TWI232883B - Novel enzyme gene and expression product thereof - Google Patents

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1232883 五、發明説明（2 (1991) ，·及Endocrinology，136· 2809-28 1 6 (1 995))。 在葡萄糖代謝途徑中，六碳糖胺生物合成途徑被視為在 攝入過量葡萄糖時的回饋機制扮演重要的角色。在六礙择 胺代謝途徑中，GFAT是重要的速率決定酵素。已知患有 非-胰島素-依賴性糖尿病患者（第二型）iGFA丁活性一般較 咼，有報告指出GFAT活性是造成血液中高葡萄糖含量的 原因之一（Diabetes，45, 302-307 (1996)) 〇 除 了人類 GFAT (J· Biol· Chem·，2^2，25208-252 12 (1992) ;美國專利案號5,876,7 1 3)外，尚有老鼠gfat， 酵母菌GFAT，及大腸桿菌GFAT報導。這些GFATs與人 類GFAT的相似程度相當高。然而，目前尚未得知對骨骼 肌（是葡萄糖代謝作用的重要組織）具有專一性之新穎^^^八丁 的存在。 分離具GFAT活性之新穎GFAT基因能闡明GFAT在六碳 糖胺生物合成作用中所扮演的調節性功能，分離特定表現 於組織中的GFAT基因（諸如骨骼肌）能進一步闡明組織中葡 萄糖的代謝機制，除此之外，發現抗〇17八丁蛋白質（該蛋白 負具有此種GFAT基因編碼胺基酸序列的表現產物）之抑制 活性特定候選化合物可開發新穎作用機制之降血糖藥劑， 以預防及治療糖尿病。 鑒於則述，本發明主旨是分離諸如此類之新穎GFATS 因，特別是特定表現於骨胳肌中之G F A τ基因。 發明揭示 為達前述目才票，本發明發明者已廣泛進行研究，並成功 X 297公釐） 國國家標準(CNS) Α4規格(21〇 -5- 1232883 A7 ___B7 五、發明説明（3 ) 自人類骨骼肌之cDNA庫中選殖出編碼具GFAT活性蛋白質 之新穎核甞酸序列的cDN A。有關特定表現於人類骨骼肌 及心臟之所要蛋白質及基因，本發明已成功完成選殖。 因此，本發明提供： (1) 包括下列聚核省:酸（a)、（b)、（幻或“）之基因： (a) 編碼SEQ ID NO : 1胺基酸序列所組成的聚肽 之聚核嘗酸’或該聚核:y：酸的互補股； (b) 至少編碼與SEQ ID NO : 1胺基酸序列所組成 的聚肽之聚核^:酸有9 8 %相似度之聚核甞酸，或該聚核:y： 酸的互補股； (c) 編碼刪除、取代、或加成根據（a)胺基酸序列其 中一或多個胺基酸，而具GF AT活性之聚肽的聚核：y：酸， 或該聚核甞酸互補股；或 (d) 至少編碼與根據（a)胺基酸序列所組成的聚肽有 98%相似度之聚肽的聚核荅酸，或該聚核茹酸互補股； (2) 包括下列聚核甞酸之基因： (a) SEQ ID NO : 2核甞酸序列所組成之聚核：y：酸 ，或該聚核#酸的互補股；或 (b) 高度嚴苛條件下，與根據（a)核荅酸序列所組成 之聚核芬酸雜化的聚核:y：酸； (3) 根據（2)的基因，其包括SEQ ID NO : 2之核:y：酸序 列； (4) (1)或（2)所列基因表現所產生之基因表現產物； (5) 包括（1)或（2)所列基因之重組表現載體； -6- 本紙張尺度適用中S g家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) —- 1232883 A7 B7 五、發明説明（4 ) (6) 帶有（5)所列重組表現載體之宿主細胞； (7) 經（5)所列重組表現載體轉型的轉型細胞； (8) 下列（a)、（b)、或（c)所示之蛋白質： (a) SEQ ID NO : 1胺基酸序列所組成之蛋白質； (b) 刪除、取代或加成根據（a)胺基酸序列其中一或 多個胺基酸，並具GFAT活性之蛋白質；或 (c) 至少與根據（a)胺基酸序列9 8 %相似度之胺基酸 序列所組成之蛋白質； (9) 一種用以治療或預防低血糖症之組合物，其包括以 (1)或（2)所列之基因，或（4)所列之基因表現產物為活性成 分； (10) —種用以治療或預防低血糖症組合物，其包括以（8) 所列蛋白質為活性成分； (11) 一種抗體，特別是單株抗體，其可鍵結至任何選自 (4)所列基因表現產物、（8)所列蛋白質，及該產物或 質的片段； (12) —種用以篩選可抑制（1)所列基因、（4)基因表現產 物、或（8)所列蛋白質酵素活性之候選化合物的方法，該方 法包括：⑴在競爭方式下，將⑴）所列抗體與含有候^化 合物及業經標記之（8)所列蛋白質或該蛋白質部分肽的試驗 ，體反應’ ·及測定已鍵結至抗體之標記蛋白質或部分肤本 量；⑻同時或依序將含有候選化合物之試驗液體與二 體及其他標記抗體反應，該抗體固定在載體物上二 在載體物上標記藥劑的活性；或（iH)在（8)所列蛋白質=

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蛋白質部分肽與受質反應，及蛋白質或該蛋白質部分肤與 文質及候選化合物反應情形下，測定蛋白質或蛋白質部分 肽之酵素活性，並比較不同情形下酵素的活性；及 (13) —種（12)所列篩選方法所採用之篩選套组，立包括 測定緩衝液、(8)所列蛋白質或該蛋白質部分肽，及；為受 質之果糖-6-磷酸及越胺。 本發明亦提供： U4)定量測定試驗液體中含SEQ ID N〇 :丨胺基酸所組 成之蛋白質（後稱“GFAT1L蛋白質，，）或該蛋白質片段的方 法，該方法包括：以競爭方式，將對抗含有編碼SEQ id NO : 1胺基酸序列聚肽之聚核甞酸或含有由SEQ id n〇 : 2聚核苷酸基因（後稱“GFAT1L基因”）基因表現產物的抗體 ，或對抗GF AT 1 L蛋白質或該蛋白質片段（例如部分肽）之 抗體與試驗液體與標記GFAT1L蛋白質或蛋白質片段反應 ’及測足键結至抗體上標1己G F A T 1 L蛋白質或蛋白質片段 的含量； (15) 測疋试驗液體中本發明蛋白質或蛋白質片段之定量 方法，該方法包括：將試驗液體與（丨4)所列已固定至載體 物上體反應’及同時或依序與對抗另一個標記gfatil 蛋白質的抗體反應；及測定在載體物上標記藥劑之活性； (16) —種藥劑，特別是係用以治療及預防糖尿病的藥劑 ’其包括對抗G F A T 1 L蛋白質的抗體（較佳是對抗具有中和 GFAT1L蛋白質活性之活性GFAT1L蛋白質）；及 (1 7) —種篩選抑制G F A T酵素活性化合物之方法，該方 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232883 A7 -----B7 五、發明説明（6 ) 法包括將GFAT1L蛋白質或蛋白質片段與受質反應情形， 及將GFAT1L蛋白質或蛋白質片段與受質及試驗化合物反 應情形下，収蛋白質或片段之酵素活性，並比較個別情 形下酵素活性。 本發明亦提供·· (18) —種反向DNA ,其包括互補於或實質互補於 GFAT1L基因之DNA，並具抑制該⑽八表現作用之核芬酸 序列； (19) 一種GFAT1L基因反向！^^^ ,其包括實質互補於 GFAT1L基因DNA的核苷酸序列，其中該核謀酸序列完全 互補於DN A，或與互補DN A至少約9 8 %(較佳者為至少約 99%)相似度之核:y：酸序列；及 (20) —種醫藥組合物，特別是係用以治療及預防糖尿病 的醫藥組合物，其包括GFAT1L基因的反向DNA。 在本發明說明書中，胺基酸、核芬酸序列，及核酸縮寫 係根據IUPAC-IUB [IUPAC-IUB生物命名信息，Einr. J. Biochem·，Hi; 9 (1984)]，”製備含有核甞酸序列或胺基 酸序列說明指引，，（日本專利局印行），及技藝中慣用符號。 圖式簡要說明 圖1是以根據實例2所獲之RT-PCR產物進行瓊脂糖膠片 電泳分析後，所顯示本發明基因在器官中表現型態的照片 〇 圖2所示是根據實例4，以F - 6 - P為受質時，所得本發明 GFAT1L酵素特徵，GFAT活性之Km及抑制型態。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1232883 A7 ______ B7 五、發明説明（7 ) 圖3所不是根據實例4，以麩胺為受質時，所得本發明 GFAT1L酵素特徵，GFat活性之Km及抑制型態。 圖4所示是根據實例4中GFAT1L之酵素反應曲線。 本發明最佳執行模式 後文將更詳細說明本發明基因及蛋白質。 本發明蛋白質特徵是其含有SEQ ID NO : 1胺基酸序列 ’或貫質上與SEQ ID NO : 1胺基酸序列相似的胺基酸序 列’例如本發明蛋白質為源自人類細胞（特別是人類橫紋肌 細胞）或人類組織（特別是骨骼肌或心臟）之蛋白質。另一種 情況是本發明蛋白質可為合成的蛋白質。 實質上與SEQ ID NO : 1相似的胺基酸序列之實例包括 具有與SEQ ID NO ·· 1胺基酸序列至少約98%相似度之胺 基酸序列，較佳至少約99%，及刪除、取代、或加成SEQ ID NO : 1胺基酸序列其中一或多個胺基酸者。實質上與 SEQ ID NO : 1胺基酸序列相同之胺基酸序列組成之蛋白 質實例包括實質上與SEQ ID NO ·· 1胺基酸序列相同之胺 基酸序列及實質與本發明SEQ ID NO : 1相同胺基酸序列 組成之蛋白質的等量相同GF AT活性之蛋白質。特定實例 包括後述GFAT1L基因同質基因產物（GFAT1L同質基因包 括異體基因），及具有與哺乳類相同GF AT活性之蛋白質， 諸如人類、馬、羊、牛、狗、猴、貓、熊、鼠及兔。 本專利說明書所用“實質等量”係指蛋白質GF AT活性在 特徵上（例如生理、化學或醫藥上）彼此相同。因此，蛋白 質與蛋白質間的定量參數會有不同，諸如GF AT活性及分 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232883 A7 B7 五、發明説明（8 子量。 利用已知的方法可測SGFAT活性，例如MarshaU等人 揭示的方法（Marshall 等人，J. Biol· chem.，，（8)， 4706-4712 (1991)) 〇 本專利說明書所用“GF ΑΤ活性，，係指在後述實例中，以 果糖-6-磷酸為受質時，UDp-N_乙醯基葡萄糖胺抑制 GF AT活性之混合抑制型態中所呈現的at活性。因此， GFAT活性明顯與拮抗抑制型態所示之GFAT活性不同。後 文中’具有本發明特定混合抑制型態之Gfat活性簡稱為 “GFAT 活性”。 刪除、取代或加成前述胺基酸位置之胺基酸是不受限制 的’只要含有所得修飾胺基酸序列之蛋白質仍呈現G f a T 活性即可。同理，可任意删除、取代或加成胺基酸數目， 只要所得胺基酸序列所組成之蛋白質具有〇 F a T活性即可 〇 本發明基因編碼對骨骼肌及心臟具有專一性之蛋白質 (GFAT1L蛋白質），其由699胺基酸殘基之SEQ ID NO : 1胺基酸序列所組成，該基因特別實例包括後述實例中以所 謂“GFAT1L”之PCR產物的DNA序列推論出之基因，該基 因的核菩酸序列如SEQ ID NO : 2所示，含有2097個核芬 酸。 本發明GFAT 1L基因業經證實具有新穎核甞酸序列，其 在McKnight等人選殖之GFAT基因（McKnight, G. L·等人 ，J· Biol· Chem.，261, 25208-252 1 2 (1 992))的第 6 84 核：y： -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232883 A7 B7 五、發明説明（9 ) 酸及第685核苷酸位置處插入54個核棼酸。 因此，本發明基因編碼蛋白質之胺基酸序列在 Me Knight等人所揭示基因推論之胺基酸序列的第22 8胺基 酸及第229胺基酸位置處多插入了 18個胺基酸。 本發明蛋白質具有GFAT活性，及可作為（例如）治療或預 防改善低血糖症的藥劑。抗本發明基因反向D N A之抗體或 抗該基因表現產物之抗體預期具有治療糖尿病的功效，及 該抗體可作為篩選治療糖尿病藥劑的候選化合物之用。 本專利說明書所用”基因”包括雙股DN A及單股DNA，諸 如雙股DN A之正向股或反向股。基因的長度不受特別的限 制。因此，除非特別聲明，本發明基因（DNA)包括含有人 類基因體DNA之雙股DNA、含有eDNA之單股DNA(正向 股）、含有互補正向股之單股DN A(反向股）及其片段。 本發明基因（DNA)可含有引導序列、編碼區域及非基因 序列（e X ο η)及基因序列（i n t r ο η)。聚核芬酸實例包括R N A 及DNA，DNA包括eDNA、基因體DNA，及合成DNA。 具有特定胺基酸序列之聚肽包括聚肽片段、聚肽同質體、 聚肽衍生物，及聚肽變體。 基因變體的實例包括天然存在的對偶基因變體、非天然 存在的變體，及進行刪除、取代、加成及插入作用之變體 。此種變體所編碼之聚肽的功能實質上並未改變。 聚肽包括具有至少對偶基因有98%相似度的聚肽（較佳者 為9 9%)、聚肽同質體，或天然存在之聚肽變體。 本發明基因表現產物之生物活性（例如GF AT活性）是（例 -12- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232883 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 如）將果糖-6 -磷酸催化轉換成葡萄糖胺-6_磷酸的作用， GF AT活性亦可為增加人類或哺乳動物血液中葡萄糖含量 的作用。利用F A S T A程式採用之序列分析軟體可測定分析 有關DNA及聚肽之相似度（Clustal，V.，Methods Mol. Bi〇U 21，307-3 1 8 (1994))。 本發明基因變體包括造成胺基酸休止或保守取代作用之 變體；換言之，變體特徵是變體核甞酸序列所編碼之胺基 酸殘基並未改變。 保守取代胺基酸殘基的類型如下所述。 原有胺基酸殘基 保守取代胺基酸殘基

Ala S er Arg Ly s Asn Gin，His Asp Glu Cy s Ser Gin Asn G1 u Asp Gly Pro His Asn 或 Gin lie Leu 或 Val Leu lie 或Val Lys Arg 或 Glu Met L eu 或 11 e P h e Met，Leu 或 Tyr -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

裝 訂

1232883 A7 B7 發明説明 S er Thr Thr S er Trp Tyr Tyr Trp或Ph( Val lie 或 Leu 通常，一或多個密碼所編碼之半胱胺酸殘基會造成特定 聚肽雙硫键’因此’删除半胱胺酸殘基，及以其他胺基酸 殘基取代該殘基。 根據前述所列，比較保守取代胺基酸殘基之情形，當任 意取代胺基酸殘基時，所得蛋白質特徵稍微改變。 通常取代作用的類型S忍為會產生最大改變之蛋白質特徵 如下： a) 疏水性胺基酸殘基（諸如白胺醯基、異白胺醯基、苯 基丙胺§1基、纈、胺縫基或丙胺醯基）取代親水性胺基酸殘基 (諸如絲胺醯基或蘇胺酿基）； b) 任何其他胺基酸殘基取代半胱胺醯基或脯胺醯基； ¢)具有負電價支鏈的胺基酸殘基（諸如熟胺醯基或天冬 胺醯基）取代正電價支鏈胺基酸殘基（諸如離胺醯基、精胺 醯基或組織胺醯基）；及 d)不具支鏈的胺基酸殘基（諸如甘胺醯基）取代具有非常 大支鏈的胺基酸殘基（諸如苯基丙胺醯基）。 本發明基因及基因產物提供闡述、瞭解、診斷、預防及 治療糖尿病之資訊及方法，本發明基因適以開發能抑制或 謗發基因表現之新穎藥劑，以作前述治療用。偵測個體或 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐)

