WO2001096574A1 - Nouveau gene enzymatique et son produit d'expression - Google Patents

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WO2001096574A1
WO2001096574A1 PCT/JP2001/004941 JP0104941W WO0196574A1 WO 2001096574 A1 WO2001096574 A1 WO 2001096574A1 JP 0104941 W JP0104941 W JP 0104941W WO 0196574 A1 WO0196574 A1 WO 0196574A1
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gene
protein
gfat
amino acid
acid sequence
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PCT/JP2001/004941
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Tsutomu Fujiwara
Takashi Okamoto
Masashi Niimi
Hiroyuki Kyushiki
Yasuchika Yamamoto
Atsunori Ueyama
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to Glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase (hereinafter referred to as GFAT).
  • Novel protein having a defined amino acid sequence.
  • G FAT is an important enzyme that catalyzes the reaction of the rate-limiting step from frux I-6-phosphate to dalcosamine-6-phosphate in the hexosamine biosynthesis pathway in vivo.
  • McKnight et al. (1992) reported a human gene for the enzyme consisting of a 681-amino acid sequence (McKniglit, GL, et al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212). Since then, a new human GFAT gene has been reported by Nishi et al. (US Pat. No. 5,876,713).
  • Drugs that inhibit this GFAT activity are thought to promote glucose uptake into cells and reduce blood sugar levels, and are therefore expected as therapeutic drugs for diabetes.
  • Insulin promotes the uptake of glucose into cells, and the uptake glucose is metabolized by glycolysis and accumulates ATP as a source of energy.
  • Fructose-6-phosphate flows into the hexosamine biosynthesis pathway. The fructose-6-phosphate that has flowed into the hexosamine biosynthesis pathway is converted to dalcosamine-6-phosphate by GFAT.
  • Darcosamine-6-phosphate metabolite inhibits translocation of sugar transporters to membranes, Thus, it has been reported that the uptake of dalcose into cells is suppressed (FASEB J., 5, 3031-3036 (1991)); Diabetologia, 38> 518-524 (1995); J. Biol. C em., 266-10155-10161 (1991); J. Biol. Chem., 266-4706-4712 (1991); Endocrinology, 136. 2809-2816 (1995)).
  • GFAT is considered to be important as a rate-limiting enzyme in the pathway. Furthermore, it is known that this type of GFAT activity is generally high in type 2 diabetic patients who do not depend on insulin, and it has been reported that this GFAT activity is one of the causes of high blood glucose levels (Diabetes, 45, 302-307 (1996)) 0
  • Isolation of a new GFAT gene that exhibits GFAT activity will help elucidate the regulatory function of GFAT in the hexosamine biosynthesis pathway, and isolation of GFAT genes that are specifically expressed in organs such as skeletal muscle will Further research on the elucidation of the mechanism of sugar metabolism in the field. Furthermore, if a specific candidate compound having an inhibitory activity on the GFAT protein as an expression product of the amino acid sequence encoded by these genes is found, it will be useful for the prevention or treatment of diabetes having a new mechanism of action. A useful hypoglycemic drug could be developed.
  • an object of the present invention is to isolate such a new GFAT gene, particularly a GFAT gene specifically expressed in skeletal muscle. Disclosure of the invention As a result of repeated research from the above problems, the present inventors have succeeded in cloning a cDNA having a novel nucleotide sequence encoding a protein having GFAT activity from a human skeletal muscle cDNA library. The present invention has been completed on genes and proteins desired to be specifically expressed in muscle and heart.
  • an invention having the following gist is provided.
  • polynucleotide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a) and encoding a polypeptide having GFAT activity, or a complementary strand thereof ,
  • a recombinant expression vector having the gene according to (1) or (2) above (6) A host cell having the recombinant expression vector according to (5).
  • composition for treating or preventing hypoglycemia comprising the gene according to (1) or (2) or the gene expression product according to (4) as an active ingredient.
  • composition for treating or preventing hypoglycemia comprising the protein of (8) as an active ingredient.
  • the percentage of the labeled protein or its partial peptide is measured, or (ii) the test solution containing the candidate compound and the above-mentioned antibody and other labeled antibodies immobilized on the carrier are simultaneously or After the continuous reaction, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured, or (iii) when the substrate or the partial peptide thereof described in (8) above is brought into contact with a substrate, Substrate and partial peptide In the case of contacting the auxiliary compound, the protein or is characterized in that the enzymatic activity of the partial peptide measured, compared to screening two Method.
  • an invention having the following gist is also provided.
  • a test solution and a labeled GFATL protein or a fragment thereof are allowed to react competitively, and the ratio of labeled GFAT1L protein or a fragment thereof bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying a GFAT 1 L protein or a fragment thereof in a test solution comprising:
  • test solution is reacted with the antibody of (14) insolubilized on the carrier and another labeled antibody against another GFAT 1 L protein simultaneously or continuously, and then the insolubilized carrier is reacted.
  • a medicine containing an antibody against GFAT 1 L protein preferably, an antibody against GFAT 1L protein having an activity of neutralizing the activity of GFAT 1 L protein, particularly a medicine that is an agent for treating and preventing diabetes .
  • a compound that inhibits GFAT enzyme activity characterized by measuring and comparing the enzyme activity of GFAT 1L protein or fragment thereof when the substrate and the test compound are brought into contact with the T1L protein or fragment thereof. Screening method. Further, according to the present invention, the invention of the following gist is also provided.
  • An antisense DNA having a base sequence complementary or substantially complementary to DNA of the GFAT1L gene, and having an action of suppressing the expression of the DNA.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the GFAT1L gene is the entire base sequence of the base sequence complementary to the DNA or at least 98% or more of the partial base sequence.
  • An antisense DNA of a G FAT 1L gene having a nucleotide sequence having a homology of (preferably about 99% or more).
  • a pharmaceutical composition comprising antisense DNA of the GFAT 1 L gene, particularly a pharmaceutical composition which is an agent for treating and preventing diabetes.
  • FIG. 1 is a photograph substituted for a drawing, showing the results of agarose gel electrophoresis in which the expression pattern of the gene of the present invention in each organ was determined by the RT-PCR method according to Example 2.
  • FIG. 2 is a graph for determining the Km value and F GAT activity inhibition mode using F-6-P as a substrate as enzymatic properties of the GF ATIL of the present invention, according to Example 4.
  • FIG. 3 is a graph for determining the Km value and GFAT activity inhibition mode using glumin as a substrate as enzymatic properties of GFAT 1 L of the present invention, according to Example 4.
  • FIG. 4 is a graph showing an enzyme reaction curve (activation state of GFAT) of 1 L of GFAT of the present invention according to Example 4.
  • the protein of the present invention is characterized by containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence substantially identical thereto.
  • the protein of the present invention can be, for example, a human cell, particularly a human striated muscle cell, or a protein derived, for example, from a human tissue, particularly a skeletal muscle or heart, or can be a synthetic protein.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 98% or more, preferably about 99% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1; : A protein having a GFAT activity substantially the same as that of the protein of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; specifically, homologs of the GFAT 1 L gene described below (GFAT including alleles) Gene products), including proteins of mammals such as humans, horses, sheep, pigs, dogs, monkeys, cats, bears, rats, and egrets having the same activity. You.
  • substantially the same means that the activity is the same in nature (for example, physiochemically or pharmacologically). Therefore, quantitative factors such as the degree of GFAT activity and the molecular weight of the protein can naturally differ.
  • the measurement of GFAT activity is performed according to a method known per se, for example, the method of Marshall et al. (Marshall, et.a., J. Biol. be able to.
  • GFAT activity As shown in the Examples below, in the case where UDP-N-acetyldarcosamine inhibits GFAT activity, when fructose-6-phosphate is used as a substrate, the mode of inhibition refers to the GFAT activity indicated by the mixed inhibition mode. Are clearly distinguished from those in the competitive inhibition mode.
  • the GFAT activity exhibiting such a mixed inhibition mode unique to the present invention is simply referred to as “GFAT activity”.
  • the position of the deletion, substitution or addition of the above amino acid sequence is arbitrary as long as the protein having such a modified amino acid sequence has GFAT activity. As long as it has ⁇
  • the gene of the present invention encodes a skeletal muscle and heart specific protein (GFAT 1L protein) having a 699 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a specific example of the gene will be described later. Examples include those deduced from the DNA sequence of the PCR product named “GFAT1L” shown in the Examples, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 2 and consists of a total of 2097 bases.
  • the GFAT 1 L gene of the present invention is the 684th and 685th of the GFAT gene cloned by McKnight et al. (McKnight, GL, et.al., J. Biol. Chem., 261.25208-25212 (1992)). It was confirmed that there was a new sequence with 54 bases inserted between the bases.
  • the protein of the present invention has GFAT activity and is useful, for example, as an agent for improving hypoglycemia.
  • antibodies against the antisense DNA of the gene of the present invention and the expression product of the gene of the present invention are expected to have therapeutic effects on diabetes, and the use of these compounds for screening of candidate compounds as therapeutic agents for diabetes is also expected. It is possible.
  • a gene is intended to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNAs such as a sense strand and an antisense strand which constitute the gene.
  • the gene (DNA) of the present invention includes a double-stranded DNA including human genomic DNA and a single-stranded DNA including cDNA (sense strand), and a single-stranded DNA having a sequence complementary to the sense strand. Strand DNA (antisense strand) and any of their fragments are included.
  • the gene (DNA) of the present invention can include a leader sequence, a coding region, exons, introns, and the like.
  • Examples of the polynucleotide include RNA and DNA.
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA, and a polypeptide having a specific amino acid sequence may include fragments, homologues, derivatives, and variants thereof.
  • Mutants in a gene include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, variants having deletions, substitutions, additions, and insertions, and the like, which function the polypeptide encoded by them. Means that does not substantially change.
  • Polypeptides include allelic forms, homologs, naturally occurring variants at least 98%, preferably 99%, homologous.
  • the biological activity of the gene expression product of the present invention is exemplified as an action of catalyzing a reaction from fructo-6-phosphate to dalcosamine-6-phosphate. This can also be considered as an effect of increasing blood sugar in humans or mammals.
  • Homology in DNA and polypeptides can be analyzed using sequence analysis software, for example, by measurement using the FASTA program (Clustal.V., Methods Mol. Biol., 25. 307-318 (1994)). it can.
  • mutants of the gene of the present invention also include silent or conservative mutants for the amino acid substitution encoded thereby, that is, mutations in the nucleotide sequence in which the amino acid residue encoded by the nucleotide sequence is not changed.
  • the types of conservative amino acid substitutions are as follows: Original amino acid residue Conservatively substituted amino acid residue
  • one or more codons encoding a cysteine residue can be replaced as a result of deletion of the cysteine residue because it affects disulfide bonding of a particular polypeptide.
  • a hydrophilic residue such as seryl or threonyl
  • a hydrophobic residue such as oral isoleucyl, isoleucyl, phenylalanyl, valyl or alanyl
  • cysteinyl or prolyl is substituted for any other residue.
  • very Residues with larger side chains for example, phenylyl, are substituted with those without side chains, such as glycyl.
  • the gene of the present invention provides extremely useful information and means for elucidation, understanding, diagnosis, prevention, and treatment of diabetes.
  • the gene of the present invention can be suitably used for the development of a novel drug that suppresses or induces the expression of the gene used in the above treatment.
  • the detection of the expression of a product that suppresses or induces the expression of the gene of the present invention in an individual or a tissue, and the detection of mutation (deletion or point mutation) or abnormal expression of the gene can be performed by elucidating or diagnosing the above-mentioned diabetes pathology Can be suitably used.
  • the gene of the present invention encoding the modified amino acid sequence may be one in which the gene of the present invention encoding the amino acid sequence before modification can be detected by its use.
  • the gene of the present invention include, for example, the GFAT 1 L gene having a base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but the gene of the present invention is not particularly limited thereto. Without including the homologue of the GFAT 1 L gene.
  • a homolog of the GFAT1L gene has sequence homology to the GFAT1L gene of the present invention (or a gene product thereof), and has the above-mentioned structural characteristics, commonality in gene expression patterns, and Similarities in their biological functions (eg
  • Homology using the FAS TA program refers to a series of related genes recognized, for example, has at least 98% homology, preferably at least 99% homology with the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Polynucleotides and their complementary polynucleotides are included.
  • the above-mentioned alteration (mutation) of the amino acid sequence and the like may occur naturally, for example, due to mutation or modification after translation, but may be artificially performed based on a naturally-derived gene (eg, the GFAT 1 L gene of the present invention). It can also be modified.
  • the present invention encompasses all modified genes having the above-mentioned properties, irrespective of the cause and means of such modification and mutation.
  • the gene of the present invention also includes an allele (allele) of a gene encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the above-mentioned artificial means include, for example, cytospectic mutagenesis [Methods in Enzymology, 154.
  • the synthesis of DNA can be carried out by a chemical synthesis by a phosphoramidite method or a triester method, or can be carried out on a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer.
  • Double-stranded fragments were chemically synthesized by synthesizing the complementary strand and either annealing the strands together under appropriate conditions or adding a complementary strand using DNA polymerase with the appropriate primer sequence. It can also be obtained from single-stranded products.
  • a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be exemplified.
  • This base sequence (coding region) shows an example of one combination of codons indicating each amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the gene of the present invention is not limited to a gene having such a specific nucleotide sequence, and may have a nucleotide sequence selected by combining any codon with each amino acid residue. Codons can be selected according to a conventional method, for example, considering the codon usage of the host to be used [Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)].
  • the gene of the present invention also includes a gene consisting of a base sequence having a certain homology with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, as described above.
  • nucleotide sequence having homology means a polynucleotide having at least 98% homology, preferably at least 99% homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a polynucleotide having a complementary strand thereof. Refers to nucleotides.
  • Such genes include, for example, the sequences under high stringent conditions of 60 ° C. in 0.6 ° C. or 0.2 ° SSC containing 0.1% SDS in 0.6 ° C. or 0.1% SDS containing 0.1% SDS.
  • a gene having a nucleotide sequence that hybridizes with the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in No. 2 can be exemplified.
  • the gene of the present invention can be easily produced and obtained by general genetic engineering techniques on the basis of sequence information on specific examples of the gene of the present invention disclosed by the present invention [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); See Sequential Chemistry Laboratory Course “Gene Research Methods I, II and III", edited by The Biochemical Society of Japan (1986)].
  • a cDNA library is prepared from an appropriate source expressing the gene of the present invention in accordance with a conventional method, and the desired clone is cloned from the library using an appropriate probe antibody specific to the gene of the present invention.
  • an appropriate probe antibody specific to the gene of the present invention Pro Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983), etc.].
  • examples of the origin of cDNA include various cells and tissues expressing the gene of the present invention, and cultured cells derived therefrom. Also, all of these
  • RNA or cDNA Libraries are commercially available, and in the present invention, such mRNA or cDNA libraries, for example, various mRNA or cDNA libraries marketed by Clontecli Lab. it can.
  • the method for screening the gene of the present invention from a cDNA library is not particularly limited, and any method can be used. Specifically, for example, for a protein produced by cDNA, a method for selecting a corresponding cDNA clone by immunoscreening using an antibody specific to the protein, a method for selectively selecting a target DNA sequence Plaque hybridization, colony hybridization using a probe that binds to, and combinations thereof.
  • DNA or the like chemically synthesized based on information on the nucleotide sequence of the gene of the present invention can be generally used, but the gene of the present invention or a fragment thereof which has already been obtained is also good.
  • sense primers and antisense primers set based on the nucleotide sequence information of the gene of the present invention can also be used as screening probes.
  • the nucleotide sequence used as the probe is a partial nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 2, 15 or more consecutive bases including at least a part of the 54 base inserted sequence portion, preferably 20 consecutive bases. Bases, more preferably 30 contiguous bases, most preferably 50 contiguous bases. Alternatively, a positive clone having the above sequence itself can be used as a probe.
  • a DNAZRNA amplification method by a PCR method can be suitably used.
  • the RACE method Rapid a immediate liiication of cDNA ends; Experimental Medicine, 12 (6), 35 (1994)
  • the 5'-RACE method MA Frohman, et al., Pro Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)
  • Primers used for adopting the PCR method can be appropriately set based on the sequence information of the GFAT1L gene revealed by the present invention, and can be synthesized according to a conventional method.
  • the isolation and purification of the amplified DNAZRNA fragment can be performed according to a conventional method as described above, for example, by gel electrophoresis.
  • the gene of the present invention or various DNA fragments obtained above can be obtained by a conventional method such as the dideoxy method (Pro Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)) or the Maxam-Gilbait method [Methods in Enzymology, 65> 499 (1980)), or simply using a commercially available sequence kit or the like.
  • the presence or absence of the expression of the gene of the present invention in an individual or various tissues can be specifically detected by utilizing a part or all of the nucleotide sequence of the gene. be able to.
  • Such detection can be performed by a conventional method, for example, RT-PCR [Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E. S. Kawasaki, et al.,
  • RNA amplification RNA amplification
  • Northern blotting analysis Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)
  • measurement at the cell level using in situ hybridization etc.
  • NASBA method Nucleic acid se-uence-based amplification, Nature, 350, 91 -92 (1991)
  • a detection method by RT-PCR can be mentioned.
  • the primer used in the case of employing the PCR method is not particularly limited as long as it is specific to the gene of the present invention that can specifically amplify only the gene of the present invention. It can be set appropriately.
  • 10-35 nu Examples include those having a partial sequence of the gene of the present invention having a length of about a nucleotide, preferably about 15 to 30 nucleotides.
  • the gene of the present invention also includes a DNA fragment used as a specific primer and / or a specific probe for detecting the gene.
  • the DNA fragment can be defined as DNA characterized in that it hybridizes under high stringent conditions to DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • high stringent end conditions include ordinary conditions used as primers or probes, and are not particularly limited.For example, 0.2XS including 0.1% SDS as described above is included. The conditions at 60 ° C in SC, or at 60 ° C in 0.1 XS SC containing 0.1% 303, can be exemplified.
  • the gene product (GFAT 1 L protein) or a protein containing the gene product can be easily and stably produced in a large amount by using ordinary genetic engineering techniques.
  • the present invention relates to a protein such as a GFAT1L protein encoded by the gene of the present invention, and to a vector for producing the protein, for example, a vector containing the gene of the present invention, or a vector transformed with the vector.
  • the present invention also provides a host cell, a method for producing the protein of the present invention by culturing the host cell, and the like.
  • the protein of the present invention can be prepared by a conventional gene recombination technique (for example, Science, 224.1431 (1984); Biochem. Biophys. Res.) Based on the sequence information of the GF ATI L gene provided by the present invention. Comm., ⁇ , 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80> 5990 (1983), etc.].
  • the production of the protein is carried out by preparing a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing the gene encoding the desired protein in a host cell, introducing this into a host cell, and transforming the host. This is carried out by culturing the transformant and then recovering the resulting culture.
  • a recombinant DNA expression vector
  • prokaryote and eukaryote can be used as the host cell.
  • prokaryote hosts include a wide range of commonly used hosts such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. Especially Escherichia coli
  • eukaryotic host cells include cells of vertebrates, yeasts, and the like. Examples of the former are COS cells (Cell, 3: 175 (1981)), which are monkey cells, and Chinese hamster ovary. Cell and its dihydrofolate reductase-deficient strain [Pro Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216
  • Saccharomyces yeast cells and the like are preferably used. Of course, it is not limited to these.
  • a vector capable of replicating in the host cell is used.
  • the vector is a promoter and an SD (Shine and Dalgarno) upstream of the gene so that the gene of the present invention can be expressed.
  • An expression plasmid having a base sequence and an initiation codon (eg, ATG) required for initiation of protein synthesis can be suitably used.
  • a plasmid derived from Escherichia coli, for example, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 and the like is often used, but not limited thereto, and various known vectors can be used.
  • coli include, for example, pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), MAL-C2, pMAL-P2 (New England Biolabs) , PET21, pET21 / lacq (Invitrogen), pBAD / His (Invitrogen) and the like.
  • the expression vector When a vertebrate cell is used as a host, the expression vector usually includes a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence located upstream of the gene of the present invention to be expressed. It may also have a replication origin if desired. Examples of the expression vector include, for example, p SV2dhfr [Mol.
  • an expression vector when a yeast cell is used as a host for example, PAM82 CProc. Nail. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983) having a promoter for the acid phosphatase gene. And the like.
  • Commercially available expression vectors for yeast cells include, for example, pPICZZ (Invitrogen) and pPICZa (Invitrogen).
  • trp tryptophan
  • lpp promoter lac promoter
  • recA promoter PL / PR promoter and the like
  • the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus
  • SP01 Promo SP02 Promo
  • penP Promo and the like.
  • yeast is used as a host, for example, a pH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter and the like can be suitably used.
  • Examples of preferred promoters when using animal cells as a host include SV40-derived promoters, retrovirus promoters, metallotionin promoters, heat shock promoters, cytomegalovirus mouth motors, and sRen promoters. it can.
  • a normal fusion protein expression vector can also be preferably used.
  • the vector include pGEX (Promega) for expression as a fusion protein with daltathione-1S-transferase (GST).
  • examples of a polynucleotide sequence that assists the expression and secretion of a polypeptide from a host cell include a secretory sequence and a leader sequence.
  • the polynucleotide sequence used for purification of a fusion mature polypeptide for a bacterial host can be exemplified. Examples include the sequence (hexahistidine tag) and, in the case of mammalian cells, the hemagglutinin (HA) tag.
  • a method for introducing a desired recombinant DNA (expression vector) into a host cell and a method for transforming the same are not particularly limited, and various general methods can be employed.
  • the resulting transformant can be cultured according to a conventional method, and the target protein of the present invention encoded by a gene designed as desired by the culture is expressed in the transformant, outside the cell or on the cell membrane of the transformant. Produced (accumulated, secreted).
  • the medium used for the cultivation various types of media commonly used depending on the host cells used can be appropriately selected and used, and the culturing can be carried out under conditions suitable for the growth of the host cells.
  • the recombinant protein of the present invention thus obtained may be subjected to various separation operations utilizing its physical properties, chemical properties, and the like [“Biochemical Data Book II”, pp. 1175-1259, 1st edition, 1st edition, if desired. Press, June 23, 1980, published by Tokyo Chemical Co., Ltd .; Biochemi stry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.] Separated from ⁇ Z , Can be purified.
  • Examples of the method include ordinary reconstitution treatment, treatment with a protein precipitant (salting out method), centrifugation, osmotic shock method, ultrasonic crushing, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration ), Adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), etc., various liquid chromatography, dialysis, and combinations thereof.
  • Examples include affinity chromatography using a column to which a specific antibody against the protein of the present invention is bound.
  • the nucleotide sequence of the GFAT1L gene shown in SEQ ID NO: 2 can be favorably used. The remains as the gene, if necessary, codons indicating each amino acid residue can be appropriately selected and changed.
  • the protein of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method according to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the method includes a method for synthesizing a peptide by a usual liquid phase method and a solid phase method.
  • such a peptide synthesis method is a so-called stepwise gelation method in which amino acids are sequentially linked one by one based on amino acid sequence information to extend the chain, and a fragment comprising several amino acids. And a fragment condensation method in which each fragment is then subjected to a coupling reaction.
  • the synthesis of the protein of the present invention may be carried out by any of these methods.
  • the condensation method employed in the above peptide synthesis can also be in accordance with a conventional method, for example, an azide method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a redox method, a DPPA (diphenyl phosphoryl azide) method, DCC + additives (eg, 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norpolene-2,3-dicarboxyimide), the Woodward method, and the like.
  • the solvent that can be used in each of these methods can also be appropriately selected from well-known general ones used in this kind of peptide condensation reaction.
  • Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMS0), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and a mixed solvent thereof.
  • DMF dimethylformamide
  • DMS0 dimethylsulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • ethyl acetate examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMS0), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and a mixed solvent thereof.
  • the hydroxyl group in the amino acid or peptide not involved in the reaction is generally converted into a lower alkyl ester such as a methyl ester, an ethyl ester, and a tertiary butyl ester by esterification, for example, a benzyl ester, It can be protected as an aralkyl ester such as methoxybenzyl ester and p_nitrobenzyl ester.
  • Amino acids having a functional group on the side chain for example, the hydroxyl group of a tyrosine residue are It may be protected with a tyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary butyl group, etc., but such protection is not necessarily required.
  • the guanidino group of an arginine residue includes a nitro group, a tosyl group, a p-methoxybenzenesulfonyl group, a methylene-12-sulfonyl group, a benzyloxycarbonyl group, an isoporyloxycarbonyl group, and an adamantyl. It can be protected by a suitable protecting group such as an oxycarbonyl group.
  • the deprotection reaction of these protecting groups in the amino acids and peptides having the above protecting groups and the finally obtained protein of the present invention can also be carried out by commonly used methods such as catalytic reduction method, liquid ammonia / sodium, hydrogen fluoride, bromide, etc. It can be carried out according to a method using hydrogen, hydrogen chloride, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid, methanesulfonic acid and the like.
  • the protein of the present invention thus obtained is appropriately purified according to the above-mentioned various methods, for example, a method widely used in the field of peptide chemistry such as ion-exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, and countercurrent partition method. It can be carried out.
  • a method widely used in the field of peptide chemistry such as ion-exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, and countercurrent partition method. It can be carried out.
  • the protein of the present invention can also be suitably used as an immunizing antigen for preparing its specific antibody.
