KR20030011868A - 신규 효소 유전자 및 그의 발현 생산물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 유전자, 이 유전자를 발현시켜 얻어지는 유전자 발현산물, 이 유전자를 갖는 재조합체 발현 벡터, 이 벡터를 보유하는 숙주 세포(형질 전환체), 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 단백질, 상기 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 하는 함유하는 저혈당증의 치료 또는 예방용 조성물, 이 단백질에 결합성을 가지는 항체 등에 관한 것이다. 이 유전자 및 그의 발현물을 이용하면, 당뇨병의 병태해명이나 새로운 작용기서에 의한 당뇨병 질환의 예방이나 치료를 위한 약제의 개발이 가능하게 된다.

Description

신규 효소 유전자 및 그의 발현 생산물{NOVEL ENZYME GENE AND EXPRESSION PRODUCT THEREOF}

GFAT는 생체내에 있어서의 헥소사민 생합성 경로에 있어서, 율속단계인 프락토오스-6-인산으로부터 글루코사민-6-인산에의 반응을 촉매하는 중요한 효소이다. 근년, 맥나이트(McKnight) 등은 681 아미노산 배열로부터 이루어진 이 효소의 사람 유전자를 보고했다(McKnight, G. L., et al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992)). 그 후, 새로운 사람 GFAT 유전자가 니시(Nishi) 등에 의해 보고되어 있다 (미국특허제5,876,713호).

이 GFAT의 활성을 저해하는 약제는 세포내에의 글루코오스의 취입을 촉진하고, 혈당치를 저하시킬 수가 있다고 생각되고 있으며, 이 때문에 당뇨병 치료약으로서 기대되고 있다. 즉, 인슐린에 의해 세포내에 글루코오스의 취입이 촉진되고, 취입된 글루코오스는 당 분해계에 의해 대사되어 에너지원으로서의 ATP를 축적하지만, 과잉에 취입되는 경우는 글루코오스 대사물인 프락토오스-6-인산이 헥소사민 생합성 경로에 흐른다. 이 헥소사민 생합성 경로에 흐른 프락토오스-6-인산은 GFAT 에 의해 글루코사민-6-인산으로 변환된다.

글루코사민-6-인산 대사 생산물이 당수송 담체의 막이행을 억제하고, 그에 의해 세포내에의 글루코오스의 취입이 억제되는 것이 보고되고 있다(FASEB. J., 5, 3031-3036 (1991)); Diabetologia. 38. 518-524 (1995); J. Biol. Chem., 266, 10155-10161 (1991); J. Biol. Chem. 266, 4706-4712 (1991); Endocrinology, 136, 2809-2816 (1995)).

당대사 경로에 있어서, 헥소사민 생합성 경로는 글루코오스의 과잉 취입에 대한 피드 백 기구로서 기능하는 것이 하나의 역할로서 고려되고 있으며, GFAT는 그 경로에 있어서의 율속효소로서 중요한 것으로 되어 있다. 더욱이, 인슐린에 의존하지 않는 2형 당뇨병 환자에 있어서는 이 GFAT 활성이 일반적으로 높은 것이 알려져 있으며, 고혈당치를 나타내는 하나의 원인인 것도 보고되고 있다(Diabetes, 45, 302-307 (1996)).

GFAT는 사람 유래(Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992); 미국 특허 제 5, 876,713호) 이외, 마우스 유래, 효모 유래 및 대장균 유래의 것이 보고되어 있다. 이것들은 모두 사람 GFAT와 높은 상동성을 나타낸다. 그러므로, 현재, 당대사에 있어서, 중요한 장기인 골격근에 특이적인 신규 GFAT의 존재에 대해서는 아직 알려지지 않았다.

GFAT 활성을 나타내는 새로운 GFAT의 유전자의 분리는 헥소사민 생합성 경로에 있어서의 GFAT에 의한 조절 기능의 해명에 도움이 되며, 또한 골격근 등의 장기 특이적으로 발현하는 GFAT 유전자의 분리는 그 장기에서의 당대사계 기구의 해명에 대해서 새로운 연구를 가능으로 한다. 더욱이, 이들 유전자에 의해 코드되는 아미노산배열의 발현물로서의 GFAT 단백질에 대해서 저해활성을 가지는 특이적인 후보 화합물이 발견되면, 새로운 작용 기서를 가지는 당뇨병 질환의 예방이나 치료에 도움이 되는 혈당 저하약의 개발이 가능하게 된다.

따라서, 본 발명의 과제는 이러한 새로운 GFAT의 유전자, 특히 골격근에 특이적으로 발현하는 GFAT의 유전자를 분리하는 데에 있다.

본 발명은 글루타민: 프락토오스-6-인산 아미도트란스페라제 (Glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase, 이하, GFAT라 약칭한다)의 활성을 가지는 신규 효소의 유전자 및 그의 유전자에 의해 코드되는 아미노산 배열을 가지는 신규 단백질(효소)에 관한 것이다

도 1은 실시예 2에 따라, RT-PCR법에 의해 각 장기에서의 본 발명 유전자의 발현패턴을 구한 아가로스 겔 전기영동 결과를 나타내는 도면 대용 사진이다.

도 2는 실시예 4에 따라, 본 발명 GFAT1L의 효소 학문적 성질로서의, F-6-P를 기질로 했을 때의 Km값 및 GFAT 활성 저해 양식을 구하기 위한 그래프이다.

도 3은 실시예 14에 따라, 본 발명 GFAT1L의 효소 학문적 성질로서의, 글루타민을 기질로 했을 때의 Km 값 및 GFAT활성 저해양식을 구하기 위한 그래프이다.

도 4는 실시예 4에 따라, 본 발명 GFAT1L의 효소 반응 곡선(GFAT의 활성화의 상태)을 나타내는 그래프이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

이하, 본 발명의 유전자 및 단백질에 대해서 상술한다.

본 발명 단백질은 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열 또는 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 것으로 특징지울 수 있다. 본 발명 단백질은 예를 들면, 사람 세포, 특히 사람 횡문근 세포, 또는 예를 들면 사람 조직, 특히 골격근, 심장에 유래하는 단백질일 수가 있으며, 또한 합성 단백질일 수도 있다.

상기 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열로서는 예를 들면, 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열과 약 98%이상, 바람직하기로는 약 99%이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열 또는 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열에 있어서, 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 들 수 있다. 그리고, 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열을 함유하는 단백질로서는 전술한 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열과 실질적으로 동일한 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 본 발명 단백질과 실질적으로 동질의 GFAT 활성을 가지는 단백질이 포함되며, 구체적으로는 후기 GFAT1L 유전자의 상동물(대립 유전자를 함유하는 GFAT1L 동등 유전자)의 유전자 생산물을 들 수 있으며, 동일한 활성을 가지는 사람, 말, 양, 소, 개, 원숭이, 고양이, 곰, 랫트, 토끼 등의 보유동물의 단백질도 포함된다.

여기서, 실질적으로 동질이라는 것은 그 활성이 성질적으로 (예를 들면, 생리 화학적 또는 약리학적으로) 동질인 것을 나타낸다. 따라서, GFAT 활성의 정도나 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 당연하게 다를 수 있다.

GFAT 활성의 측정은 그 자체 공지의 방법, 예를 들면 마샬 등의 방법(Marshall. et. al., J. Biol. Chem.. 266(8), 4706-4712 (1991))에 준하여 행할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 "GFAT 활성"이란 후기 실시예에 나타난 바와 같이, U에-N-아세틸글루코사민이 GFAT 활성을 저해함에 있어서, 프락토오스-6-인산을 기질로 했을 경우의, 그의 저해 양식이 혼합 저해양식으로 표시되는 GFAT 활성을 말하고, 상기 저해 양식이 길항 저해양식인 것과는 명확하게 구별된다. 이하, 본 명세서에서는 이러한 본 발명에 특유의 혼합 저해양식을 나타내는 GFAT 활성을 단순히 "GFAT 활성"으로 칭하는 것으로 한다.

상기 아미노산 배열의 결실, 치환 또는 부가의 위치는 이러한 개변된 아미노산 배열을 가지는 단백질이 GFAT 활성을 가지는 한, 임의이며, 이들 결실, 치환, 부가의 수도, 동일하게 GFAT 활성을 가지는 한 임의일 수가 있다.

본 발명 유전자는 배열 번호: 1로 표시되는 699 아미노산 배열의 골격근 및 심장 특이적 단백질(GFAT1L 단백질)을 코드하는 것이고, 이 유전자의 하나의 구체적인 예로서는 후술하는 실시예에 표시되는 "GFAT1L" 라고 명명된 PCR 생산물의 DNA 배열로부터 연역되는 것을 들 수가 있으며, 그의 염기배열은 배열 번호: 2로 표시되는 전체 길이 2097 염기로부터 되어 있다.

본 발명 GFAT1L 유전자는 맥나이트 등에 의해 클로닝된 GFAT 유전자 (McKnight, G. L., et. al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (]992))의 684번째와 685번째의 염기의 사이에, 54개의 염기가 삽입된 신규 배열을 가지는 것이 확인되었다.

따라서, 본 발명 유전자에 의해 코드되는 단백질의 아미노산 배열은 상기 맥나이트 등의 보고에 의한 유전자로부터 연역되는 아미노산 배열의 228번째와 229번째의 사이에, 새로운 18개의 아미노산 배열이 삽입된 것이다.

본 발명 단백질은 GFAT 활성을 가지며, 예를 들면 저혈당의 개선약으로서 유용하다. 또한, 본 발명 유전자의 안티센스 DNA 나 본 발명 유전자의 발현 생산물에 대한 항체는 당뇨병 질환의 치료효과가 예측되며, 또한 이들을 이용한 당뇨병 치료제로서의 후보 화합물의 스크리닝에의 이용도 가능하다.

본 발명에 있어서 유전자라는 것은 2본쇄 DNA 뿐만 아니라, 그것을 구성하는 센스쇄 및 안티센스쇄라고 하는 각 l본쇄 DNA를 포함하는 취지이며, 또한 그의 길이에 하등 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명 유전자(DNA)에는 특히 언급하지 않는 한, 인간게놈 DNA를 포함한 2본쇄 DNA 및 cDNA를 포함한 1본쇄 DNA (센스쇄) 및 이 센스쇄와 상보적인 배열을 가지는 l본쇄 DNA(안티센스쇄) 및 이들 단편의 모두가 포함된다.

또한, 본 발명 유전자(DNA)는 리더 배열, 코드 영역, 엑손(exon), 인트론(intron) 등을 포함할 수가 있다. 폴리뉴클레오티드로서는 RNA, DNA를 예시할 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA를 포함해, 특정 아미노산 배열을 가지는 폴리펩티드는 그의 단편, 동족체, 유도체, 변이체를 포함할 수 있다.

유전자에 있어서의 변이체는 천연에 존재하는 대립 유전자 변이체, 천연에 존재하지 않는 변이체, 결실, 치환, 부가 및 삽입을 가지는 변이체 등이며, 이들에 의해 코드되는 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는 것을 의미한다.

폴리펩티드는 대립 유전자, 호모로그, 천연 변이체로 적어도 98%, 바람직하기로는 99% 상동인 것을 포함한다.

또한, 본 발명 유전자 발현 생산물의 생물 활성, 즉, GFAT 활성이라는 것은 프락토오스-6-인산으로부터 글루코사민-6-인산에의 반응을 촉매하는 작용으로서 예시된다. 또한, 이것은 사람 또는 포유동물의 혈당의 상승작용으로서도 파악할 수가 있다. 또한, DNA 및 폴리펩티드에 있어서의 상동성은 배열 분석 소프트웨어, 예를 들면 FASTA 프로그램을 사용한 측정(Clustal. V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994))으로 해석할 수 있다.

상기 본 발명 유전자에 있어서의 변이체에는 이것에 의해 코드되는 아미노산 치환에 대해서 사일런트 또는 보존 변이체, 즉 그 염기배열에 의해 코드되는 아미노산 잔기가 변하지 않는 염기배열의 변이도 포함된다.

보존적인 아미노산 치환의 종류는 이하에 나타낸 바와 같다;

원래의 아미노산 잔기보존적인 치환 아미노산 잔기

Ala Ser

Arg Lys

AsnGln, His

AspGlu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

HisAsn 또는 Gln

IleLeu 또는 Val

LeuIle 또는 Val

LysArg 또는 Glu

MetLeu 또는 Ile

PheMet, Leu 또는 Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

TyrTrp 또는 Phe

ValIle 또는 Leu

이울러, 일반적으로 시스테인 잔기를 코드하는 l 또는 그 이상의 코드는 특정의 폴리펩티드의 디술피드 결합에 영향을 주므로, 시스테인 잔기의 결실의 결과, 치환하는 것이 가능하다.

치환기를 선택함으로써 만들어지는 기능에 있어서의 실질적인 변화는 상기 아미노산의 리스트에 기재된 것 보다 조금 보존성이 떨어진다.

단백의 특성에 가장 큰 변화를 안출하면 일반적으로 기대되는 치환은 아래의 것이다:

a) 친수성 잔기, 예를 들면 세릴 또는 쓰레오닐이 소수성 잔기 예를 들면,로이실, 이소로이실, 페닐알라닐, 바릴 또는 알라닐에 치환된다;

b) 시스테이닐 또는 프롤릴이 다른 아미노산 잔기의 어느 것에 의해 치환된다;

c) 전기적 양성 측쇄를 가지고 있는 잔기, 예를 들면, 리질, 아르기닐, 또는 히스티딜이 전기적 음성잔기, 예를 들면, 글루타밀 또는 아스파르틸로 치환된다;

d) 매우 큰 측쇄를 가지고 있는 잔기, 예를 들면, 페닐알라닐이 글리실과 같은 측쇄를 가지지 않은 것에 의해 치환된다.

본 발명 유전자 및 그 유전자 생산물의 제공은 당뇨병의 해명, 파악, 진단, 예방 및 치료 등에 극히 유용한 정보 내지 수단을 부여한다. 또, 본 발명 유전자는 상기의 처치에 이용되는 해당 유전자의 발현을 억제 또는 유도하는 신규 약제의 개발에도 매우 적합하게 이용할 수 있다. 더욱이, 개체 또는 조직에 있어서의 본 발명 유전자의 발현을 억제 또는 유도하는 그 생산물의 발현의 검출이나, 이 유전자의 변이(결실이나 점변이) 내지 발현 이상의 검출은 상기 당뇨병 병태의 해명이나 진단에 있어 매우 적합하게 이용할 수 있다.

전기 개변된 아미노산 배열을 코드하는 본 발명 유전자는 그 이용에 의해 개변전의 아미노산 배열을 코드하는 본 발명 유전자를 검출할 수 있는 것이어도 좋다.

본 발명 유전자의 구체적인 예로서는 예를 들면 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기배열을 가지는 GFAT1L 유전자를 들 수 있으나, 본 발명 유전자는 특별히 이들에 한정되는 것은 아니고, 당해 GFAT1L유전자의 상동물도 포함한다.

여기서, "GFAT1L 유전자의 상동물"이란, 본 발명 GFAT1L 유전자 (또는 그 유전자 생산물)와 배열 상동성을 가지며, 상기 구조적 특징 및 유전자 발현 패턴에 있어서의 공통성 및 상기한 것 같은 그의 생물학적 기능의 유사성 (예를 들면 FASTA 프로그램을 사용한 상동성)보다, 하나의 유전자 패밀리로 인식되는 일련의 관련 유전자를 의미하며, 예를 들면 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 단백질을 코드하는 염기배열과 적어도 98%의 상동성, 바람직하기로는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보쇄 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

상기 아미노산 배열의 개변 (변이) 등은 천연에 있어서, 예를 들면 돌연변이나 번역 후의 수식 등에 의해 생기는 것도 있지만, 천연 유래의 유전자 (예를 들면 본 발명 GFAT1L 유전자)에 의해 인위적으로 개변할 수도 있다. 본 발명은 이러한 개변·변이의 원인 및 수단 등을 불문하고, 상기 특성을 가지는 모든 개변 유전자를 포함한다. 본 발명의 유전자에는 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열을 가지는 단백질을 코드하는 유전자의 대립 유전자도 포함된다.

상기의 인위적 수단으로서는 예를 들면 사이트-스페시픽 뮤타제네시스 (Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); Methods in Enzymology, 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984); 續生化學實驗講座 1 "遺傳子 硏究法 II", 일본 생화학회편, p105 (1986)) 등의 유전자 공학적 수법, 인산트리에스테르나 인산아미다이트법 등의 화학합성 수단(J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967); 동 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); 동 24, 245 (1983)) 및 이들의 조합방법 등을 예시할 수 있다. 보다 구체적으로는 DNA의 합성은 포스포르아미다이트법 또는 트리에스테르법에 의한 화학합성에 의한 것도 될 수 있으며, 시판되고 있는 자동 올리고뉴클레오티드 합성 장치에서 행할 수도 있다. 2본쇄 단편은 상보쇄를 합성하고, 적당한 조건 하에서 이 사슬을 모두 어닐링시키던가, 또는 적당한 프라이머 배열과 함께 DNA 폴리메라제를 이용하여 상보쇄를 부가하던가에 의해, 화학 합성한 한 1본쇄 생성물로부터 얻을 수도 있다.

