JPH10510434A

JPH10510434A - Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸及び修飾糖タンパク質の産生のためのその使用

Info

Publication number: JPH10510434A
Application number: JP9505487A
Authority: JP
Inventors: シャウアー，ローラント; シュレンツカ，ビーブケ; ショー，リー; ケルム，セルゲ; ハーゼルベック，アントン; ホノルト，コンラット
Original assignee: ベーリンガーマンハイムゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1995-07-07
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 1998-10-13
Also published as: WO1997003200A1; AU6611896A; EP0837942A1

Abstract

(57)【要約】シトクロムｂ₅及びシトクロムｂ₅レダクターゼによる夾雑物を実質的に含有しない単離タンパク質であって、ａ）外生的ＤＮＡの原核細胞又は真核細胞発現の生成物であり；ｂ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃへの転化を触媒し；ｃ）配列番号：１に示されるＤＮＡ配列によりコードされるか又は配列番号：１を完全に又は少なくともその98％を含み；ｄ）緊縮条件下で配列番号：１とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ；あるいはｅ）遺伝子暗号の縮重が認められない場合には、緊縮条件下でｃ）〜ｄ）に明示された配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる単離タンパク質は、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ欠損細胞の産生に有用である。このような細胞は、好ましくはＮ−グリコリルノイラミン酸側鎖を欠く組換え体タンパク質の産生に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸及び修飾糖タンパク質の産生のためのその使用序論シアル酸は、そのすべてが構造的に最も一般的なシアル酸であるＮ−アセチル −ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）に由来する約３０の天然酸性糖類の一群である（R．Schauer(1985)（１）及びA．Varki(1992a)（２））。ほとんどの場合、それらはグリココンジュゲートのグリカン鎖の末端位置にある。この曝露位置のために、それらは、例えば炎症反応、免疫細胞の成熟、分化工程、ホルモン−、病原−及び毒素結合の場合、細胞認識に重要な役割を演じる（R．Schauer(1985)（１）及びA．Varki(1992b)（３））。さらに、例えばエリスロポイエチンのような糖タンパク質ホルモンの生物学的有効性はシアル酸に影響される（N．Imai et al.,(1990)（４））。Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）は、Ｃ５−Ｎ−アセチル残基の付加的ヒドロキシル基によりＮｅｕ５Ａｃと区別される。Ｎｅｕ５Ｇｃはシアログリココンジュゲートを有するほとんどの動物に存在し、その量は種類、組織及び発現に関して特異的である（A．P．Corfield and R．Schauer(1982)（５）；G ．Reuter et al.(1988)（６）及びD．Bouhours and J-F．Bouhours(1983)（７））。面白いことに、Ｎｅｕ５Ｇｃは健常ヒト及びニワトリ組織には生じない。ここではＮｅｕ５Ｇｃ含有グリココンジュゲートは抗原として作用し、抗体の産生を誘導し得る。歴史的には、それらはHanganutziu-Deicher 抗原及び抗体と呼ばれている（H．Deicher（1926）（８））。Hanganutziu-Deicher 抗原は多数のヒト腫瘍組織で（結腸癌、網膜芽細胞腫、黒色腫及び乳房の癌）、並びにニワトリ腫瘍組織で検出可能であった（H．Higashi et al.(1985)（９）及びH．Higashi et al.(199 0)（１０））。これらの量は非常に少ない（通常シアル酸の総量の１％未満、しばしば0.01〜0.1 ％の範囲）が、しかしHanganutziu-Deicher 抗体の産生を誘導し得る（T. Higashihara(1991)（１１））。Ｎｅｕ５Ｇｃの生合成はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ（シチジンモノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ）を介してＣＭＰシアル酸のレベルで起こる。この酵素は分子酸素及びＮＡＤＨの存在下でＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃへの転化を触媒する（L．Shaw and R．Schauer (1988)（１２））。酸素の還元的活性化のための電子は、シトクロムｂ₅レダクターゼ及びシトクロムｂ₅から成る電子伝達鎖を介してヒドロキシラーゼに渡される（Y．Kozutsumi et al.(1990)（１３）及びL．Shaw et al.(1994)（１４））。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃの生成は細胞質中で起こる。ゴルジ装置中のＣＭＰシアル酸を取り上げて（A．Lepers et al.(1989)（１５））、それらをその結果生じるグリココンジュゲートに移す（H.H．Higa and J.C．Paulson(1985)（１６））タンパク質は、基質として両ＣＭＰシアル酸を等しく受容する。それゆえ、細胞が産生するグリココンジュゲート中のＮｅｕ５ＡｃとＮｅｕ５Ｇｃの比は、サイトゾル中のそれぞれのＣＭＰシアル酸の比に対応する。後者はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの活性に依存する。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼは今日まで、マウス肝臓及びブタ顎下腺から単離されて均質にされ、特性化された（T．Kawano et al.(1994)（１８）、P．Schneckenburger et al.(1994)（１９）及びW．Schlenzka et al.(1994)（２０））。ブタ顎下腺からの酵素の精製は、イオン交換クロマトグラフィー、固定化トリアジン染料を用いたクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて実施された（W．Schlenzka et al.(1994)（２０））。マウス肝臓からのヒドロキシラーゼは２つの異なる方法で単離された（P．Schneckenburger et al． (1994)（１９））。マウスからのヒドロキシラーゼのタンパク質及びＤＮＡ配列は、日本国特許出願06 113838（T．Kawano ）（８４）に記載されている。組織がより良好に入手し易いという事実のために、ブタ顎下腺から、多量の酵素を分離し得る。組織500 g から約200 μg のヒドロキシラーゼタンパク質が得られる。ブタ顎下腺からの及びマウス肝臓からの両ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼは、分子量65 kDaの可溶性モノマーである。それらのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びシトクロムｂ₅との触媒的相互作用は、互いに非常によく似ている。これらの酵素の活性は、鉄含有補欠分子族に依存すると思われる。ブタ顎下腺からのこの65 kDaタンパク質に対する抗体はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシダーゼ活性を阻害し、ウエスターンブロッティングでは、マウス肝臓からの精製酵素との強交差反応を示す。組換え体糖タンパク質の産生のためには、哺乳類細胞においてのみタンパク質の複合グリコシル化が起きるため、哺乳類細胞を必要とする。非ヒト細胞株、特にハムスター細胞は組換え体グリココンジュゲートの調製に関してかなりの利点を示す（十分特性化された高生産性）。したがって、治療的適用を意図されたヒト糖タンパク質は、タンパク質のグリコシル化がヒト細胞でのグリコシル化と同一方法で進行するＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）で調製される。しかしながら、シアリル化における差異は：Ｎｅｕ５Ｇｃはこれらのハムスター細胞の正常グリコシル化に対応して少量（総シアル酸の 3％まで）で挿入される（C.H．Hokke et al.(1990)（１７））が、一方ヒト糖タンパク質は少なくとも検出可能な量では、いかなるＮｅｕ５Ｇｃも含有しない。治療的適用に用いられるタンパク質は、特に長期治療の場合には、それぞれ対応する糖タンパク質及びグリココンジュゲート（プロテオグリカン、糖脂質）に関して、ヒトに生じないエピトープは実質的には含有しない。本発明は、このような組換え体タンパク質及びそれらの産生方法を提供する。 T．Kawano et al.(1994)（１８）は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃヒドロキシラーゼがＣＭＰ−ＮｅｕＧｃの産生によりＮｅｕＧｃ−含有グリココンジュゲートの発現を調節する速度制限因子であると記載している。ＮｅｕＧｃ−含有グリココンジュゲートハヒトに対して抗原性であって、チャイニーズハムスター卵巣細胞により産生されるいくつかのヒト組換え体タンパク質はＮｅｕＧｃを含有すると報告されている（C.H．Hokke（１７））。Kawanoはさらに、ＮｅｕＧｃが組換え体タンパク質中でＮｅｕＡｃに置換され得る場合には、そしてこれがＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシル化系に関与する成分を、又はＣＨＯ細胞中の成分をコードする遺伝子を操作することにより達成される場合には、それは理想的であると述べている。しかしながらKawanoは、何故そしてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ系のどの成分がＮｅｕＧｃグリコシル化の有効な低減に有用であるのか、又はこの結果を達成するためにどの遺伝子を操作すべきなのかを記載していない。