JP2000511046A

JP2000511046A - 単離されたウリジンジホスホ―グルクロノシルトランスフェラーゼの性質とその使用

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Publication number: JP2000511046A
Application number: JP09541303A
Authority: JP
Inventors: ベランジェ，アラン; ハム，ディーン・ダブリュー; ボリュー，マルタン; ルヴェスク，エリック
Original assignee: Endorecherche Inc
Current assignee: Endorecherche Inc
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2000-08-29
Also published as: WO1997044466A1; AU2687897A; EP0904382A1; US6287834B1; CA2255712A1

Abstract

(57)【要約】ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17(UGT2B17)を提供する。この酵素を調製する方法およびこの酵素を用いて、当該酵素の活性を阻害もしくは変化させる物質を検出する方法を開示する。さらに、当該タンパク質を検出するための、抗体を使用する方法、遺伝子配列またはその一部をプローブとして用いる方法、または遺伝子配列を、自身の発現を乱すセンスもしくはアンチセンスDNAフラグメントまたはアンチセンスRNAを調製するために用いる方法もまた、提供する。

Description

【発明の詳細な説明】単離されたウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼの性質とその使用発明の背景発明の分野本発明は、ウリジンジホスホ-グルクロン酸から多種多様な脂溶性薬物、環境化学物質および内因性物質へのグルクロン酸の転移を触媒する酵素ファミリーに属する新規酵素の単離、特徴づけおよび使用に関し、より具体的には、アンドロゲン化合物（特にC₁₉ステロイド）を抱合することが見出された新規ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGT）（以下UGT2B17）の特徴づけと、それをコードするcDNAの単離に関する。また、アッセイにおけるこの酵素の使用と、上記DNA、そのフラグメント、そのアンチセンスフラグメント、およびそれに対する抗体の各使用法についても記述する。関連技術の説明 UGTと呼ばれる酵素は、グルクロン酸がウリジンジホスホ-グルクロン酸から多種多様な脂溶性薬物、環境化学物質ならびにビリルビン、ステロイドホルモンおよびチロキシンなどの内因性物質に転移されるグルクロン酸抱合過程を触媒する酵素ファミリーである。一般にグルクロン酸抱合は肝臓と腎臓で起こり、グルクロニド誘導体が体内から排除される原因となる。しかしUGT活性は、前立腺、精巣、皮膚、胸部、脳および卵巣組織を含む数多くの組織と、胸部および前立腺の腫瘍細胞系でも確認されている。 UGT酵素ファミリーはUGT1とUGT2の2つのサブファミリーに分類されている。 UGT1ファミリーは一般に平面的で嵩高いフェノール基質とビリルビンのグルクロン酸抱合に関与することが知られているが、UGT1ファミリーに属するいくつかの酵素はエストロゲンを抱合することができる。UGT2ファミリーの酵素は2つのサブファミリー、すなわち嗅上皮で発現される遺伝子がコードする酵素を含むUGT2 Aと、胆汁酸、C₁₉ステロイド、C₁₈ステロイド、脂肪酸、カルボン酸、フェノール類およびベンゾピレンや2-アセチルアミノフルオレンなどの発がん物質のグルクロン酸抱合を触媒する酵素を含むUGT2Bに分類される。UGT2Bファミリーに属する酵素は数種類がヒトの肝臓から単離され、特徴づけられている。これらのUG T2B酵素はその基質特異性に部分的重複があることがわかっている。本発明は、UGT2Bファミリーの構成要素であって以下に詳述する新規UGTに関する。発明の要約本発明の目的は、UGT2B17と呼ばれる新規ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGT）を提供することである。また、C₁₉ステロイドをその3α-ヒドロキシ基または17β-ヒドロキシ基で抱合することが明らかになったUGTを提供することも、本発明の目的である。本発明のもう1つの目的は、アンドロステロンのアンドロステロン-グルクロン酸への変換に関与するUGTを提供するこである。また、アンドロゲン化合物、特にアンドロステロン（ADT）、テストステロン、ジヒドロテストステロン（DHT）およびアンドロスタン-3α,17β-ジオール（3 α-ジオール）を含むC₁₉ステロイドと、オイゲノール、4-メチルウンベリフェロンに対して特異性を持つUGTを提供することも、本発明の目的である。本発明のさらなる目的は、UGT2B17のヌクレオチド配列を提供することである。また、UGT2B17酵素の活性を阻害する化合物を同定するためのアッセイでUGT2B 17を使用する方法、もしくはUGT2B17酵素を検出および定量するためにUGT2B17に対する抗体を使用する方法を提供することも、本発明の目的である。本明細書では、これらの目的とその他の目的について論じる。具体的には、新規ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ UGT2B17を同定し、特徴づけた。UGT2B17の一次タンパク質構造は530個のアミノ酸（配列番号2）を含み、53キロダルトンの見かけ分子量（SDS-PAGEで測定した場合）を持つことがわかった。このタンパク質は、次に示す配列（配列番号1および2）の（5'から3'の方向に番号を付けて）ヌクレオチド＋52から、停止コドンを含めて1644まで（アミノ酸1から530まで）によってコードされる。 1590塩基の上記オープンリーディングフレームには、51塩基対の5'非翻訳領域と463塩基対の3'非翻訳領域が隣接している。この配列のさらなる詳細については後述する。本発明は、UGT2B17の合成生産法、ならびに生物学的に機能が均等なペプチド、UGT2B17に対する抗体、および本酵素を検出し定量するための当該抗体の使用を包含する。 UGT2B17をコードするヌクレオチド配列と、その配列を含む組換え発現ベクターには、それらが機能的に均等な酵素をコードし続ける限り、改変を加えることができる。さらに本発明では、コード領域内のコドンを（なかんずく遺伝コードの縮重ゆえに同じタンパク質をコードし続けるような方法で）変異させることも考えられる。配列番号1に類似するヌクレオチド配列、もしくは配列番号1のコード領域（またはその相補鎖）に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、その類似するヌクレオチド配列の長さが少なくとも1500ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも1590ヌクレオチドである場合はとりわけ、配列番号1 のコード領域がコードするものと機能的に均等なUGT2B17をコードするだろうと考えられる。