본 발명 유전자의 구체적 모양으로서는 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열을 가지는 유전자를 예시할 수 있다. 이 염기배열(코딩 영역)은 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열의 각 아미노산 잔기를 나타내는 코돈의 하나의 조합예를 나타내고 있다. 본 발명의 유전자는 이러한 특정의 염기배열을 가지는 유전자에 한정되지 않고, 각 아미노산 잔기에 대해 임의의 코돈을 조합, 선택한 염기배열을 가지는 것도 가능하다. 코돈의 선택은 통상의 방법에 따를 수 있으며, 예를 들면 이용하는 숙주의 코돈 사용 빈도 등을 고려할 수가 있다[Nucleic Acids Res., 43 (1981)].

또한, 본 발명 유전자는 전술한 바와 같이, 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열과 일정한 상동성을 가지는 염기배열로 이루어진 것도 포함한다.

상기 상동성을 가지는 염기배열로 이루어진 것이란 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열과 적어도 98%의 상동성, 바람직하기로는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보쇄 폴리뉴클레오티드를 말한다.

이러한 유전자로서는 예를 들면, 0.l% SDS를 포함한 0.2×SSC중, 60℃ 또는 0.l% SDS를 포함한 0.1×SSC중, 60℃의 높은 스트린젠트인 조건 하에서, 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열로 이루어진 DNA와 하이브리다이즈하는 염기 배열을 가지는 유전자를 예시할 수가 있다.

본 발명 유전자는 본 발명에 의해 개시된 본 발명 유전자의 구체적인 예에 대한 배열 정보에 의해 일반적 유전자 공학적 수법에 의해 용이하게 제조·취득할 수가 있다[Molecular Cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); 續生化學實驗講座 "遺傳子硏究法 I, II, III", 일본 생화학회편 (1986) 등 참조]

구체적으로는 본 발명 유전자가 발현되는 적당한 기원으로부터, 통상의 방법으로 따라 cDNA 라이브러리를 조제하고, 이 라이브러리로부터 본 발명 유전자에 특유의 적당한 프로우브나 항체를 이용하여 소망 클론을 선택하는 수법을 들 수가 있다[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983) 등].

상기에 있어서, cDNA의 기원으로서는 본 발명의 유전자를 발현하는 각종의 세포, 조직이나 이것들에 유래하는 배양 세포 등이 예시된다. 또한, 이들 전체 RNA의 분리, mRNA의 분리나 정제, cDNA의 취득과 그의 클로닝 등은 모두 통상의 방법으로 따라서 실시할 수 있다. 또, mRNA 또는 cDNA 라이브러리는 시판되고 있는 것도 있으며, 본 발명에 있어서는 그것들 mRNA 또는 cDNA 라이브러리, 예를 들면 클론텍(Clontech Lab. Inc.) 등에서 시판되고 있는 각종 mRNA 또는 cDNA 라이브러리 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 유전자를 cDNA의 라이브러리로부터 스크리닝하는 방법도, 특히 제한되지 않고, 통상의 방법에 따를 수가 있다. 구체적으로는 예를 들면, cDNA에 의해 생산되는 단백질에 대해서, 이 단백질의 특이 항체를 사용한 면역적 스크리닝에 의해 대응하는 cDNA 클론을 선택하는 방법, 목적하는 DNA 배열에 선택적으로 결합하는 프로우브를 이용한 플라크 하이브리다이제이션, 콜로니 하이브리다이제이션, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.

여기서 이용되는 프로우브로서는 본 발명의 유전자의 염기배열에 관한 정보를 기초로 하여 화학 합성된 DNA 등이 일반적으로 사용할 수 있지만, 이미 취득된 본 발명 유전자나 그의 단편도 양호하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명 유전자의 염기배열 정보에 의해 설정된 센스·프라이머, 안티센스·프라이머를 스크리닝용 프로우브로서 이용할 수도 있다.

전기 프로우브로서 이용되는 뉴클레오티드 배열은 배열 번호: 2에 대응하는 부분 뉴클레오티드 배열이며, 54 염기의 삽입 배열부분의 일부를 적어도 포함하는 15개 이상이 연속하는 염기, 바람직하기로는 20개가 연속하는 염기, 보다 바람직하기로는 30개가 연속하는 염기, 가장 바람직하기로는 50개가 연속하는 염기를 가지는 것이다. 또는 전기 배열을 가지는 양성 클론 그 자체를 프로우브로서 이용할 수 있다.

본 발명 유전자의 취득에 있어서는 PCR법[Science,230, 1350 (1985)]에 의한 DNA/RNA 증폭법이 바람직하게 이용될 수 있다. 특히, 라이브러리로부터 전체 길이의 cDNA를 얻기 어려운 경우에는 RACE법[Rapid amplification of cDNA ends;"Jikken Igaku", 12(6), 35 (1994)], 특히 5'-RACE법[M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)] 등을 채용하는 것이 바람직하다.

이러한 PCR법의 채용에서 사용되는 프라이머는 본 발명에 의해 밝혀진 GFAT1L 유전자의 배열 정보에 의해 적당히 설정할 수 있으며, 이것은 통상의 방법으로 따라서 합성할 수 있다. 또, 증폭 DNA/RNA 단편의 분리 정제는 전술한 바와 같이, 통상의 방법에 따를 수가 있으며, 예를 들면, 겔 전기영동법 등에 의하면 좋다.

또한, 상기에서 얻어진 본 발명 유전자 또는 각종 DNA 단편은 통상의 방법, 예를 들면, 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)] 나 맥삼-길버트법[Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) 등에 따라서, 또는 간편하게는 시판의 시퀀스 킷트 등을 이용하여 그의 염기배열을 결정할 수가 있다.

이와 같이 하여 얻어진 본 발명의 유전자에 의하면, 예를 들면 이 유전자의 일부 또는 전부의 염기배열을 이용함으로써, 개체 또는 각종 조직에 있어서의 본 발명 유전자의 발현의 유무를 특이적으로 검출할 수가 있다.

이러한 검출은 통상의 방법으로 따라서 실시할 수가 있으며, 예를 들면, RT-PCR[Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E. S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol. A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)]에 의한 RNA 증폭, 노턴 브롯팅 해석[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)], in situ RT-PCR[Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)], in situ 하이브리다이제이션 등을 이용한 세포 레벨에서의 측정, NASBA법[Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92(1991)] 및 그 외의 각종 방법을 들 수 있다. 바람직하기로는 RT-PCR에 의한 검출법을 들 수가 있다.

또, 여기에서 PCR법을 채용하는 경우에 이용되는 프라이머는 본 발명 유전자만을 특이적으로 증폭할 수 있는 이 유전자 특유의 것인 한, 특히 제한은 없고, 본 발명 유전자의 배열 정보에 의하여 적당히 설정할 수가 있다. 통상, 10∼35 뉴클레오티드 정도, 바람직하기로는 15∼30 뉴클레오티드 정도의 길이를 가지는 본 발명 유전자의 부분 배열을 가지는 것을 들 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 유전자에는 이 유전자를 검출하기 위한 특이 프라이머 및/또는 특이 프로우브로서 사용되는 DNA 단편도 포함된다.

당해 DNA 단편은 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열로 이루어진 DNA와 높은 스트린젠트인 조건 하에서 하이브리다이즈하는 것을 특징으로 하는 DNA로서 규정할 수 있다. 여기서, 높은 스트린젠트인 조건으로서는 프라이머 또는 프로우브로서 이용되는 통상의 조건을 들 수가 있으며, 특히 제한은 되지 않으나, 예를 들면, 전술한 바와 같은 0.l% SDS를 함유하는 0.2×SSC 중, 60℃의 조건 또는 0.l% SDS를 함유하는 0.1×SSC 중, 60℃의 조건을 예시할 수가 있다.

본 발명 유전자에 의하면, 통상의 유전자 공학적 수법을 이용함으로서 이 유전자 생산물(GFAT1L 단백) 또는 이것을 함유하는 단백질을 용이하게 대량으로 안정적으로 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명 유전자에 의해 코드되는 GFAT1L 단백질 등의 단백질을 비롯하여 이 단백질의 제조를 위한, 예를 들면 본 발명 유전자를 함유하는 벡터, 이 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포, 이 숙주 세포를 배양하여 상기 본 발명 단백질을 제조하는 방법 등도 제공하는 것이다.

즉, 본 발명의 단백질은 본 발명에 의해 제공되는 GFAT1L 유전자 배열 정보에 의해 통상의 방법의 유전자 재조합 기술[예를 들면, Science, 224, 1431 (1984): Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983) 등 참조]에 따라서 조제할 수가 있다.

이 단백질의 제조는 보다 상세히는 이 소망의 단백을 코드하는 유전자가 숙주 세포 중에서 발현할 수 있는 재조합 DNA(발현 벡터)를 작성하고, 이를 숙주 세포에 도입하여 형질전환하고, 이 형질 전환체를 배양하고, 이어서 얻어진 배양물로부터 회수함으로써 행해진다.

상기 숙주 세포로서는 원핵생물 및 진핵생물의 모두를 이용할 수 있으며, 예를 들면, 원핵생물의 숙주로서는 대장균이나 고초균과 같은 일반적으로 이용되는 것을 광범위하게 들 수 있으며, 바람직하기로는 대장균, 특히 에세리히아·콜리(Escherichia coli) K12 주를 들 수 있다. 또, 진핵생물의 숙주 세포로는 척추동물, 효모 등의 세포가 포함되며, 전자의 예로서는 원숭이의 세포인 COS세포[Cell, 23: 175 (1981)], 차이니즈·햄스터 난소 세포 및 그의 디히드로엽산리닥타제 결손주 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)] 등을, 후자로서는 사카로마이세스속 효모 세포 등을 바람직하게 이용된다. 물론, 이것들로 한정되는 것은 아니다.

원핵생물 세포를 숙주로 하는 경우는 이 숙주 세포 중에서 복제 가능한 벡터가 이용되고, 이 벡터로서는 본 발명 유전자를 발현할 수 있도록 이 유전자의 상류에 프로모터 및 SD(Shine-Dalgarno) 염기배열, 더욱이 단백 합성 개시에 필요한 개시 코돈(예를 들면, ATG)을 부여한 발현 플라스미드를 바람직하게 이용할 수 있다. 상기 벡터로서는 일반적으로 대장균 유래의 플라스미드, 예를 들면 pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 등이 잘 이용되지만, 이것들에 한정되지 않고, 기존의 각종의 벡터를 이용할 수가 있다. 대장균을 이용한 발현계에 이용되는 상기 벡터의 시판품으로서는 예를 들면 pGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMAL-P2 (New England Biolabs), pET21, pET21/lacq(Invitrogen), pBAD/His (Invitrogen) 등을 예시할 수 있다.

척추동물 세포를 숙주로 하는 경우의 발현 벡터로서는 통상, 발현하려고 하는 본 발명 유전자의 상류에 위치하는 프로모터, RNA의 스프라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종료 배열을 보유하는 것을 들 수 있으며, 이것은 다시 필요에 따라 복제 기점을 가지고 있어도 좋다. 이 발현 벡터의 예로서는 구체적으로는 예를 들면 SV40의 초기 프로모터를 보유하는 pSV2dhfr [Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)] 등을 예시할 수 있다. 상기 이외에도 기존의 각종의 시판 벡터를 이용할 수 있다. 동물세포를 이용한 발현계에 이용한 수 있는 이들 벡터의 시판품으로서는 예를 들면 pEGFP-N, pEGFP-C(Clontech), pIND(Invitrogen), pcDNA3.l/His(Invitrogen) 등의 동물세포용 벡터나, pFastBac HT(GibcoBRL), pAcGHLT(PharMingen), pAc5/V5-His, pMT/V5-His, pMT/Bip/V5-his(이상,Invitrogen) 등의 곤충 세포용 벡터 등을 들 수 있다.

또한, 효모 세포를 숙주로 하는 경우의 발현 벡터의 구체적인 예로서는 산성 포스파타제 유전자에 대한 프로모터를 가지는 pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)] 등을 들 수 있다. 시판의 효모 세포용 발현 벡터에는 예를 들면 pPICZ (Invitrogen), pPICZα(Invitrogen) 등이 포함된다.

프로모터로서도 특히 한정되는 것은 아니고, 에세리히아속균을 숙주로 하는 경우는 예를 들면, 트립토판(trp) 프로모터, lpp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, PL/PR 프로모터 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 숙주가 바실루스속 균인 경우는 SP01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등이 바람직하다. 효모를 숙주로 하는 경우의 프로모터로서는 예를 들면, pH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 동물세포를 숙주로 하는 경우의 바람직한 프로모터로서는 SV40 유래의 프로모터, RNA 종양 바이러스의 프로모터, 메타로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, 사이트 메가로바이러스 프로모터, SRα 프로모터 등을 예시할 수 있다.

또, 본 발명 유전자의 발현 벡터로서는 통상의 융합 단백 발현벡터도 바람직하게 이용할 수 있다. 이 벡터의 구체적인 예로서는 글루타치온-S 트란스페라제 (GST)와의 융합 단백으로서 발현시키기 위한 pGEX(Promega) 등을 예시할 수 있다.

또, 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현, 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드 배열로서는 분비 배열, 리더 배열을 예시할 수 있으며, 세균 숙주에 대해서 융합 성숙 폴리펩티드의 정제에 사용되는 마커 배열(헥사히스티딘 택), 포유동물 세포의경우는 헤마글루티닌(HA) 택을 들 수 있다.

소망의 재조합 DNA(발현 벡터)의 숙주 세포에의 도입법 및 이에 의한 형질 전환법으로서는 특히 한정되지 않고, 일반적인 각종 방법을 채용할 수가 있다.

또한, 얻어진 형질 전환체는 통상의 방법에 따라 배양할 수 있고, 이 배양에 의해 바라는 바로 설계한 유전자에 의해 코드되는 본 발명의 목적 단백질이 형질 전환체의 세포내, 세포외 또는 세포막상에 발현, 생산 (축적, 분비)된다.

이 배양에 이용되는 배지로서는 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적당 선택 이용할 수 있으며, 배양도 숙주 세포의 생육에 적절한 조건 하에서 실시할 수 있다.

이렇게 얻어진 본 발명의 재조합 단백질은 소망에 따라 그의 물리적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종의 분리 조작 [生化學 데이터-북 III, 1175 1259 페이지, 제 1판 제 1쇄, 1980년 6월 23일 株式會社東京化學同人 발행; Biochemistry, 25 (25), 8274 (l986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987) 등 참조]에 의해 분리, 정제 할 수 있다.

이 방법으로서는 구체적으로는 통상의 재구성처리, 단백 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심분리, 침투압 쇼크법, 초음파파쇄, 한외여과, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합을 들 수 있다.

특히 바람직한 방법으로서는 본 발명 단백질에 대한 특이적인 항체를 결합시킨 컬럼을 이용한 어피니티 크로마토그래피 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명 단백질을 코드하는 소망한 유전자의 설계에서는 배열 번호: 2로 표시되는 GFAT1L 유전자의 염기배열을 양호하게 이용할 수가 있다. 이 유전자는 소망에 의해, 각 아미노산 잔기를 나타내는 코돈을 적당히 선택 변경하여 이용하는 것도 가능하다.

본 발명 단백질은 또한, 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열에 따라서, 일반적인 화학 합성법에 의해 제조할 수가 있다. 이 방법에는 통상의 액상법 및 고상법에 의한 펩티드 합성법이 포함된다.

이러한 펩티드 합성법은 보다 상세하게는 아미노산 배열 정보에 의해 각 아미노산을 l개씩 순서대로 결합시켜 사슬을 연장시켜 가는 소위 스텝와이즈 에론게이션법과 아미노산 몇 개로 이루어진 프라그멘트를 미리 합성하고, 이어서 각 프라그멘트를 커플링 반응시키는 프라그멘트 콘덴세이션법을 포함하며, 본 발명 단백질의 합성은 그 어느 것에 의해도 좋다.

상기 펩티드 합성에 채용되는 축합법도 통상의 방법에 따를 수가 있으며, 예를 들면, 아지드법, 혼합 산무수물법, DCC법, 활성 에스테르법, 산화 환원법, DPPA (디페닐포스포릴아지드)법, DCC+ 첨가물 (1-히드록시벤조트리아졸, N-히드록시숙신아미드, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드 등)법, 우드워드법 등을 예시할 수 있다.

이들 각 방법으로 이용할 수 있는 용매도, 이러한 종류의 펩티드 축합 반응에 사용되는 것으로 잘 알려져 있는 일반적인 것으로부터 적당히 선택할 수 있다.그 예로서는 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO), 헥사포스포로아미드, 디옥산, 테트라히드로푸란(THF), 에틸아세테이트 등 및 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있다.

