WO2004022091A1 - ジアシルグリセロール産生促進剤 - Google Patents

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WO2004022091A1
WO2004022091A1 PCT/JP2003/011332 JP0311332W WO2004022091A1 WO 2004022091 A1 WO2004022091 A1 WO 2004022091A1 JP 0311332 W JP0311332 W JP 0311332W WO 2004022091 A1 WO2004022091 A1 WO 2004022091A1
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WO
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activity
mgat
seq
gene
mgat2
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PCT/JP2003/011332
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Takeshi Watanabe
Noritaka Koseki
Hiroyuki Kyushiki
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Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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Definitions

  • the present invention relates to a monoacylglycerol-l-acyltransferase.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an enzyme having an activity (Monoacylglycerol acyltransferase: hereinafter referred to as “MGAT”) as an active ingredient.
  • MGAT Monoacylglycerol acyltransferase
  • the present invention also relates to a compound having an activity of inhibiting or promoting the above enzyme activity and a method for screening a compound having an activity of inhibiting or activating the above enzyme.
  • triglyceride also called triacylglycero, hereinafter referred to as “Ding AG”
  • Ding AG Animal and plant-derived triacylglycerol (triglyceride, also called triacylglycero, hereinafter referred to as “Ding AG”) in food is mostly degraded into free fatty acids and monoacylglycerol (hereinafter, “MAG”) in the small intestine. Is done. These are absorbed by the small intestinal epithelial cells together with the remaining TAG. The absorbed MAG is transferred to the small intestine by the activity of MGAT (monoacylglycerol acyltransferase: hereinafter referred to as “MGAT”), whereby the acyl group is transferred from the acyl-CoA to diasylglycerol.
  • MGAT monoacylglycerol acyltransferase
  • DG diacylglycerol acyltransferase
  • MGAT together with DGAT, is involved in TAG synthesis in vivo.
  • the activity of MGAT is high in liver, small intestine, and fat cells in mammalian tissues, and particularly in the small intestine, the MGAT activity is closely related to the absorption of TAG in food.
  • TAG resynthesized as described above is secreted into lymphatic vessels of the small intestine as ckylomicron in combination with food-derived phospholipids, cholesterol, proteins and the like.
  • the chylomicrons enter the lymphatic system from the small intestinal lymphatic vessels, are secreted as milky fluid into blood vessels, are decomposed by lipoprotein lipase (LPL) present in the capillaries of adipose tissue, and are taken up by tissues such as muscle to produce energy. Consumed as When energy is sufficient, it is transported to adipose tissue, such as subcutaneous tissue, muscle, and mesentery tissue, where it is stored as fat in cells. On the other hand, free fatty acids It is carried to adipose tissue and turned into TAG. In general, 99% of fat cells turn into TAG. Adipose tissue acts as a storage for this TAG, an energy storage.
  • DGAT1 DGAT gene product
  • a new protein (enzyme) showing MGAT activity has been elucidated for the regulatory function of MGAT in the lipid metabolism pathway, and if MGAT is expressed in a tissue-specific manner, the lipid metabolism mechanism of each tissue Can provide useful information about the elucidation of
  • the compound can be used as a pharmaceutical candidate compound for obesity, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia, hyperfattyacidemia. It is expected to be useful for the development of therapeutic and prophylactic agents for diabetes, arteriosclerosis, etc.
  • An object of the present invention is to elucidate a novel protein exhibiting MGAT activity and a gene encoding the same, particularly a novel molecule responsible for MGAT activity in the small intestine.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the protein (enzyme) exhibiting MGAT activity as an active ingredient, particularly a DAG production promoter.
  • the present inventors have conducted intensive studies and isolated a single human gene (named “MGAT2 gene”) that is newly expressed in the small intestine based on data on a known DC family gene, The protein encoded by the gene was expressed, and it was confirmed that the expressed product had MGAT activity and was useful as a DAG production promoter.
  • the present invention has been completed based on these findings and further studies.
  • the present invention provides the invention having the gist set forth in the following Item 1-17.
  • Item 1 A pharmaceutical composition comprising a polypeptide consisting of the following amino acid sequence of (a) or (b) together with a pharmaceutically acceptable carrier: (a) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • the amino acid sequence of (a) above has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added, and has a monoacylglycerol acyltransferase (MGAT) activity.