裝 η 1232883 A7 B7 五、發明説明（12 ) 組織中抑制或誘發本發明基因表現之基因產物的表現，或 偵測突變作用（刪除或點突變作用）或不正常基因表現適以 闡述或診斷糖尿病。 編碼前述修飾胺基酸序列之本發明基因可用以偵測編碼 非-修飾胺基酸序列之本發明基因。 本發明基因之特定實例包括（但非偈限於）由編碼S]Eq ID NO : 1胺基酸序列蛋白質的核:y：酸序列所組之gf Ατ丨L基 因。本發明基因亦包括GFAT1L基因同質體。 本發明所用” GFAT1L基因，，同質體係指視為一系列基因 群之相關基因，該基因具有與本發明GFAT1L基因序列（咬 基因產物）相似的序列’及在前述結構特徵、基因表現形式 ，及前述生物功能上與GFAT 1 L基因相似者（例如使用 FASTA程式所得之同質體）。GfaT1L基因同質體的實例 包括具有至少與編碼胺基酸序列SEQ ID NO : 1所組蛋白 質之核甞酸序列有9 8 %相似度之聚核铝酸，較佳者為至少 99%相似度，以及互補該聚核:y：酸之聚核荅酸。 藉由（例如）突變作用或轉譯作用後的修飾作用可天然修 飾前述胺基酸序列（變體），天然存在基因（例如本發明 GFAT1L基因）可以人工方式修飾之。本發明包括所有具有 前述特徵之修飾基因，不論造成或採用的修飾作用或變化 作用為何。本發明基因包括編碼SEQ ID N〇 :丨胺基酸序 列基因之對偶基因。 前述人工方法實例包括基因工程方法，諸如特定位置突 •k 作用[Methods in Enzymology，35〇，367_382 -15- 1232883 A7 B7 五、發明説明（13 ) (1987); Methods in Enzymology, 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res·，12., 9441 (1984); Zoku Seikagaku Jikken Koza 1 “Idenshi Kenkyu-ho II，’， Nippon Seikagakkai出版，l〇5頁（1986)];化學合成方法，諸如磷 酸三酯方法及磷酸amidite方法[J· Am. Chem. Soc.，89, 4801 (1967); J.Am. Chem. Sco.5 9_L? 3350(1969);

Science, .1 5 0, 1 78 (1 968); Tetrahedron Lett., 22_, 1859 (1981); Tetrahedron Lett·，24, 245 (1 983)];及前述方法 組合。更詳細言之，利用p h o s p h o r a m i d i t e方法或三酯方 法之化學合成作用可完成DNA的合成作用。另一種方式是 ，利用市售自動化寡核茹酸合成裝置合成DNA。適當的條 件下，鏈合合成互補股可自單股產物化學合成出雙股DNA ，或是使用適當的引子序列及D N A聚合肽添加互補股以合 成雙股DNA。 本發明基因特定實例包括具有SEQ ID NO ·· 2核:y：酸序 列之基因。核甞酸序列（編碼區域）為相對於SEQ ID NO : 1胺基酸序列之個別胺基酸殘基的密碼組合實例，本發明基 因非限於具有此種特定核茹酸序列的基因；本發明基因可 具有選自相對個別胺基酸殘基之任意密碼組合的核笔:酸序 列，密碼的選擇係利用慣用的方法完成，例如，選擇密碼 可考慮宿主使用密碼出現的頻率[Nucleic Acids Res。1 43 (198 1)] 0 如前所述，本發明基因包括與SEQ ID NO : 2核省:酸序 列一致相似之核棼酸序列之基因。 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ' -- 1232883 A7 B7 五、發明説明（14 ) SEQ ID NO : 2核芸酸序列一致相似之核：y：酸序列所組 之基因係指至少由與S E Q ID N 0 : 2核:y：酸序列9 8 %相似 度之核苷酸序列所組之核茹酸序列，較佳者為9 9 %，或是 與該聚核甞酸互補之聚核苷酸。 基因實例包括在高度嚴苛條件下（例如，6 0 °C下，含有 0.1% SDS 之 0.2XSSC，或 60 °C 下，含有 0.1% SDS 之 O.lxSSC)，與SEQ ID NO : 2雜化之核嘗酸序列的基因。 根據本專利說明書所揭示的基因特定實例中的序列資訊 ，可利用慣用基因工程方法輕易的製備或獲得本發明基因 [參考分子選殖第二版，冷泉灣實驗室1989年印行；Zoku Seikagaku Jikken Koza “Idenshi Kenkyu-ho I，II，III，， Nippon Seikagakkai 出版（1986)]。 明確言之，利用慣用方法，從能表現本發明之適當來源 中製備cDNA庫，並利用適當的探針或對本發明基因有專 一性的抗體，自基因庫中篩選所要的選殖體[例如，pr〇c.

Natl. Acad. Sci.5 USA., 78? 6613 (198 1); Science, 222, 778 (1983)]。 前述cDN A來源實例包括表現本發明基因之各種細胞及 組織；及源自該等細胞或組織之細胞培養，可利用慣用的 方法自此等來源分離RNA或mRNA，純化mRNA ,或製備 及選殖cDNA。在本發明中，可採用市售的mRNA或cDna 庫（例如Clontech實驗室公司產品）。 自cDN A庫中_選本發明基因的方法並無特別的限制， 且可利用慣用的方法進行筛選工作。筛選方法的特別實例 -17- 本纸張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(2l〇x297公爱)" ---—--- 五、發明説明（15 ) 蛋白質具有專—性之免疫筛選方法，自CDNA中筛 2犯產生孩蛋白質之相#eDNA選殖體的方法，·以可與 ㈣DNA序列選擇性鍵結之探針進行之菌斑雜化作用；選 殖肖豆雜化作用；及其組合。 師選時所用的探針係根據本發明基因之核#酸序列的資 以化學合成之DNA ’或為所得的本發明基因或基因片 段。另-種方式是，篩選時所用的探針係根據本發明基因 核答酸序狀資訊所設計的正㈣子或反向引子。 前述探針所用的核苷酸序列為相對SEQ ID n〇 : 2之部 刀核知酞序列，其包括至少部分插入序列的5 4個核甞酸^ 之15個或更多個的連續核苷酸，較佳為2〇個連續核甞酸， 更佳者為3 0個連續核苷酸，更佳者為5 〇個連續核甞酸。另 一種方式是，具有前述核苷酸序列之陽性選殖體可作為探 針之用。 較佳是採用PCR之DNA/RNA增殖作用方法製備本發明基 因[Science，m 1350 (1985)]。當無法自基因庫中輕易製 備全長的cDNA時，較佳採用RACE方法[Rapid amplifkati〇n of cDNA ends; Jikken Igaku，12 (6)，35 (1994)]，明確言 之’是5’-RACE 方法[M. A. Frohman 等人，proc Natl

Acad· Sci.，USA·，！，8998 (1988)]。 此P C R所用的引子是根據本發明所揭示的g F a τ i乙基因 序列資訊所設計的，可利用慣用的方法合成之。以前述的 慣用方法可分離及純化增殖的DN A/RN A ;例如膠片電;永 作用。 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1232883五、發明説明（16 ) A7 B7 利用慣用的方法可測定前述所得之本發明基因或dna片 段之核荅酸序列，諸如二去氧方法[Pr〇c Natl. Acad. Sci.， USA·，5463 (1977)]或 Maxam-Gilbert 方法[Methods in Enzymology，拉，499 (1980)]。另一種方式是，可利用 市售的定序套組方便的定出核:y：酸序列。 當使用如此所得之部分或全部本發明基因的核甞酸序列 時’可專一性偵測個體或各式組織中該基因的表現。 利用慣用方法可偵測基因表現，偵測方法的實例包括 RT-PCR之RNA增殖作用[反向轉錄-聚合酶鏈結反應；E. S· Kawasaki等人，RNA增殖作用。在pcR步驟中，方法 及應用指引，Academic Press，Inc·，聖地牙哥，21-27 (1 9 9 1)]’諾氏墨潰分析法[分子選殖，冷泉灣實驗室( 1 9 89)];原位尺丁-?〔11[]^11。1.八(^〇13 1^3.，21,3159- 3 166 (1 993)];細胞大小階段之原位雜化作用測定； NASBA方法[核酸序列為基礎之增殖作用，Nature，35〇,91-92 (1991)]，及各式的方法。較佳者，以rt-PCR進行 偵測。 PCR所採用的引子並無特別限制，只要該引子可專一性 增殖本發明基因即可。該引子係根據本發明基因核芬酸序 列資訊設計而成的。引子實例包括含有本發明基因部分核 甞酸序列，及通常具有10至35個核荅酸，較佳者约15至3〇 個核菩酸。 本發明基因包括偵測本發明基因時所用之專一性引子及/ 或專一性探針之DNA片段。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

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線 1232883 A7 B7 五、發明説明（17 ) DNAj段是與由SEQ ID N〇 : 2核甞酸序列組成之 DNA在高度嚴苛條件下進行雜化之〇财。高度嚴苛條件並 典特別限制，只要DNA片段可作為引或探針即可。例如， 雜化作用可在前述條件下進行；換言之，6〇艽下，含有 0.1% SDS之0.2xSSC，或峨下，含有〇 1% SDS之〇卜 SSC。 藉由使用本發明基因，以慣用遺傳工程技術輕易並穩定 的大量製備該基因產物（GF AT〗L蛋白質）或含有該基因產 物之蛋白質。 本發明亦提供諸如本發明基因所編碼GFAT1L蛋白質之 | 蛋白質，含有製備該蛋白之基因的載體；經該載體轉型的 很主細胞，及培養宿主細胞製備該蛋白的方法。 利用潰用的基因-裂解技術[例如，Science，224，1431 (1984) ，Biochem· Biophys. Res· Comm.，130, 692 (1985) ，Proc· Natl. Acad· Sci·，USA·，80, 5990 (1983)] ，根據本發明GFAT1L·基因核荅酸序列資訊製備本發明蛋 白質。 更明確1：之，根據下述製備蛋白質··製備能於宿主細胞 中表現編碼所要蛋白質的基因之重組Dna(表現載體）；將 DNA帶入至宿主細胞内以轉型該細胞；培養所得之轉型細 胞；及從培養產物中回收蛋白質。 前述宿主細胞可為原核細胞或真核細胞，原核宿主細胞 | η例包括廣泛使用的大腸桿菌（仏c六e r c f α c /丨）及枯草 桿菌（5aci//w 。較佳者為大腸桿菌，特別佳者 -20- 本紙張尺度適用巾s S家標準(CNS) Α4規格(21GX 297公爱) ---- !232883 發明説明（18 疋使用大腸桿菌K-1 2。真核宿主細胞實例包括脊椎動物細 胞及酵母細胞，較佳者為脊椎動物細胞，包括猴C 〇 s細胞 Kell，21: 175 (198 1)]，中國倉鼠卵細胞，及卵細胞株中 —氲葉還原自母缺失之細胞株[pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA·，21: 42 1 6 (1 980)]，酵母細胞中較佳實例包括酵母菌 屬細胞。上述實例的宿主細胞並無限制。 當宿主為原核細胞時，需使用可在宿主細胞複製之載體 。較佳的載體包括表現質體，其在本發明基因上方處含有 啟動子，SD (Shine-Dalgarno)序列，及蛋白質合成作用時 所需之起始密碼（例如A T G )，以便該基因可在宿主細胞中 表現。通常，源自大腸桿菌之質體（諸如pBR322，pBR325 ’ pUC 1 2或pUC 1 3)是廣泛使用的前述載體。這些實例並無 限制’其他各式載體亦可使用。表現基因之市售源自大腸 才干® 載體貫例包括 pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech 的產品）；PMAL-C2 及 pMAL-P2 (New England Biolabs 的產品）；pET21 及 pET21/lacq (Invitrogen 的產品） ;&pBAD/His (Invitrogen 的產品）。 當以脊椎動物細胞為宿主所用之表現載體實例所包括之 載體，需在欲表現本發明基因上方處含有啟動子、A分 解位置、聚腺酸化位置及轉錄作用終止序列，倘有需要 ’載體得含有複製原。表現載體之特別實例包括pS V2dhfr ，其具有SV40之起始啟動子[Mol· Cell. Biol.，JL: 854 (1 98 1)]。除此之外，可使用各式市售已知的載體。用以表 現基因之市售源自脊椎動物細胞載體包括動物細胞載體（諸 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 訂 1232883 A7 B7 五、發明説明（19 ) 如 pEGFP-N及pEGFP-C (Clontech的產品），pIND (Invitrogen 的產品），及pcDNA3.1/His (Invitrogen的產品）；及昆蟲 細胞載體（諸如 pFastBac HT (GibcoBRL的產品），pAcGHLT (PharMingen的產品），及pAc5/V5-His，pMT/V5-His，及 pMT/Bip/V5-his (Invitrogen 的產品）。 當以酵母細胞為宿主時，表現載體之特別實例包括 pAM82，其含有相對酸性磷酸酶基因之啟動子[Pr〇c. Natl. Acad· Sci.，USA·，脸：1 (1983)]。酵母細胞表現載體之市 售商品實例包括pPICZ (Invitrogen的產品）及pPICZa (Invitrogen 白勺產品）。 所採用的啟動子類型並無特別限制，例如，宿主為 hc/zehc/z/a屬時，較佳使用色胺酸（trp)啟動子，lpp啟動 子，lac啟動子，recA啟動子，或PL/pr啟動子。當宿主 為5 a e z· / / w屬時，較佳使用例如s P 〇 1啟動子，§ p 〇 2啟動 子，或penP啟動子。當宿主為酵母菌時，較佳使用例如 PH05啟動子，PGK啟動子，GAP啟動子，或adH啟動子 。菖彳百主為動物細胞時，較佳使用例如源自S v 4 〇啟動子， 反轉錄病毒啟動子，金屬硫蛋白啟動子，熱誘啟動子， site megalovirus啟動子，或SRa啟動子。 一般融合蛋白表現載體較佳為本發明基因之表現載體， 融合蛋白表現載體的特別實例包括表現麩胺基硫_s_移轉酶 (GST)之融合蛋白基因之pGEX (Pr〇mega的產品）。 能增進聚肽在宿主細胞中表現及分泌之聚核苷酸序列實 例包括分泌序列及導引序列。當使用細菌宿主時，例如， -22- 本纸張尺度適用巾a g家標準(CNS) A4規格(21GX297公爱)'----- 1232883 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（2〇 ) 使用標幟序列（六組胺酸標語）可以純化融合成熟之聚肽。 當宿主為哺乳細胞時，則使用例如紅血球凝集素（HA)。 將所要的重組DN A(表現載體）帶入至宿主細胞内及轉型 宿主細胞的方法並無特別限制，可採用各式慣用的方法。 利用慣用的方法培養因此所得之轉型細胞。經由培養， 表現出所設計基因編碼之本發明標的蛋白，並產生於轉型 細胞内或外（累積及分泌），或產生在轉型細胞之細胞膜上 〇 根據所用之宿主細胞，可從各式傳統之培養液中選用細 胞培養所用的培養液，在適合宿主細胞生長條件下培養細 胞。 倘有需要，可利用各式的分離技術，根據蛋白質的物理 及化學特性，分離及純化因此所得之本發明重組蛋白[參 考” Biochemistry Data Book II，” 1 175-1259 頁，第一版， 首印，1980 年 6 月 23 日，Tokyo Kagaku Dojin 印行； Biochemistry, (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 1 63一，3 13 (1987)]。 分離技術的特別實例包括一般回復原狀處理、蛋白沉澱 物處理（鹽析）、離心作用、滲透壓電擊方法、超音波、超 過濾作用、分子筛層析法（膠片過濾法）、吸附層析法、離 子人換層析法、親合力層析法、高效液態層析法（h p L匸）、 透析法、及其組合。更佳者，可採用含有能與本發明蛋白 專一性鍵結抗體之管柱的親合力層析法。

