JP2002065284A - 新規酵素遺伝子およびその発現産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミド
トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：ｆｒｕｃｔ
ｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍｉｄｏｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅ、以下、ＧＦＡＴ）活性を示す新たな遺
伝子、殊に骨格筋に特異的に発現する該遺伝子、その発
現物、新たな作用機序による糖尿病疾患の予防や治療の
ための組成物の提供。 【解決手段】ヒト骨格筋由来の特定のアミノ酸配列のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝
子、該遺伝子を発現させて得られる遺伝子発現産物、該
遺伝子を有する組換え体発現ベクター、該ベクターを保
有する宿主細胞（形質転換体）、上記アミノ酸配列から
なる蛋白質、上記遺伝子又は蛋白質を有効成分として含
有する低血糖症の治療又は予防用組成物、該蛋白質に結
合性を有する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、グルタミン：フル
クトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ（Glu
tamine：fructose-6-phosphate amidotransferase、以
下、ＧＦＡＴと略記する）の活性を有する新規な酵素の
遺伝子、およびその遺伝子によってコードされるアミノ
酸配列を有する新規な蛋白質（酵素）に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＧＦＡＴは、生体内におけるヘキソサミ
ン生合成経路において、律速段階であるフルクトース−
６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触
媒する重要な酵素である。近年、マクナイト(McＫnigh
t)らは、６８１アミノ酸配列からなる該酵素のヒト遺伝
子を報告した(McKnight, G. L. , et al., J. Biol. Ch
em., 267, 25208-25212 (1992)。その後、新たなヒトＧ
ＦＡＴ遺伝子が、ニシらによって報告されている(米国
特許第5,876,713号)。

【０００３】このＧＦＡＴの活性を阻害する薬剤は、細
胞内へのグルコースの取り込みを促進し、血糖値を低下
させることができると考えられており、そのため糖尿病
治療薬として期待されている。即ち、インスリンにより
細胞内にグルコースの取り込みが促進され、取り込まれ
たグルコースは解糖系により代謝されエネルギー源とし
てのＡＴＰを蓄積するが、過剰に取り込まれた場合はグ
ルコース代謝物であるフルクトース−６−リン酸がヘキ
ソサミン生合成経路へ流れる。このヘキソサミン生合成
経路へ流れたフルクトース−６−リン酸は、ＧＦＡＴに
よりグルコサミン−６−リン酸に変換される。

【０００４】グルコサミン−６−リン酸代謝産物が糖輸
送担体の膜移行を抑制し、それによって細胞内へのグル
コースの取り込みが抑制されることが報告されている(F
ASEBJ.，5, 3031-3036 (1991)）; Diabetologia, 38, 5
18-524 (1995);.J. Biol. Chem., 266, 10155-10161 (1
991); J. Biol. Chem., 266, 4706-4712 (1991); Endoc
rinology, 136, 2809-2816 (1995)）。

【０００５】糖代謝経路において、ヘキソサミン生合成
経路は、グルコースの過剰取り込みに対するフィードバ
ック機構として機能することが一つの役割として考えら
れており、ＧＦＡＴはその経路における律速酵素として
重要であるとされている。更に、インスリンに依存しな
い２型糖尿病患者においては、このＧＦＡＴ活性が一般
的に高いことが知られており、高血糖値を示す一つの原
因であるとも報告されている(Diabetes, 45, 302-307
(1996))。

【０００６】ＧＦＡＴは、ヒト由来(J. Biol. Chem., 2
67, 25208-25212 (1992):米国特許第5,876,713号）の
他、マウス由来、酵母由来および大腸菌由来のものが報
告されている。これらはいずれもヒトＧＦＡＴと高い相
同性を示す。しかるに、現在、糖代謝において重要な臓
器である骨格筋に特異的な新規なＧＦＡＴの存在につい
ては未だ知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ＧＦＡＴ活性を示す新
たなＧＦＡＴの遺伝子の単離は、ヘキソサミン生合成経
路におけるＧＦＡＴによる調節機能の解明に役立ち、ま
た骨格筋などの臓器特異的に発現するＧＦＡＴ遺伝子の
単離は、その臓器での糖代謝系機構の解明について更な
る研究を可能とする。更に、これらの遺伝子によってコ
ードされるアミノ酸配列の発現物としてのＧＦＡＴ蛋白
質に対して阻害活性を有する特異的な候補化合物が見い
出されれば、新たな作用機序を有する糖尿病疾患の予防
や治療に役立つ血糖低下薬の開発が可能となる。

【０００８】従って、本発明の課題は、かかる新たなＧ
ＦＡＴの遺伝子、殊に骨格筋に特異的に発現するＧＦＡ
Ｔの遺伝子を単離する点にある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
より研究を重ねた結果、ヒト骨格筋ｍＲＮＡライブラリ
ーから、ＧＦＡＴ活性を有する蛋白質をコードする新規
な塩基配列のｃＤＮＡのクローニングに成功し、ここ
に、ヒト骨格筋および心臓に特異的に発現する所望の遺
伝子に係わる本発明を完成するに至った。

【００１０】即ち、本発明によれば、以下の要旨の発明
が提供される。 (1)以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオ
チドを含む遺伝子： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補
鎖、 （ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
とも９８％の相同性を持つポリヌクレオチドまたはそれ
らの相補鎖、 （ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数
個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配
列からなり且つＧＦＡＴ活性を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖。 (2)以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドから
なる遺伝子： （ａ）配列番号：２で示される塩基配列またはその相補
鎖、 （ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチド
と高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ポリヌクレオチド。 (3)配列番号：２で示される塩基配列である上記(2)に記
載の遺伝子。 (4)上記(1)または(2)に記載の遺伝子を発現させて得ら
れる遺伝子発現産物。 (5)上記(1)または(2)に記載の遺伝子を有する組換え体
発現ベクター。 (6)上記(5)に記載の組換え体発現ベクターを保有する宿
主細胞。 (7)上記(5)に記載の組換え体発現ベクターで形質転換さ
れた形質転換体。 (8)以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋
白質、 （ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数
個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配
列からなり且つＧＦＡＴ活性を有する蛋白質。 (9)上記(1)または(2)に記載の遺伝子または上記(4)に記
載の遺伝子発現産物を有効成分として含有する低血糖症
の治療または予防用組成物。 (10)上記(8)に記載の蛋白質を有効成分として含有する
低血糖症の治療または予防用組成物。 (11)上記(4)に記載の遺伝子発現産物および上記(8)に記
載の蛋白質およびこれらの断片から選ばれるいずれかに
結合性を有する抗体、特にモノクローナル抗体。 (12)上記(1)に記載の遺伝子または上記(4)に記載の遺伝
子発現産物および上記(8)に記載の蛋白質の酵素活性を
阻害する候補化合物をスクリーニングする方法であっ
て、上記(11)に記載の抗体と、候補化合物を含む被検液
および標識化された請求項８に記載の蛋白質またはその
部分ペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した
標識化された蛋白質またはその部分ペプチドの割合を測
定するか、(2)候補化合物を含む被検液と、担体上に不
溶化した上記抗体および標識化された他の抗体とを同時
あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識
剤の活性を測定するか、或いは(3)上記(8)に記載の蛋白
質またはその部分ペプチドに基質を接触させた場合と、
同蛋白質またはその部分ペプチドに基質および候補化合
物を接触させた場合とにおける、同蛋白質またはその部
分ペプチドの酵素活性を測定、比較することを特徴とす
るスクリーニング方法。 (13)上記(12)に記載の候補化合物のスクリーニング方法
に用いられるスクリーニング用キットであって、測定用
緩衝液、上記(8)に記載の蛋白質またはその部分ペプチ
ドおよび基質としてのフルクトース−６−リン酸および
グルタミンをキット成分として含有するキット。

【００１１】また、本発明によれば、以下の要旨の発明
も提供される。 (14)前記(4)に記載の遺伝子発現産物または(8)に記載の
蛋白質(以下、これらを「ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質」と総称
する)或いはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の断片（部分ペプチ
ド）に対する抗体と、被検液および標識化されたＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質またはその断片とを競合的に反応させ、該
抗体に結合した標識化されたＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質または
その断片の割合を測定することを特徴とする被検液中の
ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片の定量法。 (15)被検液と、担体上に不溶化した前記(14)に記載の抗
体および標識化された別の異なるＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質に
対する抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、
不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とす
る被検液中のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片の定量
法。 (16)ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質に対する抗体（好ましくは、Ｇ
ＦＡＴ１Ｌ蛋白質の活性を中和する活性を有するＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質に対する抗体）を含有してなる医薬、特に
糖尿病の治療および予防剤である医薬。 (17)ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片に基質を接触さ
せた場合と、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片に基質
および試験化合物を接触させた場合とにおける、ＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質またはその断片の酵素活性を測定、比較す
ることを特徴とする、ＧＦＡＴ酵素活性を阻害する化合
物のスクリーニング方法。

【００１２】更に本発明によれば、以下の要旨の発明も
提供される。 (18)ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のＤＮＡに相補的または実質的
に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得
る作用を有するアンチセンスＤＮＡ。 (19)ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のＤＮＡに実質的に相補的な塩
基配列が、該ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列で
あるかあるいは部分塩基配列と約９８％以上（好ましく
は約９９％以上）の相同性を有する塩基配列であるＧＦ
ＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ。 (20)ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含有し
てなる医薬組成物、特に糖尿病の治療および予防剤であ
る医薬組成物。

【００１３】本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩
基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological No
menclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、
「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成の
ためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野にお
ける慣用記号に従うものとする。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
およびＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質につき、詳述する。

【００１５】本発明蛋白質は、配列番号：１で示される
アミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列
を含有することで特徴付けられる。本発明蛋白質は、例
えば、ヒト細胞、特にヒト横紋筋細胞、あるいは例えば
ヒト組織、特に骨格筋、心臓に由来する蛋白質であるこ
とができ、また合成蛋白質であることもできる。

【００１６】上記配列番号：１で示されるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列
番号：１で示されるアミノ酸配列と約９８％以上、好ま
しくは約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙
げられる。該配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質には、前記
した配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列を有し
且つ配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含有する本
発明蛋白質と実質的に同質のＧＦＡＴ活性を有する蛋白
質が包含される。ここで実質的に同質とは、その活性が
性質的に（例えば生理化学的または薬理学的に）同質で
あることを示す。従って、ＧＦＡＴ活性の程度や蛋白質
の分子量などの量的要素は当然に異なることができる。

【００１７】ＧＦＡＴ活性の測定は、それ自体公知の方
法、例えばマーシャルらの方法(Marshall, et. al., J.
Biol. Chem., 266(8), 4706-4712 (1991))に準じて行
なうことができる。

【００１８】また、本発明蛋白質には、配列番号：１で
示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ
酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し且
つＧＦＡＴ活性を有するものも包含される。

【００１９】また、本発明において「ＧＦＡＴ活性」と
は、後記実施例に示されるように、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミンがＧＦＡＴ活性を阻害することにおい
て、フルクトース−６−リン酸を基質とした場合の、そ
の阻害様式が、混合阻害様式で示されるＧＦＡＴ活性を
いい、上記阻害様式が拮抗阻害様式であるものとは明確
に区別される。以下、本明細書においては、かかる本発
明に特有の混合阻害様式を示すＧＦＡＴ活性を単に「Ｇ
ＦＡＴ活性」と称するものとする。

【００２０】上記アミノ酸配列の欠失、置換または付加
の位置は、かかる改変されたアミノ酸配列を有する蛋白
質がＧＦＡＴ活性を有する限り、任意であり、これら欠
失、置換、付加の数も、同様にＧＦＡＴ活性を有する限
り任意であることができる。

【００２１】本発明遺伝子の一具体例としては、後述す
る実施例に示される「ＧＦＡＴ１Ｌ」と名付けられたＰ
ＣＲ産物のＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げること
ができる。その塩基配列は、配列番号：２に示されると
おりである。

【００２２】該遺伝子は、配列番号：１で示される６９
９アミノ酸配列の、骨格筋および心臓特異的蛋白質（Ｇ
ＦＡＴ１Ｌ蛋白質）をコードするものであり、全長２０
９７塩基からなっている。

【００２３】本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子は、マクナイト
らによってクローニングされたＧＦＡＴ遺伝子(McKnigh
t, G.L., et. al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212
(1992))の６８４番目と６８５番目の塩基の間に、５４
個の塩基が挿入された新規な配列を有することが確認さ
れた。

【００２４】従って、本発明遺伝子によりコードされる
ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質のアミノ酸配列は、上記マクナイト
らの報告による遺伝子から演繹されるアミノ酸配列の２
２８番目と２２９番目の間に、新たな１８個のアミノ酸
配列が挿入されたものである。

【００２５】本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、ＧＦＡＴ活
性を有し、例えば低血糖の改善薬として有用である。ま
た本発明遺伝子のアンチセンスＤＮＡや本発明遺伝子の
発現産物に対する抗体は、糖尿病疾患の治療効果が予測
され、更にこれらを利用した糖尿病治療剤としての候補
化合物のスクリーニングへの利用も可能である。