本明細書において「厳密な条件」とは、特に明示しない限り、0.1 ×SSC（0.3M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウム）と0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および60℃を意味する。また、ヒトもしくはヒト以外の起源を持つ組織または細胞、特にステロイドを含む組織または細胞は、本発明に従って使用しうる程度にヒトUGT2B17に類似したUGT2B17を含むだろう。具体的に述べると、他の種で類似するcDNAを同定するには、上述のような細胞から調製されたcDNAライブラリーを、よく知られる技術に従い、様々な厳密度で、ここに開示するヌクレオチドを参照して調製されたプローブを用いてスクリーニングすればよい。これらの類似cDNAは配列番号1と好ましくは少なくとも92%相同であり、最も好ましくは少なくとも95%相同である。それらは好ましくは少なくとも10ヌクレオチド長の完全に同一な区間を含み、より好ましくは完全に同一な15または20、さらには30ヌクレオチドの区間を含む。適当なプローブは配列番号1または適当な長さ（好ましくは少なくとも15ヌクレオチド長）のそのフラグメントから調製することができる。少なくとも2種類の異なるプローブで確認することが好ましい。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）増幅法などの他の単離法も使用できる。このようにして得られる相同なUGT2B17とそれらをコードする遺伝子は、それぞれ配列番号2と配列番号1の使用法のすべてに、本発明に従って使用することができる。組換え発現ベクターは、配列番号1に示すようなUGT2B17の全コード領域、本明細書で論じるように改変されたUGT2B17のコード領域、ヒトUGT2B17のコード領域もしくは他の動物に由来する上述のような類似コード領域の一部、UGT2B17に対するアンチセンス構築物、またはUGT2B17に対するアンチセンス構築物の一部を含みうる。本発明に関して「単離された」とは、自然界に存在する時よりも高い純度を持つことを意味するが、天然の供給源からの精製を必要とはしない。UGT2B17をコードする単離されたヌクレオチドは合成的に作ることもできるし、UGT2B17をコードするmRNAから調製されたcDNAライブラリーから得られるcDNAを単離することによって、あるいは当技術分野で知られる他の任意の方法によって作ることもできる。一態様として本発明は、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、配列番号1のコード領域またはその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイズできる程度に配列番号1 またはその相補鎖に相同であり、かつ、アンドロステロンのアンドロステロン- グルクロン酸への変換を触媒する酵素をコードする配列を提供する。さらなる態様として本発明は、少なくとも配列番号1のコード領域またはその相補鎖中の連続する30ヌクレオチドと同一な連続する30ヌクレオチドを含む単離されたヌクレオチド配列を提供する。さらなる態様として本発明は、配列番号1のヌクレオチド52から927までを含むヌクレオチド配列を提供する。もう1つの態様として本発明は、配列番号1のヌクレオチド204から723までを含むヌクレオチド配列を提供する。さらなる態様として本発明は、配列番号1を含む単離されたヌクレオチド配列を提供する。さらなる態様として、配列番号1によってコードされるタンパク質が提供される。もう1つの態様として、配列番号2をコードする単離された核酸が提供される。さらなる態様として、配列番号2に示すアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つ単離されたウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17酵素が提供される。もう1つの態様として本発明は、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17をコードするコード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む発現ベクターであって、該コード配列が配列番号1のコード領域またはその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダイズできる程度に配列番号1またはその相補鎖に相同であり、かつ、該コード配列がアンドロステロンのアンドロステロン -グルクロン酸への変換を触媒する酵素をコードするものを提供する。配列番号1 と、配列番号2をコードするその他のDNA配列は、本発明ベクターのコード領域として使用できる。さらなる態様として本発明は、上述のベクターで形質転換または形質移入された宿主細胞を提供すると共に、請求項3のベクターで形質転換または形質移入された組換え宿主を調製する段階と、該宿主によるウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の産生を招く条件下に該宿主を培養する段階とを含むウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の生産法を提供する。さらなる態様として本発明は、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17またはその抗原性フラグメントを含む固定化抗原組成物と、該固定化抗原と該抗原に対する抗体の複合体を検出するための手段とを含んでなる、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗体を検出するためのキットを提供する。さらなる態様として、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2 B17またはその抗原性フラグメントに対する抗体を含む固定化抗体組成物と、該固定化抗体とウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の複合体を検出するための手段とを含んでなる、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を検出するためのキットが提供される。もう1つの態様として本発明は、精製または組換えジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗血清を提供する。さらなる態様として本発明は、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を投与する段階を含む、組織中のアンドロゲン化合物の濃度を変化させる方法を提供する。さらなる態様として本発明は、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の局所濃度を検出する方法であって、該ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する標識抗体を投与した後、該標識を検出することからなる方法を提供する。もう1つの態様として本発明は、配列番号1のコード領域またはその相補鎖中の少なくとも30残基の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を導入する段階を含む、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の合成を遮断する方法を提供する。