCEPO oligonucleotides
1. GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT1. GATCCAGATCTTTGACTACTTTGTT
2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG2. TCTCAACAAAGTAGTCAAAGATCTG
3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG3. GAGAGCTTTGGGTGCTCAAAAGGAAG
4. ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC4. ATGGCTTCCTTTTGAGCACCCAAAGC
5. CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT5. CCATTTCCCCACCAGACGCTGCTT
6. GCAGAAGCAGCGTCTGGTGGGGAA6. GCAGAAGCAGCGTCTGGTGGGGAA
7. CTGCCGCTCCATTGAGAACCATC7. CTGCCGCTCCATTGAGAACCATC
6. CAGTGATGGTTCTCAATGGAGCG6. CAGTGATGGTTCTCAATGGAGCG
9. ACTGCTGATACCTTCAGAAAGTT9. ACTGCTGATACCTTCAGAAAGTT
10. GAATAACTTTCTGAAGGTATCAG10. GAATAACTTTCTGAAGGTATCAG
11. ATTCAGAGTTTACTCCAACTTCT11. ATTCAGAGTTTACTCCAACTTCT
12. CTCAAGAAGTTGGA'GTAAACTCT12. CTCAAGAAGTTGGA'GTAAACTCT
13. TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC13. TGAGAGGTAAATTGAAGTTGTACAC
14. ACCGGTGTACAACTTCAATTTACCT14. ACCGGTGTACAACTTCAATTTACCT
15. CGGTGAAGCCTGTAGAACTGGT15. CGGTGAAGCCTGTAGAACTGGT
16. CTGTCACCAGTTCTACAGGCTTC16. CTGTCACCAGTTCTACAGGCTTC
17. GACAGATAAGCCCGACTGATAA17. GACAGATAAGCCCGACTGATAA
18. GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT18. GTTGTTATCAGTCGGGCTTAT
19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG19. CAACAGTGTAGATGTAACAAAG
- 20. TCGACTTTGTTACATCTACACT- 20. TCGACTTTGTTACATCTACACT
LENTELĖTABLE
SCEPO 3 dalisPart 3 of SCEPO
ΒβιτιΗΪ BglII 1ΒβιτιΗΪ BglII 1
GATC'CAGATCTTTG ACTACTTTGT GTCTAGAAAC TGATGAAACAGATC'CAGATCTTTG ACTACTTTGT GTCTAGAAAC TGATGAAACA
TCAGAGCTTTTCAGAGCTTT
AGTČT^GAAAAGTČT ^ GAAA
GGGTGCTCAAGGGTGCTCAA
CCCACGAGTTCCCACGAGTT
CATIGAGAACCATIGAGAAC
GTAACTCTTGGTAACTCTTG
AAGGAAGtCA TTTCCCCACC TTCCTTCGG1 PįlAGGGGTGG catcĮactgctAAGGAAGtCA TTTCCCCACC TTCCTTCGG1 PAGAGGGGTGG catcActgct
GTAGTGAČfSAGTAGTGAČfSA
GATACCTTCAGATACCTTCA
CTATGGAAGTCTATGGAAGT
AGACGCTGCTAGACGCTGCT
TCTGCGACGATCTGCGACGA
GAAAGTThTTGAAAGTThTT
CTTTCAAlAACTTTCAAlAA
TCTGCCGCTCTCTGCCGCTC
AČAČGGCGAGACHACGGCGAG
TGCAACTTCTTGCAACTTCT
AGGTTGAAGA [tgagaggtaa attgaagttgAGGTTGAAGA [tgagaggtaa attgaagttg
AČTČjTCCATT TAACTICAAC 1 14 tacacĮgggtg atgtggččaĮ:THANK YOUCCATT TAACTICAAC 1 14
nn
CAGAGTTTACCAGAGTTTAC
ČJrCTCAAATGČJrCTCAAATG
12.12th
AAGCCTGTAGAAGCCTGTAG
TTCGGACATCTTCGGACATC
AACTGGTbACAACTGGTbAC
TIGACCACTGTIGACCACTG
AGAIAAGCCCAGAIAAGCCC
TŪTATTCGGG gactgataaĮ:TŪTATTCGGG gactgataaA:
CTGACTATTG aacagtgtagCTGACTATTG aacagtgtag
Tt^tcacatcTt ^ tcacatc
SalįHall
ATGTAACAAA G TACATTC-TTT CAGCTATGTAACAAA G TACATTC-TTT CAGCT
LENTELĖTABLE
SČEPO genasThe SCHEP gene
-1 +1-1 +1
Surinktos sekcijos SCEPO eina į MI3 ir 1, 2 ir 3 sekcijos išsiskiria iš fago HindlII/Kpnl/BglII ir BglII/Sall.The assembled sections of SCEPO go to MI3 and sections 1, 2 and 3 are secreted from the phage HindlII / Kpnl / BglII and BglII / Sall.
Pirmenybine dabar ekspresijos sistema geno SCEPO produktams yra ekspresijos sistema S.Cerevisial ^-faktoriaus pagrindu, kaip aprašyta tuo pat metu esančioje peržiūroje paraiškoje JAV patentui Nr.487753, pristatytoje 1983m. balandžio 22d. Crant A.Bitter, atspausdintoje 1984m. spalio 31d. kaip paraiška Europos patentui 0123294. Trumpiau tariant, sistema turi savyje konstrukciją, kur DNR, koduojanti mielių -faktoriaus geno vedančiąja seką, išsidėsto iš karto 5' išreiškiamo ekzogeninio geno koduojančios srities atžvilgiu. To pasėkoje transliuojamas genų produktas turi vedančią arba signalinę seką, kuri apdorojama mielių endogeniniu fragmentu likusios produkto dalies sekrecijos kryptimi. Kadangi konstrukcija duoda galimybę panaudoti kodoną inicijuojantį άfaktoriaus (ATG) transliaciją, nereikėjo sukurti tokį kodoną SCEPO geno padėtyje -1. Kaip galima padaryti išvadą iš lentelės 21, alaninas (+1), koduojantis seką, stovi po surišančios grandies sekos, kas leidžia atlikti betarpišką intarpą į plazmidę, turinčią DNR pirmiems 80-čiai likučių <kfaktoriaus pradinės sekos, sekančios po ^-faktoriaus promotoriaus. Specifinė dominuojanti struktūra ČEPO geno ekspresijai turi keturpusį susiuvimą, įskaitant aukščiau nurodytą sekcijos ČEPO fragmentą ir didelį skaidymo fragmentą HindlII/SalI plazmides p 03. Iš gaunamos plazmidinės p C3/SCEP0 išskiria <i-faktoriaus promotorinę ir lyderinę sekas, o taip pat SCEPO geną, kaitinant su BamlII ir susiuva skaidymo būdu gautą plazmidinę pYE BamHI, susidarant plazmidinei pYE/SCEPO ekspresijai.The preferred now expression system for the SCEPO gene products is an expression system based on the S.Cerevisial factor as described in the simultaneous review of U.S. Patent No. 4,877,753, issued June 1983. April 22 Crant A.Bitter, printed in 1984. October 31 In short, the system comprises a construct in which the DNA encoding the yeast-factor gene leader sequence is located immediately downstream of the coding region of the exogenous gene expressed 5 '. As a result, the transduced gene product has a leader or signal sequence that is processed by an endogenous yeast fragment in the direction of secretion of the remainder of the product. Because the construct allows for codon-initiating ά-factor (ATG) translation, it was not necessary to construct such a codon at position -1 of the SCEPO gene. As can be deduced from Table 21, alanine (+1) encoding the sequence is located after the binding sequence, which allows for an immediate insertion into a plasmid containing DNA for the first 80 residues of the <RTIgt; cfactor </RTI> promoter sequence. The specific dominant structure for expression of the CEPO gene has a four-way assembly, including the above CEPO fragment and the large fragment fragment HindIII / SalI plasmid p 03. The resulting plasmid p C3 / SCEP0 delivers the promoter and leader sequences of the <i-factor as well as the SCEPO gene. heating with BamllII and stitching together the plasmid pYE BamHI resulting in the plasmid expression of pYE / SCEPO.