當设計編碼本發明蛋白之基因時，較佳是使用SEQ ID -23-

1232883 發明説明（21 N〇 ·· 2之GFAT1L基因的核荅酸序列，倘有需要，可適當 選擇及修飾相對於蛋白胺基酸殘基之密碼來設計該基因。 利用一般化學合成方法，根據SEQ ID NO : 1胺基酸序 列製備本發明蛋白質，該合成作用實例包括一般液相方法 或固相方法之肽合成作用方法。 肽合成作用方法的特別實例包括逐步加長方法，其係根 據胺基酸序列資訊，逐步依序將胺基酸鍵結至另一胺基酸 殘基上，藉此加長胺基酸鏈；及片段縮合方法，其中片段 係由數個事先合成之胺基酸所組成，經由偶合反應將片段 與另一片段鍵結。本發明蛋白質可用任何一種方法合成。 在此種肽合成作用中，可以慣用的方法進行縮合作用。 縮合作用方法實例包括疊氮化合物方法、混合酸酐方法、 DCC方法、活化酯方法、氧化-還原方法、DPpA(二苯基 磷酸基疊氮）方法、DCC +添加物（1-羥基苯并三唑、N —羥 基琥珀醯胺、N-羥基-5-去甲彳|-2,3-二羧基亞醯胺）方法， 及Woodward方法。 在此方法中所用的溶劑可選自肽縮合反應中廣泛所用的 浴劑’落劑實例包括二甲基甲醯胺（DMF)、二甲基颯 (DMSO)、穴磷酸醯胺、二呤烷、四氫呋喃（ΤΗρ)，乙酸 乙酯，及其溶劑混合物。 在刖逑肽合成作用過程中，可利用酯化作用將未參與反 應之胺基酸或肽上的羧基酯化，而將其保護起來，例如低 碳數烷酯；例如甲酯，乙酯，第三_丁酯，及芳香烷酯；例 如芊酯，對-曱氧基芊酯，及對_硝基芊酯。

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1232883 A7 B7 五、發明説明（22 可利用基團（例如乙醯基，苄基，芊基氧羰基，或第三_ 丁基）將具有側鏈官能基之胺基酸（例如酪胺酸的羥基）保護 起來。然而，保護作用是視情況進行的。除此之外，例如 ’精胺酸上的胍基可用適當的保護基團（諸如硝基，甲苯續 酿基基、對-甲氧基苯磺醯基、伸甲基_2_磺醯基、苄基氧 羰基、異莅基氧羰基或金剛烷基氧羰基）保護。 經由例行性方法可將包括於前述胺基酸、肽及本發明蛋 白貝上的保護基團去保護；例如催化還原作用或利用液態 氨/鈉、氟化氫、溴化氫、氯化氫、三氟乙酸、乙酸、甲酸 或甲燒續酸等試劑。 可利用前述各式方法適當純化因此所得之本發明蛋白質 ，例如，一般所用的方法係肽化學範疇中所採用的方法； 例如離子X換樹脂、分配層析法、膠片層析法及逆流分布 〇 本發明蛋白質適以作為製備其專一性抗體之免疫原，利 用咸免疫原，可製備所要的抗血清（多株抗體）及單株抗體 0 製備其抗體方法是技藝中所熟知的方法，因此，在本發 明中，亦可經由例行性方法製備抗體（參考，例如 seikagaku jikken k〇uza“研究免疫學方法，，，日本生化協會 出版（1 986)。 曰 因此所得之抗體（例如）可用以純化GFatil蛋白質；利 用其免疫學方法分析及鑑定蛋白質。更明確言之，因為本 發明基因證實在骨悠肌組織及心臟組織中表現，該抗體可 -25- 1232883 A7

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1232883 A7 B7 五、發明説明（24 ) 鉀或鋰；鹼土金屬鹽，諸如鈣、鎂或鋇；及銨鹽。前述鹽 類另外包括酸加成鹽’其係將本發明蛋白質與適當有機酸 或無機酸反應後而成的。典型酸加成鹽實例包括氫氯酸鹽 、氫溴酸鹽、硫酸鹽 '氳硫酸鹽、醋酸鹽、草酸鹽、戊酸 鹽、油酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、鱗 酸鹽、對-甲苯磺酸鹽（tosylates)、擰檬酸鹽、順丁婦二 酸鹽，反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、橫酸鹽、經 乙酸鹽、順丁晞二酸鹽、壞血酸鹽、苯磺酸鹽及蕃酸鹽。 前述藥劑組合物中包括醫藥有效量之本發明蛋白質（作為 活性成分），及組合時之適當藥劑載劑或稀釋劑。 用於前述藥劑組合物（藥劑配方）之藥劑載劑實例係根據 配方使用形式，包括典型之稀釋劑及媒劑。特別之實例包 括填充劑、膨脹劑、鍵結劑、潤濕劑、分散劑、表面活性 劑、潤滑劑及適當選用之載劑，並根據所製備之配方單位 投藥形式使用。 特別佳者’本發明藥劑配方是根據蛋白質配方中所用之 各式成分及類似物製備而成，諸如穩定劑、無菌劑、緩衝 劑、等張劑、螯合劑、pH-調節劑及表面活性劑。 穩定劑貫例包括人類血清白蛋白、典型L _胺基酸、醣類 及纖維素衍生物。這些穩定劑可單獨使用或組合使用，亦 可與其他成分（諸如表面活性劑）組合使用。此種組合使用 可能會另外增進活性成分之穩定性。 如述L -胺基酸並無特別限制，任何L _胺基酸均可使用， 諸如甘胺酸、半胱胺酸或鉋胺酸。 -27- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232883 A7

前述醣類並無特別限制，可使用單醋類（諸如葡萄糖 露糖、半乳糖及果糖）；_(諸如甘料、肌醇及木 ;雙酷類（諸如蔗糖、麥芽糖及乳糖）；及多酷類（諸如葡） 糖精、經基丙基殿粉、軟骨素硫酸及玻_酸）及其衍生物 〇 表面活性劑並無特別限制，不論離子性或非離子性表面 活性劑均可使用。實例包括聚氧伸乙基丙二醇花揪丹燒酉旨 、聚氧伸乙基烷酯、花楸丹單醯酯及脂肪酸甘油酯。 纖維素衍生物並無特別限制，而纖維衍生物包括甲基纖 維素、乙基纖維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維 每基丙基甲基纖維素及幾基甲基纖維素。 前述醣類適當添加總量是每微克活性成分約〇 . 〇 〇 〇丨亳克 或更多，較佳者約0.01-10毫克。前述表面活性劑添加總量 是每微克活性成分約0 · 0 〇 〇 〇 1毫克或更多，較佳者約 〇 · 0 0 0 1 - 0 · 0 1毫克。人類血清白蛋白添加總量是每微克活 性成分約〇 · 〇 〇 〇 1毫克或更多，較佳者約〇 〇 〇丨_ 〇 1亳克。 胺基酸添加總量是每微克活性成分約0 · 0 0 i _ i 0毫克，纖維 素衍生物添加總量是每微克活性成分約〇 · 〇 〇 〇 〇 1毫克或更 多’較佳者約〇 . 〇 〇 1 - 〇 . 1毫克。 加至本發明藥劑配方中之活性成分含量範圍廣泛，適當 控制在約〇 · 〇 〇 〇 〇 1 - 7 0重量％，較佳者約0 _ 0 0 0 1 - 5重量％。 本發明藥劑配方可含有各式的添加物，諸如緩衝劑、等 張劑及螯合劑。緩衝劑的實例包括硼酸、磷酸、醋酸、檸 檬酸、ε-胺基癸酸、熟胺酸，及或其鹽類（例如驗金屬鹽 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） !232883 五、發明説明（26 或奸鹽，及驗土金屬鹽，諸如旬或鎂鹽)。等張劑 广括乳化制、氯化鉀、醣類及甘油。螯合劑實例包括 伸乙二胺四乙酸鈉及擰檬酸。 本發明藥劑配方可為溶液配方形式，另一種方式是，該 配万料為便於保存之冷;東乾燥形式，使用時，將立溶解 =水’含有生理食鹽騎液㈣液，以形成適當濃度之配 可根據治療目的來決定本發明藥劑配方各種形式之投藥 單位形式，典型投藥形式實例包括固態（諸如鍵片、藥=、 粉末、藥粉、顆粒及膠囊狀藥劑）；及液態（諸如溶液、顿 浮液、乳化液、糖漿及藥水）。根據投藥的途徑，這些投藥 形式可另外區分為經口藥劑、非經腸藥劑、經鼻氣管㈣ 、經由陰道藥劑、坐劑、舌片及軟膏。根據相對之典型； 法，可混合、成形及製備這些形式。 例如，當配方為錠片時，可使用各式的配方載劑。實例 包括媒劑（諸如乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、澱粉 、碳酸鈣、白陶土、結晶體纖維素、水楊酸及磷酸鉀）；鍵 結劑（諸如水、乙醇、丙醇、單純糖漿、葡萄糖溶液、澱粉 溶液、動物膠溶液、羧基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、 甲基纖維素及聚乙烯基吡咯啶烷酮）；分散劑（諸如羧基甲 基纖維素鈉、羧基甲基纖維素-Ca、低取代程度羥基丙基纖 維素、乾澱粉、藻酸鈉、粉末瓊脂、粉末昆布糖、碳酸氫 鈉及碳酸鈉），·表面活性劑（諸如聚氧乙晞花楸丹脂肪酸酯 &酸月桂酯、及單硬脂酸甘油酯）；分散預防劑（諸如蔗 本紙張尺度適财S S家標準(CNS)城格(繼297公复） -29- 1232883 A7 ~_ __ B7 五、發明説明（27 ) 糖、三硬脂酸甘油酯、可可膏及氫化油）；吸收加強劑（諸 如四級胺基及硫酸月桂酯）；潤濕劑（諸如甘油及澱粉）；吸 附劑（諸如澱粉、乳糖、白陶土、膨土及羽狀矽酸）；及潤 滑劑（諸如純化滑石粉、硬脂酸鹽、粉末硼酸及聚乙烯丙二 醇）。 除此之外，錠片可視情況以慣用塗覆物質塗覆，形成塗 覆錠片。此種錠片的實例包括糖-塗覆錠片、動物膠-塗覆 鍵片、腸衣錠片及薄膜塗覆錠片。另一種方式是，錠片可 為雙層錠片或多層錠片。 當配方為藥丸時’可使用的配方載劑包括媒劑（諸如葡萄 糖、乳糖、澱粉、可可膏、氫化蔬菜油、白陶土及滑石粉） ;鍵結劑（諸如粉末亞拉伯膠、粉末膠黃蓍樹膠、動物膠及 乙醇）；及分散劑（諸如昆布糖及瓊脂）。 經由例行性方法，將本發明活性成分及上述實例中所述 之配方載劑混合，以製備動物膠或軟性物質之膠囊藥劑。 經口投藥之液態配方包括醫藥學上可接受溶液、乳化液 、懸浮液、糖漿及藥水，且其含有常用非活性之稀釋劑（諸 如水）。該液態配方可另外含有佐劑（諸如潤濕劑、乳化劑 及懸浮劑）。這些配方可以例行性方法製備之。 當藥劑配方為非經腸投藥之液態配方時；例如無菌水溶 液或非水溶液、乳化液及懸浮液，可使用稀釋劑，諸如水 、乙醇、丙醇、聚乙烯丙二醇、乙氧化異脂酸醇、聚氧化 異脂酸醇、聚氧乙晞花楸丹脂肪酸酯或蔬菜油，諸如撤才覽 油。除此之外，可加入可注射之有機酯，諸如油酸乙醋。 •30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ' -- !232883

這些液態配方可另外含有典型溶解佐劑， 4 请如緩衝访. 濕劑、乳化劑、懸浮液、保存劑及分散劑。 成，潤 無菌作用係採用諸如通過可過濾掉細菌之、 ;添加消毒劑；放射線處理；或加熱處理。除濾法 菌固態組合物在使用之前，溶解在無菌水或適去,無 中，亦可製備液態配方。 ”轶菌基質 當配方為坐劑及經陰道投藥藥劑時， T J使用配方載南丨， 諸如聚乙烯丙二醇、可可膏、高碳數醇古 ，丨 问石灭數醇酯、 動物膠及半合成甘油酯。 當配方為軟膏時，諸如貼片、乳液及膠體，可使用白石 蠟脂、石蠟、甘油、纖維素衍生物、丙二醇、聚乙烯丙^ 醇、矽嗣、膨土及蔬菜油，諸如橄彳覽油。 經由例行性方法’利用已知標準媒劑，可製備經鼻氣管 或舌下投藥之藥劑組合物。 本發明藥劑▼包含額外的成>，諸如色t、保存劑、香 料、芳香劑、甜味劑及其他醫藥物。 投用前述藥劑配方脂方法並無特別的限制，採用的方法 是根據條件而定的，諸如配方的形式、病患狀態；例如年 齡或性別，及疾病的嚴重性。明確言之，錠片、藥丸、液 體、懸浮液、乳化液、顆粒及膠囊藥劑係經口投藥。注射 針劑係以靜脈注射單一投藥或與典型補充劑組合使用，諸 如葡萄糖或胺基酸’倘有需要，係以肌肉内、皮内、皮下 或腹腔内方式注射之。坐劑係經肛門投藥，經鼻氣管藥劑 係經鼻腔氣管投藥，舌下藥劑係經口投藥，軟膏則是經皮 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公复7 1232883 A7 ------B7 五、發明説明（29 ) 投藥。 含於前述藥劑配方中的活性成分含量及投藥劑量並益特 別限制，根據-些條件，這些含量範圍廣範，諸如所要的 治療效果、投藥方法、治療期間及病患狀態（如年齡或性別） 等。通常，每公斤人體體重每日投藥劑量約〇 〇1微克至1〇 毫克，較佳約ο·1微克至1毫克。投藥配方可以每日投與單 劑或分次投藥。 因此所得之本發明骨骼肌專一性（本發明蛋白質）具有 GFAT活性，及該蛋白質全部或部分可作為減緩低血糖症 藥劑之用。 如後述實例所示，本發明基因證實可於骨骼肌組織中表 現，因此，製備包括本發明GFAT1L基因全部或部份反向 DNA之任意基因表現載體，&利用㈣體在骨體肌組織細 胞中產生具有互補於mRAN<RNA序列，可以抑制轉譯作 用，以抑制GFAT1L基因表現，因此，骨骼肌組織中六碳 糖胺生物合成途徑之GFAT活性會被抑制，並促進細胞攝 入葡萄糖的含量’以降低血糖的含量。如此一來，促進葡 萄糖代謝作用，進而抑制或減緩糖尿病進展。本發明基因 可能為抗··糖尿病作用之基因治療組合物，或為具有相同效 果之基因療劑。 本發明亦提供包括全部或部份GFAT1L基因以為基因治 療用之載體，及包含利用該載體將GFAT1L基因帶入細胞 内之藥劑（為活性成分）。 因此，本發明提供用於基因治療之引入載體，其包括含 __ -32- I紙張尺度適用巾國國家標準(CNS) Μ規格_Χ297公爱) '' -- A7 B7 1232883 五、發明説明（3〇 ) 有全部或部份SEQ ID NO ·· 2反向DNA序列之GFAT1L反 向基因·，利用該載體將GFAT 1L反向基因帶入的細胞；含 有作為活性成分之引入載體以為基因治療用之基因治療藥 劑’及利用載體將GF ATI L反向基因帶入的細胞。 本發明亦提供在糖尿病病患骨骼肌細胞或肌肉組織位置 投與糖尿病治療藥劑，以促進這些組織中葡萄糖代謝作用 及抑制糖尿病病患的糖尿病進展或促進其體中葡萄糖代 謝作用，藥劑的特徵在於基因治療用之引入載體，其包括 含有全部或部份SEQ ID NO : 2序列之反向DNA之GFAT1L 反向基因，及利用該載體將GF AT 1L反向基因帶入之細胞。 除此之外，本發明提供一種含有基因治療用之病毒性引 入載體之藥劑作為活性成分，其包括前述GF AT 1L反向基 因’明確言之，此藥劑係為（例如）治療用，以促進骨骼肌 中葡萄糖的代謝作用。 根據本發明基因治療將於後述。除非特別說明，慣用的 化學、分子生物學、微生物、重組DNA技術、遺傳學及免 疫學可用於進行後述的基因治療。這些方法的實例揭示於 Maniatis，T.等人，分子選殖：實驗室手冊（冷泉灣實驗室 ’冷泉灣’紐約（1 9 8 2)) ; S a m b r ο 〇 k，J ·等人分子選殖： 實驗室手冊，第二版（冷泉灣實驗室，冷泉灣，紐約（1981)) ;Ausbel，F.M·，等人，分子生物學最新步驟，J〇hll Wiley及Sons，紐約，（1 992) ; Anand，複合基因體分析 技術’（學院印行（ 1 992)广Guthrie，G·等人，酵母遺傳 指引及分子生物學，（學院印行（丨99丨））；及Fink等人， _ -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1232883