本発明の要約したがって本発明の目的は、ヒドロキシラーゼ活性を欠いた哺乳類細胞の産生方法、このような細胞、及び組換え体タンパク質の産生のためのこのような細胞の使用である。ヒドロキシラーゼ欠損哺乳類細胞の有効な産生のためには、上記の遺伝子のＮ末端におけるヒドロキシラーゼ遺伝子のノックアウトを実施することがひつようである、ということが意外にも判明した。他の領域でのヒドロキシラーゼの遺伝子の操作、調節配列の操作又はヒドロキシラーゼ系のその他の成分（シトクロムｂ5 及びシトクロムｂ5 レダクターゼ）の操作によってはＮｅｕＧｃグリコシル化の有効な低減は生じなかった。本発明の一目的は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼ（本明細書中では以後「ヒドロキシラーゼ」と呼ぶ）の分子的クローニング及び上記の酵素をコードする核酸分子の単離である。特に好ましいのは、下記の緊縮条件下で配列番号：１とハイブリダイズする、又は配列番号：１を完全に又は少なくともその98％を包含する核酸分子である。酵素をコードする核酸分子はこの判定基準を満たす。再構築実験では、組換え体ヒドロキシラーゼは、in vivo でそして単離細胞及び細胞株中でのＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃへの転化を触媒し得ることが示された。本発明のさらなる目的は、特にヒドロキシラーゼタンパク質をコードする核酸分子の検出方法である。好ましくは、ＤＮＡ及びｍ孔種が検出される。有用なプローブは、特に適用される試験方法、例えばin situ ハイブリダイゼーション、コロニーーハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション又は関連技術の条件下で結合する核酸分子である。さらに本発明の目的は、哺乳類細胞で生じるヒドロキシラーゼの核酸分子と相補的なオリゴヌクレオチド分子である。特異的であるために概して約15〜50個の塩基を有するこのようなオリゴヌクレオチド分子は、好ましくはＤＮＡ又はｍＲＮＡレベルでのヒドロキシラーゼの発現を阻害するのに有用である。このようなオリゴヌクレオチド分子は、腫瘍治療における、特に転移の治療及び防止におけるアンチセンス剤として有用である。本発明のさらに別の目的は、ヒドロキシラーゼ遺伝子を変えることにより、特に相同的組換えにより宿主細胞におけるヒドロキシラーゼの発現を、ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質が上記の宿主細胞で産生された組換え体タンパク質の検出可能なＮｅｕ５Ｇｃグリコシル化に十分な量で上記の宿主細胞中で発現されないような方法で、阻害する核酸分子である。さらに本発明の目的は、上記の所望の糖タンパク質の発現を保証し、細胞を培養し、細胞又は細胞上清からタンパク質を回収する、核酸分子で哺乳類細胞がトランスフェクトされる哺乳類細胞中での組換え体糖タンパク質の産生方法であって、好ましくはＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをコードする遺伝子が不活性化される細胞中で検出可能なＮｅｕ５Ｇｃ糖タンパク質を含有しない哺乳類細胞（ヒドロキシラーゼ欠損体）がそこで哺乳類細胞として用いられることを特徴とする方法、並びにこのような細胞及びそのように産生される組換え体糖タンパク質である。本発明の詳細な説明本発明は、ヒドロキシラーゼ活性を有する組換え体タンパク質を包含する。本タンパク質はそのＤＮＡ配列により、及びそれに由来するアミノ酸配列により限定される（例えば配列番号：２参照）。ヒドロキシラーゼタンパク質は、個体によって異なる天然対立変異体で生じ得る。アミノ酸のこのような変異は一般にアミノ酸置換である。しかしながら、それらは全体配列へのアミノ酸の欠失、挿入又は付加であってもよい。本発明のヒドロキシラーゼタンパク質は、程度及び種類に関して、それが発現される細胞及び細胞型によって、グリコシル化又は非グリコシル化形態である。「ハイブリダイズ」という用語は、下記のような標準緊縮ハイブリダイゼーション条件下でのこのような配列と配列番号：１との結合を意味する。ヒドロキシラーゼは現在、組換え法により製造し得る。非グリコシル化ヒドロキシラーゼは、原核細胞中で組換え的に産生される場合に得られる。本発明により提供される核酸配列の助けを借りて、あらゆる哺乳類細胞及び組織のゲノムにおける、好ましくはヒドロキシラーゼに対して陽性である細胞又は組織（例えば肝細胞及び顎下腺）中のヒドロキシラーゼ遺伝子又はその変異体を探して、これらを同定し、ヒドロキシラーゼをコードする所望の遺伝子を単離し得る。このような工程及び適切な標準緊縮ハイブリダイゼーション条件は当業者には公知であって、例えばJ．Sambrook(1989)（２２）及びB.D．Hames，S.G．Higgins(1985) （２３）により記載されている。この場合、これらの印刷物に記載された標準プロトコールは通常、実験用に用いられる。特に参照されるものは、核酸分子のハイブリダイゼーションに関しては第ＩＸ節 "Hybridization of radiolabeled pr obes to immobilized nucleic acid"，pp947-962、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに関しては第ＸＩ節 pp1145-1161,"Condition for h ybridization of oligonucleotide probes" で、両引用文献の記載内容は参照により本明細書中に含まれる。標準緊縮条件下は、例えばHoltke and Kessler(199 0)（２４）も記載している。さらに、本明細書中で用いられるような緊縮条件は、１mol/1 ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ及び10％硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーションを指す。この後に２ｘＳＳＣ中で室温で濾紙を５分間２回洗浄し、最後に３０分間１回洗浄する。この最終洗浄は、０．５ｘＳＳＣ，0. 1 ％ＳＤＳで、さらに好ましくは０．２ＳＳＣ，0.1 ％ＳＤＳで、最も好ましくは０．１ｘＳＳＣ，0.1 ％ＳＤＳで、65℃で実施する。他の条件も同程度の緊縮性をもたらし、「緊縮条件下」という語句に包含され、本明細書に包含される、と当業者は認識する。ヒドロキシラーゼに対して陽性デアル細胞及び組織は、ヒドロキシラーゼに特異的な抗体により同定される。このような特異的抗体は、Schlenzka 等（２０）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）にしたがって容易に産生し得る。組換え体ＤＮＡ技術の使用は、多数のヒドロキシラーゼ誘導体の産生を可能にする。このような誘導体は、例えば置換、欠失又は付加により個々の又はいくつかのアミノ酸で修飾される。誘導は、例えば特定部位の突然変異誘発により実施し得る。このような変異は、当業者には容易に実行可能である（J．Sambrook（２２），B.D. Hames（２３））。ヒドロキシラーゼ活性の特徴的属性が保存されることが保証されねばならないだけである。したがって、本発明は以下の：ａ）外生的ＤＮＡの原核又は真核細胞発現の生成物であり；ｂ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃへの転化を触媒し；ｃ）配列番号：１に示されるＤＮＡ配列によりコードされるか又は配列番号：１を完全に又はその少なくとも98％を含み；ｄ）緊縮条件下で配列番号：１とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ；あるいはｅ）遺伝子暗号の縮重が認められない場合には緊縮条件下でｃ）〜ｄ）に明示された配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる単離ヒドロキシラーゼを包含する。配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７により、又は遺伝子暗号縮重により同一アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質が好ましい。本発明はさらに、ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質の原核又は真核宿主細胞中での発現を保証し、以下の：ａ）配列番号：１に示されるＤＮＡ配列、少なくとも98％が配列番号：１と相同であるＤＮＡ配列、又は相補的配列；ｂ）緊縮条件下で配列番号：１とハイブリダイズする核酸配列；あるいはｃ）遺伝子暗号の縮重が認められない場合には緊縮条件下でａ）又はｂ）に記載された配列の１つとハイブリダイズする核酸配列から成る群から選択される核酸分子に関する。好ましくは、核酸分子は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃへの転化を触媒するタンパク質をコードする。これらの核酸分子の助けを借りて、再現可能な方法で且つ大量に、本発明のタンパク質を生成し得る。このためには、原核又は真核生物細胞、例えば原核宿主細胞又は真核宿主細胞中での発現に関して当業者に公知の方法により、核酸分子は適切な発現ベクター、例えば外生的核酸分子中に一体化される。このような発現ベクターは、好ましくはコード配列が操作可能的に連結される調節可能性／誘導可能性プロモーターを含有する。次に、これらの組換え体ベクターを発現のために適切な宿主細胞、例えば原核宿主細胞として大腸菌、あるいは真核宿主細胞としてビール酵母菌、奇形癌細胞株ＰＡ−１ｓｃ９１１７（Buttner et al.(1 991)（２５））、昆虫細胞、例えばＳｆ９、及びバキュロウイルスベクターでトランスフェクトされた全昆虫細胞、ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞、並びに形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を、異種遺伝子の発現を可能にする条件下で培養する。タンパク質の単離は、公知の方法にしたがって、宿主細胞から、又は宿主細胞の培養上清から実施し得る。このような方法は、例えばAusubel I．and Frederick M.( 1992)（２６）により記載されている。さらに、例えば原核細胞中での発現後に不溶性及び不活性タンパク質が生成された場合には、タンパク質のin vitro再活性化を要することがある。ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードし及び／又は配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７から成る核酸分子は、好ましくは本発明のタンパク質の組換え体産生に用いられる。