PAVYZDYSEXAMPLE
Šis pavyzdys priklauso ekspresijai rekombinantiniu produktų, pagamintų ECEPO ir SCEPO - genų, 11 pavyzdžio ekspresijos sistemos ribose.This sample is subject to expression within the recombinant expression system of the products produced by the ECEPO and SCEPO - genes, Example 11.
Naudojant ekspresijos sistemą, apskaičiuoja panaudojimui šeimininko E.Coli ląstelėse. 11 pavyzdžio plazmą p536 transformuoj a ląstelėse E.Coli AM7, anksčiau transformuotas su tinkama plazmidė pMWI, priėmusią į save geną C1g57. Ląstelių kultūras buljone (50 mkg/ml ampicilino, 5 mkg/ml kanamicino, geriau su 10 mM MgSO4) laiko 28 °C temperatūroj e ir ląstelių augimo periode kultūroje iki O.D6oo = 0,1, EPO ekspresiją indukuoja, pakeliant temperatūrą iki 42 °C. Ląstelės auga apytikriai iki 40 O.D., sudarydamos sąlygas EPO gavimui (įvertinta geliu) apie 5 mg/OD 1.Calculates for use in host E. coli cells using an expression system. Example 11 was transformed with p536 in E. coli AM7 previously transformed with the appropriate plasmid pMWI, which had taken up the gene C 1g57 . Cell cultures in broth (50 mcg / ml ampicillin, 5 mcg / ml kanamycin, preferably with 10 mM MgSO 4 ) were maintained at 28 ° C and during the cell growth period in culture to OD 6 0 = 0.1, inducing EPO expression by raising the temperature to 42 ° C. Cells grow to about 40 ODs, allowing EPO production (gelled) of about 5 mg / OD 1.
Ląsteles surenka, lizuoja, susmulkina prancūzišku presu (10000 psi) ir apdoroja lizicinu ir detergentu NP-40. Centrifuguojant (24000g) gautas nuosėdas ištirpina guanidino Hcl ir toliau vykdo vienkartinį valymą su C4 (Vydac) atvirkščių fazių HPLC (EtOH, 0-80 %, 50 mM NH4Ac, pH 4,5). Baltymų bazių sekos nustatymas parodo, kad produktas švaresnis nei 95 %, o gauti produktai turi du skirtingus NH2-galus, A-P-P-R..... ir PP-R...., esant kiekybiniam santykiui 3:1. Šis pastarasis hEPO ir [de-ala]hEPO produktų stebėjimas reiškia, kad amino galų “apdorojimas” šeimininko ląstelėse tarnauja pašalinimui galinio metionino, o kai kuriais atvejais, pradinio alanino. Radioimuniniais tyrimais nustatytas izoliatų aktyvumas yra 150000-160000 V/mg lygyje; in vitro nustatytas aktyvumas yra 30000-62000 V/mg; ir in vitro nustatytas aktyvumas kinta 120-720 V/mg ribose (sulyginta su žmogaus šlapimo izoliato standartu, lygiu 70000 V/mg kiekvienam bandymui). Kreivė dozė-efektas rekombinantiniam produktui, atliekant bandymą in vitro, žymiai skiriasi nuo žmogaus šlapimo EPO standarto kreivės.Cells are harvested, lysed, pulverized with a French press (10,000 psi) and treated with lysine and detergent NP-40. By centrifugation (24000g), the resulting precipitate was dissolved in guanidine HCl and continue execution of the one-time cleaning C4 (Vydac) reverse phase HPLC (EtOH 0-80% 50 mM NH 4 Ac, pH 4.5). Protein base sequencing shows that the product is more than 95% pure and the products obtained have two different NH 2 ends, APPR ..... and PP-R .... at a 3: 1 quantitative ratio. This recent observation of hEPO and [de-ala] hEPO products implies that the "treatment" of the amino terminus in host cells serves to remove terminal methionine, and in some cases, parent alanine. The activity of isolates determined by radioimmunoassay is in the range 150000-160000 U / mg; in vitro activity determined to be 30,000-62,000 U / mg; and in vitro activity ranged from 120-720 U / mg (compared to human urine isolate standard of 70,000 U / mg for each assay). The dose-effect curve for the recombinant product in the in vitro assay is significantly different from the human urine EPO standard curve.
EPO-analogo plazmidės, padarytos 11 pavyzdžio A ir B dalyse, kiekviena transformuojama į pMWI-transformuotos ląstelės E.coli AM7 ir ląstelės kultivuojamos, kaip aprašyta aukščiau. Išvalytus izoliatus tiria kaip RIA, taip ir in vitro. Reikšmės, gautos tiriant RIA ir in vitro [Asn2, de-Pro pagal Ile6]hEP0 produktų ekspresijai sudaro atitinkamai apytikriai 11000 V/mg ir 6000 V/mg baltymo, tuo tarpu [His7]hEP0 analizės reikšmės sudaro 41000 V/mg baltymo. Tai reiškia, kad analogų produktai yra “aktyvūs” 1/4 - 1/10 taip pat kaip “gimdytojo” ekspresijos produktų tyrimuose.The EPO-analog plasmids made in Example 11, Parts A and B, were each transformed into pMWI-transformed E.coli AM7 cells and cultured as described above. Purified isolates are tested both in RIA and in vitro. Values obtained from RIA and in vitro [Asn 2 , de-Pro by Ile 6 ] expression of hEP0 products are approximately 11000 U / mg and 6000 U / mg protein, respectively, whereas [His 7 ] hEP0 assay values are 41000 U / mg protein. This means that the analog products are "active" 1/4 - 1/10 in the same way as in the "maternal" expression product studies.
Ekspresijos sistemoje, skirtoje panaudoti šeimininkoAn expression system designed to utilize the host
S.Cerevisial ląstelėse. pYE/SCEPO plazmidę transformuoja į du skirtingus kamienus, YSDP4 (apep4-3trpl genotipas)/ ir PK81 depozitinis atitinkamai.In S.Cerevisial cells. pYE / SCEPO transforms plasmid into two different strains, YSDP4 (apep4-3trpl genotype) / and PK81 deposit, respectively.
genotipas pep4-3trpi). Transformuoti šeimininkai YSDP4 auginami terpėje SD (mielių genetikos metodai, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 62 psl.(1983) vykdomoje casamino rūgštimis 0,5%, pH6,5, 30° C temperatūroje. Terpės, surinktos, kai ląstelės išauga iki 36 O.D. turi produktų EPO maždaug 244 V/ml/97 mkg/ODl lygyje, kas išaiškinama naudojant RIA). Transformuotos ląstelės RK8I, išaugintos iki 6,5 O.D. arba 60 O.D., sudaro terpes su EPO koncentracija apie 80-90 V/ml/34 mkg/O.Dl, kas išaiškinta RIA/. Preliminariniai tyrimai nustato žymų heterogeniškumą produktuose, gautuose naudojant ekspresijos sistemas, kas, tikriausiai, nulemta pakitimais ekspresuotų baltymų glikozidinime, o taip pat palyginus aukšta prijungto angliavandenio koncentracija.genotype pep4-3trp i ). Transformed hosts YSDP4 were grown in SD medium (yeast genetics methods, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY p. 62 (1983)) at 0.5%, pH6.5, 30 ° C. Media harvested when cells were increases to 36 ODs containing EPO products at approximately 244 U / ml / 97 mcg / OD1, as clarified by RIA). Transformed cells RK8I grown to 6.5 OD or 60 OD form media with EPO concentrations of about 80-90 U / ml / 34 mcg / O.Dl as explained by RIA /. Preliminary studies have identified significant heterogeneity in the products obtained by expression systems, probably due to alterations in the glycosidation of the expressed proteins as well as relatively high levels of attached carbohydrates.