【００２６】本発明において遺伝子は、２本鎖ＤＮＡの
みならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス
鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、また
その長さに何ら制限されるものではない。従って、本発
明遺伝子(DNA）には、特に言及しない限り、ヒトゲノム
ＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖
ＤＮＡ（センス鎖）並びに該センス鎖と相補的な配列を
有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）およびそれらの
断片のいずれもが含まれる。

【００２７】また本発明遺伝子(ＤＮＡ）は、リーダ配
列、コード領域、エキソン、イントロン等を含むこがで
きる。ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例
示できる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成Ｄ
ＮＡを含み、特定アミノ酸配列を有するポリペプチド
は、その断片、同族体、誘導体、変異体を含み得る。

【００２８】遺伝子における変異体は、天然に存在する
アレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、
付加および挿入を有する変異体等であって、これらによ
りコードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しな
いものを意味する。

【００２９】ポリペプチドは、アレル体、ホモログ、天
然の変異体で少なくとも９８％、好ましくは９９％相同
なものを含む。

【００３０】また、本発明遺伝子発現産物の生物活性、
即ちＧＦＡＴ活性とは、フルクトース−６−リン酸から
グルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する作用とし
て例示される。また、これはヒトまたは哺乳動物の血糖
の上昇作用としても捉えることができる。なおＤＮＡお
よびポリペプチドにおける相同性は、配列分析ソフトウ
ェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用した測定（Cl
ustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994))に
て解析することがでる。

【００３１】前記本発明遺伝子における変異体は、これ
によりコードされるアミノ酸置換についてサイレントま
たは保存変異体を意味し、その塩基配列によってコード
されるアミノ酸残基が変らない塩基配列の変異のことを
表わす。

【００３２】保存的なアミノ酸置換の数は以下に示され
るとおりである： 元のアミノ酸残基 保存的な置換アミノ酸残基 Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His AsnまたはGln Ile LeuまたはVal Leu IleまたはVal Lys Arg, Alnまたは Glu Met LeuまたはIle Phe Met, LeuまたはTyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr TrpまたはPhe Val IleまたはLeu。

【００３３】加えて、一般にシスティン残基をコードす
る１またはそれ以上のコドンは、特定のポリペプチドの
ジスフィド結合に影響を与えるのでシステイン残基の欠
失の結果、置換することが可能である。

【００３４】置換基を選択することによって作られる機
能における実質的な変化は、上記アミノ酸のリストに記
載されたものより少し保存性が劣っている：例えば、 a)置換基の領域におけるポリペプチドの構造背景、 b)標的部位のポリペプチドの電荷または疎水性、 c)アミノ酸側鎖の大きさ(容積)。

【００３５】蛋白の特性に最も大きな変化を生み出すと
一般的に期待される置換は、以下のものである： a) 親水性残基、例えばセリルまたはスレオニンが疎水
性残基例えば、ロイシル、イソロイシル、ファニルアラ
ニル、ヴァリルまたはアラニイルに対して置換される、 b) システィンまたはプロリンは、いかなる他の残基に
対して置換される、 c) 電気的陽性側鎖を有している残基、例えば、リジ
ル、アルギニリル、ヒスタジルは電気的陰性残基、例え
ば、バルタアミルまたはアスパルチルによって置換され
るが、 d) 非常に大きな側鎖を有している残基、例えば、フェ
ニルアラニンはグリシンのような側鎖を有しないものと
置換できる。

【００３６】本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子およびその遺伝
子産物の提供は、糖尿病の解明、把握、診断、予防およ
び治療などに極めて有用な情報乃至手段を与える。ま
た、本発明遺伝子は、上記の処置に利用される本発明遺
伝子の発現を抑制または誘導する新規薬剤の開発の上で
も好適に利用できる。更に、個体或は組織における本発
明遺伝子の発現を抑制または誘導するその産物の発現の
検出や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）乃至発現異常
の検出は、上記糖尿病病態の解明や診断において好適に
利用できる。

【００３７】前記改変されたアミノ酸配列をコードする
本発明遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸配
列をコードする本発明遺伝子が検出できるものであって
もよい。

【００３８】本発明遺伝子の具体例としては、例えば配
列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコ
ードする塩基配列を有するＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を挙げる
ことができるが、本発明遺伝子は特にこれに限定される
ことなく、当該ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の相同物をも包含す
る。

【００３９】ここで「ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の相同物」と
は、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子（またはその遺伝子産
物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴並びに遺伝子
発現パターンにおける共通性および上記したようなその
生物学的機能の類似性（例えばＦＡＳＴＡプログラムを
使用した相同性）より、ひとつの遺伝子ファミリーと認
識される一連の関連遺伝子を意味する。

【００４０】上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、
天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などによ
り生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発
明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子）に基づいて人為的に改変するこ
ともできる。本発明は、このような改変・変異の原因お
よび手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺
伝子を包含する。本発明の遺伝子には、配列番号：１で
示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝
子の対立遺伝子（アレル体）もまた包含される。

【００４１】上記の人為的手段としては、例えばサイト
スペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzym
ology, 154, 350, 367-382 (1987)；同100, 468 (198
3)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学
実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105
(1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステ
ル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am.
Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同91, 3350 (1969)；Sc
ience, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 1859
(1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方
法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成
は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による
化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴ
ヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断
片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニ
ーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共に
ＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによっ
て、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。

【００４２】本発明遺伝子の具体的態様としては、配列
番号：２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示でき
る。この塩基配列(コーディング領域)は、配列番号：１
に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドン
の一つの組合せ例を示している。本発明の遺伝子は、か
かる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ
酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配
列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に
従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度
などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9,
43 (1981)〕。

【００４３】また、本発明遺伝子は、前記のとおり、配
列番号：２に示される塩基配列と一定の相同性を有する
塩基配列からなるものも包含する。

【００４４】上記相同性を有する塩基配列からなるもの
とは、配列番号：２に示される塩基配列と少なくとも９
８％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を
有するポリヌクレオチドおよびそれらの相補鎖ポリヌク
レオチドをいう。

【００４５】かかる遺伝子としては、例えば、０．１％
ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、６０℃または０．１％
ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、６０℃の高いストリン
ジェントな条件下で、配列番号：２に示される塩基配列
からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する
遺伝子を例示することができる。

【００４６】本発明遺伝子は、本発明により開示された
本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、
一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得するこ
とができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring H
arbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子
研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参
照〕。

【００４７】具体的には、本発明遺伝子が発現される適
当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調
製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当
なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択す手法を
挙げることができる〔Proc.Natl. Acad. Sci., USA., 7
8, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。

【００４８】上記において、ｃＤＮＡの起源としては、
本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに
由来する培養細胞などが例示される。また、これらから
の全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの
取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実
施することができる。また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡラ
イブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれ
らｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー、例えばクロー
ンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されて
いる各種ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーなどを用
いることもできる。

【００４９】本発明の遺伝子をｃＤＮＡのライブラリー
からスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常
の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮ
Ａによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異
抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃ
ＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選
択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイ
ゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、これら
の組合せなどを例示できる。

【００５０】ここで用いられるプローブとしては、本発
明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合
成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得
された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。ま
た、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセン
ス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリー
ニング用プローブとして用いることもできる。

【００５１】前記プローブとして用いられるヌクレオチ
ド配列は、配列番号：２に対応する部分ヌクレオチド配
列であって、５４塩基の挿入配列部分の一部を少なくと
も含む１５個以上の連続した塩基、好ましくは２０個の
連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、
最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものであ
る。或いは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプ
ローブとして用いることもできる。

【００５２】本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ
法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮ
Ａ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから
全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ
法〔Rapid amplification ofcDNA ends；実験医学、12
(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohma
n, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1
988)〕などの採用が好適である。

【００５３】かかるＰＣＲ法の採用に際して使用される
プライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺
伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に
従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片
の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例え
ばゲル電気泳動法などによればよい。

【００５４】また、上記で得られる本発明遺伝子或いは
各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサ
ム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499
(1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエン
スキットなどを用いて、その塩基配列を決定することが
できる。

【００５５】このようにして得られる本発明の遺伝子に
よれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を
利用することにより、個体もしくは各種組織における本
発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができ
る。

【００５６】かかる検出は常法に従って行うことがで
き、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polyme
rase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplif
ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to method
s and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 2
1-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅、ノーザンブロッティ
ング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor La
b. (1989)〕、in situＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Re
s., 21, 3159-3166 (1993)〕、in situ ハイブリダイゼ
ーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢ
Ａ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, N
ature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を
挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検
出法を挙げることができる。

【００５７】尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用い
られるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅
できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はな
く、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定すること
ができる。通常、１０〜３５ヌクレオチド程度、好まし
くは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有する本発明
遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。

【００５８】このように、本発明の遺伝子には、本発明
にかかるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を検出するための特異プラ
イマーおよび／または特異プローブとして使用されるＤ
ＮＡ断片もまた包含される。

【００５９】当該ＤＮＡ断片は、配列番号：２に示され
る塩基配列からなるＤＮＡと高いストリンジェントな条
件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとし
て規定することできる。ここで、高いストリンジェント
な条件としては、プライマーまたはプローブとして用い
られる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされ
ないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む
０．２×ＳＳＣ中、６０℃の条件または０．１％ＳＤＳ
を含む０．１×ＳＳＣ中、６０℃の条件を例示すること
ができる。

【００６０】本発明のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子によれば、通
常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産
物（ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易
に大量に、安定して製造することができる。

【００６１】従って本発明は、本発明遺伝子によってコ
ードされるＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質などの蛋白質を始め、該
蛋白質の製造のための、例えば本発明遺伝子を含有する
ベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細
胞、該宿主細胞を培養して上記本発明蛋白質を製造する
方法などをも提供するものである。

【００６２】本発明蛋白質の具体的態様としては、配列
番号：１に示すアミノ酸配列を有するＧＦＡＴ１Ｌ蛋白
質を挙げることができるが、本発明蛋白質には、該ＧＦ
ＡＴ１Ｌ蛋白質のみならず、その相同物も包含される。
該相同物としては、上記配列番号：１に示されるアミノ
酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置
換または付加されたアミノ酸配列を有し且つ前記ＧＦＡ
Ｔ活性を有する蛋白質を挙げることができる。ここで前
記ＧＦＡＴ活性とはフルクトース−６−リン酸からグル
コサミン−６−リン酸への反応を触媒する作用または血
糖上昇作用を例示でき且つフルクトース−６−リン酸を
基質としてＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンがＧＦＡ
Ｔに対して、混合阻害の様式を示すものを包含するもの
とする。具体的には、前記ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の相同物
（アレル体を含むＧＦＡＴ１Ｌ同等遺伝子）の遺伝子産
物を挙げることができる。

【００６３】また、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の相同物
には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のＧＦＡＴ
１Ｌ蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒ
ト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラ
ット、ウサギなどの哺乳動物の蛋白質も包含される。

【００６４】本発明の蛋白質は、本発明により提供され
るＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺
伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984)
; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；
Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など
参照〕に従って調製することができる。

【００６５】該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望
の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組
換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞
に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで
得られる培養物から回収することにより行なわれる。

【００６６】上記宿主細胞としては、原核生物および真
核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の
宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いら
れるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株を例示
できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵
母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞
であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕、チャイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77:
4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス
属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限
定される訳ではない。

【００６７】原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主
細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中
に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプ
ロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガー
ノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン
（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利
用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来の
プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵ
Ｃ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに
限定されず既知の各種のベクターを利用することができ
る。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクター
の市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham P
harmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡＬ−Ｐ
２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２
１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（In
vitrogen社）等を例示できる。

【００６８】脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベク
ターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の
上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有する
ものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有し
ていてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的に
は、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ
Ｖ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例
示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用
いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用さ
れるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦ
Ｐ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮＤ（I
nvitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitroge
n社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ
ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（PharMi
ngen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈ
ｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen
社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。

【００６９】また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベ
クターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺
伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示で
きる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰ
ＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen
社）なとが包含される。

【００７０】プロモーターとしても特に限定なく、エッ
シェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトフ
ァン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを
好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合
は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモ
ーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモ
ーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモ
ーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適
に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ま
しいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネイン
プロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメ
ガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを
例示できる。

【００７１】尚、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用でき
る。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現
させるためのｐＧＥＸ（Promega社）などを例示でき
る。

【００７２】また、成熟ポリペプチドをコードする配列
が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポ
リヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が
例示でき、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精
製に使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タ
グ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグ
を例示できる。

【００７３】所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿
主細胞への導入法およびこれによる形質転換法として
は、特に限定されず、一般的な各種方法を採用すること
ができる。

【００７４】また得られる形質転換体は、常法に従い培
養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によ
りコードされる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細
胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分
泌）される。

【００７５】該培養に用いられる培地としては、採用し
た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利
用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施で
きる。

【００７６】かくして得られる本発明の組換え蛋白質
は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利
用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、
1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社
東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (198
6); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕に
より分離、精製できる。

【００７７】該方法としては、具体的には、通常の再構
成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、
浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これ
らの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本
発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを
利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示す
ることができる。

【００７８】尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝
子の設計に際しては、配列番号：２に示されるＧＦＡＴ
１Ｌ遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。
該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドン
を適宜選択変更して利用することも可能である。