ヒドロキシラーゼを特異的にコードする核酸分子を検出するために用い得る、本発明により提供されるヒドロキシラーゼの核酸配列を基礎にした試験を提供し得る。このような試験は、例えば細胞又は細胞溶解物で実施し得る。このような試験は、核酸診断によって実施し得る。この場合、試験される標本を、ヒドロキシラーゼに特異的な配列を有するヒドロキシラーゼをコードする核酸分子（配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７）とハイブリダイズするプローブと接触させる。プローブと標本からの核酸分子との間のハイブリダイゼーションは、発現されたヒドロキシラーゼの存在を示す。このような方法は当業者には公知であって、例えばWO 89/06698（２７）、欧州特許出願第0 200 362 号（２８）、米国特許第2,915,082 号（２８）、欧州特許出願第0 063 879 号（３０）、欧州特許出願第0 173 251 号（３１）、欧州特許出願第0 128 018 号（３２）に記載されている。本発明の好ましい実施態様では、ヒドロキシラーゼをコードする標本の核酸分子を試験前に、例えば十分公知のＰＣＲ技法により増幅する。誘導化（標識化）核酸プローブは、一般に核酸診断の分野に用いられる。このプローブを標本からの担体結合変性ＤＮＡ又はＲＮＡと接触させ、この工程で、核酸分子標本の長さ及びその結果生じる予測ハイブリッドの融解温度によって、標識化ＤＮＡ又はＲＮＡが相同ＤＮＡ又はＲＮＡと結合し得る様な方法で、温度、イオン強度、pH値及びその他の緩衝条件を選択する（ハイブリダイゼーション：J．Mol．Biol．98(1975)，503（３３）；Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76(1979)，3683（３４）参照）。適切な担体は、ニトロセルロースを基礎にした膜又は担体物質（例えばSchleicher and S chull，BA 85，Amersham Hybond，C．）、粉末形態の強化又は結合ニトロセルロース、あるいは種々の官能基（例えばニトロ基）で誘導されるナイロン膜（例えばSchleicher and Schull，Nytran; NEN，Gene Screen; Amersham Hybond M.; P all Biodyne ）である。次に、非特異的結合を阻止するために徹底的洗浄及び飽和後、担体を抗体又は抗体断片とともにインキュベートすることによりハイブリッド化ＤＮＡ又はＲＮＡを検出する。抗体又は抗体断片は、誘導化中に核酸プローブに取り込まれる物質に向けられる。抗体は順次標識化される。しかしながら、直接標識化ＤＮＡを用いることもできる。抗体とのインキュベーション後、特異的結合抗体抱合体を検出するだけのために、それを再び洗浄する。次いで、十分公知の方法にしたがって、抗体又は抗体断片の標識により確定を実行する。ヒドロキシラーゼ発現の検出は、例えば以下のように実施し得る： −固定組織スミア及び単離中期染色体を用いた固定全細胞とのin situ ハイブリダイゼーション； −コロニーハイブリダイゼーション（細胞）及びプラークハイブリダイゼーション（ファージ及びウイルス）； −ノーザンハイブリダイゼーション（ＲＮＡ検出）； −血清分析（例えばスロット−ブロット分析による血清中の細胞の細胞型分析）； −増幅後（例えばＰＣＲ技法）。ヒドロキシラーゼは好ましくはｍＲＮＡレベルで調節されるため、ヒドロキシラーゼ発現を検出するためには、検査される細胞のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを実施するのが好ましい。したがって、本発明は、ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする核酸分子の検出方法であって、検査される標本が配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７とハイブリダイズする核酸分子又は特異的オリゴヌクレオチドから成る群から選択される核酸プローブとインキュベートされ、核酸プローブが標本からの核酸分子とインキュベートされ、そして標本中の核酸分子と核酸プローブとのハイブリダイゼーションが所望によりさらに別の結合相手を介して検出されることを特徴とする方法を含む。そうでなければ休眠状態のヒドロキシラーゼ遺伝子の異常活性化が哺乳類腫瘍で見出されるので、このような検定は腫瘍診断において有益な試験である。本発明の別の特徴は、哺乳類細胞中出のヒドロキシラーゼの発現を特異的に阻害するオリゴヌクレオチド分子である。約１５〜１７ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオチド分子は全ヒトゲノムと比較して独特の配列を有するに違いなく、したがって特異的であるということが判明している。さらに、短アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞中に持ち込まれ、阻害を示すことが示された（Zame cnik et al.(1986)（５８））。特に、１５〜５０塩基、好ましくは１５〜２５塩基を有するオリゴヌクレオチド分子が使用に適している。本発明のさらに別の実施態様は、哺乳類ヒドロキシラーゼの核酸分子に特異的であるように、配列番号：１の一部又は全部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子である。したがって、哺乳類ヒドロキシラーゼ遺伝子の上記配列と相補的で且つそれを基礎にして設計されるこのようなオリゴヌクレオチド分子が、in vivo での及び単離哺乳類細胞中のヒドロキシラーゼの発現を阻害するのに有用である。「哺乳類ヒドロキシラーゼの核酸分子に特異的であるようにハイブリダイズする」とは、哺乳類細胞、特にヒト細胞中のこのような核酸分子又はオリゴヌクレオチド分子が上記の細胞中のヒドロキシラーゼをコードする核酸分子と結合することを意味する。特異的結合は、これらの核酸分子が注目すべきやり方で、そして細胞の他の代謝工程が損傷されないような方法で、ヒドロキシラーゼの発現を阻害する（50％以上、好ましくは80％以上又は90％以上）場合に認められる。ヒドロキシラーゼ核酸分子と特異的にハイブリダイズするためのオリゴヌクレオチド分子又は核酸分子は、少なくともその本質的部分で、配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７のコード領域の配列と相補的である。標準ハイブリダイゼーション条件は、前述のSambrook et al.(1989)（２２）に記載されている。好ましいオリゴヌクレオチド分子は、ヒドロキシラーゼｍＲＮＡとの結合によりヒドロキシラーゼｍＲＮＡのタンパク質への翻訳のような工程で、配列特異的に、妨害される。使用に適したさらに別のオリゴヌクレオチド分子は、三重螺旋構造を形成する場合に相互作用し得るゲノムＤＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド分子である（M．Cooney et al.(1988)（３５）及びDuvall-Valentine et al.( 1992)（３６））。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子として、好ましくはオリゴヌクレオチド誘導体、例えばホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロチオエート又は置換オリゴヌクレオチド、例えばアクリジン、挿入結合オリゴヌクレオチド又はαアノマー（J.J．Toulme and C．Helene(1988)（３７））が用いられる。ホスホロチオエート及びメチルホスホネートが特に好ましい。このようなオリゴ誘導体は、当業界の形成にしたがって、例えば自動化技術により合成し得る（S ．Beaucage and M．Caruthers(1981)（３８）;G．Zon and T．Geiser(1991)（３９）；C.A．Stein et al.(1991)（４０）；P．Miller(1991)（４１））。特にホスホチオエート及びメチルホスホネートは、それらが血清及び細胞内ヌクレアーゼに対して耐性であるために、有用なオリゴヌクレオチドである。ヌクレアーゼ耐性であるさらに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、P.S．Miller et a l.(1985)（４２）に記載されている。大体において、細胞に非特異的に取り込まれるために、本発明の裸のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い得る。しかしながら、このようなオリゴヌクレオチドは低効率で細胞中で一体化される。したがって、概して、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はターゲッティングベクターに関する供給系は、特にin vivo 使用のために好ましい。 in vitroの哺乳類細胞、特にハムスター細胞のトランスフェクションは、当業界で公知の方法により、例えば電気穿孔法又はマイクロインジェクションにより達成される。トランスフェクション後、ヒドロキシラーゼ活性を欠いた細胞を、例えば単一細胞分離により分離し、その後、例えばウエスターンブロティングによりこれらの細胞中のヒドロキシラーゼ活性を確定する。この方法により、本発明は常態で（その初期未修飾状態で）ヒドロキシラーゼ活性を有する哺乳類細胞の突然変異体を提供するが、上記の突然変異体はヒドロキシラーゼ活性を欠いている。常態でヒドロキシラーゼ活性を有する細胞は、ほとんどが非ヒト細胞、例えばハムスター、マウス、ラット、ブタ細胞、そしてそれから誘導されるハイブリドーマである。「ヒドロキシラーゼ活性を欠く」という用語は、非突然変異化初期細胞と比較して、ヒドロキシラーゼ活性が約80％、好ましくは90％以上低減されたことを意味する。ヒドロキシラーゼ活性の確定は、L．Shaw et al.(1994)（１４）に記載されているような酵素検定により成し遂げるのが適している。このようなヒドロキシラーゼ欠損哺乳類細胞は、核酸分子に特異的であるように緊縮条件下で配列番号：１又は関連ＲＮＡ種とハイブリダイズする核酸分子で上記の細胞をトランスフェクトすることにより産生し、上記のヒドロキシラーゼ活性を欠いた少なくとも１つの細胞を細胞混合物から単離することにより産生される。このような細胞は、好ましくは非ヒト細胞株における糖タンパク質の組換え体産生に用い得るし、それにより細胞産生性糖タンパク質はＮ−グリコリルノイラミン酸を含有しない。本発明の方法は、糖タンパク質、例えばエリトロポイエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭｅｇＣＳＦ又はトロンボポイエチン）の産生に用い得る。