Hum· Gene Ther·，1，1 1 - 1 9 ( 1 992)。 本發明提供一種基因治療方法，其中提供反向核荅酸藥 劑會在本發明基因表現細胞中產生具有與mRN A序列互補 之RNA ’以抑制GFAT活性或抑制血糖濃度的增加；抑制 轉譯作用；及抑制GFAT 1L基因的表現。 七述基因治療方法是種利用抑制轉錄作用或轉譯作用步 驟來抑制標的基因表現的方法，該抑制效果係（例如）在含 有GFAT1L基因之GFAT表現細胞中鍵結適當<mRNA， 或在DN A雙股螺旋結構中併入形成三股結構達到的。此方 法被認為是產生與該基因mRNA互補之反向寡核菩酸，及 該反向寡核：y：酸移轉至標的細胞所導致的。 倘提供抑制GFAT1L基因表現功能效果，則受體細胞/標 的細胞中G F A T活性或血糖濃度的增加會受抑制。利用含 有反向寡核甞酸之載體或質體，將寡核:y：酸帶入至標的細 胞内，然其仍留在染色體外。 根據前述反向寡核甞酸之糖尿病基因療法，係將該反向 核4酸係併入至反轉錄病毒、腺病毒或源自A a v之載體上 ’而以病毒或載體轉植至GF AT活性表現的細胞，以便大 量表現反向寡核：y：酸，如此，可以達到降低所要血糖濃度 的效果。 以反向寡核：y：酸帶入至含有GFAT1L基因細胞内，以抑 制GF AT 1 L蛋白質表現為例，反向寡核苷酸無須與相對 GF AT 1 L基因全長相同，例如，仍可使用具有特定功能之 前述包括部分序列之改良者及基因，只要這些採用者所具 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1232883

有的功能實質上與抑制GF ATI L基因表現功能相當即可。 此種引入所要基因，以達重組目的及保持在染色體外目 的之載體疋技藝中所熟知的，任何已知的載體均可用於本 發明。這些載體實例包括病毒性載體及質體性載體，其包 括一套與表現控制元素鏈結之GFAT1L·反向寡核：y：酸，並 可在抓的細胞中表現出反向寡核芬酸的產物。雖然前述表 現載體可為前述載體，但揭示於美國專利申請案 5,252,479及PCT國際申請案w〇 93/07282或利用 pRC/CMV (Invitrogen的產品）之原始載體（諸如pWP-7A 、pWP-19、pWU-1、pWP-8A、PWP-21 及/或 pRSVL)是 較佳者。更佳者’可使用後述各式的病毒性載體。 有關基因轉移治療時所用載體中之啟動子，較佳使用與 治療疾病標的之疾病部分組織有專一性的啟動子。 說明啟動子之特別實例。骨骼肌有關的啟動子實例包括 骨骼肌肌動蛋白、肌凝蛋白長鏈、及肌酸激酶等。心臟有 關之啟動子實例包括心房鋼尿激素、心室專一性肌凝蛋白 短鏈及心房專一性及心室專一性α -肌凝蛋白長鏈。肝臟有 關之啟動子實例包括白蛋白、α —胎兒蛋白、α丨_抗胰蛋白 酶、運鐵蛋白及transstyrene。大腸有關之啟動子實例包 括羧酸脫水酶I抗原及胚胎致癌性抗原。子宮及胎盤有關之 啟動子實例包括動情激素、芳香酶細胞素p 4 5 0、膽固醇側 鍵溶解S每P450及17α-#基酉每P450 。 前列腺有關之啟動子實例包括前列腺抗原、gp 9 1 - fox基 因及前列腺專一性卡利克連。胸部有關之啟動子實例包括 -35- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232883 A7 __ B7__ 五、發明説明（33 ) erb-B2、erb-B3、冷-酪蛋白、召_乳球蛋白及乳蛋白。肺 臟有關之啟動子實例包括活化子蛋白C尿球蛋白。皮膚有關 之啟動子實例包括K-14角蛋白、人類角蛋白1或6及白血素 〇 腦部有關之啟動子實例包括grial纖維狀酸性蛋白、成熟 星狀細胞專一性蛋白、髓脂質鹼性蛋白及酪胺酸羥基酶。 胰臟有關之啟動子實例包括絨毛素、升血糖激素、 Langerhans擬澱粉小體聚肽、澱粉酶及pAPi。胸腺有關 之啟動子實例包括硫球蛋白及降血鈣素。骨骼有關之啟動 子實例包括α 1膠原蛋白、骨鈣素及骨涎糖蛋白。腎臟有關 之啟動子實例包括腎酵素、肝臟/骨骼/腎臟鹼性磷酸酶及 紅血球生成蛋白。 製備併有反向寡核:y：酸之載體時，可根據本發明基因之 核苷酸序列資訊，以一般遺傳工程方法（如前所述），輕易 的製備出欲引入之反向寡核甞酸（與相對Gf AT 1 L基因序列 芫全或部分之互補序列）。 藉由將DN A帶入至細胞内之已知任何各式方法，可將併 有反向寡核省:酸之載體帶入至細胞中，此方法實例包括電 擊穿孔法、磷酸鈣共同沉澱法及病毒轉誘法。亦可使用經 GFAT1L基因反向寡核芸酸轉型之細胞，其為純化狀態時 ，可用以抑制GF AT活性或抑制血糖含量增加之藥劑或為 研究基因療法之模式。 在基因治療中，併有前述反向寡核菩酸之載體可藉由注 射至組織位置，或以一般注射法將其帶入至病患標的細胞 •36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)' 一 1232883 五、發明説明（34 内。當以一般注射法注射該載體時，載體會到達任何可表 =FATmRNA的其他位置之細胞中，倘無法使得轉誘基 的=的併入至每個標的細胞染色體上’則必須定期重複 —本發明基因治療包括將併有前述反向寡料酸（引入反向 暴核《之載體）直接投與體内之活體内方法，及活體外方 法’其係自病患身體取出標的細胞，在身體外將基因帶入 至細胞内，再將細胞移植回身體。 另一種亦可採用的方式是，將基因治療用之gfatil基 因《反向寡核誓酸直接帶入細胞内，並使用核糖酶活化分 子切割RNA鏈。 後述本發明基因治療藥劑特別可以糖尿病為標的，其中 藥劑含有作為活性成分之載體（其併有與本發明相對 GFAT1L基因序列之全部或片段反向寡核誓酸之基因），及 利用該載體將人類GFAT1L基因反向寡核#酸帶入之細胞 。然而，除了糖尿病外，亦可進行前述基因治療（處理）， 以避免糖尿病併發症發生（諸如糖尿病性神經性病變、糖尿 病性腎臟病變及糖尿病性視網膜病變）及遺傳標記。 可根據基因治療（處理）目標，適當的選擇欲將反向寡核 芸酸帶入的標的細胞。除了骨骼肌組織及心臟組織外，標 的細胞一確實表現GFAT的細胞—包括淋巴細胞、纖維母 細胞、肝臟細胞及補血幹細胞。 有關將前述基因治療之反向寡核荅酸之引入方法包括利 用病毒之方法及不利用病毒之方法。 本紙银尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） -37 1232883 A7 B7 五、發明説明（35 ) 利用病毒的方法實例包括以反轉錄病毒載體為載體之方 法，該方法係根據GFAT1L基因之反向寡核芸酸是正常細 胞中表現之外來物質，其他病毒性載體實例包括腺病毒載 體、HIV(人類免疫不全症病毒）載體、AAV(腺體相關病毒） 、疱疹病毒、HSV(單純疱疹病毒）及EBV(非洲淋巴細胞瘤 (Epstein-Barr)病毒）。 不使用病毒之方法實例包括磷酸鈣共同沉澱方法；膜融 合脂小體方法，其中脂小體包括DNA及事先已利用UV線 破壞去活化之融合Sendai病毒，以產生膜融合脂小體，所 形成之脂小體直接與細胞膜融合，以便將DNA帶入至細胞 内[Kato，K 等人，J· Biol. Chem·，266· 22071-22074 (1991)];利用包金質體DNA在高伏特電價下，將DNA帶 入細胞内的方法[Yang，N.S·，等人，Proc. Natl. Acad. Sci.， 11，9568-9572 (1990)];裸錄DNA方法，其中直接將質體 DNA注射至活體器官或標的組織内[w〇lff，J·A.等人， Science，1465-1467 (1990)];陽性脂小體方法，其 中將基因包埋在陽性電價多脂層脂小體帶入細胞内[Kuni〇

Yagi，Igaku no Ayumi，第 175冊，第 9卷，635-637 ( 1 995 )] ;及配位體-DNA複合物方法，其中DNA鏈結至可與受體 (標的細胞中會表現）鍵結之配位體上，以便將基因帶入特 定細胞内，而不會帶入其他的細胞内，並投用所形成之複 合物[Frindeis 等人，Trends Biotechnol·，U，202 (1993)] ;Miller等人，FASEB J.，見，190 (1995)]。 前述配位體-DN A複合物方法實例包括以涎糖蛋白為配位 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

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粒時的訊號，及併入選殖位置之篩選標幟(基因)(ne〇、 hyg)及所要引入反向寡核苷酸（相對gfatil或其片段之整 個反向暴核％酸）取代病毒基因而重組至病毒内。為了獲取 门效仏病母顆粒，限制插入的長度相當重要，盡可能短， 並加寬包括部分gag基因之包裝訊息，並避免㈣基因之 ATG留滯其中。 利用移轉，將併有所要(3]?八丁11^基因之寡核甞酸之載體 DNA帶入至輔細胞中，輔細胞產生的病毒結構蛋白將載體 基因RNA包裝起來，以便在輔細胞内形成病毒顆粒，並自 輔細胞分泌出病毒顆粒。當重組病毒顆粒之病毒顆粒轉植 至標的細胞後，病毒基因體RNA所反轉錄出DN A會併入至 標的細胞細胞核内，以表現出插入載體上之反向基因。 為了增進引入基因的效率，可採用具有細胞吸附區域之 纖維網蛋白片段、肝素-鍵結位置及共軛片段的方法 [Hanenberg，H·等人，Exp· Hemat·，23_, 747 (1995)]。 前述反轉錄病毒載體系統所用載體實例包括源自老鼠白 血病病毒之反轉錄病毒[McLachlin，J.R.等人，Proc· Natl. Acad. Res. Molec· Biol·，3_8_3 9 1 - 1 3 5 ( 1 990)]。 採用腺病毒載體之方法將於後文詳述。根據Berkner， K.L. [Curr. Topics Microbiol. Immunol., 1 58, 39-66 (1992)]; Setoguchi，Y·，等人，[Blood，M，2946-2953 ( 1 994)]; Hiromi Kanegae 等人，[Jikken Igaku，IX 28-34 (1994)];或 Ketnei:，G·等人[Proc. Natl. Acad· Sci.，USA，9J_5 6 1 86-6 1 90 ( 1 994)]中所述之方法製備腺 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1232883

病毒載體。 、例如，為了製備非生長腺病毒载體，先去除腺病毒。及/ 或E 3區域之起始基因，而後，用含有所要標的外部基因表 現單位（包括標的引入反向寡核菩酸；例如本發明gfatil 基因之反向寡核甞酸；反向寡核-酸轉錄用之啟動子；及 k供轉錄基因穩定性之p〇ly-A)及部分腺病毒基因體 《質體載體及含有腺病毒基因體之質體同時轉植細胞（例如 2 93細胞），兩種類型的質體會進行同質重組以取代η或基 因表現單位，反之亦然，以便製備非生長腺病毒載體—一 種包括所要GFAT 1L基因之反向寡核甞酸。除此之外，將 腺病毒基因體DNA併至黏接質體中以製備終蛋白質，其3, 端加上腺病毒載體。另外，YAC載體可用以製備重組腺病 毒載體。 簡要說明製備腺病毒相關病毒（AAV)載體。AAVs是種 小病毒，常混入腺病毒之培養系統中。在AAVs中，證實 有兩類·播須輔病毒即可在宿主細胞内以自我控制方式增 殖的，及需要輔病毒執行複製之 Depen心v/rMM。AAVs是種具有廣泛宿主之普通病毒，可 輕易轉植細胞。每個病毒基因體由4 6 8 0個核省:酸的直鏈單 股DNA組成，而每個端點的ι45個核芸酸具有特徵序列， 名為ITR(端點逆向重複序列），ITr係作為複製起始點，具 有引子功能。除此之外，當AAV包裝至病毒顆粒及將aav 併入至宿主細胞染色體時，ITR是必須的。有關病毒蛋白 質’基因體的左半邊形成非結構性蛋白，因此病毒蛋白編 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公董) 1232883