【００７９】本発明蛋白質は、また、配列番号：１に示
すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製
造することができる。該方法には、通常の液相法および
固相法によるペプチド合成法が包含される。

【００８０】かかるペプチド合成法は、より詳しくは、
アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐
次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエ
ロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメン
トを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング
反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包
含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよ
い。

【００８１】上記ペプチド合成に採用される縮合法も、
常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水
物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰ
Ａ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物
（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ
サクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法
などを例示できる。

【００８２】これら各方法に利用できる溶媒も、この種
ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている
一般的なものから適宜選択することができる。その例と
しては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミ
ド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸
エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることが
できる。

【００８３】尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応
に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシ
ル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエス
テル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低
級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メ
トキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル
などのアラルキルエステルなどとして保護することがで
きる。

【００８４】また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例
えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル
基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基など
で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要
はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基
は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホ
ニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシ
カルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダ
マンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により
保護することができる。

【００８５】上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドお
よび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護
基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還
元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭
化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メ
タンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施する
ことができる。

【００８６】かくして得られる本発明蛋白質は、前記し
た各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグ
ラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などの
ペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精
製を行うことができる。

【００８７】本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、その特異抗
体を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、
この抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリク
ローナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得するこ
とができる。

【００８８】該抗体の製造法自体は、当業者によく理解
されているところであり、本発明においてもこれら常法
に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫
生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。

【００８９】かくして得られる抗体は、例えばＧＦＡＴ
１Ｌ蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ない
しは識別などに有利に利用することができる。より具体
的には、本発明遺伝子の発現が骨格筋や心臓の組織にお
いて確認されていることから、該抗体を用いて、ＧＦＡ
Ｔのこれら組織中での濃度の測定に利用することができ
る。

【００９０】上記で得られた本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質
は、これを有効成分とする医薬品として医薬分野におい
て有用である。従って、本発明は本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋
白質を有効成分とする医薬組成物をも提供するものであ
る。

【００９１】本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の医薬としての
有用性は上記したようにその糖代謝において、重要とさ
れる組織である骨格筋に特異的ポリペプチドが有するＧ
ＦＡＴ活性の促進、または低血糖改善作用の促進にあ
り、これらの活性を確認する方法は、例えば後記実施例
に記載されているMarshallらの方法(Marshall, J. Bio
l.Chem.,266(8), 4706-4712 (1991))に準じて実施でき
る。

【００９２】該方法は、ＧＦＡＴにより生成されたグル
タメート(Glutamate)をさらにグルタメート脱水素酵素
(Glutamate deydrogenase:GDH）と反応させる際に、同
時に補酵素であるAPADがAPADHに還元され、この還元反
応に伴った吸光度の変化をＧＦＡＴ活性として測定する
方法である。即ち、該方法では、96穴のマイクロプレー
トを用い、200μlの基質溶液(40 mM Sodium phosphate
buffer、pH 7.5、50 mM KCl、1.25 mM EDTA、0.3 mM AP
AD、6 U/ml (GDH)、0-6 mM Glutamine、0-6 mMFructose
-6-P (F6P))に適宜希釈したＧＦＡＴ１Ｌの大腸菌溶解
液の可溶性画分50μlを加え、37℃で60分間反応させ、
この時の365nmの吸光度の変化をマイクロプレートリー
ダーを用いる分光光度計法にて測定する。

【００９３】医薬組成物において有効成分とする蛋白質
には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。か
かる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例
えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マ
グネシウム、バリウム、アンモニウムなどのアルカリ金
属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含
される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当な有機酸
ないし無機酸との反応による酸付加塩も包含される。代
表的酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、
臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉
草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香
酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩
（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸
塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール
酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスル
ホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。

【００９４】上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成
分として、その薬学的有効量を、適当な医薬担体ないし
希釈剤と共に含有するものが含まれる。

【００９５】上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる
医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用さ
れる、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面
活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示で
き、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜
選択使用される。

【００９６】特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋
白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化
剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整
剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。

【００９７】上記安定化剤としては、例えばヒト血清ア
ルブミン、通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導
体などを例示でき、これらは単独でまたはそれぞれを組
合せたり、更にこれらに界面活性剤などと組合せて使用
できる。この組合せによれば、有効成分の安定性をより
向上させ得る場合がある。

【００９８】上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく例え
ばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれで
もよい。

【００９９】上記糖としても特に限定はなく、例えばグ
ルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖
類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの
糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖
類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コン
ドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類、それらの
誘導体などを使用できる。

【０１００】界面活性剤としても特に限定はなく、イオ
ン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき
る。例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンア
ルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テ
ル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセ
リド系などを使用できる。

【０１０１】セルロース誘導体としても特に限定はな
く、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシ
エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースナトリウムなどを使用できる。

【０１０２】上記糖類の添加量は、有効成分1μg当り約
0.0001mg程度以上、好ましくは約0.01〜10mg程度の範囲
とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成
分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.0001
〜0.01mg程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清ア
ルブミンの添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度
以上、好ましくは約0.001〜0.1mg程度の範囲とするのが
適当である。アミノ酸は、有効成分1μg当り約0.001〜1
0mg程度とするのが適当である。また、セルロース誘導
体の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以
上、好ましくは約0.001〜0.1mg程度の範囲とするのが適
当である。

【０１０３】本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量
は、広範囲から適宜選択されるが、通常約0.00001〜70
重量％、好ましくは約0.0001〜5重量％程度の範囲とす
るのが適当である。

【０１０４】また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、
例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加する
ことができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン
酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミ
ン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれら
のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）な
どを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示でき
る。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウ
ム、クエン酸などを例示できる。

【０１０５】本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用で
きる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした
後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解
して適当な濃度に調製した後に使用することも可能であ
る。

【０１０６】本発明の医薬製剤の投与単位形態として
は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表
的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒
剤、カプセル剤などの固体投与形態、溶液、懸濁剤、乳
剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含ま
れ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、
経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類さ
れ、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製す
ることができる。

【０１０７】例えば、錠剤の形態に成形するに際して
は、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリ
ウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カ
オリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなど
の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロッ
プ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキ
シメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合
剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキ
シメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプ
ロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウ
ム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、
炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ス
テアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ス
テアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制
剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム
などの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿
剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイ
ド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸
塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤な
どを使用できる。

【０１０８】更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した
錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィ
ルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ない
しは多層錠とすることもできる。

【０１０９】丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担
体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、
硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビア
ゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結
合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用で
きる。

【０１１０】カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有
効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質
ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調製さ
れる。

【０１１１】経口投与用液体投与形態は、慣用される不
活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶
液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなど
を包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ま
せることができ、これらは常法に従い調製される。

【０１１２】非経口投与用の液体投与投与形態、例えば
滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへ
の調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアル
コール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ
化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル、オリーブ油などの植物油などを
使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレ
イン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の
溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存
剤、分散剤などを添加することもできる。

【０１１３】滅菌は、例えばバクテリア保留フィルター
を通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および
加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直
前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのでき
る滅菌固体組成物形態に調製することもできる。

【０１１４】坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際
しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコー
ル、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエス
テル類、ゼラチン、半合成グリセライドなどを使用でき
る。

【０１１５】ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の
形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色
ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導
体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
シリコン、ベントナイト、オリーブ油などの植物油など
を使用できる。

【０１１６】経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標
準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。

【０１１７】尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色
剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品な
どを含有させることもできる。

【０１１８】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、
液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投
与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸など
の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応
じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、
坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤
は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は
経皮的に局所投与される。

【０１１９】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的に
は、該投与量は、通常、1日当りヒト体重1kg当り、約0.
01μg〜10mg程度、好ましくは約0.1μg〜1mg程度とする
のがよく、該製剤は1日に1回または数回に分けて投与す
ることができる。

【０１２０】上記により得られる本発明骨格筋特異的ポ
リペプチド、即ちＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、ＧＦＡＴ活性
を有しており、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白の全ポリペプチ
ドまたはその一部は、それら自身低血糖改善剤として有
用である。

【０１２１】また、後記実施例に示されるように本発明
遺伝子は、骨格筋や心臓の組織においてその発現が認め
られていることから、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアン
チセンスＤＮＡの全部または一部を包含する任意の遺伝
子発現ベクターを作成し、該発現ベクターをこれら骨格
筋組織において細胞内のｍＲＮＡに対して相補的配列を
有するＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害することにより強
制的にＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現を抑制させることがで
き、かくして、骨格筋組織におけるヘキソサミン生合成
経路においてＧＦＡＴの活性を阻害することができ、細
胞内へのグルコースの取り込みを促進させ、血糖値を低
下させることができ、結果として糖代謝を改善し、糖尿
病の進展の抑制または改善することができる。本発明遺
伝子は、かかる抗糖尿病作用を有する遺伝子治療用組成
物として、或いは遺伝子治療剤として利用できると考え
られる。

【０１２２】また、本発明は、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の全
部または一部を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該
ベクターによりＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を導入した細胞を有
効成分とする医薬を提供しようとするものである。

【０１２３】即ち、本発明によれば、配列番号：２で示
される塩基配列のアンチセンスＤＮＡ配列の全部または
一部を含むＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を含有する
遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＧ
ＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を導入した細胞、並びに
該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターにより
ＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を導入した細胞を有効
成分とする遺伝子治療剤が提供される。

【０１２４】また、本発明によれば、配列番号：２で示
される塩基配列のアンチセンスＤＮＡ配の全部または一
部を含むＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を含有する遺
伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＧＦ
ＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を導入した細胞を糖尿病患
者の骨格筋細胞または患者の筋肉組織部位に投与するこ
とによってこれら組織における糖代謝を改善し、糖尿病
の進展の抑制または糖尿病患者の糖代謝の改善をするこ
とを特徴とする糖尿病治療剤を提供することができる。

【０１２５】更にまた、本発明によれば、上記ＧＦＡＴ
１Ｌアンチセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用導入用
のウイルスベクターを有効成分として含有する医薬、特
に、骨格筋における糖代謝を改善するための処置などに
使用される当該医薬が提供される。

【０１２６】以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。
尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないか
ぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺
伝学および免疫学の慣用的な方法を用いることができ
る。これらは、例えばマニアティス(Maniatis,T., et a
l., Molecular cloning: A laboratory manual (Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Y
ork (1982))、サムブルック(Sambrook,J., et al.,Mole
cular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed.(Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Y
ork (1981))、アウスベル(Ausbel,F.M., et al., Curre
nt Protocols in Molecular Biology,John Wiley and S
ons, New York, New York,(1992))、グローバー(Glove
r,D., DNA Cloning,I and II(Oxford Press)(1985))、
アナンド(Anand,Techniques for the Analysis of Comp
lex Genomes,(Academic Press(1992))、グスリー(Guthr
ie,G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecul
ar Biology, (Academic Press)(1991))およびフィンク
(Fink,et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992)に記
載されている。

【０１２７】本発明は、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発
現する細胞において、細胞内のｍＲＮＡに対して相補的
配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、ＧＦＡＴ
１Ｌ遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬の
提供によるＧＦＡＴ活性抑制または血糖の上昇を抑制す
る遺伝子治療法を提供する。

【０１２８】該治療法は、例えばＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を
有するＧＦＡＴ発現細胞本来のｍＲＮＡと結合させる
か、あるいはＤＮＡ二重螺旋の間に入り込み三重鎖を形
成させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害す
ることによって、標的とする遺伝子の発現を抑制する方
法である。この方法は遺伝子のｍＲＮＡと相補的なアン
チセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該アンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する方法とし
てとらえることができる。

【０１２９】かかるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現機能を抑
制する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞における
ＧＦＡＴ活性または血糖の上昇を抑制することができ
る。当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する
ベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、
目的の細胞に導入することができる。

【０１３０】上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドを
用いた糖尿病の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、
アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これをＧＦＡＴ活
性発現細胞に感染させてアンチセンス・オリゴヌクレオ
チドを過剰発現させることにより、所望の血糖降下効果
を得ることができる。

【０１３１】このようにＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を有する細
胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入してＧＦ
ＡＴ１Ｌ蛋白の発現を抑制させる場合、当該アンチセン
ス・オリゴヌクレオチドは対応するＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
の全長に対応するものである必要はなく、例えば該ＧＦ
ＡＴ１Ｌ遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同
質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であ
っても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺
伝子を使用することもできる。

【０１３２】かかる組換えおよび染色体外維持の双方の
ための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野
において既に知られており、本発明ではかかる既知のベ
クターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレ
メントに連結したＧＦＡＴ１Ｌ のアンチセンス・オリ
ゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ目的の細胞内で当
該アンチセンス・オリゴヌクレオチド産物を発現できる
ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げるこ
とができる。かかるベクターとして、通常前述する発現
用ベクターを利用することもできるが、好適には、例え
ば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明
細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細
書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐｗＰ−１
９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／
またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitr
ogen社製）などを用いて、調製されたベクターを挙げる
ことができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス
・ベクターである。

【０１３３】なお、遺伝子導入治療において用いられる
ベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患
の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用す
ることができる。