本発明はさらに、Ｎ−グリコリルノイラミン酸の付着を伴わない、他のヒトタンパク質を実質的に、好ましくは全く含まない組換え体糖タンパク質を包含する。ヒドロキシラーゼ活性を欠く細胞は、好ましくは相同組換えにより産生される。このような方法は、例えば米国特許第5,272,071 号（７５）、M.R．Capecchi( 1989)（７６）、G.Y．Wu et al.(1991) （７７）及びWO 91/13151（７８）に記載されている。相同的組換えに関しては、高ターゲッティング頻度を有するために、できるだけ多くのヒドロキシラーゼ相同を含有するターゲッティングベクターを用いるのが好ましい。ターゲッティングベクターは、相同的組換え後、もはやイカナルタンパク質も、又は単に無視できる量のタンパク質が標的化細胞がヒドロキシラーゼ活性を欠くように標的化細胞中に生成されるように、ヒドロキシラーゼ遺伝子を修飾するものである。このヒドロキシラーゼ配列又はその一部が選択可能な遺伝子、例えばＮｅｏＨＰＲＴにより中断されるベクターを用いるのが特に好ましい。細胞としては、特に選択されるハムスター細胞、例えばＣＨＯ、特にジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ遺伝子）を欠く細胞がある。このようなＤＨＦＲ欠損細胞は、例えば米国特許第4,399,216 号（７９）及び第4,634,665 号（８０）に記載されている。最も好ましくは、ヒドロキシラーゼ遺伝子の配列は、ヒドロキシラーゼ遺伝子のＮ末端のノックアウトにより操作される。ヒドロキシラーゼ遺伝子のＮ末端は、Rieske鉄−硫黄センター及び／又はＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸結合モチーフを含有するか、あるいはRieske鉄−硫黄センター及び／又はＣＭＰ−Ｎ− アセチルノイラミン酸結合モチーフの上流に位置し得る上記のＮ末端領域並びに上流領域を特徴とする（W．Schlenzka et al．（８５））。Ｎ末端の最初の５０アミノ酸以内でノックアウト操作を実施するのが、特に好ましい。このような操作は、配列中のヌクレオチドの修飾、欠失又は挿入により実行し得る。しかしながら、ヒドロキシラーゼ遺伝子の発現が90％以上、好ましくは98％又はそれ以上低減されるような操作である必要がある。したがって、本発明の細胞は、ヒドロキシラーゼ発現が上記のように低減されるようなヒドロキシラーゼ遺伝子のＮ末端部分の修飾を含有する。ターゲッティングベクターは、好ましくは約５〜10 kB のゲノムＤＮＡ配列を含有する。この配列は、遺伝子のイントロン及びエキソンを有し、さらに５’− 又は３’−非コード配列を含有し得る。好ましくは、突然変異化される細胞（例えばＣＨＯ）からのゲノムＤＮＡを用いる。しかしながら、対応する相同性に関しては、別の種の細胞からのゲノムＤＮＡを用いる。ゲノムＤＮＡのクローニングは、配列番号：１由来のＤＮＡ標本を用いたλ−ＤＮＡのスクリーニングにより成し遂げ得る。さらに、ターゲッティングベクターは好ましくは選択可能な人工マーカーを含有する。正の選択を行うには、例えばＧ−４１８選択を可能にするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）が適用される。このマーカーの使用により、ターゲッティングベクターＤＮＡを含有する細胞を単離し得る。本マーカーは、例えばコードエキソン中でクローニングされるか又はコードエキソンを取り換える場合には、突然変異誘発物質としても適用し得る。負の選択を行うには、例えばAcyclovir 又はGanciclovir を生じる単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を用い得る。この負のマーカーは、相同的組換えの場合に標的細胞のＤＮＡに一体化されないようにターゲッティングベクター中に取り込まれる。２種類のターゲッティングベクターが適用される：即ち置換ベクター又は挿入ベクターである。それらはその構造が独特で、相同的組換え後、異なる一体化生成物を生じる（A.L．Joyner(1993)（８１））。これら２つのベクターを、図１に示す。細胞のヒドロキシラーゼ遺伝子にターゲッティングする方法としては、マイクロインジェクション又は電気穿孔法が好ましい。導入されたマーカー遺伝子に関する選択によるか又はＰＣＲ検定によって、標的化クローンを検出する。このＰＣＲ検定に関しては、２つのプライマーを用いる：即ちプライマー１は標的遺伝子座に特異的で、好ましくは細胞のゲノム中のターゲッティング断片の５’末端の約４００bp上流であり、プライマー２は入ってくるＤＮＡに特異的である。特異的ＰＣＲ増幅は、ターゲッティングがこれら２角プライマーを並列する場合にのみ起こり得る。約200 の別々のクローンを含有し、マーカー活性を示すＰＣＲ陽性プールから、標的化クローンを単離した。このプールからの細胞を、各々の中に約１０個の細胞を含む９６の小プール中に希釈した。増殖後、ターゲッティングの存在に関してＰＣＲにより、これらの小プールを再スクリーニングした。ここで、陽性シグナルは、非標的化細胞１０個毎に１個の標的化細胞を有する混合物に対応した。次に濃縮プールの１つを微小滴定皿中で希釈して、ウエルの10〜20％だけが１個の細胞を受容するようにした。十分な密度に増殖後、標本を取り出して、ＰＣＲ検定により再び分析した。この方法により、陽性標的化細胞のクローンが単離された。さらに分析するために、標的化クローンの１単離物を増殖させて、サザーンブロット分析用のゲノムＤＮＡの調製に用いた。本発明のさらに別の目的は、ヒドロキシラーゼの核酸分子に特異的であるようにオリゴヌクレオチド分子結合剤と結合した配列番号：１の一部又は全部とハイブリダイズし、細胞外条件下でオリゴヌクレオチド分子を結合し、ヒドロキシラーゼ核酸分子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド分子として細胞内条件下で上記のオリゴヌクレオチド分子を放出する本発明のオリゴヌクレオチド分子をターゲッティングするための可溶性複合体である。このような供給系は、当業界で十分公知である。例えば、オリゴヌクレオチドはポリカチオン、例えばポリリシンと共有結合する（M．Lemaitre et al.(1987) （４３））。さらにポリカチオン抱合体（例えばトランスフェリン）を用いた供給系が、WO 92/20316（４４）、米国特許第5,166,320 号（４５）、WO 92/19281 （４６）、WO 92/13570（４７）、欧州特許出願第0 388 758 号（４８）、WO 93 /07283（４９）、WO 92/17210（５０）、WO 91/17773（５１）、WO 93/04701（５２）に記載されており、並びにPCT/EP94/01147（５３）に明示されている転移ペプチドも使用に適している。細胞中の本発明の核酸分子のインターナリゼーションの効能は、核酸分子を複合体中のポリエチレングリコールのような両親媒性分子と結合させることにより、改良し得る。さらに好ましいのは、トランスフェクション試薬、例えばＤＯＴＭＡの使用である（WO 91/06309（５４）及びWO 91/17424（５５））。リポソーム及びデンドロマーも有用である。細胞特異性を獲得するために、ＤＮＡ結合物質（例えばポリカチオン）からの抱合体及び／又は細胞特異性配位子と本発明の核酸分子とを非共有的に結合させる（Wu and Wu(1987)（５６）；Wu et al.(1988)（５７））。さらに、配位子としてマンノース及びラクトースを含有する化学合成抱合体から成る可溶性ＤＮＡ担体系により、細胞中の核酸分子のインターナリゼーションを成し遂げる（P. M idoux et al.(1993)（５８））。欧州特許出願第0 388 758 号（４８）は、ポリアニオン性核酸分子との複合体を構成する化学合成トランスフェリンポリカチオン抱合体を開示する。トランスフェリン受容体との結合により、これらの複合体は標的細胞中にインターナライズされる。複合体中にポリリシンとアシアロ糖タンパク質の抱合体（Wu et al.(1988)（５７））を、又はガラクトース配位子（Plank et al.(1992)（５９））とともに用いることも公知である。配位子としては、不活性化アデノウイルス（Cotten et al.(1992)（６０）；Wagner et al.(1992)（６１））又はヘマグルチニン注入ペプチド（Wagner et al.(1992)（６２））も用いられた。WO 93/0 7283（４９）はさらに、非ウイルス性遺伝子転移に関して、ＤＮＡ結合（ポリカチオン）部分（核酸分子に対する親和性を有する物質）及び細胞中のＤＮＡ取込みのためのインターナリゼーション因子から成る「２配位子系」を記載する。エンドソームから細胞質中に複合体を放出するために、WO 93/07283（４９）に記載されているように、例えばウイルス又はウイルス成分（例えばアデノウイルス又はインフルエンザヘマグルチニン）に対応するいわゆるエンドソーム溶解剤をこれらの複合体に付加し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、好ましくは配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７の一部又は全部と適切にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが選択される。オリゴヌクレオチドのための担体が細胞特異的配位子及びＤＮＡ結合物質からの抱合体である場合、これらの物質は共有結合するのが好ましく、結合は典型的にはペプチド結合である。これは、G．Jung et al.(1981)（６３）に記載されているように、例えば水溶性カルボジイミドを用いて生成される。代替的結合は、ジスルフィド結合である。細胞特異性作因は、天然又は合成配位子（例えば、タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質等）であるか、あるいは細胞表面構造と特異的に結合し、次いで結合複合体のインターナリゼーションを媒介する抗体又はその類似体でもよい。このような抗体は、例えば抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体である。結合後、これらの抗体はインターナライズされる。典型的には、細胞特異的結合剤は細胞表面受容体と結合する配位子である。好ましくは、用いられる受容体は、治療すべき腫瘍を生じる組織細胞に特異的な受容体である。転移の可能性が高い腫瘍性疾患（小細胞肺癌、髄芽腫、ウィルムス腫瘍及びリンパ様腫瘍）の治療には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるのが特に好ましい（W.F．Kern et al.(1993)（６５））。表面受容体として用いるのに適した腫瘍抗原は、例えば腫瘍抗原である。さらに、用いられる細胞特異的配位子は、本発明のオリゴヌクレオチド分子のインターナリゼーションを促す物質として作用するのが好ましい。