Plazmidės PctC3 ir pYE ląstelėse E.Coli HBIOI buvo pateiktos registracijai pagal JAV Patentų reikalų žinybos taisykles nuo 27 rugsėjo I984m. Amerikos tipinių kultūrų kolekcijos, 12301 Parklovvn Drive, Rockville, Maryland numeris A.T.C.C. 39881 ir A.T.C.C.39882 Plazmidės pCFM526 ląstelėse MI03 ir pMVVI ląstelėse MI03 buvo užregistruotos panašiu būdu 21 lapkričio 1984m., kaip A.T.C.C. 33932, 33934 ir 33933 atitinkamai.Plasmids in PctC3 and pYE cells were submitted to E. coli HBIOI for registration under U.S. Patent Office regulations from September 27, I984. Collections of American Typical Cultures, 12301 Parklovvn Drive, Rockville, Maryland Issue A.T.C.C. 39881 and A.T.C.C.39882 Plasmids in pCFM526 cells in MI03 and in pMVVI cells in MI03 were recorded in a similar fashion on November 21, 1984 as A.T.C.C. 33932, 33934 and 33933 respectively.
Kamienai YSPDA ir RK8P Saecharomyces Cerevisial buvo užregistruoti 21 lapkričio 1984m., kaip A.T.C.C. 20734 ir 20733 atitinkamai.The strains YSPDA and RK8P Saecharomyces Cerevisial were registered on November 21, 1984 as A.T.C.C. 20,734 and 20,733 respectively.
Iš aukščiau pateiktų iliustracinių pavyzdžių turėtų būti aišku, kad šis išradimas daugeliu aspektų siūlo ypač vertingus produktus ir būdus.From the above illustrative examples, it should be clear that the present invention offers particularly valuable products and methods in many respects.
Siūlomi polipeptidai yra aiškiai naudinga medžiaga ar tai būtų mikrobiniu ar sintetiniu būdu gauti produktai, kurių pirminė, antrinė ir tretinė konformacijos tapo pirmą kartą žinoma šio išradimo dėka.The proposed polypeptides are clearly useful material, be they microbially or synthetically derived products, the primary, secondary and tertiary conformations of which have become known for the first time with the present invention.
Kaip anksčiau buvo pašymėta, rekombinantiškai gaminami ir sintetiniai išradimo produktai skiria nevienodu laipsniu iš natūralių šaltinių EPO izoliatų aktyvumą in vitro ir todėl projektuojami tam, kad tiktų kaip EPO izoliatų pakaitalai kultūrinėse terpėse, naudojamose eritropoetino ląstelių auginimui kultūroje. Taip pat, kadangi šio išradimo polipeptidiniai produktai skiria natūralių EPO izoliatų aktyvumą in vivo jie gali būti tinkami eritropoetinų terapijos metodikoje, naudojamoje žinduoliams, įskaitant žmogų, gavimui bet kurio ar visų efektų, būdingų EPO in vivo. pavyzdžiui, retikulocitų atsakymo stimuliavimui, ferokinetinių efektų išvystymui (tokių, kaip geležies apykaita plazmoje ir perėjimo į smegenų medžiagą laiko efektas), eritrocitų masės mainų, hemoglobino C sintezės stimuliavimas (žiūr. Eschlach et ai., Supra) ir, kaip pažymėta 10 pavyzdyje, hematokrito lygio padidinimas žinduoliuose. Į grupę žmonių, gaunančių siūlomus produktus, įeina pacientai, kaip taisyklė tie, kuriems reikalingas kraujo perpylimas, įskaitant traumų aukas, chirurginius ligonius, inkstų ligoniai, įskaitant dializuojamus ligonius, pacientus su kraujo sudėties ypatybe, iššaukiančia sutrikimus, tokius kaip hemofilija, fiziologinė anemiazė ir panašios. Kraujo perpylimo būtinumo minimizacija terapijoje eritropoetino terapijos panaudojimo dėka, galima laukti, sumažins infekcinės ligos sukėlėjo pernešimą. Rekombinantinių būdu gauti siūlomi produktai, reikia manyti, neturi pirogenų, natūralių slopinančių produktų, ir todėl be abejonės turi užtikinti padidintą bendrą efektą terapijos metoduose, palyginus su gamtiniais produktais. Eritropoetinų terapija, naudojant siūlomus produktus, turėtų būti naudinga, pakeliant individualų deguonies pralaidumo sugebėjimą, palyginus su hipoksinėmis išorinės aplinkos sąlygomis ir, gal būt, užtikrinant palankius širdies kraujagyslių efektus.As noted above, recombinantly produced and synthetic products of the invention differentiate the activity of EPO isolates from natural sources in vitro and are therefore designed to be suitable substitutes for EPO isolates in culture media used for culturing erythropoietin cells in culture. Also, since the polypeptide products of the present invention confer activity on natural EPO isolates in vivo, they may be useful in the erythropoietin therapy methodology used in mammals, including man, to produce any or all of the effects of EPO in vivo. for example, stimulation of reticulocyte response, development of ferro-kinetic effects (such as plasma iron turnover and time-to-brain effect), stimulation of erythrocyte mass exchange, hemoglobin C synthesis (see Eschlach et al., supra) and, as noted in Example 10, increase in hematocrit levels in mammals. The group of people receiving the products offered includes patients as a rule those who require blood transfusions, including trauma victims, surgical patients, renal patients, including dialysis patients, patients with a blood disorder causing disorders such as haemophilia, physiological anemia and similar. Minimizing the need for blood transfusions in therapy The use of erythropoietin therapy can be expected to reduce the transmissibility of infectious agents. The products offered by recombinant methods are presumed to be free of pyrogens, natural inhibitory products, and therefore undoubtedly have to provide an enhanced overall effect in therapeutic approaches compared to natural products. Erythropoietin therapy using the proposed products should be beneficial in increasing individual oxygen permeability compared to hypoxic conditions of the external environment and possibly providing beneficial cardiovascular effects.
Siūlomų polipeptidinių produktų geriausias įvedimo būdas yra parenterialinis (pavyzdžiui, į veną, į raumenis, į poodį ar į pilvą), ir įvedamos kompozicijos turi, kaip įprasta, turėti terapiškai efektyvų produkto kiekį derinyje su tinkamais skiedikliais, nešikliais ar stimuliatoriais. Preliminarūs farmakokinetiniai tyrimai pažymi ilgesnį skilimo pusperiodį in vivo beždžionės EPO produktams, leidžiant juos į raumenis, negu į veną. Kaip spėjama, efektyvios dozės gali žymiai keistis priklausomai nuo sąlygų, tačiau terapinės dozės, kaip laukiama, gali svyruoti nuo 0,1-7 iki 100-7000 V/mkg aktyvios medžiagos kilogramui kūno svorio. Standartiniai skiedikliai, tokie kaip plazminis žmogaus albuminas, numatomas farmacinėse šio išradimo kompozicijose greta standartinių nešiklių, tokių kaip fiziologinis tirpalas.Parenteral (e.g., intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraperitoneal) administration is the preferred route of administration of the polypeptide products provided, and the compositions to be administered must, as usual, contain a therapeutically effective amount of product in combination with suitable diluents, carriers or stimulants. Preliminary pharmacokinetic studies indicate a longer half-life of in vivo monkey EPO products when administered intramuscularly than intravenously. Effective doses are expected to vary considerably with conditions, but therapeutic doses are expected to range from 0.1-7 to 100-7000 U / mcg of active ingredient per kg body weight. Standard diluents, such as human plasma albumin, are contemplated in the pharmaceutical compositions of the present invention in addition to standard carriers, such as saline.