【０１３４】その具体例としては、例えば、骨格筋に対
しては、骨格筋アクチン、ミオシン重鎖、クレアチンキ
ナーゼなどを例示できる。心臓に対しては、心房性ナト
リウム利尿ホルモン、Ventricle-specific myosine軽
鎖、Atrial- and ventricular-specific α-myosine重
鎖などを例示できる。また、肝臓に対しては、アルブミ
ン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、
トランスフェリン、トランススチレンなどを例示でき
る。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カ
ルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮およ
び胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイト
クロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、
１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示で
きる。

【０１３５】前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１
−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを
例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−
Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質
などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウロ
グロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１
４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンな
どを例示できる。

【０１３６】脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、
成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白
質、チロシンヒドロキシラーゼなどを例示できる。膵臓
に対しては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島
アミロイドポリペプチド、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを
例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カル
シトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラー
ゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンな
どを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎
臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを
例示できる。

【０１３７】なおアンチセンス・オリゴヌクレオチド導
入用ベクターの製造において、導入されるアンチセンス
・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子配列に対応
する相補配列全部または一部）は、本発明のＧＦＡＴ１
Ｌ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般
的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することが
できる。

【０１３８】かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチド
導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポ
レーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導
入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野
において既に知られている各種の方法に従って行うこと
ができる。なお、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・
オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体
単離状態でＧＦＡＴ活性または血糖の上昇を抑制するた
めの医薬や、治療研究のためのモデル系として利用する
ことも可能である。

【０１３９】遺伝子治療においては、上記のアンチセン
ス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象
とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与する
ことにより患者の標的細胞内に導入することができる。
この際全身的投与によれば、他の部位にＧＦＡＴｍＲＮ
Ａが発現し得るいずれの細胞にも到達させることができ
る。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒
久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り
返せばよい。

【０１４０】本発明の遺伝子治療方法は、前述するアン
チセンス・オリゴヌクレオチド導入用の材料（アンチセ
ンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内
に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より
一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入し
て、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex viv
o）法の両方の方法を包含する。

【０１４１】またＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・
オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を
切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も
可能である。

【０１４２】後述する、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子に対
応する配列のアンチセンス・オリゴヌクレオチド全部も
しくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび
該ベクターによりヒトＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを導入された細胞を有効成分と
する本発明の遺伝子治療剤は、特に糖尿病をその利用対
象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、
糖尿病以外にも糖尿病性神経症、糖尿病性腎症、糖尿病
性網膜症のような糖尿病合併症の治療、並びに遺伝子標
識をも目的として行うことができる。

【０１４３】また、アンチセンス・オリゴヌクレオチド
を導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象によ
り適宜選択することができる。例えば、標的細胞とし
て、ＧＦＡＴ発現が認められる細胞、特に骨格筋、心臓
組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細
胞などを挙げることができる。

【０１４４】上記遺伝子治療におけるアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法お
よび非ウイルス的導入方法が含まれる。

【０１４５】ウイルス的導入方法としては、例えば、Ｇ
ＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド
が正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、
ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を
挙げることができる。その他のウイルスベクターとして
は、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunode
ficiency virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクタ
ー（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイ
ルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクタ
ー、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Ba
rr virus）ベクターなどがあげられる。

【０１４６】非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、
リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソーム
と予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイ
ルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と
直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソ
ーム法〔Kato,K.,et al., J. Biol. Chem., 266, 2207
1-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして
高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方
法〔Yang,N.S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,8 7, 9568-
9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓
器や標的組織に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法
〔Wolff,J.A.,et al., Science, 247, 1465-1467 (199
0)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞
に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医
学のあゆみ, Vol.175,No.9,635-637(1995)〕；特定細胞
のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにする
ために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合す
るリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガン
ド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biotech
nol., 11, 202 (1993); Miller, et al.,FASEB J.,9, 1
90 (1995)〕などを使用することができる。

【０１４７】上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例え
ば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲ
ットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法
〔Wu, et al.,J.Biol.Chem., 266, 14338 (1991); Ferk
ol, et al.,FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)〕、標的細
胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを
標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方
法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8
7, 3410 (1990)〕などが含まれる。

【０１４８】また本発明で用いられる遺伝子導入法は、
上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入
法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる
方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡを
アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン
抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれ
ば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合
し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させる
ことにより本発明アンチセンス・オリゴヌクレオチドの
導入を行い得る。この方法では、アデノアイルスベクタ
ーにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的
な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。
また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボ
にて遺伝子導入を媒介できる。

【０１４９】以下、具体的な本発明のアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並び
に標的細胞または標的組織へのアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド導入法について述べる。

【０１５０】レトロウイルスベクター・システムは、ウ
イルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）
からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイル
スの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白
質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）な
どの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成
していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パ
ッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeat
s)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏ
ｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケー
ジング・シグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際に
タグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とク
ローニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス
・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ に対応する全ア
ンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはその断片）がウ
イルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイ
ルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パ
ッケージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広く
とることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにする
ことが重要である。

【０１５１】所望のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス
・オリゴヌクレオチドを組込んだベクターＤＮＡをヘル
パー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っ
ているウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡ
がパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌され
る。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞
に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写された
ＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入された
アンチセンス遺伝子が発現する。

【０１５２】尚、遺伝子の導入効率を上げる方法とし
て、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結
合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Ha
nenberg,H.,et al., Exp. Hemat., 23, 747 (1995)〕を
採用することもできる。

【０１５３】上記レトロウイルスベクター・システムに
おいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白
血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin,
J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Bio
l., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができる。

【０１５４】アデノウイルスベクターを利用する方法に
つき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、
バークネル〔Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Imm
unol., 158, 39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguch
i,Y.,et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)〕、鐘カ江
裕美ら〔実験医学, 12, 28-34 (1994)〕およびケナーら
〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91, 6
186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。

【０１５５】例えば、非増殖性アデノウイルスベクター
を作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ
１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目
的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入用
アンチセンス・オリゴヌクレオチド、即ち本発明ＧＦＡ
Ｔ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドその
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを転写するためのプ
ロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリ
Ａから構成）およびアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部
を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを
含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトラン
スフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こ
させて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することによ
り、所望のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴ
ヌクレオチドを包含するベクターである非増殖性アデノ
ウイルスベクターを作成することができる。また、コス
ミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込ん
で、末端蛋白質を付加した３’側アデノウイルスベクタ
ーを作成することもできる。更に組換えアデノウイルス
ベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能であ
る。

【０１５６】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの
製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養
系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。こ
れには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず
宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘ
ルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存
在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の
細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲ
ノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからな
り、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal
repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在してい
る。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマー
の役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや
宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必
須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの
左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調
節蛋白質のＲｅｐをコードしている。

【０１５７】組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、か
くして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この
方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の
両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセン
ス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチ
センス・オリゴヌクレオチド）を挿入したプラスミド
（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイ
ルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス
蛋白質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。
この両者の間には共通の塩基配列が存在しないように
し、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないよ
うにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例え
ば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、
さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３
細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染さ
せると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。
続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞
を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６
℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウ
ムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮す
る。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡ
Ｖを得ることができる。

【０１５８】ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの
方法に準じて行うことができる〔清水則夫ら、細胞工
学, 14(3), 280-287 (1995)〕。

【０１５９】本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチ
ド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢ
ウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエ
プスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リ
ンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属す
るウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Vir
ology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.188
9-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活
性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、
このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しな
ければならない。これは次の如くして実施できる。

【０１６０】即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む
標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そ
こに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込
み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当
な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベ
クターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクト
する。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面
免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生
型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ
陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選
択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組
換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ること
ができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞に
ウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の
組換えウイルスベクターを産生することができる。

【０１６１】組換えウイルスベクターを用いることなく
所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に
導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合
リポソームによる遺伝子導入法により実施することがで
きる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）
に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソー
ムの内容物を直接細胞内に導入する方法である。

【０１６２】上記膜融合リポソームによるアンチセンス
・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法に
よって行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Ce
ll Res.,159, 399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al.,G
ene introduction into animal tissues.In Trends and
Future Perspectives in Peptide and Protein DrugDe
livery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academi
c Publishers Gmbh.Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。

【０１６３】以下、該膜融合リポソームによるアンチセ
ンス・オリゴヌクレオチドの導入法につき概略する。即
ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと
所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドや発現蛋白質
などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合
させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由
来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパ
イクがある疑似またイルスともよばれる構造を有してい
る。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培
養細胞または組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃
で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容
物が細胞に導入され、所望のアンチセンス・オリゴヌク
レオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームと
して用いられる脂質としては、５０％(モル比）コレス
テロールとレシチンおよび陰電荷をもつ合成リン脂質
で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用
するのが好ましい。

【０１６４】また、別のリポソームを用いてアンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法とし
ては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・
オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方
法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et a
l.,B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)〕。この方法は、
プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、
リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によ
りプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用
を高めようとするものである。ここで用いられるリポソ
ームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（mult
ilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、
大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicle
s: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small unilame
llar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複
合体を作製し、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチ
ドを導入することも可能である。

【０１６５】プラスミト包埋カチオニックＭＬＶの調製
法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-
(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate
chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholin
e）およびＤＯＰＥ（dioleoylphosphatidylethanolamin
e）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホル
ム溶液（脂質濃度として1mM）を調製する。次いで総量1
μmolの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエ
バポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を
調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、
乾燥させる。次いで20μgの遺伝子導入用プラスミドを
含む0.5mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍ
ｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテ
ックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチセンス・
オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニ
ックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。

【０１６６】上記で得られたプラスミド包埋カチオニッ
クＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、
例えば発現目的アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組
み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤ
ＮＡ量として0.6μg、リポソーム脂質量として30nmolに
なるように包埋し、これを2μlのリン酸緩衝生理食塩液
に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織
に対して隔日投与する方法が例示できる。

【０１６７】ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を
目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒト
の体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義さ
れている。しかしながら、本発明における遺伝子治療と
は、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞
にＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の、ＧＦＡＴ発現抑制アンチセン
スＤＮＡとして特徴付けられるアンチセンス・オリゴヌ
クレオチドを導入することによって糖尿病を始めとする
糖尿病合併症の治療のみならず、更に標識となる遺伝子
または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒト体内に導
入することも含むものとする。

【０１６８】本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子
の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的に
は２種類の方法が含まれる。

【０１６９】その第１法は、目的とするアンチセンス・
オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセン
ス・オリゴヌクレオチド）を導入された、アデノウイル
スベクター等のウイルスベクターを患者の標的細胞また
は標的組織に直接感染させる遺伝子導入法である。

【０１７０】上記第１法の別法として、目的アンチセン
ス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチ
センス・オリゴヌクレオチド）を含有するウイルスベク
ターを感染、あるいはウイルスベクターを含有するウイ
ルス産生細胞と共培養し、患者由来の細胞に目的アンチ
センス・オリゴヌクレオチドを導入し、患者体内に移植
するex vivo法も採用することができる。

【０１７１】第２法は、目的とする適当な動物細胞発現
ベクタープラスミドＤＮＡに組み込まれたアンチセンス
・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセ
ンス・オリゴヌクレオチド）を直接患者の体内や、骨格
筋などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法（直接
法）である。これは例えばＨＶＪリポソーム法、カチオ
ニックリポソーム法、ＤＮＡ直接注射法、電気穿孔法、
遺伝子銃法等により実施できる。

【０１７２】上記実施においては、特に体外における予
備試験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的ア
ンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入されるか
否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による
検索やin situＰＣＲ法によって確認するか、あるいは
目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ
遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）の導入に
基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇または低
下や、標的細胞への効果を確認することが望ましい。ま
た、ウイルスベクターを用いる場合には、増殖性ウイル
スの検索をＰＣＲ法で行うなどして、遺伝子治療に際
し、これらのアンチセンス・オリゴヌクレオチド等の導
入による安全性を確認することが重要であることはいう
までもない。

【０１７３】本発明はまた、本発明のアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド導入用ベクターまたは目的アンチセン
ス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチ
センス・オリゴヌクレオチドど）が導入された細胞を活
性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担
体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬
製剤（遺伝子治療剤）を提供する。

【０１７４】本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用で
きる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使
用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、
表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例
示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて
適宜選択使用できる。

【０１７５】本発明医薬製剤の投与単位形態としては、
前記したＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質抗体製剤の製剤例を同様に
挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適
宜選択することができる。

【０１７６】例えば、本発明のアンチセンス・オリゴヌ
クレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクタ
ーをリポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチ
センス・オリゴヌクレオチドが包含されるウイルスベク
ターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態
に調製される。

【０１７７】これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ
７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合
した形態などに調製することもでき、またプロタミンな
どの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるよう
な形態に調製することもできる。

【０１７８】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。

【０１７９】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。

【０１８０】該製剤は１日に１回または数回に分けて投
与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与す
ることもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝
子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投
与することができる。

【０１８１】本発明に従う遺伝子治療を糖尿病の治療に
適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合
わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺
伝子治療に、従来のインスリン療法、食事療法、などを
組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療
は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考
にして実施することができる〔Recombinant DNA Adviso
ry Committee, HumanGene Therapy, 4, 365-389 (199
3)〕。