碼Rep —調節性蛋白質，負責複製作用及轉錄作用。 根據AAV併入染色體DNA的特性可製備重組AAV，以 製備引入基因時所需的載體。更明確言之，在此方法中， 製備插入至野生型AAV的5,及3,之間而併有所要反向寡核 甘酸（GFAT1L基因反向寡核甞酸）之質體（AAV載體質體） ，然每個端點的ITR仍然存在。相反地，病毒複製及形成 病母顆粒時所要的病毒蛋白是由其他輔助質體供給。必須 提供此這兩種質體，因為質體並無一般核甞酸序列，且不 會產生野生型病毒。其後，將這些質體以轉植方式引入至 細胞（諸如2 9 3 )中，而轉植細胞再以腺病毒轉植（當使用 2 9 3細胞時，可用非生長型病毒），以製備所要非生長型的 重組AAV。因為所製備的重組aaV仍留置在細胞核中，故 以冷凍解凍方式自相關細胞收集重組A a V，在5 6 °C下加熱 使混入其中的腺病毒失活。視情況分離重組A a V，並利用 氯化铯之超高速離心法濃縮之。在前述方法中，可獲得基 因引入的重組AAV。 根據例如Norio SHIMIZU等人[Cell Engineering，14 (3)， 280-287 (1 995)]中所述方法製備EBV載體。 簡要說明製備併有本發明反向寡核甞酸之EBV載體方法 EB 病毒（Epstein-Barr病毒：EBV)係屬於 Z/erpes v/Wdae 病 毒，在1 964年首次由Epstein等人從源自Burkitt淋巴腫瘤 培養細胞中分離出來[Kieff，E·及Liebowitz，D·: Virology ’ 第二版，Raven 印行，紐約，1 990，1 8 89-1 920頁]。因為EBV具有轉型細胞的活性，為要構築引入 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1232883

基因的載體需先製備不具轉型活性之病毒，以下列的方式 製備之。 月崔。之，選殖將所要外來基因引入至標的鄰近的 基因體。為選殖基因體，併入外來基因的DN A片段及 藥Μ抗性基因，以便形成製備重組病毒載體。其後，將製 備重、、且病母之載體轉質至EBV_陽性Abu細胞，並以適當 的限制切割。以抗表面免疫球蛋白處理經由同質重組所 形成 < 重組病毒，以刺激產生病毒，並與野生型Ahta EBV 一起收集。用病毒混合物轉植EBV陰性的Akata細胞 ，在藥劑存在下，篩選抗藥株，以獲取只有所要重組病毒 ’而不包括野生型EBV之Akata細胞。除此之外，重組病 毒轉植之Akata細胞具有病毒之活性，故標的除組病毒載 體可大量生產。 利用膜融合之脂小體引入基因之方法，可製備沒有利用 重組病毒載體將所要反向寡核：y：酸引入至標的細胞之非病 毒載體。此方法係將活性膜脂小體與細胞膜融合，而將脂 小體内成分直接引入至細胞中。 利用前述膜融合脂小體引入反向寡核：y：酸係例如根據 Nakanishi，M·，等人[Exp. Cell. Res·，15 9· 3 99-499 (1 985) :及將基因帶入動物組織，肽及蛋白藥劑傳送趨勢及未來 展 (Lee，V.H·等人出版）’ Harwood Academic

Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995，第 337-349 頁]中所 述方法進行。 簡要說明利用膜融合脂小體引入反向寡核芬酸之方法。 -43- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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1232883 五、發明説明（41 明確將UV線去活化基因之病毒及包括聚合 拉物貝（诸如所要反向寡核#酸及表現蛋白）之脂小體在η °C下融合。所形成之膜融合脂小體包括得自非融合脂小體 之空洞（内部）及類似病毒外套之突出物（外部），因此，膜 融合脂小體具有類似假病毒的構造。經由薦糖密度梯度離 心法進-步純化膜融合脂小體，其後，於代下吸附在標的 培養細胞或組織細胞上’將溫度上升至价，脂小體内的 成分會帶入至細胞内，因此，所要的反向寡核答酸會帶入 至心的，·田胞内。所採用作為脂小體的脂肪較佳為合成的鱗 脂質，其含有50%(莫耳）的膽固醇及卵鱗脂，且為自電價 ，及較佳形成直徑為3GG毫微米之單脂層脂小體。 為利用其他脂小體將反向寡財酸帶人至標的細胞内， 可應用"陽離子脂小體將反向寡核芬酸引入。此方法係根據 Yagl 等人[B.B.R.C·，迦 1042_1〇48 〇983)]所述之方法 進行。此方法係根據質體及細胞兩者均為負電價，而脂小 體内部及外部表面呈現正電價，利用電性，可增加質體的 攝入，增加對細胞的相互反應。本說明書所採用的脂小體 較佳者為正電價多脂層脂小體（多脂層大媒劑：MU)，然 而，製備質體及大單脂層脂小體（大單脂層媒劑：luv)或 小單脂層脂小體（大單脂層媒劑：suv)之複合體亦可引入 所要的反向寡核:酸。 簡要說明製備包括陽性MLV質體之方法。明確言之，脂 ^TMAG (Ν-(α-三甲基胺基乙醯基卜十二醯基二麩胺‘ 氯），DLPC(二月桂醯基磷脂酸膽鹼）及〇〇1>£(二油醯基磷 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x297公釐） -44- 五、發明説明（42 ) 脂酸乙醇胺）溶解在氯仿中，製備含有此三種成分莫耳比例 . 2 . 2足溶液（脂質濃度為丨mM)，其後，含有總量脂 f為1微莫耳之部分溶液置於Spitz試管中，利用旋轉蒸發 為’於減壓下蒸發去除氯仿，以致備脂質薄膜。減壓下進 I步去除所剩的氯仿’乾燥薄膜。而後，在脂質膜中加入 0有基因引入之貝m(2〇微克）之Duibecc〇瑪酸緩衝鹽溶液 (加入Mg ’ Ca)(0.5毫升），用氮氣吹氣。利用震盧混合器 搅拌混合物2分鐘，以產生包埋陽性MLV質體旋浮液（含有 所要反向寡核苷酸）。 所得包埋陽性MLV質體可用作為基因治療劑，例如，將 併有標的反向餘#酸脂表現載㈣人包埋至前述陽性 L V中使D N A含量及脂小體脂肪含量分別控制在〇 · 6微 克及3〇毫微莫耳。所得脂質體包埋陽性MLV懸浮於磷酸緩 衝食鹽溶液中（2微升）’將懸浮液每隔—日投與自病患所萃 取之標的細胞，或投與病患組織。 基因/cr療足義如曰本健康及福利部所定義 體基因或經基因轉移之細胞，以治療疾病”，然， 指引的定義外，根據本發明基因治療包括將反向寡核嘗酸 (特徵在於抑制GFAT表現之GFAT1L基因之反向⑽句帶 入至前述標的細月包g，以、治療糖尿病及其併發症。基因治 療耶包括Μ標記基因或引入該標記基因之細胞帶入至人類 身體内。 & 在本發明基因治療中’將所要基因帶入至標的細胞或組 織之典型方法實例包括下列兩種方法。 1232883 A7 广—____ B7 五、發明説明（43 ) 第一種方法是基因轉移方法，其中以併有標的反向寡核 甘fe(GFATlL基因之反向寡核替敗）之病毒性載體（諸如腺 病毒載體）直接轉植病患的標的細胞或組織。 另一種方式是第一種方法的變化。利用活體外方法，以 併有標的反向寡核:y：酸（GFAT1L基因之反向寡核苷酸）病 母性載體轉植源自病患的細胞，或將源自病患之細胞與含 有病毒性載體之病毒產生細胞一起培養’以便將標的反向 寡核答酸引入至標的細胞中，後將細胞移植回病患身體内 〇 第一種方法是直接基因轉移方法（直接方法），其中將併 有反向寡核謀酸之適當動物細胞表現載體質體DN A直接注 射至病患的標的位置；例如身體或骨骼肌。注射方法可為 諸如HVJ脂小體方法、陽性脂小體方法、直接DNA注射法 、電穿孔法或基因槍法。 當則述万法進行後，較佳進一步確認標的反向寡核茹酸 (GFAT1L基因反向寡核芬酸）是否真的已被帶入至細胞内 ，特別是以試管内試驗，諸如載體基因cDNA恢復pcR或 原位PCR。另一種方式是，較佳係以特定活性—移轉標的 反向寡核甞酸（GFAT1L基因反向寡核甞酸）後所提供所要 的治療效果-的增加或減少，及對標的細胞的影響來確認 。不待言，當採用病毒性載體進行基因治療時，重要的是 根據增殖病毒之PCR回覆試驗來確認有關所移轉反向寡核 甘酸的安全性。 本發明亦才疋供-種藥劑組合物或藥劑配方（基因治療劑） -46 -

1232883 A7 B7 五、發明説明（44 ’其包括作為活性成分用以移轉本發明反向寡核甞酸之有 效療政含量載體，或帶有標的反向寡核苷酸（GFAT1L基因 之反向暴核：y：酸）之有效療效含量細胞，及適當非-毒性藥 劑載劑或稀釋劑。 本發明前述藥劑組合物（藥劑配方）所用藥劑載劑的實例 包括根據配方用途形式所採用之典型稀釋劑及媒劑。特別 實例包括填充劑、膨脹劑、鍵結劑、濕潤劑、分散劑、表 面活性劑、及潤滑劑，而載劑係根據所製備的投藥配方形 式適當的選擇及使用。 配方投藥形式實例包括前述有關GF AT 1 L蛋白質抗體配 方中所述者，及根據治療標的自各式形式中適當選擇。 例如，藥劑配方中包括包埋在脂小體内併有本發明反向 寡核甞酸之載體’或經包括所要反向寡核苷酸之病毒性載 體轉植之培養細胞。 這些配方可加至磷酸緩衝食鹽溶液（pH 7.4)中' Ringer 溶液、注射用細胞内組合物液體等。另一種方式是，這些 配方可與可增進基因移轉效率的物質組合投用，諸如魚精 蛋白。 投用如述藥劑配方並無特別限制，係根據諸如配方形式 、病患年齡、性別及其他狀況、及疾病的嚴重性而定的。 刎述醫藥組合物中活性成分的含量及組合物劑量並無特 別限制’其係根據所要的治療效果、投藥方式、治療期間 、病患年齡及性別、及其他狀況來適當的彈性決定。 醫藥組合物可每日投藥’或每日劑量分次投藥。又本發 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232883 五、發明説明（％ 明組合物可間歇性一 因移轉之魚於數週投樂。較佳者，是含可增進基 ，盥醫座、"或相似物質’或含有此種物質之組合物 =醫樂组合物—起組合投藥。 人2用根據本發明基因治療來治療糖尿病時，可適當組 = = 基因治療)。又，前述基因治療 =苴、' ” ’口療、營養療法等組合。然而，進行本 Λ /口療時，包括治療的安全性，需參考Nm指引（重 二DNA諸詢委員會，人體基因㈣，4 , 365-3 89 ( 1 993)) ♦據本發月，藉製備生物樣品（諸如血液或血清），萃取 所需之核酸，及確認GFAT1L敏感基因的存在，以偵測 GFAT1L基因一其引發細胞⑽八丁活性。又，根據本發明 :細胞或I織中的GFAT活性含量及GFA 丁㈣财表現含 量及/、碳糖胺生物合成途徑調節功能不全之進展或診斷 勺寺日數了藉I備與7糖胺生物合成途徑功能不全之生 物樣w ’並偵測G F A T 1 L基因或其mRN A含量來決定。採 用本發明此種方法可偵測到細胞或組織中G F A T活性含量 及GFAT mRNA表現含量，及鑑定六碳糖胺生物合成途徑 调節功能不全之進展或診斷的指數，及因此可了解所言功 能不全的診斷（例如糖尿病），決定糖尿病的治療效果，及 糖尿病治療的預診。 根據偵測方法’根據自病患樣品（已事前確認呈現G ρ a 丁 活性）所獲G F A T 1 L基因有關資訊’設計及製備d n A片段 ，用以篩選GFAT1L基因及/或增殖該基因。更明確言之， 48- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1232883 A7

序列的基因存在。可以各式幫助偵測標的序列的方法製備 核酸樣品，諸如變性作用、限制酶切割仙、電泳、點墨 潰法等。 ㈣及^備作為菌鱗化作用、菌落雜化作用、語氏墨潰 法寺用探針的片段’或製備全部或部分㈣川DM片 段（業經聚合酶鏈結反應（PCR)q合酶增殖之核酸序列） 以為探針用之片段。最後，第—步是製備具有與心川 序列㈣之序列的引子’所得引子作為蒒選用之探針，與 生物樣品(核酸樣品)反應，因A ’可以確認具有㈣川 從敏感性的觀點而言，PCR是較佳的篩選方法。pcR並 無特別的限制，只要引子為GFAT1L片段即可，可採用慣 用已知的方法（Science，230，1350-1354 (1985))或最近 所開發足改良PCR(或將來可使用者）（“Jikken Igaku，，特 別議題，8(9) (1990)，Yoshiyuki Sakaki等人出版 ，Yodosha 印行，Tanpakushitu，Kakusan，Koso，，3 5( 1 7) ( 1 990) ，再版，Kyoritsu Shuppan κ·Κ 印行）。

作為引子用的DNA片段是化學合成之寡]：)]^八，可利用自 動DNA合成儀合成；例如dna合成儀” Pharmacia KLB

Gene Assembler Plus”（Pharmacia 的產品）。所合成引 子的長度（正向引子或反向引子）較佳約丨〇至5 〇個核:y：酸， 更佳者為15至30個核菩酸。在本說明書中，所合成的引子 較佳是可與任何其他已知GF at之DNA序列區別之序列。 通常’前述篩選時所用的探針是標記探針，然而，探針可 以未經標記，而係根據與標記配位體專一性鍵結以直接或 -49 - 本紙張尺度適财g @家標準(CNS) M規格(_ 297公爱)— 1232883 A7

1接方式偵/1彳到。適當的標記類型及將探針或配位體標記 的適田方法疋本發明技術範圍已知的，例如，可使用放 射活f生“ X物貝、生物素、螢光物質、化學冷光部分、酵 素抗恤、或以已知方法（諸如切口轉譯作用、逢機鏈引作 用或以激酶處理）將相似物質併入至探針或配位體上。 偵測目的所用之PCR稱之為RT_pcR，亦可採用各式的 改良PCR方法。 更甚者，利用偵測樣品中GFAT1L基因的試劑套組可輕 易及方便的進行本發明分析方法。 因此，本發明提供一種偵測GFAT1L的試劑套組，其特 徵在於該套組含有前述GFAT1L dna片段。 該試劑套組包括其可與剛ID N〇 ·· 2核#酸序列全部 或部分雜化之DNA片段，或其互補核茹酸序列。套組中可 視情況含有其他元素，諸如標記試劑及pCR所需的試劑（例 如Taq DNA聚合酶、去氧核甞酸三磷酸、引子等）。 標記試劑的實例包括化學修飾物質，諸如放射線同位素 及磷核。DNA片段可事先與標記試劑纟輛，除此之外，為 了分析方便，試劑套組中可包括適當物質，諸如稀釋劑、 標準抗體、緩衝液、清潔劑及反應終止溶液。 本發明亦提供一種利用前述分析方法診斷葡萄糖代謝疾 病的方法，特別是六碳糖胺生物合成功能不全疾病·，該方 法所用之診斷試劑；及診斷套組。 當使用前述分析方法時，可直接或間接定序測試檢體中 所得之GFAT 1L，以幫助鑑定相關基因，例如與新