또한, 상기 펩티드 합성 반응에서, 반응에 관여하지 않는 아미노산 내지 펩티드의 카르복실기는 일반적으로는 에스테르화에 의해, 예를 들면 메틸에스테르, 에틸에스테르, 제 3급 부틸 에스테르 등의 저급 알킬 에스테르, 예를 들면, 벤질에스테르, p-메톡시벤질에스테르, p-니트로벤질에스테르 등의 아랄킬 에스테르 등으로 하여 보호할 수 있다.

또한, 측쇄에 관능기를 가지는 아미노산, 예를 들면, 티로신 잔기의 히드록시기는 아세틸기, 벤질기, 벤질옥시카르보닐기, 제 3급 부틸기 등으로 보호되어도 좋지만, 반드시 이러한 보호를 행할 필요는 없다. 더욱이, 예를 들면 아르기닌 잔기의 구아니디노는 니트로기, 토실기, p-메톡시벤젠술포닐기, 메틸렌-2-술포닐기, 벤질옥시카르보닐기, 이소보르닐옥시카르보닐기, 아다만틸옥시카르보닐기 등의 적당한 보호기로 보호할 수 있다.

상기 보호기를 가지는 아미노산, 펩티드 및 최종적으로 얻어지는 본 발명 단백질에 있어서의 이들 보호기의 탈보호 반응도 관용되는 방법, 예를 들면 접촉 환원법이나, 액체 암모니아/나트륨, 불화수소, 브롬화수소, 염화수소, 트리플루오르아세트산, 아세트산, 포름산, 메탄술폰산 등을 이용하는 방법 등에 따라서 실시할 수 있다.

이렇게 얻어진 본 발명 단백질은 전술한 각종의 방법, 예를 들면 이온교환수지, 분배 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 향류 분배법 등의 펩티드 화학의 분야에서 범용되는 방법으로 따라, 적당히 정제할 수가 있다.

본 발명 단백질은 그 특이 항체를 작성하기 위한 면역 항원으로서도 바람직하게 이용할 수 있으며, 이 항원을 이용함으로써 소망의 항혈청(폴리클로날 항체) 및 단일 클론 항체를 취득할 수가 있다.

이 항체의 제조법 자체는 당업자에게 잘 이해되고 있는 것이며, 본 발명에 있어서도 이들 통상의 방법에 따를 수가 있다[예를 들면, 續化學實驗講座 "免疫生化學硏究法", 일본 생화학회편 (1986) 등 참조].

이렇게 얻어진 항체는 예를 들면, GFAT1L 단백의 정제 및 그의 면역학적 수법에 의한 측정 내지는 식별 등에 유리하게 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명 유전자의 발현이 골격근이나 심장의 조직에서 확인되고 있는 것으로부터 이 항체를 이용하여 GFAT의 이들 조직 중에서의 농도 측정에 이용할 수가 있다. 또한, 이 항체를 유효성분으로 하는 의약은 당뇨병 및 당뇨병 합병증 등의 질환에 대한 치료제 또는 예방제로서 유용하다.

상기에서 얻어진 본 발명 단백질은 이것을 유효성분으로 하는 의약품으로서 의약분야에 있어서 유용하다. 따라서, 본 발명은 이 단백질을 유효성분으로 하는 의약 조성물도 제공하는 것이다.

본 발명 단백질 의약으로서의 유용성은 상기한 것처럼 그의 당대사에 있어서, 중요한 조직인 골격근에 특이적 폴리펩티드가 가지는 GFAT 활성의 촉진, 또는 저혈당 개선 작용의 촉진에 있어, 이들의 활성을 확인하는 방법은 예를 들면, 후기실시예에 기재되어 있는 Marshall 등의 방법 [Marshall, J. Biol. Chem. 266(8), 4706-4712 (1991)]에 준해 실시할 수 있다.

이 방법은 GFAT에 의해 생성된 글루타메이트(Glutamate)를 다시 글루타메이트 탈수소 효소(Glutamate deydrogenase: GDH)와 반응시킬 때에, 동시에 조효소인 APAD가 APADH로 환원되어 이 환원 반응에 수반한 흡광도의 변화를 GFAT 활성으로서 측정하는 방법이다. 즉, 이 방법에서는 96 웰의 마이크로플레이트를 이용하여 200 ㎕의 기질 용액(40 mM Sodium phosphate buffer, pH 7.5, 50 mM KCl, 1.25 mM EDTA, 0.3 mM APAD, 6 U/㎖ (GDH), 0-6 mM Glutamine, 0-6 mM Fructose-6-P (F6P))에 적당히 희석한 GFAT1L의 대장균 용해액의 가용성 획분 50 ㎕를 가하고, 37℃에서 60분간 반응시키고, 이 때의 365nm의 흡광도의 변화를 마이크로플레이트 리더를 이용하는 분광 광도계법에 의해 측정한다.

의약 조성물에 있어서 유효 성분으로 하는 본 발명 단백질에는 그의 의약적으로 허용되는 염도 또 포함된다. 이러한 염으로는 당업계에서 주지의 방법에 의해 조제된다, 예를 들면 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 바륨, 암모늄 등의 알칼리 금속염, 알칼리토류 금속염, 암모늄염 등이 포함된다. 또한, 상기 염에는 본 발명 단백질과 적당한 유기산 또는 무기산과의 반응에 의한 산부가염도 포함된다. 대표적인 산부가염으로서는 예를 들면 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 중황산염, 아세트산염, 옥살산염, 길초산염, 올레인산염, 라우린산염, 붕산염, 벤조산염, 젖산염, 인산염, p-톨루엔술폰산염(토실레이트), 시트르산염, 마레인산염, 푸말산염, 숙신산염, 타르타르산염, 술폰산염, 글리콜산염, 마레인산염, 아스코르빈산염, 벤젠술폰산염, 나프실레이트 등을 들 수 있다.

상기 의약 조성물은 본 발명 단백질을 활성성분으로서 그의 약학적 유효량을 적당한 의약 담체 내지 희석제와 함께 함유하는 것이 포함된다.

상기 의약 조성물 (의약 제제)에 이용될 수 있는 의약 담체로서는 제제의 사용 형태에 따라 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 부습제, 붕괴제, 표면 활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제 등을 들 수 있으며, 이들 은 얻어지는 제제의 투여 단위 형태에 따라 적당히 선택 사용된다.

특히, 바람직한 본 발명의 의약 제제는 통상의 단백 제제 등에 사용되는 각종의 성분, 예를 들면 안정화제, 살균제, 완충제, 등장화제, 킬레이트제, pH 조정제, 계면활성제 등을 적당히 사용하여 조제된다.

상기 안정화제로써는 사람 혈청알부민, 통상의 L-아미노산, 당류, 셀룰로오스 유도체 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 또는 각각을 조합하거나 또는 이들에 계면활성제 등과 조합하여 사용할 수 있다. 이 조합에 의하면, 유효성분의 안정성을 보다 향상시킬 수 있는 경우가 있다.

상기 L-아미노산은 특히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 글리신, 시스틴, 글루타민산 등의 어느 것이라도 좋다.

상기 당으로서도 특히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 과당 등의 단당류, 만니톨, 이노시톨, 크실리톨 등의 당알코올, 자당, 말토오스, 락토오스 등의 2당류, 덱스트란, 히드록시프로필스타치, 콘드로이틴 황산, 히아루론산 등의 다당류, 이들의 유도체 등을 사용할 수 있다.

계면활성제로서는 특히 한정되는 것은 아니고, 이온성 및 비이온성 계면활성제의 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리옥시에틸렌글리콜 소르비탄 알킬 에스테르계, 폴리옥시에틸렌알킬에테르계, 소르비탄 모노아실 에스테르계, 지방산 글리세리드계 등을 사용할 수 있다.

셀룰로오스 유도체로서는 특히 한정되는 것은 아니고, 메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 등을 사용할 수 있다.

상기 당류의 첨가량은 유효성분 1 ㎍당 약 0.0001㎎ 정도 이상, 바람직하기로는 약 0.01∼10 ㎎ 정도의 범위로 하는 것이 적당하다. 계면활성제의 첨가량은 유효 성분 1 ㎍당 약 0.00001 mg 정도 이상, 바람직하기로는 약 0.0001∼0.01 mg 정도의 범위로 하는 것이 적당하다. 사람 혈청알부민의 첨가량은 유효성분 1 ㎍당 약 0.0001 mg 정도 이상, 바람직하기로는 약 0.001∼0.1mg 정도의 범위로 하는 것이 적당하다. 아미노산은 유효성분 l ㎍당 약 0.001∼10 ㎎ 정도로 하는 것이 적당하다. 또한, 셀룰로오스 유도체의 첨가량은 유효성분 1 ㎍당 약 0.00001 mg 정도 이상, 바람직하기로는 약 0.001∼0.1 ㎎ 정도의 범위로 하는 것이 적당하다.

본 발명 의약 제제 중에 포함되는 유효성분의 양은 광범위하게 적당히 선택되나, 통상 약 0.00001∼70 중량%, 바람직하기로는 약 0.0001∼5 중량% 정도의 범위로 하는 것이 적당하다.

또한, 본 발명 의약 제제 중에는 각종 첨가제, 예를 들면 완충제, 등장화제, 킬레이트제 등도 첨가할 수가 있다. 여기서 완충제로서는 붕산, 인산, 아세트산,시트르산, ε-아미노카프로산, 글루타민산 및/또는 이들에 대응하는 염(예를 들면, 이들의 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 금속염이나 알칼리토류 금속염) 등을 예시할 수 있다. 등장화제로서는 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 당류, 글리세린 등을 예시할 수 있다. 또 킬레이트제로서는 예를 들면, 에데트산나트륨, 시트르산 등을 들 수 있다.

본 발명 의약 제제는 용액 제제로서 사용할 수 있는 이외에 이것을 동결 건조하여 보존할 수 있는 상태로 한 후, 사용시 물, 생리적 식염수 등을 포함한 완충액 등으로 용해해 적당한 농도에 조제한 후에 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 의약 제제의 투여 단위 형태로서는 각종의 형태가 치료 목적에 따라 선택할 수 있고, 그의 대표적인 것으로 해서는 정제, 환약, 산제, 분말제, 과립제, 캅셀제 등의 고체 투여 형태, 용액, 현탁제, 유제, 시럽, 에릭실 등의 액제투여 형태가 포함되며, 이들은 더욱이 투여 경로에 따라 경구제, 비경구제, 경비제, 경질제, 좌제, 설하제, 연고제 등으로 분류되며, 각각 통상의 방법에 따라, 조합, 성형 내지 조제할 수가 있다.

예를 들면, 정제 형태로 성형할 때는 상기 제제 담체로서 예를 들면 락토오스, 백당, 염화나트륨, 포도당, 요소, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 결정 셀룰로오스, 규산, 인산칼륨 등의 부형제, 물, 에탄올, 프로판올, 단시럽, 포도당액, 전분액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 건조 전분, 알긴산나트륨,칸텐말, 라미나란말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘 등의 붕괴제, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르류, 라우릴황산나트륨, 스테아린산모노글리세리드 등의 계면활성제, 백당, 스테아린, 카카오 버터, 수소 첨가유 등의 붕괴 억제제, 제 4급 암모늄 염기, 라우릴황산나트륨 등의 흡수 촉진제, 글리세린, 전분 등의 보습제, 전분, 유당, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드상 규산 등의 흡착제, 정제 탈크, 스테아린산염, 붕산 분말, 폴리에틸렌글리콜 등의 활택제 등을 사용할 수 있다.

더욱이 정제는 필요에 따라, 통상의 제피를 시행한 정제, 예를 들면 당의정, 젤라틴 피포정, 장용피정, 필름 코팅정으로 할 수 있으며, 또한 이중정 내지는 다층정으로 할 수 있다.

환약의 형태에 성형할 때는 제제 담체로서 예를 들면, 포도당, 유당, 전분, 카카오지방, 경화 식물유, 카올린, 탈크 등의 부형제, 아라비아검, 트라간트말, 젤라틴, 에탄올 등의 결합제, 라미나란, 칸텐 등의 붕괴제 등을 사용할 수 있다.

캅셀제는 통상의 방법에 따라 통상 본 발명의 유효성분을 상기에 예시한 각종의 제제 담체와 혼합하고, 경질 젤라틴 캅셀, 연질 캅셀 등에 충전하여 조제된다.

경구투여용 액체 투여 형태는 관용되는 불활성 희석제, 예를 들면 물을 포함한 의약적으로 허용되는 용액, 에멀젼, 현탁액, 시럽, 에릭실 등을 포함하고, 다시 습윤제, 유제, 현탁제 등의 조제를 포함하게 할 수가 있으며, 이들은 통상의 방법에 따라 조제된다.

비경구투여용의 액체 투여형태, 예를 들면 멸균 수성 내지 비수성 용액, 에멀젼, 현탁액 등의 조제로 할 때는 희석제로서 예를 들면 물, 에틸알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에톡시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 올리브유 등의 식물유 등을 사용할 수 있으며, 또한 주입 가능한 유기 에스테르류, 예를 들면 올레인산에틸 등을 배합할 수 있다. 이들에는 다시 통상의 용해 보조제, 완충제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제, 분산제 등을 첨가할 수 있다.

멸균은 예를 들면, 박테리아 보류 필터를 통과시키는 여과조작, 살균제의 배합, 조사 처리 및 가열 처리 등에 의해 실시할 수 있다. 또한, 이것들은 사용 직전에 멸균수나 적당한 멸균 가능 매체에 용해할 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 조제할 수 있다.

좌제나 질 투여용 제제의 형태로 성형할 때는 제제 담체로서 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 카카오지방, 고급 알코올, 고급 알코올의 에스테르류, 젤라틴, 반합성 글리세라이드 등을 사용할 수 있다.

페이스트, 크림, 겔 등의 연고제의 형태에 성형할 때는 희석제로서 예를 들면 백색 바셀린, 파라핀, 글리세린, 셀룰로오스 유도체, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 올리브유 등의 식물유 등을 사용할 수 있다.

경비 또는 설하 투여용 조성물은 주지의 표준 부형제를 이용하여 통상의 방법에 따라 조제할 수가 있다.

또한, 본 발명 약제 중에는 필요에 따라 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등이나 다른 의약품 등을 함유시킬 수 있다.

상기 의약 제제의 투여 방법은 특히 제한이 없고, 각종 제제 형태, 환자의 연령, 성별 그 외의 조건, 질환의 정도 등에 응해 결정된다. 예를 들면 정제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 및 캅셀제는 경구 투여되며, 주사제는 단독으로 또는 포도당이나 아미노산 등의 통상의 보조액과 혼합하여 정맥내 투여되며, 또한, 필요에 따라, 단독으로 근육내, 피내, 피하 또는 복강내 투여되어 좌제는 직장내 투여되고, 경질제는 질내 투여되고, 경비제는 비강내 투여되며, 설하제는 구강내 투여되고 연고제는 경피적으로 국소 투여된다.

상기 의약 제제중 함유되어야 하는 유효성분의 양 및 그 투여량은 특히 한정되지 않고, 소망의 치료효과, 투여법, 치료 기간, 환자의 연령, 성별 그 외의 조건 등에 따라 광범위보다 적당히 선택된다. 일반적으로는 이 투여량은 통상, 1일당 사람 체중 1kg당 약 0.01㎍∼10㎎ 정도, 바람직하기로는 약 0.1㎍∼1㎎ 정도로 하는 것이 좋고, 이 제제는 1일에 1회 또는 여러 차례로 나누어 투여할 수가 있다.

상기에 의해 얻어지는 본 발명 골격근 특이적 폴리펩티드, 즉 본 발명 단백질은 GFAT 활성을 가지고 있으며, 이 단백질의 총 폴리펩티드 또는 그의 일부는 그 자신 저혈당 개선제로서 유용하다.

또한, 후기 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명 유전자는 골격근이나 심장의 조직에 있어서 그의 발현이 보이고 있는 것으로부터 본 발명의 GFAT1L 유전자의 안티센스 DNA의 전부 또는 일부를 포함하는 임의의 유전자 발현 벡터를 작성하고, 이 발현 벡터를 이들 골격근 조직에서 세포내의 mRNA에 대해 상보적 배열을 가지는 RNA를 만들고, 번역을 저해함으로써 강제적으로 GFAT1L 유전자의 발현을 억제시킬수 있고, 이렇게 하여 골격근 조직에 있어서의 헥소사민 생합성 경로에 있어서 GFAT의 활성을 저해할 수 있고, 세포내의 글루코오스의 취입을 촉진시켜 혈당치를 저하시킬 수가 있으며, 결과적으로 당대사를 개선하여 당뇨병의 진전의 억제 또는 개선할 수가 있다. 본 발명 유전자는 이러한 항당뇨병 작용을 가지는 유전자 치료용 조성물로서 또는 유전자 치료제로서 이용할 수 있다고 생각된다.