  • desired antisera polyclonal antibody
  • monoclonal antibody monoclonal antibody
  • the antibody thus obtained can be advantageously used, for example, for purification of GFAT 1 L protein and its measurement or identification by immunological techniques. More specifically, since the expression of the gene of the present invention has been confirmed in skeletal muscle and heart tissues, the antibody can be used to measure the concentration of GFAT in these tissues. Also, a medicament containing the antibody as an active ingredient is useful as a therapeutic or preventive agent for diseases such as diabetes and diabetic complications.
  • the protein of the present invention obtained as described above is useful in the pharmaceutical field as a drug containing the protein as an active ingredient. Therefore, the present invention also provides a pharmaceutical composition containing the protein as an active ingredient.
  • the usefulness of the protein of the present invention as a medicament is to promote GFAT activity of a polypeptide specific to skeletal muscle, which is an important tissue, or to promote hypoglycemic amelioration in sugar metabolism.
  • the method for confirming these activities is described in, for example, the method of Marshal et al. (Marshal, J. Biol. Chem., 266 (8), 4706-4712 (1991)) described in Examples below. It can be implemented according to.
  • the co-enzyme APAD is simultaneously reduced to APADH when the glutamic acid produced by GFAT is further reacted with glutamate dehydrogenase (GDH).
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • the change in absorbance associated with the reduction reaction is measured as GFAT activity.
  • a 96-well microplate was used, and 200 1 substrate solution (40 M sodium phosphate buf fer, pH 7.5, 50 mM KCK 1.25 mM EDTA, 0.3 mM APAD, 6 U per ml (GDH), 0-6 mM Glutamine, 0-6 mM Fructose-6-P (F6P)), add the soluble fraction 50 ⁇ 1 of 1 L GFAT E. coli lysate, and add 37 ° Reaction at 60 ° C for 60 minutes, and the change in absorbance at 365 nm at this time is measured by a spectrophotometer using a microplate reader.
  • 200 1 substrate solution 40 M sodium phosphate buf fer, pH 7.5, 50 mM KCK 1.25 mM EDTA, 0.3 mM APAD, 6 U per ml (GDH), 0-6 mM Glutamine, 0-6 mM Fructose-6-P (F6P)
  • the protein of the present invention as an active ingredient in a pharmaceutical composition also includes a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Such salts include, for example, alkali metal salts such as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, barium, ammonium, alkaline earth metal salts, ammonium salts and the like, prepared by methods well known in the art. Further, the above salts also include acid addition salts obtained by reacting the protein of the present invention with a suitable organic or inorganic acid.
  • Representative acid addition salts include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, bisulfate, acetate, oxalate, valerate, oleate, phosphate, borate, benzoate , Lactate, phosphate, p-toluenesulfonate (tosylate), citrate, maleate, fumarate, succinate, tartar Acid salts, sulfonates, glycolates, maleates, ascorbates, zensulphonates, napsylates and the like.
  • compositions include those containing the protein of the present invention as an active ingredient and a pharmaceutically effective amount thereof together with a suitable pharmaceutical carrier or diluent.
  • Pharmaceutical carriers that can be used in the above pharmaceutical composition include fillers, bulking agents, binders, humectants, disintegrants, surfactants, and lubricants that are usually used depending on the use form of the formulation.
  • diluents or excipients such as preparations can be exemplified, and these are appropriately selected and used according to the dosage unit form of the obtained preparation.
  • Particularly preferred pharmaceutical preparations of the present invention include various components which can be used in ordinary protein preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH regulators, surfactants It is prepared by using such as appropriate.
  • the stabilizer examples include human serum albumin, ordinary L-amino acids, saccharides, cellulose derivatives, and the like.These can be used alone or in combination with each other, and further can be used in combination with a surfactant or the like. . According to this combination, there are cases where the stability of the active ingredient can be further improved.
  • the L_amino acid is not particularly limited and may be, for example, any of glycine, cysteine, daltamic acid and the like.
  • sugars there is no particular limitation on the above-mentioned sugars, and for example, monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, dextran, hydroxypropyl starch And polysaccharides such as chondroitin sulfate and hyaluronic acid, and derivatives thereof.
  • monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose
  • sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol
  • disaccharides such as sucrose, maltose and lactose
  • dextran hydroxypropyl starch
  • polysaccharides such as chondroitin sulfate and hyaluronic acid, and derivatives thereof.
  • the surfactant is not particularly limited, and both ionic and nonionic surfactants can be used.
  • ionic and nonionic surfactants can be used.
  • polyoxyethylene dalicol sorbine alkyl ester type polyoxyethylene alkyl ether type
  • polyoxyethylene alkyl ether type polyoxyethylene alkyl ether type
  • Steroids and fatty acid glycerides can be used.
  • cellulose derivative methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and the like can be used.
  • the amount of the saccharide to be added is about 0.001 mg or more per active ingredient, preferably about 0.01 to 10 mg.
  • the amount of the surfactant to be added is about 0.000 mg or more per active ingredient 12, preferably about 0.0001 to 0.1 mg.
  • the amount of human serum albumin to be added is about 0.001 mg or more per gram of the active ingredient, and preferably about 0.001 to 0.1 mg.
  • the amount of amino acid is about 0.001 to 10 mg per gram of the active ingredient.
  • the amount of the cell mouth derivative added is about 0.000 mg or more, preferably about 0.001 to 0.1 mg per 1 g of the active ingredient.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation of the present invention is appropriately selected from a wide range, and is usually about 0.0001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight. It is.
  • various additives such as a buffer, an isotonic agent, a chelating agent and the like can be added to the pharmaceutical preparation of the present invention.
  • a buffer boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ⁇ -aminocaproic acid, glutamic acid and / or a salt thereof (for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, etc.)
  • Alkali metal salts such as salts and alkaline earth metal salts.
  • the isotonic agent include sodium chloride, potassium chloride, saccharides, glycerin and the like.
  • the chelating agent include sodium edetate and citric acid.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be used not only as a solution preparation, but also by lyophilizing it to make it storable, dissolving it in a buffer solution containing water for use, a saline solution, or the like, at an appropriate concentration. It is also possible to use it after preparing it.
  • a buffer solution containing water for use a saline solution, or the like, at an appropriate concentration. It is also possible to use it after preparing it.
  • various forms can be selected according to the purpose of treatment, and typical examples are tablets, pills, powders, powders, granules, capsules and the like.
  • Liquid dosage forms such as solid dosage forms, solutions, suspensions, emulsions, syrups, elixirs, etc., depending on the route of administration, and further include oral preparations, parenteral preparations, nasal preparations, vaginal preparations, and suppositories. , Sublingual preparations, ointments and the like, and can be prepared, molded or prepared according to the usual methods.
  • excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, caic acid, potassium phosphate, and water
  • Binders such as ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, propyloxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, low substitution degree Disintegrators such as hydroxypropylcellulose, dried starch, sodium alginate, powdered agar, powdered laminar, sodium hydrogencarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fat
  • Surfactants such as acid esters, sodium lauryl sulfate, and monoglyceride stearate; crushing inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa batata, and hydrogenated oil;
  • the tablets may be tablets coated with a usual coating, if necessary, such as sugar-coated tablets, gelatin-coated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, or double tablets or multilayer tablets.
  • pharmaceutical carriers such as excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, and talc; Powder, tragacanth powder, binders such as gelatin and ethanol, and disintegrants such as laminaran and agar can be used.
  • Capsules are usually prepared by mixing the active ingredient of the present invention with the various pharmaceutical carriers exemplified above and filling the mixture into hard gelatin capsules, soft capsules, and the like according to a conventional method.
  • Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable solutions including conventional inert diluents such as water, emulsions, suspensions, syrups, elixirs, and the like, as well as humectants, emulsions, suspensions and the like.
  • An auxiliary agent such as a turbidity agent can be contained, and these are prepared according to a conventional method.
  • liquid dosage forms for parenteral administration such as sterile aqueous to non-aqueous solutions, emulsions and suspensions
  • diluents such as water, ethyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, ethoxylated isostearyl
  • Vegetable oils such as alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, and olive oil
  • injectable organic esters such as ethyl oleate can be blended.
  • these may further contain ordinary solubilizers, buffers, wetting agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, dispersants, and the like.
  • Sterilization can be performed by, for example, a filtration operation through a bacteria-retaining filter, a disinfectant combination, irradiation treatment, and heat treatment. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions which can be dissolved in sterile water or a suitable sterilizable medium immediately before use.
  • polyethylene glycol for example, polyethylene glycol, cocoa butter, higher alcohols, esters of higher alcohols, gelatin, semisynthetic dalyceride and the like can be used as preparation carriers.
  • ointments such as pastes, creams and gels
  • diluents such as white petrolatum, paraffin, glycerin, cellulose derivatives, propylene glycol, polyethylene glycol, silicone, bentonite, and oil Vegetable oils such as oil oil can be used.
  • composition for nasal or sublingual administration can be prepared according to a conventional method using well-known standard excipients.
  • the drug of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals, if necessary.
  • the administration method of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, gender and other conditions, degree of disease, and the like.
  • tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules and capsules are administered orally, injections are administered intravenously alone or in admixture with normal replenishers such as glucose and amino acids.
  • Intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally, suppositories are administered rectally, vaginal agents are administered intravaginally, nasal agents are administered intranasally, and sublingual agents are administered orally Ointments are topically administered transdermally.
  • the amount of the active ingredient to be contained in the medicament and the dose thereof are not particularly limited, and may vary widely depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. More appropriately selected. In general, the dose is usually about 0.01 to 10 mg, preferably about 0.1 to 1 mg per kg of human body weight per day. Can be administered once or several times a day.
  • the gene of the present invention since the expression of the gene of the present invention has been observed in skeletal muscle and heart tissues, all or one of the antisense DNAs of the GFAT1L gene of the present invention has been confirmed.
  • Part of the gene expression vector, and the expression vector is forcibly generated in these skeletal muscle tissues by creating an RNA having a sequence complementary to the intracellular mRNA and inhibiting translation.
  • the gene of the present invention can be used as a composition for gene therapy having such an antidiabetic action or as a gene therapy agent.
  • Another object of the present invention is to provide a vector for gene therapy containing all or a part of the GFAT 1 L gene, and a medicament containing, as an active ingredient, a cell into which the GFAT 1 L gene has been introduced using the vector. .
  • a vector for gene therapy containing a GFAT1L antisense gene containing all or a part of the antisense DNA sequence having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 is provided.
  • a cell into which the GFAT1L antisense gene has been introduced by the vector, and a gene therapy agent comprising, as an active ingredient, the gene therapy transfer vector and the cell into which the GFAT1L antisense gene has been introduced by the vector. Is provided.
  • a vector for gene therapy introduction containing a GFAT 1 L antisense gene containing all or a part of the antisense DNA sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and GFAT
  • 1L antisense gene-transfected cells to skeletal muscle cells of diabetic patients or muscle tissue sites of patients improves glucose metabolism in these tissues, thereby suppressing the development of diabetes or improving glucose metabolism in patients with diabetes.
  • An antidiabetic agent characterized by improvement can be provided.
  • a medicine containing, as an active ingredient, a viral vector for gene therapy introduction containing the GFAT 1 L antisense gene, in particular, a treatment for improving glucose metabolism in skeletal muscle and the like.
  • the medicament used for is provided.
  • the present invention provides an antisense for producing RNA having a sequence complementary to intracellular mRNA in a cell expressing the gene of the present invention, inhibiting translation and suppressing expression of the GFAT1L gene. It is intended to provide a gene therapy method for suppressing GFAT activity or suppressing an increase in blood glucose by providing a medicine.
  • the therapy involves, for example, binding to the native mRNA of a GFAT-expressing cell having the GFAT1L gene, or by intercalating between DNA duplexes to form a triplex, thereby regulating the process of transcription or translation.
  • This is a method of suppressing the expression of a target gene by inhibiting the target gene.
  • This method can be considered as a method for producing an antisense oligonucleotide complementary to a gene mRNA and supplying the antisense oligonucleotide to a target cell.
  • the recipient cell By providing such an action of suppressing the expression function of the G F AT 1 L gene, the recipient cell
  • the antisense oligonucleotide is incorporated into a vector derived from a retrovirus, an adenovirus or an AAV, and the vector is infected with GFAT activity-expressing cells.
  • a desired hypoglycemic effect can be obtained.
  • the antisense oligonucleotide When the antisense oligonucleotide is introduced into cells having the GFAT 1 L gene to suppress the expression of the GFAT 1 L protein, the antisense oligonucleotide corresponds to the full length of the corresponding GFAT 1 L gene. It is not necessary that the modified product retains a specific function even if it is a variant as long as it retains a function substantially equivalent to the function of suppressing the expression function of the GFAT 1 L gene. A gene consisting of a partial sequence can also be used.
  • Vectors for the introduction of the desired gene for both recombination and extrachromosomal maintenance are already known in the art, and any of the known vectors can be used in the present invention.
  • a viral vector or a plasmid vector containing a copy of the antisense oligonucleotide of GFAT 1 L linked to an expression control element and capable of expressing the antisense oligonucleotide product in a target cell can be mentioned.
  • the above-mentioned expression vector can be usually used, but preferably, for example, disclosed as a source vector in U.S. Patent No. 5,252,479 and PCT International Publication WO 93/07282.
  • pWP-7A pwP-19, pWU-1, pWP-8A, pWP-21 and / or pRSVL
  • pR C / CMV Invitrogen
  • a promoter used in a vector used in gene transfer therapy a promoter specific to an affected tissue to be treated for various diseases is preferably used. Can be.
  • Atrial sodium diuretic hormone for skeletal muscle, skeletal muscle actin, myosin heavy chain, creatine kinase, and the like.
  • atrial sodium diuretic hormone for the heart, there may be exemplified atrial sodium diuretic hormone, Ventricle-specific myosine light chain, Atrial- and ventricular-specific myo- heavy chain, and the like.
  • examples include albumin, hyphen protein, ⁇ 1-antitrypsin, transferrin, and transstyrene.
  • carboxylate anhydrase I, carcinoembrogen antigen and the like can be exemplified.
  • estrogen, aromase cytochrome P450, cholesterol side chain cleavage P450, 17alpha monohydroxylase P450 and the like can be exemplified.
  • prostate antigen for the prostate, prostate antigen, gp911-fox gene, prostate-specific kallikrein and the like can be exemplified.
  • breast examples include erb-B2, erb-B3, 6-casein, ⁇ -lactoglopine, milk and protein.
  • the activator protein C-globulin can be exemplified.
  • skin 1-141-keratin, human keratin 1 or 6, leucrin and the like can be exemplified.
  • glial fibrillary acidic protein mature astrocyte specific protein, myelin basic protein, tyrosine hydroxylase and the like can be exemplified.
  • villin, glucagon, Langerhans amyloid polypeptide, amylase, PAP1 and the like can be exemplified.
  • thyroglobulin, calcitonin and the like can be exemplified.
  • bone include collagen 1, osteocalcin, bone sialoglycoprotein, and the like.
  • renin, liver, bone, kidney, kidney phosphatase, erythropoietin and the like can be exemplified.
  • the introduced antisense oligonucleotide (all or a part of the complementary sequence corresponding to the GFAT1L gene sequence) is determined based on the nucleotide sequence information of the gene of the present invention. As described above, it can be easily produced and obtained by a general genetic engineering technique.
  • the introduction of such antisense-oligonucleotide-introducing vectors into cells is already known in the art for introducing DNA into cells, including, for example, electroporation, calcium phosphate co-precipitation, and virus transduction. It can be performed according to various methods.
  • Cells transformed with the antisense oligonucleotide of the GFAT 1 L gene can be used as a drug for suppressing the increase in GFAT activity or blood glucose in an isolated state, or as a model system for therapeutic research. It is also possible to use it.
  • the antisense oligonucleotide introduction vector described above can be introduced into a patient's target cells by local or systemic injection into the target tissue site of the patient. it can. At this time, by systemic administration, it is possible to reach any other cell capable of expressing GFA TmRNA at other sites. If the transduced gene is not permanently incorporated into the chromosome of each target cell, the administration may be repeated periodically.
  • the gene therapy method of the present invention includes an in vivo method in which the material for introducing an antisense oligonucleotide (the vector for introducing an antisense oligonucleotide) described above is directly injected into the body. It includes both the ex vivo method, in which the target cell is once removed, the gene is introduced outside the body, and the cell is then returned to the body.
  • the gene therapy agent of the present invention containing the introduced cells as an active ingredient is particularly intended for the use of diabetes, but the above-described gene therapy (treatment) is not limited to diabetes. It can also be used for the treatment of diabetic complications such as sexual neuropathy, diabetic nephropathy and diabetic retinopathy, and for gene labeling.
  • target cells include cells in which GFAT expression is observed, particularly skeletal muscle and heart tissue, as well as lymphocytes, fibroblasts, hepatocytes, hematopoietic stem cells, and the like.
  • the method of introducing antisense oligonucleotides in the above gene therapy includes a viral introduction method and a non-viral introduction method.
  • virus vectors include adenovirus vectors, HIV (human immunodeficiency virus) vectors, adeno-associated virus (AAV), herpes virus vectors, and simple virus (HSV).
  • V Vector, EBV, Epstein-Barr virus vector.
  • Non-viral gene transfer methods include calcium phosphate coprecipitation; fusion of DNA-encapsulated liposomes with inactivated Sendai virus whose genes have been previously disrupted by ultraviolet light to form membrane-fused ribosomes, which are directly fused with cell membranes. Fusion ribosome method in which DNA is introduced into cells by the method [Kato, K., et al., J. Biol. Chem., 266.22]
  • the ligand-DNA complex method includes, for example, a method using ashi oral glycoprotein as a ligand targeting ashi oral glycoprotein receptor expressed by hepatocytes [Wu, et al., J. Biol. Chem., 266 ⁇ 14338 ( 1991); Ferkol, et al., FASEB J., 7, 108 1-1091 (1993)], and a method using transferrin as a ligand targeting transferrin receptor strongly expressed in target cells [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)].
  • the gene transfer method used in the present invention may be a combination of various biological and physical gene transfer methods as described above.
  • An example of the method by the combination is a method of combining a plasmid DNA of a certain size with a polylysine-conjugated antibody specific to adenovirus / hexon protein.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be introduced by binding the obtained complex to an adenovirus vector and infecting the cell with the thus obtained trimolecular complex. This method allows for efficient binding, internalization, and endosomal degradation before DNA coupled to the adenovirus vector is damaged.
  • the ribosome ZDNA complex can mediate gene transfer directly in vivo.
  • the retroviral vector system consists of a viral vector and a helper cell.
  • Packaging cells express genes such as the retroviral structural protein g ag (the structural protein in the viral particle), po 1 (reverse transcriptase), and en V (the coat protein) in advance.
  • a cell that does not produce virus vectors have packaging signals and LTRs (long terminal repeats), but do not have structural genes such as gag, pol, and env necessary for virus replication.
  • the packaging signal is a sequence that serves as a tag during assembly of the virus particles. It corresponds to the selected gene (neo, hyg) and the desired introduced antisense oligonucleotide (GFAT-1L) incorporated into the cloning site.
  • All antisense oligonucleotides or fragments thereof) are inserted in place of the viral genes.
  • the insert should be as short as possible, and the packaging signal should be wide, including a part of the gag gene: To avoid leaving the ATG of the gg gene is important.
  • the vector genome RNA is packaged with the virus structural protein produced by the helper cell. Virus particles are formed and secreted. After the virus particles as recombinant viruses infect target cells, the DNA reverse-transcribed from the viral genome RNA is integrated into the cell nucleus, and the antisense gene inserted into the vector is expressed.
  • a method for increasing the gene transfer efficiency a method using a fragment containing a cell adhesion domain of fibronectin, a heparin binding site and a junction segment is used.
  • a retrovirus originating from murine leukemia virus [McLadilin, J., et al., Proc. Nail. Acad. Res. Mole Biol., 38 -91-135 (1990)].
  • the method of using the adenovirus vector will be described in detail. The construction of the adenovirus vector is performed by the method described in Berkner, KL, Curr. Topics Microbiol.
  • the E1 and Z or E3 gene regions of the adenovirus early gene are first removed.
  • the desired exogenous gene expression unit antisense oligonucleotide for introduction, ie, the antisense oligonucleotide of the GFAT1L gene of the present invention, which is used to transcribe the antisense oligonucleotide.
  • a plasmid vector containing a promoter, a portion of adenovirus genomic DNA and a plasmid containing the adenovirus genome, and a plasmid containing the adenovirus genome are simultaneously transfected into, for example, 293 cells. I do.
  • a non-proliferative adenovirus which is a vector containing the antisense oligonucleotide of the desired GFAT 1 L gene Vectors can be created.
  • an adenovirus genome DNA can be incorporated into a cosmid vector to prepare a 3 'adenovirus vector to which a terminal protein has been added.
  • a YAC vector can also be used to construct a recombinant adenovirus vector.
  • AAV adeno-associated virus
  • the ITR is also essential for packaging the host cell into virus particles and for incorporation into the chromosome DNA of the host cell.
  • the left half of the genome encodes a nonstructural protein, ie, Rep, a regulatory protein that controls replication and transcription.
  • Recombinant AAV can be prepared by utilizing the property of AAV being integrated into chromosome DNA, and thus a desired gene transfer vector can be prepared. More specifically, this method first leaves the ITRs at both the 5 'and 3' ends of the wild-type AAV and inserts the desired antisense oligonucleotide for introduction (the antisense oligonucleotide of the GFAT1L gene) between them. Create the inserted plasmid (AAV vector plasmid). On the other hand, a virus protein required for virus replication and virus particle formation is supplied by another helper plasmid. It is necessary to ensure that there is no common base sequence between the two and that no wild-type virus is produced by genetic recombination.
  • both plasmids are introduced by transfection into, for example, 293 cells, and further infected with an adenovirus (if 293 cells are used, a non-proliferative one may be used) as a helper virus.
  • the desired recombinant AAV is produced.
  • the cells are recovered by freezing and thawing, and the contaminating adenovirus is inactivated by heating at 56 ° C. If necessary, the recombinant AAV is separated and concentrated by ultracentrifugation using cesium chloride. As described above, a desired recombinant AV for gene introduction can be obtained.
  • the EBV vector can be produced, for example, according to the method of Shimizu et al. [Norio Shimizu et al., Cell Engineering, 14 (3), 280-287 (1995)].
  • Epstein-Barr virus was introduced in 1964 in Epps-Barr virus.
  • the EBV genome near the target DNA into which the desired foreign gene is to be integrated is cloned.
  • the DNA fragment of the exogenous gene and the drug resistance gene are then inserted into the vector to produce a recombinant virus.
  • the vector for producing a recombinant virus cut out with an appropriate restriction enzyme is transfected into EBV-positive Akata cells. Recombinant virus generated by homologous recombination can be recovered together with wild-type Akat aEBV by stimulating virus production by anti-surface immunoglobulin treatment.
  • non-viral vector in which a desired antisense oligonucleotide is introduced into a target cell without using a recombinant virus vector can be performed, for example, by a gene transfer method using a membrane fusion liposome. This is a membrane ribosome
  • Introduction of the antisense oligonucleotide by the membrane fusion ribosome can be performed, for example, by the method of Nakanishi et al. [Nakanishi, M., et al., Exp. Cell.
  • the contents of the ribosome are introduced into the cells, and the desired antisense oligonucleotide can be introduced into the target cells.
  • the lipid used as the ribosome is preferably 50% (molar ratio) cholesterol, lecithin and a synthetic phospholipid having a negative charge, and a monolayer ribosome having a diameter of 300 nm is preferably used.
  • a method for introducing an antisense oligonucleotide into a target cell using another ribosome a method for introducing an antisense oligonucleotide using a cationic ribosome can be exemplified.
  • This method can be performed according to the method of Yagi et al., CYagi. K., et al., II. III. RC, Week, 1042-1048 (1993)].
  • This method focuses on the fact that both the plasmid and the cell are negatively charged, giving a positive charge to both the inner and outer surfaces of the ribosome membrane, increasing plasmid uptake by static electricity and enhancing interaction with the cell. It is assumed that.
  • the ribosomes used here are positively charged multilamellar large vesicles (MLV), but large unilamellar ribosomes (LUV) and It is also possible to create a complex with a plasmid using small unilamellar ribosomes (SUVs) to introduce the desired antisense oligonucleotide.
  • the method of preparing plasmid-embedded catholic ML V is summarized as follows. Prepare a black-mouthed form solution (ImM as lipid concentration) containing a ratio of 1: 2: 2.
  • a total of 1 mol of fat is put into a Spitz-type test tube, and the form of the mouth is removed under reduced pressure using a rotary evaporator to prepare a lipid thin film. Further, the form at the mouth is completely removed under reduced pressure and dried. Then, add 0.5 ml of Dulbecco's phosphate buffered saline containing Mg and Ca containing 20 zg of the gene transfer plasmid, replace with nitrogen gas, and stir with a Portex mixer for 2 minutes after replacing with nitrogen gas. A plasmid-embedded Cationic MLV suspension containing sense oligonucleotides can be obtained.
  • an expression plasmid incorporating an antisense oligonucleotide for expression is added to the above-mentioned catonic MLV at a DNA amount of 0.6 g and a liposome.
  • a method of embedding so as to have a lipid content of 30 nmol, suspending the suspension in 21 phosphate buffered saline, and administering to target cells or patient tissues extracted from a patient every other day can be exemplified.
  • gene therapy is defined in the Ministry of Health and Welfare guidelines as "administering a gene or a cell into which a gene is introduced into a human body for the purpose of treating a disease".