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A7 B7 1232883 五、發明説明（明） GFAT1L基因相關的基因，其與野生型GFAT1L具有高度 的相似性。 因此，本發明亦提供用以篩選測試檢體中人類GFAT1L 相關基因之方法，該方法包括前述的分析方法及定序出測 試檢體中GFAT1L DNA。 利用人類G F A T 1 L基因編碼之本發明s E Q ID N 0 : 1聚 肽，刪除、取代、或插入SEQ ID NO ·· 1中胺基酸序列中 的一至數個胺基酸’或其片段，可合成聚肽，或該聚肽之 抗體，用以分析野生型GFAT1L及/或突變GFAT1L。 因此’本發明提供一種分析抗野生型GFAT1L抗體，及/ 或抗突變GFAT1L抗體的方法，與分析相對抗原之方法。 利用本發明分析方法，根據野生型Gp AT 1 L聚肽的改變可 測出：GF AT活性的含量、葡萄糖調節功能不全的程度、 X碳糖胺生物合成途徑功能不全的嚴重性、糖尿病的嚴重 性及糖尿病併發症的嚴重性，諸如糖尿病潰瘍，糖尿病視 網膜病變、糖尿病腎臟病變等。雖然利用前述技藝中慣用 的技術定序GFAT1L可測出這些變化，但較佳使用抗體（多 株抗體或單株抗體），以偵測Agfatil聚肽間所存在的差 異或GFAT1L聚肽的有無。在本發明分析方法的特別實例 中’ GFAT1L抗體會使GFAT1L蛋白質從人類收集之液態 生物樣品（諸如血液或血清）中免疫沉澱，並於聚丙缔醯胺 膠片進行西方墨潰法或免疫墨潰法時與GFAT丨L聚肽反應 。利用免疫組織化學技術，GFAT1L抗體亦可偵測到包埋 於石蠟中或冷凍切片中的GFAT1L聚肽。製備及純化抗體

装

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1232883 五 、發明説明（ 49 的技術是括蔽+ 议#干所熟知的，因此可自這些技術選出適當者 7於偵’則野生型GFATIL或其變體之較佳方法的特別實 例包t根據三明治方法，利用單株抗體及/或多株抗體之酵 素鏈、、"免疫吸附分析法（ELISA)、放射線免疫法（RIA)、 免疫放射線分析法（IRMA)及免疫酵素分析 法（IEMA)。 <在本發明用以篩選候選化合物（作為抑制OF AT活性的藥 砭篩選方法的一個具體實例中，是定量出GFAT1L蛋白 貝或其部分肽。簡而言之，對抗GFAT1L基因表現產物或 GFAT1L蛋白質（此兩者後文統稱GFA 丁蛋白質）或其片 段j抗體與含有候選化合物之試驗液體及標記GFAT1L·蛋 白質或其部分肽進行競爭反應，測定鍵結至抗體上之標記 GFAT1L蛋白質或其部分肽之含量。 亦可以下列分析進行定量測定試驗液體中所含之 GFAT1L蛋白質或部分肽：同時或依序將含有候選化合物 之試驗液體與固定在載物體（carrier)之抗體及另一已標記 且係對抗GFAT1L蛋白質之抗體反應。 根據另一種用以篩選抑制GFAT1L蛋白質或其部分肽之 酵素活性（例如GFAT活性）化合物之可能方法，進行下列兩 種情況反應，將受質與GFAT1L蛋白質或其部分肽反應， 及兩種受質與試驗化合物與GFAT1L蛋白質或其部分肤反 應，測定GF AT 1 L蛋白質或其部分肽的酵素活性，所得之 結果與另一情況相互比較。 在上述方法中，受質並無特別限制，只要其可作為本發 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 52- 1232883 A7 五、發明説明-- 月蛋白貝或GFATil蛋白質部分肽之受質即可，典型是採 用果糖-6-磷酸或麩胺。當使用果糖_6_磷酸時，較佳是採 用放射線同位素標記（例如1 4 C、3 Η等）之果糖-6 -磷酸。試 驗化合物實例包括（但不侷限於）肽、蛋白質、非肽化合物 、合成化合物、發效產物、細胞萃取物、植物萃取物、動 物組織萃取物及血液。所提供的化合物可為新穎的化合物 或已知的化合物。 在進行㈤述任何篩選方法時，將本發明蛋白質或 GFAT1L蛋白質部分懸浮於適合篩選目的用的緩衝液中 ，以製備蛋白質或部分肽之樣品。任何ρΗ約4至1〇(較佳約 6至8)之緩衝液均可使用，諸如磷酸緩衝液、Tris-HCi緩 衝液等’只要該緩衝液不會抑制本發明蛋白或GfaTIL蛋 白質部分肽鍵結至受質上即可。 可以已知的方法測定本發明蛋白質或Gf at 1 L蛋白質部 分肽之GFAT活性；例如根據Marshal等人（journal 〇f

Biological Chemistry，第 266 冊，第 8 卷，4706-47 12 (1 9 9 1)所揭示的方法。 例如’適當稀釋能表現GFAT1L之大腸桿菌細胞分解物 (50微升）中加入200微升受質溶液（4〇〇 mM磷酸鈉緩衝液 (pH 7.5)，50 mM 氯化鉀，1.25 mM EDTA，0.3 mM APAD ’ 6單位/毫升越胺去氫酶（GDH)，0-6 mM越胺， 0-6 mM果糖-6-磷酸（F-6-P))，將所得之溶液置於96槽孔 之微量盤中，在3 7。(：下反應6 0分鐘，利用微量盤讀計測定 在3 6 5毫微米的吸收值變化。根據所進行〇 ρ a T活性分析， -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232883 A7 ____B7 五、發明説明（51 ) GFAT所產生的麩胺會與麩胺去氫酶（GDH)進一步反應， 在反應期間，同時產生APAD(輔酶），APAD還原成 APADH反應所伴隨的吸收值變化視為GFAT的活性。 另一種方式是以Smith等人所揭示的方法（Analytical Biochemistry，泣，478-480，1 979)進行，此方法步驟如 下。簡而言之，本發明蛋白質或GFAT1L蛋白質部分肽中 加入含有12 果糖-6-磷酸，5 μΜ魏胺，及0.2 Μ磷酸 緩衝液（pH 8.0)之混合物，所得之溶液保持在25它下3〇分 鐘，溶液中加入0.5 Μ H C1，讓反應在9 8 °C下進行2小時 ，此後，加入 2.5% NaN02 及 12.5% ΝΗ403ΝΗ2，而後 0.25% 2-甲基-2-苯并硫π坐酉同，而後加入〇·5% FeCl3，在 650毫微米分析所得溶液之吸收值，以定量測定所產生之葡 萄糖胺· 6 -磷酸。 在前述每個方法中，可以下述方法篩選藥劑候選化合物 。例如，當未加入前述試驗化合物的情形與加入試驗化合 物情开;^比較後，所測之G F A T活性被抑制約2 〇 %或更高者 ，較佳約3 0%或更高者，更佳者約5〇%或更高者，則所篩 選之試驗化合物為可抑制本發明蛋白質或gfatil蛋白質 部分肽之G F A T活性之化合物。 根據本發明，提供用以篩選抑制前述GFAT活性候選化 合物之套組。 本發明篩選套組包括為其元素之本發明蛋白質或 GFATIL蛋白質部分肽。後文將說明本發明筛選套組之特 定實例。 -54-

1232883 A7 B7 五、發明説明（52 )

1.篩選套組I

[篩選試劑] 1) GFAT1L樣品··表現GFAT1-L之大腸桿菌細胞分解 液（GFAT1L蛋白質之部分肽） 2) 含輔酶緩衝液：400 mM磷酸鈉緩衝液（ρΐί 7.5)、50 mM 氯化鉀、ι·25 mM EDTA、0.3 mM APAD、6 單位 / 毫升麩胺去氫酶（GDH) 3) 受質：0-6 mM果糖-6-磷酸、0-6 mM麩胺 偵測時，測定3 65毫微米的吸收值。 [分析方法]將適當稀釋表現GF AT 1-L之大腸桿菌細胞分 解液（50微升）加至200微升受質溶液（4 00 mM磷酸鈉緩衝 液（pH 7.5)、50 mM 氯化鉀、1.25 mM EDTA、0.3 mM APAD、6單位/毫升麩胺去氫酶（Gdh)、0-6 mM麩胺' 0-6 mM果糖-6-磷酸（F-6-P))，所得之溶液置於96槽孔之 微量盤中’在37°C下反應60分鐘，利用微量盤讀計，測定 3 6 5亳微米的吸收值變化。 2 ·篩選套組11 [篩選試劑] 1)蛋白質樣品：本發明蛋白質（GFAT1L蛋白質部分肽） 或其鹽類 2 )緩衝液·· 0.2 Μ磷酸鈉緩衝液（p Η 8 · 0) 3)受質·· 12 yM果糖-6-鱗酸、5 越胺 偵測時，測定6 5 0毫微米的吸收值。 [分析方法]將試驗化合物加至含有12 “Μ果糖-6-鱗酸、 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) !232883 A7 五、發明説明（53 ) 5 //M麩胺、本發明蛋白質（或其鹽類），及〇2 μ磷酸鈉緩 衝液（pH 8.0)之反應混合物中，所得混合物在25«c下反應 30分鐘，加入〇.6 M HC1，在98 °C下水解2小時，加入 2.5% NaN02&12.5% ΝΗ403ΝΗ2 之後再加入 0.25% 2- 甲基-2 -苯并硫唑酮，其後加入〇 · 5 % F e c 13，分析所得溶 液6 5 0亳微米之吸收值。 利用本發明篩選方法或本發明篩選套組所獲之化合物或 其鹽類係選自前述的試驗化合物（例如，肽、蛋白質、非肽 化合物、合成化合物、發酵產物、細胞萃取物、植物萃取 物、動物組織萃取物）及抑制本發明蛋白質的酵素活性 (GFAT1L蛋白質部分肽）（例如GFAT活性）。這些化合物是 新穎的化合物或已知的化合物。減輕低血糖症的候選化合 物是種可促進本發明蛋白質（GF AT丨l蛋白質部分肽）酵素 活性（例如GFAT活性）之化合物。 此種化合物的鹽類之實例包括化合物與生理上可接受酸 (諸如無機酸及有機酸）所形成的鹽類，或化合物與鹼（諸如 鹼金屬）所形成的鹽類。酸加成鹽中的酸為生理上可接受的 酸疋較佳的。這些鹽類的實例包括（但不侷限於）化合物與 典機酸（例如，氫氯酸、磷酸、氫溴酸、硫酸）及化合物與 有機酸（例如，乙酸、甲酸、丙酸、反丁烯二酸、順丁烯二 酉欠、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸' 韻果酸、草酸、苯甲酸、 甲燒績酸，及苯磺酸）所形成的鹽類。 抑制本發明蛋白質（包括GFAT 1L蛋白質部分肽；後文同 義）酵素活性之化合物或其鹽類可作為糖尿病及糖尿病併發

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1232883 A7 B7 五、發明説明（55 田獲得的GFAT1L蛋白質足夠量時，所選殖的GFAT1L 序列可進行對GFAT1L蛋白質之分析研究，諸如線結晶 法。又’ SEQ ID NO : 1胺基酸序列所形成之gfaTIL蛋 白質可應用電腦模型技術，以取代χ_線結晶法，或除了 χ_ 線結晶法外，另增電腦模型技術。 除此之外’根據本發明，可產生不含Gfat 1L基因老鼠 或含GFAT1L基因老鼠（突變老鼠），而此種老鼠可用以鑑 別在G F A Τ 1 L基因序列中影響前述各式G F a 丁丨乙活性的位 置’換吕之’也就是在活體内GFAT1L基因產物的功能或 GFAT 1 L基因產物的變體。 所揭示的方法係利用基因同質重組作用修飾活體内基因 的訊息，及其中一個實例方法係採用老鼠胚胎幹細胞（£8細 胞 KCapeccchi，M.R·，Science，244, 1 288- 1292 (1 989)) 〇 在本發明中，用以產生前述突變老鼠的方法已成為熟知 技藝者間的例行性方法。以此種經適當改良過技術組合（揭 不於”Jikken Igaku”特刊，14，（2〇)，1996; Testuo Noda 出版，Yodosha印行）修飾人類野生型GFAT1]L基因或突變 GFAT1L基因後，可輕易的產生突變老鼠。因此，可了解 所設計及開發能促進GFAT 1 L活性或穩定性，並具有不同 功能之藥劑，例如抑制劑、促進劑，或拮抗劑。 實例 利用下述實例可更詳細說明本發明。 實例1 -58 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱·) 1232883 A7 B7 五、發明説明（56 選殖GFAT1L及構築表現載體 為構築已知人類GFAT之表現載體（G. L. McKnight等 人，J.Biol.Chem·，267, 2 5 2 0 8 - 2 5 2 1 2 ( 1 9 9 2 ))，根據 人類GFAT cDNA之序列合成四種引子P1-P4。這些引子 的核茹酸序列示於SEQ ID NO ·· 3-6。 P1核芸酸序列相對於SEQ ID NO : 2第34個至第66個核 甞酸，P2核甞酸序列相對於SEQ ID NO : 2第16個至第48 個核苷酸，P3核苷酸序列相對於SEQ ID NO : 2第1個至 第30個核：y：酸，P4核苷酸序列相對於SEQ ID NO : 2第 2077個至第2097個核茹酸。為了增加在大腸桿菌細胞内的 表現效率，以增加密碼取代作用的效率，在p 1 _ P 3下列位 置處引入變異，其稱為前進引子。PI : SEQ ID NO : 3之 第6、9、12、13、15 及 18 核嘗酸處，P2 : SEQ ID NO : 4 之第7、9、18、24、27、30、31 及 33 核苷酸處，P3: SEQ ID NO : 5 之第 22、32 及 34 核:y：酸處。 在P3相對於SEQ ID NO : 5第1至1〇核:y：酸處引入部分 的核芬酸序列，以產生Ndel位置（CATATG)，其為插入 PET載體時所需。 P4是逆向引子，其包括緊接C-端胺基酸殘基後的xh〇i 位置（CTCGAG ;係SEQ ID NO : 6第1至π核：y：酸的序 列）’所設計的引子在Xhol位置處之前有一終止密碼（TaA) 〇 利用前述四種引子，下列方法可構築在大腸桿菌細胞内 表現出合成N -端胺基酸殘基之取代密碼的載體。 -59- 本紙張尺度適用巾S S家標準(CNS) A4規格(210 X 297公穿) ----------' 1232883 A7 B7 五、發明説明（57 ) 利用引子P4及反轉錄酶，以人類骨骼肌mRNA(購自 Clontech公司）為基礎，進行反轉錄作用之反應。人類骨 骼肌mRNA (2微克/微升）在100°C下變性5分鐘，後快速的 置於冰上冷卻，在混合物中加入丁 ris氫氯酸（PH = 8.3 ; 50 mM)、氯化鉀（40 mM)、氯化鎂（6 mM)、1 mM DTT、 引子4 (0.1 mM)、BSA (0.1毫克）、MMLV反轉錄酶 (GIBCO BRL公司產品·· 400單位/2微升）及去離子水 (DDW)，使最終的體積微50微升，並讓混合物在37°C下反 應1 0分鐘。 反應產物（5微升）在100 °C下變性5分鐘，後以下列的方 式以引子P1及P4進行PCR反應。在反轉錄作用的產物（5微 升）中加入1 〇 X緩衝液（5微升）、2 mM之dNTP s混合物（5微 升）、兩種引子（各為0·4 //M)、氯化鎂（1 mM)、K0D少 量（2.5單位）及DDW，使最終體積微50微升。1〇χ緩衝液 含有 Tris 氫氯酸（ρΗ = 8·0 ; 1.2 mM)、氯化鉀（1〇〇 mM) 、硫酸銨（60 mM)、Triton X-100 (1〇/〇)及 BSA (0·1 毫 克/毫升）。所得之混合物進行30次循環反應，每次循環包 括9 5 °C 3 0秒、6 5 °C 2秒及7 4 °C 6 0秒；其後7 4 °C 5分鐘 〇 所得產物（5微升）以前述相似的條件進行pcr，除了所用 引子為P2及P4。 所得產物（5微升）以前述相似的條件進行Pcr，除了所用 引子為P3及P4。 最終產物選殖至pET23b (N0vagen公司產品）中，利用 -60-