  • MGAT monoacylglycerol acyltransferase
  • Item 2 A pharmaceutical composition comprising an expression product of a DNA molecule comprising the polynucleotide of any of the following), (d) or (e) together with a pharmaceutically acceptable carrier:
  • MGAT monoglycylglycosyltransylase
  • a diacylglycerol production promoter comprising at least one selected from the group consisting of the polypeptide according to Item 1 and the expression product according to Item 2, together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Item 4 A method for promoting the production of diacylglycerol, comprising administering an effective amount of at least one selected from the group consisting of the polypeptide according to Item 1 and the expression product according to Item 2 to a patient in need of treatment.
  • Item 5 Use of at least one member selected from the group consisting of the polypeptide according to Item 1 and the expression product according to Item 2 for the production of a diacylglycerol production promoter.
  • Item 6 Measure the enzymatic activity of a polypeptide consisting of any of the following amino acid sequences (a) or (b) in the presence and absence of the test substance, and measure the enzyme activity in the presence of the test substance Inhibitor for monoacylglycerolacyltransferase (MGAT) activity, characterized in that the measured value is compared with the measured value in the absence of the test substance, and an inhibitor that reduces the activity is selected.
  • MGAT monoacylglycerolacyltransferase
  • Item 7 In the presence and absence of the test substance, measure the enzymatic activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of either (a) or (b) below. Comparing the measured value in the absence of the test substance with the measured value in the absence of the test substance, and selecting an Axerele overnight that enhances the activity, characterized in that the activity of monoacylglycerol acyltransferase (MGAT) is enhanced. How to screen an Axelere:
  • (b) It comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and has an activity of monoacylglycerol-l-acyltransferase (MGAT).
  • MGAT monoacylglycerol-l-acyltransferase
  • Item 8 In the presence and absence of the test substance, measure the enzymatic activity of the expressed DNA molecule consisting of any of the following polynucleotides (c), (d) or (e), and Comparing the measured value in the presence of the test substance with the measured value in the absence of the test substance, and selecting an inhibitor that reduces the activity, wherein the inhibitor for monoacylglycerol-acyltransferase (MGAT) activity is selected.
  • MGAT monoacylglycerol-acyltransferase
  • MGAT monoacylglycerol-lucyltransferase
  • Item 9 In the presence and absence of a test substance, measure the enzymatic activity of an expression product of a DNA molecule consisting of any of the following polynucleotides (), (d), or (e), and determine the presence of the test substance. The measured value in the above is compared with the measured value in the absence of the test substance.
  • a method for screening for an accelerator for monoacylglycerol-acyltransferase (MGAT) activity which comprises selecting an axelele that enhances sex.
  • MGAT monoglycylglycosyltransylase
  • Item 10 At least one selected from the group consisting of the polypeptide according to Item 1 and the expression product according to Item 2 is contained as a component together with a substrate for monoacylglycerol-l-a-lasyltransferase (MGAT). Screening kit for screening for inhibitors of monoacylglycerolacyltransferase (MGAT) activity.
  • MGAT monoacylglycerol-l-a-lasyltransferase
  • Claim 1 1.
  • MGAT monoacylglycerol lucyltransferase
  • An antisense DNA molecule for the indicated DNA sequence
  • RNA molecule having at least 15 consecutive nucleotides which is a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, and which has an RNA interference effect.
  • an antisense DNA molecule consisting of at least 15 consecutive nucleotides and having a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3;
  • RNA molecule which is a double-stranded RNA sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides and corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3 and having an RNA interference effect.
  • Item 14 Patients who are required to be treated with at least one substance having the activity of inhibiting or decreasing the activity of monoacyldaricelylacyltransferase (MGAT) selected from the group consisting of the following (1)-(3) Method of inhibiting monoacylglycerol acyltransferase (MGAT) activity for administration to:
  • MGAT monoacyldaricelylacyltransferase
  • RNA molecule having at least 15 consecutive nucleotides which is a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, and which has an RNA interference effect.
  • Monoacylglycerol acyl a substance having an activity of inhibiting or decreasing at least one type of monoacyldaricelyl acyltransferase (MGAT) activity selected from the group consisting of the following (1) to (3): Uses for the production of transerase (MGAT) activity inhibitors:
  • RNA sequence consisting of at least 15 consecutive nucleotides and corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having an RNA interference effect.
  • An RNA molecule consisting of at least 15 consecutive nucleotides and corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having an RNA interference effect.
  • RNA molecule having an RNA interference effect on an untranslated region and a translated region of the monoacylglycerolacyltransferase (MGAT) gene represented by SEQ ID NO: 3 or 6, excluding the transcribed region.
  • MGAT monoacylglycerolacyltransferase
  • the present invention also provides the inventions described in the following items 18 to 32.
  • Item 18 The polypeptide enzyme according to Item 1, which is screened by the screening method according to any one of Items 6 to 9 or obtained by a screening method using the screening kit according to Item 10 or 11. An inhibitor of the activity or the enzymatic activity of the expression product of Item 2.