또한, 본 발명은 GFAT1L 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자 치료용 벡터 및 이 벡터에 의해 GFAT1L 유전자를 도입한 세포를 유효성분으로 하는 의약을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명에 의하면, 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열의 안티센스 DNA 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 GFAT1L 안티센스 유전자를 함유하는 유전자 치료용 도입용 벡터 및 이 벡터에 의해 GFAT1L 안티센스 유전자를 도입한 세포, 및 이 유전자 치료용 도입용 벡터 및 이 벡터에 GFAT1L 안티센스 유전자를 도입한 세포를 유효성분으로 하는 유전자 치료제가 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열의 안티센스 DNA 배열의 전부 또는 일부를 포함하는 GFAT1L 안티센스 유전자를 함유하는 유전자 치료용 도입용 벡터 및 이 벡터에 의해 GFAT1L 안티센스 유전자를 도입한 세포를 당뇨병 환자의 골격근 세포 또는 환자의 근육 조직 부위에 투여함으로써 이들 조직에서의 당대사를 개선하고, 당뇨병의 진전의 억제 또는 당뇨병 환자의 당대사의 개선함을 특징으로 하는 당뇨병 치료제를 제공할 수가 있다.

더욱이 또한, 본 발명에 의하면, 상기 GFAT1L 안티센스 유전자를 함유하는유전자 치료용 도입용의 바이러스 벡터를 유효성분으로서 함유하는 의약, 특히, 골격근에 있어서의 당대사를 개선하기 위한 처치 등에 사용되는 해당 의약이 제공된다.

이하, 이러한 유전자 치료에 대해 상술한다. 또, 이하의 유전자 치료의 실시에서는 특기하지 않는 한, 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학 및 면역학의 관용적인 방법을 이용할 수가 있다. 이들의 예로서는 마니아티스(Maniatis, T., et al., Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)), 삼브룩크 (Sambrook, J., et al, Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981)), 오스벨 (Ausbe, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York, (1992)), 글로버 (Glover, D., DNA Cloning, I and II (Oxford Press) (1985)), 아난드 (Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press (1992)), 구스리 (Guthrie, G., et al, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press) (1991)) 및 핀크 (Fink, et at, Hum. Gene Ther., 3, 11-19 (1992)에 기재되어 있다.

본 발명은 본 발명 유전자의 발현하는 세포에 있어서, 세포내의 mRNA에 대하여 상보적 배열을 가지는 RNA를 만들고, 번역을 저해하여 GFAT1L 유전자의 발현을 억제하기 위한 안티센스 의약의 제공에 의한 GFAT 활성억제 또는 혈당의 상승을 억제하는 유전자 치료법을 제공한다.

이 치료법은 예를 들면, GFAT1L 유전자를 가지는 GFAT 발현세포 본래의 mRNA와 결합시키던가, 또는 DNA 이중 나선의 사이에 끼워 넣은 3중쇄를 형성시킴으로서 전사 또는 번역 과정을 저해함으로써 표적으로 하는 유전자의 발현을 억제하는 방법이다. 이 방법은 유전자의 mRNA와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 이 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 세포에 공급하는 방법으로서 파악될 수가 있다.

이러한 GFAT1L 유전자의 발현 기능을 억제하는 작용을 공급하면, 수용세포/표적세포에 있어서의 GFAT 활성 또는 혈당의 상승을 억제할 수가 있다. 당해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 벡터 또는 플라스미드를 이용하여 염색체외로 유지하여 목적하는 세포에 도입할 수 있다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 당뇨병의 유전자 치료에 의하면, RNA 종양 바이러스, 아데노바이러스, AAV 유래의 벡터에 이 안티센스 올리고뉴클레오티드를 끼워 넣고, 이를 GFAT 활성 발현 세포에 감염시켜 안티센스 올리고뉴클레오티드를 과잉 발현시킴으로써 소망한 혈당 강하 효과를 얻을 수 있다.

이와 같이 GFAT1L 유전자를 가지는 세포에 안티센스·올리고뉴클레오티드를 도입하여 GFAT1L 단백의 발현을 억제시키는 경우, 당해 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대응하는 GFAT1L 유전자의 전체 길이에 대응하는 것일 필요는 없고, 예를 들면, 이 GFAT1L 유전자의 발현 기능을 억제하는 기능과 실질적으로 동질인 기능을 유지하는 한, 전술한 개변체이어도, 또는 특정의 기능을 유지한 일부 배열로 이루어진 유전자를 사용할 수도 있다.

이러한 재조합 및 염색체외 유지의 쌍방을 위한 소망 유전자의 도입을 위한 벡터는 당해 분야에 있어 이미 알려져 있으며, 본 발명에서는 이러한 기존의 벡터의 모두를 사용할 수 있다. 예를 들면, 발현 제어 엘리먼트에 연결된GFAT1L의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 카피를 포함하고, 더욱이 목적하는 세포내에서 당해 안티센스 올리고뉴클레오티드 생산물을 발현할 수 있는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터를 들 수가 있다. 이러한 벡터로서 통상 전술한 발현용 벡터를 이용할 수도 있지만, 바람직하기로는 예를 들면, 기원 벡터로서 미국특허제5252479호 명세서 및 PCT 국제 공개 WO93/07282호 명세서에 개시된 벡터(pWP-7A, pWP-19, pWU-1, pWP-8A, pWP-21 및/또는 pRSVL 등) 또는 pRC/CMV (Invitrogen) 등을 이용하여 조제된 벡터를 들 수가 있다. 보다 바람직하기로는 후술하는 각종 바이러스 벡터이다.

또, 유전자 도입 치료에 있어서 이용되는 벡터로 사용되는 프로모터로서는 각종 질환의 치료 대상이 되는 환부 조직에 고유의 것을 바람직하게 이용할 수 있다.

그 구체적인 예로서는 예를 들면, 골격근에 대해서는 골격근 엑틴, 미오신 중쇄, 크레아틴키나제 등을 들 수 있다. 심장에 대해서는 심방성 나트륨 이뇨 호르몬, Ventricle-specific myosine 경쇄, Atrial-and ventricular-specific α-myosine 중쇄 등을 예시할 수 있다. 또, 간장에 대해서는 알부민, α-페토프로틴, αl-안티트립신, 트란스페린, 트랜스 스티렌 등을 예시할 수 있다. 결장에 대해서는 카르복실산 안히드라제 I, 카르시노엔브로겐의 항원 등을 예시할 수 있다. 자궁 및 태반에 대해서는 에스트로겐, 아로마타제 사이트크롬 P450, 콜레스테롤 측쇄 절단 P450, 17-알파히드록시라제 P450 등을 예시할 수 있다.

전립선에 대해서는 전립선 항원, gp91-폭스 유전자, 전립선 특이적 칼리크레인 등을 예시할 수 있다. 유방에 대해서는 erb-B2, erb-B3, β-카제인, β-락토글로빈, 락토프로테인 등을 예시할 수 있다. 폐에 대해서는 활성제 단백질 C 유로글로블린 등을 예시할 수 있다. 피부에 대해서는 K-l4-케라틴, 사람 케라틴 1 또는 6, 로이콜린 등을 예시할 수 있다.

뇌에 대해서는 신경교섬유질 산성 단백질, 성숙 아스트로사이트 특이 단백질, 미에린 알칼리성 단백질, 티로신히드록시라 등을 예시할 수 있다. 췌장에 대해서는 비린(villin), 글르카곤, 란게르한스 섬 아밀로이드 폴리펩티드, 아미라제, PAPl 등을 예시할 수 있다. 갑상선에 대해서는 티오글로블린, 칼시토닌 등을 예시할 수 있다. 뼈에 대해서는 α1 콜라겐, 오스테오칼신, 뼈 시아로글리코프로틴 등을 예시할 수 있다. 신장에 대해서는 레닌, 간장/뼈/신장 알칼리성 포스포타제, 에리쓰로포이에틴 등을 예시할 수 있다.

또, 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용 벡터의 제조에 있어서, 도입되는 안티센스 올리고뉴클레오티드(GFAT1L 유전자 배열에 대응하는 상보 배열 전부 또는 일부)는 본 발명의 유전자의 염기배열 정보에 의해 전술한 바와 같이, 일반적 유전자 공학적 수법에 의해 용이하게 제조·취득할 수 있다.

이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용 벡터의 세포에의 도입은 예를 들면 일렉트로포레이션, 인산칼슘 공침법, 바이러스 형질 도입 등을 비롯한 세포에 DNA를 도입하는 당해 분야에서 이미 알려져 있는 각종의 방법으로 따라서 행할 수있다. 또, GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 형질전환된 세포는 그 자체 분리상태에서 GFAT 활성 또는 혈당의 상승을 억제하기 위한 의약이나, 치료 연구를 위한 모델계로서 이용하는 것도 가능하다.

유전자 치료에 대해서는 상기의 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용 벡터는 환자를 대상으로 하는 조직 부위에 국소적으로 또는 전신적으로 주사 투여함으로써 환자의 표적계 포내에 도입할 수가 있다. 이 때, 전신적 투여에 의하면, 다른 부위에 GFATmRNA가 발현할 수 있는 어느 세포에도 도달시킬 수가 있다. 형질 도입된 유전자가 각 표적 세포의 염색체내에 항구적으로 취입되지 않는 경우에는 이 투여를 정기적으로 반복하면 좋다.

본 발명의 유전자 치료 방법은 전술하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용의 재료 (안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용 벡터)를 직접 체내에 투여하는 인 비보(in vivo)법과 환자의 체내에서 일단 표적으로 하는 세포를 꺼내 체외에서 유전자를 도입하고, 그런 다음, 이 세포를 체내에 되돌리는 엑소 비보(exvivo)법의 양쪽 모두의 방법을 포함한다.

또한, GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 직접 세포내에 도입하여 RNA쇄를 절단하는 활성 분자인 리보자임에 의한 유전자 치료도 가능하다.

후술하는 본 발명 GFAT1L 유전자에 대응하는 배열의 안티센스 올리고뉴클레오티드 전부 또는 그 단편을 함유하는 유전자 도입용 벡터 및 이 벡터에 의해 사람 GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 도입된 세포를 유효성분으로 하는 본 발명의 유전자 치료제는 특히, 당뇨병을 그 이용 대상으로 하는 것이지만, 상기의 유전자 치료 (처치)는 당뇨병 이외에도 당뇨병성 노이로제, 당뇨병성 신부전, 당뇨병성 망막증과 같은 당뇨병 합병증의 치료 및 유전자 표지도 목적으로 하여 행할 수가 있다.

또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 표적 세포는 유전자 치료(처치)의 대상에 의해 적당 선택할 수가 있다. 예를 들면, 표적 세포로서 GFAT 발현이 보이는 세포, 특히 골격근, 심장 조직 이외에, 임파구, 섬유아세포, 간세포, 조혈간세포 등을 들 수가 있다.

상기 유전자 치료에 있어서의 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입 방법에는 바이러스적 도입 방법 및 비바이러스적 도입 방법이 포함된다.

바이러스적 도입 방법으로서는 예를 들면, GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 정상세포에 발현하는 외래의 물질인 것을 감안하여 벡터로서 RNA 종양 바이러스 벡터를 이용하는 방법을 들 수가 있다. 그 외의 바이러스 벡터로서는 아데노바이러스벡터, HIV (human Immunodeficiency virus) 벡터, 아데노수반 바이러스 벡터(AAV, adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스 벡터, 단순 헤그페스 바이러스(HSV) 벡터, 엡스타인 바르 바이러스(EBV, Epstein-Barr virus) 벡터 등을 들 수 있다.

비바이러스적인 유전자 도입 방법으로서는 인산칼슘공침법; DNA를 봉입한 리포솜과 미리 자외선으로 유전자를 파괴한 불활성화 센다이 바이러스를 융합시켜 막융합 리포솜을 작성하여 세포막과 직접 융합시켜 DNA를 세포내에 도입하는 막융합 리포솜법[Kato, K., et al., J. Biol. Chem., 266. 22071-22074 (1991)]; 플라스미드 DNA를 금으로 코팅하여 고압 방전에 의해 물리적으로 세포내에 DNA를 도입하는 방법[Yang, N. S. et al.. Proc. Natl. Acad. Sci., 87. 9568-9572 (1990)]; 플라스미드 DNA를 직접 인 비보에서 장기나 표적 조직에 주입하는 네이키드 (naked) DNA법 (Wolff, J. A., et al., Science. 247, 1465-1467 (1990)); 다중막 정전하 리포솜으로 둘러싼 유전자를 세포에 도입하는 카치오닉·리포솜법[Kunio Yagi, Igakku no Ayumi, Vol. 175, No. 9, 635-637 (1995)]; 특정 세포에만 유전자를 도입하여 다른 세포에 들어오지 않게 하기 위해서, 목적하는 세포에 발현하는 리셉터에 결합하는 리간드를 DNA와 결합시키고, 그것을 투여하는 리간드-DNA 복합체법[Frindeis, et a1., Trends Biotechnol., 11. 202 (1993); Miller, et al., FASEB J., 9, 190 (1995)] 등을 사용할 수가 있다.

상기 리간드 DNA 복합체법에는 예를 들면, 간세포가 발현하는 아시아로당단백 리셉터를 타겟으로서 아시아로당단백을 리간드로서 이용하는 방법[Wu, et al., J. Biol. Chem., 266, 14338 (1991); Ferkol, et al., FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)], 표적 세포가 강하게 발현하고 있는 트란스페린 리셉터를 표적으로서 트란스페린을 리간드로서 이용하는 방법[Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)] 등이 포함된다.

또한, 본 발명에서 이용되는 유전자 도입법은 상기와 같은 각종의 생물학적 및 물리학적인 유전자 도입법을 적당히 조합한 것이어도 좋다. 이 조합에 의한 방법으로서는 예를 들면, 특정 사이즈의 플라스미드 DNA를 아데노바이러스 헥손 단백질에 특이적인 폴리리진 포합 항체와 조합시키는 방법을 들 수 있다. 이 방법에 의하면, 얻어지는 복합체가 아데노바이러스 벡터에 결합하고, 이렇게 얻어지는 3분자 복합체를 세포에 감염시킴으로서 본 발명 안티센스 올리고뉴클레오티드의 도입을 행할 수 있다. 이 방법에서는 아데노바이러스 벡터에 커플링한 DNA가 손상되기 전에, 효율적인 결합, 내재화 및 엔도솜 분해가 가능해진다. 또, 전기 리포솜/DNA 복합체는 직접 인 비보에서 유전자 도입을 매개할 수 있다.

이하, 구체적인 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용 바이러스 벡터의 작성법 및 표적 세포 또는 표적 조직에의 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입법에 대해서 기술한다.

레트로바이러스 벡터 시스템은 바이러스 벡터와 헬퍼 세포(펙케이징 세포)로 이루어져 있다. 여기서 헬퍼 세포는 레트로바이러스의 구조 단백질 gag (바이러스 입자내의 구조단백질), pol(역전사 효소), env(외피 단백질) 등의 유전자를 미리 발현하고 있지만, 바이러스 입자를 생성하고 있지 않는 세포를 말한다. 한편, 바이러스 벡터는 팩케이징 시그널이나 LTR(long terminal repeats)를 가지고 있지만, 바이러스 복제에 필요한 gag, pol, env 등의 구조 유전자를 가지고 있지 않다. 팩케이징 시그널은 바이러스 입자의 어셈블리 시에 태그로 되는 배열에서, 선택 유전자 (neo, hyg)와 클로닝 사이트에 결합된 소망의 도입 안티센스 올리고뉴클레오티드 (GFAT1L에 대응하는 총 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 단편)가 바이러스 유전자대신에 삽입된다. 여기서 고역가의 바이러스 입자를 얻기 위하여는 인서트를 가능한 한 짧게 하고, 팩케이징 시그널을 gag 유전자의 일부를 포함하는 넓게 하고, gag 유전자의 ATG를 남기지 않도록 하는 것이 중요하다.

소망의 GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 결합한 벡터 DNA를 헬퍼 세포에 이입함으로써 헬퍼 세포가 만들고 있는 바이러스 구조 단백질에 의해 벡터 게놈 RNA가 팩케이지되어 바이러스 입자가 형성되어 분비된다. 재조합 바이러스로서의 바이러스 입자는 표적 세포에 감염된 후, 바이러스 게놈 RNA로부터 역전사된 DNA가 세포핵에 끼워져 벡터 내에 삽입된 안티센스 유전자가 발현한다.

또, 유전자의 도입 효율을 올리는 방법으로서 피브로넥틴의 세포 접착 도메인과 헤파린 결합 부위와 접합 세그멘트를 포함한 단편을 이용하는 방법[Hanenberg, R., et at., Exp. Hemat., 23, 747 (1995)]를 채용할 수 있다.

상기 레트로바이러스 벡터·시스템에 있어서 이용되는 벡터로서는 예를 들면, 마우스의 백혈병 바이러스를 기원으로 하는 레트로바이러스[McLachlin, J. R., et at., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)]을 들 수 있다.

아데노바이러스 벡터를 이용하는 방법에 대해 상술하면, 이 아데노바이러스벡터의 작성은 베르크너[Berkner. K. L., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)], 세토구치 야스히로 등[Setoguchi, Y., et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)], 히로미 카네가에 등["Jikken Igaku", 12, 28-34 (1994)] 및 케트너 등[Ketner. G., et al., Proc. Natl, Acad. Sci., USA., 91, 6186-6190 (1994)] 방법에 준하여 행할 수 있다.