このようなインターナリゼーション因子は、例えばトランスフェリン又は抗ＣＤ４抗体である。複合体中の細胞特異的結合剤対オリゴヌクレオチド分子及びオリゴヌクレオチド結合剤の任意の比率は、経験的に確定し得る。ポリカチオンを用いる場合、成分のモル比は、ポリカチオンのサイズ及びオリゴヌクレオチドのサイズによって変化する。複合体を生成するには、オリゴヌクレオチド分子及び担体を混合し、複合体化を実行可能な条件下でインキュベートする。例えば、オリゴヌクレオチド分子及び担体を2 mol/l ＮａＣｌ中で適切な比率で混合し、溶液を0.15 mol/l に希釈して、濾過し、投与可能な組成物を提供する。本発明のオリゴヌクレオチド分子又は分子複合体は、非経口的に投与し得る。好ましくは、それは静脈内に注入される。複合体は、生理学的に許容可能なビヒクル中の溶液で投与される。配列番号：１のヌクレオチド１５０〜１９８６を含有するベクターｐＷＳＰＨ．０１は、ブダペスト条約下で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Z ellkulturen GmbH（ＤＳＭ）,Mascherod er Weg 1b，D-38124 Braunschweig に1995年 5月24日に寄託され、寄託番号ＤＳＭ10009 とされた。配列番号：１のヌクレオチド１〜２１１を含有する第二のベクターｐＷＳＰＨ．０３は、ブダペスト条約下で Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Z ellkulturen GmbH（ＤＳＭ）,Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig に19 95年 5月24日に寄託され、寄託番号ＤＳＭ10010 とされた。ＤＮＡ配列のシーケンシングにおける小エラーの発生を除外し得ないという事実のため、ベクターｐＷＳＰＨ．０１及びｐＷＳＰＨ．０３に含まれる配列と配列番号：１で提示される配列との間のあらゆる不一致の事象において、当業者に許容可能な上記のベクターからの配列が頼みとされる。本発明の理解を助けるために、以下の実施例、参考文献及び配列表、並びに図面は、本発明の理解を提示するが、本発明の真の範囲は貼付の請求の範囲に記載されている。本発明の精神を逸脱しない限り、前記の手順の修正が成され得ると理解される。図面の説明図１：ヒドロキシラーゼ欠損宿主細胞の産生に有用なベクター。太線は標的遺伝子座（ヒドロキシラーゼ遺伝子）と相同関係にあるベクターを示す。細線は、細菌プラスミド配列（例えばｐＵＣ）を示す。水玉模様の長方形はヒドロキシラーゼエキソンを表す。正の選択マーカーは「＋」の記号で示す。Ａ）置換ベクター：正の選択マーカーは、ゼロ突然変異体を獲得するために、好ましくは上流エキソンで、ヒドロキシラーゼ遺伝子の標的相同部分を中断する。負の選択マーカーは「−」の記号で示す。置換ベクターは標的相同領域の外側にトランスフェクション前に線状化される。Ｂ）挿入ベクター：正の選択性マーカーは、ヒドロキシラーゼ相同配列中で又はベクターバックグラウンド中でクローン化される。相同ターゲッティング配列内での二本鎖中断は、トランスフェクション前に挿入される。電気穿孔法により、産生細胞株中にターゲッティングベクターが挿入される。ＤＮＡ（サザーンブロット、ＰＣＲ）、ＲＮＡ（ノーザンブロット）及びタンパク質分析により、ヒドロキシラーゼ遺伝子が首尾よく突然変異したか否かを実証し得る。無傷対立遺伝子が細胞中に残存するという事象では、代替的選択マーカーを用いて、別のノックアウト調製を実施し得る。配列表配列番号：１は、ヒドロキシラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド及び推定上のタンパク質配列を示す。配列番号：２は、ｃＤＮＡから推定されるタンパク質配列を示す。実施例１ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの精製４℃で全手順を実施した。ブタ顎下腺を新鮮な屠殺動物から取り出して、−20 ℃で冷凍保存した。解氷組織を細かく刻み、Ultraturrax を用いて50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4)（5 ml/ 湿潤質量の組織１g ）中で均質化した。その結果生じたホモジネートを10,000 gで30分間遠心分離し、ペレットを捨てた。50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）中に溶解した２％（質量）臭化Ｎ−セチル −Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムを付加して（最終濃度0.2 ％）、100,000 g で１時間遠心分離することにより、10,000 g上清中のムチン及び残りの粒状物質を沈殿させた。ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼをこの高速上清から精製した。オルシノール試薬を用いたシアル酸の定量（R．Schauer et al.(1978)（８２））により、ムチン含量を概算した。 10 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）で平衡させたQ-Sepharose スラリー 3 00 ml を用いて、バッチ法でムチン無含有高速上清（１．１１）を分別した。各工程に関しては、75 g で 5分間の遠心分離により、Q-Sepharose を沈殿させた。10 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）1.75 l でSepharose から非結合タンパク質を除去し、ヒドロキシラーゼ活性を含む結合タンパク質を400mM ＮａＣｌを含有する 10mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）500mlで溶離した。 50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH7.4）で４倍希釈後、Q-Sepharose 溶離液を1 00 mMＮａＣｌを含有する50mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）で平衡させたCi bacron Blue 3GA −アガロースカラム（5 ｘ 11cm）に適用した。流速は約 2 ml /分であった。非結合タンパク質を平衡緩衝液で除去し、カラムを50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）中の0.1 〜1.5 M ＮａＣｌ線状勾配1.2 l で展開させた。最大ヒドロキシラーゼ活性を有する分画をプールし、濃縮して、脱塩後、流速 0.1 ml/分で50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）で平衡させた Reactive Brown 10 −アガロース（1.5 ｘ 5.5 cm ）に適用した。平衡緩衝液で洗浄後、平衡緩衝液中の0 〜2 M ＮａＣｌ線状勾配120 mlで溶離した。最大活性分画をプールし、濃縮後、硫酸アンモニウムを付加して41％飽和液とし、標本を41％飽和で硫酸アンモニウムを含有する50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）中に平衡させたヘキシル−アガロース（1.5 ｘ6.0 cm）のカラムに適用した。平衡緩衝液でカラムを洗浄後、 50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）中の41〜0 ％飽和の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の線状勾配 140mlで、流速 1 ml/分で結合タンパク質を溶離した。容積200 μl に濃縮後、脱塩ヘキシル−アガロースプールを用いて、Sepharos e S.12上での最終精製を実施した。Sepharose S.12カラムを100 mM ＮａＣｌを含有する50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）中で平衡させ、シトクロムｃ（ 12.5 kDa）、カルボニックアンヒドラーゼ（29 kDa）、オボアルブミン（45 kDa ）及びウシ血清アルブミン（66 kDa）で校正した。流速は0.2 ml/ 分であって、分画 200μl を収集した。 Bio-Rad 試薬（Bio-Rad，Munich，FRG）を用いて、Bradford(1976)の方法により、タンパク質濃度を測定した。10又は20 kDaのＭｒカットオフ（Sartorius，G ottingen，FRG）を用いた膜上での限外濾過により、タンパク質標本を濃縮した。４％積重ねゲル及び13％分解ゲルから成るゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、各精製工程の標本を分析した。実施例２ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼのクローニング３つのアミノ酸配列（ペプチド１、２及び５）を用いて、ブタにおけるコドン使用を考慮して、両配向に関する変性オリゴヌクレオチドプライマーを調製した。ブタ顎下腺からのｍＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに転写した。このｃＤＮＡ及びプライマーを用いて、種々の条件でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を実施した。その場合、考え得るプライマーの全組合せを第一反応シリーズで調べた。これらの調製物から得られる生成物を、逆プライマーを交換する（入れ子プライマー）ＰＣＲ反応の第二シリーズに適用した。その場合、２つのＰＣＲ生成物（９６bp及び４１１bp）を得たが、これらは以下のオーダーのペプチドを示唆する：ペプチド１、２及び５。大腸菌ＸＬ１ブルー株細胞中の電気穿孔によるｐＵＣベクター中への結紮後、９６bpのサイズのＰＣＲ生成物を形質転換した。陽性クローンのプラスミド挿入物をシーケンシングした。それから得られるタンパク質配列は、プライマーを調製するのに用いたペプチド片２及び５の領域、並びに隣接領域を含有する。したがって、このＰＣＲ生成物はヒドロキシラーゼ遺伝子の一部である。ブタ顎下腺のｍＲＮＡから、λ−ファージＺＡＰＩＩ（Stratagene）中にオリゴ（ｄｔ）−プライムドｃＤＮＡライブラリーを調製した。９６bpＰＣＲ生成物を、ジゴキシゲニンで標識後、ブタ顎下腺からのこのｃＤＮＡライブラリー内での探査のためのプローブとして用いた。