1232883 A7 B7 五、發明説明（58 ) ABI3 7 7 DNA定序儀（PE-ABI公司產品）確定的序 列。 最終的產物以酚/氯仿處理，並以乙醇沉澱之，其後溶解 在TE緩衝液中。以限制酵素NdeI&Xh〇I切割DNa的兩端 〇 藉由鏈合作用，將經限制酵素Ndel及Xh〇I切割所得之 DNA片段插入至pET23b載體中。 定序出所得基因的序列，發現其為新穎序列，該基因名 為“GFAT1L 基因’，。 所仔基因編碼區域之全長係為2 0 9 7個核菩酸s E Q ID N 0 : 2所組成，此驗基序列編碼的胺基酸序列為6 9 9胺基 酸殘基之SEQ ID NO : 1，該基因是人類cDNA(全長： 2 0 9 7鹼基），其編碼該胺基酸序列。 本發明GFAT1L基因證實為具有此序列之新穎基因，其 為McKnight等人選殖之GFAT基因（McKnight，G. L·等 人，J. Biol. Chem·，267, 25208-25212 (1992))的第 4核嘗敗及弟6 8 5核嘗酸位置處插入54個核替酸，此 G F A T 1 L基因編碼蛋白質之胺基酸序列在原胺基酸序列的 胺基酸及盖221_胺基酸位置處多插入了 18個胺基酸。 在下列所述試驗中，本發明分離新穎基因係為“GFAT1L 基因”，而根據McKnight等人之人類GFAT基因係為 “GFAT1S 基因’’。 實例2 利用RT-PCR研究不同器官中GFAT1L基因的表現型態 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) '麵

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1232883 A7 B7 五、發明説明（59 ) ，並比較GFAT1L基因與GFAT1 S基因之表現型態。 以 QUICK-Clone cDNA (Clontech 公司產品；心臟、 腦、肝臟、骨骼肌、小腸、腎臟、胰臟及脂肪）為試驗樣品 〇 合成並使用SEQ ID NO : 7及8的引子。亦使用ExTaq (Takara Shuzo 公司產品）。 先在95°C下進行PCR 1分鐘，其後進行40次循環反應， 每次反應包括95°C 30秒、55°C 30秒，及72°C 45秒。一 部份反應產物在4%瓊脂糖膠上進行電泳，以得知每個基因 的表現型態。 所得結果示於圖1中。 圖1中每行標示有說明，其相對於器官組織（括號中）如下 標準品標記（標記）、心臟（心臟）、腦（腦）、肝臟（肝臟）、 骨骼肌（骨骼肌）、腎臟（腎臟）、胰臟（胰臟）、小腸（小腸）及 脂肪（脂肪）。 如圖1所示，GFAT1L基因在心臟及骨骼肌有強烈的表現 ，而在腦部有非常弱的表現，只有GFAT1S能在其他試驗 器官中表現。 因此，咸發現本發明基因表現受控於組織專一性。 實例3 製備GFAT1L重組蛋白質 將人類GFAT1L基因或GFAT1S基因（為比較目的用）插 入至pET23b載體（Novagen公司產品）中，並所得之載體 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232883 A7 —______________B7 五、發明説明（- -- #^BL21-C〇d〇nPlus(DE3)RIL (Stratagene5-j ^ . 中），將轉型細胞隔夜培養在37t含有安皮西林培養液中， 次日，將液態培養組織（5〇毫升）加至含有安皮西林Μ培養 液（1 L)中，37t下再培養9〇分鐘，所得之混合物中加入 1M異丙基/5 _〇_(·).硫半乳糖基峨喃糖扣純 化學公司產品：2毫升），置於2〇°C下隔夜培養，誘發重組 蛋白的表現。 所得液毖培養液以700 0 rpm速度離心5分鐘，以收集大 腸桿菌細胞，用〇t Dulbecco，s PBS(-)(Nihon醫藥公司 產品；50毫升）清洗大腸桿菌細胞，其後懸浮於二硫蘇糖醇 (DTT = 5 mM)及含有甘油磷酸鈉緩衝液（pH 8 〇 ; 5〇 mM) 中，使最終體積為40毫升，懸浮液以超音波處理，以便將 細胞打破。細胞分解液在4。(：下以3〇,〇〇〇 rpm速度離心3〇 分鐘，去除不溶的物質。 在前述的方式中，可獲得含有所要蛋白質之澄清液，分 裝澄清液（每毫升），利用液態氮急速冷凍，保存在_ 8 〇 t直 至使用。 實例4 研究GFAT1L及GFAT1S間特徵的差異 1 GFAT活性分析方法 根據下述Mar shall等人以微量盤（96槽孔）光學法測定法 方式（Journal of Biological Chemistry，第 266 冊，第 8卷，4706-47 1 2 ( 1 99 1 ))測定 GFAT活性。GFAT所產生 的麩胺與麩胺去氫 （GDH)反應，在還原反應期間，輔g每 -63- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232883 A7 B7 五、發明説明（61 ) APAD同時反應成APADH，APAD還原成APADH後所伴 隨的吸收值改變視為GF AT的活性。 簡而言之，在適當稀釋之引入GFAT1L或GFATIS基因 之大腸桿菌細胞分解液（50微升）中加入含有磷酸鈉緩衝液 (ρΗ = 7·5 ; 40 mM)、氯化鉀（50 mM)、EDTA (1.25 mM)、APAD (0.3 mM)、GDH (6 單位 / 毫升）、麩胺（0-6 mM)及果糖-6-磷酸（F-6-P : 0-6 mM)之受質溶液（200微 升），讓混合物在3 7 °C下反應6 0分鐘，以微量盤讀計測定 反應後3 6 5毫微米之吸收值變化。 2.GFAT1L及GFAT1 S間酵素行為的差異 為了研究GFAT1L及GFAT1S間酵素行為的差異，以麩 胺及F-6-P為受質，測定Km值。Km值係根據酵素受質濃 度（S)與酵素活性（反應速率（v))所求之s/v-s圖形及v-v/S 圖形計算而得。利用S/v-S圖形，X軸與圖形線交叉處求得 Km值（相對於“ _Km”之交叉點），而利用v-v/s圖形，Km 值則是由圖線的斜率求得（斜率=-Km)。 因為已有報告指出UDP-N -乙醯基葡糖胺（UDP-GlcNAc) 了抑制 GFAT 活性（Journal of Biological Chemistry 第 MX冊，1 705- 1 7 1 2 ( 1 966))，因此亦測定其抑制型態。 從圖形所得之圖線外觀測定之抑制型態與前述相似。 所得之結果示於圖2及3與表1中。 圖2顯不以F-6-P為受質時，UDP-GlcNAc抑制GFAT1S 及GFAT 1 L的抑制型態，γ軸為酵素的反應速率v，而X軸 為（反應速率（v))/(酵素受質的濃度（s))。 -64 - ΐ紙張尺度適用中國國家標準(CNS_) A4規格(21〇χ跗7公釐)一-

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線 1232883 A7 _____ B7 五、發明説明（62 ) 在圖2中’左邊圖形是gfaT IS所得結果，而右邊圖形是 GF AT 1 L所得的結果。在兩個圖形中，線（丨）係未添加 UDP-GlcNAc所得之結果，線（2)係添加UDP-GicNAc (30 #M)而線（3)係添加 UDP_gicnAc (100 #M)所得之 結果。 如圖2所示，GFAT1S及GFAT1L之Km值分別為90 及478 βΜ，咸發現抑制GfaT活性的抑制型態分別是“競 爭抑制’’（G F A T 1 S情形）及“混合抑制，，（G F a T i L情形）。 圖3顯示以麩胺為受質時，uDP-GlcNAc抑制GFAT1S 及GFAT 1L的抑制型態，γ軸為酵素的反應速率（v)，而χ 軸為（反應速率（v))/(酵素受質的濃度（s))比率。 在圖3中’左邊圖形是GFAT 18所得結果，而右邊圖形是 GFAT1L所得的結果。在圖形中，線（1)係未添加1；1)1)_

GlcNAc所得之結果，線（2)係添加UDP-GlcNAc (10 //M) 而線（3)係添加UDP-GlcNAc (30 //Μ)所得之結果，而線 (4)則是添加UDP-GlcNAc (100 #Μ)所得之結果。 如圖3所示，GFAT1S及GFAT1L之Km值分別為822 及8 0 4 # Μ，咸發現抑制G F A Τ活性的抑制型態分別是“非 競爭抑制”（GFAT1S情形）及“混合抑制，，（GFatil情形）。 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232883 — A7 ______B7 五、發明説明（63 ) 表1 GFAT1S GFAT1L Km 值（# M) F-6-P 78-118 458-478 麩胺 761-822 804-812 抑制型態 麩胺 非競爭抑制 混合抑制 F-6-P 競爭抑制 混合抑制 圖2及圖3及表1中顯示，當受質為F-6-p時，GFAT1 s(約 1〇〇 //Μ)及GFAT1L(約5〇〇 μΜ)的Km值有明顯的差異， 然以麩胺為受質時，GFAT1S(約800 //M)及GFFAT1L(約 8 00 #M)的Km值則無明顯的差異。 UDP-GlcNAc呈現的抑制型態如下：當F-6_p為受質時 ’是以競爭抑制型態抑制GF AT 1 S，以同時發生競爭抑制 及非競爭抑制之混合抑制型態抑制GFAT1L ;然以麩胺為 文質時’係以非競爭抑制型態抑制GF AT 1 S，而係同時發

生非競爭抑制及其他的抑制之混合抑制型態抑制Gf AT 1 L 〇 從前述的結果，證實根據本發明GFAT1L及人類GFAT 間酵素行為的下列差異，（1)以F_6_p為受質時，本發明 GFAT1L的Km值較人類GFAT者高約5倍；（2)110?- G1 cN A c係以不同的型態抑制。 3 ·研究G F A T 1 L對胰島素抗性的效應 已報告指出GFAT可影響活體外及活體内試驗之胰島素 抗性，然而，利用本發明基因發現存在兩種〇 F A T次型； -66 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1232883

換言之，GFAT1L及人類GFAT (GFAT1S)。後文將討論 GFAT1L或人類GFAT (GFAT1S)影響胰島素抗性的程度 通常，健康人體之骨骼肌藉胰島素刺激後會約有7〇%血 糖會代謝，相反地，咸報告第二型糖尿病患之骨骼肌中葡 萄糖的利用性則低到3 〇 %，而其他器官組織中的葡萄糖利 用性與健康人體中者相同（J〇urnal 〇f CHnical Investigation，(1)，1 49- 1 55 ( 1 98 5))。因此，骨骼 肌被視為具有顯著的胰島素抗性。咸發現本發明gf AT j L 可在骨體肌中表現，而G F A T 1 S則否，因此，本發明 GFAT1L被視為可影響其顯著的胰島素抗性。 從GFAT1S及GFAT1L酵素行為的研究顯示，（丨丨以厂 6-P為受質時，本發明GFAT1L的Km值較GFAT1S者高約 5倍；（2)因為細胞内麩胺的濃度為4-5 mM，根據細胞内 F-6-P濃度之GFAT活性，與先前報導（3)第11型糖尿病病 患紅血球中F-6-P濃度為數1〇 (Horm_ Metabol·

Res·，14，23 3 -2 3 6 ( 1 9 82))，推測後文。 簡而言之，如圖4所示，報告中所指GF AT活性係根據F-6-P濃度推測，濃度與Km值相近時，GFAT1S維持穩定， 而GFAT1L則很難活化。 圖4是GFAT1S及GFAT1L(GFAT活化狀態）之酵素反應 曲線。Y軸為酵素反應速率（v)，而X軸為細胞内F-6-P濃度 (# Μ)。濃度較高時，有較多量的葡萄糖流入細胞内。圖4 中’粗線係文獻報導中非胰島素依賴糖尿病病患紅血球中 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐)

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F-6-P濃度，而粗線箭頭所指為胰島素抗性。 除此之外，後述如下。以胰島素刺激後，細胞攝入葡萄 糖會增加，此情況下，對GFAT1S而言，因為酵素反應達 到Vmax，當葡萄糖再流入細胞内，GFAT活性會飽和，不 會進一步活化。相反地，以本發明GFAT1L而言，當葡萄 糖流入細胞内的含量增加時，GFAT會活化，於是代謝物 會增加，因而會抑制葡萄糖轉送受體自細胞膜移送至細胞 内，導致血糖的增加（假設GFAT1L的 幾乎相同）。 因此，與GFAT1S比較，.本發明⑽八丁丨乙被視為與胰島 素抗性有關。因此，結論是本發明GFAT1L在胰島素抗性 機制上扮演重要的角色。 工業應用 本發明提供GFAT1L基因，其編碼與人類GFA 丁同質之 新穎人類蛋白質同質體。 本發明基因在骨骼肌及心臟中可高度表現，這些組織是 糖代謝作用重要的組織，而該基因被視為可促進此種組織 及週邊組織中GFAT的活性，或是糖解作用系統中六碳糖 胺的生物合成途徑。除此之外，該基因被視為可避免葡萄 糖轉送受體移送至細胞膜上，因此，因為該基因可有效的 調節糖代謝系統中血糖的含量，分析該基因GF AT活性的 表現程度可用以研究與該基因相關功能與糖代謝相關及疾 病的關係。明確言之，該基因可用以基因診斷患有低血糖 症或糖尿病之患者，並可用以研究對抗該基因或表現產物 -68- 本纸張尺度適财國@家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) - *- 1232883

或反向DNA產物之抗體之醫藥應用。 利用本發明基因，可 而 J研九基因在各式組織之表現，及分 析基因在活體中功能。 利用咸基因，利用遺傳工程技術可大量生產該基因所編 碼的GFAT1L蛋白質，所提供的蛋白質可研究gfatil活性 及GFAT1L蛋白質的鍵結活性。 本發明蛋白質可用以闡明、診斷及治療與gfatil基因 或其表現產物相關疾病（例如，與GFAT活性或糖解作用系 統中調節六碳糖胺生物合成途徑之相關疾病；與低血糖症 及血糖含量碉節作用相關之疾病；低血糖症；糖尿病；及 糖尿病併發症，諸如糖尿病腎臟病變、糖尿病視網膜病變 及糖尿病神經病變）。 本發明亦提供含有本發明基因反向寡核謀酸之基因引入 載體’该載體可作為基因治療用；含有進入細胞之 GFAT 1L反向寡核：y：酸（活性成分）及載體或細胞之基因治 療劑；及採用該治療劑的基因治療方法。 本發明亦提供含有活性成分之本發明基因之反向寡核苷 酸、可鍵結至GFAT 1L之抗體，或抗體片段之藥劑，該藥劑 可預防骨骼肌（特別’是骨骼肌的平滑細胞）GF AT mRNA 的表現，因此可用以治療諸如糖尿病及糖尿病併發症之疾 病及病理病徵。 本發明亦提供一種篩選會抑制G F A T 1 L蛋白質酵素活性 及GFAT1L基因表現產物之候選化合物，及可用以治療糖 尿病的方法及套組。 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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A7 B7 五、發明説明（67 序列清單 <110〉Otsuka醫藥有限公司 <120〉新穎酵素基因及其表現產物 <130> OP0036 <150> JP P2000-176631 <151〉 2000-06-13 <150> JP P2000-290679 <151〉 2000-09-25 <160> 7 <170> Patentln Ver. 2. 0 <210〉 1 <211〉 699 <212〉 PRT <213〉人類骨骼肌 <400> 1