Siūlomose kompozicijose tinkamos stimuliuojančios medžiagos turi junginių, savarankiškai nurodytų eritropoetiniams (1982); Kalmanti, Kidney I Eng. J. Med., 289, 72-80 stimuliuojantiems efektams, kaip pvz., testosteronas, ląstelių pirmtakų stimuliatoriai, augimo faktorius insulino tipo, prostoglandinai, serotoninas, ciklinis ΑΜΦ prolaktinas ir trijodtironinas, o taip pat priemonės, paprastai naudojamos aplastinės anemijos gydymui, tokios kaip metendenas, stanozolas ir nandrelonas [žiūr., pvz., Resegott et ai., Panminerva Medica, 23, 243-248 (1981); McGonigle et ai., Kidney I nt, 26/2, 437-444 (1984); Pavlovic-Kantera et ai., Exp. Hematol., 8 supp., 283-291 (1980); Kurtz, FEBS Letters, 14a/I/, 105-108 (1982)]. Kaip stimuliatorius taip pat numatoma naudoti medžiagas, sustiprinančias arba sinergizuojančias eritropoetino arba asialo EPO veikimą, pavyzdžiui, adrenerginiai antagonistai, tiroidiniai hormonai, adrogeniniai ir BPA [žiūr. Dunn “Current Concepts in Erythropoiesis”, John VVilly & Sons / Chichester, England, 1983; VVeiland et ai., Blut, 44(3), 173-175 nt, 22, 383-391 (1982); Shahid, New (1973); Fischer et ai., Steroids, 30(6), 833-845 (1977); Urabe et ai., J.Exp. Med., 149, 1614-1325 (1979) ir Billat et ai., Exp. Hematol., 10(1), 133-140 (1982)], o taip pat klasės junginių, žymimų kaip hepatiniai, eritropoetiniai faktoriai [žiūr.Naughton et ai., Actą Haemat., 69, 171-179 (1983)] ir “eritrotropiniai” [kaip aprašyta Congote et ai., žurnale Abstract 364, Proceedings 7th International Congress of Endocrinology (Qebec City, Qebec, 1984 m. liepos 1-7 d.; Congate, Biochem. Biophys. Res. Comun., 115(2), 447-483 (1983) ir Congate, Anai. Biochem., 140, 428-433 (1984)] ir “eritrogeniniai” [kaip aprašyta darbe Rothman et ai., J. Surg. Oncol., 20, 105-108 (1982)]. Preliminarus skryningas, skirtas eritropoetinių atsakymų išmatavimui ekshipoksinių policiteminių pelių, iš anksto apdorotų dihidrotestosteronu arba pandrodonu, o po eritropoetinu, davė abejotinus rezultatus.Suitable stimulants in the proposed compositions include compounds independently designated as erythropoietic (1982); Kalmanti, Kidney I Eng. J. Med., 289, 72-80 for stimulatory effects such as testosterone, cell precursor stimulators, insulin-like type, prandlandin, serotonin, cyclic ΑΜΦ-prolactin and triiodothyronine, as well as agents commonly used in the treatment of aplastic anemia, such as as methendene, stanozol and nandrelone [see, e.g., Resegott et al., Panminerva Medica, 23, 243-248 (1981); McGonigle et al., 1984, Kidney I, 26/2, 437-444; Pavlovic-Kantera et al., Exp. Hematol., 8 Supp., 283-291 (1980); Kurtz, FEBS Letters, 14a (I), 105-108 (1982)]. Substances that enhance or synergize with the action of erythropoietin or asial EPO, such as adrenergic antagonists, thyroid hormones, adrogenic and BPA, are also contemplated as stimulants. Dunn, Current Concepts in Erythropoiesis, John Willy & Sons / Chichester, England, 1983; Weiland et al., Blut, 44 (3), 173-175 nt, 22, 383-391 (1982); Shahid, New (1973); Fischer et al., Steroids, 30 (6), 833-845 (1977); Urabe et al., J.Exp. Med., 149, 1614-1325 (1979) and Billat et al., Exp. Hematol., 10 (1), 133-140 (1982)], as well as a class of compounds designated as hepatic, erythropoietic factors (see Naughton et al., Act Haemat, 69, 171-179 (1983)) and "Erythropropic" [as described in Congote et al., Abstract 364, Proceedings of the 7th International Congress of Endocrinology (Qebec City, Qebec, 1-7 July 1984; Congate, Biochem. Biophys. Res. Comun., 115 ( 2), 447-483 (1983) and Congate, Ann. Biochem., 140, 428-433 (1984)] and "erythrogenic" [as described in Rothman et al., J. Surg. Oncol., 20, 105- 108 (1982)] A preliminary screening for the measurement of erythropoietic responses in exhypoxic polycythaemic mice pretreated with dihydrotestosterone or pandrodone followed by erythropoietin yielded questionable results.
Siūlomų polipeptidų panaudojimas diagnostikai taip pat yra platus, ir įskaitant žymėtų ir nežymėtų formų panaudojimą imuninių tyrimų metodikų įvairovėje, įskaitant RIA, ELISA ir panašiai, o taip pat įvairovėje analizių, atliekamų norint išryškinti aktyvumą in vitro ir in vivo. Žiūr., pvz., Dum et ai., Exp. Hematol., 11(7), 649-660 (1983); Gibson et ai., Pathology, 16, 155-156 (1984); Krystal, Exp. Hematol., 11(7), 649-660 (1983); Saito et ai., Jap. J. Med., 23(1), 61-71 (1984);The diagnostic utility of the proposed polypeptides is also wide, including the use of labeled and unlabeled forms in a variety of immunoassay protocols, including RIA, ELISA, and the like, as well as in assays to detect activity in vitro and in vivo. See, e.g., Dum et al., Exp. Hematol., 11 (7): 649-660 (1983); Gibson et al., 1984, Pathology 16: 155-156; Krystal, Exp. Hematol., 11 (7): 649-660 (1983); Saito et al., Jap. J. Med., 23 (1): 61-71 (1984);
arba 5-ato siūlomuor 5th suggested
Nathan et ai., New Eng. J. Med., 308(9), 520-522 (1983); ir įvairios nuorodų medžiagos, turinčios ryšį su paminėtais šiuose darbuose tyrimais. Siūlomi polipeptidai, įskaitant sintetinius peptidus, kurie turi pirmą kartą išryškinto EPO liekanų sekas, taip pat turi ypatingai vertingų grynų medžiagų gamybai polikloninių antikūnų ir monokloninių antikūnų blokų, specifinių nepertraukiamiems ir pertraukiamiems EPO epitopams. Kaip vienas pavyzdys, preliminariniai VI lentelės aminorūgščių sekos tyrimai, sutinkamai su Hopp et ai., P.N.A.S. (USA), 78, 3824-3828 (1981) ir antrinių struktūrų sutinkamai su Chon et ai., Ann. Rev. Biochem., 47, 251 (1978) išaiškino, kad sintetiniai peptidai, duplikuojantys nepertraukiamas liekanų sekas, sutraukiančias 41-57 padėtis imtinai, 116-118 imtinai ir 144-166 imtinai, tikriausiai turi produkuoti ypač antigeninę reakciją ir gaminti naudingus monokloninius ir polikloninius antikūnus, imunoreaktyvius kaip su sintetiniu peptidu, taip ir su visu baltymu. Tokios medžiagos, kaip tikimasi, turėtų būti naudingos aptinkant ir giminingai valant EPO ir su juo surištus produktus.Nathan et al., New Eng. J. Med. 308 (9): 520-522 (1983); and various reference materials related to the studies mentioned in these works. The proposed polypeptides, including synthetic peptides having sequences of first-expressed EPO residues, also possess particularly valuable purity production of polyclonal antibodies and monoclonal antibody blocks specific for continuous and discontinuous EPO epitopes. As one example, preliminary studies on the amino acid sequence of Table VI, in agreement with Hopp et al., P.N.A.S. (USA), 78, 3824-3828 (1981), and secondary structures according to Chon et al., Ann. Rev. Biochem., 47, 251 (1978), explained that synthetic peptides that duplicate continuous residue sequences at positions 41-57 inclusive, 116-118 inclusive and 144-166 inclusive must probably produce a highly antigenic reaction and produce useful monoclonal and polyclonal antibodies. , immunoreactive with both the synthetic peptide and the whole protein. Such materials are expected to be useful in the detection and related purification of EPO and its bound products.