その場合、いくつかの陽性クローンが見出された：約1800bpの長さのこれらのクローンの内の最長のものを特性表示し、シーケンシングした。ヌクレオチド配列では、５’末端で開放される約１２７０bpの読取り枠が見出された。そこから得られるペプチド配列は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃヒドロキシラーゼの公知の全ペプチド片を含有する。これは、見出されたクローンがヒドロキシラーゼタンパク質の約80％をコードすることを確証する。実施例３大腸菌中での無融合ヒドロキシラーゼの組換え発現大腸菌中での有効な発現を可能にするように、ヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を修飾した。発現のために、発現プラスミドを適切な大腸菌株中にトランスフェクトさせた。このような菌株は、発現プラスミドｐ１１３７９のような１ａｃリプレッサーの制御下での発現プラスミドの使用の場合には、十分高い細胞内濃度の１ａｃリプレッサーを保有する。これらの種類の菌株は、ｐＲＥＰ４（Diagen GmbH）、ｐＵＢＳ５００又はｐＵＢＳ５２０（Bri nckmann et al.(1989)（６７））のような二次プラスミドのトランスフェクションにより調製し得る。適用大腸菌株は、好ましくは、例えば大腸菌ＵＴ５６００（Earhart et al.(1979)（６７））、大腸菌ＢＬ２１（Grodberg and Dunn(1988 )（６８））又は大腸菌Ｂを用いた場合と同様に、細胞固有の低プロテアーゼ活性を有する。次に、当業界の形成にしたがって、発現培養を実施した。回収のために、大腸菌からタンパク質集合体として得られたヒドロキシラーゼを、欧州特許第0 241 022 号（６９）、欧州特許第0 364 926 号（７０）、欧州特許第0 21 9 874 号（７１）及び独国出願第40 37 196 号（７２）に記載された手順にしたがって、処理した。詳細には、例えばこのために以下の手順を適用した：大腸菌発酵物からのヒドロキシラーゼ含有タンパク質集合体（いわゆる「封入体」）を6 M 塩酸グアニジニウム、100 mM Tris-HCl，pH 8、1 mM ＥＤＴＡ中に溶解し、その後pH 3〜4 に調整し、pH 3.5で 4 M 塩酸グアニジニウムに対して透析した。次いで、1 M アルギニン，pH 8、1 mM ＥＤＴＡ、5 mM ＧＳＨ（グルタチオン、還元型）及び0.5 mM ＧＳＳＧ（グルタチオン、酸化型）中で、可溶化タンパク質の再生を実施した。再生調製物から、例えばFractogel TSK Butyl（E．Merck，Darmstadt ）のような疎水性ゲルマトリックスに吸着させることにより1.4 M 硫酸アンモニウムを付加し、その後20mM Tris-HCl，pH 7中で溶離後、ヒドロキシラーゼを得た。実施例４哺乳類細胞におけるヒドロキシラーゼの組換え発現このために、強プロモーター−エンハンサー系を基礎にして、ｃＤＮＡをそれが哺乳類細胞中に転写されるベクター中に結紮した。このようなプロモーター及びエンハンサーはほとんどが、ＳＶ４０、ｈＣＭＶ、ポリオーマ又はレトロウイルスのようなウイルスからのものであった。代替物として、例えばＷＡＰ−、ＭＭＴＶ−又は免疫グロブリンプロモーターのようなある種の細胞又は組織に特異的なプロモーター−エンハンサー系、あるいは例えばメタロチオネインプロモーターのような誘導可能な系を適用し得る。この種のベクターは、ヒドロキシラーゼｃＤＮＡ（後者を用いる場合）をＲＮＡプロセッシングに関する供与体及び受容体シグナル、並びにポリ−Ａ付加に関するシグナルとともに補足する。例えば、ｐＣＭＸ−ｐＬ１（Umisono et al.(1991)（７３））はこのような適切なベクターである。このベクターの１つのそして唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に、ＥｃｏＲＩリンカーにより提供されるヒドロキシラーゼｃＤＮＡを結紮するが、この場合、ヒドロキシラーゼｃＤＮＡがＣＭＶプロモーターの読み取り方向に配向されることが、このベクターのポリリンカーの他の切断部位の助けを借りた制限分析により確証される。他のベクター中への、例えばｐＣＤＮＡ３（In vitrogen，San Diego/USA ）又はｐＳＧ５（Stratagene，LaJolla/USA ）中へのクローニングの場合には、全く類似した手法を適用した。そのようにして得られた発現プラスミドのＤＮＡを大腸菌から調製し、特定の場合における細胞型に特異的な技法を適用して、哺乳類細胞中にトランスフェクトした（Methods of Enz ymology 185(Gene Expression Technology)，ed．David V．Goeddel，Acacemic Press 1991，section（７４））。トランスフェクション後、細胞をウシ胎仔血清を付加しないＭＥＭ（Gibco）中で培養し、それにより48時間後に、細胞培養上清中でヒドロキシラーゼを検出した。実施例５診断のためのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化ＲＮＡプローブプローブを調製するために、ハイブリダイゼーションに用いられる断片を適切な転写ベクター（Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターを有する）中でクローニングした。標識化のために、プラスミド１〜2 μg を線状化し、次いでフェノール／クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈殿させた。反応バッチ：ＤＮＡ（ＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏ中に溶解）1 〜2 μg 、10ｘ転写緩衝液（Boehrin ger Mannheim ）2μl 、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６）40U 、ＮＴＰ／ＤＩＧ−ＵＴＰ混合物（10mM ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、6.5 mM ＵＴＰ；3.5 mM ＤＩＧ−ＵＴＰ）2 μl 、及びＲＮアーゼ阻害剤（20Ｕ/ μl ）1 μ l にＨ₂Ｏを加えて容量を20μl とした。調製物を37℃で２時間インキュベートした。その後、ＲＮアーゼ無含有ＤＮアーゼ（10U/μl ）2 μl を付加し、さらに37℃で15分インキュベートすることにより、ＤＮＡを除去した。0.5 M ＥＤＴＡ（pH 8.0）1 μl を付加して反応を停止させ、合成されたＲＮＡを3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）0.1 容量及びエタノール 2.5 容量で沈殿させた。ＲＮＡを70％エタノールで１回洗浄し、乾燥し、次いで100 μl のＨ₂Ｏ（ＤＥＰＣ処理）中に溶解した。標識化標本及び標識化対照ＲＮＡの希釈シリーズをナイロン膜上に固定し、その後、実施例８に記載されているように、抗ＤＩＧ−Ｆａｂアルカリホスファターゼ抱合体で展開させて、標識化効率を測定した。実施例６ハイブリダイゼーション検定ナイロン膜上に固定された標本からのＲＮＡ又はＤＮＡをＤＩＧ−標識化ＲＮＡプローブとハイブリダイズした。ＲＮＡ及びＤＮＡに関して、同一条件下でハイブリダイゼーションを実施したが、但し、ＤＮＡ− ＲＮＡハイブリダイゼーションの場合にはハイブリダイゼーション温度を低くした。ハイブリダイズ緩衝液（50％ホルムアミド、50mM リン酸ナトリウム，pH 7.0 、7 ％ＳＤＳ、0.1 ％Ｎ−ラウロイルサルコシン、5 ｘＳＳＣ、2 ％遮断試薬（ Boehringer Mannheim ））中で1 〜2 時間（ＲＮＡ−ＲＮＡの場合は65℃、ＤＮＡ−ＲＮＡの場合には50℃）で、最初に膜が予備ハイブリダイズされた。ＤＩＧ標識化プローブとのハイブリダイゼーションは、16〜90時間、それぞれ65℃及び 50℃で実施した。直前に、プローブを98℃で５分間加熱し、その後氷上で冷却した。ハイブリダイゼーション後、2 ｘＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳ（周囲温度で）中で 5 分間、２回、0.1 ｘＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳ（65℃）中で15分間、２回、洗浄した。以下の手順を適用して、ハイブリダイズ化プローブの検出を実施した：１．緩衝液１（150 mM ＮａＣｌ、100 mM マレイン酸，pH 7.5）中で2 分間洗浄し；２．膜を緩衝液２（緩衝液１中の1 ％遮断試薬）中に30〜60分間浸潤させ；３．抗−ＤＩＧ−Ｆａｂアルカリホスファターゼ抱合体（緩衝液２中で1 ：10 ,000希釈；75 mU/ml）とともに30分間インキュベートし；４．0.3 ％ Tween-20 を含有する緩衝液１中で15分間、２回洗浄し；５．緩衝液３（100 mM ＮａＣｌ、100 mM Tris-HCl ，pH 9.5）中で２分間洗浄した。膜を、基質溶液（ＣＳＰＤ〔ジーナトリウム−３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ〔３．３．１．１^3,7〕デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート〕緩衝液３中で１：100 の比で希釈）と一緒にプラスチック箔中で合一させて、37℃で30分間インキュベートした。その後、基質溶液を箔から押し出して、箔を溶接で密封し、Ｘ線フィルム上での提示によりシグナルが示された。最適提示時間は、30分〜 2 時間であった。実施例７アンチセンスＤＮＡ及びヒドロキシラーゼ欠損ＣＨＯ細胞の調製 J.P．Leonetti et al.，Gene 72(1988)323-332にしたがって、オリゴヌクレオチド及びＰＬＬ抱合体を調製した。ホスホラミジテ法を用いてBiosearch Cyclone ＤＮＡ合成機で、配列番号：１のヌクレオチドと相補的なβアノマーオリゴデソキシヌクレオチド分子（15〜20 mer ）を合成した。対照として、同一長を有する無作為オリゴヌクレオチド分子を同様に調製した。臭化エチジウムで染色した15％ポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動により、オリゴヌクレオチド分子の純度を測定した。アデノシン誘導支持体の調製塩化メチレン 12.3 mlに溶解したＮ⁶，２’−（３’）−ｏ−ジベンゾイル− ５’−ジメトキシトリチル−アデノシン 2.15 g，2.76 mmol（Kempe et al.，Nu cleic Acids Res．10(1982)6695-6714 ）及びジメチルアミノ−４−ピリジン0.5 06g，4.15 mmol の溶液に、無水コハク酸 0.415 mmol 及びトリエチルアミン 0. 