さらなる態様として、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ 2B17を投与する段階を含む、組織中のアンドロゲン活性を変化させる方法が提供される。さらなる態様として本発明は、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の濃度を測定する段階を含む、試料中のアンドロゲン活性のレベルの変化を検出する方法を提供する。もう1つの態様として本発明は、試験試料中のウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を検出する方法であって、該試験試料をウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗体と接触させ、該抗体と該ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17との免疫複合体の形成を測定することからなる方法を提供する。もう1つの態様として本発明は、試験試料中のウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗体を検出する方法であって、該試験試料をウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17と接触させ、該抗体と該ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17との免疫複合体の形成を測定することからなる方法を提供する。本発明のその他の特徴と利点は、添付の図面に言及する次の本発明の説明から明らかになるだろう。図面の簡単な説明図１は、ウリジングルクロノシルトランスフェラーゼの役割を説明する、ステロイド産生のスキームを示す概略図である。図２は本発明によって宿主細胞を形質移入するために使用可能な物の一例である、pCMVベクターのマップである。図３はUTG2B17のアイドロゲン化合物に対する特異性を測定したアッセイの結果を示す。図4Aおよび図4Bはそれぞれ、ADTとDHT、および3α-ジオールとテストステロン (TESTO)のラインウィーバー-バークプロットである。図5は様々な組織における、UGT2B17の有無を示す、サザンブロットである。発明の詳細な説明グルクロン酸抱合は、ステロイド代謝経路における、非可逆的酵素反応であり、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)に触媒されている。UGTはウリジンジホスホ-グルクロン酸の糖酸成分とステロイドとの抱合反応を触媒している。ステロイド-グルクロナイド(-G)の形成により、アンドロゲンが完全に不活性化されることが知られている。従って、UGT酵素は組織内の物質の濃度を調節するのに用いることができる。 UGT2B17酵素をコード化するcDNAを単離され、530アミノ酸を有するタンパク質をコード化する、分子量53キロダルトンのものであることがわかった。コード領域は、ヌクレオチド＋52位から1644位であり、ここにはストップコドンを含む（そしてアミノ酸＋１から530までをコード化する）。この番号付は5’から3’方向へと成されている。このタンパク質構造には、小胞体中へタンパク質を導く疎水性シグナルペプチドをアミノ酸5から12の位置に有する。さらに、リーダー配列は正荷電リジンを第4位に有し、23位のシステイン残基にある分割可能部位にて終了している。さらに、UGT2B17は疎水性膜透過領域をアミノ酸494と510の間に有しており、これに続いて正荷電リジン残基が存在している。UGT2B17はまた、３つのアスパラギンリンクグリコシレーション部位(NXS／T)と成り得る部位を、をアミノ酸65、316および483位に有している。ステロイド合成の一般的な概略図およびUGTの役割を図1に説明した。図1中、E Rはエストロゲン受容体、ARはアンドロゲン受容体、E1はエストロン、Ｅ２はエストラジオール、HSDはヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、およびDHEAはデヒドロエピアンドロステロンを示す。酵素のカルボキシ末端領域、即ちアミノ酸290から530を含有する領域には、ウリジンジホスホ-グルクロン酸(UDPGA)との結合に臨界的なドメインを含有することが示されている。さらに、基質特異性のドメインはアミノ末端領域、特にアミノ酸54と227の間にあることが示されている。 UGT2B17酵素は、この遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列をベクターへ取りこませ、酵素の発現能を有する宿主系へこのベクターを形質転換もしくは形質移入させることによって、産生することができる。DNAは宿主内にて保持されるか、または安定に宿主細胞のゲノム中に取りこまれる。詳細には、UGT2B17の発現をクローニングするために、いかなる従来の発現ベクター、例えばプラスミドなど、を使用してもよい。ベクターは、λgt11および λEMBL3のごときバクテリオファージλ、pBR322のごとき大腸菌株およびブルースクリプト(ストラタジェン)のごとき原核発現ベクターであっても、pCMVファミリー内の真核性ベクターであってもよい。単離したUGT2B17のヒトcDNA(配列番号１のヌクレオチド36から1870)を導入したベクターを、ブダペスト条約に基づいてアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC，米国メリーランド州ロックビル)に寄託した(ATCC寄託番号98228)。本寄託菌は、本特許出願に基づく特許権の発効と共に第三者に分譲可能となる。遺伝子はまた、ヒト前立腺およびLNCaP （ヒト前立腺アデノカルシノーマセルライン）細胞ｃＤＮＡライブラリーを、配列番号1の全体もしくは一部から誘導されたプローブを用いてスクリーニングすることによって得ることも可能である。本発明を実施するために用い得るベクターは一般に、形質転換先の宿主系に適合性を有する複製および調節配列を有している。プロモーター配列が、一般に含まれる。原核生物の場合、代表的なプロモーターとしてはβ-ラクタマーゼ、ラクトースおよびトリプトファンが挙げられる。哺乳類の細胞で通常使用されるプロモーターとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)およびシミアンウイルス40(SV40)が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは任意に複製起点、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニレーション部位、転写終結配列および／または選択可能マーカーを含有してもよい。本発明の実施に用いることができる様々な性質を有する様々なベクター系がある。本発明の実施に使用し得るベクターの1例として、pCMVベクターのマップを図2に示した。酵素を発現することが知られている、よく知られている宿主系であって、UGT2 B17遺伝子を有する適当なベクターを形質移入し得るものは、本発明の実施に用い得る。このような宿主系には、原核生物宿主、例えば大腸菌、バチルス・ズブチリスのごとき杆菌もしくはサルモネラ、セラチアおよびシュードモナス種のごときその他の腸内細菌を含む。