  • a lipid metabolism inhibitor comprising the inhibitor according to Item 18 together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Item 20 The lipid metabolism inhibitor according to Item 19, wherein the target disease is any one selected from the group consisting of obesity, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia, diabetes, and arteriosclerosis. .
  • Item 21 An antibody which binds to a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Item 22 An antisense DNA molecule corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, consisting of at least 15 consecutive nucleotides.
  • Item 23 The pharmaceutical composition according to Item 12, wherein the target disease is any one selected from the group consisting of obesity, hyperlipidemia, hypertrilipidemia, hyperVLDLemia, diabetes, and arteriosclerosis.
  • Item 24 The pharmaceutical composition according to Item 12, which is a lipid metabolism inhibitor.
  • Item 25 Monoacylglycerol containing at least one selected from the group consisting of the inhibitor according to Item 18 and a substance having an action of inhibiting or reducing MGAT activity according to Item 12, together with a pharmaceutically acceptable carrier. Bulking agent.
  • Item 26 Inhibiting or inhibiting the inhibitor according to Item 18 and the MGAT activity according to Item 12.
  • An acyl-CoA cholesterol acyltransferase inhibitor comprising at least one selected from the group consisting of substances having a reducing action together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Item 27 A peroxisome containing at least one selected from the group consisting of the inhibitor according to Item 18 and a substance having an activity of inhibiting or reducing MGAT activity according to Item 12, together with a pharmaceutically acceptable carrier. Growth factor-activated receptor activator.
  • Item 28 Screened by the screening method described in any of Items 6 to 9 or obtained by the screening method using a screening kit described in Item 10 or 11.
  • a lipid metabolism promoter comprising the AXELELE of Item 28 together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Item 30 The lipid metabolism promoter according to Item 29, wherein the target disease is any one selected from the group consisting of a skin disease and a hair loss disease.
  • a monoacylglycerol-lowering agent comprising the accelerator according to Item 28 together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Item 32 A diacylglycerol or triacylglycerol production promoter comprising the axerele as described in Item 28 together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Item 33 A test solution containing the polypeptide (or a salt thereof) according to Item 1 and a labeled polypeptide (or a salt thereof) according to Item 1 and the antibody according to Item 21 Item 3.
  • the method for quantifying a polypeptide according to Item 1, wherein the ratio of the labeled polypeptide (or a salt thereof) bound to the antibody is measured by allowing the antibody to react competitively.
  • Item 34 A test solution containing the polypeptide of Item 1 (or a salt thereof), the antibody of Item 21 insolubilized on a carrier (first antibody) and the labeled antibody of Item 21 Item 2.
  • the gene is intended to include not only double-stranded DNA but also single-stranded DNAs comprising the sense strand and the antisense strand, and is not limited to its length. Therefore, unless otherwise specified, the gene (DNA molecule) of the present invention includes a double-stranded DNA containing human genomic DNA, a single-stranded DNA containing cDNA (sense strand), and a sequence complementary to the sense strand. It includes the main-strand DNA (antisense strand) and any of these fragments.
  • the gene does not matter which functional region is used, and may include at least one of an expression suppression region, a coding region, a leader sequence, exon, and an intron.
  • Polynucleotides include RNA and DNA.
  • DNA molecules include cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • polypeptide having a specific amino acid sequence and the polynucleotide encoding the same include fragments, homologues, derivatives and variants thereof.
  • Polynucleotide variants include naturally occurring allelic variants; non-naturally occurring variants; variants with deletions, substitutions, additions and insertions. However, these variants encode polynucleotides that do not substantially alter the function of the polypeptide encoded by the polynucleotide before mutation. Polypeptide mutations (alteration of amino acid sequence) need not be naturally-occurring, for example, mutations or post-translational modifications, and use naturally-occurring genes (e.g., the MGAT2 gene of the present invention). It may be artificially generated. Variants of the above polypeptide include alleles, homologs, natural variants, etc., wherein at least 80%, preferably 95%, more preferably 99% are homologous to the polypeptide before mutation. It is.
  • the homology between polypeptides and polynucleotides can be determined using known sequence analysis software.
  • Software for example, measurement using the FASTA program (Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994), and analysis using SWISSPLOTS).
  • the most preferable and simplest method for the homology search is a medium readable by a computer (for example, a floppy disk,
  • Examples of public databases include:
  • BLAST program There are five BLAST tools, three of which were designed for nucleotide sequence queries (BLASTN BLASTX and BLASTX) and two were designed for amino acid sequence queries (BLASTP and 1). "BLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birren et al., Genome Analysis, 1: 543-559 (1997)).