Iliustracijai imti trys sintetiniai peptidai:Three synthetic peptides are taken for illustration:
(1) hEPO, 41-57 V-P-D-T-K-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G;(1) hEPO, 41-57 V-P-D-T-K-N-F-Y-A-W-K-R-M-E-V-G;
(2) hEPO, 116-128 K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A;(2) hEPO, 116-128 K-E-A-I-S-P-P-D-A-A-S-A-A;
(3) hEPO, 144-166 V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.(3) hEPO, 144-166 V-Y-S-N-F-L-R-G-K-L-K-L-Y-T-G-E-A-C-R-T-G-D-R.
Preliminarūs imunizacijos tyrimai, naudojant aukščiau nurodytus polipeptidus, parodė palyginti silpną teigiamą reakciją į hEPO 41-57, neišmatuojamą reakciją į hEPO 116-128 ir stiprią teigiamą reakciją į hEPO 144-166, kaip nustatyta triušio serumo antikūnų sugebėjimu imunonusodinti žmogaus šlapimo EPO, žymėto 125I, izoliatu. Preliminarūs aktyvumo in vivo tyrimai, atlikti su trimis peptidais, neparodė žymaus aktyvumo nei atskirai, nei kombinacijose.Preliminary immunization studies using the above polypeptides showed a relatively weak positive response to hEPO 41-57, an immeasurable positive response to hEPO 116-128, and a strong positive response to hEPO 144-166 as determined by the ability of rabbit serum antibodies to immunoprecipitate human urine EPO labeled with 125 I, isolate. Preliminary in vivo activity studies with the three peptides showed no significant activity alone or in combination.
Nežiūrint į tai, kad įvestos žinduolių EPO aminorūgščių sekos, pateiktos iliustraciniuose pavyzdžiuose, iš esmės nustato pirminę subrendusio EPO konformaciją, reikia suprasti, kad 5 lentelėje pateikta specifinė beždžionės EPO 165 aminorūgščių liekanų seka ir 6 lentelėje pateikta žmogaus EPO 165 aminorūgščių liekanų, neapriboja naudingų polipeptidų, siūlomų išradėjų, kiekio. Šis išradimas apima tas įvairias laisvai sutinkamas alelines EPO formas, kurios praeityje įėjo į biologiškai aktyvių žinduolių polipeptidų tyrimus, kaip, pavyzdžiui, žmogaus interferonas. (Palyginkite, pavyzdžiui, žmogaus imuninį interferoną, turintį arginino liekaną 140 EPO padėtyje, apie kurį buvo pranešama paskelbtoje paraiškoje patentui Nr.0077670 ir turintys glutaminą padėtyje Nr.140, kaip pranešta darbe Gray et ai., Nature, 295, 503-508(1982). Abi rūšys skiriasi tuo, kad sudaro sekas subrendusio žmogaus interferono).Although the introduced mammalian EPO amino acid sequences in the illustrative examples essentially determine the primary conformation of the mature EPO, it should be understood that the specific sequence of monkey EPO 165 amino acids and Table 6 of the human EPO 165 amino acid residues do not limit the useful polypeptide. , the number of inventors offered. The present invention encompasses various free-form allelic forms of EPO that have been previously tested in biologically active mammalian polypeptides, such as human interferon. (Compare, for example, human immune interferon containing the arginine residue at position 140 EPO reported in published patent application No. 0077670 and containing glutamine at position 140 as reported in Gray et al., Nature, 295, 503-508 ( 1982) .The two species differ in that they form sequences in mature human interferon).
Subrendusio EPO alelinės formos gali skirtis viena nuo kitos ir nuo sekų, pateiktų 5 ir 6 lentelėje pagal ilgį ir seką ir/arba pagal delecijas, pakaitus, intarpus ar amino rūgščių priedus į seką greta su logiškai sekančiomis variacijomis pagal sugebėjimą glikozidintis. Kaip anksčiau buvo pažymėta, žmogaus EPO alelinė forma, atrodo, turi turėti metionino liekaną 126 padėtyje. Spėjama, kad laisvai sutinkamos alelinės formos DNR sekų ir EPO - koduojančios genominės DNR, tikriausiai, taip pat gali pasitaikyti, be to, aukščiau nurodyti aleliniai polipeptidų tipai koduojančiais ar paprastai naudojančiais skiriasi kodonai skirti susidarymui tokių pačių polipeptidų, kurie nurodyti.The allele forms of mature EPO may differ from each other and from the sequences shown in Tables 5 and 6 by length and sequence, and / or by deletions, substitutions, insertions, or amino acid additions to the sequence, along with logically sequential variations in glycosidation ability. As previously noted, the allele form of human EPO appears to have a methionine residue at position 126. It is anticipated that the free-form allele DNA sequences and the EPO-encoding genomic DNA probably also occur, and that the above allele types of polypeptide encoding or commonly used are intended to produce the same polypeptides as indicated.
Prie laisvai sutinkamų subrendusio EPO alelinių formų, šis išradimas taip pat turi kitų EPO produktų, tokių kaip EPO polipeptidų analogai ir subrendusio EPO fragmentai. Pagal anksčiau paminėtą ir spaudoje paskelbtą paraišką patentui Alton et ai., /VV0/83/04053/, galima nesunkiai išskaičiuoti ir pagaminti genus, koduojančius mikrobinę ekspresiją polipeptidų, turinčių pirminę konformaciją, kuri skiriasi nuo konformacijos, čia nurodytos subrendusiam EPO identiškumo ir vieno ar daugiau liekanų padėties atžvilgiu (pavyzdžiui, pakaitų galiniai ar tarpiniai priedai ir delecijos). Ir dar, DNR modifikacijos ir genominių EPO genų gali būti lengvai įgyvendinti gerai žinomų sait-nukreiptų mutagenezės metodikų ir naudojami EPO analogų ir jo darinių generavimui. Tokie EPO produktai turi turėti bent jau vieną iš biologinių EPO savybių, bet gali skirtis kitomis. Kaip pavyzdžiai, šio išradimo projektuojami EPO produktai apima tuos, kurie 2 2 sutrumpinti keliu, pvz., delecijų [ASn , des-Pro iki Ile6]hEP0, [des-Thr163 iki Arg166]hEP0 ir 27-55hEP0, be to pastaroji turi likučių, koduojamų išbrauktu visu egzonu; arba kurie atsparesni hidrolizei (ir, to pasėkoje, gali turėti stipriau išreikštą ar ilgiau trunkantį poveikį, negu laisvai sutinkamas EPO); arba kurie buvo pakeisti išbraukiant vieną ar daugiau potencialių sričių glikozidinimui (kuris gali suteikti didelį aktyvumą mielių gaminamiems produktams); arba, kurie turi vieną ar daugiau cisteino liekanų, išbrauktų arba pakeistų, pavyzdžiui, histidinu arba serinu (kaip, pavyzdžiui, [His7]hEP0 analogas), ir potencialiai lengviau išsiskiria aktyvioj formoj iš mikrobinės sistemos; arba kurie turi vieną ar daugiau tirozino, pakeisto fenilalaninu likučių (kaip, pvz., [Phe15]hEP0, [Phe49]hEP0, [Phe145]hEP0 analogai) ir gali daugiau ar mažiau lengvai jungtis su EPO receptoriais ant planinių ląstelių. Taip pat apimti polipeptidų fragmentai, duplikuojantieji tik dalį nepertraukiamos amino rūgščių sekos arba antrinių konformacijų subrendusio EPO ribose, be to fragmentai gali turėt vieną EPO aktyvumą (pavyzdžiui, eritropoetinis aktyvumas). Ypač svarbūs šia prasme tie EPO potencialiniai fragmentai, kurie paaiškinti apžvelgiant žmogaus DNR genomines sekas, pateiktas 6 lentelėje, t.y. fragmentai pilnos nepertraukiamos EPO sekos, kuri apibrėžta introninėmis sekomis ir kuri gali sudaryti ryškiai išreikštus biologinio aktyvumo domenus. Reikia atkreipti dėmesį, kad aktyvumo nebuvimas in vivo bet kuriam vienam ar daugiau EPO produktų, pateiktų šiame išradime, apskritai nekenkia terapiniam naudingumui (žiūr., VVeiland et ai., Supra) ar naudingumui kituose kontekstuose, tokiuose kaip EPO-bandymai ar EPO-antagonizmas. Eritropoetino antagonistai gali būti labai veiksmingi gydant policetemiazę ar EPO perprodukcijos atvejais [žiūr., pvz., Adamson, Hosp.Practice, 18/12/, 4957(1983) ir Hellman et ai., Clin.Lab. Haemat., 5, 335342(1983).In addition to the free-form alleles of mature EPO, the present invention also includes other EPO products