  • the gene therapy according to the present invention means, in addition to the definition of the guidelines, diabetes by introducing an antisense oligonucleotide of the GFAT1L gene, which is characterized as a GFAT expression-suppressing antisense DNA, into the target cells described above. This includes not only the treatment of diabetic complications but also the introduction of a marker gene or cells into which a gene as a marker has been introduced into the human body.
  • introduction of a desired gene into a target cell or target tissue typically include two types of methods.
  • the first method involves directly infecting a patient's target cell or tissue with a viral vector, such as an adenovirus vector, into which the desired antisense oligonucleotide (the antisense oligonucleotide of the GFAT1L gene) has been introduced.
  • a viral vector such as an adenovirus vector
  • a virus vector containing the target antisense oligonucleotide antisense oligonucleotide of the GFAT 1L gene
  • An ex vivo method in which a target antisense oligonucleotide is introduced into cells derived from a subject and transplanted into a patient can also be employed.
  • the antisense oligonucleotide (antisense oligonucleotide of the GFAT 1L gene) incorporated into the appropriate animal cell expression vector plasmid DNA is directly targeted to the patient's body or skeletal muscle.
  • This is a direct gene transfer method (direct method) in which the gene is injected into the site. This can be performed by, for example, the HVJ ribosome method, the cationic ribosome method, the direct DNA injection method, the electroporation method, the gene gun method, and the like.
  • the target antisense oligonucleotide antisense oligonucleotide of the GFAT1L gene
  • the target antisense oligonucleotide antisense oligonucleotide of the GFAT1L gene
  • Specific activity that is the desired therapeutic effect based on cDNA search by PCR, in situ PCR, or the introduction of the desired antisense oligonucleotide (antisense oligonucleotide of GFAT 1L gene). It is desirable to confirm the increase or decrease of the protein and its effect on target cells.
  • the present invention also provides, as an active ingredient, a cell into which the antisense-oligonucleotide-introducing vector or the target antisense-oligonucleotide of the present invention (the antisense-oligonucleotide of the GFAT1L gene) has been introduced.
  • a pharmaceutical composition or a pharmaceutical preparation (gene therapeutic agent) containing a pharmaceutically effective amount and an appropriate nontoxic pharmaceutical carrier or diluent.
  • Pharmaceutical carriers that can be used in the pharmaceutical composition (pharmaceutical formulation) of the present invention include fillers, bulking agents, binders, humectants, disintegrants, surfactants, which are usually used according to the use form of the formulation. Diluents and excipients such as lubricants can be exemplified, and these can be appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the obtained product.
  • the preparation examples of the above-mentioned GFAT1L protein antibody preparation can be mentioned in the same manner, and it can be appropriately selected from various forms according to the purpose of treatment.
  • a pharmaceutical preparation containing the antisense oligonucleotide introduction vector of the present invention includes a vector in which the vector is embedded in a liposome or a virus vector containing a desired antisense oligonucleotide. Prepared in the form of cultured cells infected by the virus.
  • PH 7.4 phosphate buffered saline
  • Ringer's solution injection for intracellular composition, etc.
  • the administration method of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, gender and other conditions, degree of disease, and the like.
  • the amount of the active ingredient to be contained in the above pharmaceutical preparation and the dose thereof are not particularly limited, and may vary widely depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, gender and other conditions. It is appropriately selected.
  • the preparation may be administered once or several times a day, or may be administered intermittently at intervals of one to several weeks.
  • gene transfer such as prominin is used. It can be co-administered with a substance that enhances entry efficiency or a preparation containing the same.
  • the gene therapy according to the present invention When the gene therapy according to the present invention is applied to the treatment of diabetes, the above-described various gene therapies can be appropriately combined (combined gene therapy). Therapy can be used in combination. Furthermore, the gene therapy of the present invention, including its safety, can be performed with reference to the NIH guidelines, Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)].
  • a biological sample such as blood or serum is prepared, nucleic acids are extracted if desired, and GFAT1L It is possible to analyze for the presence or absence of a susceptibility gene.
  • a biological method having hexosamine biosynthesis pathway dysregulation is required.
  • a sample may be prepared and analyzed for the presence of the GFAT 1 L gene or for the amount of its mRNA.
  • this method it is possible to detect the level of GFAT activity in cells or tissues, the expression level of GFAT mRNA, progression to dysregulation of the hexosamine biosynthesis pathway, or as a prognostic indicator. For example, it is possible to diagnose diabetes, determine the therapeutic effect of diabetes, and predict prognosis.
  • the detection method is, for example, obtained from a patient sample having GFAT activity in advance.
  • the DNA fragment is designed based on the information about the GFAT1L gene and used for screening and / or amplifying the GFAT1L gene. More specifically, for example, those having a property as a probe in plaque hybridization, colony hybridization, southern blotting, northern blotting, etc., and polymerase chain reaction (Amplification of nucleic acid sequence by polymerase) PCR), all or part of the amplified GFAT 1 L DNA fragment
  • a probe having properties as a probe to be obtained can be prepared. For this purpose, first, a primer having the same sequence as that of GFAT 1 L is prepared, used as a screening probe, and reacted with a biological sample (nucleic acid sample) to thereby obtain the GFAT 1 L sequence. The presence of the gene can be confirmed.
  • the nucleic acid sample may be prepared by various methods that facilitate detection of the target sequence, for example, denaturation, restriction digestion, electrophoresis or dot blotting.
  • a PCR method from the viewpoint of sensitivity.
  • the method is not particularly limited as long as the method uses a GFAT 1 L fragment as a primer. , Base, 1350-1354 (1985)) and a newly developed or future modified PCR method (Yoshiyuki Sakaki, et al., Yodosha, Experimental Medicine, extra edition, 8 (9) (1990); Protein ⁇ Nucleic acids ⁇ Enzymes, extra editions, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 35 (17) (1990)).
  • the DNA fragment used as a primer is a chemically synthesized oligo DNA, and the synthesis of these oligo DNA is performed by an automatic DNA synthesizer or the like, for example, a DNA synthesizer.
  • the length of the synthesized primer is preferably about 10 to 50 nucleotides, more preferably about 1 to 50 nucleotides.
  • the probe used for the above screening is usually a labeled probe, but may be unlabeled, or may be detected directly or indirectly by specific binding to a labeled ligand.
  • Suitable labels, and methods for labeling probes and ligands are known in the art and can be incorporated by known methods, such as nick'translation, random priming dam or kinase treatment. Radiolabels, biotin, fluorescent groups, chemiluminescent groups, enzymes, antibodies and the like are included in these technologies.
  • a PCR method used for detection for example, an RT_PCR method is exemplified, and various modified methods used in the art can be applied.
  • the measurement method of the present invention can be easily carried out by using a reagent kit for detecting a G FAT1 L gene in a sample.
  • the present invention provides a reagent kit for detecting GFAT1L, which comprises the above GFAT1L DNA fragment.
  • the reagent kit may contain at least a DNA fragment that hybridizes to at least a part or all of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or its complementary nucleotide sequence as an essential component, and as another component, a labeling agent
  • reagents essential for the PCR method for example, TaQ DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate, primer, etc. may be contained.
  • the labeling agent examples include a chemically modified substance such as a radioisotope or a fluorescent substance, and the DNA fragment itself may be conjugated with the labeling agent in advance.
  • the reagent kit may include a reaction diluent, a standard antibody, a buffer, a detergent, a reaction stop solution, etc., which are suitable for the convenience of performing the measurement.
  • the present invention also provides a method for diagnosing a disorder of sugar metabolism, particularly a disorder of hexosamine biosynthesis, using the above-mentioned measuring method, a diagnostic agent and a diagnostic kit used for the method.
  • the GFAT 1 L sequence obtained from the test sample is directly or indirectly sequenced to obtain a new homolog that is highly homologous to wild-type GFAT 1 L.
  • Related genes related to various GFAT 1 L genes can be found.
  • the present invention also provides a method for screening for a related gene related to the human GFAT 1 L gene in a test sample by such measurement and sequencing of GFAT 1 L DNA in the test sample.
  • the gene encoded by the human GFAT1 L gene represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention A polypeptide from the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, or an antibody against the polypeptide.
  • the synthesis allows measurement of wild-type G FAT 1L and Z or mutant G FAT 1L.
  • the present invention provides a method for assaying an antibody and an antigen of wild-type GFAT 1 L and / or mutant GFAT 1 L.
  • the degree of GFAT activity the degree of glycemic control disorder, the degree of dysfunction of the hexosamine biosynthetic pathway or the severity of diabetes, diabetic complications such as diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, etc.
  • an antibody polyclonal or monoclonal antibody
  • the GFAT1L antibody is used to immunoprecipitate the GFAT1L protein from a solution containing a biological material sample collected from a human such as blood or serum, and to perform Western blotting of a polyacrylamide gel or React with GFAT 1 L polypeptide on an immunoblot.
  • GFAT 1 L antibodies can also detect GFAT 1 L polypeptide in paraffin or frozen tissue sections using immunohistochemical techniques. Since antibody production technology and purification technology are well known in the art, these technologies can be appropriately selected.
  • More preferred embodiments related to methods for detecting wild-type GFAT 1 L or mutants thereof include enzyme-linked immunosorbent assays (EL), including sandwich methods using monoclonal antibodies and Z or polyclonal antibodies.
  • EL enzyme-linked immunosorbent assays
  • ISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • IRMA immunoradiometric assay
  • a candidate compound for a drug inhibiting the GFAT activity of the present invention is screened.
  • an antibody against a GFAT 1 L gene expression product or a GFAT 1 L protein (hereinafter, also referred to as GFAT 1 L protein) or a fragment thereof, a test solution containing a candidate compound, GFAT 1 L protein or a partial peptide of GFAT 1 L protein is reacted competitively, and the ratio of labeled GFAT 1 L protein or GFAT 1 L protein partial peptide bound to the antibody is measured.
  • a screening method for quantifying GFAT 1 L protein or a partial peptide of GFAT 1 L protein in a test solution, which is a feature of the test solution, is also possible.
  • the labeling agent on the insolubilized carrier is reacted.
  • a method for quantifying GFAT 1 L protein or a partial peptide of GFAT 1 L protein in a test solution, which is characterized by measuring the activity, is also possible.
  • the GFAT 1 L protein or the partial peptide of the GFAT 1 L protein was contacted with the substrate and the GFAT 1 L protein or the GFAT 1 L protein partial peptide was contacted with the substrate and the test compound.
  • the GFAT 1 L protein or the partial peptide of the GFAT 1 L protein was contacted with the substrate and the test compound.
  • the substrate may be any substrate as long as it can serve as a substrate for the protein of the present invention or a partial peptide of the GFAT 1 L protein, and usually, fructose-16-phosphate and glutamine are used.
  • fructose-6-phosphate it is preferable to use radiolabeled (eg, 14C, 3H, etc.) fructose-6-phosphate.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, blood, etc., and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • these samples are prepared by suspending the protein of the present invention or a partial peptide of the GFAT 1 L protein in a buffer suitable for screening.
  • the buffer does not inhibit the binding of the protein of the present invention or a partial peptide of the G FAT 1 L protein to a substrate, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably about 6 to 8) or a tris-hydrochloride buffer. Anything is fine.
  • the GFAT activity of the protein of the present invention or the partial peptide of the GFAT 1 L protein is determined according to a known method, for example, the method of Marshall et al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 266, No. 8, 4706-4712, (1991)). Can be measured.
  • a 200 ⁇ l substrate solution 400 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 50 mM chloride, 1.25 mM EDTA, 0.3 mM APAD. 6 U / ml (GDH ), 0-6 mM glutamine, 0-6 mM fructose-6-phosphate (F-6-P)), add 50 l of GFAT 1 L E. coli lysate, and add 60 l at 37 ° C.
  • the reaction can be carried out by measuring the change in absorbance at 365 nm with a microplate reader at this time.
  • the above GFAT activity was measured by reacting glutamate (Glutamate) produced by GFAT with further Glutamate dehydrogenase (GDH), and simultaneously reducing APAD, a coenzyme that was induced to APADH.
  • GDH Glutamate dehydrogenase
  • the method of Smith et al. [Analytical Biochemistry, 98-478-480 (1979)] can be mentioned.
  • the method is performed, for example, as follows. First, 12 ⁇ fructos-6-phosphate, 5 / ⁇ glutamine and 0.2M phosphate buffer (p
  • a partial peptide of the protein of the present invention or GFAT 1 L protein is added, and the resulting solution is kept at 25 ° C for 30 minutes.
  • the 0. 5 M hydrochloric acid in the solution was added, allowed to react for 2 hours at 98 ° C, 2. 5% NaN0 2 and 12. 5% NH Add 40 3 SNH 2 and then add 0.25% 2-methyl-2-benzothiazolone. Then, by adding 0. 5% Fe C l 3, and the solution absorbance was measured at 650 nm, Darukosamin generated - quantifying 6-phosphate.
  • the method of selecting a drug candidate compound is, for example, that in each test, the GFAT activity in the case where the above-mentioned test compound is not added is about 20% or more as compared with the case where the above-mentioned test compound is added.
  • the inhibition is preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more
  • the test compound can be selected as a compound that inhibits the GFAT activity of the protein of the present invention or a partial peptide of GFAT 1 L protein. .
  • a screening kit for screening a candidate compound for a drug that inhibits the GFAT activity there can be provided a screening kit for screening a candidate compound for a drug that inhibits the GFAT activity.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention or a partial peptide of the GFAT 1 L protein as one of the components. Specific examples of the screening kit of the present invention are described below. >
  • GFAT 1 L preparation 50 GFAT 1 L E. coli lysate of the present invention (partial peptide of GFAT 1 L protein)
  • Buffer for measuring coenzyme 400 mM sodium phosphate buffer (pH7.5), 5 OmM potassium chloride, 1.25 mM EDTA, 0.3 mM APAD, 6 U / m 1 (GDH)
  • Substrate 0-6 mM fructose-6-phosphate, 0-6 mM glutamine For detection, measure the absorbance at 365 nm.
  • a 200 aI substrate solution 400 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 5 OmM potassium chloride, 1.25 mM
  • GFDTA 0.3 mM APAD, 6 U / m 1 (GDH), 0—6 mM gluta Min, 0-6 mM fructose-1-6-phosphate (F-6-P)), add 1 L of G FAT E. coli lysate 50 ⁇ 11 appropriately diluted, and react at 37 ° C for 60 minutes. The change in absorbance at 365 nm at this time is measured using a microplate reader.
  • Protein sample the protein of the present invention (partial peptide of G FAT 1 L protein) or a salt thereof
  • Substrate 12 nU fructose_6_phosphate, 5 ⁇ Glutamine For detection, measure the absorbance at 650 nm.
  • test compound was added to a reaction solution containing 12 M flux 1-6-phosphate, 5 M glutamine, the protein of the present invention or a salt thereof, and 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0). Then, keep at 25 ° C for 30 minutes. Add 0.5 M hydrochloric acid and hydrolyze at 98 ° C for 2 hours. And 2.5% N aN0 2 was added 12. 5% NH 4 0 3 SNH 2, then 0.25% 2-methyl - adding 2-base Nzochiazoro down. Then, after the addition of 0. 5% F e C l 3 , measuring the absorbance at 650 nm.
  • the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention may be a test compound (for example, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant) Extract, animal tissue extract, etc.) and a compound that inhibits the enzymatic activity (eg, GFAT activity) of the protein of the present invention (partial peptide of GFAT 1 L protein).
  • the compound may be a novel compound or a known compound.
  • the candidate compound for improving hypoglycemia is a compound that promotes the enzymatic activity (eg, GFAT activity) of the protein of the present invention (a partial peptide of the GFAT 1 L protein).
  • Salts of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and salts Examples thereof include salts with a group (eg, an alkali metal), and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic
  • the compound or its salt that inhibits the enzymatic activity of the protein of the present invention can be used, for example, as a medicament as a therapeutic or prophylactic agent for diabetes and diabetic complications.
  • a medicament as a therapeutic or prophylactic agent for diabetes and diabetic complications.
  • the compound or a salt thereof that promotes the enzymatic activity of the protein of the present invention is useful as a medicament as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as hypoglycemia and complications due to hypoglycemia.
  • a derivative of a GF AT1 L protein in a more active or stable form or, for example, a drug capable of enhancing or inhibiting the function of a GF AT 1 L protein in vivo is developed.
  • biologically active polypeptides or structural analogs for which they interact e.g., GFAT 1 L agonist, GF AT 1 L inhibitor, GF AT 1 L inhibitor, etc. It is possible to do.
  • the structural analog can be determined by, for example, X-ray crystallography, computer modeling, or a combination thereof, for the three-dimensional structure of a complex of GFAT1L and another protein.
  • information on the structure of a structural analog can be obtained by protein modeling based on the structure of a homologous protein.
  • each amino acid residue of a peptide is analyzed in this manner by substituting an amino acid residue with Ala and measuring its effect on the activity of the peptide. This is a method to determine the area that is important for qualification. By this method, a more active or stable derivative of the GFAT 1 L protein can be designed.
  • GFAT 1 L sequence With the cloned GFAT 1 L sequence, a sufficient amount of GFAT 1 L protein can be obtained for analytical studies such as X-ray crystallography. Furthermore, by providing the GFAT 1 L protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention, it is possible to adapt to computer-modeling technology instead of or in addition to X-ray crystallography.
  • any portion of the GFAT 1 L gene sequence Whether the activity is affected, that is, the function of the GFAT 1 L gene product and the modified GFAT 1 L gene product in vivo can be confirmed.
  • This method is a technique for intentionally modifying the genetic information of an organism by utilizing homologous recombination of a gene, and includes a method using mouse embryonic stem cells (ES cells).
  • ES cells mouse embryonic stem cells
  • the method for producing the above mutant mouse is a technique already used by those skilled in the art. Yes, the adaptation technology (Tetsuo Noda, ed., Experimental Medicine, extra edition, 14 (20) (1996), Yodosha) can be easily adapted to human wild-type G FAT 1 L gene and mutant G FAT 1 L gene. Mutant mice can be created. Therefore, by applying the above technology, it is possible to design and develop a drug having an improved GF ATIL activity or stability or an action as an inhibitor, agonist, or anginaist of GF AT1 L activity.
  • Example 1 Example 1
  • P1 corresponds to the nucleotide sequence of positions 34 to 66 of SEQ ID NO: 2.
  • P2 corresponds to the nucleotide sequence of positions 16 to 48 of SEQ ID NO: 2.
  • P3 corresponds to the nucleotide sequence at position 110 of SEQ ID NO: 2.
  • P4 corresponds to the nucleotide sequence of positions 2077 to 2097 of SEQ ID NO: 2.
  • P1 to P3 are forward primers, respectively, which are mutated in consideration of the codon usage of Escherichia coli in order to increase the expression efficiency in Escherichia coli.
  • P 1 nucleotides 6, 9, 12, 13, 15, 18 of SEQ ID NO: 3
  • P2 nucleotides 7, 9, 18, 24, 27, 30, 31, 33 of SEQ ID NO: 4
  • the nucleotide sequence of the 1st to 10th nucleotides of SEQ ID NO: 5 in P3 is added to introduce the NdeI site (CATATG) required for insertion into the pET vector. It is the array which did.
  • P4 is a reverse primer, which is a sequence containing an XhoI site (CTCGAG, see nucleotide sequences 1 to 11 in SEQ ID NO: 6) after the C-terminal amino acid. It was designed such that a stop codon (TAA) was inserted immediately before the XhoI site.
  • CTCGAG XhoI site
  • TAA stop codon
  • PCR reaction was performed with primers P1 and P4.
  • the PCR reaction consisted of 51 reverse transcription reactions and 51 10 buffers (1.2 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 OmM potassium chloride, 60 mM ammonium sulfate, 1% Triton X_100, 0.1 mg / m 1 BSA), 5 zl of a 2 mM dNTPs mixture, 0.4 ⁇ M of each primer, ImM of magnesium chloride, 2.5 units of KOD dash and DDW to give a total volume of 501, 95 30 cycles of 30 ° C., 30 ° C., 65 ° C., 2 seconds, 74 ° C., and 60 seconds were performed, followed by a reaction at 74 ° (:, 5 minutes).
  • the PCR reaction was performed on the 51 reaction products obtained above under the same PCR conditions with the primers changed to P2 and P4.
  • PCR was performed on 5 n1 of the reaction product under the same PCR conditions using primers P3 and P4.
  • the final reaction product was cloned into a pET23b vector (Novagen: Novagen), and the DNA sequence was confirmed with ABI 377 DNA Sequencer (PE-ABI).
  • the DNA fragment was inserted by ligation into a pET23b vector cut with restriction enzymes NdeI and XhoI.
  • the obtained gene had a total length of its coding region consisting of 2097 bases represented by SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence encoded by the base sequence consisted of the 699 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. This was a human cDNA (2097 bases in total) encoding the amino acid sequence.
  • the gene GFAT 1L of the present invention is a human GFAT gene cloned by McNight et al. (McKnight, GL, et. Al., J. Biol. Cem., 261-25208-25212).
  • GFAT1 L gene the novel gene isolated by the present inventors is referred to as “GFAT1 L gene”
  • GFAT1 S gene the human GFAT gene of McKnight et al.
  • the PCR reaction was repeated for 95 cycles at 95 ° C, 30 seconds, 55 ° (:, 30 seconds and 72 ° C, 45 seconds) for 40 cycles.
  • a portion of the reaction product was analyzed by 4% agarose gel electrophoresis, and the results are shown in FIG.
  • the cells were further cultured at 37 ° C. After 90 minutes, 2 ml of 1 M isopropyl J3-D- (I) -thiogalactovyranoside (IPTG: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. The cells were cultured overnight at 20 ° C to induce the expression of the recombinant protein.
  • IPTG isopropyl J3-D- (I) -thiogalactovyranoside
  • the culture was centrifuged at 7000 rpm for 5 minutes to collect E. coli, and washed once with 50 ml of Dulbecco's PBS (->: Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) cooled to 0 ° C.
  • 5 OmM sodium phosphate buffer (pH 8.0) containing 5 mM dithiosyl] ⁇ (DTT) and 20% glycerin was added to a total volume of 40 ml, suspended, and then sonicated. Then, the cells were disrupted.
  • the crushed liquid was subjected to ultracentrifugation (30,000 rpm, 30 minutes, 4 ° C) to remove insoluble components.
  • a supernatant containing the desired recombinant protein was obtained.
  • the obtained supernatant was dispensed in lml portions, rapidly frozen in liquid nitrogen, and stored at 180 ° C until use.
  • GFAT activity was measured by a spectrophotometer method using a 96-well microplate according to Marshall et al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 266. No. 8, 4706-4712, (1991)).
  • daltamate (Glutamate) generated by GFAT is further reacted with daltamate dehydrogenase (GDH), and APAD, a coenzyme that occurs at the same time, becomes APADH.
  • GDH daltamate dehydrogenase
  • APAD a coenzyme that occurs at the same time
  • a substrate solution of 2001 40 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 50 mM potassium chloride, 1.25 EDTA, 0.3 mM APAD, 6 U / ml (GDH), 0-6 mM glutamine, 0-6 mM 1 L of GFAT or 50 ⁇ 1 of E. coli lysate of GFAT 1 S appropriately diluted in fructose-6-phosphate (F-6-P)) was added thereto, and reacted at 37 ° C for 60 minutes. The change in absorbance at 365 nm at this time was measured by a microplate reader.
  • UDP_N-acetyldarcosamine (UDP-GlcNAc) inhibits GFAT activity (Journal of Biological Chemistry vol. 241. 1705-1712 (1966)). Also considered. This mode of inhibition was determined by performing the same plotting and obtaining a linear format.
  • FIG. 2 is a graph showing the mode of inhibition of GFAT activity of UDP-GlcNAc in GFAT 1 S and GFAT 1 L when F-6-P is used as a substrate.
  • the vertical axis indicates the enzyme reaction rate (V )
  • the horizontal axis shows the reaction rate (V) / enzyme substrate concentration (s).
  • the left graph in FIG. 2 shows the results for GFAT 1 S
  • the right graph shows the results for GFAT 1.
  • (1) shows the case without UDP-G1 cNAc
  • (2) shows the case with UDP-G1 cNAc 30 M addition
  • the Km values obtained from the figure were 90 / xM and 478 M for GFAT 1 S and GFAT 1 L, respectively, and the mode of inhibition of GFAT activity was “antagonistic inhibition” and “mixed inhibition”, respectively. Inhibition ".
  • Figure 3 is a graph showing the mode of inhibition of GFAT activity of UDP-G1cNAc in GFAT 1 S and GFAT 1 L using glutamine as a substrate.
  • the vertical axis indicates the enzyme reaction rate (V),
  • the axis indicates the reaction rate (V) and the substrate concentration (s) of the Z enzyme.
  • the left graph in FIG. 3 shows the results for GFAT 1 S, and the right graph shows the results for GFAT 1.
  • (1) shows the case without UDP-G 1 cNAc
  • UDP-G 1 cNAc 10 M addition shows the case where 30 M was added, and (4) shows the case where 100 iM of UDP-G1cNAc was added.
  • the Km values obtained from the figure are 822 xM and 804 zM, respectively, for GFAT 1 S and GFAT 1 L, and the inhibition modes of GFAT activity are “antagonistic inhibition” and “mixed inhibition”, respectively. Inhibition ".