58 ml，4.15mmolを付加した。混合物を2.5 時間攪拌し、１M 水性炭酸水素トリエチルアンモニウム（120 ml）上に注ぎ入れて、生成物を塩化メチレン（３ｘ15 0 ml）で抽出した。併合有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で脱水して、蒸発、乾燥した。溶離液としてメタノール−トリエチルアミン−塩化メチレン（0 ：1 ：99〜2 ：1 ：97， v/v/v）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより、残渣を分別した。純粋３’−ｏ −ヘミスクシネートを含有する分画を併合し、蒸発、乾燥させた。残渣を１，２ −ジメトキシエタンに溶解し、ペンタクロロフェノール 0.783 g，2.94 mmol及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド 0.606 g ，2.94 mmol を付加した。溶液を24時間攪拌し、蒸発、乾燥した。その結果生じた残渣を、溶離液としてアセトン−塩化メチレン（5 ：95〜8 ：92， v/v）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。純粋スクシネートジエステルを含有する分画を併合し、蒸発、乾燥させた。石油エーテルから残渣を沈殿させて、無色粉末を収率 56％で得た。長鎖アルキルアミン制御孔ガラス（5 g ，Sigma ）をピリジン（10.5 ml ）中のトリエチルアミン（0.3 ml，1.5 mmol）で活性化した。溶媒を蒸発させた後、残渣をドライピリジン（15ml）に溶解したスクシネートジエステル（1.69 g，1. 5 mmol）の溶液中に懸濁した。混合物を室温で３日間静かに攪拌後、固体物質を吸引収集し、ピリジン及び塩化メチルで徹底的に洗浄して、乾燥した。無水テトラヒドロフラン（30 ml ）中の無水酢酸（0.186 ml，1.98 mmol ）、２，６−ルチジン（0.198 ml，l.71 mmol ）及び４−ジメチルアミノピリジン（1.8 g ，14 .7 mmol ）から作ったキャッピング溶液（24 ml ）中にガラスビーズを懸濁した。混合物を10分間攪拌し、ガラスビーズを吸引収集し、テトラヒドロフラン（２ｘ20ml）及び塩化メチレン（４ｘ20 ml ）で洗浄し、乾燥した。官能化アデノシン誘導ガラスビーズの一部をアセトニトリル中の0.1 M トルエン−スルホン酸で処理することにより遊離されたジメトキシトリチルの量を分光測光した結果、24 μmol ・g の負荷が示された。オリゴ体の合成ホスホラミジテ法を用いてBiosearch Cyclone ＤＮＡ合成機で、（β）アノマーオリゴヌクレオチドを合成した。上記のように調製したアデノシン誘導化支持体上で合成を開始させた。オリゴ体のポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）との抱合 20 mM 酢酸ナトリウム（pH 4.4） 100 μm 中の（β）アノマーオリゴ体（80 nmol ）を、暗中で0 ℃で30分間、4.6 μmol Ｎａメタペリオデートで酸化させた。2 M ＮａＣｌ、0.2 M ホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 8.4）及び100 μmol ナトリウムシアノボロヒドライド中の等容量のＰＬＬ（平均14 kDa，Sigma ）を付加した。混合物を20℃で一夜インキュベートし、次いで0.5 M ＮａＣｌ，20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0）で平衡指せたSephadex G-50 カラムに入れた。各分画を、260 nmの吸光度によるそのオリゴ−ＰＬＬ含量に関して、ＢＣＡタンパク質検定（Pierce）により検定した。抱合体は−80℃で保存した。トランスフェクションヒドロキシラーゼ陽性ＣＨＯ−ｗｔ細胞を0.9 μg のオリゴ−ＰＬＬ抱合体と一緒にインキュベートした。W．Schlenzka et al.(1994)（２０）にしたがって、ヒドロキシラーゼ活性を測定した。Triton X-100（質量で1.3 ％）中に溶解した1 mM ＮＡＤＨ、0.5 mM ＦｅＳＯ₄、10μM ＣＭＰ−〔４，５，６，７，８，９−^-14Ｃ〕Ｎｅｕ５Ａｃ及びブタ肝臓ミクロソーム（本試験におけるタンパク質〜20μg ）の存在下で、37℃で50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）の混合物に、細胞抽出物を37℃で付加し、検定の最終容量ヲ30μl とした。可溶化ミクロソームをシトクロムｂ₅及びシトクロムｂ₅レダクターゼの供給源として用いた（L．Shaw et al.(1994)（１４））。二重に実施した検定は、１M トリクロロ酢酸５μl を付加して停止させた。遠心分離により沈殿物質を除去し、放出された〔¹⁴Ｃ〕シアル酸を放射性ＴＬＣを用いて分析した（L．Shaw and R．Schau er(1989)（８３））。 Q-Sepharose 、Cibacron Blue 3GA アガロース、Reactive Brown 10 アガロース及びヘキシルアガロースクロマトグラフィーからの分画を、ヒドロキシラーゼ活性を測定する前に、50 mM ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（pH 7.4）で平衡させたＮＡＰ−５カラム上で脱塩した。実施例８ヒドロキシラーゼ欠損ＣＨＯ細胞におけるエリトロポイエチン（ＥＰＯ）の産生図１の置換又は挿入ベクターを用いたＣＨＯ野性型細胞のトランスフェクションにより、ヒドロキシラーゼ欠損ＣＨＯ細胞を調製した。欧州特許Ｂ第 0 205 564号の実施例６に記載されたプラスミドｐＰＴＦＬ１３からのＤＮＡ（20μg ）を制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩで消化してプラスミドを線状化し、アデノウイルス主後期プロモーターにより駆動される無傷ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有するプラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐ（Ａ）１（2 μg ）からのＣｌａＩ消化ＤＮＡに結紮した（Kauf man and Sharp(1982)（２１））。この結紮ＤＮＡを用いてＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、次いで2 日間増殖させて、少なくとも１つのＤＨＦＲ遺伝子を取り込んだ細胞を、ヌクレオチドを欠き、10％透析ウシ胎仔血清を補充したα培地中に選択した。選択培地中で2 週間増殖後、元のプレートからコロニーを取り出し、10〜100 コロニー／プールの群にプールし、置換し、ヌクレオチドを欠くα培地中で合流するよう増殖させた。メトトレキセート選択前に増殖させたプールからの上清培地を、ＲＩＡによりＥＰＯに関して検定した。陽性ＥＰＯ産生を示したプールをメトトレキセート（0.02μ M ）の存在下で増殖させ、次いでサブクローニングし、再検定した。欧州特許Ｂ第 0 205 564号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）にしたがって、サブクローンを漸増濃度のＭＴＸ中で段階的に選択した。このようなサブクローンは、ＥＰＯの産生に用い得る；ＥＰＯは、例えば欧州特許Ｂ第 0 205 5 64号（６４）に記載されているような異なる標準クロマトグラフィー技法を適用することにより、細胞上清から精製し得る。実施例９シアル酸の確定の実施シアル酸を酵素でスプリットし、次いで「Dionex-HPEAC」によりシアル酸のクロマトグラフィー的確定を実施することにより、シアル酸の確定を実行した。リン酸ナトリウム緩衝液，pH 7.2（約90〜180 μl ）中のＥＰＯ標本溶液に、リン酸緩衝液中のArthrobacter ureafaciens 1U/100μl（Boehringer Mannheim ，No:269 611 ）からのノイラミダーゼ 5 μl を付加して、最終濃度を200 μl 中 2 nmolＥＰＯタンパク質とした。混合を実施し、インキュベーションを37℃ で７時間実施した。標本容量100 μl を取り出して、水300 μl と混合した。この希釈標本溶液を用いて、「Dionex-HPEAC」によるシアル酸のクロマトグラフィー的確定を実施した。ＨＰＥＡＣと一列に並んだアンペア測定検出器（ＰＡＤ； Dionex Corp.，Sunnyvale，USA）で検出を実施した。Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃの分離は、100 mM ＮａＯＨ（溶離液Ａ）及び500 mM酢酸ナトリウム（溶離液Ｂ）ヲ用いた線状勾配により成し遂げられた。溶離液Ｂは40分間で0 ％カラ10 0 ％に増大された。Ｎｅｕ５ＡｃはＮｅｕ５Ｇｃがこれらの条件下で溶離するまえに溶離し、基準としてＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃを用いて両シアル酸を定量した（濃度：Ｎｅｕ５Ａｃに関しては１対10 nmo l 、Ｎｅｕ５Ｇｃに関しては0.05対0.5 nmol）。ＰＡＤはＮｅｕ５Ａｃ８ｓ30 00nA 及びＮｅｕ５Ｇｃ，100 nAの検出用に設置された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月３０日【補正内容】請求の範囲１．核酸分子の一部に特異的であるように緊縮条件下で、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質のＮ末端の最初の５０アミノ酸をコードする配列番号：１又は関連ＲＮＡ配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子。２．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼの発現を阻害する請求項１記載のオリゴヌクレオチド分子。３．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼｍＲＮＡと結合することを特徴とする請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド分子。４．オリゴヌクレオチド分子として、オリゴヌクレオチド分子誘導体、例えばホスホトリエステル、メチルホスホネート又はホスホチオエート、あるいは置換オリゴヌクレオチド、例えばアクリジン置換又は挿入結合オリゴヌクレオチド分子又はαアノマーが用いられる請求項１〜３記載のオリゴヌクレオチド分子。５．