such as EPO polypeptide analogs and fragments of mature EPO. The above-mentioned and published patent application Alton et al., WO0 / 83/04053 /, readily deduce and produce genes encoding microbial expression of a polypeptide having a primary conformation different from that of the mature EPO identified herein and one or more residues with respect to position (for example, substituents at the rear or intermediate and deletions). Furthermore, DNA modifications and genomic EPO genes can be readily implemented by well-known site-directed mutagenesis techniques and used to generate EPO analogs and derivatives thereof. Such EPO products must have at least one of the biological properties of the EPO, but may be different. By way of example, the EPO products designed by the present invention include those truncated, such as the deletions [ASn, des-Pro to Ile 6 ] hEP0, [des-Thr 163 to Arg 166 ] hEP0, and 27-55hEP0. the latter contains residues encoded by the deleted exon; or which are more resistant to hydrolysis (and, as a result, may have a more pronounced or longer duration of action than the free EPO); or which have been replaced by deleting one or more potential domains for glycosidation (which may confer high activity on yeast-derived products); or having one or more cysteine residues deleted or substituted, for example, by histidine or serine (such as the [His 7 ] hEP0 analog), and potentially more readily released in the active form from the microbial system; or having one or more tyrosine-substituted phenylalanine residues (such as [Phe 15 ] hEP0, [Phe 49 ] hEP0, [Phe 145 ] hEP0 analogs) and can bind more or less readily to EPO receptors on target cells. Also included are polypeptide fragments that duplicate only part of the continuous amino acid sequence or secondary conformations within the mature EPO, and may also have a single EPO activity (e.g., erythropoietic activity). Of particular interest in this respect are the potential EPO fragments explained in the overview of the human DNA genomic sequences in Table 6, that is, fragments of the complete continuous EPO sequence defined by intronic sequences, which may form highly expressed domains of biological activity. It should be noted that the absence of in vivo activity for any one or more of the EPO products of the present invention does not in general impair therapeutic utility (see Weiland et al., Supra) or utility in other contexts such as EPO-testing or EPO-antagonism. . Erythropoietin antagonists may be very effective in the treatment of polycythaemia or in cases of EPO overproduction [see, e.g., Adamson, Hosp.Practice, 18/12 /, 4957 (1983) and Hellman et al., Clin.Lab. Haemat., 5, 335342 (1983).
Kita šio išradimo ypatybė yra ta, kad čia aprašytos klonuotos DNR sekos, kurios koduoja žmogaus ir beždžionės EPO polipeptidus, yra vertingos informacijai, kurią jie siūlo žinduolių eritropoetino aminorūgščių sekos, kurios anksčiau nebuvo prieinamos, nepaisant dešimtmečius vykdyto laisvai sutinkamų produktų izoliatų analitinio apdorojimo atžvilgiu. DNR sekos taip pat labai vertingos kaip produktai, tinkami stambiai mikrobinei eritropoetino sintezei, naudojant įvairias rekombinantinės metodikas. Be to, siūlomos DNR sekos naudingos, gaminant naujus ir tinkamus vektorius virusinei ir žiedinei plazmidinei DNR, naujų ir naudingų transformuotų ir transfektuotų mikrobinių prokariotinio ir eukariotinio> šeimininko ląstelių (įskaitant bakterijų ir mielių ląsteles, bei žinduolių ląsteles, išaugintas kultūroje), o taip pat nauji tinkami būdai kultivuojamo tokių mikrobinių šeimininko ląstelių, galinčių užtikrinti EPO ir EPO produktų ekspresiją. Siūlomo išradimo DNR sekos taip pat yra gana tinkama medžiaga naudoti kaip žymėtus zondus izoliavimui EPO ir su juo surišto baltymo, koduojančio DNR sekas ir žinduolių DNR genomines, kitokias, negu beždžionės ir žmogaus, čia iliustruojamas specifiškai.Another feature of the present invention is that the cloned DNA sequences described herein that encode human and monkey EPO polypeptides are valuable for the information they offer in the mammalian erythropoietin amino acid sequences that were previously unavailable despite decades of analytical processing of free-standing product isolates. DNA sequences are also very valuable as products suitable for large-scale microbial synthesis of erythropoietin using various recombinant techniques. In addition, the proposed DNA sequences are useful for the production of novel and suitable vectors for viral and circular plasmid DNA, novel and useful transformed and transfected microbial prokaryotic and eukaryotic host cells (including bacterial and yeast cells, and mammalian cells grown in culture), as well as novel suitable methods for culturing such microbial host cells capable of expressing EPO and EPO products. The DNA sequences of the present invention are also quite suitable material for use as labeled probes for the isolation of EPO and its associated protein encoding DNA sequences and mammalian DNA genomes other than those specifically described in monkeys and humans.
DNR sekų panaudojimo laipsnio įvairiuose baltymų sintezės būduose (pavyzdžiui, vabzdžių ląstelėse) arba genetinei žmonių ar kitų žinduolių terapijai dar negalima nustatyti. Siūlomos DNR sekos, kaip laukiama, turi būti naudingos išvedant transgenines žinduolių rūšis, kurie gali tarnauti kaip eukariotiniai šeimininkai eritropoetino produktų gavimui dideliais kiekiais. Žiūrėkite, pirmiausia, darbą: Palmiteretal, Science, 222/4625/ 803-814(1983).The degree of utilization of DNA sequences in various protein synthesis pathways (such as insect cells) or genetic therapy in humans or other mammals has not yet been determined. The proposed DNA sequences are expected to be useful in the derivation of transgenic mammalian species that can serve as eukaryotic hosts for the production of large amounts of erythropoietin products. See, in particular, the work: Palmiteretal, Science, 222/4625 / 803-814 (1983).
Čia išnagrinėti konkretūs paaiškinamieji pavyzdžiai, be abejo, neapriboja šio išradimo apimties, ir specialistai matys daugybę kitimų ir modifikacijų. Nors DNR sekos turi paaiškinamuosius pavyzdžius, vienu pavyzdžiu apima DNR ir genomines DNR sekas, kadangi duota paraiška pateikia informaciją apie aminorūgščių seką, svarbią DNR sekos sudarymui. Išradimas taip pat numato pagaminimą tokios DNR sekos, kurią galima pagaminti remiantis žiniomis apie EPO aminorūgščių seką. Jie gali koduoti EPO (kaip 12 pavyzdyje) o taip pat EPO fragmentus ir EPO polipeptidinius analogus (t.y. EPO produktus), kurie gali turėti vieną ar daugiau laisvai sutinkamų EPO biologinių savybių, tačiau neturi kitų (ar turi kitų įvairiu laipsniu).The specific illustrative examples discussed herein do not, of course, limit the scope of the present invention, and many variations and modifications will be apparent to those skilled in the art. Although DNA sequences have illustrative examples, one example includes DNA and genomic DNA sequences, as the application provides information on the amino acid sequence important for DNA sequencing. The invention also provides for the production of a DNA sequence that can be made based on knowledge of the amino acid sequence of EPO. They may encode EPO (as in Example 12) as well as EPO fragments and EPO polypeptide analogs (i.e., EPO products), which may have one or more of the free biological properties of EPO but have no other (or varying degrees of others).