真核生物微生物、例えば培養酵母もまた用いることができる。最もよく使用されるのが、サッカロマイセスセレビジューであるが、他の種も市場で入手でき、また使用できる。さらに、哺乳類細胞から誘導された細胞培養物もまた、増殖させることができる。好ましい宿主セルラインには胎児腎臓(293)、SW-13，チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、HeLa、骨髄腫、ジャーカット細胞(Jurkat)、COS-1、BHK、W138およびマディン-ダービーイヌ腎臓(MDCK)を含む。本発明の実施には、293細胞が好ましい。本明細書に開示のごとく組換えにより調製したものであっても、天然から精製したものであっても、あるいは他の方法にて調製したものであっても、UGT2B17 はこの酵素活性を阻害する、あるいは変化させる化合物の同定に用いることができる。特に、UGT2B17はグルクロン抱合反応を触媒することが知られているため、この酵素はこの反応を妨害する化合物を同定するのに用いることができる。宿主細胞での発現の後、酵素を含有する粗ホモゲネートを調製して、組換え宿主から直接酵素を得るのが好ましい。次いでアドレステロンのごとき酵素の基質、および試験しようとする化合物をこのホモゲネートと混合する。試験化合物の存在、不存在における、酵素活性を比較する。ある時間の間の基質および生成物の相対量を容易に知るための、基質の活性に及ぼす試験化合物の効果を示す数多くの方法が知られている。例えば、基質が生成する生成物にも標識が残るよう、基質を標識化することが可能である。C¹⁴またはH³のごとき放射活性標識は、定量的に分析でき、特に好ましい。酵素、試験化合物および基質の混合物を、予め定めた時間インキュベートすることが、好ましい。さらに、より分析を容易にするために、生成物は基質から分離するのが好ましい。数多くの分離手法が知られており、例えば簿相クロマトグラフィー(TLC)、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、分光光度法、ガスクロマトグラフィー、マススペクトロホトメトリーおよび核磁気共鳴(NMR)のごとき方法が挙げられる。さらに基質と生成物とを区別することができる、他のいかなる方法を用いてもよい。さらに、本願タンパク質またはそのフラグメントを含む組成物、もしくは該タンパク質もしくはその抗原性フラグメントに対する抗体を含む組成物を調製することもできる。かかる組成物を、UGT2B17抗体もしくはUGT2B17が含有されていると予測される体液もしくは組織のごとき試料と接触させる。接触させた後、抗原／抗体複合体が形成されている程度を、公知の方法にて測定すればよい。抗原／抗体複合体の生成を検出する好ましい手法には、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、間接蛍光アッセイ、ラテックス凝集、ラジオイムノアッヤイ(RIA)およびリポソームベースのアッセイが含まれるが、これらに限定されない。ウエスタンブロット技術を用いてもよく、この場合には、バンドが可視で調べられ、濃いバンドの実質的な出現が、陽性の指標となる。さらに、インビボアッセイも用いることができるが、この場合には、該抗原に対する標識抗体がUGT2B17の存在をインビボで検出するのに用いられる。本発明の好ましい態様においては、本発明の抗原または抗体組成物を固定化して、試験しようとする試料と接触させる。試料および結合していないあらゆる抗体もしくは抗原を洗浄除去した後、標準的な方法を用いて、抗原抗体の結合の程度を測定すればよい。必須ではないが試験のための試料を本発明の抗原もしくは抗体組成物と接触させる前に、抗原もしくは抗体組成物は従来の手法(例えばELISA)を用いて固定化するのが好ましい。ある態様においては、以下に詳しく述べるリポソームベースのアッセイが用いられる。従来の方法による固定化には例えばポリスチレンプレートを本発明によって調製した抗原または抗体縣濁液と接触させることが挙げられる。または、例えば電気泳動ゲル上にタンパク質のバンドとして単離された抗原を、公知の方法でニトロセルロース製シートに写し取ってもよい。トウビン（ Towbin）ら、Proc.Nat'l.Acad.Sci.,76：4350-54(1979)；バーネット(Burnette) ら、Biochem.112：195-203(1981)。抗原もしくは抗体を実質的に不活性な基質上へ固定化するための数多くの他の方法が当業者に知られている。結合された本発明の抗原を、好ましくはUGT2B17に対する抗体の存否についての試験をしようとする試料を含んだ希釈液と接触させる。抗原および試料は好ましくは少なくとも5から15分間インキュベートする。ヒトの体温である約３７℃ 付近でインキュベーションを行う場合は、時間を短くできる。他の温度、例えば 4℃でのインキュベーションでも可能であるが、追加のインキュベーション時間が必要となる。37℃における好ましいインキュベーション時間は、約5分から約 90分である。結合させた抗原は、次いでリンスして結合していないすべての抗体、即ちこの抗原に特異性を有していない抗体を除く。好ましくは、リンスはPBS T、PBS TTまたはトリス/ツイン/塩化ナトリウム/アジドのごとき緩衝液にて行う。複数回のリンスが好ましい。インキュベーションの間に、UGT2B17特異的抗体は固定化抗原に結合して抗原／抗体複合体を形成する。すべての非結合抗体はリンス工程において実質的に除かれる。本発明の抗原は高い特異性を有しているため、UGT2B17に特異的でない抗体はリンスによって実質的に除かれる。当然のことながら、試料がUGT2B17特異的抗体を含有しない場合は、固定化抗原には実質的にヒト抗体が結合せず、続く抗原／抗体複合体検出試験においてかかる複合体の実質的な存在が示されることはない。一方、試験試料にUGT2B17特異的抗体が豊富に含まれている場合には、これらの抗体は固定化抗原に結合して大量の抗原／抗体複合体を形成し、次いで検出される。抗原／抗体複合体の検出は、広く様々な公知の手法を用いて行えばよい。好ましい方法には、酵素結合免疫吸着検定法、ラテックス凝集反応、ウエスタンブロット手法または間接蛍光免疫アッセイが含まれるが、これらに限定はされない。典型的には、固定化抗原と複合体を形成したUGT2B17特異的抗体は、検出する免疫グロブリン(即ち抗-UGT2B17)に特異的であって、標識化した、あるいは他の方法にて検出可能とした第2抗体と接触させて検出する。例えば試験試料がヒト血清である場合、この検出可能な第2抗体はヒト免疫グロブリンに特異的である。標識化第2抗体はIgGあるいはIgAなど、いずれのヒト抗体に対して特異的なものであってもよい。急性抗体陽転(sero-conversion)の疑いがある場合には、IgM に特異的な第2抗体を用いたIgM試験を行うのが適当である。第2抗体と固定化抗原は、約5分間から約2時間の間、好ましくは30分から60分の間、約20℃から約37 ℃の温度にてインキュベートする。次いで、抗原を緩衝液にて好ましくは複数回洗浄して、すべての非結合標識抗体を除去する。洗浄によって、抗原上の免疫グロブリンに結合したもの以外の標識抗体が実質的にすべて除去される。もちろん、ここに存在する実質的に唯一のヒト免疫グロブリンは、UGT2B17特異抗体である。こうして、UGT2B17特異的抗体を、標識第2抗体の存否を調べることによって間接的に測定することができる。