예를 들면, 비증식성 아데노바이러스 벡터를 작성하기 위하여는 우선 아데노바이러스의 초기 유전자의 E1 및/또는 E3 유전자 영역을 제거한다. 다음에, 목적으로 하는 소망의 외래 유전자 발현 단위(목적으로 하는 도입용 안티센스 올리고뉴클레오티드, 즉 본 발명 GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 그의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 전사하기 위한 프로모터, 전사된 유전자의 안정성을 부여하는 폴리A로 구성) 및 아데노바이러스 게놈 DNA의 일부를 포함한 플라스미드 벡터와 아데노바이러스 게놈을 포함한 플라스미드를, 예를 들면, 293 세포에 동시에 트란스펙션한다. 이 2자 사이에 상동성 재조합을 일으켜 유전자 발현 단위와 E1을 치환함으로써, 소망의 GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터인 비증식성 아데노바이러스 벡터를 작성할 수가 있다. 또한, 코스미드 벡터에 아데노바이러스 게놈 DNA를 끼워 넣어, 말단 단백질을 부가한 3'-측 아데노바이러스 벡터를 작성할 수 있다. 더욱이 재조합 아데노바이러스 벡터의 작성에는 YAC 벡터도 이용 가능하다.

아데노수반 바이러스 (adeno-associated virus, AAV) 벡터의 제조에 대해 개략하면, AAV는 아데노바이러스의 배양계에 혼입되어 오는 소형의 바이러스로서 발견되었다. AAV에는 바이러스 복제에 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않고 숙주세포내에서 자율적으로 증식하는 파르보바이러스속(Parvoviridae)과 헬퍼 바이러스를 필요로 하는 디펜도바이러스속(Dependoviridae)의 존재가 확인되어 있다. 이 AAV는 숙주역이 넓고, 각종 세포에 감염하는 흔히 있던 바이러스이고, 바이러스 게놈은 크기가 4680 염기의 선상 1본쇄 DNA로 되고, 그의 양단의 145염기가 ITR(inverted terminal repeat)로 불리는 특징적인 배열을 가지고 존재하고 있다. 이 ITR의 부분이 복제 개시점으로 되어 프라이머의 역할을 한다. 더욱이 바이러스 입자에의 팩케이징이나 숙주 세포의 염색체 DNA에의 조합에도, 이 ITR이 필수로 된다. 또한, 바이러스 단백질에 관해서는 게놈의 왼쪽 반이 비구조 단백질, 즉, 복제나 전사를 주관하는 조절 단백질의 Rep를 코드하고 있다.

재조합 AAV의 작성은 AAV가 염색체 DNA에 결합하는 성질을 이용하여 행할 수 있으며, 이렇게 소망의 유전자 도입용 벡터를 작성할 수 있다. 이 방법은 보다 상세하게는 우선 야생형 AAV의 5'와 3'의 양단의 ITR를 남기고, 그 사이 소망의 도입용 안티센스 올리고뉴클레오티드(GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 삽입한 플라스미드(AAV 벡터 플라스미드)를 작성한다. 한편, 바이러스 복제나 바이러스 입자의 형성에 필요로 하는 바이러스 단백질은 다른 헬퍼 플라스미드에 의해 공급시킨다. 이 양자의 사이에는 공통의 염기배열이 존재하지 않도록 하고, 유전자 재조합에 의한 야생형 바이러스가 출현하지 않게 할 필요가 있다. 그런 다음, 양자의 플라스미드를 예를 들면, 293세포로 트랜스팩션에 의해 도입하고, 다시 헬퍼 바이러스로서 아데노바이러스 (293세포를 이용하는 경우는 비증식형의 것이라도 좋다)를 감염시키면, 비증식성의 소망의 재조합 AAV가 생산된다. 이어서, 이 재조합 AAV는 핵내에 존재하므로, 세포를 동결 융해하여 회수하고, 혼입하는 아데노바이러스를 56℃로 가열하여 실활시킨다. 다시 필요에 따라, 염화세슘을 이용하는 초원심법에 의해 재조합 AAV를 분리 농축한다. 상기와 같이 하여 소망의 유전자 도입용 재조합 AAV를 얻을 수 있다.

EBV 벡터의 제조는 예를 들면, 시미즈 등의 방법으로 준해 행할 수 있다[Cell Engineering, 14(3), 280-287 (1995)].

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용 EBV 벡터의 제조에 대해 개략하면, EB 바이러스(Epstein-Barr virus: EBV)는 1964년에 엡스타인(Epstein) 등에 의해 버킷트(Burkitt) 임파종 유래의 배양 세포로부터 분리한 헤르파과(Herpesviridae)에 속하는 바이러스이다[Kieff. E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp. 1889-1920]. 이 EBV에는 세포를 트랜스폼하는 활성이 있으므로, 유전자 도입용 벡터로 하기 위해서는 이 트랜스폼 활성을 없앤 바이러스를 조제해야한다. 이것은 다음과 같이 하여 실시할 수 있다.

즉, 우선, 소망한 외래 유전자를 끼워 넣은 표적 DNA 근방의 EBV게놈을 클로닝한다. 그곳에 외래 유전자의 DNA단편과 약제 내성 유전자를 조합, 재조합 바이러스 제작용 벡터로 한다. 이어서, 적당한 제한 효소로 잘라낸 재조합 바이러스 제작용 벡터를 EBV 양성 Akata 세포에 트란스펙트한다. 상동 재조합에 의해 생긴 재조합 바이러스는 항표면 면역 글로블린 처리에 의한 바이러스 생산 자극에 의해 야생형 AkataEBV와 함께 회수될 수 있다. 이것을 EBV 음성 Akata 세포에 감염시키고, 약제 존재하에서 내성주를 선택함으로써, 야생형 EBV가 공존하지 않는 소망의 재조합 바이러스만이 감염한 Akata 세포를 얻을 수 있다. 다시 재조합 바이러스 감염 Akata 세포에 바이러스 활성을 유도함으로써, 목적으로 하는 대량의 재조합 바이러스 벡터를 생산할 수 있다.

재조합 바이러스 벡터를 이용하지 않고, 소망의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 세포에 도입하는 비바이러스 벡터의 제조는 예를 들면, 막융합 리포솜에 의한 유전자 도입법에 의해 실시할 수가 있다. 이것은 막 리포솜(지질 이중막으로된 소포, vesicle)에 세포막에의 융합활성을 부여함으로써 리포솜의 내용물을 직접 세포내에 도입하는 방법이다.

상기 막융합 리포솜에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 도입은 예를 들면 나카니시 등의 방법에 의해 행할 수가 있다[Nakanishi, M., et al.,Exp. Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi, M., et al., Gene introduction into animal tissues. In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery(ed. by Lee, V. H. et al.). Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp. 337-349].

이하, 이 막융합 리포솜에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 도입법에 대해 개략한다. 즉, 자외선으로 유전자를 불활성화한 센다이바이러스와 소망의 안티센스 올리고뉴클레오티드나 발현 단백질 등의 고분자 물질을 봉입한 리포솜을 37℃ 에서 융합시킨다. 이 막융합 리포솜은 안쪽에 리포솜 유래의 공동을, 외측에 바이러스 엔벨로오프와 스파이크가 있는 유사 바이러스라고도 불리는 구조를 가지고 있다. 더욱이, 자당 밀도 구배 원심법으로 정제한 후, 표적으로 하는 배양 세포 또는 조직 세포에 대해서 막융합 리포솜을 4℃에서 흡착시킨다. 이어서, 37℃로 하면, 리포솜의 내용물이 세포에 도입되어 소망의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 세포에 도입할 수 있다. 여기서, 리포솜으로서 이용되는 지질로서는 50%(몰비) 콜레스테롤과 레시틴 및 음전하를 갖는 합성 인지질로, 직경 300㎚의 1매 막 리포솜을 제작하여 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 다른 리포솜을 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오티드를 표적 세포에도입하는 방법으로서는 카치오닉 리포솜에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입법을 들 수가 있다. 이 방법은 야기 등의 방법에 준하여 행할 수 있다[Yagi, K. et al., B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)]. 이 방법은 플라스미드도 세포도 음으로 하전되어 있는 것에 착안하여 리포솜 막의 내외 양면에 양의 전하를 부여하고 정전기에 의해 플라스미드의 취입을 증가시켜, 세포와의 상호작용을 높이도록 한 것이다. 여기서 이용되는 리포솜은 양의 하전을 가지는 다중막의 큰 리포솜(multilamellar large vesicles: MLV)이 유용하지만, 큰 l매 막 리포솜(large unilamellar vesicles: L UV)이나 작은 1매 막 리포솜 (small unilamellar vesicles: SUV)을 사용하여 플라스미드와의 복합체를 제작하여 소망의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 것도 가능하다.

플라스미드-매립 카치오닉 MLV의 조제법에 대해서 개략하면, 이것은 우선 지질 TMAG(N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride), DLPC(dilauroyl phosphatidylcholine) 및 DOPE(dioleoyl phosphatidylethanolamine)를 몰비가 1: 2: 2가 되는 비율로 함유하는 클로로포름 용액(지질 농도로서 1 mM)을 조제한다. 그 다음에 총량 1 μmol의 지질을 스피츠형 시험관에 넣고, 로터리 에바포레이터로 클로로포름을 감압 제거하여 지질 박막을 조제한다. 다시 감압하에 클로로포름을 완전하게 제거하여 건조시킨다. 그 다음에 20㎍의 유전자 도입용 플라스미드를 함유하는 0.5㎖의 둘베코의 인산 완충생리식염액- Mg, Ca 함유를 첨가하고, 질소가스로 치환한 후, 2분간 보르텍스 믹서로 교반하여 소망의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드 매립 카치오닉MLV 현탁액을 얻을 수 있다.

상기와 같이 하여 얻어진 플라스미드 매립 카치오닉 MLV를 유전자 치료제로서 사용하는 일례로서는 예를 들면, 발현 목적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 끼워 넣은 발현 플라스미드를 상기 카치오닉 MLV에 DNA량으로서 0.6㎍, 리포솜 지질량으로서 30 nmol이 되도록 매립하고, 이것을 2㎕의 인산 완충 생리식염액에 현탁시켜 환자에서 추출한 표적 세포 또는 환자 조직에 대해서 격일 투여하는 방법을 예시할 수 있다.

그런데, 유전자 치료란 "질병의 치료를 목적으로서, 유전자 또는 유전자를 도입한 세포를 사람의 체내에 투여하는 것"이란 후생성 가이드 라인에 정의되고 있다. 그러나, 본 발명에 있어서의 유전자 치료란 이 가이드 라인의 정의에 더하여 전술 한 표적 세포에 GFAT1L 유전자의, GFAT 발현 억제 안티센스 DNA로서 특징지울 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입함으로써 당뇨병을 비롯한 당뇨병 합병증의 치료뿐만 아니라, 더욱이 표지로 되는 유전자 또는 표지로 되는 유전자를 도입한 세포를 사람 체내에 도입하는 것도 포함하는 것으로 한다.

본 발명의 유전자 치료에 있어서, 소망 유전자의 표적 세포 또는 표적 조직에 도입방법에는 대표적으로는 2 종류의 방법이 포함된다.

그의 제 l법은 목적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드)가 도입된 아데노바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 환자의 표적 세포 또는 표적 조직에 직접 감염시키는 유전자 도입법이다.

상기 제 1법의 별법으로서 목적 안티센스 올리고뉴클레오티드 (GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 함유하는 바이러스 벡터를 감염, 또는 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 생산 세포와 함께 배양하여 환자 유래의 세포에 목적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하여, 환자 체내에 이식하는 ex vivo 법도 채용할 수가 있다.

제 2법은 목적으로 하는 적당한 동물세포 발현벡터 플라스미드 DNA에 결합된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드)를 직접 환자의 체내나, 골격근 등의 표적 부위에 주입하는 유전자 직접 도입법(직접법)이다. 이것은 예를 들면, HVJ 리포솜법, 카치오닉 리포솜법, DNA 직접 주사법, 전기 천공법, 유전자 건법 등에 의해 실시할 수 있다.

상기 실시에서는 특히, 체외에서의 예비 시험에 의해, 유전자 도입법에 의해, 실제로 목적 안티센스 올리고뉴클레오티드 (GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드)가 도입되는지 여부를, 미리 벡터 유전자 cDNA의 PCR법에 의한 검색이나 in situ PCR법에 의해 확인하던가, 또는 목적 안티센스 올리고뉴클레오티드 (GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 도입에 의해 소망의 치료 효과인 특이적 활성의 상승 또는 저하나, 표적 세포에의 효과를 확인하는 것이 바람직하다. 또한, 바이러스 벡터를 이용하는 경우에는 증식성 바이러스의 검색을 PCR법으로 행하는 등으로서 유전자 치료시에 이들의 안티센스 올리고뉴클레오티드 등의 도입에 의한 안전성을 확인하는 것이 중요하다는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명은 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 도입용 벡터 또는 목적 안티센스 올리고뉴클레오티드(GFAT1L 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드)가 도입된 세포를 활성성분으로 하고, 이를 약학적 유효량, 적당한 무독성 의약 담체 내지는 희석제와 함께 함유하는 의약 조성물 또는 의약 제제 (유전자 치료제)를 제공한다.

본 발명의 의약 조성물(의약 제제)에 이용할 수 있는 의약 담체로서는 제제의 사용 형태에 따라 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 부습제, 붕괴제, 표면 활성제, 활택제 등의 희석제 내지 부형제 등을 예시할 수 있으며, 이들은 얻어지는 제제의 투여 단위 형태에 따라 적당히 선택 사용할 수 있다.

본 발명 의약 제제의 투여 단위 형태로서는 전술한 GFAT1L 단백질 항체 제제의 제제예를 동일하게 들 수 있으며, 치료 목적에 따라 각종의 형태로부터 적의 선택할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 안티센스·올리고뉴클레오티드 도입용 벡터를 포함한의약 제제는 이 벡터를 리포솜에 매립된 형태 또는 소망한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함되는 바이러스 벡터를 포함한 바이러스에 의해 감염된 배양 세포의 형태로 조제된다.

이들은 인산완충생리식염액(pH 7.4), 링거액, 세포내 조성액용 주사제중에 배합한 형태 등으로 조제할 수 있다. 또한 프로타민 등의 유전자 도입효율을 높이는 물질과 함께 투여되도록 하는 형태로 조제할 수도 있다.

상기 의약제제의 투여방법은 특히 제한이 없고, 각종 제제형태, 환자의 연령, 성별 그 외의 조건, 질환의 정도 등에 따라 결정된다.

상기 의약 제제중에 함유되어야 하는 유효성분의 양 및 그의 투여량은 특히한정되지 않고, 소망의 치료 효과, 투여법, 치료 기간, 환자의 연령, 성별 그 외의 조건 등에 따라 광범위하게 적의 선택된다.

이 제제는 1일에 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 1 내지 수주간 간격으로 간헐적으로 투여할 수도 있다. 또, 바람직하기로는 프로타민 등 유전자도입효율을 높이는 물질 또는 이를 포함한 제제와 병용 투여할 수가 있다. 본 발명에 따른 유전자 치료를 당뇨병의 치료에 적용하는 경우는 전술한 각종 유전자 치료를 적의 조합하여 행할 수도 있으며(결합 유전자 치료), 전술한 유전자 치료에, 종래의 인슐린 요법, 식사 요법, 등을 조합하여 행할 수도 있다. 더욱이, 본 발명 유전자 치료는 그의 안전성을 포함하여, NIH의 가이드 라인을 참고하여 실시할 수가 있다 [Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)] .

본 발명에 의하면, 세포의 GFAT 활성을 촉진하는 GFAT1L 유전자의 존재를 검출하기 위해서, 혈액 또는 혈청과 같은 생물학적 시료를 조제하고, 소망에 따라 핵산을 추출하고, GFAT1L의 감수성 유전자가 존재하는지 여부에 대해서 분석하는 것이 가능하다. 또한, 세포 또는 조직에 있어서의 GFAT 활성 레벨, GFATmRNA의 발현 레벨을 헥소사민 생합성경로 조절기능장해로의 진행 또는 예후지표로서 검출하기 위해서는 헥소사민 생합성경로 조절장해를 가지는 생물학적인 시료를 조제하고, GFAT1L 유전자가 존재하는지 여부, 또는 그의 mRNA의 양에 대해서 분석하면 좋다. 이 방법을 이용함으로써 세포 또는 조직에 있어서의 GFAT 활성의 레벨, GFATmRNA의 발현 레벨, 헥소사민 생합성 경로의 조절 기능 장해로의 진행, 또는 예후지표로서검출하는 것이 가능하게 되고, 이들의 진단, 예를 들면 당뇨병의 진단 및 당뇨병 치료 효과의 판정 및 예후의 예측이 가능해진다.