  • GFAT 1 S when F-6-P was used as a substrate, GFAT 1 S exhibited a mixed inhibition mode, and GFAT 1 L exhibited a mixed inhibition mode in which non-antagonistic and competitive inhibition were mixed.
  • glutamine was used as a substrate, GFAT 1 S exhibited non-antagonistic inhibition, and GFAT 1 L exhibited a mixed inhibition mode including non-antagonism and other modes of inhibition.
  • GFAT is involved in insulin resistance in vitro and in vitro. It has been reported in both bipo studies. However, the novel gene discovered by the present inventors revealed that GFAT has two subtypes, so that either GFAT 1 L or human GFAT (GFAT 1 S) was better. It was considered as follows whether or not it was involved in insulin resistance.
  • the Km value of the present invention GFAT 1 L for F-6-P is about 5 times higher than that of GFAT 1 S,
  • GFAT activity is defined by intracellular F-16-P concentration.
  • FIG. 4 shows the enzyme reaction curves (G
  • FAT activation state is plotted, and the vertical axis is the reaction rate of the enzyme.
  • the horizontal axis shows the concentration (zM) of F-6-P in the cells.
  • the bold line indicates the F-61P concentration in red blood cells of non-insulin-dependent diabetic patients reported in the literature, and the bold arrow indicates that it is involved in insulin resistance.
  • GFAT 1 L of the present invention is considered to be more involved in insulin resistance than GFAT 1 S. From the above, it can be concluded that GFAT 1 L of the present invention is greatly involved in insulin resistance. Industrial applicability
  • GFAT 1 L gene encoding a novel human protein homolog having homology to human GFAT.
  • the gene of the present invention is highly expressed in skeletal muscle and heart, which are important tissues for glucose metabolism, promotes GFAT activity in these tissues and surrounding tissues, or promotes the hexosamine biosynthesis pathway in glycolysis, and It is considered that the transfer of the carrier to the cell membrane is suppressed. Therefore, it is thought that the expression of the gene of the present invention and the GFAT activity may be related to the function of the related gene and the glucose metabolism-related disease. In particular, it can be used for gene diagnosis for hypoglycemic or diabetic patients, and for application research on pharmaceutical use by antibodies or antisense against expression products of the gene. Further, according to the use of the gene of the present invention, the expression status of the gene in various tissues can be examined. This makes it possible to analyze its function in a living body.
  • the GFAT1 L protein encoded by the gene can be produced in large quantities by genetic engineering. According to the provision of the protein, the GFAT1 L activity and the binding activity of the GFAT1 L protein You can also check functions such as:
  • the protein of the present invention relates to a disease associated with the GFAT1L gene and its product (for example, a disease associated with GFAT activity or regulation of the hexosamine biosynthesis pathway in the glycolytic pathway or a hypoglycemic or glycemic control). It is useful for the treatment of diseases, especially for hypoglycemia, or for elucidating, diagnosing, and treating the pathology of diabetes, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, and diabetic complications such as diabetic neuropathy.
  • a disease associated with the GFAT1L gene and its product for example, a disease associated with GFAT activity or regulation of the hexosamine biosynthesis pathway in the glycolytic pathway or a hypoglycemic or glycemic control. It is useful for the treatment of diseases, especially for hypoglycemia, or for elucidating, diagnosing, and treating the pathology of diabetes, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, and diabetic complications such as diabet
  • a gene transfer vector useful for gene therapy containing the antisense oligonucleotide of the gene of the present invention, a cell into which the antisense oligonucleotide of the GFAT1L gene has been introduced, and the vector or the cell And a gene therapy method using the same as an active ingredient.
  • the present invention further has an inhibitory action on the expression of GFAT mRNA in skeletal muscle, particularly smooth cells of skeletal muscle, and is used for treatment of diseases and conditions such as diabetes and diabetic complications by the action. It is also possible to provide a medicament comprising an antisense oligonucleotide of a gene or an antibody having a binding property to GFAT1L or a fragment thereof as an active ingredient.
  • a screening method and a screening kit for a candidate compound for treating diabetes which inhibits the enzyme activity of a GFAT 1 L protein and a GFAT 1 L gene expression product.

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Description

新規酵素遺伝子およびその発現産物
技術分野
本発明は、 グルタミン：フルクト一ス一 6—リン酸 アミドトランスフェラー ゼ (Glutamine： fructose-6-phosphate amidotransferase、 以下、 G F A Tと略 明
記する） の活性を有する新規な酵素の遺伝子およびその遺伝子によってコードさ 田
れるアミノ酸配列を有する新規な蛋白質 （酵素） に関する。
背景技術
G F A Tは、 生体内におけるへキソサミン生合成経路において、 律速段階であ るフルク I ス一 6—リン酸からダルコサミン— 6—リン酸への反応を触媒する 重要な酵素である。 近年、 マクナイト（McKnight)らは、 6 8 1アミノ酸配列か らなる該酵素のヒト遺伝子を報告した (McKniglit, G. L. ， et al. , J. Biol. Chem. , 267, 25208-25212 (1992)。 その後、 新たなヒト G F A T遺伝子が、 ニシ らによって報告されている（米国特許第 5, 876, 713号)。
この G F A Tの活性を阻害する薬剤は、 細胞内へのグルコースの取り込みを促 進し、 血糖値を低下させることができると考えられており、 そのため糖尿病治療 薬として期待されている。 即ち、 インスリンにより細胞内にグルコースの取り込 みが促進され、 取り込まれたグルコースは解糖系により代謝されエネルギ一源と しての A T Pを蓄積するが、 過剰に取り込まれた場合はグルコース代謝物である フルクト一ス—6—リン酸がへキソサミン生合成経路へ流れる。 このへキソサミ ン生合成経路へ流れたフルクトースー 6—リン酸は、 G F ATによりダルコサミ ンー 6—リン酸に変換される。
ダルコサミンー 6—リン酸代謝産物が糖輸送担体の膜移行を抑制し、 それによ つて細胞内へのダルコースの取り込みが抑制されることが報告されている（FASEB J. , 5, 3031-3036 (1991)) ； Diabetologia, 38> 518-524 (1995)；. J. Biol. C em. , 266- 10155-10161 (1991)； J. Biol. Chem. , 266- 4706-4712 (1991)； Endocrinology, 136. 2809-2816 (1995))。
糖代謝経路において、 へキソサミン生合成経路は、 グルコースの過剰取り込み に対するフィードバック機構として機能することが一つの役割として考えられて おり、 GFATはその経路における律速酵素として重要であるとされている。 更 に、 インスリンに依存しない 2型糖尿病患者においては、 この GFAT活性が一 般的に高いことが知られており、 高血糖値を示す一つの原因であるとも報告され ている（Diabetes, 45, 302-307 (1996) )0
GFATは、 ヒト由来（J. Biol. Chem. , 261. 25208-25212 (1992)：米国特許 第 5, 876， 713号） の他、 マウス由来、 酵母由来および大腸菌由来のものが報告さ れている。 これらはいずれもヒト GFATと高い相同性を示す。 しかるに、 現在、 糖代謝において重要な臓器である骨格筋に特異的な新規な GFATの存在につい ては未だ知られていない。
GFAT活性を示す新たな GFATの遺伝子の単離は、 へキソサミン生合成経 路における GFATによる調節機能の解明に役立ち、 また骨格筋などの臓器特異 的に発現する GFAT遺伝子の単離は、 その臓器での糖代謝系機構の解明につい て更なる研究を可能とする。 更に、 これらの遺伝子によってコードされるァミノ 酸配列の発現物としての GFAT蛋白質に対して阻害活性を有する特異的な候補 化合物が見い出されれば、 新たな作用機序を有する糖尿病疾患の予防や治療に役 立つ血糖低下薬の開発が可能となる。
従って、 本発明の課題は、 かかる新たな GFATの遺伝子、 殊に骨格筋に特異 的に発現する GFATの遺伝子を単離する点にある。 発明の開示 本発明者らは、 上記課題より研究を重ねた結果、 ヒト骨格筋 cDNAライブラ リーから、 G FAT活性を有する蛋白質をコードする新規な塩基配列の cDN A のクローニングに成功し、 ここに、 ヒト骨格筋および心臓に特異的に発現する所 望の遺伝子及び蛋白質に係る本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明によれば、 以下の要旨の発明が提供される。
(1) .以下の （a)、 （b)、 (c) または （d) のポリヌクレオチドを含む遺伝 子：
(a) 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖、
(b) 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドに対して少なくとも 98 %の相同性を持つポリ.ヌクレオチド またはそれらの相補鎖、
(c) 上記 （a) のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたァミノ酸配列からなり且つ G F A T活性を有するポリべプ チドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖、
(d) 上記 （a) のアミノ酸配列と 98%以上の相同性を持つアミノ酸配列か らなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖。
(2) 以下の （a) または （b) のポリヌクレオチドからなる遺伝子：
(a) 配列番号： 2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその 相補鎖、
(b) 上記 （a) の塩基配列からなるポリヌクレオチドと高いストリンジェン トな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド。
(3) 配列番号： 2で示される塩基配列である上記 （2) に記載の遺伝子。
(4) 上記 （1) または （2) に記載の遺伝子を発現させて得られる遺伝子発現
(5) 上記 （1) または （2) に記載の遺伝子を有する組換え体発現べクタ' (6) 上記 （5) に記載の組換え体発現ベクターを保有する宿主細胞。
(7) 上記 （5) に記載の組換え体発現ベクターで形質転換された形質転換体。
(8) 以下の （a)、 (b) または （c) の蛋白質：
(a) 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) 上記 （a) のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ G FAT活性を有する蛋白質、
(c) 上記 （a) のアミノ酸配列と 98%以上の相同性を持つアミノ酸配列か らなる蛋白質。
(9) 上記 （1) または （2) に記載の遺伝子または上記 （4) に記載の遺伝子 発現産物を有効成分として含有する低血糖症の治療または予防用組成物。
(10) 上記 （8) に記載の蛋白質を有効成分として含有する低血糖症の治療ま たは予防用組成物。
(11) 上記 （4) に記載の遺伝子発現産物および上記 （8) に記載の蛋白質お よびこれらの断片から選ばれるいずれかに結合性を有する抗体、 特にモノクロ一 ナル抗体。
(12) 上記 （1) に記載の遺伝子または上記 （4) に記載の遺伝子発現産物お よび上記 （8) に記載の蛋白質の酵素活性を阻害する候補化合物をスクリーニン グする方法であって、 （i) 上記 （11) に記載の抗体と、 候補化合物を含む被検 液および標識化された上記 （8) に記載の蛋白質またはその部分ペプチドとを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された蛋白質またはその部分べプチド の割合を測定するか、 （ii) 候補化合物を含む被検液と、 担体上に不溶化した上 記抗体および標識化された他の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定するか、 或いは （iii) 上記 （8) に記載の 蛋白質またはその部分ペプチドに基質を接触させた場合と、 同蛋白質またはその 部分ペプチドに基質および候補化合物を接触させた場合とにおける、 同蛋白質ま たはその部分ペプチドの酵素活性を測定、 比較することを特徴とするスクリー二 ング方法。
(13) 上記 （12) に記載の候補化合物のスクリーニング方法に用いられるス クリーニング用キットであって、 測定用緩衝液、 上記 （8) に記載の蛋白質また はその部分ペプチドおよび基質としてのフルクトース _ 6—リン酸およびダル夕 ミンをキット成分として含有するキット。
また、 本発明によれば、 以下の要旨の発明も提供される。
(14) 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドを含む遺伝子もしくは配列番号： 2で示される塩基配列のポ リヌクレオチドからなる遺伝子 （以下、 これらを 「GFAT 1 L遺伝子」 ともい う） の遺伝子発現産物または配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白 質 （以下、 これらを 「GFAT 1 L蛋白質」 ともいう） 或いは該 GFAT 1 L蛋 白質の断片 （部分ペプチド） に対する抗体と、 被検液および標識化された GF A Tl L蛋白質またはその断片とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化さ れた GFAT 1 L蛋白質またはその断片の割合を測定することを特徴とする被検 液中の GFAT 1 L蛋白質またはその断片の定量法。
(15) 被検液と、 担体上に不溶化した前記 （14) に記載の抗体および標識化 された別の異なる GFAT 1 L蛋白質に対する抗体とを、 同時あるいは連続的に 反応させた後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液 中の本発明蛋白質またはその断片の定量法。
' (16) GFAT 1 L蛋白質に対する抗体 （好ましくは、 GFAT 1 L蛋白質の 活性を中和する活性を有する GFAT 1L蛋白質に対する抗体） を含有してなる 医薬、 特に糖尿病の治療および予防剤である医薬。
(17) GFAT 1 L蛋白質またはその断片に基質を接触させた場合と、 GFA
T 1 L蛋白質またはその断片に基質および試験化合物を接触させた場合とにおけ る、 GFAT 1L蛋白質またはその断片の酵素活性を測定、 比較することを特徴 とする、 GFAT酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。 更に本発明によれば、 以下の要旨の発明も提供される。
(18) GF AT 1 L遺伝子の DNAに相補的または実質的に相補的な塩基配列 を有し、 該 DN Aの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンス DNA。
(19) GF AT 1 L遺伝子の DNAに実質的に相補的な塩基配列が、 該 DNA に相補的な攆基配列の全塩基配列であるかあるいは部分塩基配列と約 98 %以上
(好ましくは約 99%以上） の相同性を有する塩基配列である G FAT 1 L遺伝 子のアンチセンス DNA。
(20) GFAT 1 L遺伝子のアンチセンス DNAを含有してなる医薬組成物、 特に糖尿病の治療および予防剤である医薬組成物。
本明細書におけるアミノ酸、 ペプチド、 塩基配列、 核酸等の略号による表示は、
I UP AC— I UBの規定 〔IUPAC_IUB Communication on Biological
Nomenclature, Eur. J. Biochem. , 138： 9 (1984)〕、 「塩基配列またはアミノ酸 配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」 （特許庁編） および当該分野 における慣用記号に従うものとする。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 2に従い、 RT— PC R法により各臓器での本発明遺伝子の発 現パターンを求めたァガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。 図 2は、 実施例 4に従い、 本発明 GF ATI Lの酵素学的性質としての、 F— 6—Pを基質としたときの Km値および G FAT活性阻害様式を求めるためのグ ラフである。
図 3は、 実施例 4に従い、 本発明 GFAT 1 Lの酵素学的性質としての、 グル 夕ミンを基質としたときの Km値および G FAT活性阻害様式を求めるためのグ ラフである。
図 4は、 実施例 4に従い、 本発明 GFAT 1 Lの酵素反応曲線 （GFATの活 性化の状態） を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の遺伝子および蛋白質について詳述する。
本発明蛋白質は、 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列またはこれと実質的に 同一のアミノ酸配列を含有することで特徴付けられる。 本発明蛋白質は、 例えば、 ヒト細胞、 特にヒト横紋筋細胞、 あるいは例えばヒト組織、 特に骨格筋、 心臓に 由来する蛋白質であることができ、 また合成蛋白質であることもできる。
上記配列番号： 1で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列と約 9 8 %以上、 好ましく は約 9 9 %以上の相同性を持つアミノ酸配列または配列番号： 1で示されるアミ ノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミ ノ酸配列が挙げられる。 そして、 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 前記した配列番号： 1で示さ れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなり且つ配列番号： 1で示 されるアミノ酸配列からなる本発明蛋白質と実質的に同質の G F AT活性を有す る蛋白質が包含され、 具体的には、 後記 G F A T 1 L遺伝子の相同物 （アレル体 を含む G F A T 1 L同等遺伝子） の遺伝子産物を挙げることができ、 同一の活性 を有するヒト、 ゥマ、 ヒッジ、 ゥシ、 ィヌ、 サル、 ネコ、 クマ、 ラット、 ゥサギ などの哺乳動物の蛋白質も包含される。
ここで、 実質的に同質とは、 その活性が性質的に （例えば生理化学的または薬 理学的に） 同質であることを示す。 従って、 G F A T活性の程度や蛋白質の分子 量などの量的要素は当然に異なることができる。
G F AT活性の測定は、 それ自体公知の方法、 例えばマーシャルらの方法 (Mar shal l, et. aし J. Biol. Chem. , 266 (8) , 4706-4712 (1991) )に準じて行なう ことができる。
また、 本発明において 「G F AT活性」 とは、 後記実施例に示されるように、 U D P— N—ァセチルダルコサミンが G F A T活性を阻害することにおいて、 フ ルクトース— 6—リン酸を基質とした場合の、 その阻害様式が、 混合阻害様式で 示される G F A T活性をいい、 上記阻害様式が拮抗阻害様式であるものとは明確 に区別される。 以下、 本明細書においては、 かかる本発明に特有の混合阻害様式 を示す GFAT活性を単に 「GFAT活性」 と称するものとする。
上記アミノ酸配列の欠失、 置換または付加の位置は、 かかる改変されたァミノ 酸配列を有する蛋白質が GFAT活性を有する限り、 任意であり、 これら欠失、 置換、 付加の数も、 同様に GFAT活性を有する限り任意であることができる。 ■ 本発明遺伝子は、 配列番号： 1で示される 699アミノ酸配列の、 骨格筋およ び心臓特異的蛋白質 （GFAT 1L蛋白質） をコードするものであり、 該遺伝子 の一具体例としては、 後述する実施例に示される 「GFAT1L」 と名付けられ た PC R産物の DNA配列から演繹されるものを挙げることができ、 その塩基配 列は、 配列番号： 2に示され全長 2097塩基からなっている。
本発明 GFAT 1 L遺伝子は、 マクナイトらによってクローニングされた GF AT遺伝子 (McKnight, G. L. , et. al. , J. Biol. Chem. , 261. 25208-25212 (1992))の 684番目と 685番目の塩基の間に、 54個の塩基が挿入された新 規な配列を有することが確認された。
従って、 本発明遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、 上記マク ナイトらの報告による遺伝子から演繹されるアミノ酸配列の 228番目と 229 番目の間に、 新たな 18個のアミノ酸配列が挿入されたものである。
本発明蛋白質は、 GFAT活性を有し、 例えば低血糖の改善薬として有用であ る。 また本発明遺伝子のアンチセンス DN Aや本発明遺伝子の発現産物に対する 抗体は、 糖尿病疾患の治療効果が予測され、 更にこれらを利用した糖尿病治療剤 としての候補化合物のスクリ一二ングへの利用も可能である。
本発明において遺伝子とは、 2本鎖 DNAのみならず、 それを構成するセンス 鎖およびアンチセンス鎖といった各 1本鎖 DN Aを包含する趣旨であり、 またそ の長さに何ら制限されるものではない。 従って、 本発明遺伝子 （DNA) には、 特に言及しない限り、 ヒトゲノム DNAを含む 2本鎖 DNAおよび cDNAを含 む 1本鎖 DNA (センス鎖） 並びに該センス鎖と相補的な配列を有する 1本鎖 D NA (アンチセンス鎖） およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
また本発明遺伝子 （DNA) は、 リーダ配列、 コード領域、 ェキソン、 イント ロン等を含むことができる。 ポリヌクレオチドとしては、 RNA、 DNAを例示 できる。 DNAは、' cDNA、 ゲノム DNA、 合成 DNAを含み、 特定アミノ酸 配列を有するポリペプチドは、 その断片、 同族体、 誘導体、 変異体を含み得る。 遺伝子における変異体は、 天然に存在するアレル変異体、 天然に存在しない変 異体、 欠失、 置換、 付加および挿入を有する変異体等であって、 これらによりコ ードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないものを意味する。
ポリペプチドは、 アレル体、 ホモログ、 天然の変異体で少なくとも 98 %、 好 ましくは 99 %相同なものを含む。
また、 本発明遺伝子発現産物の生物活性、· 即ち GFAT活性とは、 フルク卜一 スー 6—リン酸からダルコサミン— 6—リン酸への反応を触媒する作用として例 示される。 また、 これはヒトまたは哺乳動物の血糖の上昇作用としても捉えるこ とができる。 なお DNAおよびポリペプチドにおける相同性は、 配列分析ソフト ウェア、 例えば FAS TAプログラムを使用した測定 （Clustal.V., Methods Mol.Biol., 25. 307-318 (1994) )にて解析することができる。
前記本発明遺伝子における変異体には、 これによりコードされるァミノ酸置換 についてサイレントまたは保存変異体、 すなわちその塩基配列によってコードさ れるアミノ酸残基が変らない塩基配列の変異も包含される。 保存的なアミノ酸置換の種類は以下に示されるとおりである： 元のアミノ酸残基 保存的な置換アミノ酸残基
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin, His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asnまたは Gin
l ie Leuまたは Val
Leu l ieまたは Val
Lys Argまたは Glu
Met Leuまたは l ie
Phe Met, Leuまたは Tyr
Ser T r
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trpまたは Phe
Val l ieまたは Leu。
加えて、 一般にシスティン残基をコードする 1またはそれ以上のコドンは、 特 定のポリペプチドのジスフィド結合に影響を与えるのでシスティン残基の欠失の 結果、 置換することが可能である。
置換基を選択することによって作られる機能における実質的な変化は、 上記ァ ミノ酸のリストに記載されたものより少し保存性が劣つている。 蛋白の特性に最も大きな変化を生み出すと一般的に期待される置換は、 以下の ものである：
a) 親水性残基、 例えばセリルまたはスレオニルが疎水性残基例えば、 口イシ ル、 イソロイシル、 フエ二ルァラニル、 バリルまたはァラニルに置換される、 b) システニルまたはプロリルが、 いかなる他の残基に対して置換される、 c) 電気的陽性側鎖を有している残基、 例えば、 リジル、 アルギニル、 ヒスチ ジルが電気的陰性残基、 例えば、 ダル夕ミルまたはァスパルチルに置換される、 d) 非常に大きな側鎖を有している残基、 例えば、 フエ二ルァラ二ルがグリシ ルのような側鎖を有しないものに置換される。
本発明遺伝子およびその遺伝子産物の提供は、 糖尿病の解明、 把握、 診断、 予 防および治療などに極'めて有用な情報乃至手段を与える。 また、 本発明遺伝子は、 上記の処置に利用される当該遺伝子の発現を抑制または誘導する新規薬剤の開発 の上でも好適に利用できる。 更に、 個体或は組織における本発明遺伝子の発現を 抑制または誘導するその産物の発現の検出や、 該遺伝子の変異 （欠失や点変異） 乃至発現異常の検出は、 上記糖尿病病態の解明や診断において好適に利用できる。 前記改変されたアミノ酸配列をコードする本発明遺伝子は、 その利用によって 改変前のアミノ酸配列をコードする本発明遺伝子が検出できるものであってもよ い。
本発明遺伝子の具体例としては、 例えば配列番号： 1で示されるアミノ酸配列 からなる蛋白質をコードする塩基配列を有する GFAT 1 L遺伝子を挙げること ができるが、 本発明遺伝子は特にこれに限定されることなく、 当該 GFAT 1 L 遺伝子の相同物をも包含する。
ここで 「GFAT 1 L遺伝子の相同物」 とは、 本発明 GFAT1L遺伝子 （ま たはその遺伝子産物） と配列相同性を有し、 上記構造的特徴並びに遺伝子発現パ ターンにおける共通性および上記したようなその生物学的機能の類似性 （例えば
FAS TAプログラムを使用した相同性） より、 ひとつの遺伝子ファミリーと認 識される一連の関連遺伝子を意味し、 例えば配列番号： 1で示されるアミノ酸配 列からなる蛋白質をコードする塩基配列と少なくとも 9 8 %の相同性、 好ましく は少なくとも 9 9 %の相同性を有するポリヌクレオチドおよびそれらの相補鎖ポ リヌクレオチドが挙げられる。
上記アミノ酸配列の改変 （変異） などは、 天然において、 例えば突然変異や翻 訳後の修飾などにより生じることもあるが、 天然由来の遺伝子 （例えば本発明 G F A T 1 L遺伝子） に基づいて人為的に改変することもできる。 本発明は、 この ような改変 ·変異の原因および手段などを問わず、 上記特性を有する全ての改変 遺伝子を包含する。 本発明の遺伝子には、 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列 を有する蛋白質をコードする遺伝子の対立遺伝子 （アレル体） もまた包含される。 上記の人為的手段としては、 例えばサイトスぺシフィック ·ミュータゲネシス [Me thods in Enzymology, 154. 350, 367-382 (1987) ；同遍， 468 (1983) ； Nuc l e ic Ac ids Res. , 12, 9441 (1984) ；続生化学実験講座 1 「遺伝子研究法 I I」、 日本生化学会編， P 105 (1986) ] などの遺伝子工学的手法、 リン酸トリエス テル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段 〔J. Am. Chem. Soc. , 89. 480 1 (1967) ；同 M, 3350 (1969) ； Sc ience, 通 178 (1968) ； Te t rahedron Let t. , 22, 1859 (1981) ；同 M， 245 (1983) ) およびそれらの組合せ方法などが例示で きる。 より具体的には、 D NAの合成は、 ホスホルアミダイト法またはトリエス テル法による化学合成によることもでき、 市販されている自動オリゴヌクレオチ ド合成装置上で行うこともできる。 二本鎖断片は、 相補鎖を合成し、 適当な条件 下で該鎖を共にァニ一リングさせるか、 または適当なプライマ一配列と共に D N Aポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、 化学合成した一本鎖生成物 から得ることもできる。
本発明遺伝子の具体的態様としては、 配列番号： 2に示される塩基配列を有す る遺伝子を例示できる。 この塩基配列（コーディング領域）は、 配列番号： 1に示 されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示してい る。 本発明の遺伝子は、 かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、 各アミ ノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、 選択した塩基配列を有することも可能 である。 コドンの選択は、 常法に従うことができ、 例えば利用する宿主のコドン 使用頻度などを考慮することができる 〔Ncleic Acids Res. , 9, 43 (1981)〕。 また、 本発明遺伝子は、 前記のとおり、 配列番号： 2に示される塩基配列と一 定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。
上記相同性を有する塩基配列からなるものとは、 配列番号： 2に示される塩基 配列と少なくとも 98%の相同性、 好ましくは少なくとも 99%の相同性を有す るポリヌクレオチドおよびそれらの相補鎖ポリヌクレオチドをいう。
かかる遺伝子としては、 例えば、 0. 1%303を含む0. 2XSSC中、.6 0°Cまたは 0. 1%SDSを含む 0, 1XSSC中、 60°Cの高いストリンジェ ントな条件下で、 配列番号： 2に示される塩基配列からなる DNAとハイブリダ ィズする塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。
本発明遺伝子は、 本発明により開示された本発明遺伝子の具体例についての配 列情報に基づいて、 一般的遺伝子工学的手法により容易に製造 ·取得することが できる [Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989) ； 続生化学実験講座 「遺伝子研究法 I、 II、 III」、 日本生化学会編 （1986) など参 照〕。
具体的には、 本発明遺伝子が発現される適当な起源より、 常法に従って cDN Aライブラリ一を調製し、 該ライブラリ一から本発明遺伝子に特有の適当なプロ ーブゃ抗体を用いて所望クローンを選択する手法を挙げることができる 〔Pro Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981) ； Science, 222, 778 (1983)など〕。 上記において、 c DNAの起源としては、 本発明の遺伝子を発現する各種の細 胞、 組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。 また、 これらからの全
RNAの分離、 mRNAの分離や精製、 c DNAの取得とそのクローニングなど はいずれも常法に従って実施することができる。 また、 mRNAまたは cDNA ライブラリ一は市販されてもおり、 本発明においてはそれら mRNAまたは cD NAライブラリー、 例えばクローンテック社 （Clontecli Lab. Inc. ) などより市 販されている各種 mRNAまたは cDNAライブラリ一などを用いることもでき る。