用いる標識によって様々の、標識を検出するための非常に多くの公知の手法がある。例えばフルオレセイン標識抗体は一定の蛍光波長における放出光を測定することによって、検出することができる。また、酵素標識の場合には、適当な基質と共にインキュベートして、酵素活性を検出すればよい。酵素活性は、色の変化に帰結するものが好ましい。かかる活性は、目視によって測定しても、あるいは適当な波長にセットした分光光度計によって自動的に読み取ってもよい。例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼにて酵素標識した場合、基質をH₂O₂と2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)とすれば、これらは酵素の存在下、414nmに設定した分光光度計で測定し得る化合物を生成する。ウエスタンブロッティング法においては、酵素が第2抗体と複合体を形成している場合に陽性シグナルが検出される。適当な基質とインキュベートすると、この手法によって分割された抗原性バンドの周囲に着色産生物が酵素的に生成される。こうして、反応性のバンドの存在を、視覚検出することができる。間接的蛍光免疫アッセイでは、フルオレセイン標識化第2抗体は、蛍光活性化検出器によってあるいは、視覚により検出すればよい。リポソームベースのアッセイには、表面上にUGT2B17抗原を発現させたリポソーム内にフルオレセイン、酵素もしくは基質を含有したものを用いればよい。希釈した試験体液試料と共にこのようなリポソームをインキュベートし、洗浄する。免疫グロブリンがその表面に結合しているいずれのリポソームも、抗原／抗体複合体を形成しており、リポソームを含有するポリスチレン管の内壁上の試験しようとする免疫グロブリンに対して特異的な第2抗体に結合することによって認識され得る。即ち、こうして表面に抗体が結合したリポソームは管の内壁に固定化され、そして固定化されないものは洗い流される。リポソームを例えば洗剤や補体によって破壊すれば、内部の酵素または基質が、管内溶液中の相補的な基質もしくは酵素と反応できるようになる。酵素活性は、視覚または分光光度計による色の測定によって確認できる変色反応であるのが好ましい。 UGT2B17またはその抗原性部位に対する抗体を用い、試験試料中の抗原を検出することも可能である。この手法および方法は、抗体を固定化し、UGT2B17を含有すると思われる試料を試験し、標識化抗-UGT2B17を用いて、UGT2B17と固定化した抗体との複合体形成を検出する以外は上に説明したものと同じである。 UGT2B17特異的テストキットは、抗体または抗原をいくつかの異なった検出方法にて検出するものとして、構成することができる。抗体または抗原検出のテストキットは、UGT2B17抗原または抗体にて使用前に被覆されている複数のウエル、プレート、酵素検出のためのELISA材料、および色変化指示系を含む区画に分けられた囲いを有するものであってよい。様々な酵素および現像剤を使用することができるのは当然である。抗体をウエスタンブロット法によって検出するための第2のテストキットは、容器、カバー、ニトロセルロースシートおよびドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド平板ゲル、界面活性剤、pH調節剤、乾燥ノンファットミルクおよびトリス中のDAGとハイドロゲンパーオキシドのごとき変色指示系から構成され得る。ウエスタンブロット分析キットにはパーオキシダーゼ標識ヤギもしくはウサギ抗ヒト免疫グロブリンおよびUGT2B17抗原の源もさらに、含む。間接蛍光免疫アッセイを用いて抗体または抗原を検出するための、UGT2B17-特異的テストキットとしては、区分けされた容器にUGT2B17抗原または抗体、燐酸緩衝生理食塩水および蛍光標識複合体を含有するものであり得る。最後に、リポソームを用い、容器を含む抗体または抗原を検出するための別の UGT2B17特異的試験キットには、表面にUGT2B17抗原または抗体が結合し、フルオレセン標識（または酵素もしくは基質）で満たされたリポソームと、界面活性剤を含む。このアッセイにおいて、容器には適当な複合体にて予め被覆した管またはウエルが用いられる。陽性信号であるとすべき抗原／抗体複合体の検出程度は、選択した検出方法によって変わるが、一般に、他のすべてのパラメータ(例えば試料の希釈度、インキュベーションの時間)一定に保った際の、陰性コントロール群の結果の平均プラス１標準偏差より大きな値であると規定される。高い特異性が望まれるいくつかの態様においては、平均プラス２または３標準偏差の基準が用いられる。 UGT2B17遺伝子またはその部分は、UGT2B17の発現をインビボで阻害するためのアンチセンス核酸を調製するのに用いることもできる。こうして、望ましい場合には、酵素の活性および酵素に対する基質(例えばアンドロゲン)のレベルを上昇させることができるのである。一般に、アンチセンス核酸配列は転写、スプライシングまたは翻訳プロセスを妨害する。アンチセンス配列は三重ラセンの形成、 RNAポリメラーゼによって生み出されたオープンループとのハイブリダイズ、または発生期のRNAとハイブリダイズすることによって転写を防止し得る。一方、スプライシングはアンチセンス配列がエクソンとイントロンの交差する部位に結合した場合、効果的に妨害される。最後に、翻訳は開始因子の結合をブロックすることによって、スタートコドンにおけるリボソームサブユニットのアセンブリを妨害することによって、あるいはリボゾームをmRNAのコード領域から、この場合はこのメッセージRNAとアンチセンスなRNAを用いるのが好ましいが、ブロックすることによって影響を受ける。さらなる一般的な情報については、ヘレン(Hel ene)ら、Biochimica et Biophysica Acta 1049:99-125(1990)に開示されており、この開示内容は本出願に含まれる。アンチセンス核酸配列はRNAまたは一本鎖DNA配列であって、標的タンパク質または標的遺伝子と相補的なものである。これらアンチセンス配列は、細胞内へ導入され、細胞内ではこの相補鎖が標的遺伝子と塩基対を形成し、機能性UGT2B17 の転写、スプライシングまたは翻訳が妨害される。アンチセンス鎖は、10ヌクレオチドから全遺伝子長の長さであり得るが、約10から50ヌクレオチドが好ましく、15から25ヌクレオチドが最も好ましい。遺伝子のいずれの部分であっても、アンチセンス配列の調製に用いることはできるが、アンチセンスが遺伝子のコード領域またはmRNAの翻訳開始領域の周囲の配列もしくはプロモーター領域に対するものであることが好ましい。アミノ酸1 から295位、最も好ましくはアミノ酸54から227位を含む領域を用いることが好ましい。当業者によく知られているように、配列は、様々な方法によって、処置の効果をあげるために改変してもよい。特に、RNAの3’末端に、更なるRNAを含むようにして、ヘアピンループ構造を取らせ、これによってヌクレアーゼによる分解を防止してもよい。さらに、オリゴヌクレオチドのバックボーン内の化学結合を、ヌクレアーゼによる分割を防止するために改変してもよい。アンチセンス鎖を細胞内に導入する数多くの方法が知られている。ひとつの戦略としては、UGT2B17をコード化する遺伝子を、ベクター内に逆向きに導入し、プラスミドから転写されるＲＮＡが細胞遺伝子から転写されるmRNAに対して相補的であるようにしてもよい。