DNR sekos, siūlomos šiame išradime, tokiu būdu turi apimti visas DNR sekas, tinkamas panaudoti ekspresijai prokarioto ir eukarioto šeimininko ląstelėje polipeptidinio produkto, turinčio, kraštutiniu atveju, dalį pirminės struktūrinės konformacijos struktūros ir viena ar daugiau eritropoetino biologinių savybių ir atrenkamos iš: a) DNRsekų, pateiktų 5 ir 6 lentelėse; b) DNR sekų, kurios hibridizuoja į DNR sekas, apibrėžtas (a) ar jų fragmentus; c) DNR sekų, kurios dėl genetinio kodo degeneracijos turi hibridizuotis į DNR sekas, apibrėžtas (a) ir (b). Todėl, dėmesio verta tai, kad žmogaus ir beždžionės alelinio EPO genų sekos ir kitų žinduolių genų sekos, kaip laukiama, turi hibridizuotis į sekas, nurodytas 5 ir 6 lentelėse ar jų fragmentus. Be to dėl genetinio kodo degeneracijos genai ČEPO ir EOEPO ir pagamintos ar mutavusios sekos į kDNR ar genominę DNR, koduojančios įvairius EPO fragmentus ir jo analogus, turi taip pat hibridizuotis į ankščiau minėtas DNR sekas. Tokias hibridizacijas galima nesunkiai įvykdyti čia aprašytose sąlygose dėl DNR pirminės izoliacijos, koduojančios žmogaus ir beždžionės DNR ar griežtesnėse sąlygose, jei norima sumažint fono hibridizaciją.The DNA sequences provided by the present invention must thus include all DNA sequences suitable for expression in a prokaryotic and eukaryotic host cell of a polypeptide product having, as a last resort, part of the parent structural conformation and one or more biological properties of erythropoietin and selected from: shown in Tables 5 and 6; b) DNA sequences which hybridize to DNA sequences defined in (a) or fragments thereof; (c) DNA sequences which, due to degeneracy of the genetic code, must hybridize to the DNA sequences defined in (a) and (b). Therefore, it is noteworthy that the human and monkey allelic EPO gene sequences and other mammalian gene sequences are expected to hybridize to the sequences or fragments in Tables 5 and 6. In addition, due to the degeneracy of the genetic code, the genes CEPO and EOEPO and the produced or mutated sequences into cDNA or genomic DNA encoding various EPO fragments and its analogs must also hybridize to the DNA sequences mentioned above. Such hybridizations can be readily accomplished under the conditions described herein for primary DNA isolation encoding human and monkey DNA, or more stringent conditions if reduced background hybridization is desired.
Nors anksčiau pateikti pavyzdžiai iliustruoja išradimą EPO produktų mikrobinės ekspresijos kontekste žinduolių DNR ekspresijos, įstatytos į hibridinius vektorius bakterinių plazmidinių ir genominių rūšių virusų, panašiai išradime yra pateiktos įvairesnės sistemų ekspresijos. Ypač atkreiptas dėmesys į ekspresijos sistemas, turinčias genominių rūšių vektorius, priklausančius įvairovei bakterinių, mielių ir žinduolių ląstelių kultūroje, o taip pat į ekspresijos sistemas, neturinčias vektorių (pavyzdžiui, ląstelių transfekcija kalcio fosfatu). Todėl bus aišku, kad ekspresijos, pavyzdžiui, beždžionės DNR ląstelėse šeimininko beždžionės kultūroje ir ląstelėse šeimininko žmogaus kultūroje iš tikrųjų sudaro DNR “egzogeninės” ekspresijos pavyzdį, kadangi DNR EPO, kurio aukšto lygio ekspresija ieškoma, neturės savo šaltinių šeimininko genome. Šio išradimo ekspresijos sistemos, be to, numato šiuos veiksmus, išplaukiančius į citoplazmatinį EPO produktų susidarymą ir glikozidintų ir neglikozidintų EPO produktų susikaupimą ląstelės šeimininko citoplazmoje arba membranose (pavyzdžiui, susikaupimą bakterinėse periplazmos erdvėse) arba kultūros terpės viršnuosėdų esančiuose skysčiuose, kaip anksčiau buvo paaiškinta, arba gana retose sistemose, kaip pavyzdžiui, Pige reginosa ekspresijos sistemose (aprašytose darbe Gray et ai., Biotechnology, 2, 161-165(1984).Although the examples above illustrate the invention in the context of microbial expression of EPO products in mammalian DNA expression inserted into hybrid vectors of bacterial plasmid and genomic viruses, the invention similarly provides more diverse system expressions. In particular, expression systems containing vectors of genomic species belonging to diversity in bacterial, yeast and mammalian cell culture as well as expression systems lacking vectors (such as calcium phosphate transfection of cells) are of particular interest. Therefore, it will be clear that expressions such as in monkey DNA cells in host monkey culture and cells in host human culture do indeed exemplify DNA "exogenous" expression, since the high-level expression of the EPO DNA will not have its source in the host genome. The expression systems of the present invention further contemplate the following steps resulting from the cytoplasmic formation of EPO products and the accumulation of glycosidated and non-glycosidated EPO products in the cytoplasm or membranes of the host cell (e.g., accumulation in bacterial periplasmic spaces), or in relatively rare systems such as the expression systems of Pige reginosa (described by Gray et al., Biotechnology, 2, 161-165 (1984)).
Patobulintos šiame išradime hibridizacijos metodologijos, nors ir buvo aukščiau iliustracijai panaudotos skryningui. DNR/DNR-hibridizacijos, taip pat tinka RNR/RNR ir RNR/DNR skryningui· Mišrių zondų metodikos, kaip čia paaiškinta, pirmiausia, sudaro eilę patobulinimų hibridizacijos procesuose, įgalindamos greičiau ir patikimiau atlikti polinukleotidų izoliaciją. Šie daugelis atskirų apdorojimo patobulinimų apima: pagerintą kolonijų pernešimą ir išlaikymo metodikas; filtrų nailono pagrindu tokių kaip Gene Soreen ir Gene Soreen Plūs, panaudojimą, įgalinantį pakartotiną zondavimą šiais filtrais ir pakartotiną filtro panaudojimą, panaudojimą naujų gydymo proteaze metodikų (palyginkite, pvz., su Taub et ai., Anai Biochem., 126, 222-230(1982); labai žemų atskirų koncentracijų panaudojimą (0,025 pikomolio eilės) didelio kiekio mišrių zondų (pavyzdžiui daugiau negu 32); ir atlikimas hibridizacijos ir post-hibridizacijos ciklų griežtuose temperatūros intervaluose arti priartėjančiuose (t.y. 4° C ribose ir, geriau 2° C ribose) prie mažiausios išskaičiuotos bet kurio iš naudojamų mišrių zondų disociacijos temperatūros. Šie patobulinimai siejasi su gavimu rezultatų, kurių nebuvo galima laukti. Tai pilnai paaiškinama tuo, kad mišrių zondų metodikos, turinčios 4-gubą zondų kiekį, kurie, kaip buvo nurodyta, anksčiau visada sėkmingai buvo naudojami net DNR sietuose, palyginti mažo skaitlingumo informacinės DNR rūšims, buvo sėkmingai panaudoti unikalios sekos geno izoliacijai, persijojant genominę biblioteką iš 1500000 sterilių dėmių. Šis žygdarbis buvo atliktas, iš esmės, sutapo su nuomonės publikacija Anderson et ai., Supra, kad skryningo būdai, naudojant mišrius zondus buvo ... nepraktiški žinduolių genų atskyrimui, kai atitinkamos DNR neprieinamos.The hybridization methodologies of the present invention, although used above for illustration purposes, have been improved. DNA / DNA Hybridizations, Also Suitable for RNA / RNA and RNA / DNA Screening · Mixed probe techniques, as explained herein, first and foremost, provide a number of enhancements to hybridization processes, enabling quicker and more reliable polynucleotide isolation. These many individual processing enhancements include: improved colony transfer and retention techniques; the use of nylon-based filters such as Gene Soreen and Gene Soreen Pluses to enable re-probing of these filters and reuse of the filter, utilizing novel protease treatment techniques (compare, e.g., Taub et al., Anai Biochem. 126, 222-230 (1982), the use of very low individual concentrations (0.025 picomole order) of large numbers of mixed probes (more than 32, for example), and conducting hybridization and post-hybridization cycles at tight temperature ranges close to (e.g., 4 ° C and preferably 2 ° C). range) at the lowest calculated dissociation temperature for any of the mixed probes used. These improvements are related to obtaining unexpected results. This is fully explained by the fact that mixed probe methodologies containing 4-fold probes as previously reported have always been used successfully, even on DNA screens, by comparatively low-numerical information D NR species have been successfully used to isolate a unique sequence gene by screening a genomic library of 1,500,000 sterile spots. This feat was performed, in essence, in agreement with Anderson et al., Realizing that screening techniques using hybrid probes were ... impractical for mammalian gene separation when the DNA in question is unavailable.