【０１８２】本発明によれば、細胞のＧＦＡＴ活性を促
すＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の存在を検出するために、血液ま
たは血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により核
酸を抽出し、ＧＦＡＴ１Ｌの感受性遺伝子が存在する否
かについて分析することが可能である。また、本発明に
よれば細胞または組織におけるＧＦＡＴ活性レベル、Ｇ
ＦＡＴｍＲＮＡの発現レベル、ヘキソサミン生合成経路
調節機能障害への進行、または予後指標としての存在を
検出するためには、ヘキソサミン生合成経路調節障害を
有する生物学的な試料を調製し、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子が
存在するか否か、あるいはそのｍＲＮＡの量について分
析できる。この方法を用いることにより細胞または組織
におけるＧＦＡＴ活性のレベル、ＧＦＡＴｍＲＮＡの発
現レベル、ヘキソサミン生合成経路の調節機能障害への
進行、または予後指標としての存在を検出することが可
能となり、これらの診断、例えば糖尿病の診断並びに糖
尿病治療効果の判定並びに予後の予測が可能となる。

【０１８３】該検出方法は、例えば、予めＧＦＡＴ活性
を有する患者サンプルから得られたＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
に関する情報を基に、該ＤＮＡ断片を作成し、ＧＦＡＴ
１Ｌ遺伝子のスクリーニングおよび／またはその増幅に
用いられるように設計される。より具体的には、例えば
プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダ
イゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法
などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸
配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）により、増幅したＧＦＡＴ１Ｌの全部または
一部のＤＮＡ断片を得ることができるためのプローブと
しての性質を有するものを作成できる。そのためにはま
ずＧＦＡＴ１Ｌと同じ配列を持つプライマーを作成し、
スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料
（核酸試料）と反応させることにより、当該ＧＦＡＴ１
Ｌ配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。
該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方
法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロ
ッティングで調製してもよい。

【０１８４】前記スクリーニング方法としては、特にＰ
ＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、
ＧＦＡＴ１Ｌ断片をプライマーとして用いる方法であれ
ば特に制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 135
0-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用さ
れるＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、
増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共
立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが
可能である。

【０１８５】プライマーとして使用されるＤＮＡ断片
は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤ
ＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合
成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマ
シア社製)を使用して合成することができる。合成され
るプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプ
ライマー)の長さは約１０〜５０ヌクレオチド程度が好
ましく、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度が
例示できる。前記において、特に合成されるプライマー
は、公知の他のＧＦＡＴのＤＮＡ配列と区別される配列
を使用することが好ましい。上記スクリーニングに用い
られるプローブは、通常は標識したプローブを用いる
が、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識
したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。
適当な標識、並びにプローブおよびリガンドを標識する
方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・ト
ランスレーション、ランダム・プライミングムまたはキ
ナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませる
ことができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発
光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。

【０１８６】検出のために用いるＰＣＲ法としては、例
えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いら
れる種々の変法を適応することができる。

【０１８７】また、本発明の測定方法は、試料中のＧＦ
ＡＴ１Ｌ遺伝子の検出のための試薬キットを利用するこ
とによって、簡便に実施することができる。

【０１８８】故に本発明は上記ＧＦＡＴ１Ｌ ＤＮＡ断
片を含有することを特徴とするＧＦＡＴ１Ｌの検出用試
薬キットが提供される。

【０１８９】該試薬キットは、少なくとも配列番号：２
に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部
または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成
成分として含んでいればよく、他の成分として、標識
剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマー
など）が含まれていてもよい。

【０１９０】標識剤としては、放射性同位元素または蛍
光物質などの化学修飾物質などが挙げられ、ＤＮＡ断片
自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよ
い。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のため
に適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応
停止液などが含まれていてもよい。

【０１９１】更に本発明は、前記測定方法を用いる糖代
謝障害、特にヘキソサミン生合成障害の診断方法および
該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供する
ものである。

【０１９２】また、前記方法を用いることにより、被検
試料中から得られたＧＦＡＴ１Ｌ配列を直接的若しくは
間接的に配列決定することにより、野生型ＧＦＡＴ１Ｌ
と相同性の高い相同物である新たなＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
に関連する関連遺伝子を見出すことができる。

【０１９３】従って、本発明はかかる測定と被検試料中
のＧＦＡＴ１Ｌ ＤＮＡの配列決定により、被検試料中
のヒトＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子に関連する関連遺伝子のスク
リーニング方法をも提供するものである。

【０１９４】また、本発明の配列番号：１で示されるヒ
トＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子でコードされるポリペプチド、ま
たは該配列番号：１において、１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、または
これらの断片からポリペプチドを合成し、もしくは該ポ
リペプチドに対する抗体を合成することによって、野生
型ＧＦＡＴ１Ｌおよび／または変異ＧＦＡＴ１Ｌの測定
が可能となる。

【０１９５】従って、本発明は、野生型ＧＦＡＴ１Ｌお
よび／または変異ＧＦＡＴ１Ｌの抗体測定法、抗原測定
法を提供するものである。該測定法によってＧＦＡＴ活
性の程度、血糖調節障害の程度、ヘキソサミン生合成経
路の機能障害の程度あるいは糖尿病の重症度、糖尿病性
神経症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病合
併症の程度を野生性型ＧＦＡＴ１Ｌポリペプチドの変化
に基づいて検出することも可能である。かかる変化は、
この分野における前記慣用技術によるＧＦＡＴ１Ｌ配列
分析によっても決定できるが、更に好ましくは、抗体
(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、
ＧＦＡＴ１Ｌポリペプチド中の相違、またはＧＦＡＴ１
Ｌポリペプチドの有無を検出することができる。本発明
の測定法の具体的な例示としては、ＧＦＡＴ１Ｌ抗体
は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含
有溶液からＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を免疫沈降し、かつポリ
アクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイム
ノブロット上でＧＦＡＴ１Ｌポリペプチドと反応するこ
とができる。また、ＧＦＡＴ１Ｌ抗体は免疫組織化学的
技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中のＧＦＡ
Ｔ１Ｌポリペプチドを検出することができる。抗体産生
技術および精製する技術は当該分野においてよく知られ
ているので、これらの技術を適宜選択することができ
る。

【０１９６】野生型ＧＦＡＴ１Ｌまたはその突然変異体
を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モ
ノクローナル抗体および／または、ポリクローナル抗体
を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベ
ントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩ
Ａ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)、および免疫酵素法
(ＩＥＭＡ)が含まれる。

【０１９７】また、本発明のＧＦＡＴ活性を阻害する薬
剤の候補化合物をスクリーニングする方法において、例
えば、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子発現産物またはＧＦＡＴ１Ｌ
蛋白質(以下、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質と併せて称する)また
はそれらの断片に対する抗体と、候補化合物を含む被検
液および標識化されたＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドとを競合的に反応させ、該
抗体に結合した標識化されたＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質または
ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの割合を測定するこ
とを特徴とする被検液中のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧ
ＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを定量するスクリーニ
ング方法も可能である。

【０１９８】また候補化合物を含む被検液と担体上に不
溶化した前記抗体および標識化された別の異なるＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質に対する抗体とを同時あるいは連続的に反
応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定する
ことを特徴とする被検液中のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質または
ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの定量法も可能であ
る。

【０１９９】さらに、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドに基質を接触させた場合と
ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペ
プチドに基質および試験化合物を接触させた場合におけ
る、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部
分ペプチドの酵素活性を測定して、比較することによっ
てＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）
を阻害する化合物をスクリーニングすることも可能であ
る。

【０２００】上記において、基質としては、本発明ＧＦ
ＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチ
ドの基質となり得るものであれば何れのものでもよく、
通常、フルクトース−６−リン酸およびグルタミンが用
いられる。フルクトース−６−リン酸としては、放射線
標識（例、¹⁴Ｃ、³Ｈなど）したフルクトース−６−リ
ン酸などを用いるのが好適である。試験化合物として
は、例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物
組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規
な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよ
い。

【０２０１】上記のスクリーニング方法を実施するに
は、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白
質の部分ペプチドを、スクリーニングに適した緩衝液に
懸濁させてこれらの標品を調製する。緩衝液は、ｐＨ約
４〜１０（望ましくはｐＨ約６〜８）のリン酸バッファ
ー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明ＧＦＡＴ１
Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドと基
質との結合を阻害しないものであればいずれでもよい。

【０２０２】本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ
１Ｌ蛋白質の部分ペプチドのＧＦＡＴ活性は、公知の方
法、例えばマーシャルらの方法(Journal of Biological
Chemistry, vol. 266, No. 8, 4706-4712, (1991))に
準じて測定することができる。

【０２０３】該方法は、例えば９６穴のマイクロプレー
ト上に２００μｌの基質溶液(400 mM リン酸ナトリウム
緩衝液(pH 7.5)、50 mM塩化カリウム、1.25 mM EDTA、
0.3 mM APAD、6 U/ml (GDH)、0-6 mMグルタミン、0-6 m
Mフルクトース−６−リン酸 (F-6-P))に適宜希釈したＧ
ＦＡＴ１Ｌの大腸菌溶解質５０μlを加え、３７℃で６
０分間反応させ、この時の３６５ｎｍの吸光度の変化を
マイクロプレートリーダーにより測定することにより実
施することができる。上記ＧＦＡＴ活性の測定は、ＧＦ
ＡＴにより生成されたグルタメート(Glutamate)をさら
にグルタメート脱水素酵素(Glutamate deydrogenase:GD
H）と反応させ、その際同時に惹起される補酵素である
ＡＰＡＤがＡＰＡＤＨ に還元される反応に伴われる吸
光度の変化をＧＦＡＴ活性として表わす方法である。

【０２０４】また、別方法としては、例えばスミスらの
方法〔アナリティカル・バイオケミストリー（Analytic
al Biochemistry）, 98, 478-480 (1979)〕を挙げるこ
とができる。該方法は例えば次の如くして実施される。
即ち、まず１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μ
Ｍ グルタミンおよび０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ
８.０）からなる混合液に本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質ま
たはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを添加し、得ら
れる溶液を２５℃で３０分間保温する。同溶液に０.５
Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間反応させた後、２.５％
ＮａＮＯ₂と１２.５％ ＮＨ₄Ｏ₃ＳＮＨ₂を添加し、さら
に０.２５％ ２−メチル−２−ベンゾチアゾロンを添加
する。次に、０.５％ ＦｅＣｌ₃を加えて、その溶液を
６５０ｎｍで吸光度を測定し、生成されるグルコサミン
−６−リン酸を定量する。

【０２０５】上記各方法において、医薬候補化合物の選
択方法は、例えば各試験において上記試験化合物が添加
されていない場合におけるＧＦＡＴ活性が上記試験化合
物が添加されている場合に比べて、約２０％以上、好ま
しくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害
されている場合、該試験化合物を本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋
白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドのＧＦＡ
Ｔ活性を阻害する化合物として選択することができる。

【０２０６】また本発明によれば、上記ＧＦＡＴ活性を
阻害する薬剤の候補化合物をスクリーニングするための
スクリーニング用キットが提供できる。

【０２０７】本発明のスクリーニング用キットは、構成
要素の一つとして、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質または
ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを含有するものであ
る。本発明のスクリーニング用キットの具体例を以下に
例示する。 １．スクリーニング用キットＩ 〔スクリーニング用試薬〕 １）ＧＦＡＴ１Ｌ標品：５０μl本発明のＧＦＡＴ１Ｌ
大腸菌溶解質(ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチド) ２）補酵素入測定用緩衝液：４００ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液(pH7.5)、５０ｍＭ塩化カリウム、１．２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．３ｍＭ ＡＰＡＤ、６Ｕ／ｍｌ(ＧＤ
Ｈ) ３）基質:０−６ｍＭフルクトース−６−リン酸、０−
６ｍＭグルタミン検出は、３６５ｎｍでの吸光度を測定
する。 〔測定法〕９６穴のマイクロプレート上に２００μｌの
基質溶液(400 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)、50
mM塩化カリウム、1.25 mM EDTA、0.3 mM APAD、6 U/ml
(GDH)、０−６ｍＭグルタミン、０−６ｍＭフルクトー
ス−６−リン酸 (F-6-P))に適宜希釈したＧＦＡＴ１Ｌ
の大腸菌溶解質５０μｌを加え、３７℃で６０分間反応
させる。この時の３６５ｎｍの吸光度の変化をマイクロ
プレートリーダーにより測定する。 ２．スクリーニング用キットＩＩ 〔スクリーニング用試薬〕 １）蛋白質標品：本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質の部分ペプチド)またはその塩 ２）測定用緩衝液：０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ
８.０） ３）基質:１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ
グルタミン検出は、６５０ｎｍでの吸光度を測定す
る。 〔測定法〕１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μ
Ｍ グルタミン、本発明のタンパク質またはその塩およ
び０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８．０）からなる反
応液に試験化合物を添加した後、２５℃で３０分間保温
する。これに０.５Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間加水
分解する。２.５％ＮａＮＯ₂と１２.５％ＮＨ₄Ｏ₃ＳＮ
Ｈ₂を添加し、次いで０.２５％ ２−メチル−２−ベン
ゾチアゾロンを添加する。次に、０.５％ ＦｅＣｌ₃を
添加した後、６５０ｎｍで吸光度を測定する。