強力なプロモーター（例えばpCMV）は、一般にベクター内の、遺伝子配列の上流に含ませて、多量のアンチセンスRNAが産性され、センスmRNAの結合に供されるようにしてもよい。ベクターは次いで細胞内に形質移入され、そして細胞が投与される。一本鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスRNAを調製して、これらを細胞もしくはリポソーム内に導入したものを投与してもよい。リポソームの使用は、例えばWO95／03788に開示されている通り(これは、本明細書に参考として含まれる)好ましい。しかしながら、他の当業者によく理解される方法もまた、アンチセンス鎖を細胞内に導入し、あるいは処置の必要な患者に対して投与するのに用いることができる。以下はUGT2B17 cDNAクローンの単離に使用される材料と方法の説明である。また、UGT2B17の発現と基質特異性の決定に使用される材料と方法についても以下に記述する。これらの実施例は本発明を例示するものであって、本発明の範囲内でその操作と供給源に改良と変更を加えたりおよび／または異なる技術を使用できることは当業者には十分に理解される。また、本遺伝子を組換え法で生産できることも十分に理解される。材料 UDP-グルクロン酸と全てのアグリコンはシグマケミカル社（ミズーリ州セントルイス）とアイシーエヌファーマシューティカル(ICN Pharmaceutical)社（カナダ・モントリオール）から入手した。非放射性ステロイド類はステラノイズ(Steraloids)社（ニューハンプシャー州ウィルトン）から購入した。[9,11-³H ]アンドロステロン（59Ci/mmol）、[9,11-³Hアンドロスタン-3α,17β-ジオール（56Ci/mmol）および[¹⁴C]UDP-グルクロン酸（285mCi/mmol）はエヌイーエヌデュポン(NEN Dupont)社（マサチューセッツ州ボストン）から入手した。 [1,2-³H]ジヒドロテストステロン（47Ci/mmol）、[1,2,6,7-³H]テストステロン（90Ci/mmol）、α-[³²P]-dCTP（3000Ci/mmol）およびα-[³²P]-dUTP（3000Ci/m mol）はアマシャム(Amersham)社（カナダ・オークビル）から入手した。ジェネティシン（G418）とリポフェクチンはギブコ・ビーアールエル(Gibco BRL)社（カナダ・バーリントン）から入手した。タンパク質定量試薬はバイオラッド(Bio-Rad)社（カリフォルニア州リッチモンド）から入手した。制限酵素類とその他の分子生物学用試薬はファルマシア・エルケービー・バイオテクノロジー(Pharmacia LKB Biotechnology)社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ギブコビーアールエル(Gibco BRL)社（カナダ・バーリントン）、ストラタジェン( Stratagene)社（カリフォルニア州ラホーヤ）およびベーリンガー・マンハイム( Boehringer Mannheim)社（インディアナ州インディアナポリス）から入手した。 AmpliTaq DNAポリメラーゼはパーキン-エルマー・セタス(Perkin-Elmer Cetus) 社（ニュージャージー州ブランチバーグ）から得た。ヒト胎児腎293細胞（HK293 ）とLNCaP細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）から入手した。ヒト前立腺、副腎、精巣、乳腺、腎臓、子宮および胚の全RNAはクロンテック(Clontech)社（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。ヒトRNA単離トリ・試薬(tri reagent)酸フェノール法をその供給者（モレキュラー・リサーチ・センター(Molecular Research Center)社；オハイオ州シンシナティ）の指定通りに行なうことにより、全RNAをヒト肝臓、脂肪組織、皮膚、胎盤、良性前立腺肥大組織（BPH）およびLNCaP細胞から単離した。ヒト前立腺肥大組織（BPH）とLNCaP細胞から得たmRNAを、オリゴ（dT）-セルロース（フアルマシア社；ウィスコンシン州ミルウォーキー）によるクロマトグラフィーでアフィニティー精製した。 cDNA単離アフィニティー精製したBPHおよびLNCaP細胞mRNAを使つて、ZAP発現ベクターに、その供給者（ストラタジェン社；カリフォルニア州ラホーヤ）の指定通りにして、cDNAライブラリーを構築した。フィルターを、40%ホルムアミド、5×デンハート液、5×SSPE、0.1%SDSおよび100mg/mlサケ精子DNA中42℃で4 時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはUGT2B7、UGT2B10およびUGT2B15c DNAから得た2.0×10⁶cpm/mlのプローブプールを用いて同じ溶液中42 ℃で16時間行なった。これらのcDNAプローブは、[α-³²P]dCTPの存在下にランダムプライマー法で放射標識した。そのフィルターを2×SSC、0.1%SDS中42℃で15 分間2回洗浄した後、増感紙とXAR5フィルム（コダック社；ニューヨーク州ロチェスター）に−80℃で2日間暴露した。約1×10⁶個の組換え体をスクリーニングした。30個の陽性クローンをLNCaP細胞ライブラリーから単離し、5個の陽性クローンをBPH cDNAライブラリーから単離した。これらのクローンのうち、LNCaPライブラリーからの2クローンとBPHライブラリーからの1クローンはUGT2B17をコードすることがわかった。特異的UGT オリゴヌクレオチドを使って、これら3つのcDNAクローンを両方向に配列決定したところ、5'非翻訳領域の長さとポリ（A+）末端中の残基数以外は同一であることがわかった。 UGT2B17の安定発現 5%CO₂の雰囲気下37℃の加湿培養器にて、4.5g/lグルコース、10mMHEPES、110μｇ/mlピルビン酸ナトリウム、100IUペニシリン/ml、100μ ｇ/mlストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改良イーグル培地でヒト腎293細胞を生育した。リポフェクチンを用いてその製造者（ギブコビーアールエル；カナダ・バーリントン）の指示に従って行なったHK29 3細胞の形質移入には、5μｇのpBK-CMV-UGT2B17を使用した。形質移入の48時間後、800μｇ/ml G418を含む培地で、安定な形質移入体を選択した。5回の選択後、高レベルのUGT2B17を安定に発現させるクローン細胞系が単離された。 UGT2B17酵素の活性 UGT2B17酵素をコードするcDNAをpBK-CMWベクター中に切出すことによって、UGT2B17タンパク質を発現させた。T3ポリメラーゼを用いてそのpBK-CMV-UGT2B17構築物を試験管内で転写し、得られた転写物をウサギ網状赤血球系を使って翻訳した。発現されたタンパク質は53キロダルトンの分子量を持つことがわかった。細胞ホモジネートを用いるグルクロン酸抱合アッセイ 0.5mM DTTを含むトリス緩衝食塩水にUGT2B17を発現するHK293細胞を懸濁し、ブリンクマン（Brinkman ）ポリトロンでホモジナイズした。酵素アッセイは[¹⁴C]UDP-グルクロン酸（UDP GP)）、500μＭの種々のアグリコンおよび細胞ホモジネートから得た150μｇのタンパク質を用いて、50mMトリス-塩酸（pH7.5）、10mM MgCl₂、100μｇ/mlホスファチジルコリンおよび8.5mMサッカロラクトン中、100μｌの最終体積で行なった。