本発明の遺伝子を cDN Aのライブラリーからスクリーニングする方法も、 特 に制限されず、 通常の方法に従うことができる。 具体的には、 例えば cDNAに よって産生される蛋白質に対して、 該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリ —ニングにより対応する c DNAクロ一ンを選択する方法、 目的の DNA配列に 選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダィゼーシヨン、 コロニー ハイブリダィゼーシヨン、 これらの組合せなどを例示できる。
ここで用いられるプロ一ブとしては、 本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報 をもとにして化学合成された DNAなどが一般的に使用できるが、 既に取得され た本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。 また、 本発明遺伝子の塩基配列 情報に基づき設定したセンス ·プライマー、 アンチセンス ·プライマーをスクリ 一二ング用プローブとして用いることもできる。
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、 配列番号： 2に対応する 部分ヌクレオチド配列であって、 54塩基の挿入配列部分の一部を少なくとも含 む 15個以上の連続した塩基、 好ましくは 20個の連続した塩基、 より好ましく は 30個の連続した塩基、 最も好ましくは 50個の連続した塩基を有するもので ある。 或いは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いるこ ともできる。
本発明遺伝子の取得に際しては、 PCR法 [Science, 230, 1350 (1985)〕 に よる DNAZRNA増幅法が好適に利用できる。 殊に、 ライブラリーから全長の cDNAが得られ難いような場合には、 RACE法 〔Rapid a即 liiication of cDNA ends；実験医学、 12 (6), 35 (1994)〕、 特に 5' - RACE法 (M. A. Frohman, etal. , Pro Natl. Acad. Sci.， USA., 8, 8998 (1988)〕 などの採用が好適で ある。
かかる PC R法の採用に際して使用されるプライマーは、 本発明によって明ら かにされた GFAT 1 L遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、 これは常法 に従って合成できる。 尚、 増幅させた DNAZRNA断片の単離精製は、 前記の 通り常法に従うことができ、 例えばゲル電気泳動法などによればよい。
また、 上記で得られる本発明遺伝子或いは各種 DNA断片は、 常法、 例えばジ デォキシ法 〔Pro Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)) やマキサム一 ギルバ一ト法 [Methods in Enzymology, 65> 499 (1980)) などに従って、 また 簡便には市販のシークェンスキットなどを用いて、 その塩基配列を決定すること ができる。
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、 例えば該遺伝子の一部また は全部の塩基配列を利用することにより、 個体もしくは各種組織における本発明 遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
かかる検出は常法に従って行うことができ、 例えば RT— PCR [Reverse transcribed - Polymerase chain reaction; E. S. Kawasaki, et al. ,
Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and
applications, Academic Press, Inc. , SanDiego, 21-27 (1991) ) による RNA増 幅、 ノーザンブロッテイング解析 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、 in situ RT— PCR CNucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕、 in situハイブリダィゼーシヨンなどを利用した細胞レベルでの測定、 NASBA法 [Nucleic acid se uence-based amplification, Nature, 350, 91 -92 (1991)〕 およびその他の各種方法を挙げることができる。 好適には、 RT— PCRによる検出法を挙げることができる。
尚、 ここで PCR法を採用する場合に用いられるプライマ一は、 本発明遺伝子 のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、 特に制限はなく、 本 発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。 通常、 10〜35ヌ クレオチド程度、 好ましくは 15〜30ヌクレオチド程度の長さを有する本発明 遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
このように、 本発明の遺伝子には、 該遺伝子を検出するための特異プライマー および/または特異プローブとして使用される DN A断片もまた包含される。 当該 DNA断片は、 配列番号： 2に示される塩基配列からなる DNAと高いス トリンジェントな条件下でハイブリダィズすることを特徴とする D N Aとして規 定することできる。 ここで、 高いストリンジエンドな条件としては、 プライマー またはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、 特に制限はさ れないが、 例えば、 前述するような 0. 1 %SDSを含む 0. 2XS SC中、 6 0°Cの条件または 0. 1%303を含む0. 1 XS SC中、 60°Cの条件を例示 することができる。
本発明遺伝子によれば、 通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、 該遺伝 子産物 （GFAT 1 L蛋白） またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、 安定して 製造することができる。
従って本発明は、 本発明遺伝子によってコードされる GF AT 1 L蛋白質など の蛋白質を始め、 該蛋白質の製造のための、 例えば本発明遺伝子を含有するべク 夕一、 該ベクターによって形質転換された宿主細胞、 該宿主細胞を培養して上記 本発明蛋白質を製造する方法などをも提供するものである。
すなわち、 本発明の蛋白質は、 本発明により提供される GF ATI L遺伝子の 配列情報に基づいて、 常法の遺伝子組換え技術 〔例えば、 Science, 224. 1431 (1984) ； Biochem. Biophys. Res. Comm., 层， 692 (1985) ； Proc. Natl. Acad. Sci.， USA., 80> 5990 (1983)など参照〕 に従って調製することができる。
該蛋白質の製造は、 より詳細には、 該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細 胞中で発現できる組換え DNA (発現ベクター） を作成し、 これを宿主細胞に導 入して形質転換し、 該形質転換体を培養し、 次いで得られる培養物から回収する ことにより行なわれる。 上記宿主細胞としては、 原核生物および真核生物のいずれも用いることができ、 例えば原核生物の宿主としては、 大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるも のが広く挙げられ、 好適には大腸菌、 とりわけェシエリヒア ·コリ
(Escherichia coli) K 12株を例示できる。 また、 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 酵母等の細胞が含まれ、 前者としては、 例えばサルの細胞である CO S細胞 〔Cell， 3： 175 (1981)〕、 チャイニーズ ·ハムスター卵巣細胞およびそ のジヒドロ葉酸レダク夕一ゼ欠損株 〔Pro Natl. Acad. Sci., USA., 77： 4216
(1980)〕 などが、 後者としては、 サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用い られる。 勿論、 これらに限定される訳ではない。
原核生物細胞を宿主とする場合は、 該宿主細胞中で複製可能なベクターが用い られ、 このベクターとしては本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流に プロモーターおよび SD (シャイン ·アンド ·ダルガーノ) 塩基配列、 更に蛋白 合成開始に必要な開始コドン （例えば ATG) を付与した発現プラスミドを好適 に利用できる。 上記ベクターとしては、 一般に大腸菌由来のプラスミド、 例えば pBR 322、 p BR 325, pUC12、 p U C 13などがよく用いられるが、 これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。 大腸菌を利 用した発現系に利用される上記べクタ一の市販品としては、 例えば pGEX— 4 T (Amer sham Pharmacia Bio tech社）、 MAL-C 2, pMAL-P 2 (New England Biolabs社）、 p ET 21 , pET21/l acq (Invitrogen社）、 p BAD/H i s (Invitrogen社） 等を例示できる。
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、 通常、 発現しようと する本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、 ポ リアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、 これは更に必 要により複製起点を有していてもよい。 該発現ベクターの例としては、 具体的に は、 例えば S V40の初期プロモーターを保有する p SV2dhfr [Mol. Cell.
Biol., I： 854 (1981)〕 等が例示できる。 上記以外にも既知の各種の巿販ベクタ 一を用いることができる。 動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるべクタ 一の市販品としては、 例えば pEGFP— N， pEGFP-C (Clontech社）、 p I ND (Invitrogen社）、 p cDNA3. 1 /U i s (Invitrogen社） などの 動物細胞用ベクターや、 pF a s t B a c HT (GibcoBRL社）、 pAc GHLT (PharMingen社）、 Ac 5/V 5 -H i s , pMT/V5— H i s , pMT/ B i p/V5 -h i s (以上、 Invitrogen社） などの昆虫細胞用ベクターなどが 挙げられる。
また、 酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、 例えば酸 性ホスファターゼ遺伝子に対す'るプロモータ一を有する PAM82 CProc. Nail. Acad. Sci., USA., 80： 1 (1983)〕 などが例示できる。 市販の酵母細胞用発現 ベクターには、 例えば pP I CZ (Invitrogen社）、 p P I C Z a (Invitrogen 社） なとが包含される。
プロモ一ターとしても特に限定なく、 エツシエリヒア属菌を宿主とする場合は、 例えばトリプトファン（trp)プロモーター、 lppプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモーター、 PL/PRプロモーターなどを好ましく利用できる。 宿主がバチ ルス属菌である場合は、 SP01プロモー夕一、 SP02プロモ一夕一、 penPプロモー夕 一などが好ましい。 酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、 例えば pH05 プロモーター、 PGKプロモータ一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどを好 適に利用できる。 また、 動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとし ては、 SV40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタロチ ォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 サイトメガロウィルスプ 口モーター、 s R enプロモータ一などを例示できる。
尚、 本発明遺伝子の発現ベクターとしては、 通常の融合蛋白発現ベクターも好 ましく利用できる。 該ベクターの具体例としては、 ダルタチオン一 S—トランス フェラ一ゼ （GST) との融合蛋白として発現させるための pGEX (Promega 社） などを例示できる。 また、 宿主細胞からのポリペプチドの発現、 分泌を助けるポリヌクレオチド配 列としては、 分泌配列、 リーダ配列が例示でき、 細菌宿主に対して融合成熟ポリ ぺプチドの精製に使用されるマ一力一配列（へキサヒスチジン ·タグ）、 哺乳動物 細胞の場合はへマグルチニン（HA) ·タグを例示できる。
所望の組換え D NA (発現ベクター） の宿主細胞への導入法およびこれによる 形質転換法としては、 ，特に限定されず、 一般的な各種方法を採用することができ る。
また得られる形質転換体は、 常法に従い培養でき、 該培養により所望のように 設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的蛋白質が、 形質転換体の細胞内、 細胞外または細胞膜上に発現、 生産.（蓄積、 分泌） される。
該培養に用いられる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種 のものを適宜選択利用でき、 培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。 かくして得られる本発明の組換え蛋白質は、 所望により、 その物理的性質、 化 学的性質などを利用した各種の分離操作 〔「生化学データーブック I I」、 1175- 1259 頁、 第 1版第 1刷、 1980年 6月 23日株式会社東京化学同人発行； Biochemi s t ry, 25 (25) , 8274 (1986)； Eur. J. B iochem. , 163, 313 (1987)など参照〕 \Z より分離、 精製できる。
該方法としては、 具体的には、 通常の再構成処理、 蛋白沈澱剤による処理 （塩 析法）、 遠心分離、 浸透圧ショック法、 超音波破砕、 限外濾過、 分子篩クロマト グラフィ一 （ゲル濾過）、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフ ィ一、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー （H P L C ) などの各種液体クロマトグラフィー、 透析法、 これらの組合せが例示でき、 特に好ましい方法としては、 本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させた力 ラムを利用したァフィ二ティクロマトグラフィーなどを例示することができる。 尚、 本発明蛋白質をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、 配列番号： 2 に示される G F AT 1 L遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。 該遺 伝子は、 所望により、 各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用する ことも可能である。
本発明蛋白質は、 また、 配列番号： 1に示すアミノ酸配列に従って、 一般的な 化学合成法により製造することができる。 該方法には、 通常の液相法および固相 法によるべプチド合成法が包含される。
かかるペプチド合成法は、 より詳しくは、 アミノ酸配列情報に基づいて、 各ァ ミノ酸を 1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズェロン ゲーシヨン法と、 アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、 次いで各フ ラグメントをカップリング反応させるフラグメント ·コンデンセーシヨン法とを 包含し、 本発明蛋白質の合成は、 そのいずれによってもよい。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、 常法に従うことができ、 例えば、 ァ ジド法、 混合酸無水物法、 D C C法、 活性エステル法、 酸化還元法、 D P P A (ジフエニルホスホリルアジド） 法、 D C C +添加物 （1—ヒドロキシベンゾ卜 リアゾール、 N—ヒドロキシサクシンアミド、 N—ヒドロキシー 5—ノルポルネ ンー 2， 3 —ジカルポキシイミドなど） 法、 ウッドワード法などを例示できる。 これら各方法に利用できる溶媒も、 この種ペプチド縮合反応に使用されること のよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。 その例として は、 例えばジメチルホルムアミド （D M F )、 ジメチルスルホキシド （D M S 0)、 へキサホスホロアミド、 ジォキサン、 テトラヒドロフラン （T H F )、 酢酸 ェチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
尚、 上記ペプチド合成反応に際して、 反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチド における力ルポキシル基は、 一般にはエステル化により、 例えばメチルエステル、 ェチルエステル、 第 3級プチルエステルなどの低級アルキルエステル、 例えばべ ンジルエステル、 p—メトキシベンジルエステル、 p _ニトロべンジルエステル などのァラルキルエステルなどとして保護することができる。
また、 側鎖に官能基を有するアミノ酸、 例えばチロシン残基の水酸基は、 ァセ チル基、 ベンジル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 第 3級ブチル基などで保護 されてもよいが、 必ずしもかかる保護を行う必要はない。 更に、 例えばアルギニ ン残基のグァニジノ基は、 ニトロ基、 トシル基、 p—メトキシベンゼンスルホ二 ル基、 メチレン一 2—スルホニル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 イソポル二 ルォキシカルポニル基、 ァダマンチルォキシカルポニル基などの適当な保護基に より保護することができる。
上記保護基を有するアミノ酸、 ペプチドおよび最終的に得られる本発明蛋白質 におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、 慣用される方法、 例えば接触還元法 や、 液体アンモニア/ナトリウム、 フッ化水素、 臭化水素、 塩化水素、 トリフル ォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施す ることができる。
かくして得られる本発明蛋白質は、 前記した各種の方法、 例えばイオン交換樹 脂、 分配クロマトグラフィー、 ゲルクロマトグラフィー、 向流分配法などのぺプ チド化学の分野で汎用される方法に従って、 適宜精製を行うことができる。
本発明蛋白質は、 その特異抗体を作成するための免疫抗原としても好適に利用 でき、 この抗原を利用することにより、 所望の抗血清 （ポリクローナル抗体） お よびモノクローナル抗体を取得することができる。
該抗体の製造法自体は、 当業者によく理解されているところであり、 本発明に おいてもこれら常法に従うことができる 〔例えば、 続生化学実験講座 「免疫生化 学研究法」、 日本生化学会編 （1986) など参照〕。
かくして得られる抗体は、 例えば G F A T 1 L蛋白の精製およびその免疫学的 手法による測定ないしは識別などに有利に利用することができる。 より具体的に は、 本発明遺伝子の発現が骨格筋や心臓の組織において確認されていることから、 該抗体を用いて、 G F A Tのこれら組織中での濃度の測定に利用することができ る。 また該抗体を有効成分とする医薬は、 糖尿病および糖尿病合併症などの疾患 に対する治療剤または予防剤として有用である。 上記で得られた本発明蛋白質は、 これを有効成分とする医薬品として医薬分野 において有用である。 従って、 本発明は該蛋白質を有効成分とする医薬組成物を も提供するものである。
本発明蛋白質の医薬としての有用性は上記したようにその糖代謝において、 重 要とされる組織である骨格筋に特異的ポリペプチドが有する G F A T活性の促進、 または低血糖改善作用の促進にあり、 これらの活性を確認する方法は、 例えば後 記実施例に記載されている Marshal lらの方法 (Marshal l, J. B iol. Chem. , 266 (8) , 4706-4712 (1991) )に準じて実施できる。
該方法は、 G F A Tにより生成されたダル夕メート（Glut amate)をさらにグル 夕メート脱水素酵素（Glut amate deydrogenase : GDH) と反応させる際に、 同時に 補酵素である A P ADが A P AD Hに還元され、 この還元反応に伴つた吸光度の 変化を G F A T活性として測定する方法である。 即ち、 該方法では、 96穴のマイ クロプレートを用い、 200 1の基質溶液 (40 M Sodium phosphate buf fer, pH 7. 5、 50 mM KCK 1. 25 mM EDTA、 0. 3 mM APAD、 6 U/ml (GDH)、 0-6 mM Glutamine, 0-6 mM Fructose- 6- P (F6P) )に適宜希釈した G F A T 1 Lの大腸菌溶解液の可溶 性画分 50 ^ 1を加え、 37°Cで 60分間反応させ、 この時の 365nmの吸光度の変化をマ ィクロプレートリーダーを用いる分光光度計法にて測定する。
医薬組成物において有効成分とする本発明蛋白質には、 その医薬的に許容され る塩もまた包含される。 かかる塩には、 当業界で周知の方法により調製される、 例えばナトリウム、 カリウム、 リチウム、 カルシウム、 マグネシウム、 バリウム、 アンモニゥムなどのアルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩、 アンモニゥム塩など が包含される。 更に上記塩には、 本発明蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との 反応による酸付加塩も包含される。 代表的酸付加塩としては、 例えば塩酸塩、 臭 化水素酸塩、 硫酸塩、 重硫酸塩、 酢酸塩、 蓚酸塩、 吉草酸塩、 ォレイン酸塩、 ラ ゥリン酸塩、 硼酸塩、 安息香酸塩、 乳酸塩、 リン酸塩、 p—トルエンスルホン酸 塩 （トシレート）、 クェン酸塩、 マレイン酸塩、 フマル酸塩、 コハク酸塩、 酒石 酸塩、 スルホン酸塩、 グリコール酸塩、 マレイン酸塩、 ァスコルビン酸塩、 ゼンスルホン酸塩、 ナプシレートなどが例示される。
上記医薬組成物は、 本発明蛋白質を活性成分として、 その薬学的有効量を、 適 当な医薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。
上記医薬組成物 （医薬製剤） に利用できる医薬担体としては、 製剤の使用形態 に応じて通常使用される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性 剤、 滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、 これらは得られる製剤の投 与単位形態に応じて適宜選択使用される。
特に好ましい本発明医薬製剤は、 通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成 分、 例えば安定化剤、 殺菌剤、 緩衝剤、 等張化剤、 キレート剤、 p H調整剤、 界 面活性剤などを適宜使用して調製される。
上記安定化剤としては、 例えばヒト血清アルブミン、 通常の L一アミノ酸、 糖 類、 セルロース誘導体などを例示でき、 これらは単独でまたはそれぞれを組合せ たり、 更にこれらに界面活性剤などと組合せて使用できる。 この組合せによれば、 有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
上記 L _アミノ酸は、 特に限定はなく例えばグリシン、 システィン、 ダルタミ ン酸などのいずれでもよい。
上記糖としても特に限定はなく、 例えばグルコース、 マンノース、 ガラクトー ス、 果糖などの単糖類、 マンニトール、 イノシトール、 キシリトールなどの糖ァ ルコール、 ショ糖、 マルトース、 乳糖などの二糖類、 デキストラン、 ヒドロキシ プロピルスターチ、 コンドロイチン硫酸、 ヒアルロン酸などの多糖類、 それらの 誘導体などを使用できる。
界面活性剤としても特に限定はなく、 イオン性および非イオン性界面活性剤の いずれも使用できる。 例えばポリオキシエチレンダリコールソルビ夕ンアルキル エステル系、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、
ステル系、 脂肪酸グリセリド系などを使用できる。 セルロース誘導体としても特に限定はなく、 メチルセルロース、 ェチルセル口 ース、 ヒドロキシェチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキ シプロピルメチルセルロース、 カルポキシメチルセルロースナトリウムなどを使 用できる。
上記糖類の添加量は、 有効成分 当り約 0. OOOlmg程度以上、 好ましくは約 0. 01〜10mg程度の範囲とするのが適当である。 界面活性剤の添加量は、 有効成分 1 2 当り約0. OOOO lmg程度以上、 好ましくは約 0. 0001〜0. O lmg程度の範囲とする のが適当である。 ヒト血清アルブミンの添加量は、 有効成分 l g当り約 0. OOOlmg 程度以上、 好ましくは約 0. 001〜0. lmg程度の範囲とするのが適当である。 ァミノ 酸は、 有効成分 l g当り約 0. 001〜10mg程度とするのが適当である。 また、 セル 口一ス誘導体の添加量は、 有効成分 1 1 g当り約 0. 0000 lmg程度以上、 好ましくは 約 0. 001〜0. lmg程度の範囲とするのが適当である。
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、 広範囲から適宜選択されるが、 通常約 0. 00001〜70重量％、 好ましくは約 0. 0001〜5重量％程度の範囲とするのが 適当である。
また本発明医薬製剤中には、 各種添加剤、 例えば緩衝剤、 等張化剤、 キレート 剤などをも添加することができる。 ここで緩衝剤としては、 ホウ酸、 リン酸、 酢 酸、 クェン酸、 ε—アミノカプロン酸、 グルタミン酸および/またはそれらに対 応する塩 （例えばそれらのナトリウム塩、 カリウム塩、 カルシウム塩、 マグネシ ゥム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩） などを例示できる。 等張化 剤としては、 例えば塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 糖類、 グリセリンなどを例 示できる。 またキレート剤としては、 例えばェデト酸ナトリウム、 クェン酸など を例示できる。
本発明医薬製剤は、 溶液製剤として使用できる他に、 これを凍結乾燥化し保存 し得る状態にした後、 用時水、 生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適 当な濃度に調製した後に使用することも可能である。 本発明の医薬製剤の投与単位形態としては、 各種の形態が治療目的に応じて選 択でき、 その代表的なものとしては、 錠剤、 丸剤、 散剤、 粉末剤、 顆粒剤、 カブ セル剤などの固体投与形態、 溶液、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ、 エリキシルなどの 液剤投与形態が含まれ、 これらは更に投与経路に応じて経口剤、 非経口剤、 経鼻 剤、 経膣剤、 坐剤、 舌下剤、 軟膏剤などに分類され、 それぞれ通常の方法に従い、 調合、 成形乃至調製することができる。
例えば、 錠剤の形態に成形するに際しては、 上記製剤担体として例えば乳糖、 白糖、 塩化ナトリウム、 ブドウ糖、 尿素、 デンプン、 炭酸カルシウム、 カオリン、 結晶セルロース、 ケィ酸、 リン酸カリウムなどの賦形剤、 水、 エタノール、 プロ パノール、 単シロップ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチン溶液、 力ルポキシメ チルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メチルセルロース、 ポリビニ ルピロリドンなどの結合剤、 カルポキシメチルセルロースナトリウム、 カルポキ シメチルセルロースカルシウム、 低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、 乾燥 デンプン、 アルギン酸ナトリウム、 カンテン末、 ラミナラン末、 炭酸水素ナトリ ゥム、 炭酸カルシウムなどの崩壊剤、 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス テル類、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性 剤、 白糖、 ステアリン、 カカオバタ一、 水素添加油などの崩壌抑制剤、 第 4級ァ ンモニゥム塩基、 ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、 グリセリン、 デン プンなどの保湿剤、 デンプン、 乳糖、 カオリン、 ベントナイト、 コロイド状ケィ 酸などの吸着剤、 精製タルク、 ステアリン酸塩、 ホウ酸末、 ポリエチレングリコ ールなどの滑沢剤などを使用できる。
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、 例えば糖衣錠、 ゼラチン被包 錠、 腸溶被錠、 フィルムコーティング錠とすることができ、 また二重錠ないしは 多層錠とすることもできる。
丸剤の形態に成形するに際しては、 製剤担体として例えばブドウ糖、 乳糖、 デ ンプン、 カカオ脂、 硬化植物油、 カオリン、 タルクなどの賦形剤、 アラビアゴム 末、 トラガント末、 ゼラチン、 エタノールなどの結合剤、 ラミナラン、 カンテン などの崩壊剤などを使用できる。
カプセル剤は、 常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤 担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、 軟質カプセルなどに充填して調製される。 経口投与用液体投与形態は、 慣用される不活性希釈剤、 例えば水、 を含む医薬 的に許容される溶液、 ェマルジヨン、 懸濁液、 シロップ、 エリキシルなどを包含 し、 更に湿潤剤、 乳剤、 懸濁剤などの助剤を含ませることができ、 これらは常法 に従い調製される。
非経口投与用の液体投与投与形態、 例えば滅菌水性乃至非水性溶液、 ェマルジ ヨン、 懸濁液などへの調製に際しては、 希釈剤として例えば水、 ェチルアルコー ル、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 エトキシ化イソステアリ ルアルコール、 ポリオキシ化イソステアリルアルコール、 ポリオキシエチレンソ ルビタン脂肪酸エステル、 ォリーブ油などの植物油などを使用でき、 また注入可 能な有機エステル類、 例えばォレイン酸ェチルなどを配合できる。'これらには更 に通常の溶解補助剤、 緩衝剤、 湿潤剤、 乳化剤、 懸濁剤、 保存剤、 分散剤などを 添加することもできる。
滅菌は、 例えばバクテリア保留フィル夕一を通過させる濾過操作、 殺菌剤の配 合、 照射処理および加熱処理などにより実施できる。 また、 これらは使用直前に 滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製 することもできる。
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、 製剤担体として、 例えばポ リエチレングリコール、 カカオ脂、 高級アルコール、 高級アルコールのエステル 類、 ゼラチン、 半合成ダリセライドなどを使用できる。
ペースト、 クリーム、 ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、 希釈剤 として、 例えば白色ワセリン、 パラフィン、 グリセリン、 セルロース誘導体、 プ ロピレンダリコール、 ポリエチレングリコール、 シリコン、 ベントナイト、 オリ 一ブ油などの植物油などを使用できる。
経鼻または舌下投与用組成物は、 周知の標準賦形剤を用いて、 常法に従い調製 することができる。
尚、 本発明薬剤中には、 必要に応じて着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤、 甘味剤 などや他の医薬品などを含有させることもできる。
上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がなく、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性 別その他の条件、 疾患の程度などに応じて決定される。 例えば錠剤、 丸剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、 注射剤は単独でまたは ブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、 更に必要に応 じ単独で筋肉内、 皮内、 皮下もしくは腹腔内投与され、 坐剤は直腸内投与され、 経膣剤は膣内投与され、 経鼻剤は鼻腔内投与され、 舌下剤は口腔内投与され、 軟 膏剤は経皮的に局所投与される。
上記医薬繫剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、 特に限定 されず、 所望の治療効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条件な どに応じて広範囲より適宜選択される。 一般的には、 該投与量は、 通常、 1日当 りヒト体重 lkg当り、 約 0. 0l g〜10mg程度、 好ましくは約 0. l ^ g〜lmg程度とす るのがよく、 該製剤は 1日に 1回または数回に分けて投与することができる。
上記により得られる本発明骨格筋特異的ポリペプチド、 即ち本発明蛋白質は、 G F AT活性を有しており、 該蛋白質の全ポリペプチドまたはその一部は、 それ ら自身低血糖改善剤として有用である。
また、 後記実施例に示されるように本発明遺伝子は、 骨格筋や心臓の組織にお いてその発現が認められていることから、 本発明の G F A T 1 L遺伝子のアンチ センス D NAの全部または一部を包含する任意の遺伝子発現ベクターを作成し、 該発現ベクターをこれら骨格筋組織において細胞内の mR N Aに対して相補的配 列を有する R NAを作り出し、 翻訳を阻害することにより強制的に G F AT 1 L 遺伝子の発現を抑制させることができ、 かくして、 骨格筋組織におけるへキソサ ミン生合成経路において G FATの活性を阻害することができ、 細胞内へのダル コースの取り込みを促進させ、 血糖値を低下させることができ、 結果として糖代 謝を改善し、 糖尿病の進展の抑制または改善することができる。 本発明遺伝子は、 かかる抗糖尿病作用を有する遺伝子治療用組成物として、 或いは遺伝子治療剤と して利用できると考えられる。
また、 本発明は、 GFAT 1 L遺伝子の全部または一部を含有する遺伝子治療 用ベクターおよび該ベクターにより GF AT 1 L遺伝子を導入した細胞を有効成 分とする医薬を提供しょうとするものである。
即ち、 本発明によれば、 配列番号： 2で示される塩基配列のアンチセンス DN A配列の全部または一部を含む GF AT 1 Lアンチセンス遺伝子を含有する遺伝 子治療用導入用べクタ一および該ベクターにより GF AT 1 Lアンチセンス遺伝 子を導入した細胞、 並びに該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該べクタ一によ り GFAT 1 Lアンチセンス遺伝子を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療 剤が提供される。
また、 本発明によれば、 配列番号： 2で示される塩基配列のアンチセンス DN A配の全部または一部を含む GFAT 1 Lアンチセンス遺伝子を含有する遺伝子 治療用導入用ベクターおよび該ベクターにより GFAT 1 Lアンチセンス遺伝子 を導入した細胞を糖尿病患者の骨格筋細胞または患者の筋肉組織部位に投与する ことによってこれら組織における糖代謝を改善し、 糖尿病の進展の抑制または糖 尿病患者の糖代謝の改善をすることを特徴とする糖尿病治療剤を提供することが できる。
更にまた、 本発明によれば、 上記 GFAT 1 Lアンチセンス遺伝子を含有する 遺伝子治療用導入用のウィルスベクタ一を有効成分として含有する医薬、 特に、 骨格筋における糖代謝を改善するための処置などに使用される当該医薬が提供さ れる。
以下、 かかる遺伝子治療にっき詳述する。 尚、 以下の遺伝子治療の実施におい ては、 特記しないかぎり、 化学、 分子生物学、 微生物学、 組換え D NA、 遺伝学 および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。 これらは、 例えばマニアテ イス (Maniat is, T. , et al. , Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) )、 サムプル ック (Sambrook, J. , et al. , Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed.