Skiriamieji išradimo bruožai, atskleisti aprašyme, sekančioje išradimo apibrėžtyje ir/arba pridedamuose brėžiniuose, gali atskirai ir bet kokioj jų kombinacijoj tapti medžiaga išradimo įgyvendinimui įvairiose jo formose.The distinctive features of the invention disclosed in the following description of the invention and / or in the accompanying drawings may, in isolation and in any combination, become the material for practicing the invention in its various forms.
Claims (4)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US65584184A | 1984-09-28 | 1984-09-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
LTIP1836A LTIP1836A (en) | 1995-08-25 |
LT4012B true LT4012B (en) | 1996-08-26 |
Family
ID=24630601
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
LTIP1836A LT4012B (en) | 1984-09-28 | 1994-01-31 | Process for the preparation of polipeptides |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
DD (1) | DD255359A5 (en) |
LT (1) | LT4012B (en) |
UA (1) | UA54363C2 (en) |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US439443A (en) | 1890-10-28 | Back-band buckle | ||
US483451A (en) | 1892-09-27 | Waterproof composition | ||
US4264731A (en) | 1977-05-27 | 1981-04-28 | The Regents Of The University Of California | DNA Joining method |
US4273875A (en) | 1979-03-05 | 1981-06-16 | The Upjohn Company | Plasmid and process of isolating same |
US4293652A (en) | 1979-05-25 | 1981-10-06 | Cetus Corporation | Method for synthesizing DNA sequentially |
EP0070687A2 (en) | 1981-07-17 | 1983-01-26 | Amoco Corporation | Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method |
EP0071685A2 (en) | 1981-08-12 | 1983-02-16 | Olaf Soot | Method and apparatus for handling nuclear fuel elements |
EP0093619A1 (en) | 1982-05-05 | 1983-11-09 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator, pharmaceutical compositions containing it, processes for making it, and DNA and transformed cell intermediates therefor |
WO1983004053A1 (en) | 1982-05-06 | 1983-11-24 | Applied Molecular Genetics, Inc. | The manufacture and expression of large structural genes |
-
1985
- 1985-06-19 UA UA3917560A patent/UA54363C2/en unknown
-
1987
- 1987-03-02 DD DD30037687A patent/DD255359A5/en unknown
-
1994
- 1994-01-31 LT LTIP1836A patent/LT4012B/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US439443A (en) | 1890-10-28 | Back-band buckle | ||
US483451A (en) | 1892-09-27 | Waterproof composition | ||
US4264731A (en) | 1977-05-27 | 1981-04-28 | The Regents Of The University Of California | DNA Joining method |
US4273875A (en) | 1979-03-05 | 1981-06-16 | The Upjohn Company | Plasmid and process of isolating same |
US4293652A (en) | 1979-05-25 | 1981-10-06 | Cetus Corporation | Method for synthesizing DNA sequentially |
EP0070687A2 (en) | 1981-07-17 | 1983-01-26 | Amoco Corporation | Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method |
EP0071685A2 (en) | 1981-08-12 | 1983-02-16 | Olaf Soot | Method and apparatus for handling nuclear fuel elements |
EP0093619A1 (en) | 1982-05-05 | 1983-11-09 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator, pharmaceutical compositions containing it, processes for making it, and DNA and transformed cell intermediates therefor |
WO1983004053A1 (en) | 1982-05-06 | 1983-11-24 | Applied Molecular Genetics, Inc. | The manufacture and expression of large structural genes |
Non-Patent Citations (10)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DD255359A5 (en) | 1988-03-30 |
LTIP1836A (en) | 1995-08-25 |
UA54363C2 (en) | 2003-03-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5547933A (en) | Production of erythropoietin | |
JP2957974B2 (en) | Method for producing protein having erythropoietin activity | |
US4703008A (en) | DNA sequences encoding erythropoietin | |
FI113372B (en) | Method for Preparation of a LIF Polypeptide (LIF = Leukemia Inhibiting Factor) | |
JPH06502987A (en) | O-glycosylated IFN-alpha | |
JPH07308191A (en) | Dna coding for hybrid type human leukocyte interferon | |
US6187564B1 (en) | DNA encoding erythropoietin multimers having modified 5′ and 3′ sequences and its use to prepare EPO therapeutics | |
LT4012B (en) | Process for the preparation of polipeptides | |
RU2261276C2 (en) | Isolated dna molecule encoding human erythropoietin (variants), expressing plasmid or viral dna-vector, glycoprotein erythropoietin (variants) and method for its preparing, pharmaceutical composition (variants), mammalian cell line (variants) | |
CA1341607C (en) | Production of erythropoietin | |
CZ281542B6 (en) | Dna chain used for assuring expression of polypetide product | |
DK172611B1 (en) | DNA sequence encoding erythropoietin, vector which includes the sequence, host which is transformed or transfected with the sequence, polypeptide product of the expression of the sequence in such a host, process for preparing the polypeptide product, a pharmaceutical preparation which comprises the polypeptide product, and the use of the polypeptide product for producing a pharmaceutical for erythropoietin therapy. | |
AU4252400A (en) | Production of erythropoietin | |
AU1974001A (en) | Production of erythropoietin | |
DD251786A5 (en) | Process for the preparation of a polypeptide |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
SPCF | Filing an spc |
Free format text: PRODUCT NAME: ARANESP - DARBOPOETIN ALFA; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/01/185/001 20010608 Spc suppl protection certif: PA2004014 Filing date: 20041029 Expiry date: 20140131 Free format text: PRODUCT NAME: EPOETIN ALFA (EPREX); REGISTRATION NO/DATE: 01/7750/9 20011107 Spc suppl protection certif: PA2004013 Filing date: 20041029 Expiry date: 20140131 |
|
SPCR | Rejection of an spc |
Free format text: PRODUCT NAME: ARANESP - DARBOPOETIN ALFA; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/01/185/001 20010608 Spc suppl protection certif: PA2004014 Filing date: 20041029 Expiry date: 20140131 Effective date: 20050217 Free format text: PRODUCT NAME: EPOETIN ALFA (EPREX); REGISTRATION NO/DATE: 01/7750/9 20011107 Spc suppl protection certif: PA2004013 Filing date: 20041029 Expiry date: 20140131 Effective date: 20050217 |
|
MK9A | Expiry of a patent |
Effective date: 20140131 |