100μｌのメタノールを添加することによってこの酵素アッセイを停止し、各チューブを14,000gで1分間遠心分離して、沈降したタンパク質を除去した。その水相100μｌを薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（厚さ0.25mmのシリカゲル；60F₂₅₄S）（イーエム・サイエンス(EM Science)社；ニュージャージー州ギブスタウン）にのせ、トルエン：メタノール：酢酸（比率7：3：1）を溶媒とするクロマトグラフィーにかけた。そのTLCプレートを4日間暴露し、グルクロン酸抱合の程度をホスホルイメージャー（Phosphorimager；モレキュラーダイナミクス(Molecular Dynamics社)）で測定した。 UGT2B17と反応する基質をスクリーニングするために、基質を6μＭの[¹⁴C]UDP GAと94μＭの非標識UDPGAに30℃で16時間さらすアッセイを行なった。このスクリーニングアッセイでUGT2B17に対する反応性を示した化合物を、引き続いて再測定することにより、酵素活性の量を測定した。第二のアッセイでは、基質を6 μＭの[¹⁴C]UDPGAと494μＭの非標識UDPGAに30℃で15分間暴露した。UDPGAのKm が200μＭである場合、酵素反応はこれらの条件下で30分間は直線状である。グルクロン酸抱合活性は形質移入されていないHK293細胞には検出されなかった。上述のように、UGT2B17をコードする遺伝子を含むベクターでHK293細胞を形質移入することにより、UGT2B17の酵素活性を評価した。図3に示すように、安定に発現されたUGT2B17を含むHK293細胞ホモジネートを、そのアグリコン特異性について、TLCを使って分析した。表1に示すように、60種類を越える内因性物質と外因性物質を活性について試験したところ、それらのうち25種類の化合物がUGT2B1 7によってグルクロン酸抱合されることがわかった。UGT2B17タンパク質を含有しない対照HK293細胞ホモジネートでは、これら化合物のグルクロン酸抱合は起らなかった。 3αおよび17βヒドロキシアンドロゲンである下記の化合物が主な内因性基質であると確認された：ジヒドロテストステロンテストステロンアンドロステロンアンドロスタン-3α,17β-ジオールアンドロスタン-3β,17β-ジオールアンドロスタン-5-エン-3β,17β-ジオールまた表1に記載するように、試験したアンドロゲンのうちテストステロンとその5α-還元代謝産物、DHT、3α-ジオールおよびADTが、UGT2B17グルクロン酸抱合の好ましい基質である。 ADT、DHT、3α-ジオールおよびテストステロンに対するUGT2B17の特異性をさらに特徴づけるために、速度論的分析も行なった。図4Aと4Bに示すように、ADT 、DHT、3α-ジオールおよびテストステロンに対する本酵素の親和力は、それらのKm値によれば類似している。図5は特異的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析のサザンブロットであり、UGT2B17転写物を検出しうる組織の一部を示している。このように内因性および外因性化合物のグルクロニド誘導体への変換は、基質のレベルの制御に使用できる。さらに、UGT2B17のレベルはアンドロゲンのレベルと相関するので、組織中のアンドロゲン活性のレベルを示すために、UGT2B17 濃度の測定単位を使用することができる。抗血清を調製するためのUGT2B17融合タンパク質の作成と精製 UGT2B17酵素の 57位から300位までのアミノ酸配列からなる29kDaタンパク質を発現させるため、 UGT2B17 cDNAのHincII-SpeIフラグメントをpET23a（ノヴァジェン(Novagen)社；ウィスコンシン州）原核生物用発現ベクターにサブクローニングした。この組換えベクターを保有する大腸菌BL21細胞（ノヴァジェン社；ウィスコンシン州）を、アンピシリン（00μｇ/ml）を添加したテリフィックブロス培地1リットル中37 ℃で生育した。600nmでの吸光度が0.5〜0.6 OD単位に達した時点で、1mMイソプロピルβ-p-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して37℃で2時間培養することにより、融合タンパク質の生産を達成した。4℃、5000×gで10分間の遠心分離により、細胞を収集した。その細菌ペレットを25m1の溶菌緩衝液（125mMトリス-塩酸（pH8.0）、4.6%SDS、10%β-メルカプトエタノールおよび20%グリセロール）に再懸濁し、超音波発生器を用いて均一になるまで超音波処理した。タンパク質をSDS-PAGEにて調製用12%ポリアクリルアミドゲルで分離した後、50mMトリス-塩酸（pH7.5）と50mMトリス-塩酸（pH7.5）／150mM NaClを用いて、室温で4時間および4℃で16時間の2回の透析を行なった。免疫法環境制御室でウサギ（チャールズリバー(Charles River)社；カナダ・ケベック）をそれぞれ別々のカゴで飼育した。それらのウサギに、リン酸緩衝食塩水中の合計100μｇの精製融合タンパク質500μｌを500μｌの完全フロイントアジュバントと共に複数部位に注射した。6週間の間隔を置いて、不完全フロイントアジュバントと共に同じ量のタンパク質を使用して、2回の追加免疫注射を行なった。各注射の12日後に耳穿刺によって採取した血液で、抗体の産生を調べた。免疫ブロット分析新規抗UGT2B17抗体に関する情報を得るために、HK293細胞、安定なHK293-UGT2B17細胞のミクロソームと、処理済LNCaP細胞のミクロソームを標準的な方法で精製した。各ミクロソームタンパク質10μｇと、融合タンパク質を発現させるもしくは発現させない大腸菌BL21 pLys S（ノヴァジェン社）株1 00ngを、12%SDS-PAGEゲルで分離した。そのゲルをニトロセルロースフィルターに転写し、上記ウサギ抗血清の1:2000希釈液でプローブした。抗ウサギIgGセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（アマシャム社；カナダ・オークビル）を二次抗体として使用し、認識されたタンパク質を増強した化学発光（レナイッサンス(Renaissance)；カナダ・ケベック）で可視化し、ハイパーフィルム（コダック社；ニューヨーク州ロチェスター）に1時間暴露した。ポリクローナル抗体の反応性を立証するために、組換えUGT2B17融合タンパク質を含む100ngの大腸菌BL 21（pLys S）細胞溶解液を使用した。 UGT2B17 によるアンドロゲン活性の低下リポーター遺伝子の発現がアンドロゲン活性の指標となるように、LNCaP細胞をアンドロゲン反応要素によって制御されるリポーター構築物の存在下にUGT2B17で形質移入した。遺伝子導入された UGT2B17の存在はリポーター遺伝子の発現の減少につながることから、UGT2B17がアンドロゲンを抱合してアンドロゲン反応を終わらせることが示される。本発明をその特定の態様に関して説明し終えたが、その他の数多くの変法や変形およびその他の使用法は当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/573 ＡＧ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者ハム，ディーン・ダブリューカナダ、ジー１エックス・４エックス１、ケベック、ステ―フォイ、リュ・フィリッポン3847番 (72)発明者ボリュー，マルタンカナダ、ジー４ゼット・２ジー１、ケベック、ベ・コモー、ルイ・フィリップ・ガニュ67番 (72)発明者ルヴェスク，エリックカナダ、ジー１ブイ・２エックス７、ケベック、ヴィクトリアヴィラン、ブリエ90番