【０２０８】また本発明のスクリーニング方法またはス
クリーニング用キットを用いて得られる化合物またはそ
の塩は、上記した試験化合物（例えば、ペプチド、蛋
白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など）から選ば
れた化合物であり、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦ
ＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチド）の酵素活性（例、ＧＦ
ＡＴ活性）を阻害する化合物である。該化合物は、新規
化合物であってもよいし、公知化合物であってもよい。
また、低血糖改善用候補化合物としては、本発明のＧＦ
ＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの
酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進する化合物であ
る。

【０２０９】該化合物の塩としては、生理学的に許容さ
れる酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金
属）などとの塩が例示でき、とりわけ生理学的に許容さ
れる酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例え
ば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫
酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プ
ロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石
酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスル
ホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられ
る。

【０２１０】本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦＡＴ１
Ｌ蛋白質の部分ペプチドを含む、以下同じ）の酵素活性
を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病およ
び糖尿病合併症などの疾患に対する治療剤または予防剤
としての医薬として有用である。

【０２１１】本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の酵素活性を
促進する化合物またはその塩は、例えば、低血糖症及び
低血糖による合併症などの疾患に対する治療剤または予
防剤としての医薬として有用である。

【０２１２】また本発明によれば、より活性または安定
した形態のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の誘導体または例えば、
イン・ビボ(in vivo)でＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の機能を高
めるか、もしくは妨害する薬剤を開発するために、それ
らが相互作用する目的の生物学的に活性なポリペプチド
または構造アナログ、例えばＧＦＡＴ１Ｌアゴニスト、
ＧＦＡＴ１Ｌアンタゴニスト、ＧＦＡＴ１Ｌインヒビタ
ーなどを作製することが可能である。前記構造アナログ
は、例えばＧＦＡＴ１Ｌと他の蛋白質の複合体の三次元
構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリングまたは
これらの組み合わせた方法によって決定することができ
る。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性
蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得る
ことも可能である。

【０２１３】また上記より活性または安定した形態のＧ
ＦＡＴ１Ｌ蛋白質の誘導体を得る方法としては、例えば
アラニン・スキャンによる分析方法が挙げられる。該方
法はあるアミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性
に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ
酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定
性に重要な領域を決定する方法である。該方法によっ
て、より活性な、または安定なＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の誘
導体を設計することができる。

【０２１４】また機能性アッセイによって選択した標的
−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析する
ことも可能である。原則として、このアプローチによ
り、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmac
ore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗
−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学
的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプ
チドを同定したり単離したりすることが可能である。故
に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると
予測される。

【０２１５】かくして、改善されたＧＦＡＴ１Ｌ活性も
しくは安定性またはＧＦＡＴ１Ｌ活性のインヒビター、
アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する
薬剤を設計・開発することができる。

【０２１６】クローン化ＧＦＡＴ１Ｌ配列によって、十
分な量のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を入手して、Ｘ線結晶学の
ような分析研究をも行うことができる。さらに、本発明
の配列番号：１に示されるアミノ酸配列よりなるＧＦＡ
Ｔ１Ｌ蛋白質の提供により、Ｘ線結晶学に代えるかまた
はこれに加えて、コンピューターモデリング技術に適応
可能である。

【０２１７】また本発明によれば、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
のノックアウト・マウスやノックイン・マウス(変異マウ
ス)を作成することによってＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子配列の
どの部位が生体内で上記したような多様なＧＦＡＴ１Ｌ
活性に影響を与えるかどうか、即ちＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
産物、並びに改変ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子産物が生体内でど
のような機能を有するかを確認することができる。

【０２１８】該方法は、遺伝子の相同組換えを利用し
て、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マ
ウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる
（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (198
9))。

【０２１９】尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野
の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術
(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土
社)に、ヒト野性型ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子および変異ＧＦ
ＡＴ１Ｌ遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得
る。従って前記技術の適応により、改善されたＧＦＡＴ
１Ｌ活性もしくは安定性またはＧＦＡＴ１Ｌ活性のイン
ヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作
用を有する薬剤を設計・開発することができる。

【０２２０】

【発明の効果】本発明によれば、ヒトＧＦＡＴと相同性
を有する新規なヒト蛋白相同物をコードする遺伝子が提
供される。

【０２２１】本発明の遺伝子は糖代謝に重要な組織であ
る骨格筋および心臓においてその発現が高く、これら組
織およびその周辺組織におけるＧＦＡＴ活性または解糖
系におけるヘキソサミン生合成経路を促進し、糖輸送担
体の細胞膜への移行性を抑制すると考えられる。従って
糖代謝における血糖調節に対して上昇的に作用すること
が考えられることから、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発
現量やＧＦＡＴ活性などの解析により、関連遺伝子の機
能と糖代謝関連疾患との係わりについての研究に利用で
き、特に低血糖または糖尿病患者への遺伝子診断並びに
該遺伝子の発現産物に対する抗体やアンチセンスによる
医薬用途への応用研究に用いることが可能である。

【０２２２】また、本発明遺伝子の利用によれば、各種
組織での該遺伝子の発現状況が調べられ、生体内におけ
るその機能を解析することが可能となる。

【０２２３】また、該遺伝子によれば、該遺伝子がコー
ドするＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造
することができ、該蛋白質の提供によれば、ＧＦＡＴ１
Ｌ活性やＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の結合活性などの機能を調
べることもできる。

【０２２４】またＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、ＧＦＡＴ１Ｌ
遺伝子およびその産物が関与する疾患（例えば、ＧＦＡ
Ｔ活性または解糖系におけるヘキソサミン生合成経路の
調節に関連する疾患または低血糖、血糖調節に関連する
疾患など、特に低血糖症の治療、または糖尿病や糖尿病
性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症などの糖尿病
性合併症）の病態解明や診断、治療などに有用である。

【０２２５】本発明によれば、更にＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子
のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子
治療に有用な遺伝子導入用ベクター、該ＧＦＡＴ１Ｌ遺
伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが導入された
細胞および該ベクターまたは細胞を有効成分とする遺伝
子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法などが提
供される。

【０２２６】本発明によれば、更に骨格筋、特に骨格筋
の平滑細胞におけるＧＦＡＴｍＲＮＡの発現の抑制作用
を有し、該作用による糖尿病および糖尿病合併症などの
疾患および病態の処置などに使用されるＧＦＡＴ１Ｌ遺
伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＧＦＡ
Ｔ１Ｌに結合性を有する抗体またはその断片を有効成分
とする医薬も提供することができる。

【０２２７】また、本発明によれば、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白
質、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子発現産物の酵素活性を阻害す
る、糖尿病の治療のための候補化合物のスクリーニング
方法およびスクリーニング用キットをも提供することが
できる。

【０２２８】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【０２２９】

【実施例１】ＧＦＡＴ１Ｌのクローニングと発現ベクタ
ーの構築 まず、マクナイトらの公知のヒトＧＦＡＴ(G.L.McKnigh
t et.al. J.Biol.Chem., 267, 25208-25212 (1992))の
発現ベクターの構築のために、ヒトＧＦＡＴのｃＤＮＡ
配列をもとに４つのプライマーＰ１〜Ｐ４を合成した。
之等の塩基配列は、それぞれ配列番号：３〜６に示すと
おりである。

【０２３０】Ｐ１は、配列番号：２の３４−６６番目の
ヌクレオチド配列に相当する。Ｐ２は、同配列番号：２
の１６−４８番目のヌクレオチド配列に相当する。Ｐ３
は、同配列番号：２の１−３０番目のヌクレオチド配列
に相当する。またＰ４は、同配列番号：２の２０７７−
２０９７番目のヌクレオチド配列に相当する。Ｐ１〜Ｐ
３は、それぞれフォワード・プライマーであり、大腸菌
において発現効率をあげるために大腸菌のコドン利用度
を考えて以下の部分に変異を与えたものである。 Ｐ１：配列番号：３の６，９，１２，１３，１５，１８
番目のヌクレオチド Ｐ２：配列番号：４の７，９，１８，２４，２７，３
０，３１，３３番目のヌクレオチド Ｐ３：配列番号：５の２２，３２，３４番目のヌクレオ
チド Ｐ３における配列番号：５の１〜１０番目のヌクレオチ
ド配列は、ｐＥＴベクターに挿入する際に必要になるＮ
ｄｅＩサイト（CATATG）を導入するために付加した配列
である。

【０２３１】また、Ｐ４はリバース・プライマーであ
り、Ｃ末アミノ酸の後にＸｈｏＩサイト(CTCGAG，配列
番号：６の１〜１１番目のヌクレオチド配列参照)を含
む配列である。該ＸｈｏＩサイトの直前には終止コドン
(TAA)が挿入されるように設計された。

【０２３２】以下の方法で上記４つのプライマーを使っ
て、Ｎ末アミノ酸が大腸菌で合成しやすいコドンに置き
換わったベクターが構築され得る。

【０２３３】ついで、クロンテック社から購入したヒト
骨格筋ｍＲＮＡをもとに、プライマーＰ４で逆転写酵素
を用いて逆転写反応をおこなった。ヒト骨格筋ｍＲＮＡ
２μｇ／μｌを１００℃で５分間で変性させた後、氷中
にて急冷させた。最終的に５０ｍＭトリス塩酸(pH8.
3)、４０ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ塩化マグネシウ
ム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭのプライマー４、０．
１ｍｇＢＳＡおよび４００単位／２μｌのＭＭＬＶ逆転
写酵素（ギブコBRL社製）と脱イオン水(ＤＤＷ)を加え
て５０μｌとし、３７℃で１０分間反応させた。

【０２３４】前記反応物５μｌを１００℃で５分間で変
性させた後、プライマーＰ１およびＰ４にてＰＣＲ反応
を行った。ＰＣＲ反応は５μｌの逆転写反応物と５μｌ
の１０×緩衝液(１．２ｍＭトリス塩酸(pH8.0)、１００
ｍＭ塩化カリウム 、６０ｍＭ硫酸アンモニウム、１％
トリトンＸ−１００、 ０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ) 、５
μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合物、０．４μＭの各プラ
イマー、１ｍＭの塩化マグネシウム、２．５単位のＫＯ
Ｄダッシュ(dash) およびＤＤＷを加えて、総量５０μ
ｌとし、９５℃、３０秒、６５℃、２秒、７４℃、６０
秒を３０サイクル行い、さらに、７４℃、５分間反応さ
せた。

【０２３５】前記で得られた５μｌの反応産物について
同様のＰＣＲ条件でプライマーをＰ２およびＰ４に変え
てＰＣＲ反応を行なった。

【０２３６】さらに、その反応産物の５μｌについて同
様のＰＣＲ条件でプライマーＰ３およびＰ４にてＰＣＲ
反応を行った。

【０２３７】最終反応物は、ｐＥＴ２３ｂベクター（ノ
バゲン：Novagen社製）にクローニングし、ＡＢＩ３７
７ＤＮＡシークエンサー（PE-ABI社製）にてＤＮＡ配列
を確認した。

【０２３８】次いで最終反応物はフェノール／クロロホ
ルム処理し、エタノール沈殿をおこない、ＴＥ緩衝液に
溶かした後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩにてＤＮＡの
両端を切断した。

【０２３９】該ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏ
Ｉで切断したｐＥＴ２３ｂベクターにライゲーションに
より挿入した。

【０２４０】かくして、塩基配列決定によって新規な配
列の遺伝子を得、これを「ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子」と命名
した。

【０２４１】得られた遺伝子は、そのコード領域の全長
が配列番号：２で示される２０９７塩基からなり、該塩
基配列によってコードされるアミノ酸配列は、配列番
号：１に示される６９９アミノ酸配列からなっていた。
これは該アミノ酸配列をコードするヒトｃＤＮＡ（全長
２０９７塩基）であった。

【０２４２】本発明遺伝子ＧＦＡＴ１ＬがコードするＧ
ＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、マクナイトらによってクローニン
グされたヒトＧＦＡＴ遺伝子(McKnight, G.L., et. a
l., J.Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992)) の６８
４番目と６８５番目の塩基の間に、５４個の塩基が挿入
された新規な遺伝子であることが確認された。従って、
遺伝子配列でコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、２
２８番目と２２９番目の間に１８個のアミノ酸配列が挿
入された構造物であることが判明した。

【０２４３】以下に続く試験においては、本発明者らが
単離した新規遺伝子を「ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子」と呼び、
マクナイトらのヒトＧＦＡＴ遺伝子を「ＧＦＡＴ１Ｓ遺
伝子」と呼ぶ。

【０２４４】

【実施例２】ＲＴ−ＰＣＲ法により、各臓器でのＧＦＡ
Ｔ１Ｌ遺伝子の発現パターンを、ＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子の
それと対比して、検索した。

【０２４５】サンプルとしては、クローンテック社のク
イッククローンｃＤＮＡ（QUICK-Clone cDNA, 心臓、
脳、肝臓、骨格筋、小腸、腎臓、膵臓、脂肪）を用い
た。