(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981) )、 ァウスべル (Ausbel, F. M. , et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York, (1992) )、 グローバー（Glover, D. , DNA Cloning, I and II (Oxford Press) (1985) )、 アナンド（Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press (1992) )、 グスリ一
(Guthrie, G. , et al. , Guide to Yeast Genet ics and Molecular Biology, (Ac a demic Press) (1991) )およびフィンク（Fink， et al. , Hum. Gene Ther. , 3, 11-19 (1992)に記載されている。
本発明は、 本発明遺伝子の発現する細胞において、 細胞内の mRNAに対して 相補的配列を持つ R NAを作り出し、 翻訳を阻害し、 G F AT 1 L遺伝子の発現 を抑 01するためのアンチセンス医薬の提供による G F AT活性抑制または血糖の 上昇を抑制する遺伝子治療法を提供する。
該治療法は、 例えば G F AT 1 L遺伝子を有する G F AT発現細胞本来の mR N Aと結合させるか、 あるいは D N A二重螺旋の間に入り込み三重鎖を形成させ ることによって、 転写或いは翻訳の過程を阻害することによって、 標的とする遺 伝子の発現を抑制する方法である。 この方法は遺伝子の mRNAと相補的なアン チセンス 'オリゴヌクレオチドを製造し、 該アンチセンス ·オリゴヌクレオチド を標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
かかる G F AT 1 L遺伝子の発現機能を抑制する作用を供給すれば、 受容細胞
/標的細胞における G F AT活性または血糖の上昇を抑制することができる。 当 該アンチセンス .オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを用 いて染色体外に維持し、 目的の細胞に導入することができる。
上記アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを用いた糖尿病の遺伝子治療によれば、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 AAV由来のベクタ一に該アンチセンス ·ォ リゴヌクレオチドを組み込み、 これを G FAT活性発現細胞に感染させてアンチ センス ·オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、 所望の血糖降下効果 を得ることができる。
このように GFAT 1 L遺伝子を有する細胞にアンチセンス ·オリゴヌクレオ チドを導入して GFAT 1 L蛋白の発現を抑制させる場合、 当該アンチセンス · オリゴヌクレオチドは対応する G F A T 1 L遺伝子の全長に対応するものである 必要はなく、 例えば該 GFAT 1 L遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に 同質な機能を保持する限りにおいて、 前記した改変体であっても、 また特定の機 能を保持した一部配列からなる遺伝子を使用することもできる。
かかる組換えおよび染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベ クタ一は、 当該分野において既に知られており、 本発明ではかかる既知のベクタ 一のいずれもが使用できる。 例えば、 発現制御エレメントに連結した GFAT 1 L のアンチセンス ·ォリゴヌクレオチドのコピーを含み、 かつ目的の細胞内で 当該アンチセンス ·オリゴヌクレオチド産物を発現できるウィルスベクターまた はプラスミドベクタ一を挙げることができる。 かかるベクターとして、 通常前述 する発現用ベクターを利用することもできるが、 好適には、 例えば起源ベクター として、 米国特許第 5252479号明細書および PC T国際公開 W〇 93/0 7282号明細書に開示されたべクタ一 （pWP— 7A、 pwP— 19、 pWU — 1、 pWP— 8A、 pWP— 21および または pRS VLなど） または pR C/CMV (Invitrogen社製） などを用いて、 調製されたベクターを挙げること ができる。 より好ましくは、 後述する各種ウィルス ·ベクターである。
なお、 遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーター としては、 各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用するこ とができる。
その具体例としては、 例えば、 骨格筋に対しては、 骨格筋ァクチン、 ミオシン 重鎖、 クレアチンキナーゼなどを例示できる。 心臓に対しては、 心房性ナトリウ ム利尿ホルモン、 Ventricle- specif ic myosine軽鎖、 Atrial- and ventricular- specif ic a- myosine重鎖などを例示できる。 また、 肝臓に対しては、 アルブミ ン、 ひーフエ トプロテイン、 《 1—アンチトリプシン、 トランスフェリン、 トラ ンススチレンなどを例示できる。 結腸に対しては、 カルボン酸アンヒドラーゼ I、 カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。 子宮および胎盤に対しては、 ェ ストロゲン、 ァロマ夕ーゼサイトクローム P 4 5 0、 コレステロール側鎖切断 P 4 5 0、 1 7アルファ一ヒドロキシラーゼ P 4 5 0などを例示できる。
前立腺に対しては、 前立腺抗原、 g p 9 1—フォックス遺伝子、 前立腺特異的 カリクレインなどを例示できる。 乳房に対しては、 e r b— B 2、 e r b— B 3、 ;6—カゼイン、 ιδ—ラクトグロピン、 乳 ·蛋白質などを例示できる。 肺に対して は、 活性剤蛋白質 Cゥログロブリンなどを例示できる。 皮膚に対しては、 Κ— 1 4一ケラチン、 ヒ卜ケラチン 1または 6、 ロイクリンなどを例示できる。
脳に対しては、 神経膠繊維質酸性蛋白質、 成熟ァストロサイト特異蛋白質、 ミ エリン塩基性蛋白質、 チロシンヒドロキシラ一ゼなどを例示できる。 膝臓に対し ては、 ヴィリン、 グルカゴン、 ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド、 アミ ラーゼ、 P A P 1などを例示できる。 甲状腺に対しては、 チログロブリン、 カル シトニンなどを例示できる。 骨に対しては、 ひ 1コラーゲン、 ォステオカルシン、 骨シァログリコプロテインなどを例示できる。 腎臓に対してはレニン、 肝臓 Ζ骨 Ζ腎臓アル力リ性ホスフオタ一ゼ、 エリスロポェチンなどを例示できる。
なおアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、 導入 されるアンチセンス ·オリゴヌクレオチド （G F AT 1 L遺伝子配列に対応する 相補配列全部または一部） は、 本発明の遺伝子の塩基配列情報に基づいて、 前記 の如く、 一般的遺伝子工学的手法により容易に製造 ·取得することができる。 かかるアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ベクターの細胞への導入は、 例えばエレクト口ポレーシヨン、 リン酸カルシウム共沈法、 ウィルス形質導入な どを始めとする、 細胞に D N Aを導入する当該分野において既に知られている各 種の方法に従って行うことができる。 なお、 G F A T 1 L遺伝子のアンチセン ス ·オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、 それ自体単離状態で G F AT 活性または血糖の上昇を抑制するための医薬や、 治療研究のためのモデル系とし て利用することも可能である。
遺伝子治療においては、 上記のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用べク 夕一は、 患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与すること により患者の標的細胞内に導入することができる。 この際全身的投与によれば、 他の部位に G F A T m R N Aが発現し得るいずれの細胞にも到達させることがで きる。 形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない 場合には、 該投与を定期的に繰り返せばよい。
本発明の遺伝子治療方法は、 前述するアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入 用の材料 （アンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用べクタ一） を直接体内に投 与するインビポ （in vivo) 法と、 患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出 して体外で遺伝子を導入して、 その後、 該細胞を体内に戻すェクスビポ （ex vivo) 法の両方の方法を包含する。
また G F AT 1 L遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを直接細胞内に 導入し、 R NA鎖を切断する活性分子であるリポザィムによる遺伝子治療も可能 である。
後述する、 本発明 G F AT 1 L遺伝子に対応する配列のアンチセンス ·オリゴ ヌクレオチド全部もしくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該べ クタ一によりヒト G F AT 1 L遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを導 入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、 特に糖尿病をその利用 対象とするものであるが、 上記の遺伝子治療 （処置） は、 糖尿病以外にも糖尿病 性神経症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症のような糖尿病合併症の治療、 並びに 遺伝子標識をも目的として行うことができる。
また、 アンチセンス，オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、 遺伝子治療
(処置） の対象により適宜選択することができる。 例えば、 標的細胞として、 G F AT発現が認められる細胞、 特に骨格筋、 心臓組織以外に、 リンパ球、 線維芽 細胞、 肝細胞、 造血幹細胞などを挙げることができる。
上記遺伝子治療におけるアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入方法には、 ゥ ィルス的導入方法および非ウィルス的導入方法が含まれる。
ウィルス的導入方法としては、 例えば、 G F AT 1 L遺伝子のアンチセンス · ォリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、 べク 夕一としてレトロウイルスベクタ一を用いる方法を挙げることができる。 その他 のウィルスベクターとしては、 アデノウイルスベクター、 H I V (human immunodef iciency virus) ベクタ一、 アデノ随伴ウィルスベクター （AAV, ad eno- associated virus) , ヘルぺスウィルスベクター、 単純へルぺスウィルス （H S
V) ベクター、 ェプス夕イン一パ一ウィルス （E B V, Epstein-Barr virus) ベ クタ一などが挙げられる。
非ウィルス的な遺伝子導入方法としては、 リン酸カルシウム共沈法； D NAを 封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルス を融合させて膜融合リボソームを作成し、 細胞膜と直接融合させて D NAを細胞 内に導入する膜融合リボソーム法 〔Kato, K.，et al.， J. Biol. Chem. , 266. 22
071-22074 (1991)〕 ；プラスミド D NAを金でコートして高圧放電によって物理 的に細胞内に D NAを導入する方法 [Yang, N. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. ,
87. 9568-9572 (1990)〕 ；プラスミド D NAを直接インビポで臓器や標的組織に 注入するネイキッド （naked) D NA法 〔Wolii, J. A.， et al. , Science, 24ϊ>
1465-1467 (1990) ] ；多重膜正電荷リボソームに包埋した遺伝子を細胞に導入す るカチォニック · リポソ一ム法 〔八木国夫， 医学のあゆみ， Vol. 175， No. 9, 635 -637 (1995)〕 ；特定細胞のみに遺伝子を導入し、 他の細胞に入らないようにする ために、 目的とする細胞に発現するレセプ夕一に結合するリガンドを D N Aと結 合させてそれを投与するリガンドー D NA複合体法 〔Fr indeis， et al. , Trends Biotechnol , H, 202 (1993)； Mi l ler, et al. , FASEB J. , 9, 190 (1995)〕 など を使用することができる。
上記リガンドー D N A複合体法には、 例えば肝細胞が発現するァシァ口糖蛋白 レセプターをターゲットとしてァシァ口糖蛋白をリガンドとして用いる方法 〔Wu， et al. , J. Biol. Chem. , 266· 14338 (1991)； Ferkol, et al. , FASEB J. , 7, 108 1-1091 (1993)〕、 標的細胞が強く発現しているトランスフェリン ·レセプターを 標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法 〔Wagner et al. , Proc. Nat l. Acad. Sci. , USA. , 87, 3410 (1990)〕 などが含まれる。
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、 上記の如き各種の生物学的および物 理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。 該組合せによる方法 としては、 例えばあるサイズのプラスミド D NAをアデノウイルス ·へキソン蛋 白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。 該方法によ れば、 得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、 かくして得られる三 分子複合体を細胞に感染させることにより本発明アンチセンス ·オリゴヌクレオ チドの導入を行い得る。 この方法では、 アデノアィルスベクターにカップリング した D NAが損傷される前に、 効率的な結合、 内在化およびエンドソーム分解が 可能となる。 また、 前記リボソーム ZD NA複合体は、 直接インビポにて遺伝子 導入を媒介できる。
以下、 具体的な本発明のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ウィルスべ クタ一の作成法並びに標的細胞または標的組織へのアンチセンス ·オリゴヌクレ ォチド導入法について述べる。
レトロウイルスベクター ·システムは、 ウィルスベクタ一とヘルパー細胞 （パ ッケージング細胞） からなつている。 ここでヘルパー細胞は、 レトロウイルスの 構造蛋白質 g ag (ウィルス粒子内の構造蛋白質)、 p o 1 (逆転写酵素)、 e n V (外被蛋白質） などの遺伝子を予め発現しているが、 ウィルス粒子を生成して いない細胞を言う。 一方、 ウィルスベクターは、 パッケージングシグナルや LT R (long terminal repeats)を有しているが、 ウィルス複製に必要な g a g、 p o l、 e nvなどの構造遺伝子を持っていない。 パッケージング 'シグナルはゥ ィルス粒子のアセンブリ一の際にタグとなる配列で、 選択遺伝子 （n e o， hy g) とクローニングサイ卜に組込まれた所望の導入アンチセンス ·オリゴヌクレ ォチド （GFAT 1 L に対応する全アンチセンス ·ォリゴヌクレオチドまたは その断片） がウィルス遺伝子の代りに挿入される。 ここで高力価のウィルス粒子 を得るにはインサートを可能な限り短くし、 パッケージングシグナルを g a g遺 伝子の一部を含め広くとることと： g g遺伝子の ATGを残さぬようにするこ とが重要である。
所望の G FAT 1 L遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを組込んだベ クタ一 DN Aをヘルパー細胞に移入することによって、 ヘルパー細胞が作ってい るウィルス構造蛋白質によりべクタ一ゲノム RN Aがパッケージされてウィルス 粒子が形成され、 分泌される。 組換えウィルスとしてのウィルス粒子は、 標的細 胞に感染した後、 ウィルスゲノム RN Aから逆転写された DN Aが細胞核に組み 込まれ、 ベクター内に挿入されたアンチセンス遺伝子が発現する。
尚、 遺伝子の導入効率を上げる方法として、 フイブロネクチンの細胞接着ドメ ィンとへパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法
CHanenberg, H. , et al.， Exp. Hemat. , 23, 747 (1995)] を採用することもできる。 上記レトロウイルスベクター ·システムにおいて用いられるベクターとしては、 例えばマウスの白血病ウィルスを起源と^ "るレトロウイルス 〔McLadilin, J. . , et al., Proc. Nail. Acad. Res. Mole Biol., 38- 91-135 (1990)〕 を例示 することができる。 アデノウイルスベクタ一を利用する方法につき詳述すれば、 該アデノウイルス ベクターの作成は、 バークネル [Berkner, K. L. , Curr. Topics Microbiol.