이 검출 방법은 예를 들면, 미리 GFAT활성을 가지는 환자 샘플로부터 얻어진 GFAT1L 유전자에 관한 정보를 기초로 하여 DNA 단편을 작성하고, GFAT1L 유전자의 스크리닝 및/또는 그 증폭에 이용되도록 설계된다. 보다 구체적으로 예를 들면, 플라크 하이브리다이제이션, 콜로니 하이브리다이제이션, 서든 플롯법, 노던 블롯법 등에서의 프로우브로서 성질을 가지는 것, 핵산 배열을 폴리메라제로 증폭하는 폴리메라제 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭한 GFAT1L의 전부 또는 일부의 DNA 단편을 얻을 수 있기 위한 프로우브로서의 성질을 갖는 것을 작성할 수 있다. 이를 위하여는 우선, GFAT1L과 같은 배열을 가지는 프라이머를 작성하고, 스크리닝용 프로우브로서 이용해 생물학적 시료(핵산 시료)와 반응시킴으로써 당해 GFAT1L 배열을 가지는 유전자의 존재를 확인할 수가 있다. 이 핵산 시료는 표적 배열의 검출을 용이하게 하는 각종 방법, 예를 들면 변성, 제한소화, 전기영동 또는 돗트 플롯팅으로 조제해도 좋다.

상기 스크리닝 방법으로서는 특히 PCR법을 이용하는 것이 감도의 점에서 바람직하고, 이 방법은 GFAT1L 단편을 프라이머로서 이용하는 방법이면 특히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법[Science, 230, 1350-1354(1985)]이나 새롭게 개발된, 또는 장래 사용되는 PCR변법[Yoshiyuki Sakaki 佳之 등 편, 羊土社, 實驗醫學, 增刊 8(9) (1990); 단백질·핵산·효소, 臨時增刊, 共立出版(株), 35(17) (1990)]의 어느 것이라도 이용하는 것이 가능하다.

프라이머로서 사용되는 DNA 단편은 화학 합성한 올리고DNA이며, 이들 올리고DNA의 합성은 자동 DNA합성장치 등, 예를 들면 DNA합성장치, PharmaciaLKB Gene Assembler Plus (Pharmacia사제)를 사용해 합성할 수가 있다. 합성되는 프라이머(센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머)의 길이는 약 10∼50 뉴클레오티드 정도가 바람직하고, 보다 바람직하기로는 15∼30 뉴클레오티드 정도를 예시할 수 있다. 상기에서, 특히 합성되는 프라이머는 공지의 다른 GFAT의 DNA 배열과 구별되는 배열을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 스크리닝에 이용되는 프로우브는 통상은 표지한 프로우브를 이용하지만, 표지하지 않은 것이어도 좋고, 직접적 또는 간접적으로 표지한 리간드와의 특이적 결합에 의해 검출하여도 좋다. 적당한 표지 및 프로우브 및 리간드를 표지하는 방법은 본 발명의 기술 분야에서 알려져 있으며, 닉크 트랜슬레이션(nick translation), 랜덤·프라이밍 또는 키나제 처리와 같은 기존의 방법에 의해 결합될 수 있는 방사성 표지, 비오틴, 형광성기, 화학 발광기, 효소, 항체 등이 이들의 기술에 포함된다.

검출을 위해서 이용하는 PCR법으로서는 예를 들면 RT-PCR법을 들 수 있으나, 당해 분야에서 이용되는 각종 변법을 적응할 수가 있다.

또한, 본 발명의 측정방법은 시료중의 GFAT1L 유전자의 검출을 위한 시약킷트를 이용함으로써 간편하게 실시할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 GFAT1L DNA 단편을 함유하는 것을 특징으로 하는 GFAT1L의 검출용 시약 킷트를 제공한다.

이 시약 킷트는 적어도 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열 또는 그의 상보적염기배열의 일부 또는 모두에 하이브리다이즈하는 DNA 단편을 필수 구성 성분으로서 포함하고 있으면 좋고, 다른 성분으로서 표지제, PCR법에 필수적인 시약(예를 들면, TaqDNA 폴리메라제, 데옥시뉴클레오티드 3인산, 프라이머 등)이 포함되어 있어도 좋다.

표지제로서는 방사성 동위원소 또는 형광물질 등의 화학 수식물질 등을 들 수 있고, DNA 단편 자체가 미리 이 표지제로 콘주게이트되어 있어도 좋다. 더욱이, 당해 시약 킷트에는 측정의 실시의 편익을 위해 적당한 반응 희석액, 표준항체, 완충액, 세정제, 반응 정지액 등이 포함되어 있어도 좋다.

또한, 본 발명은 상기 측정 방법을 이용하는 당대사 장해, 특히 헥소사민 생합성 장해의 진단 방법 및 이 방법으로 이용하는 진단제 및 진단용 킷트도 제공하는 것이다.

또한, 상기 방법을 이용함으로써 피검 시료 중에서 얻어진 GFAT1L 배열을 직접적 또는 간접적으로 배열 결정함으로써 야생형 GFAT1L과 상동성이 높은 상동물인 새로운 GFAT1L 유전자에 관련하는 관련 유전자를 찾아낼 수가 있다.

따라서, 본 발명은 이러한 측정과 피검시료중의 GFAT1L DNA의 배열 결정에 의해, 피검시료중의 사람 GFAT1L 유전자에 관련하는 관련 유전자의 스크리닝 방법도 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 배열 번호: 1로 표시되는 사람 GFAT1L 유전자로 코드되는 폴리펩티드, 또는 이 배열 번호: 1에서, 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열, 또는 이들의 단편으로부터 폴리펩티드를 합성하거나, 또는 이 폴리펩티드에 대한 항체를 합성함으로써 야생형 GFAT1L 및/또는 변이 GFAT1L의 측정이 가능해진다.

따라서, 본 발명은 야생형 GFAT1L 및/또는 변이 GFAT1L의 항체 측정법, 항원 측정법을 제공하는 것이다. 이 측정법에 의해 GFAT 활성의 정도, 혈당 조절 장해의 정도, 헥소사민 생합성 경로의 기능 장애의 정도 또는 당뇨병의 중증도, 당뇨병성 노이로제, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신부전 등의 당뇨병 합병증의 정도를 야생성형 GFAT1L 폴리펩티드의 변화에 의해 검출하는 것도 가능하다. 이러한 변화는 이 분야에 있어서의 상기 관용 기술에 의한 GFAT1L 배열 분석에 의해도 결정될 수 있지만, 더욱이 바람직하기로는 항체 (폴리클로날 또는 단일 클론항체)를 이용하여 GFAT1L 폴리펩티드중의 다름, 또는 GFAT1L 폴리펩티드의 유무를 검출할 수가 있다. 본 발명의 측정법의 구체적인 예로서는 GFAT1L 항체는 혈액·혈청 등의 사람으로부터 채취한 생체 재료 시료 함유 용액으로부터 GFAT1L 단백질을 면역 침강하고, 폴리아크릴로아미드 겔의 웨스턴 플롯 또는 이뮤노 플롯상에서 GFAT1L 폴리펩티드와 반응할 수가 있다. 또한, GFAT1L 항체는 면역 조직화학적 기술을 이용하여 파라핀 또는 동결 조직 절편중의 GFAT1L 폴리펩티드를 검출할 수가 있다. 항체 생산 기술 및 정제하는 기술은 당해 분야에서 잘 알려져 있으므로, 이들 기술을 적당히 선택할 수가 있다.

야생형 GFAT1L 또는 그의 돌연변이체를 검출하는 방법에 관련하는 보다 바람직한 구체적인 예로서는 단일 클론 항체 및/또는 폴리클로날 항체를 이용하는 샌드위치법을 포함한, 효소 결합 이뮤노소르벤트앗세이(ELISA), 방사선 면역검정법(RIA), 면역 방사선 검정법(IRMA) 및 면역 효소법(IEMA)을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 GFAT 활성을 저해하는 약제의 후보 화합물을 스크리닝 방법에 있어서, 예를 들면, GFAT1L 유전자 발현 생산물 또는 GFAT1L 단백질 (이하, GFAT1L 단백질이라 합하여 칭한다) 또는 이들 단편에 대한 항체와 후보 화합물을 포함한 피검액 및 표지화된 GFAT1L 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드를 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합한 표지화된 GFAT1L 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 GFAT1L 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드를 정량하는 스크리닝 방법도 가능하다.

또한, 후보 화합물을 포함한 피검액과 담체상에 불용화한 상기 항체 및 표지화된 다른 GFAT1L 단백질에 대한 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 GFAT1L 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드의 정량법도 가능하다.

더욱이, GFAT1L 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드에 기질을 접촉시켰을 경우와 GFAT1L 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드에 기질 및 시험 화합물을 접촉시켰을 경우에 있어서의, GFAT1L 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드의 효소활성을 측정하여 비교함으로써 GFAT1L 단백질의 효소활성 (예, GFAT 활성)을 저해하는 화합물을 스크리닝하는 것도 가능하다.

상기에 있어서, 기질로서는 본 발명 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드의 기질로 될 수 있는 것이면 어느 쪽의 것이어도 좋고, 통상, 프락토오스-6-인산 및 글루타민이 이용된다. 프락토오스-6-인산으로서는 방사선 표지(예, 14C, 3H등)한 프락토오스-6-인산 등을 이용하는 것이 매우 적합하다. 시험 화합물로서는 예를 들면, 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액, 혈액 등을 들 수 있으며, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 괜찮고, 공지의 화합물이어도 좋다.

상기의 스크리닝 방법을 실시하기 위하여는 본 발명 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드를 스크리닝에 적절한 완충액에 현탁시켜 이들의 표품을 조제한다. 완충액은 pH 약 4∼10 (바람직하기로는 pH 약 6∼8)의 인산완충액, 트리스- 염산 완충액 등의, 본 발명 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드와 기질과의 결합을 저해하지 않는 것이면 어느 것이어도 좋다.

본 발명 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드의 GFAT 활성은 공지의 방법, 예를 들면 마셜 등의 방법(Journal of Biological Chemistry, vol. 266, No. 8, 4706-4712, (1991))에 준하여 측정할 수 있다.

이 방법은 예를 들면, 96 웰 마이크로플레이트상에 200㎕의 기질 용액(400 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5), 50mM 염화칼륨, 1.25mM EDTA, 0.3mM APAD, 6 U/㎖(GDH), 0-6 mM 글루타민, 0-6 mM 프락토오스-6-인산(F-6-P))에 적당히 희석한 GFAT1L의 대장균 용해질 50㎕를 가하고, 37℃에서 60분간 반응시키고, 이 때의 365nm의 흡광도의 변화를 마이크로플레이트 리이더에 의해 측정함으로써 실시할 수가 있다. 상기 GFAT활성의 측정은 GFAT에 의해 생성된 글루타메이트 (Glutamate)를 다시 글루타메이트 탈수소효소(Glutamate deydrogenase: GDH)와 반응시키고, 그 때 동시에 야기되는 보효소인 APAD가 APADH로 환원되는 반응에 수반되는 흡광도의 변화를 GFAT 활성으로서 나타내는 방법이다.

또한, 별법으로서는 예를 들면 스미스 등의 방법[Analytical Biochemistry, 98, 478-480 (1979)]를 들 수가 있다. 이 방법은 예를 들면, 다음과 같이 하여 실시된다. 즉, 우선 12μM 프락토오스-6-인산, 5μM 글루타민 및 0.2M 인산완충액(pH 8.0)으로 이루어진 혼합액에 본 발명 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드를 첨가하고, 얻어지는 용액을 25℃에서 30분간 보온한다. 이 용액에 0.5M 염산을 가하고, 98℃에서 2시간 반응시킨 후, 2.5% NaNO₂와 12.5% NH₄O₃SNH₂를 첨가하고, 다시 0.25% 2-메틸-2-벤조티아졸론을 첨가한다. 다음에, 0.5% FeCl₃를 가하고, 그 용액을 650nm에서 흡광도를 측정하고, 생성되는 글루코사민-6-인산을 정량한다.

상기 각 방법에 있어서, 의약 후보 화합물의 선택 방법은 예를 들면, 각 시험에 있어서 상기 시험 화합물이 첨가되어 있지 않은 경우에 있어서의 GFAT 활성이 상기 시험 화합물이 첨가되고 있는 경우에 비해, 약 20% 이상, 바람직하기로는 약 30% 이상, 보다 바람직하기로는 약 50% 이상 저해되어 있는 경우, 이 시험 화합물을 본 발명 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드의 GFAT 활성을 저해하는 화합물로서 선택할 수가 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 GFAT 활성을 저해하는 약제의 후보 화합물을 스크리닝용 킷트를 제공할 수 있다.

본 발명의 스크리닝용 킷트는 원가요소의 하나로서 본 발명의 단백질 또는 GFAT1L 단백질의 부분 펩티드를 함유하는 것이다. 본 발명의 스크리닝용 킷트의 구체적인 예를 이하에 예시한다.

1. 스크리닝용 킷트 I

[스크리닝용 시약]

1) GFAT1L 표품: 50㎕ 본 발명의 GFAT1L 대장균 용해질(GFAT1L 단백질의 부분 펩티드)

2) 보효소 함유 측정용 완충액: 400 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5), 50mM 염화칼륨, 1.25mM EDTA, 0.3mM APAD, 6U/㎖(GDH)

3) 기질: 0-6 mM 프락토오스-6-인산, 0-6 mM 글루타민 검출은 365nm에서의 흡광도를 측정한다.

[측정법] 96 웰 마이크로 플레이트상에 200㎕의 기질용액 (400mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5), 50mM 염화 칼륨, 1.25mM EDTA, 0.3mM APAD, 6 U/㎖ (GDH), 0-6mM 글루타민, 0-6mM 프락토오스-6-인산 (F-6-P)에 적당히 희석한 GFAT1L의 대장균 용해질 50㎕를 가하고, 37℃에서 60분간 반응시킨다. 이 때의 365nm의 흡광도의 변화를 마이크로플레이트 리더에 의해 측정한다.

2. 스크리닝용 킷트 II

[스크리닝용 시약]

1) 단백질 표품: 본 발명의 단백질(GFAT1L 단백질의 부분 펩티드) 또는 그 염

2) 측정용 완충액: 0.2M 인산완충액(pH 8.0)

3) 기질: 12μM 프락토오스-6-인산, 5μM 글루타민 검출은 650nm에서의 흡광도를 측정한다.

[측정법] 12μM 프락토오스 6-인산, 5μM 글루타민, 본 발명의 단백질 또는 그의 염 및 0.2M 인산완충액(pH 8.0)으로 이루어진 반응액에 시험 화합물을 첨가한 후, 25℃에서 30분간 보온한다. 여기에 0.5M 염산을 가하고, 98℃에서 2시간 가수분해한다. 2.5% NaNO₂와 12.5% NH₄O₃SNH₂를 첨가하고, 이어서 0.25% 2-메틸-2-벤조티아졸론을 첨가한다. 다음에, 0.5% FeCl₃를 첨가한 후, 650nm에서 흡광도를 측정한다.

또한, 본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 킷트를 이용하여 얻어지는 화합물 또는 그의 염은 상기 시험 화합물(예를 들면, 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 등)로부터 선택된 화합물이고, 본 발명의 단백질(GFAT1L 단백질의 부분 펩티드)의 효소활성(예, GFAT 활성)을 저해하는 화합물이다. 이 화합물은 신규 화합물이어도 좋고, 공지 화합물이어도 좋다. 또한, 저혈당 개선용 후보 화합물로서는 본 발명의 단백질 (GFAT1L 단백질의 부분 펩티드의 효소활성(예, GFAT 활성)을 촉진하는 화합물이다.

이 화합물의 염으로서는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산, 유기산)이나 염기(예, 알칼리 금속) 등과의 염을 들 수 있고, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로서는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산)과의 염, 또는 유기산 (예를 들면, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸말산, 말레인산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산)과의 염 등을 들 수 있다.

본 발명의 단백질(GFAT1L 단백질의 부분 펩티드를 포함한다, 이하 같다)의 효소활성을 저해하는 화합물 또는 그 염은 예를 들면, 당뇨병 및 당뇨병 합병증 등의 질환에 대한 치료제 또는 예방제의 의약으로서 유용하다.

본 발명의 단백질의 효소활성을 촉진하는 화합물 또는 그 염은 예를 들면, 저혈당증 및 저혈당에 의한 합병증 등의 질환에 대한 치료제 또는 예방제의 의약으로서 유용하다.

또한, 본 발명에 의하면, 보다 활성 또는 안정된 형태의 GFAT1L 단백질의 유도체 또는 예를 들면, 인 비보 (in vivo)로 GFAT1L 단백질의 기능을 높이던가, 또는 방해하는 약제를 개발하기 위해서, 그것들이 상호 작용하는 목적의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 구조 아날로그, 예를 들면 GFAT1L 아고니스트, GFAT1L 안타고니스트, GFAT1L 인히비터 등을 제작하는 것이 가능하다. 상기 구조 아날로그는 예를 들면, GFAT1L과 다른 단백질의 복합체의 삼차원 구조를 X선결정학, 컴퓨터 모델링 또는 이들을 조합한 방법에 의해 결정할 수가 있다. 또한, 구조 아날로그의 구조에 관한 정보는 상동성 단백질의 구조에 의해 단백질의 모델링에 의해 얻는 것도 가능하다.