【０２４６】プライマーとしては、配列番号：７および
８に示す塩基配列を合成して使用し、更にExTaq（宝酒
造社）を使用した。

【０２４７】ＰＣＲ反応は、９５℃１分の後、９５℃、
３０秒、５５℃、３０秒および７２℃、４５秒を１サイ
クルとして、４０サイクル繰り返した。遺伝子発現パタ
ーンの検索は、反応産物の一部を４％アガロースゲル電
気泳動に供してもとめた。

【０２４８】結果を図１に示す。

【０２４９】図における各レーンは次の通りである。

【０２５０】Marker（マーカー）、Heart（心臓）、Bra
in（脳）、Liver（肝臓）、SkeltalMuscle（骨格筋）、
Kidney（腎臓）、Pancreas（膵臓）、Small Intestine
（小腸）およびFat（脂肪） 図１より、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子は、心臓および骨格筋に
強い発現が認められ、脳でも非常に弱い発現が認められ
た。試験した他の臓器においては、ＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子
のみの発現が認められた。

【０２５１】このことから、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝
子の発現は、臓器特異的に制御されていることが判明し
た。

【０２５２】

【実施例３】ＧＦＡＴ１Ｌ組換え蛋白質の調製 ヒトＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子（対比のためＧＦＡＴ１Ｓ遺伝
子）のそれぞれをｐＥＴ２３ｂベクター（ノバゲン社
製：Novagen）に組み込み、該ベクターを用いてＢＬ２
１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ(ＤＥ３)ＲＩＬ(ストラタジー
ン社製：Stratagene）を形質転換し、得られた形質転換
体をアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、一晩培養し
た。翌日、５０ｍｌの培養液を１Ｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地に加え、さらに３７℃で培養した。９０分
後、２ｍｌの１Ｍイソプロピルβ−Ｄ−(−)−チオガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ：和光純薬社製）を加え、２
０℃で一晩培養して組換え蛋白質の発現を誘導した。

【０２５３】培養液を７０００ｒｐｍで５分間遠心して
大腸菌を回収し、５０ｍｌの０℃に冷やしたダルベッコ
のＰＢＳ(-)：日水製薬社製）で１回洗浄した。次に５
ｍＭジチオスレイトール（DTT）、２０％グリセリンを
含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）を、全
量が４０ｍｌになるように加えて懸濁した後、超音波処
理して菌体を破砕した。この破砕液を超遠心（30,000rp
m、30分、4℃）して不溶性成分を除いた。

【０２５４】かくして、所望の組換え蛋白質を含む上清
を得た。得られた上清は１ｍｌづつ分注して、液体窒素
で急速凍結後に−８０℃に使用時まで保存した。

【０２５５】

【実施例４】ＧＦＡＴ１ＬとＧＦＡＴ１Ｓの特徴的な差
異の検討 １．ＧＦＡＴ活性測定方法 ＧＦＡＴ活性の測定は、マーシャル(Marshall)らに準
じ、９６穴のマイクロプレートを用いた分光光度計法に
て行なった(Journal of Biological Chemistry,vol. 26
6, No. 8, 4706-4712, (1991))。この測定方法では、Ｇ
ＦＡＴにより生成されたグルタメート(Glutamate)をさ
らにグルタメート脱水素酵素(Glutamatedeydrogenase:G
DH）と反応させ、その際同時に起こる補酵素であるＡＰ
ＡＤがＡＰＡＤＨに還元される反応に伴われる吸光度の
変化をＧＦＡＴ活性として表わした。

【０２５６】即ち、２００μlの基質溶液(40 mM リン酸
ナトリウム緩衝液(pH 7.5)、50 mM塩化カリウム、1.25
mM EDTA、0.3 mM APAD、6 U/ml (GDH)、0-6 mMグルタミ
ン、0-6 mMフルクトース−６−リン酸 (F-6-P))に適宜
希釈したＧＦＡＴ１ＬあるいはＧＦＡＴ１Ｓの大腸菌溶
解質５０μlを加え、３７℃で６０分間反応させた。こ
の時の３６５ｎｍの吸光度の変化をマイクロプレートリ
ーダーにより測定した。 ２．ＧＦＡＴ１ＬとＧＦＡＴ１Ｓの酵素学的相違 ＧＦＡＴ１ＬとＧＦＡＴ１Ｓの間の酵素学的な相違を検
討するため、基質としてグルタミンおよびＦ−６−Ｐの
それぞれを用いて、Ｋｍ値を求めた。Ｋｍ値は、酵素の
基質濃度（S）および酵素活性（反応速度（v））の値を
基に作成したＳ／ｖ〜Ｓおよびｖ〜ｖ／ｓプロットから
算出した。またその算出は、Ｓ／ｖ〜Ｓのプロットでは
グラフのＸ軸とプロットして得られた直線の交点（交点
＝−Ｋｍ値）から、ｖ〜ｖ／ｓプロットでは直線の傾き
（傾き＝−Ｋｍ値）から求めた。

【０２５７】さらにＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン
(UDP-GlcNAc)がＧＦＡＴ活性を阻害することが報告さ
れていることから（Journal of Biological Chemistry
vol.241, 1705-1712( 1966)）、この阻害様式について
も検討した。この阻害様式は、同様のプロッティングを
行ない、得られた直線の形式から求めた。

【０２５８】その結果を図２、図３および表１に示す。

【０２５９】図２は、Ｆ−６−Ｐを基質とした場合のＧ
ＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１ＬにおけるＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＮＡｃのＧＦＡＴ活性阻害様式を示すグラフであり、縦
軸は酵素の反応速度（ｖ）を、横軸は反応速度（ｖ）／
酵素の基質濃度（ｓ）を示す。

【０２６０】図２の左のグラフがＧＦＡＴ１Ｓの結果で
あり、右のグラフがＧＦＡＴ１Ｌの結果を示している。
各図において、(1)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃなしの場合
を、(2)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ３０μＭ添加の場合
を、(3)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ１００μＭ添加の場合
をそれぞれ示す。

【０２６１】該図より求められたＫｍ値は、ＧＦＡＴ１
ＳおよびＧＦＡＴ１Ｌにおいて、それぞれ９０μＭおよ
び４７８μＭであり、またＧＦＡＴ活性阻害様式は、そ
れぞれ「拮抗阻害」および「混合阻害」を示すことが明
らかとなった。

【０２６２】図３は、グルタミンを基質とした場合のＧ
ＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１ＬにおけるＵＤＰ−Ｇｌｃ
ＮＡｃのＧＦＡＴ活性阻害様式を示すグラフであり、縦
軸は酵素の反応速度（ｖ）を、横軸は反応速度（ｖ）／
酵素の基質濃度（ｓ）を示す。

【０２６３】図３の左のグラフがＧＦＡＴ１Ｓの結果で
あり、右のグラフがＧＦＡＴ１Ｌの結果を示している。
各図において、(1)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃなしの場合
を、(2)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ１０μＭ添加の場合
を、(3)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ３０μＭ添加の場合
を、また(4)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ１００μＭ添加の
場合をそれぞれ示す。

【０２６４】該図より求められたＫｍ値は、ＧＦＡＴ１
ＳおよびＧＦＡＴ１Ｌにおいて、それぞれ８２２μＭお
よび８０４μＭであり、またＧＦＡＴ活性阻害様式は、
それぞれ「不拮抗阻害」および「混合阻害」を示すこと
が明らかとなった。

【０２６５】

【表１】

【０２６６】図２、図３および表１より、ＧＦＡＴ１Ｌ
およびＧＦＡＴ１ＳのＫｍ値については、Ｆ−６−Ｐに
対してはＧＦＡＴ１Ｓが１００μＭ、ＧＦＡＴ１Ｌが５
００μＭ程度と両者で大きな差が認められた。一方、グ
ルタミンに対してはＧＦＡＴ１ＳとＧＦＡＴ１Ｌともに
８００μＭ前後であり両者に差は認められなかった。

【０２６７】UDP-GlcNAcの阻害様式ついては、Ｆ−６−
Ｐを基質とした場合、ＧＦＡＴ１Ｓでは拮抗阻害、ＧＦ
ＡＴ１Ｌでは非拮抗および拮抗阻害が混在した混合阻害
様式を示した。また、グルタミンを基質とした場合、Ｇ
ＦＡＴ１Ｓでは不拮抗阻害、ＧＦＡＴ１Ｌにおいては不
拮抗およびその他の阻害様式を含んだ混合阻害様式を示
した。

【０２６８】上記の結果から、本発明のＧＦＡＴ１Ｌと
ヒトＧＦＡＴの酵素学的な違いとして、(1)Ｆ−６−Ｐ
に対するＫｍ値は本発明のＧＦＡＴ１ＬがヒトＧＦＡＴ
より５倍程高い、および(2)UDP-GlcNAcの阻害様式が異
なる、の２点が認められた。 ３．インスリン抵抗性におけるＧＦＡＴ１Ｌの関わりに
ついての検討 ＧＦＡＴがインスリン抵抗性に関与していることはイン
・ビトロおよびイン・ビボ試験の両者において報告され
ている。しかしながら、本発明者らにより発見された新
規遺伝子により、ＧＦＡＴには２つのサブタイプが存在
することが明らかとなったことから、ＧＦＡＴ１Ｌとヒ
トＧＦＡＴ(ＧＦＡＴ１Ｓ)のどちらがよりインスリン抵
抗性に関与しているのかについて、以下の通り考察し
た。

【０２６９】正常人では通常、インスリン刺激時には血
中グルコースの約７０％が骨格筋で代謝されるのに対
し、２型糖尿病患者においては、特に骨格筋でグルコー
スの利用率が３０％まで減弱しており他の臓器ではその
利用率が正常人と変わらないことが報告されている(Jou
rnal of Clinical Investigation, 76 (1), 149-155(1
985))。このことから、インスリン抵抗性の主要な臓器
は骨格筋であると考えられる。この骨格筋ではＧＦＡＴ
１Ｓは発現しておらず、本発明のＧＦＡＴ１Ｌのみが発
現していることが明らかとなったことから、インスリン
抵抗性には主に本発明のＧＦＡＴ１Ｌが関与していると
考えられる。

【０２７０】また、ＧＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１Ｌの
酵素学的検討の結果より、(1)Ｆ−６−Ｐに対する本発
明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のＫｍ値は、ＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子
のそれよりも５倍程高い、(2)細胞内のグルタミン濃度
は４〜５ｍＭ存在するため、ＧＦＡＴ活性は細胞内のＦ
−６−Ｐ濃度に規定される、(3)基礎レベルにおける２
型糖尿病患者の赤血球中のＦ−６−Ｐ濃度は数十μＭで
あると報告されている（Horm. Metabol. Res., 14, 233
-236 (1982)）、ことなどを考え合わせ、以下のような
ことが推測された。

【０２７１】即ち、この濃度のＦ−６−ＰからＧＦＡＴ
の活性状態を推測すると、ＧＦＡＴ１ＳではＫｍ値付近
であり定常的に働いているが、ＧＦＡＴ１Ｌではほとん
ど活性化されていないと考えられる。このことは図４よ
り明らかである。

【０２７２】図４は、上記結果より、ＧＦＡＴ１Ｓおよ
びＧＦＡＴ１Ｌの酵素反応曲線（ＧＦＡＴの活性化の状
態）をグラフ化したものであり、縦軸は酵素の反応速度
（ｖ）を、横軸は細胞内のＦ−６−Ｐの濃度（μＭ）を
示しており、この濃度が高いほど細胞内への糖の流入量
が大きいことを表わす。また、図中、太線は文献に報告
されている非インスリン依存型糖尿病患者の赤血球中の
Ｆ−６−Ｐ濃度を示しており、太矢印はインスリン抵抗
性に関与することを示している。

【０２７３】更に、インスリン刺激時には細胞内へのグ
ルコースの取り込みは数倍増加するが、この場合、ＧＦ
ＡＴ１Ｓでは酵素反応がＶｍａｘに達しているため、さ
らにグルコースが細胞内に流入してもそれ以上のＧＦＡ
Ｔの活性化は起こらないのに対し、本発明のＧＦＡＴ１
Ｌではグルコースの流入量が増加すればするほどＧＦＡ
Ｔが活性化され代謝物も増加し、糖輸送担体の細胞膜へ
の移行が抑制され、血糖が上昇するものと考えられる
（ただし、ＧＦＡＴ１ＬおよびＧＦＡＴ１ＳともにＶｍ
ａｘは同程度と仮定している）。

【０２７４】従ってＧＦＡＴ１Ｓに比べ本発明のＧＦＡ
Ｔ１Ｌがよりインスリン抵抗性に関与していると考えら
れる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のＧＦ
ＡＴ１Ｌの関与が大きいと結論づけられる。