Immunol. , 158. 39-66 (1992)〕、 瀬戸口康弘ら [Setoguchi, Y. , et al. , Blood, 84. 2946-2953 (1994)〕、 鐘カ江裕美ら 〔実験医学， H, 28-34 (1994)〕 および ケナ一ら CKetner, G. , et aL . Proc. Nat l. Acad. Sc i. , USA. , 91. 6186-6190 (199 4) 3 の方法に準じて行うことができる。
例えば、 非増殖性アデノウイルスベクタ一を作成するには、 まずアデノウィル スの初期遺伝子の E 1および Zまたは E 3遺伝子領域を除去する。 次に、 目的と する所望の外来遺伝子発現単位 （目的とする導入用アンチセンス ·オリゴヌクレ ォチド、 即ち本発明 G F AT 1 L遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドそ のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを転写するためのプロモーター、 転写され た遺伝子の安定性を賦与するポリ Aから構成） およびアデノウイルスゲノム D N Aの一部を含むプラスミドベクターと、 アデノウイルスゲノムを含むプラスミド とを、 例えば 2 9 3細胞に同時にトランスフエクシヨンする。 この 2者間で相同 性組換えを起こさせて、 遺伝子発現単位と E 1とを置換することにより、 所望の G F A T 1 L遺伝子のアンチセンス .オリゴヌクレオチドを包含するベクターで ある非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。 また、 コスミド ベクタ一にアデノウイルスゲノム D N Aを組み込んで、 末端蛋白質を付加した 3 ' 側アデノウイルスベクターを作成することもできる。 更に組換えアデノウィ ルスべクタ一の作成には、 YA Cベクターも利用可能である。
アデノ随伴ウィルス （AAV) ベクターの製造につき概略すると、 AA Vはァ デノウィルスの培養系に混入してくる小型のウィルスとして発見された。 これに は、 ウィルス複製にヘルパーウィルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖す るパルボウイルス属と、 ヘルパーウィルスを必要とするディベンドウィルス属の 存在が確認されている。 該 A A Vは宿主域が広く、 種々の細胞に感染するありふ れたウィルスであり、 ウィルスゲノムは大きさが 4 6 8 0塩基の線状一本鎖 D N Aからなり、 その両端の 1 4 5塩基が I T R (inverted terminal repeat)と呼ば れる特徴的な配列を持って存在している。 この I T Rの部分が複製開始点となり、 プライマ一の役割をなす。 更にウイルス粒子へのパッケ一ジングゃ宿主細胞の染 色体 D NAへの組込みにも、 該 I T Rが必須となる。 また、 ウィルス蛋白質に関 しては、 ゲノムの左半分が非構造蛋白質、 即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白 質の R e pをコードしている。
組換え AAVの作成は、 AAVが染色体 D N Aに組み込まれる性質を利用して 行うことができ、 かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。 この方法 は、 より詳しくは、 まず野生型 AAVの 5 'と 3 'の両端の I T Rを残し、 その間 に所望の導入用アンチセンス ·オリゴヌクレオチド （G F AT 1 L遺伝子のアン チセンス ·オリゴヌクレオチド） を挿入したプラスミド （AAVベクタープラス ミド） を作成する。 一方、 ウィルス複製やウィルス粒子の形成に必要とされるゥ ィルス蛋白質は、 別のへルパープラスミドにより供給させる。 この両者の間には 共通の塩基配列が存在しないようにし、 遺伝子組換えによる野生型ウィルスが出 現しないようにする必要がある。 その後、 両者のプラスミドを例えば 2 9 3細胞 へのトランスフエクションにより導入し、 さらにヘルパーウィルスとしてアデノ ウィルス （2 9 3細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい） を感染させると、 非増殖性の所望の組換え AAVが産生される。 続いて、 この組換え AAVは核内 に存在するので、 細胞を凍結融解して回収し、 混入するアデノウイルスを 5 6 °C 加熱により失活させる。 更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により 組換え AAVを分離濃縮する。 上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換え A A Vを得ることができる。
E B Vベクターの製造は、 例えば清水らの方法に準じて行うことができる 〔清 水則夫ら、 細胞工学， 14 (3) , 280-287 (1995)〕。
本発明のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用 E B Vベクターの製造につ き概略すると、 E Bウィルス （Epstein- Barr virus : EBV) は、 1964年にェプス タイン (Epstein)らによりバーキット （Burkitt) リンパ腫由来の培養細胞より分 離されたヘルぺス科に属するウィルスである 〔Kieff, E. and Liebowitz, D.： Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, PP.1889 - 1920〕。 該 EBVに は細胞をトランスフォームする活性があるので、 遺伝子導入用べクタ一とするた めには、 このトランスフオーム活性を欠いたウィルスを調製しなければならない。 これは次の如くして実施できる。
即ち、 まず、 所望の外来遺伝子を組み込む標的 DNA近傍の EBVゲノムをク ローニングする。 そこに外来遺伝子の DNA断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、 組 換えウィルス作製用べクタ一とする。 次いで適当な制限酵素により切り出された 組換えウィルス作製用ベクターを EBV陽性 Ak a t a細胞にトランスフエクト する。 相同組換えにより生じた組換えウィルスは抗表面免疫グロブリン処理によ るウィルス産生刺激により野生型 Ak a t aEBVとともに回収できる。 これを EBV陰性 Ak a t a細胞に感染し、 薬剤存在下で耐性株を選択することにより、 野生型 EBVが共存しない所望の組換えウィルスのみが感染した Ak a t a細胞 を得ることができる。 さらに組換えウィルス感染 Ak a t a細胞にウィルス活性 を誘導することにより、 目的とする大量の組換えウィルスベクタ一を産生するこ とができる。
組換えウィルスベクターを用いることなく所望のアンチセンス ·オリゴヌクレ ォチドを標的細胞に導入する、 非ウィルスベクターの製造は、 例えば膜融合リポ ソ一ムによる遺伝子導入法により実施することができる。 これは膜リボソーム
(脂質二重膜からなる小胞） に細胞膜への融合活性をもたせることにより、 リポ ソ一ムの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
上記膜融合リボソームによるアンチセンス ·オリゴヌクレオチドの導入は、 例 えば中西らの方法によって行うことができる 〔Nakanishi,M.， et al.,Exp. Cell
Res. , j59. 399-499 (1985)； Nakanishi, M. , et al. , Gene introduction into animal tissues. In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Del ivery (ed. by Lee, V. H. et al. ) . , Harwood Academic Publ ishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp. 337— 349〕。
以下、 該膜融合リボソームによるアンチセンス ·オリゴヌクレオチドの導入法 にっき概略する。 即ち、 紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウィルスと所望 のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入した リボソームを 3 7 °Cで融合させる。 この膜融合リボソームは、 内側にリボソーム 由来の空洞を、 外側にウィルス ·エンベロープと同じスパイクがある疑似ウィル スともよばれる構造を有している。 更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、 標的と する培養細胞または組織細胞に対して膜融合リボソームを 4 °Cで吸着させる。 次 いで 3 7 °Cにするとリボソームの内容物が細胞に導入され、 所望のアンチセン ス ·オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できる。 ここでリボソームとして用い られる脂質としては、 5 0 % (モル比） コレステロールとレシチンおよび陰電荷 をもつ合成リン脂質で、 直径 3 0 0 nmの 1枚膜リボソームを作製して使用する のが好ましい。
また、 別のリボソームを用いてアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを標的細胞 に導入する方法としては、 カチォニック · リボソームによるアンチセンス ·オリ ゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。 該方法は、 八木らの方法に準じて 実施できる CYagi. K. , et al. , Β. Β. R. C. , 週， 1042-1048 (1993)〕。 この方法は、 プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、 リボソーム膜の内外両面 に正の電荷を与え、 静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、 細胞との相 互作用を高めようとするものである。 ここで用いられるリボソームは正荷電を有 する多重膜の大きなリボソーム （mul t i lamel lar large vesicles : ML V) が有 用であるが、 大きな 1枚膜リボソーム （large uni lamel lar vesicles : L UV) や小さな 1枚膜リボソーム （smal l uni lamel lar vesicles : S UV) を使用して プラスミドとの複合体を作製し、 所望のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを導 入することも可能である。 プラスミト包埋カチォニック ML Vの調製法について概略すると、 これはまず 脂質 TMAG (N- (a-trimethylanimonioacetyl) -didodecyl-D-glutamate chloride)^ DLPC (dilauroyl phosphatidylcholine) および DOPE (dioleoyl p osp atidylethanolamine) をモル比が 1 ： 2 ： 2となる割合で含 むクロ口ホルム溶液 （脂質濃度として ImM) を調製する。 次いで総量 l molの脂 質をスピッツ型試験管に入れ、 ロータリーエバポレー夕一でクロ口ホルムを減圧 除去して脂質薄膜を調製する。 更に減圧下にクロ口ホルムを完全に除去し、 乾燥 させる。 次いで 20 zgの遺伝子導入用プラスミドを含む 0.5mlのダルベッコのリン 酸緩衝生理食塩液一 Mg, C a含有を添加し、 窒素ガス置換後、 2分間ポルテツ クスミキサーにより攪袢して、 所望のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを含有 するプラスミド包埋カチォニック M L V懸濁液を得ることができる。
上記で得られたプラスミド包埋カチォニック M L Vを遺伝子治療剤として使用 する一例としては、 例えば発現目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを組み込 んだ発現プラスミドを上記カチォニック ML Vに DNA量として 0.6 g、 リポソ ーム脂質量として 30nmolになるように包埋し、 これを 2 1のリン酸緩衝生理食塩 液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する 方法が例示できる。
ところで、 遺伝子治療とは 「疾病の治療を目的として、 遺伝子または遺伝子を 導入した細胞をヒトの体内に投与すること」 と厚生省ガイドラインに定義されて いる。 しかしながら、 本発明における遺伝子治療とは、 該ガイドラインの定義に 加えて、 前記した標的細胞に GFAT1L遺伝子の、 GFAT発現抑制アンチセ ンス DN Aとして特徴付けられるアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを導入する ことによって糖尿病を始めとする糖尿病合併症の治療のみならず、 更に標識とな る遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒト体内に導入することも含 むものとする。
本発明の遺伝子治療において、 所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入 方法には、 代表的には 2種類の方法が含まれる。
その第 1法は、 目的とするアンチセンス ·オリゴヌクレオチド （GFAT1L 遺伝子のアンチセンス ·ォリゴヌクレオチド） を導入された、 アデノウイルスべ クタ一等のウィルスベクターを患者の標的細胞または標的組織に直接感染させる 遺伝子導入法である。
上記第 1法の別法として、 目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチド （GFAT 1 L遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド） を含有するウィルスベクター を感染、 あるいはウィルスベクターを含有するウィルス産生細胞と共培養し、 患 者由来の細胞に目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを導入し、 患者体内に移 植する ex vivo法も採用することができる。
第 2法は、 目的とする適当な動物細胞発現ベクタープラスミド DNAに組み込 まれたアンチセンス ·オリゴヌクレオチド (GFAT 1 L遺伝子のアンチセン ス ·オリゴヌクレオチド) を直接患者の体内や、 骨格筋などの標的部位に注入す る遺伝子直接導入法 （直接法） である。 これは例えば HV Jリボソーム法、 カチ ォニックリボソーム法、 DNA直接注射法、 電気穿孔法、 遺伝子銃法等により実 施できる。
上記実施においては、 特に体外における予備試験によって、 遺伝子導入法によ つて、 実際に目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチド （GFAT 1L遺伝子のァ ンチセンス ·オリゴヌクレオチド） が導入されるか否かを、 予めベクター遺伝子 cDNAの PCR法による検索や in situP C R法によって確認するか、 あるい は目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチド （GFAT 1 L遺伝子のアンチセン ス ·オリゴヌクレオチド） の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上 昇または低下や、 標的細胞への効果を確認することが望ましい。 また、 ウィルス ベクタ一を用いる場合には、 増殖性ウイルスの検索を P C R法で行うなどして、 遺伝子治療に際し、 これらのアンチセンス 'オリゴヌクレオチド等の導入による 安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。 本発明はまた、 本発明のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ベクターま たは目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチド （G F A T 1 L遺伝子のアンチセン ス ·オリゴヌクレオチドど） が導入された細胞を活性成分とし、 それを薬学的有 効量、 適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医 薬製剤 （遺伝子治療剤） を提供する。
本発明の医薬組成物 （医薬製剤） に利用できる医薬担体としては、 製剤の使用 形態に応じて通常使用される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面 活性剤、 滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、 これらは得られる製 剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、 前記した G F A T 1 L蛋白質抗体製 剤の製剤例を同様に挙げることができ、 治療目的に応じて各種の形態から適宜選 択することができる。
例えば、 本発明のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医 薬製剤は、 該ベクタ一をリポソ一ムに包埋された形態あるいは所望のアンチセン ス ·オリゴヌクレオチドが包含されるウィルスベクタ一を含むウィルスによって 感染された培養細胞の形態に調製される。
これらは、 リン酸緩衝生理食塩液 （P H 7 . 4 )、 リンゲル液、 細胞内組成液 用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、 またプロ夕ミンなどの遺 伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。 上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がなく、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性 別その他の条件、 疾患の程度などに応じて決定される。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、 特に限定 されず、 所望の治療効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条件な どに応じて広範囲より適宜選択される。
該製剤は 1日に 1回または数回に分けて投与することもでき、 1から数週間間 隔で間欠的に投与することもできる。 尚、 好ましくは、 プロ夕ミンなど遺伝子導 入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
本発明に従う遺伝子治療を糖尿病の治療に適用する場合は、 前記した種々の遺 伝子治療を適宜組合わせて行う （結合遺伝子治療） こともでき、 前記した遺伝子 治療に、 従来のインスリン療法、 食事療法、 などを組合わせて行うこともできる。 さらに本発明遺伝子治療は、 その安全性を含めて、 N I Hのガイドラインを参考 にして実施することができる Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。
本発明によれば、 細胞の GF AT活性を促す GF AT 1 L遺伝子の存在を検出 するために、 血液または血清のごとき生物学的試料を調製し、 所望により核酸を 抽出し、 GFAT 1 Lの感受性遺伝子が存在する否かについて分析することが可 能である。 また、 細胞または組織における GFAT活性レベル、 GFATmRN Aの発現レベルをへキソサミン生合成経路調節機能障害への進行または予後指標 として検出するためには、 へキソサミン生合成経路調節障害を有する生物学的な 試料を調製し、 GFAT 1 L遺伝子が存在するか否か、 あるいはその mRNAの 量について分析すればよい。 この方法を用いることにより細胞または組織におけ る GFAT活性のレベル、 GFATmRNAの発現レベル、 へキソサミン生合成 経路の調節機能障害への進行、 または予後指標として検出することが可能となり、 これらの診断、 例えば糖尿病の診断並びに糖尿病治療効果の判定並びに予後の予 測が可能となる。
該検出方法は、 例えば、 予め GFAT活性を有する患者サンプルから得られた
GFAT 1 L遺伝子に関する情報を基に、 該 DNA断片を作成し、 GFAT1L 遺伝子のスクリーニングおよび またはその増幅に用いられるように設計される。 より具体的には、 例えばプラークハイプリダイゼーシヨン、 コロニーハイブリダ ィゼーシヨン、 サザンブロット法、 ノーザンブロット法などにおけるプローブと しての性質を有するもの、 核酸配列をポリメラ一ゼで増幅するポリメラーゼ連鎖 反応 （PCR) により、 増幅した GFAT 1 Lの全部または一部の DNA断片を 得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。 その ためにはまず G F A T 1 Lと同じ配列を持つプライマーを作成し、 スクリ一ニン グ用プロ一ブとして用い、 生物学的試料 （核酸試料） と反応させることにより、 当該 G F AT 1 L配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。 該核酸試 料は、 標的配列の検出を容易にする種々の方法、 例えば変性、 制限消化、 電気泳 動またはドッ卜ブロッティングで調製してもよい。
前記スクリーニング方法としては、 特に P C R法を用いるのが感度の点から好 ましく、 該方法は、 G F A T 1 L断片をプライマーとして用いる方法であれば特 に制限されず、 従来公知の方法（Sc ience, 塁， 1350- 1354 (1985) )や新たに開発 された、 或いは将来使用される P C R変法 (榊 佳之、 ほか編、 羊土社、 実験医学、 増刊， 8 (9) (1990)； 蛋白質 ·核酸 ·酵素、 臨時増刊、共立出版 (株)， 35 (17) (1990) )のいずれも利用することが可能である。
プライマーとして使用される D N A断片は、 化学合成したオリゴ D N Aであり、 これらオリゴ D NAの合成は自動 D NA合成装置など、 例えば D NA合成装置
(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus : フアルマシア社製）を使用して合成するこ とができる。 合成されるプライマー（センスプライマ一またはアンチセンスブラ イマ一）の長さは約 1 0〜5 0ヌクレオチド程度が好ましく、 より好ましくは 1
5〜 3 0ヌクレオチド程度が例示できる。 前記において、 特に合成されるプライ マ一は、 公知の他の G F A Tの D N A配列と区別される配列を使用することが好 ましい。 上記スクリーニングに用いられるプローブは、 通常は標識したプローブ を用いるが、 非標識であってもよく、 直接的または間接的に標識したリガンドと の特異的結合によって検出してもよい。 適当な標識、 並びにプローブおよびリガ ンドを標識する方法は、 本発明の技術分野で知られており、 ニック ' トランスレ ーシヨン、 ランダム ·プライミンダムまたはキナーゼ処理のような、 既知の方法 によって取り込ませることができる放射性標識、 ピオチン、 蛍光性基、 化学発光 基、 酵素、 抗体などがこれらの技術に包含される。 検出のために用いる P C R法としては、 例えば R T _ P C R法が例示されるが、 当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
また、 本発明の測定方法は、 試料中の G FAT 1 L遺伝子の検出のための試薬 キットを利用することによって、 簡便に実施することができる。
故に本発明は上記 GFAT 1 L DNA断片を含有することを特徴とする GF AT 1 Lの検出用試薬キッ卜が提供される。
該試薬キットは、 少なくとも配列番号： 2に示される塩基配列もしくはその相 補的塩基配列の一部または全てにハイブリダィズする DNA断片を必須構成成分 として含んでいればよく、 他の成分として、 標識剤、 PCR法に必須な試薬 （例 えば、 T a QDNAポリメラーゼ、 デォキシヌクレオチド三リン酸、 プライマー など） が含まれていてもよい。
標識剤としては、 放射性同位元素または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙 げられ、 DNA断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。 更 に当該試薬キットには、 測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、 標準抗体、 緩衝液、 洗浄剤、 反応停止液などが含まれていてもよい。
更に本発明は、 前記測定方法を用いる糖代謝障害、 特にへキソサミン生合成障 害の診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供するもの である。
また、 前記方法を用いることにより、 被検試料中から得られた GFAT 1 L配 列を直接的若しくは間接的に配列決定することにより、 野生型 GFAT 1 Lと相 同性の高い相同物である新たな GFAT 1 L遺伝子に関連する関連遺伝子を見出 すことができる。
従って、 本発明はかかる測定と被検試料中の GFAT 1 L DNAの配列決定 により、 被検試料中のヒト GFAT 1 L遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリ一 ニング方法をも提供するものである。
また、 本発明の配列番号： 1で示されるヒト GFAT1 L遺伝子でコードされ るポリペプチド、 または該配列番号： 1において、 1もしくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列、 またはこれらの断片からポリべプチ ドを合成し、 もしくは該ポリペプチドに対する抗体を合成することによって、 野 生型 G FAT 1 Lおよび Zまたは変異 G FAT 1 Lの測定が可能となる。
従って、 本発明は、 野生型 GFAT 1 Lおよび//または変異 GFAT 1 Lの抗 体測定法、 抗原測定法を提供するものである。 該測定法によって GFAT活性の 程度、 血糖調節障害の程度、 へキソサミン生合成経路の機能障害の程度あるいは 糖尿病の重症度、 糖尿病性神経症、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性腎症などの糖尿病 合併症の程度を野生性型 G FAT 1 Lポリペプチドの変化に基づいて検出するこ とも可能である。 かかる変化は、 この分野における前記慣用技術による GFAT
1 L配列分析によっても決定できるが、 更に好ましくは、 抗体（ポリクローナル またはモノクローナル抗体）を用いて、 GFAT 1 Lポリペプチド中の相違、 ま たは GFAT 1 Lポリペプチドの有無を検出することができる。 本発明の測定法 の具体的な例示としては、 GFAT 1 L抗体は、 血液 ·血清などのヒトより採取 した生体材料試料含有溶液から GFAT1 L蛋白質を免疫沈降し、 かつポリアク リルアミドゲルのウエスタン ·ブロットまたはィムノブロット上で GFAT 1 L ポリペプチドと反応することができる。 また、 GFAT 1 L抗体は免疫組織化学 的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中の GFAT 1 Lポリペプチドを 検出することができる。 抗体産生技術および精製する技術は当該分野においてよ く知られているので、 これらの技術を適宜選択することができる。
野生型 GFAT 1 Lまたはその突然変異体を検出する方法に関連するより好ま しい具体例には、 モノクローナル抗体および Zまたは、 ポリクローナル抗体を用 いるサンドイッチ法を含む、 酵素結合ィムノソルベントアツセィ（EL I SA)、 放射線免疫検定法（R I A)、 免疫放射線検定法（ I RMA)、 および免疫酵素法
(I EMA)が含まれる。
また、 本発明の GFAT活性を阻害する薬剤の候補化合物をスクリーニングす る方法において、 例えば、 GFAT 1 L遺伝子発現産物または GFAT 1 L蛋白 質 (以下、 GFAT 1 L蛋白質と併せて称する）またはそれらの断片に対する抗体 と、 候補化合物を含む被検液および標識化された GFAT 1 L蛋白質または GF AT 1 L蛋白質の部分ペプチドとを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化 された GFAT 1 L蛋白質または GFAT 1 L蛋白質の部分ペプチドの割合を測 定することを特徴とする被検液中の GFAT 1 L蛋白質または GFAT 1 L蛋白 質の部分べプチドを定量するスクリーニング方法も可能である。
また候補化合物を含む被検液と担体上に不溶化した前記抗体および標識化され た別の異なる GFAT 1 L蛋白質に対する抗体とを同時あるいは連続的に反応さ せたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の GFAT 1 L蛋白質または GFAT 1 L蛋白質の部分ペプチドの定量法も可能で ある。
さらに、 GFAT 1 L蛋白質または GFAT 1 L蛋白質の部分ペプチドに基質 を接触させた場合と GFAT 1 L蛋白質または GFAT 1 L蛋白質の部分べプチ ドに基質および試験化合物を接触させた場合における、 GFAT 1 L蛋白質また は G F A T 1 L蛋白質の部分ペプチドの酵素活性を測定して、 比較することによ つて GFAT 1 L蛋白質の酵素活性 （例、 GFAT活性） を阻害する化合物をス クリーニングすることも可能である。
上記において、 基質としては、 本発明蛋白質または GFAT 1 L蛋白質の部分 ペプチドの基質となり得るものであれば何れのものでもよく、 通常、 フルクトー ス一 6—リン酸およびグルタミンが用いられる。 フルクトースー 6―リン酸とし ては、 放射線標識 （例、 14C、 3Hなど） したフルクトース— 6—リン酸など を用いるのが好適である。 試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白、 非べ プチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織 抽出液、 血 ·などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明蛋白質または GFAT 1 L 蛋白質の部分ペプチドを、 スクリーニングに適した緩衝液に懸濁させてこれらの 標品を調製する。 緩衝液は、 pH約 4〜10 (望ましくは pH約 6〜8) のリン 酸バッファー、 トリスー塩酸バッファ一などの、 本発明蛋白質または G FAT 1 L蛋白質の部分ペプチドと基質との結合を阻害しないものであればいずれでもよ い。
本発明蛋白質または GFAT 1 L蛋白質の部分ペプチドの GFAT活性は、 公 知の方法、 例えばマーシャルらの方法（Journal of Biological Chemistry, vol. 266, No. 8, 4706-4712, (1991) )に準じて測定することができる。
該方法は、 例えば 96穴のマイクロプレート上に 200 ΐの基質溶液（400 mM リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH 7.5)、 50 mM塩化力リゥム、 1.25 mM EDTA、 0.3 mM APAD. 6 U/ml (GDH)、 0-6 mMグルタミン、 0-6 mMフルクト一ス— 6—リン酸 (F - 6- P))に適宜希釈した GFAT 1 Lの大腸菌溶解質 50 lを加え、 3 7°Cで 60分間反応させ、 この時の 365 nmの吸光度の変化をマイクロプレートリー ダ一により測定することにより実施することができる。 上記 G F A T活性の測定 は、 GFATにより生成されたグルタメート（Glutamate)をさらにダルタメ一ト 脱水素酵素（Glutamate deydrogenase:GDH) と反応させ、 その際同時に惹起され る補酵素である APADが AP ADH に還元される反応に伴われる吸光度の変 化を G F A T活性として表わす方法である。
また、 別方法としては、 例えばスミスらの方法 〔アナリティカル ·バイオケミ ストリ一 (Analytical Biochemistry) , 98- 478-480 (1979)〕 を挙げることが できる。 該方法は例えば次の如くして実施される。 即ち、 まず 1 2 Μ フルク ト一ス一 6 _リン酸、 5 / Μ グルタミンおよび 0. 2M リン酸バッファ一 （p
H8. 0) からなる混合液に本発明蛋白質または GFAT 1 L蛋白質の部分ぺプ チドを添加し、 得られる溶液を 25°Cで 30分間保温する。 同溶液に 0. 5 M塩 酸を加え、 98 °Cで 2時間反応させた後、 2. 5% NaN02と12. 5% NH 403SNH2を添加し、 さらに 0.25% 2—メチルー 2 _ベンゾチアゾロンを 添加する。 次に、 0. 5% Fe C l 3を加えて、 その溶液を 650 nmで吸光度 を測定し、 生成されるダルコサミン— 6—リン酸を定量する。