１５〜５０塩基を有する請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチド分子。６．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質のＮ末端の最初の５０アミノ酸をコードする核酸分子又はオリゴヌクレオチド結合剤で結合される関連ＲＮＡ配列に特異的であるようにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子を哺乳類細胞にターゲッティングするための可溶性複合体であって、上記核酸分子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド分子として細胞外条件下でオリゴヌクレオチド分子を結合し、細胞内条件下で上記オリゴヌクレオチドを放出する複合体。７．オリゴヌクレオチド分子結合剤がポリカチオン、例えばポリリシンである請求項６記載の可溶性複合体。８．複合体がさらに細胞特異性結合剤を含有する請求項６又は７記載の可溶性複合体。９．ヒドロキシラーゼ活性を含有する一次非ヒト哺乳類細胞をヒドロキシラーゼ活性コード遺伝子の遺伝子領域に特異的であるように緊縮条件下で二次細胞のゲノムとハイブリダイズする核酸分子でランスフェクトし、それにより上記一次細胞がさらにヒドロキシラーゼ活性を含有しないように一次細胞のゲノムを修飾し、細胞混合物から上記ヒドロキシラーゼ活性を欠いた少なくとも１つの二次細胞を単離することによるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を欠いたin vitro二次非ヒト哺乳類細胞の産生方法。１０．その初期状態でＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を含有し、その後組換え体糖タンパク質の産生のために上記細胞がもはやヒドロキシラーゼ活性を含有しないように修飾され、上記細胞が上記組換え体タンパク質の発現を保証する核酸分子でトランスフェクトされる非ヒト哺乳類細胞の使用であって、上記細胞を培養し、上記組換え糖タンパク質を細胞又は上清から単離する使用。１１．Ｎｅｕ５Ｇｃの非存在を特徴とし、他のヒトタンパク質を実質的に含有しないするグリココンジュゲート、特に請求項１０記載の細胞から得られる糖タンパク質。１２．Ｎｅｕ５Ｇｃの非存在を特徴とし、他のヒトタンパク質を実質的に含有しないする請求項１０記載の細胞、特にＣＨＯ細胞から得られるエリトロポイエチン。【手続補正書】【提出日】１９９８年１月６日【補正内容】請求の範囲１．核酸分子の一部に特異的であるようにストリンジェント条件下で、ＣＭＰ −Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質のＮ末端の最初の５０アミノ酸をコードする配列番号：１又は関連ＲＮＡ配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子。２．ヒドロキシラーゼ活性を含有する一次非ヒト哺乳類細胞をヒドロキシラーゼ活性コード遺伝子の遺伝子領域に特異的であるようにストリンジェント条件下で二次細胞のゲノムとハイブリダイズする核酸分子でランスフェクトし、それにより上記一次細胞がさらにヒドロキシラーゼ活性を含有しないように一次細胞のゲノムを修飾し、細胞混合物から上記ヒドロキシラーゼ活性を欠いた少なくとも１つの二次細胞を単離することによるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を欠いたin vitro二次非ヒト哺乳類細胞の産生方法。３．その初期状態でＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を含有し、その後組換え体糖タンパク質の産生のために上記細胞がもはやヒドロキシラーゼ活性を含有しないように修飾され、上記細胞が上記組換え体タンパク質の発現を保証する核酸分子でトランスフェクトされる非ヒト哺乳類細胞の使用方法であって、上記細胞を培養し、上記組換え糖タンパク質を細胞又は上清から単離する使用方法。４．Ｎｅｕ５Ｇｃの非存在を特徴とし、他のヒトタンパク質を実質的に含有しないするグリココンジュゲート、特に請求項３記載の細胞から得られる糖タンパク質。５．Ｎｅｕ５Ｇｃの非存在を特徴とし、他のヒトタンパク質を実質的に含有しないする請求項３記載の細胞、特にＣＨＯ細胞から得られるエリトロポイエチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シュレンツカ，ビーブケドイツ連邦共和国，デー−24118 キール, ハンザシュトラーセ 58 (72)発明者ショー，リードイツ連邦共和国，デー−24103 キール, ユングフェルンシュティーク 26 (72)発明者ケルム，セルゲドイツ連邦共和国，デー−24146，エルムシェンハーゲン，ドルフシュトラーセ 14 (72)発明者ハーゼルベック，アントンドイツ連邦共和国，デー−82362，ビルヘルム，ベーレンミュールベーク 50 (72)発明者ホノルト，コンラットドイツ連邦共和国，デー−82377 ペンツベルク，マイヒェベックシュトラーセ２

Claims

【特許請求の範囲】１．シトクロムｂ₅及びシトクロムｂ₅レダクターゼによる夾雑物を実質的に含有しない単離タンパク質であって、ａ）外生的ＤＮＡの原核細胞又は真核細胞発現の生成物であり；ｂ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃへの転化を触媒し；ｃ）配列番号：１に示されるＤＮＡ配列によりコードされるか又は配列番号：１を完全に又は少なくともその98％を含み；ｄ）緊縮条件下で配列番号：１とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ；あるいはｅ）遺伝子暗号の縮重が認められない場合には、緊縮条件下でｃ）〜ｄ）に限定された配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる単離タンパク質。２．上記タンパク質が緊縮条件下で配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７とハイブリダイズする配列によりコードされる請求項１記載のタンパク質。３．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質の原核又は真核宿主細胞中での発現を保証し、以下の：ａ）配列番号：１に示されるかあるいは配列番号：１を完全に又はその少なくとも98％を含むＤＮＡ分子かあるいは相補的配列；ｂ）緊縮条件下で配列番号：１とハイブリダイズする核酸分子；あるいはｃ）遺伝子暗号の縮重が認められない場合には、緊縮条件下でａ）又はｂ）に示された配列の１つとハイブリダイズする核酸分子から成る群から選択される単離核酸分子。４．上記核酸分子が緊縮条件下で配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７とハイブリダイズする請求項３記載の核酸分子。５．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の検出方法であって、検査される標本が緊縮条件下で配列番号：１のヌクレオチド４２〜１３０７とハイブリダイズする核酸分子から成る群から選択される核酸プローブと一緒にインキュベートされ、核酸プローブ標本からの核酸分子と一緒にインキュベートされ、標本中の核酸分子及び核酸プローブのハイブリダイゼーションが所望によりさらに別の結合相手を介して検出されることを特徴とする方法。６．核酸分子に特異的であるように緊縮条件下で、細胞外又は細胞内条件下でＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号：１又は関連ＲＮＡ配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子。７．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼの発現を阻害する請求項６記載のオリゴヌクレオチド分子。８．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼｍＲＮＡと結合することを特徴とする請求項６又は７記載のオリゴヌクレオチド分子。９．オリゴヌクレオチド分子として、オリゴヌクレオチド分子誘導体、例えばホスホトリエステル、メチルホスホネート又はホスホチオエート、あるいは置換オリゴヌクレオチド、例えばアクリジン置換又は挿入結合オリゴヌクレオチド分子又はαアノマーが用いられる請求項６〜８記載のオリゴヌクレオチド分子。１０．１５〜５０塩基を有する請求項６〜９記載のオリゴヌクレオチド分子。１１．ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に特異的であるようにオリゴヌクレオチド結合剤で結合される配列番号：１の一部又は全部あるいは関連ＲＮＡ配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子を哺乳類細胞にターゲッティングするための可溶性複合体であって、上記核酸分子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド分子として細胞外条件下でオリゴヌクレオチド分子を結合し、細胞内条件下で上記オリゴヌクレオチドを放出する複合体。１２．オリゴヌクレオチド分子結合剤がポリカチオン、例えばポリリシンである請求項１１記載の可溶性複合体。１３．複合体がさらに細胞特異性結合剤を含有する請求項１１又は１２記載の可溶性複合体。１４．ヒドロキシラーゼ活性を含有する一次哺乳類細胞をヒドロキシラーゼ活性コード遺伝子の遺伝子領域に特異的であるように緊縮条件下で二次細胞のゲノムとハイブリダイズする核酸分子でトランスフェクトし、それにより上記一次細胞がさらにヒドロキシラーゼ活性を含有しないように一次細胞のゲノムを修飾し、細胞混合物から上記ヒドロキシラーゼ活性を欠いた少なくとも１つの二次細胞を単離することによるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を欠いたin vitro二次哺乳類細胞の産生方法。１５．その初期状態でＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ活性を含有し、その後組換え体糖タンパク質の産生のために上記細胞がもはやヒドロキシラーゼ活性を含有しないように修飾され、上記細胞が上記組換え体タンパク質の発現を保証する核酸分子でトランスフェクトされる哺乳類細胞の使用であって、上記細胞を培養し、上記組換え糖タンパク質を細胞又は上清から単離する使用。１６．Ｎｅｕ５Ｇｃの非存在を特徴とするグリココンジュゲート、特に請求項１５記載の細胞から得られる糖タンパク質。１７．Ｎｅｕ５Ｇｃの非存在を特徴とする請求項１５記載の細胞、特にＣＨＯ細胞から得られるエリトロポイエチン。