【０２７５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. <120> New enzyme gene and expression product thereof <130> 31600JP <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 699 <212> PRT <213> Human skeletal muscle mRNA <400> 1 Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr 20 25 30 Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Phe Asp Gly Gly Asn Asp Lys 35 40 45 Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly 50 55 60 Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp 65 70 75 80 Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp 85 90 95 Ala Thr His Gly Glu Pro Ser Pro Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser 100 105 110 Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn 115 120 125 Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu 130 135 140 Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr 145 150 155 160 Asp Asn Arg Glu Ser Gln Asp Thr Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg 165 170 175 Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val 180 185 190 His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu 195 200 205 Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile 210 215 220 Leu Tyr Arg Thr Ala Arg Thr Gln Ile Gly Ser Lys Phe Thr Arg Trp 225 230 235 240 Gly Ser Gln Gly Glu Arg Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Asn Leu 245 250 255 Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Val Glu Glu Lys Ala 260 265 270 Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val Ile Glu His Thr 275 280 285 Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp 290 295 300 Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro 305 310 315 320 Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys 325 330 335 Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu 340 345 350 Ser Val Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr 355 360 365 Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile Lys Glu Ile Gln Arg Cys 370 375 380 Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val 385 390 395 400 Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val 405 410 415 Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp 420 425 430 Asp Val Cys Phe Phe Leu Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu 435 440 445 Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile 450 455 460 Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val 465 470 475 480 His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr 485 490 495 Thr Ser Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe Ala Leu Met Met Cys Asp 500 505 510 Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys Glu Ile Met Leu Gly Leu 515 520 525 Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val Leu Ser Met Asp Asp Glu 530 535 540 Ile Gln Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His Gln Lys Ser Val Leu Ile 545 550 555 560 Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys 565 570 575 Ile Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu 580 585 590 Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Leu Met Pro Val Ile 595 600 605 Met Ile Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu 610 615 620 Gln Gln Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro Val Val Ile Cys Asp Lys 625 630 635 640 Glu Asp Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys Arg Thr Ile Lys Val Pro 645 650 655 His Ser Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln 660 665 670 Leu Leu Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe 675 680 685 Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu 690 695 <210> 2 <211> 2097 <212> DNA <213> Human skeletal muscle mRNA <220> <221> CDS <222> (1)..(2097) <400> 2 atg tgt ggt ata ttt gct tac tta aac tac cat gtt cct cga acg aga 48 Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg 1 5 10 15 cga gaa atc ctg gag acc cta atc aaa ggc ctt cag aga ctg gag tac 96 Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr 20 25 30 aga gga tat gat tct gct ggt gtg gga ttt gat gga ggc aat gat aaa 144 Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Phe Asp Gly Gly Asn Asp Lys 35 40 45 gat tgg gaa gcc aat gcc tgc aaa atc cag ctt att aag aag aaa gga 192 Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly 50 55 60 aaa gtt aag gca ctg gat gaa gaa gtt cac aag caa caa gat atg gat 240 Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp 65 70 75 80 ttg gat ata gaa ttt gat gta cac ctt gga ata gct cat acc cgt tgg 288 Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp 85 90 95 gca aca cat gga gaa ccc agt cct gtc aat agc cac ccc cag cgc tct 336 Ala Thr His Gly Glu Pro Ser Pro Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser 100 105 110 gat aaa aat aat gaa ttt atc gtt att cac aat gga atc atc acc aac 384 Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn 115 120 125 tac aaa gac ttg aaa aag ttt ttg gaa agc aaa ggc tat gac ttc gaa 432 Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu 130 135 140 tct gaa aca gac aca gag aca att gcc aag ctc gtt aag tat atg tat 480 Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr 145 150 155 160 gac aat cgg gaa agt caa gat acc agc ttt act acc ttg gtg gag aga 528 Asp Asn Arg Glu Ser Gln Asp Thr Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg 165 170 175 gtt atc caa caa ttg gaa ggt gct ttt gca ctt gtg ttt aaa agt gtt 576 Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val 180 185 190 cat ttt ccc ggg caa gca gtt ggc aca agg cga ggt agc cct ctg ttg 624 His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu 195 200 205 att ggt gta cgg agt gaa cat aaa ctt tct act gat cac att cct ata 672 Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile 210 215 220 ctc tac aga aca gct agg act cag att gga tca aaa ttc aca cgg tgg 720 Leu Tyr Arg Thr Ala Arg Thr Gln Ile Gly Ser Lys Phe Thr Arg Trp 225 230 235 240 gga tca cag gga gaa aga ggc aaa gac aag aaa gga agc tgc aat ctc 768 Gly Ser Gln Gly Glu Arg Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Asn Leu 245 250 255 tct cgt gtg gac agc aca acc tgc ctt ttc ccg gtg gaa gaa aaa gca 816 Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Val Glu Glu Lys Ala 260 265 270 gtg gag tat tac ttt gct tct gat gca agt gct gtc ata gaa cac acc 864 Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val Ile Glu His Thr 275 280 285 aat cgc gtc atc ttt ctg gaa gat gat gat gtt gca gca gta gtg gat 912 Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp 290 295 300 gga cgt ctt tct atc cat cga att aaa cga act gca gga gat cac ccc 960 Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro 305 310 315 320 gga cga gct gtg caa aca ctc cag atg gaa ctc cag cag atc atg aag 1008 Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys 325 330 335 ggc aac ttc agt tca ttt atg cag aag gaa ata ttt gag cag cca gag 1056 Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu 340 345 350 tct gtc gtg aac aca atg aga gga aga gtc aac ttt gat gac tat act 1104 Ser Val Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr 355 360 365 gtg aat ttg ggt ggt ttg aag gat cac ata aag gag atc cag aga tgc 1152 Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile Lys Glu Ile Gln Arg Cys 370 375 380 cgg cgt ttg att ctt att gct tgt gga aca agt tac cat gct ggt gta 1200 Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val 385 390 395 400 gca aca cgt caa gtt ctt gag gag ctg act gag ttg cct gtg atg gtg 1248 Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val 405 410 415 gaa cta gca agt gac ttc ctg gac aga aac aca cca gtc ttt cga gat 1296 Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp 420 425 430 gat gtt tgc ttt ttc ctt agt caa tca ggt gag aca gca gat act ttg 1344 Asp Val Cys Phe Phe Leu Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu 435 440 445 atg ggt ctt cgt tac tgt aag gag aga gga gct tta act gtg ggg atc 1392 Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile 450 455 460 aca aac aca gtt ggc agt tcc ata tca cgg gag aca gat tgt gga gtt 1440 Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val 465 470 475 480 cat att aat gct ggt cct gag att ggt gtg gcc agt aca aag gct tat 1488 His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr 485 490 495 acc agc cag ttt gta tcc ctt gtg atg ttt gcc ctt atg atg tgt gat 1536 Thr Ser Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe Ala Leu Met Met Cys Asp 500 505 510 gat cgg atc tcc atg caa gaa aga cgc aaa gag atc atg ctt gga ttg 1584 Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys Glu Ile Met Leu Gly Leu 515 520 525 aaa cgg ctg cct gat ttg att aag gaa gta ctg agc atg gat gac gaa 1632 Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val Leu Ser Met Asp Asp Glu 530 535 540 att cag aaa cta gca aca gaa ctt tat cat cag aag tca gtt ctg ata 1680 Ile Gln Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His Gln Lys Ser Val Leu Ile 545 550 555 560 atg gga cga ggc tat cat tat gct act tgt ctt gaa ggg gca ctg aaa 1728 Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys 565 570 575 atc aaa gaa att act tat atg cac tct gaa ggc atc ctt gct ggt gaa 1776 Ile Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu 580 585 590 ttg aaa cat ggc cct ctg gct ttg gtg gat aaa ttg atg cct gtg atc 1824 Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Leu Met Pro Val Ile 595 600 605 atg atc atc atg aga gat cac act tat gcc aag tgt cag aat gct ctt 1872 Met Ile Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu 610 615 620 cag caa gtg gtt gct cgg cag ggg cgg cct gtg gta att tgt gat aag 1920 Gln Gln Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro Val Val Ile Cys Asp Lys 625 630 635 640 gag gat act gag acc att aag aac aca aaa aga acg atc aag gtg ccc 1968 Glu Asp Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys Arg Thr Ile Lys Val Pro 645 650 655 cac tca gtg gac tgc ttg cag ggc att ctc agc gtg atc cct tta cag 2016 His Ser Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln 660 665 670 ttg ctg gct ttc cac ctt gct gtg ctg aga ggc tat gat gtt gat ttc 2064 Leu Leu Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe 675 680 685 cca cgg aat ctt gcc aaa tct gtg act gta gag 2097 Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu 690 695 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Primer P1 <400> 3 gttccgcgta ctcgtcgtga aatcctggag acc 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Primer P2 <400> 4 gcttacctga actaccacgt tccgcgtact cgt 33 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Primer P3 <400> 5 tttttttcat atgtgtggta tctttgctta cctgaactac 40 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Primer P4 <400> 6 ccctcgagtt actctacagt cacagatttg gc 32 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 7 agccctctgt tgattggtgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Primer <400> 8 tccatctgga gtgtttgcac 20

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２に従い、ＲＴ−ＰＣＲ法により各臓器
での本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現パターンを求めた
アガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真であ
る。

【図２】実施例４に従い、本発明ＧＦＡＴ１Ｌの酵素学
的性質としての、Ｆ−６−Ｐを基質としたときのＫｍ値
およびＧＦＡＴ活性阻害様式を求めるためのグラフであ
る。

【図３】実施例４に従い、本発明ＧＦＡＴ１Ｌの酵素学
的性質としての、グルタミンを基質としたときのＫｍ値
およびＧＦＡＴ活性阻害様式を求めるためのグラフであ
る。

【図４】実施例４に従い、本発明ＧＦＡＴ１Ｌの酵素反
応曲線（ＧＦＡＴの活性化の状態）を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/10 ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 33/53 (Ｃ１２Ｎ 1/21 33/68 Ｃ１２Ｒ 1:19） // Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 山本 恵史 徳島県板野郡北島町鯛浜字西ノ須34−１ (72)発明者 植山 篤則 徳島県徳島市庄町２−44−１ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 DA20 DA36 DA77 FB01 FB03 FB11 4B024 AA01 BA10 BA41 BA61 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 4B064 AG26 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4B065 AA90X AA90Y AA93Y AB01 AB04 BA01 BA08 CA25 CA46 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 CA18 CA53 DC25 NA14 ZC192 ZC351 4H045 AA11 BA10 CA40 DA86 DA89 EA50 FA74

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリ
   ヌクレオチドを含む遺伝子：（ａ）配列番号：１で示さ
   れるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌク
   レオチドまたはそれらの相補鎖、（ｂ）配列番号：１で
   示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
   ポリヌクレオチドに対して少なくとも９８％の相同性を
   持つポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖、（ｃ）上
   記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミ
   ノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からな
   り且つＧＦＡＴ活性を有するポリペプチドをコードする
   ポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖。
2. 【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオ
   チドからなる遺伝子：（ａ）配列番号：２で示される塩
   基配列またはその相補鎖、（ｂ）上記（ａ）の塩基配列
   からなるポリヌクレオチドと高いストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】配列番号：２で示される塩基配列である請
   求項２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】請求項１または２に記載の遺伝子を発現さ
   せて得られる遺伝子発現産物。
5. 【請求項５】請求項１または２に記載の遺伝子を有する
   組換え体発現ベクター。
6. 【請求項６】請求項５に記載の組換え体発現ベクターを
   保有する宿主細胞。
7. 【請求項７】請求項５に記載の組換え体発現ベクターで
   形質転換された形質転換体。
8. 【請求項８】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：
   （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋
   白質、（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もし
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミ
   ノ酸配列からなり且つＧＦＡＴ活性を有する蛋白質。
9. 【請求項９】請求項１または２に記載の遺伝子または請
   求項４に記載の遺伝子発現産物を有効成分として含有す
   る低血糖症の治療または予防用組成物。
10. 【請求項１０】請求項８に記載の蛋白質を有効成分とし
    て含有する低血糖症の治療または予防用組成物。
11. 【請求項１１】請求項４に記載の遺伝子発現産物および
    請求項８に記載の蛋白質およびこれらの断片から選ばれ
    るいずれかに結合性を有する抗体。
12. 【請求項１２】請求項１に記載の遺伝子または請求項４
    に記載の遺伝子発現産物および請求項８に記載の蛋白質
    の酵素活性を阻害する候補化合物をスクリーニングする
    方法であって、(1)請求項１１に記載の抗体と、候補化
    合物を含む被検液および標識化された請求項８に記載の
    蛋白質またはその部分ペプチドとを競合的に反応させ、
    該抗体に結合した標識化された蛋白質またはその部分ペ
    プチドの割合を測定するか、(2)候補化合物を含む被検
    液と、担体上に不溶化した上記抗体および標識化された
    他の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不
    溶化担体上の標識剤の活性を測定するか、或いは(3)請
    求項８に記載の蛋白質またはその部分ペプチドに基質を
    接触させた場合と、同蛋白質またはその部分ペプチドに
    基質および候補化合物を接触させた場合とにおける、同
    蛋白質またはその部分ペプチドの酵素活性を測定、比較
    することを特徴とするスクリーニング方法。
13. 【請求項１３】請求項１２に記載の候補化合物のスクリ
    ーニング方法に用いられるスクリーニング用キットであ
    って、測定用緩衝液、請求項８に記載の蛋白質またはそ
    の部分ペプチドおよび基質としてのフルクトース−６−
    リン酸およびグルタミンをキット成分として含有するキ
    ット。