또한, 상기에서 활성 또는 안정된 형태의 GFAT1L 단백질의 유도체를 얻는 방법으로서는 예를 들면, 알라닌 스캔에 의한 분석 방법을 들 수 있다. 이 방법은 있는 아미노산 잔기를 Ala으로 치환하고, 펩티드의 활성에 대한 그의 영향을 측정하는 방법으로 펩티드의 각 아미노산 잔기를 이와 같이 분석하고, 당해 펩티드의 활성이나 안정성에 중요한 영역을 결정하는 방법이다. 이 방법에 의해, 보다 활성인, 또는 안정한 GFAT1L 단백질의 유도체를 설계할 수가 있다.

또한, 기능성 앗세이에 의해 선택한 표적-특이적 항체를 분리하고, 이어서, 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 원칙적으로, 이 접근 방법에 의해, 계속 약제의 설계의 기본이 되는 파르마코아(pharmacore)를 얻는다. 기능성의 약리학적으로 활성인 항체에 대한 항이디오타입(anti-idiotype) 항체를 생성시킴으로서 화학적 또는 생물학적으로 생성한 펩티드의 뱅크로부터 펩티드를 분류하거나, 분리하는 것이 가능하다. 따라서, 선택된 펩티드도 파르마코아로서 작용한다고 예측된다.

이와 같이 하여 개선된 GFAT1L 활성 또는 안정성 또는 GFAT1L 활성의 인히비터, 아고니스트, 안타고니스트 등으로서의 작용을 가지는 약제를 설계 개발할 수가 있다.

클론화 GFAT1L 배열에 의해, 충분한 양의 GFAT1L 단백질을 입수하여 X 선 결정학과 같은 분석연구도 실시할 수가 있다. 또한, 본 발명의 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 되는 GFAT1L 단백질의 제공에 의해, X선 결정학으로 대체하던가, 또는 이것에 더하여, 컴퓨터 모델링 기술에 적응 가능하다.

또한 본 발명에 의하면, GFAT1L-유전자-녹아웃 마우스나 GFAT1L-유전자-노크 인 마우스 (변이 마우스)를 작성함으로써 GFAT1L 유전자 배열의 어느 부위가 생체내에서 상술한 것 같은 다양한 GFAT1L 활성에 영향을 주는 지의 여부, 즉, GFAT1L유전자 생산물 및 개변 GFAT1L 유전자 생산물이 생체내에서 어떠한 기능을 가지는지를 확인할 수가 있다.

이 방법은 유전자의 상동 재조합을 이용하여 생물의 유전 정보를 의도적으로 수식 기술이고, 마우스의 배성 간세포(胚性幹細胞: ES 세포)를 이용한 방법을 들 수 있다(Capeccchi, M. R., Science. 244, 1288-1292 (1989)).

또한, 상기 변이 마우스의 제작 방법은 이 분야의 당업자에게 이미 통상의 기술이며, 이 개변 기술(野田哲生편, "Jikken Igaku", 증간, 14 (20) (1996), 羊土社)에, 사람 야성형 GFAT1L 유전자 및 변이 GFAT1L 유전자를 적응하여 용이하게 변이 마우스를 제작할 수 있다. 따라서 상기 기술의 적응에 의해, 개선된 GFAT1L 활성 또는 안정성 또는 GFAT1L 활성의 인히비터, 아고니스트, 안타고니스트 등으로 서의 작용을 가지는 약제를 설계 개발할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 더 상세하게 설명하기 위해, 실시예를 든다.

실시예 1

GFAT1L의 클로닝과 발현 벡터의 구축

우선, 맥나이트 등의 공지의 사람 GFAT(G. L. McKnight et. al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992))의 발현 벡터의 구축을 위해서, 사람 GFAT의 cDNA 배열을 기초로 하여 4개의 프라이머 P1∼P4를 합성했다. 이들의 염기배열은 각각 배열 번호: 3-6에 나타낸 바와 같다.

P1은 배열 번호: 2의 34-66번째의 뉴클레오티드 배열에 상당한다. P2는 동 배열 번호: 2의 16-48번째의 뉴클레오티드 배열에 상당한다. P3은 동배열 번호:2의 1-30번째의 뉴클레오티드 배열에 상당한다. 또한 P4는 동배열 번호: 2의 2077-2097번째의 뉴클레오티드 배열에 상당한다. P1-P3은 각각 포워드 프라이머이고, 대장균에 있어서 발현 효율을 위해 대장균의 코돈 이용도를 고려하여 이하의 부분에 변이를 부여한 것이다.

P1: 배열 번호: 3의 6, 9, 12, 13, 15, 18번째의 뉴클레오티드

P2: 배열 번호: 4의 7, 9, 18, 24, 27, 30, 31, 33번째의 뉴클레오티드

P3: 배열 번호: 5의 22, 32, 34번째의 뉴클레오티드

P3에서의 배열 번호: 5의 1-10번째의 뉴클레오티드 배열은 pET 벡터에 삽입할 때에 필요한 NdeI 사이트(CATATG)를 도입하기 위해서 부가한 배열이다.

또한, P4는 리버스 프라이머이고, C말단 아미노산의 다음에 XhoI 사이트 (CTCGAG, 배열 번호: 6의 1-11번째의 뉴클레오티드 배열 참조)를 포함한 배열이다. 이 XhoI 사이트의 직전에는 종지 코돈(TAA)이 삽입되도록 설계되었다.

이하의 방법으로 상기 4개의 프라이머를 사용하여, N 말단 아미노산이 대장균에서 합성하여 저렴한 코돈으로 치환된 벡터가 구축될 수 있다.

이어서, 클론텍사(Clontech Co., Ltd.)로부터 구입한 사람 골격근 mRNA를 기초로 하여 프라이머- 4로 역전사 효소를 이용하여 역전사 반응을 일으켰다. 사람 골격근 mRNA 2㎍/㎕를 100℃에서 5 분간으로 변성시킨 후, 얼음 중에서 급냉시켰다. 최종적으로 50mM 트리스 염산(pH 8.3), 40mM 염화칼륨, 6mM 염화 마그네슘, 1mM DTT, 0.1mM의 프라이머 4, 0.1mg BSA 및 400단위/2㎕의 MMLV 역전사진 효소(GIBCO BRL 사제)와 탈이온수(DDW)를 가하여 50㎕로 하고, 37℃에서 10분간 반응시켰다.

상기 반응물 5㎕를 100℃에서 5분간으로 변성시킨 후, 프라이머 P1 및 P4를 사용하여 PCR반응을 행했다. PCR 반응은 5㎕의 역전사진 반응물과 5㎕의 10×완충액(1.2mM 트리스 염산(pH 8.0), 100mM 염화칼륨, 60mM 황산암모늄, 1% 트리톤 X-100, 0.1mg/㎖ BSA), 5㎕의 2mM dNTPs 혼합물, 0.4μM의 각 프라이머, 1mM의 염화마그네슘, 2.5 단위의 KOD 데쉬(dash) 및 DDW를 가하고, 총량 50㎕로 하고, 95℃에서 30초, 65℃에서 2초, 74℃에서 60초를 30사이클 행하고, 다시 74℃에서 5분간 반응시켰다.

상기에서 얻어진 5㎕의 반응산물에 대하여 동일한 PCR 조건에서 프라이머를 P2 및 P4 로 바꾸어 PCR반응을 행했다.

더욱이, 그의 반응 생산물의 5㎕에 대해서 같은 PCR 조건에서 프라이머 P3 및 P4에서 PCR반응을 행했다.

최종 반응물은 pET23b 벡터(Novagen 사제)로 클로닝하고, ABI377DNA 시퀀서(PE-ABI 사제)로 DNA 배열을 확인했다.

이어서, 최종 반응물은 페놀/클로로포름으로 처리하고, 에탄올 침전을 행하고, TE 완충액에 녹인 후, 제한효소 NdeI와 XhoI에서 DNA의 양단을 절단했다.

이 DNA 단편을 제한효소 NdeI와 XhoI로 절단한 pET23b 벡터에 라이게이션에 의해 삽입했다.

이렇게 하여 염기배열 결정에 의해 신규 배열의 유전자를 얻고, 이것을 "GFAT1L 유전자"라 명명했다.

얻어진 유전자는 그의 코드 영역의 전체 길이가 배열 번호: 2로 표시되는 2097염기로 이루어지고, 이 염기배열에 의해 코드되는 아미노산 배열은 배열 번호: 1로 표시되는 699아미노산 배열로 되어 있다. 이것은 이 아미노산 배열을 코드하는 사람 cDNA(전체 길이 2097염기)이었다.

본 발명 유전자 GFAT1L은 맥나이트 등에 의해 클로닝된 사람 GFAT 유전자(McKnight, G. L., et. al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992))의 684번째와 685번째의 염기의 사이에, 54개의 염기가 삽입된 신규 유전자인 것이 확인되었다. 따라서, 유전자 배열에서 코드되는 단백질의 아미노산 배열은 228번째와 229번째의 사이에 18개의 아미노산 배열이 삽입된 구조물인 것이 판명되었다.

이하에 계속되는 시험에서는 본 발명자들이 분리한 신규 유전자를 "GFAT1L 유전자"라고 부르며, 맥나이트 등의 사람 GFAT 유전자를 "GFATlS 유전자"라고 부른다.

실시예 2

RT-PCR법에 의해, 각 장기에서의 GFAT1L 유전자의 발현 패턴을, G FAT1S 유전자의 그것과 대비해, 검색했다.

샘플로서는 클론텍사의 퀵 클론 cDNA(QUICK-Clone cDNA, 심장, 뇌, 간장, 골격근, 소장, 신장, 췌장, 지방)을 이용했다.

프라이머로서는 배열 번호: 7 및 8로 표시되는 염기배열을 합성하여 사용하고, 다시 ExTaq (Takara 주조사)를 사용했다.

PCR 반응은 95℃에서 1분 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 45 초를 1 사이클로서 40 사이클 반복했다. 유전자 발현 패턴의 검색은 반응 생산물의 일부를 4% 아가로스 겔 전기영동에 걸어 각 유전자의 발현 패턴을 얻었다.

결과를 도 1에 나타낸다.

도에 있어서의 각 레인은 다음과 같다.

Marker (마커), Heart(심장), Brain(뇌), Liver(간장), Skeltal Muscle(골격근), Kidney(신장), Pancreas(췌장), Small Intestine(소장) 및 Fat(지방).

도 1로부터 GFAT1L 유전자는 심장 및 골격근에 강한 발현이 보이며, 뇌에서도 매우 약한 발현이 확인되었다. 시험한 다른 장기에서는 GFAT1S 유전자만의 발현이 확인되었다.

이것으로부터, 본 발명의 유전자의 발현은 장기 특이적으로 제어되고 있는 것이 판명되었다.

실시예 3

GFAT1L 재조합 단백질의 조제

사람 GFAT1L 유전자 (대비를 위해 GFAT1S 유전자)의 각각을 pET23b 벡터(Novagen)에 끼워 넣고, 이 벡터를 이용하여 BL21-Codon Plus(DE3)RIL (Stratgene)을 형질 전환하고, 얻어진 형질전환체를 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 3℃ 하룻밤 배양했다. 다음날, 50㎖의 배양액을 1ℓ의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에 가하고, 다시 37℃에서 배양했다. 90분후, 2㎖의 1M 이소프로필 β-D-(-) 티오갈락토피라노시드 (IPTG: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 가하고, 20℃에서 밤새 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도했다.

배양액을 7000rpm로 5분간 원심하여 대장균을 회수하고, 50㎖의 0℃로 냉각한 둘베코의 PBS(-)(Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.)로 l 회 세정했다. 이어서, 5mM 디티오쓰레이톨(DIT), 20% 글리세린을 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액 (pH 8.0)을 전량이 40㎖ 가 되도록 가하여 현탁한 후, 초음파 처리하여 균체를 파쇄 했다. 이 파쇄액을 초원심(30,000rpm, 30분, 4℃)하여 불용성 성분을 제거했다.

이와 같이 하여 소망의 재조합 단백질을 함유하는 상청을 얻었다. 얻어진 상청은 1㎖씩 분주하고, 액체 질소로 급속 동결한 후에 -80℃에서 사용시까지 보존했다.

실시예 4

GFAT1L과 GFAT1S의 특징적인 차이의 검토

1. GFAT 활성 측정방법

GFAT 활성의 측정은 마셜(Marshall) 등에 준하여 96 웰 마이크로플레이트를 이용한 분광 광도계법에서 행했다(Journal of Biological Chemistry. vol. 266, No. 8. 4706-4712, (1991)). 이 측정 방법에서는 GFAT에 의해 생성된 글루타메이트 (Glutamate)를 다시 글루타메이트 탈수소효소(Glutamate deydrogenase: GDH)와반응시키고, 그 때 동시에 일어나는 보효소인 APAD가 APADH로 환원되는 반응에 수반되는 흡광도의 변화를 GFAT 활성으로서 나타냈다.

즉, 200㎕의 기질 용액(40mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5), 50mM 염화칼륨, 1.25mM EDTA, 0.3mM APAD, 6 U/㎖ (GDH), 0-6mM 글루타민, 0-6mM 프락토오스-6-인산(F-6-P))에 적당히 희석한 GFAT1L 또는 GFAT1S의 대장균 용해질 50㎕를 가하고, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이 때의 365nm의 흡광도의 변화를 마이크로플레이트 리이더에 의해 측정했다.

2. GFAT1L과 GFAT1S의 효소학적 상위

GFAT1L과 GFAT1S의 사이의 효소학적인 상위를 검토하기 위해, 기질로서 글루타민 및 F-6-P의 각각을 이용하여 Km치를 구했다. Km치는 효소의 기질 농도 (5) 및 효소활성(반응속도(v))의 값을 기초로 하여 작성한 S/v∼s 및 v∼v/s 플롯으로부터 산출했다. 또한, 그의 산출은 S/v∼s의 플롯에서는 그래프의 X축과 플롯하여 얻어진 직선의 교점(교점= -Km치)으로부터, v∼v/s 플롯에서는 직선의 기울기(기울기= -Km치)로부터 구했다.

더욱이, UDP-N-아세틸글루코사민(UDP-GlcNAc)이 GFAT 활성을 저해하는 것이 보고되고 있는 것으로부터(Journal of Biological Chemistry vol. 241, 1705-1712 (1966)), 이 저해 양식에 대해서도 검토했다. 이 저해 양식은 동일한 플롯팅을 행하고, 얻어진 직선의 형식으로부터 구했다.

그 결과를 도 2, 도 3 및 표 1에 나타낸다.

도 2는 F-6-P를 기질로 했을 경우의 GFAT1S 및 GFAT1L에서의 UDP-GlcNAc의GFAT 활성 저해양식을 나타내는 그래프이며, 세로축은 효소의 반응속도(v)를, 횡축은 반응속도(v)/효소의 기질농도(s)를 나타낸다.

도 2의 왼쪽의 그래프가 GFAT1S의 결과이고, 오른쪽 그래프가 GFAT1L의 결과를 나타내고 있다. 각 도에 있어서, (1)은 UDP-GlcNAc 없는 경우를, (2)는 UDP-GlcNAc 30μM 첨가의 경우를, (3)는 UDP-GlcNAc 100μM 첨가의 경우를 각각 나타낸다.

이 도로부터 구된 Km치는 GFAT1S 및 GFAT1L에 있어서, 각각 90μM 및 478μM이고, 또한 GFAT 활성 저해 양식은 각각 "길항 저해" 및 "혼합 저해"를 나타내는 것이 분명해졌다.

도 3은 글루타민을 기질로 했을 경우의 GFAT1S 및 GFAT1L에 있어서의 UDP-GlcNAc의 GFAT 활성저해 양식을 나타내는 그래프이고, 세로축은 효소의 반응속도(v)를, 횡축은 반응속도(v)/효소의 기질농도(s)를 나타낸다.

도 3의 왼쪽의 그래프가 GFAT1S의 결과이고, 오른쪽 그래프가 GFAT1L의 결과를 나타내고 있다. 각 도에 있어서, (1)은 UDP-GlcNAc 없음의 경우를, (2)는 UDP-GlcNAc 10μM 첨가의 경우를, (3)은 UDP-GlcNac 30μM 첨가의 경우를, 또한, UDP-GlcNAc 100μM 첨가의 경우를 각각 나타낸다.

이 도로부터 구한 Km치는 GFAT1S 및 GFAT1L에 있어서, 각각 822μM 및 804μM이고, 또한 GFAT 활성저해 양식은 각각 "불길항 저해" 및 "혼합 저해"를 나타내는 것이 분명해졌다.

표 1

	GFAT1S	GFAT1L
Km치(㎛)	F-6-P글루타민	78~118761~822	458~478804~812
저해양식	F-6-P글루타민	길항 저해불길항 저해	혼합 저해혼합 저해

도 2, 도 3 및 표 1로부터, GFAT1L 및 GFAT1S의 Km치에 대해서는 F-6-P에 대해서는 GFAT1S가 100μM, GFAT1L이 500μM 정도와 양자에서 큰 차이가 확인되었다. 한편, 글루타민에 대해서는 GFAT1S와 GFAT1L 함께 800μM 전후이며, 양자에 차이는 인정되지 않았다.