上記各方法において、 医薬候補化合物の選択方法は、 例えば各試験において上 記試験化合物が添加されていない場合における G F AT活性が上記試験化合物が 添加されている場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは約 30%以上、 より好 ましくは約 50%以上阻害されている場合、 該試験化合物を本発明蛋白質または G F A T 1 L蛋白質の部分ペプチドの G F A T活性を阻害する化合物として選択 することができる。
また本発明によれば、 上記 GF AT活性を阻害する薬剤の候補化合物をスクリ —ニングするためのスクリーニング用キットが提供できる。
本発明のスクリーニング用キットは、 構成要素の一つとして、 本発明の蛋白質 または GFAT 1 L蛋白質の部分ペプチドを含有するものである。 本発明のスク リーニング用キットの具体例を以下に例示する。 >
1. スクリーニング用キット I
〔スクリーニング用試薬〕
1) GFAT 1 L標品： 50 本発明の GFAT 1 L大腸菌溶解質（GFAT 1 L蛋白質の部分ペプチド）
2 ) 補酵素入測定用緩衝液： 400 mMリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.5)、 5 OmM塩化カリウム、 1. 25mM EDTA、 0. 3mM APAD、 6 U/m 1 (GDH)
3) 基質： 0— 6mMフルクトース— 6—リン酸、 0— 6mMグルタミン 検出は、 365 nmでの吸光度を測定する。
〔測定法〕 96穴のマイクロプレート上に 200 a Iの基質溶液 （400 mM リン酸ナトリウム緩衝液 （pH 7. 5)、 5 OmM塩化カリウム、 1. 2 5mM
EDTA、 0. 3mM APAD、 6 U/m 1 (GDH), 0— 6mMグルタ ミン、 0— 6mMフルクト一ス一 6—リン酸 （F— 6—P)) に適宜希釈した G FAT 1 Lの大腸菌溶解質 50 }11を加え、 37°Cで 60分間反応させる。 この 時の 365 nmの吸光度の変化をマイクロプレートリーダ一により測定する。
2. スクリーニング用キット I I
〔スクリーニング用試薬〕
1) 蛋白質標品：本発明の蛋白質（G FAT 1 L蛋白質の部分ペプチド）または その塩
2) 測定用緩衝液： 0.2M リン酸バッファ一 （pH8.0)
3) 基質： 12 nU フルクトース _ 6 _リン酸、 5 ιιΜ グルタミン 検出は、 650 nmでの吸光度を測定する。
〔測定法〕 12 M フルク 1 ス— 6—リン酸、 5 M グルタミン、 本発明の タンパク質またはその塩および 0. 2M リン酸バッファ一 （pH8. 0) からな る反応液に試験化合物を添加した後、 25 °Cで 30分間保温する。 これに 0. 5 M塩酸を加え、 98 °Cで 2時間加水分解する。 2.5 %N aN02と 12. 5 % NH403 SNH2を添加し、 次いで 0.25% 2—メチル— 2—べンゾチアゾロ ンを添加する。 次に、 0. 5% F e C l 3を添加した後、 650 nmで吸光度を 測定する。
また本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩は、 上記した試験化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白、 非 ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液など） から選ばれた化合物であり、 本発明の蛋白質（GFAT 1 L蛋白 質の部分ペプチド） の酵素活性 （例、 GFAT活性） を阻害する化合物である。 該化合物は、 新規化合物であってもよいし、 公知化合物であってもよい。 また、 低血糖改善用候補化合物としては、 本発明の蛋白質（GFAT 1 L蛋白質の部分 ペプチドの酵素活性 （例、 GFAT活性） を促進する化合物である。
該化合物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩 基 （例、 アルカリ金属） などとの塩が例示でき、 とりわけ生理学的に許容される 酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リ ン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロ ピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚 酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが挙げられ る。
本発明の蛋白質（G F A T 1 L蛋白質の部分ペプチドを含む、 以下同じ） の酵 素活性を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 糖尿病および糖尿病合併症な どの疾患に対する治療剤または予防剤としての医薬として有用である。
本発明の蛋白質の酵素活性を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 低血糖 症及び低血糖による合併症などの疾患に対する治療剤または予防剤としての医薬 として有用である。
また本発明によれば、 より活性または安定した形態の G F AT 1 L蛋白質の誘 導体または例えば、 イン ·ビポ（in vivo)で G F AT 1 L蛋白質の機能を高める 力、 もしくは妨害する薬剤を開発するために、 それらが相互作用する目的の生物 学的に活性なポリぺプチドまたは構造アナ口グ、 例えば G F A T 1 Lァゴニスト、 G F AT 1 Lアン夕ゴニスト、 G F AT 1 Lインヒビ夕一などを作製することが 可能である。 前記構造アナログは、 例えば G F AT 1 Lと他の蛋白質の複合体の 三次元構造を X線結晶学、 コンピューター ·モデリングまたはこれらの組み合わ せた方法によって決定することができる。 また、 構造アナログの構造に関する情 報は、 相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能 である。
また上記より活性または安定した形態の G F AT 1 L蛋白質の誘導体を得る方 法としては、 例えばァラニン ·スキャンによる分析方法が挙げられる。 該方法は あるアミノ酸残基を Al aで置換し、 ペプチドの活性に対するその影響を測定する 方法でぺプチドの各ァミノ酸残基をこのように分析し、 当該べプチドの活性や安 定性に重要な領域を決定する方法である。 該方法によって、 より活性な、 または 安定な G F A T 1 L蛋白質の誘導体を設計することができる。
また機能性アツセィによって選択した標的一特異的抗体を単離し、 次いでその 結晶構造を解析することも可能である。 原則として、 このアプローチにより、 続 く薬剤の設計の基本となるファーマコア（pharmacore)を得る。 機能性の薬理学的 に活性な抗体に対する抗—イディォタイプ抗体を生成させることによって、 化学 的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離し たりすることが可能である。 故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用 すると予測される。
かくして、 改善された GFAT 1 L活性もしくは安定性または GFAT 1 L活 性のインヒビター、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストなどとしての作用を有する薬剤 を設計 ·開発することができる。
クロ一ン化 GFAT 1 L配列によって、 十分な量の GFAT 1 L蛋白質を入手 して、 X線結晶学のような分析研究をも行うことができる。 さらに、 本発明の配 列番号： 1に示されるアミノ酸配列よりなる GFAT 1 L蛋白質の提供により、 X線結晶学に代えるかまたはこれに加えて、 コンピュータ一モデリング技術に適 応可能である。
また本発明によれば、 GFAT 1 L遺伝子のノックアウト ·マウスゃノックイ ン ·マウス（変異マウス）を作成することによって GFAT 1 L遺伝子配列のどの 部位が生体内で上記したような多様な GFAT 1 L活性に影響を与えるかどうか、 即ち GFAT 1 L遺伝子産物、 並びに改変 GFAT 1 L遺伝子産物が生体内でど のような機能を有するかを確認することができる。
該方法は、 遺伝子の相同組換えを利用して、 生物の遺伝情報を意図的に修飾す る技術であり、 マウスの胚性幹細胞（E S細胞）を用いた方法を例示できる
(Capeccchi, M. R. , Science, 244, 1288-1292 (1989))。
尚、 上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術で あり、 この改変技術 (野田哲生編、 実験医学,増刊， 14 (20) (1996)、 羊土社）に、 ヒト野性型 G FAT 1 L遺伝子および変異 G FAT 1 L遺伝子を適応して容易に 変異マウスを作製し得る。 従って前記技術の適応により、 改善された GF ATI L活性もしくは安定性または GF AT 1 L活性のィンヒビター、 ァゴニスト、 ァ ン夕ゴ二ストなどとしての作用を有する薬剤を設計 ·開発することができる。 実施例
以下、 本発明を更に詳しく説明するため、 実施例を挙げる。
実施例 1
GFAT 1 Lのクローニングと発現べクタ一の構築
まず、 マクナイトらの公知のヒト GFAT (G.L.McKnight et. al. J. Biol. Chem. , 261. 25208-25212 (1992) )の発現ベクターの構築のために、 ヒト GFA Tの cDNA配列をもとに 4つのプライマ一 P 1〜P 4を合成した。 之等の塩基 配列は、 それぞれ配列番号： 3〜6に示すとおりである。
P 1は、 配列番号： 2の 34— 66番目のヌクレオチド配列に相当する。 P2 は、 同配列番号： 2の 16— 48番目のヌクレオチド配列に相当する。 P3は、 同配列番号： 2の 1一 30番目のヌクレオチド配列に相当する。 また P4は、 同 配列番号： 2の 2077— 2097番目のヌクレオチド配列に相当する。 P 1〜 P3は、 それぞれフォワード ·プライマーであり、 大腸菌において発現効率をあ げるために大腸菌のコドン利用度を考えて以下の部分に変異を与えたものである。 P 1 :配列番号： 3の 6, 9, 12, 13, 15, 18番目のヌクレオチド P2 :配列番号： 4の 7， 9, 18， 24， 27, 30， 31, 33番目のヌク レオチド
P 3 ：配列番号： 5の 22， 32， 34番目のヌクレオチド
P 3における配列番号： 5の 1〜10番目のヌクレオチド配列は、 pETべク ターに挿入する際に必要になる Nd e Iサイト （CATATG) を導入するために付加 した配列である。
また、 P 4はリバース ·プライマ一であり、 C末アミノ酸の後に Xh o Iサイ ト（CTCGAG, 配列番号： 6の 1〜 11番目のヌクレオチド配列参照）を含む配列で ある。 該 Xh o Iサイトの直前には終止コドン（TAA)が挿入されるように設計さ れた。
以下の方法で上記 4つのプライマーを使って、 N末アミノ酸が大腸菌で合成し やすいコドンに置き換わったベクタ一が構築され得る。
ついで、 クロンテック社から購入したヒト骨格筋 mRNAをもとに、 プライマ —P 4で逆転写酵素を用いて逆転写反応をおこなった。 ヒト骨格筋 mRNA2 g/ 1を 100°Cで 5分間で変性させた後、 氷中にて急冷させた。 最終的に 5 OmMトリス塩酸（pH8.3)、 40mM塩化カリウム、 6mM塩化マグネシウム、 ImM DTT、 0. ImMのプライマー 4、 0. 1 m g B S Aおよび 400単 位/ 2 X 1の MMLV逆転写酵素 （ギブコ BRL社製） と脱イオン水（D DW)を加 えて 50/ lとし、 37°Cで 10分間反応させた。
前記反応物 5 / 1を 100°Cで 5分間で変性させた後、 プライマー P 1および P 4にて PC R反応を行った。 PCR反応は 5 1の逆転写反応物と 5 1の 1 0 緩衝液（1. 2mMトリス塩酸（pH8.0)、 10 OmM塩化カリウム 、 60m M硫酸アンモニゥム、 1%トリトン X_100、 0. lmg/m 1 B S A) 、 5 z lの 2mM dNTP s混合物、 0. 4 ^Mの各プライマ一、 ImMの塩化 マグネシウム、 2. 5単位の KODダッシュ（dash) および DDWを加えて、 総 量 50 1とし、 95°C、 30秒、 65°C、 2秒、 74°C、 60秒を 30サイク ル行い、 さらに、 74° (：、 5分間反応させた。
前記で得られた 5 1の反応産物について同様の PCR条件でプライマーを P 2および P 4に変えて PC R反応を行なった。
さらに、 その反応産物の 5 n 1について同様の PC R条件でプライマー P 3お よび P4にて PCR反応を行った。 最終反応物は、 pET23bベクター （ノバゲン： Novagen社製） にクロー二 ングし、 AB I 377DNAシークェンサ一 （PE- ABI社製） にて DNA配列を確 認した。
次いで最終反応物はフエノール Zクロロホルム処理し、 エタノール沈殿をおこ ない、 TE緩衝液に溶かした後、 制限酵素 Nd e Iと Xh o Iにて DNAの両端 を切断した。
該 DNA断片を制限酵素 Nd e Iと Xh o Iで切断した pET23 bベクター にライゲーシヨンにより挿入した。
かくして、 塩基配列決定によって新規な配列の遺伝子を得、 これを 「GFAT 1L遺伝子」 と命名した。
得られた遺伝子は、 そのコード領域の全長が配列番号： 2で示される 2097 塩基からなり、 該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、 配列番号： 1 に示される 699アミノ酸配列からなっていた。 これは該アミノ酸配列をコード するヒト cDNA (全長 2097塩基） であった。
本発明遺伝子 GFAT 1 Lは、 マクナイ卜らによってクローニングされたヒト GFAT遺伝子 (McKnight, G. L , et. al. , J. Biol. C em. , 261- 25208-25212
(1992)) の 684番目と 685番目の塩基の間に、 54個の塩基が挿入された 新規な遺伝子であることが確認された。 従って、 遺伝子配列でコードされる蛋白 質のアミノ酸配列は、 228番目と 229番目の間に 18個のアミノ酸配列が揷 入された構造物であることが判明した-。
以下に続く試験においては、 本発明者らが単離した新規遺伝子を 「GFAT1 L遺伝子」 と呼び、 マクナイトらのヒト GFAT遺伝子を 「GFAT1 S遺伝 子」 と呼ぶ。
実施例 2
RT— PCR法により、 各臓器での GFAT 1 L遺伝子の発現パターンを、 G
FAT 1 S遺伝子のそれと対比して、 検索した。 サンプルとしては、 クローンテック社のクイッククローン cDNA (QUICK - Clone cDNA, 心臓、 脳、 肝臓、 骨格筋、 小腸、 腎臓、 塍臓、 脂肪） を用いた。 プライマ一としては、 配列番号： 7および 8に示す塩基配列を合成して使用し、 更に ExTaQ (宝酒造社） を使用した。
PCR反応は、 95t i分の後、 95°C、 30秒、 55° (：、 30秒および 7 2°C、 45秒を 1サイクルとして、 40サイクル繰り返した。 遺伝子発現パター ンの検索は、 反応産物の一部を 4 %ァガロースゲル電気泳動に供してもとめた。 結果を図 1に示す。
図における各レ一ンは次の通りである。
Marker (マ一力一）、 Heart (心臓）、 Brain (脳）、 Liver (肝臓）、 Skeltal Muscle (骨格筋）、 Kidney (腎臓）、 Pancreas (膝臓）、 Small Intestine (小腸) および Fat (脂肪）
図 1より、 GFAT1 L遺伝子は、 心臓および骨格筋に強い発現が認められ、 脳でも非常に弱い発現が認められた。 試験した他の臓器においては、 GFAT 1 S遺伝子のみの発現が認められた。
このことから、 本発明の遺伝子の発現は、 臓器特異的に制御されていることが 判明した。
実施例 3
GFAT 1 L組換え蛋白質の調製
ヒト GFAT1 L遺伝子 （対比のため GFAT 1 S遺伝子） のそれぞれを pE
T23bベクタ一 （ノバゲン社製： Novagen) に組み込み、 該ベクタ一を用いて
BL 21— Co donP 1 u s (DE 3) R I L (ストラタジーン社製：
Stratagene) を形質転換し、 得られた形質転換体をアンピシリンを含む L B培地 で 37° (：、 ー晚培養した。 翌日、 50m 1の培養液を 1 Lのアンピシリンを含む
L B培地に加え、 さらに 37 °Cで培養した。 90分後、 2 m 1の 1 Mイソプロピ ル J3—D—（一）—チォガラクトビラノシド （ I P T G：和光純薬社製） を加え、 20°Cで一晩培養して組換え蛋白質の発現を誘導した。
培養液を 7000 r pmで 5分間遠心して大腸菌を回収し、 50mlの 0°Cに 冷やしたダルベッコの PBS (-〉 ： 日水製薬社製） で 1回洗浄した。 次に 5mM ジチオスレィ ] ^一ル （DTT)、 20%グリセリンを含む 5 OmMリン酸ナトリウム 緩衝液 （pH8.0) を、 全量が 40m 1になるように加えて懸濁した後、 超音波処 理して菌体を破砕した。 この破砕液を超遠心 （30, 000rpm、 30分、 4°C) して不溶 性成分を除いた。
かくして、 所望の組換え蛋白質を含む上清を得た。 得られた上清は lmlづっ 分注して、 液体窒素で急速凍結後に一 80°Cに使用時まで保存した。
実施例 4
GFAT 1 Lと GFAT 1 Sの特徴的な差異の検討
1. GFAT活性測定方法
GFAT活性の測定は、 マーシャル (Marshall)らに準じ、 96穴のマイクロプ レ一トを用いた分光光度計法にて行なった（Journal of Biological Chemistry, vol. 266. No. 8, 4706-4712, (1991))。 この測定方法では、 GFATにより生 成されたダルタメ一ト（Glutamate)をさらにダルタメ一ト脱水素酵素（Glutamate deydrogenase:GDH) と反応させ、 その際同時に起こる補酵素である A P ADが A P AD Hに還元される反応に伴われる吸光度の変化を GFAT活性として表わし た。
即ち、 200 1の基質溶液 (40 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.5)、 50 mM 塩化カリウム、 1.25 EDTA、 0.3 mM APAD、 6 U/ml (GDH)、 0-6 mMグルタミン、 0-6 mMフルクト一ス— 6—リン酸 （F- 6- P))に適宜希釈した GFAT 1 Lあるい は GFAT 1 Sの大腸菌溶解質 50 ^1を加え、 37°Cで 60分間反応させた。 この時の 365 nmの吸光度の変化をマイクロプレートリーダーにより測定した。
2. GFAT 1 Lと GFAT 1 Sの酵素学的相違
GFAT 1 Lと GFAT 1 Sの間の酵素学的な相違を検討するため、 基質とし てグルタミンおよび F— 6— Pのそれぞれを用いて、 Km値を求めた。 Km値は、 酵素の基質濃度 （S) および酵素活性 （反応速度 （V)) の値を基に作成した SZ v〜Sおよび v〜vZsプロットから算出した。 またその算出は、 SZv〜Sの プロットではグラフの X軸とプロッ卜して得られた直線の交点 （交点 =一 Km 値） から、 v〜vZsプロットでは直線の傾き （傾き =一 Km値） から求めた。 さらに U D P _ N—ァセチルダルコサミン （UDP- Gl cNAc)が G F A T活性を阻 害することが報告されていることから (Journal of Biological Chemistry vol. 241. 1705-1712 ( 1966))、 この阻害様式についても検討した。 この阻害様式は、 同様のプロッティングを行ない、 得られた直線の形式から求めた。
その結果を図 2、 図 3および表 1に示す。
図 2は、 F— 6— Pを基質とした場合の GFAT 1 Sおよび GFAT 1 Lにお ける UDP— G l cNAcの GFAT活性阻害様式を示すグラフであり、 縦軸は 酵素の反応速度 （V) を、 横軸は反応速度 （V) /酵素の基質濃度 （s ) を示す。 図 2の左のグラフが GFAT 1 Sの結果であり、 右のグラフが GFAT 1 の 結果を示している。 各図において、 （1)は UDP— G 1 cNAcなしの場合を、 (2)は UDP— G 1 cNAc 30 M添加の場合を、 ）は UDP—G 1 cNAc 100 添加の場合をそれぞれ示す。
該図より求められた Km値は、 GFAT 1 Sおよび GFAT 1 Lにおいて、 そ れぞれ 90 /xMおよび 478 Mであり、 また G F AT活性阻害様式は、 それぞ れ 「拮抗阻害」 および 「混合阻害」 を示すことが明らかとなった。
図 3は、 グルタミンを基質とした場合の GFAT 1 Sおよび GFAT 1 Lにお ける UDP— G 1 cNAcの GFAT活性阻害様式を示すグラフであり、 縦軸は 酵素の反応速度 （V) を、 横軸は反応速度 （V) Z酵素の基質濃度 （s ) を示す。 図 3の左のグラフが GFAT 1 Sの結果であり、 右のグラフが GFAT 1 の 結果を示している。 各図において、 （1)は UDP— G 1 cNAcなしの場合を、
(2)は UDP— G 1 cNAc 10 M添加の場合を、 （3)は UDP— G 1 c NAc 30 M添加の場合を、 また（4)は UDP— G 1 c NAc 100 iM添加の場合 をそれぞれ示す。
該図より求められた Km値は、 GFAT 1 Sおよび GFAT 1 Lにおいて、 そ れぞれ 822 xMおよび 804 zMであり、 また G F AT活性阻害様式は、 それ ぞれ 「不拮抗阻害」 および 「混合阻害」 を示すことが明らかとなった。
Figure imgf000061_0001
図 2、 図 3および表 1より、 GFAT 1 Lおよび GFAT 1 Sの Km値につい ては、 F— 6— Pに対しては GFAT 1 Sが 100 M、 GFAT 1 Lが 500 M程度と両者で大きな差が認められた。 一方、 グルタミンに対しては GFAT 1,Sと GFAT1 Lともに 800 M前後であり両者に差は認められなかった。
UDP- GlcNAcの阻害様式ついては、 F— 6— Pを基質とした場合、 GFAT 1 S では拮抗阻害、 GFAT 1 Lでは非拮抗および拮抗阻害が混在した混合阻害様式 を示した。 また、 グルタミンを基質とした場合、 GFAT 1 Sでは不拮抗阻害、 GFAT 1 Lにおいては不拮抗およびその他の阻害様式を含んだ混合阻害様式を 示した。
上記の結果から、 本発明の GFAT 1 Lとヒト GFATの酵素学的な違いとし て、 （1) F— 6— Pに対する Km値は本発明の GFAT 1 Lがヒト GFATより
5倍程高い、 および (2)UDP-GlcNAcの阻害様式が異なる、 の 2点が認められた。
3. インスリン抵抗性における GFAT 1 Lの関わりについての検討
GFATがインスリン抵抗性に関与していることはイン 'ビトロおよびイン . ビポ試験の両者において報告されている。 しかしながら、 本発明者らにより発見 された新規遺伝子により、 G F ATには 2つのサブタイプが存在することが明ら かとなつたことから、 GFAT 1 L,とヒト GFAT (GFAT 1 S)のどちらがよ りインスリン抵抗性に関与しているのかについて、 以下の通り考察した。
正常人では通常、 ィンスリン剌激時には血中グルコースの約 70 %が骨格筋で 代謝されるのに対し、 2型糖尿病患者においては、 特に骨格筋でグルコースの利 用率が 30%まで減弱しており他の臓器ではその利用率が正常人と変わらないこ とが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 76 (1), 149-155 (1985) ) o このことから、 インスリン抵抗性の主要な臓器は骨格筋であると考え られる。 この骨格筋では G FAT 1 Sは発現しておらず、 本発明の GFAT1L のみが発現していることが明らかとなったことから、 インスリン抵抗性には主に 本発明の GFAT 1 Lが関与していると考えられる。
また、 GFAT 1 Sおよび GFAT 1 Lの酵素学的検討の結果より、
(1) F— 6—Pに対する本発明 GFAT 1 Lの Km値は、 GFAT 1 Sのそれよ りも 5倍程高い、
(2)細胞内のグルタミンは 4〜 5 mM存在するため、 GFAT活性は細胞内の F 一 6— P濃度で規定される、
(3)基礎レベルにおける 2型糖尿病患者の赤血球中の F— 6— P濃度は数十/ xM であると報告されている （Horm. Metabol. Res.， 14, 233-236 (1982))、 ことなどを考え合わせ、 以下のようなことが推測された。
即ち、 この濃度の F— 6— Pから GFATの活性状態を推測すると、 GFAT 1 Sでは Km値付近であり定常的に働いているが、 GFAT 1 Lではほとんど活 性化されていないと考えられる。 このことは図 4より明らかである。
図 4は、 上記結果より、 GFAT 1 Sおよび GFAT 1 Lの酵素反応曲線 （G
FATの活性化の状態） をグラフ化したものであり、 縦軸は酵素の反応速度
(V) を、 横軸は細胞内の F— 6— Pの濃度 （ zM) を示しており、 この濃度が 高いほど細胞内への糖の流入量が大きいことを表わす。 また、 図中、 太線は文献 に報告されている非ィンスリン依存型糖尿病患者の赤血球中の F— 6一 P濃度を 示しており、 太矢印はィンスリン抵抗性に関与することを示している。
更に、 インスリン刺激時には細胞内へのグルコースの取り込みは数倍増加する が、 この場合、 GFAT1 Sでは酵素反応が Vmaxに達しているため、 さらに ダルコースが細胞内に流入してもそれ以上の G F A Tの活性化は起こらないのに 対し、 本発明の G FAT 1 Lではグルコースの流入量が増加すればするほど GF ATが活性化され代謝物も増加し、 糖輸送担体の細胞膜への移行が抑制され、 血 糖が上昇するものと考えられる （ただし、 GFAT 1 Lおよび GFAT 1 Sとも に Vmaxは同程度と仮定している）。
従って GFAT 1 Sに比べ本発明の GFAT 1 Lがよりインスリン抵抗性に関 与していると考えられる。 以上のことからインスリン抵抗性に本発明の GFAT 1 Lの関与が大きいと結論づけられる。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 ヒト GFATと相同性を有する新規なヒト蛋白相同物をコー ドする GFAT 1 L遺伝子が提供される。
本発明の遺伝子は糖代謝に重要な組織である骨格筋および心臓においてその発 現が高く、 これら組織およびその周辺組織における G F A T活性または解糖系に おけるへキソサミン生合成経路を促進し、 糖輸送担体の細胞膜への移行性を抑制 すると考えられる。 従って糖代謝における血糖調節に対して上昇的に作用するこ とが考えられることから、 本発明遺伝子の発現量や G F A T活性などの解析によ り、 関連遺伝子の機能と糖代謝関連疾患との係わりについての研究に利用でき、 特に低血糖または糖尿病患者への遺伝子診断並びに該遺伝子の発現産物に対する 抗体やアンチセンスによる医薬用途への応用研究に用いることが可能である。 また、 本発明遺伝子の利用によれば、 各種組織での該遺伝子の発現状況が調べ られ、 生体内におけるその機能を解析することが可能となる。
また、 該遺伝子によれば、 該遺伝子がコードする GFAT1 L蛋白質を遺伝子 工学的に大量に製造することができ、 該蛋白質の提供によれば、 GFAT1 L活 性や G FAT 1 L蛋白質の結合活性などの機能を調べることもできる。
また本発明蛋白質は、 GF AT 1 L遺伝子およびその産物が関与する疾患 （例 えば、 GF AT活性または解糖系におけるへキソサミン生合成経路の調節に関連 する疾患または低血糖、 血糖調節に関連する疾患など、 特に低血糖症の治療、 ま たは糖尿病や糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経症などの糖尿病性合 併症） の病態解明や診断、 治療などに有用である。
本発明によれば、 更に本発明遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを含 有する遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクター、 該 GFAT 1 L遺伝子のアン チセンス ·オリゴヌクレオチドが導入された細胞および該ベクターまたは細胞を 有効成分とする遺伝子治療剤、 並びにその利用による遺伝子治療法などが提供さ れる。
本発明によれば、 更に骨格筋、 特に骨格筋の平滑細胞における GFATmRN Aの発現の抑制作用を有し、 該作用による糖尿病および糖尿病合併症などの疾患 および病態の処置などに使用される本発明遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレ ォチドまたは GFAT 1 Lに結合性を有する抗体またはその断片を有効成分とす る医薬も提供することができる。
また、 本発明によれば、 GFAT 1 L蛋白質、 GFAT 1 L遺伝子発現産物の 酵素活性を阻害する、 糖尿病の治療のための候補化合物のスクリーニング方法お よびスクリーニング用キットをも提供することができる。

Claims

請求の範囲
1. 以下の （a)、 （b)、 (c) または （d) のポリヌクレオチドを含む遺伝 子：
(a) 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖、
(b) 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドに対して少なくとも 98 %の相同性を持つポリヌクレオチド またはそれらの相補鎖、
(c) 上記 （a) のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたァミノ酸配列からなり且つ G F A T活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖、
(d) 上記 （a) のアミノ酸配列と 98%以上の相同性を持つアミノ酸配列か らなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖。
2. 以下の （a) または （b) のポリヌクレオチドからなる遺伝子：
(a) 配列番号： 2で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその 相補鎖、
(b) 上記 （a) の塩基配列からなるポリヌクレオチドと高いストリンジェン トな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド。
3. 配列番号： 2で示される塩基配列である請求項 2に記載の遺伝子。
4. 請求項 1または 2に記載の遺伝子を発現させて得られる遺伝子発現産物。
5. 請求項 1または 2に記載の遺伝子を有する組換え体発現ベクター。
6. 請求項 5に記載の組換え体発現ベクターを保有する宿主細胞。
7. 請求項 5に記載の組換え体発現ベクターで形質転換された形質転換体。
8. 以下の （a)、 (b) または （c) の GFAT 1 L蛋白質：
(a) 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、 ( b ) 上記 （a ) のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ G F A T活性を有する蛋白質、
( c ) 上記 （a ) のアミノ酸配列と 9 8 %以上の相同性を持つアミノ酸配列か らなる蛋白質。
9 . 請求項 1または 2に記載の遺伝子または請求項 4に記載の遺伝子発現産物 を有効成分として含有する低血糖症の治療または予防用組成物。
1 0 . 請求項 8に記載の蛋白質を有効成分として含有する低血糖症の治療また は予防用組成物。
1 1 . 請求項 4に記載の遺伝子発現産物および請求項 8に記載の蛋白質および これらの断片から選ばれるいずれかに結合性を有する抗体。
1 2 . 請求項 1に記載の遺伝子または請求項 4に記載の遺伝子発現産物および 請求項 8に記載の蛋白質の酵素活性を阻害する候補化合物をスクリーニングする 方法であって、 （1 ) 請求項 1 1に記載の抗体と、 候補化合物を含む被検液およ び標識化された請求項 8に記載の蛋白質またはその部分ペプチドとを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化された蛋白質またはその部分べプチドの割合を 測定するか、 （2 ) 候補化合物を含む被検液と、 担体上に不溶化した上記抗体お よび標識化された他の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担 体上の標識剤の活性を測定するか、 或いは （3 ) 請求項 8に記載の蛋白質または その部分ペプチドに基質を接触させた場合と、 同蛋白質またはその部分ペプチド に基質および候補化合物を接触させた場合とにおける、 同蛋白質またはその部分 ペプチドの酵素活性を測定、 比較することを特徴とするスクリーニング方法。
1 3 . 請求項 1 2に記載の候補化合物のスクリーニング方法に用いられるスク リーニング用キットであって、 測定用緩衝液、 請求項 8に記載の蛋白質またはそ の部分ペプチドおよび基質としてのフルクト一ス一 6—リン酸およびグルタミン をキット成分として含有するキッ卜。
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