Met Cys Gly lie Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg 1 5 l〇 15

Arg Glu lie Leu Glu Thr Leu He Lys Gly Leu Gin Arg Leu Glu Tyr 2〇 25 30

Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Phe Asp Gly Gly Asn Asp Lys 35 40 45

Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys lie Gin Leu lie Lys Lys Lys Gly 50 55 60

Lys Yal Lys Ala Leu Asp Glu Glu Val His Lys Gin Gin Asp Met Asp 65 70 75 80

Leu Asp lie Glu Phe Asp Val His Leu Gly lie Ala His Thr Arg Trp 85 90 95

Ala Thr His Gly Glu Pro Ser Pro Yal Asn Ser His Pro Gin Arg Ser 100 105 no

Asp Lys Asn Asn Glu Phe lie Val lie His Asn Gly lie lie Thr Asn 115 120 125

Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu 130 135 140

Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr He Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr M5 1 50 1 55 1 60

Asp Asn Arg Glu Ser Gin Asp Thr Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg 165 170 175

Val He Gin Gin Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Va] -70- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

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1232883 A7 B7 五、發明説明 ( 68 ) 180 185 190 His Phe Pro Gly Gin Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu 195 200 205 lie Gly Yal Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His lie Pro lie 210 215 220 Leu Tyr Arg Thr Ala Arg Thr Gin lie Gly Ser Lys Phe Thr Arg Trp 225 230 235 240 Gly Ser Gin Gly Glu Arg Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Asn Leu 245 250 255 Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Yal Glu Glu Lys Ala 260 265 270 Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Yal lie Glu His Thr 275 280 285 Asn Arg Val lie Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp 290 295 300 Gly Arg Leu Ser lie His Arg lie Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro 305 310 315 320 Gly Arg Ala Val Gin Thr Leu Gin Met Glu Leu Gin Gin lie Met Lys 325 330 335 Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gin Lys Glu lie Phe Glu Gin Pro Glu 340 345 350 Ser Val Yal Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr 355 360 365 Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His lie Lys Glu lie Gin Arg Cys 370 375 380 丨Arg Arg Leu lie Leu lie Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val 3S5 390 395 400 Ala Thr Arg Gin Yal Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val 405 410 415 Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp 420 425 430 Asp Val Cys Phe Phe Leu Ser Gin Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu 435 440 445 Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Yal Gly lie 450 455 460 Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser lie Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val 465 470 475 480 His lie Asn Ala Gly Pro Glu lie Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr 485 490 495 Thr Ser Gin Phe Val Ser Leu Val Met Phe Ala Leu Met Met Cys Asp 500 505 510 Asp Arg lie Ser Met Gin Glu Arg Arg Lys Glu lie Met Leu Gly Leu 515 520 525 Lys Arg Leu Pro Asp Leu lie Lys Glu Yal Leu Ser Mel Asp Asp Glu 530 535 540 He Gin Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His Gin Lys Ser Val Leu lie -71 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1232883 A7 B7 五、發明説明（69 ) 545 550 555 560

Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys 565 570 575 lie Lys Glu lie Thr Tyr Mel His Ser Glu Gly lie Leu Ala Gly Glu 580 585 590

Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Yal Asp Lys Leu Met Pro Val lie 595 600 605

Met lie lie Met Arg Asp His Thr Tyr Ala Lys Cys Gin Asn Ala Leu 610 615 620

Gin Gin Yal Val Ala Arg Gin Gly Arg Pro Val Val lie Cys Asp Lys 625 630 635 640

Glu Asp Thr Glu Thr lie Lys Asn Thr Lys Arg Thr lie Lys Val Pro 645 650 655

His Ser Yal Asp Cys Leu Gin Gly He Leu Ser Yal lie Pro Leu Gin 660 665 670

Leu Leu Ala Phe His Leu Ala Yal Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe 675 680 685

Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu : 690 695 <210〉 2 <211> 2097 <212> DNA ' 〈213>人類骨絡肌mRNA ,; 〈220〉 * <221> CDS <222〉 （1)·· (2097) <400> 2 atg tgi ggt ata ttt get Uc tla aac tac cat gtt cct cga acg aga 48

Met Cys Gly lie Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Yal Pro Arg Thr Arg 1 5 l〇 15 ega gaa ate ctg gag acc cla ate aaa ggc ctl cag aga ctg. gag tac 96 ,Arg Glu lie Leu Glu Thr Leu lie Lys Gly Leu Gin Arg Leu Glu Tyr 20 25· 30 aga gga tat gat tet get ggt gtg gga ttt gat gga ggc aat gal aaa 144 I Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Yal Gly Phe Asp Gly Gly Asn Asp Lys 35 40 45 I gat igg gaa gCC aa( gcc tgc aaa ate cag ett att aag aag aaa gga 192

Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys lie Gin Leu lie Lys Lys Lys Gly 50 55 60 aaa gtt aag gca ctg gat gaa gaa g[( cac aag caa caa gal a(g gal 240

Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Giu Val His Lys Gin Gin Asp Mel Asp 65 70 75 80 tig gat a(a gaa 111 gal g(a cac ett gga ala get cal acc cgt Igg 288 -72- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

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1232883 A7 B7 五、 發明説明 ( 70 ) Leu Asp lie Glu Phe Asp Val His Leu Gly lie Ala His Thr Arg Trp 85 90 95 gca aca cat gga gaa ccc agt cct gtc aat age cac ccc cag ege tct 336 Ala Thr His Gly Glu Pro Ser Pro Yal Asn Ser His Pro Gin Arg Ser 100 105 110 gat aaa aat aat gaa ttt ate gtt att cac aat gga ate ate acc aac 384 Asp Lys Asn Asn Glu Phe lie Yal lie His Asn Gly lie lie Thr Asn 115 120 125 i tac aaa gac Itg aaa aag ttt ttg gaa age aaa ggc tat gac ttc gaa 432 Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu 130 135 140 丨tct gaa aca gac aca gag aca atl gee aag etc gtt aag tat atg tat 480 Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr lie Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr 145 150 155 160 gac aat egg gaa agt caa gat acc age ttt act acc ttg gtg gag aga 528 Asp Asn Arg Glu Ser Gin Asp Thr Ser Phe Thr Thr Leu Yal Glu Arg 165 170 175 gtl ate caa caa ttg gaa ggt get ttt gca ett gtg tit aaa agt gtt 576 Val lie Gin Gin Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Yal Phe Lys Ser Val 180 185 190 cat tit ccc ggg caa gca gtt ggc aca agg ega ggt age cct ctg ttg 624 His Phe Pro Gly Gin Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu 195 200 205 att ggt gta egg agt gaa cat aaa ett tct act gat cac att cct ata 672 lie Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His lie Pro lie 210 215 220 etc lac aga aca get agg act cag att gga lea aaa ttc aca egg tgg 720 Leu Tyr Arg Thr Ala Arg Thr Gin lie Gly Ser Lys Phe Thr Arg Trp 225 230 235 240 gga tea cag gga gaa aga ggc aaa gac aag aaa gga age tgc aat etc 768 Gly Ser Gin Gly Glu Arg Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Asn Leu 245 250 255 tct cgt gtg gac age aca acc tgc ett ttc ccg gtg gaa gaa aaa gca 816 Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Yal Glu Glu Lys Ala t i 260 265 270 | gtg gag tat tac ttt get tct gat gca agt get gtc ata gaa cac acc 864 j Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val lie Glu His Thr l 1 275 280 285 'aat ege gtc ate ttt ctg gaa gat gat gat gtt gca gca gla gtg gal 912 Asn Arg Val lie Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp 290 295 300 gga cgt clt tel ate cat ega att aaa ega act gca gga gat cac ccc 960 Gly Arg Leu Ser lie His Arg lie Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro 305 310 315 320 gga ega get gtg caa aca etc cag aig gaa etc cag cag ale aig aag 1008 Gly Arg Ala Val Gin Thr Leu Gin Met Glu Leu Gin Gin lie Mel Lys -73- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

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1232883 A7 B7 五、發明説明 ( 71 ) 325 330 335 ggc aac ttc agl tea ttt atg cag aag gaa ata ttt gag cag cca gag 1056 Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gin Lys Glu lie Phe Glu Gin Pro Glu 340 345 350 tct gtc gtg aac aca atg aga gga aga gtc aac lit gal gac tat act 1104 Ser Val Yal Asn Th.r Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr 355 360 365 gtg aat ttg ggt ggt ttg aag gat cac ata aag gag ate cag aga tgc 1152 Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His lie Lys Glu lie Gin Arg Cys 370 375 380 egg cgt ttg att ct( att get tgt gga aca agt tac cat get ggt gta 1200 Arg Arg Leu lie Leu lie Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val 385 390 395 400 gca aca cgt caa gtt ett gag gag ctg act gag tig cct gtg atg gtg 1248 Ala Thr Arg Gin Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val 405 410 415 gaa eta gca agt gac ttc ctg gac aga aac aca cca gtc ttt ega gat 1296 Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp 420 425 430 1 gat gtt tgc ttt ttc ett agt caa tea ggt gag aca gca gat act ttg 1344 Asp Val Cys Phe Phe Leu Ser Gin Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu 435 440 445 atg ggt ett cgt tac tgt aag gag aga gga get tta act gig ggg ale 1392 Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly lie 450 455 460 aca aac aca gtt ggc agt tcc ata tea egg gag aca gat tgt gga gtt 1440 ;Thr Asn Thr Yal Gly Ser Ser lie Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Yal 1 465 470 475 480 cat at t aal get ggt cct gag att ggt gtg gcc agt aca aag get tat 1488 His lie Asn Ala Gly Pro Glu lie Gly Yal Ala Ser Thr Lys Ala Tyr 485 490 495 acc age cag tit gta tcc ett gig atg ttt gcc clt atg atg tgt gal 1536 Thr Ser Gin Phe Val Ser Leu Val Met Phe Ala Leu Met Met Cys Asp 500 505 510 gat egg ate tcc atg caa gaa aga ege aaa gag ate atg ett gga ttg 1584 Asp Arg lie Ser Mel Gin Glu Arg Arg Lys Glu lie Met Leu Gly Leu 515 520 525 aaa egg clg cct gat tig att aag gaa gla ctg age atg gat gac gaa 1632 Lys Arg Leu Pro Asp Leu lie Lys Glu Yal Leu Ser Met Asp Asp Glu 530 535 540 at t cag aaa cla gca aca gaa ell (at cat cag aag lea gtt ctg ala 1680 lie Gin Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His Gin Lys Ser Val Leu lie 545 550 555 560 atg gga ega ggc tat cat tat gel act tgt ett gaa ggg gca cig aaa 1728 Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys 565 570 575 -74- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1232883 A7 B7 1776 1824 1872 1920 1968 2016 2064 2097 五、發明説明（72 ) ate aaa gaa att act tat atg cac tct gaa ggc ate ctt get ggt gaa lie Lys Glu lie Thr Tyr Met His Ser Glu Gly lie Leu Ala Gly Glu 580 585 590 ttg aaa cat ggc ccl clg get ttg gtg gat aaa ttg atg cct gig ate

Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Leu Met Pro Val lie 595 600 605 atg ate ate atg aga gat cac act tat gee aag tgt cag aat get ett

Met lie lie Met Arg Asp His Thr Tyr Ala Lys Cys Gin Asn Ala Leu 610 615 620 ：cag caa gtg gtt get egg cag ggg egg cct gtg gta att tgt gat aag ；Gin Gin Val Val Ala Arg Gin Gly Arg Pro Val Val lie Cys Asp Lys I 625 630 635 640 I gag gat act gag acc att aag aac aca aaa aga aeg ate aag gtg ccc 丨 Glu Asp Thr Glu Thr lie Lys Asn Thr Lys Arg Thr lie Lys Val Pro 645 650 655 cac tea gtg gac tgc ttg cag ggc att etc age gtg ate cct Ita cag

His Ser Val Asp Cys Leu Gin Gly lie Leu Ser Val lie Pro Leu Gin 660 665 670 ttg ctg get tic cac ett get gtg ctg aga ggc tat gat gtt gat ttc

Leu Leu Ala Phe His Leu Ala Yal Leu Arg Gly Tyr Asp Yal Asp Phe 675 680 685 cca egg aat ett gee aaa tet gig act gta gag

Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu 690 695

<210〉 3 <211> 33 <212> DNA <213〉引子 PI <400> 3 gticcgcgla ctcgtcgtga aalcctggag acc 33 <210〉 4 <211> 33 ;<212> DNA :〈213〉引子 P2 <400> 4 gcttacclga actaccacgt tccgcgtacl cgt 33 〈210〉 5 <211> 40 <212) DNA <213〉引子 P3 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

裝 訂

1232883 A7 B7 五、發明説明（73 ) <400> 5 ttttlttcat atgtgtggta tcttlgctta cctgaactac <2!0> 6 <211〉 32 <212> DNA <213〉引子 P4 <400> 6 ccctcgagtt actctacagt cacagalttg gc 〈210〉 7 <211> 20 <212> DNA 〈213〉引子 - <400> 7 agccctctgt Igattggtgt <210〉 8 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉引子 <400> 8 tccalclgga gtgtttgcac 40 32 20 20 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐）

Claims (1)

1. 文身4 8 ny 3T 2 請J忡替 J範 lm利 月 2 年 94 A BCD 六、申請專利範圍 1. 一種基因，其係包含下列（a)或（b)之聚核嘗酸或彼等之 互補股，其係可於心臟或骨骼肌高度表現： (a) 編碼SEQ ID NO : 1胺基酸序列所組成的聚肽之聚 核苷酸； (b) 編碼由與上述SEQ ID NO : 1胺基酸序列具有98% 以上相似度之胺基酸序列所組成之聚肽之聚核甞酸 〇 2. —種基因，其包括下列（a)或（b)之聚核甞酸或彼等之互 補股，其係可於心臟或骨骼肌高度表現： (a) 由SEQ ID NO : 2核茹酸序列所組成之聚核苷酸或 其互補股；或 (b) 高度嚴苛條件下，可與由SEQ ID NO : 2之第 6 8 5〜73 8聚核苷酸雜化的聚核甞酸。 3·—種如SEQ ID NO : 2所示之鹼基序列之基因。 4· 一種表現申請專利範圍第2或3項之基因所產生之基因表 現產物。 5 · —種重組表現載體之製造方法’其特徵在於該重組載體 包含申請專利範圍第2或3項之基因。 6·—種宿主細胞之製造方法，其特徵在於該宿主細胞帶有 申請專利範圍第5項之重組表現載體。 7 · —種轉形體之製造方法，其特徵在於該轉體係經申請專 利範圍第5項之重組表現載體轉形。 8·—種具有下列（a)及（b)之特徵之gfatil蛋白質，其係 可於心臟或骨骼肌高度表現： 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 8 8 8 8 A BCD 1232883 六、申請專利範圍 (a) 由SEQ ID NO : 1之胺基酸序列所組成之蛋白質； (b) 由與上述（a)胺基酸序列具有9 8 %上之相似度之胺基 酸序列所組成之蛋白質。 9·一種由SEQ ID NO : 1之胺基酸序列所組成之蛋白質。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210χ 297公釐）