UDP-GlcNAc의 저해 양식에 대해서는 F-6-P를 기질로 했을 경우, GFAT1S 에서는 길항저해, GFAT1L에서는 비길항 및 길항저해가 혼재한 혼합저해 양식을 나타냈다. 또한, 글루타민을 기질로 했을 경우, GFAT1S에서는 불길항저해, GFAT1L 에 대해 불길항 및 그 외의 저해 양식을 포함한 혼합 저해 양식을 나타냈다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 GFAT1L과 사람 GFAT의 효소학적인 차이로서, (1) F-6-P 에 대한 Km치는 본 발명의 GFAT1L이 사람 GFAT보다 5 배정도 높으며, (2) UDP-GlcNAc의 저해 양식이 다른 2가지 점이 인정되었다.

3. 인슐린 저항성에 있어서의 GFAT1L의 효과에 대한 검토

GFAT가 인슐린 저항성에 관여하고 있는 것은 인 비트로 및 인 비보 시험의 양자에서 보고되어 있다. 그러나, 본 발명자들에 의해 발견된 신규 유전자에 의해, GFAT에는 2개의 서브타입이 존재하는 것이 명백한 것으로부터, GFAT1L과 사람 GFAT(GFAT1S)의 어느 쪽이 보다 인슐린 저항성에 관여하고 있는지에 대해서, 이하와 같이 고찰했다.

정상인에서는 통상, 인슐린 자극시에는 혈중 글루코오스의 약 70%가 골격근으로 대사되는 것에 반해, 2형 당뇨병 환자에 있어서는 특히 골격근으로 글루코오스의 이용률이 30%까지 감소하고 있으며, 다른 장기에서는 그 이용률이 정상인으로 변하지 않음이 보고되어 있다(Journal of Clinical Investigation, 76(1), 149-155(1985)). 이것으로부터, 인슐린 저항성의 주요한 장기는 골격근인 것으로 생각된다. 이 골격근에서는 GFAT1S는 발현하고 있지 않고, 본 발명의 GFAT1L 만이 발현하고 있는 것이 명백해진 것으로부터, 인슐린 저항성에는 주로 본 발명의 GFAT1L이 관여하고 있는 것으로 고려된다.

또한, GFAT1S 및 GFAT1L의 효소학적 검토의 결과로부터,

(1) F-6-P에 대한 본 발명 GFAT1L의 Km치는 GFAT1S의 그것보다 5배정도 높다.

(2) 세포내의 글루타민은 4∼5mM 존재하기 때문에, GFAT 활성은 세포내의 F-6-P 농도로 규정된다.

(3) 기초 레벨에 있어서의 2형 당뇨병 환자의 적혈구중의 F-6-P 농도는 수십μM인 것으로 보고되어 있다(Horm. Metabol. Res., 14. 233-236 (1982))인 것 등을 고려해 볼 때 아래와 같은 것이 추측된다.

즉, 이 농도의 F-6-P에서 GFAT의 활성 상태를 추측하면, GFAT1S에서는 Km치 부근이며, 정상적으로 작용하고 있으나, GFAT1L에서는 거의 활성화되어 있지 않는 것으로 생각된다. 이것은 도 4로부터 명백하다.

도 4는 상기 결과로부터 GFAT1S 및 GFAT1L의 효소반응 곡선(GFAT의 활성화 상태)을 그래프화 한 것이고, 세로축은 효소의 반응속도(v)를, 횡축은 세포내의 F-6-P의 농도(μM)를 나타내고 있으며, 이 농도가 높을수록 세포내로 당의 유입량이 큰 것을 나타낸다. 또한, 도면 중, 굵은 선은 문헌에 보고되고 있는 비인슐린 의존형 당뇨병 환자의 적혈구중의 F-6-P 농도를 나타내며, 굵은 화살표는 인슐린 저항성에 관여하는 것을 나타내고 있다.

더욱이, 인슐린 자극시에는 세포내에의 글루코오스의 결합은 수배 증가하나, 이 경우, GFAT1S에서는 효소 반응이 Vmax에 달하기 때문에, 한층 더 글루코오스가 세포내에 유입해도 그 이상의 GFAT의 활성화는 일어나지 않는 것에 반해, 본 발명의 GFAT1L에서는 글루코오스의 유입량이 증가하면 할수록 GFAT가 활성화되어 대사물도 증가하고, 당 수송 담체의 세포막으로의 이행이 억제되어 혈당이 상승하는 것으로 고려된다(다만, GFAT1L 및 GFAT1S 함께 Vmax는 동일한 정도로 가정하고 있다) .

따라서, GFAT1S에 비해 본 발명의 GFAT1L이 보다 인슐린 저항성에 관여하고 있다고 생각된다. 이상의 것으로부터 인슐린 저항성에 본 발명의 GFAT1L의 관여가 크다고 결론지울 수 있다.

본 발명자들은 상기 과제로부터 연구를 중첩한 결과, 사람 골격근 cDNA 라이브러리로부터, GFAT 활성을 가지는 단백질을 코드하는 신규 염기배열의 cDNA의 클로닝에 성공하고, 사람 골격근 및 심장에 특이적으로 발현하는 소망의 유전자 및 단백질에 관한 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 의하면, 이하의 요지의 발명이 제공된다.

(1) 이하의 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자:

(a) 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로부터 되는 폴리펩티드를 코드폴리 뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄,

(b) 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대해서 적어도 98%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄,

(c) 상기 (a)의 아미노산 배열에 있어서 l 또는 여러 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 더욱이 GFAT 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄,

(d) 상기 (a)의 아미노산 배열과 98%이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄.

(2) 이하의 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유전자:

(a) 배열번호: 2로 표시되는 염기배열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보쇄,

(b) 상기 (a)의 염기배열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 높은 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드.

(3) 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열인 상기 (2)에 기재된 유전자.

(4) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 유전자를 발현시켜 얻을 수 있는 유전자 발현 생산물.

(5) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 유전자를 가지는 재조합체 발현 벡터.

(6) 상기 (5)에 기재된 재조합체 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포.

(7) 상기 (5)에 기재된 재조합체 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.

(8) 이하의 (a), (b) 또는 (c)의 단백질:

(a) 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 단백질,

(b) 상기 (a)의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 더욱이 GFAT 활성을 가지는 단백질,

(c) 상기 (a)의 아미노산 배열과 98% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열인가들 되는 단백질.

(9) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 유전자 또는 상기 (4)에 기재된 유전자 발현 생산물을 유효 성분으로서 함유하는 저혈당증의 치료 또는 예방용 조성물.

(10) 상기 (8)에 기재된 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 저혈당증의 치료는 예방용 조성물.

(11) 상기 (4)에 기재된 유전자 발현 생산물 및 상기 (8)에 기재된 단백질 및 이들의 단편으로부터 선택되는 어느 하나에 결합성을 가지는 항체, 특히 단일 클론 항체.

(12) 상기 (1)에 기재된 유전자 또는 상기 (4)에 기재된 유전자 발현 생산물 및 상기 (8)에 기재된 단백질의 효소활성을 저해하는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법으로, (i) 상기 (11)에 기재된 항체와 후보 화합물을 포함한 피검액 및 표지화된 상기 (8)에 기재된 단백질 또는 그 부분 펩티드를 경합적으로 반응시켜, 항체에 결합한 표지화된 단백질 또는 그 부분 펩티드의 비율을 측정하던가, (ii) 후보 화합물을 포함한 피검액과 담체상에 불용화한 상기 항체 및 표지화된 다른 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체의 표지제의 활성을 측정하던가, 또는 (iii) 상기 (8)에 기재된 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 기질을 접촉시킨 경우와 동일 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 기질 및 후보 화합물을 접촉시킨 경우에 있어서, 동일 단백질 또는 그의 부분 펩티드의 효소활성을 측정, 비교하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

(13) 상기 (12)에 기재된 후보 화합물의 스크리닝 방법으로 이용되는 스크리닝용 킷트에서, 측정용 완충액, 상기 (8)에 기재된 단백질 또는 그의 부분 펩티드 및 기질로서의 프락토오스-6-인산 및 글루타민을 킷트 성분으로서 함유하는 킷트.

또한, 본 발명에 의하면, 아래 요지의 발명도 제공된다.

(14) 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 유전자 또는 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유전자 (이하, 이들을 "GFAT1L 유전자"라고도 한다)의 유전자 발현 생산물 또는 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 단백질(이하, 이들을 "GFAT1L 단백질"이라고도 한다) 또는 이 GFAT1L 단백질의 단편 (부분 펩티드)에 대한 항체와 피검액 및 표지화된 GFAT1L 단백질 또는 그 단편을 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합한 표지화된 GFAT1L 단백질 또는 그 단편의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 GFAT1L 단백질 또는 그 단편의 정량법.

(15) 피검액과 담체상에 불용화한 상기 (14)에 기재된 항체 및 표지화된 다른 GFAT1L 단백질에 대한 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 본 발명 단백질 또는 그 단편의 정량법.

(16) GFAT1L 단백질에 대한 항체 (바람직하기로는 GFAT1L 단백질의 활성을 중화하는 활성을 가지는 GFAT1L 단백질에 대한 항체)를 함유하여서 되는 의약, 특히 당뇨병의 치료 및 예방제인 의약.

(17) GFAT1L 단백질 또는 그 단편에 기질을 접촉시켰을 경우와 GFAT1L 단백질 또는 그의 단편에 기질 및 시험 화합물을 접촉시켰을 경우와에 있어서의, GFAT1L 단백질 또는 그 단편의 효소활성을 측정, 비교하는 것을 특징으로 하는 GFAT 효소활성을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법.

더욱이 본 발명에 의하면, 아래 요지의 발명도 제공된다.

(18) GFAT1L 유전자의 DNA에 상보적 또는 실질적으로 상보적인 염기배열을 가지며, 이 DNA의 발현을 억제할 수 있는 작용을 가지는 안티센스 DNA .

(19) GFAT1L 유전자의 DNA에 실질적으로 상보적인 염기배열이, 이 DNA에 상보적인 염기배열의 전 염기 배열이던가 또는 부분 염기배열과 약 98%이상(바람직하기로는 약 99% 이상)의 상동성을 가지는 염기배열인 GFAT1L 유전자의 안티센스 DNA .

(20) GFAT1L 유전자의 안티센스 DNA를 함유하여서 되는 의약 조성물, 특히 당뇨병의 치료 및 예방제인 의약 조성물.

본 명세서에 있어서의 아미노산, 펩티드, 염기배열, 핵산 등의 약호에 의한 표시는 IUPAC-IUB의 규정[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature. Eur. J. Biochem., 138: 9 (]984)], "염기배열 또는 아미노산 배열을 포함한 명세서 등의 작성을 위한 가이드 라인"(특허청편) 및 해당 분야에 있어서의 관용 기호에 따르는 것으로 한다.

본 발명에 의하면, 사람 GFAT와 상동성을 가지는 신규 사람 단백 상동물을 코드하는 GFAT1L유전자가 제공된다.

본 발명의 유전자는 당대사에 중요한 조직인 골격근 및 심장에 있어서 그 발현이 높고, 이들 조직 및 그 주변 조직에 있어서의 GFAT활성 또는 당분해계(glycolysis system)에 있어서의 헥소사민 생합성 경로를 촉진하여 당수송 담체의 세포막으로의 이행성을 억제한다고 생각된다. 따라서, 당대사에 있어서의 혈당 조절에 대해서 상승적으로 작용하는 것이 고려되는 것으로부터, 본 발명 유전자의 발현량이나 GFAT 활성 등의 해석에 의해, 관련 유전자의 기능과 당대사 관련 질환과의 관계에 대한 연구에 이용될 수 있으며, 특히 저혈당 또는 당뇨병 환자의 유전자 진단 및 이 유전자의 발현 생산물에 대한 항체나 안티센스에 의한 의약 용도로의 응용 연구에 이용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명 유전자의 이용에 의하면, 각종 조직에서의 이 유전자의 발현 상황이 조사되고, 생체내에서의 그의 기능을 해석하는 것이 가능해진다.

또한, 이 유전자에 의하면, 이 유전자가 코드하는 GFAT1L 단백질을 유전자 공학적으로 대량으로 제조할 수가 있으며, 이 단백질의 제공에 의해 GFAT1L 활성이나 GFAT1L 단백질의 결합 활성 등의 기능을 조사할 수도 있다.

또한, 본 발명 단백질은 GFAT1L 유전자 및 그의 생산물이 관여하는 질환 (예를 들면, GFAT 활성 또는 당 분해계에 있어서의 헥소사민 생합성 경로의 조절에 관련하는 질환 또는 저혈당, 혈당 조절에 관련하는 질환 등, 특히 저혈당증의 치료, 또는 당뇨병이나 당뇨병성 신부전, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 노이로제 등의 당뇨병성 합병증)의 병태 해명이나 진단, 치료 등에 유용하다.

본 발명에 의하면, 더욱이 본 발명 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 유전자 치료에 유용한 유전자 도입용 벡터, 이 GFAT1L 유전자의 안치센스 올리고뉴클레오티드가 도입된 세포 및 이 벡터 또는 세포를 유효성분으로 하는 유전자 치료제 및 그의 이용에 의한 유전자 치료법 등이 제공된다.

본 발명에 의하면, 더욱이 골격근, 특히 골격근의 평활 세포에 있어서의 GFATmRNA의 발현의 억제 작용을 가지며, 이 작용에 의한 당뇨병 및 당뇨병 합병증 등의 질환 및, 병태의 처치 등에 사용되는 본 발명 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 GFAT1L에 결합성을 가지는 항체 또는 그의 단편을 유효성분으로 하는 의약도 제공할 수가 있다.

또한, 본 발명에 의하면, GFAT1L 단백질, GFAT1L 유전자 발현 생산물의 효소활성을 저해하는 당뇨병의 치료를 위한 후보 화합물의 스크리닝 방법 및 스크리닝용 킷트도 제공할 수가 있다.

Claims (13)

1. 아래의 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자:

   (a) 배열번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄,

   (b) 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대해서 적어도 98%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄,

   (c) 상기 (a)의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 GFAT 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄,

   (d) 상기 (a)의 아미노산 배열과 98%이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어진 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보쇄.
2. 아래의 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유전자:

   (a) 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보쇄,

   (b) 상기 (a)의 염기배열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 높은 스트린젠트인 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드.
3. 제 2항에 있어서, 배열 번호: 2로 표시되는 염기배열인 유전자.
4. 청구항 1 또는 2에 기재된 유전자를 발현시켜 얻어지는 유전자 발현 생산물.
5. 청구항 1 또는 2에 기재된 유전자를 가지는 재조합체 발현 벡터.
6. 청구항 5에 기재된 재조합체 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포.
7. 청구항 5에 기재된 재조합체 발현 벡터로 형질전환된 형질 전환체.
8. 아래의 (a), (b) 또는 (c)의 GFAT1L 단백질:

   (a) 배열 번호: 1로 표시되는 아미노산 배열로 이루어진 단백질,

   (b) 상기 (a)의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 GFAT 활성을 가지는 단백질,(c) 상기 (a)의 아미노산 배열과 98%이상의 상동성을 가지는 아미노산 배열로 이루어진 단백질.
9. 청구항 l 또는 2에 기재된 유전자 또는 청구항 4에 기재된 유전자 발현 생산물을 유효성분으로서 함유하는 저혈당증의 치료 또는 예방용 조성물.
10. 청구항 8에 기재된 단백질을 유효성분으로서 함유하는 저혈당증의 치료 또는 예방용 조성물.
11. 청구항 4에 기재된 유전자 발현 생산물 및 청구항 8 에 기재의 단백질 및 이들의 단편으로부터 선택되는 어느 하나에 결합될 수 있는 항체.
12. 청구항 1에 기재된 유전자 또는 청구항 4에 기재된 유전자 발현 생산물 및 청구항 8에 기재된 단백질의 효소활성을 저해하는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법에 있어서, (1) 청구항 11에 기재된 항체와 후보 화합물을 함유하는 피검액 및 표지화된 청구항 8에 기재된 단백질 또는 그 부분 펩티드를 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합한 표지화된 단백질 또는 그 부분 펩티드의 비율을 측정하던가, (2) 후보 화합물을 함유하는 피검액과 담체상에 불용화한 상기 항체 및 표지화된 다른 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하던가, 또는 (3) 청구항 8에 기재된 단백질 또는 그의 부분 펩티드 기질을 접촉시켰을 경우와 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 기질 및 후보 화합물을 접촉시켰을 경우에서의 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드의 효소활성을 측정, 비교함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
13. 청구항 12에 기재된 후보 화합물의 스크리닝 방법으로 이용되는 스크리닝용 킷트에 있어서, 측정용 완충액, 청구항 8에 기재된 단백질 또는 그의 부분 펩티드 및 기질로서의 프락토오스-6-인산 및 글루타민을 킷트 성분으로서 함유하는 킷트.