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１のコード領域もしくはその相補鎖に対して、厳密な条件下で十分ハイブリダイズし得るよう、配列番号１の配列またはその相補鎖の配列と十分な相同性を有し、該配列がアンドロステロンからアンドロステロン-グルクロン酸への転化を触媒する酵素をコード化するものである、ウリジンジホスホ-グルクロシルホスホトランスフェラーゼ2B17をコード化する単離されたヌクレオチド配列。２．該配列が配列番号１のコード領域を含む、請求項１記載のヌクレオチド配列。３．プロモーター配列と、請求項１記載のヌクレオチド配列とを含有する、組換え発現ベクター。４．プロモーター配列と、請求項２記載のヌクレオチド配列とを含有する、組換え発現ベクター。５．請求項４記載のベクターにて形質転換もしくは形質移入された、組換え宿主細胞。６．宿主細胞が真核細胞である、請求項５記載の組換え宿主細胞。７．請求項３記載のベクターにて形質移入された、組換え宿主細胞。８．宿主細胞が真核細胞である、請求項７記載の組換え宿主細胞。９．厳密な条件下で配列番号１の配列またはその相補鎖とハイブリダイズするヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノム内に組み込まれている、請求項８記載の組換え宿主細胞。１０．該ヌクレオチド配列が、組換えベクター上に存在している、請求項９記載の組換え宿主細胞。１１．宿主細胞が、生物活性を有するウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を発現し得る、請求項８記載の組換え宿主細胞。１２．配列番号１の配列のコード領域またはその相補鎖の３０個の連続したヌクレオチドと同一である少なくとも３０の連続したヌクレオチド配列を含有する、単離されたヌクレオチド配列。１３．配列番号１の配列中、５２位から９２７位のヌクレオチドを含有する、ヌクレオチド配列。１４．配列番号１の配列中、２０４位から７２３位のヌクレオチドを含有する、ヌクレオチド配列。１５．配列番号１のヌクレオチドを含有する、単離されたヌクレオチド配列。１６．配列番号２記載のものと同一のアミノ酸配列を有する、単離されたウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17酵素。１７．配列番号２記載のアミノ酸配列をコード化する、単離されたヌクレオチド配列。１８．請求項３記載のベクターにて形質転換もしくは形質移入された組換え宿主細胞を調製する、宿主細胞を、宿主細胞によるウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17産生が促されるような条件下で培養する、工程を含む、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を調製する方法。１９．請求項４記載のベクターにて形質転換もしくは形質移入された組換え宿主細胞を調製する、宿主細胞を、宿主細胞によるウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17産生が促されるような条件下で培養する、工程を含む、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を調製する方法。２０．ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17またはその抗原性フラグメントを含む固定化抗原性組成物、該固定化抗原と該抗原に対する抗体との複合体を検出する手段を含有する、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗体を検出するためのキット。２１．ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17またはその抗原性フラグメントに対する抗体である、固定化抗体、固定化抗体とウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17との複合体を検出するための手段を含有する、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17検出のためのキット。２２．精製もしくは組換えウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗血清。２３．ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を投与することを含む、ある組織中のアンドロゲン化合物の濃度を変化させる方法。２４．アンドロゲン性化合物が、ジヒドロテストステロンである、請求項２３記載の方法。２５．ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17を投与することを含む、ある組織中のアンドロゲン性化合物の活性を変化させる方法。２６．ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する標識化抗体を投与する、次いで標識を検出する工程を含む、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の局所濃度を検出する方法。２７．配列番号１のコード領域またはその相補鎖内へ、少なくとも３０の連続したヌクレオチド配列を導入することを含む、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17合成のブロック方法。２８．ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の濃度を測定する工程を含む、試料中のアンドロゲン活性レベルの変化を検出する方法。２９．試験試料をウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2Bl7に対する抗体と接触させ、この抗体とウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17との免疫複合体の生成を測定する工程を含む、試験試料中のウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17の検出方法。３０．試験試料をウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17と接触させ、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗体と、ウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17との免疫複合体の生成を測定する工程を含む、試験試料中のウリジンジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ2B17に対する抗体の測定方法。