  • sequence alignment programs programs for identifying more distant sequences, and are well known to those of skill in the art. I have.
  • the mutant of the polynucleotide means a silent or conservative mutant with respect to the amino acid substitution encoded thereby, and indicates a mutation in the nucleotide sequence in which the amino acid residue encoded by the nucleotide sequence is not changed. Examples of conservative amino acid substitutions are shown in Table 1 below. table 1
  • one or more codons encoding a cysteine residue affects disulfide bonding of a particular polypeptide.
  • Amino acid residue substitutions that are commonly thought to alter the properties of the protein are:
  • hydrophilic residues such as Ser or Thr
  • hydrophobic residues such as Leu, lle, Phe, Val or Ala
  • composition of the present invention (polypeptide)
  • the polypeptide used as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention includes: (a) SEQ ID NO: 1 Or (b) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted or added in SEQ ID NO: 1 and has MGAT activity.
  • the polypeptide of the present invention may be, for example, a human cell, particularly a human intestinal epithelial cell, or a human cell, particularly a human cell or tissue-derived polypeptide isolated from the small intestine (duodenum, jejunum, ileum), liver, or large intestine. It may be a peptide or a polypeptide obtained by synthesizing it according to its amino acid sequence information.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is not limited to that represented by SEQ ID NO: 1, and may have a certain homology with this.
  • the homology is, for example, about 80% or more, preferably about 95% or more, and more preferably about 98% or more.
  • such a polypeptide having an amino acid sequence having a certain homology needs to have substantially the same MGAT activity as the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • substantially the same means that the activity is the same in nature (for example, physiochemically or pharmacologically). Quantitative factors such as the degree of MGAT activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • amino acid in the “amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1” shown as (b) in the polypeptide of the present invention The degree of modification, that is, the degree of “deletion, insertion, substitution or addition” and their positions are determined by the fact that the polypeptide of the modified amino acid sequence has a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. There is no particular limitation as long as the substance has the same function. It is preferable that the degree of the above modification is usually about 1 to several.
  • “homogeneous” has the same meaning as described above.
  • the polypeptide of the present invention shown in the above (b) is, in addition to the above-mentioned MGAT activity, also in the antigenicity and immunogenic activity of the protein, for example, in the same quality as the polypeptide of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Preferably it is.
  • the MGAT activity of the polypeptide of the present invention can be understood as an action of catalyzing a reaction from monoacylglycerol (MAG) to diacylglycerol (DAG), or particularly in lipid metabolism of human or mammal. It is understood as the effect of increasing the accumulation of neutral fat.
  • MAG monoacylglycerol
  • DAG diacylglycerol
  • a PCR product (polypeptide) named “MGAT2” shown in Examples described later can be mentioned.
  • the DNA sequence of the human MGAT2 gene is as shown in SEQ ID NO: 3 (total length 1074 bp), and the amino acid sequence encoded by its ORF (1005 bp) consists of 334 amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 1 .
  • the DNA sequence of the mouse MGAT2 gene is as shown in SEQ ID NO: 6 (total length 1728 bp), and the amino acid sequence encoded by its ORF (1005 bp) is 334 amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 4.
  • Consists of Human MGAT2 has its gene expression in the small intestine, liver and large intestine, and mouse MGAT2 gene has specific expression in the absorption epithelium of the small intestine.
  • the deduced amino acid sequence encoded by the human MGAT2 gene is encoded by the ORF of clone (derived from a human gastric cancer cDNA library) disclosed as clone number HP02485 in paragraphs [0223] to [0226] of Patent Document 1.
  • Amino acid sequence is presumed to be a transmembrane protein, and the nematode virtual protein W01A11.2 (GenBank accession number U64852) and the amino acid sequence Shows a similarity of 45.5%.
  • Patent Document 1 does not disclose the isolation of the protein having the deduced amino acid sequence, nor does it disclose any specific use or usefulness of the protein.
  • MGAT2 has MGAT activity, and therefore, disclosed herein are new pharmaceutical uses such as, for example, DAG production promoters, TAG production promoters, and various disease symptoms caused by lipid lowering. , For example, skin diseases, alopecia, hypolipoproteinemia, This is the first discovery that it can be used as a lipid metabolism promoter for patients such as cancer patients whose bioenergetic energy is enhanced by host growth.
  • composition of the present invention expression of DNA molecule
  • the expressed product of the DNA molecule as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention (and the same expressed product used in the screening method of the present invention) (hereinafter, simply referred to as “expressed product”) is represented by (c) SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide of a DNA sequence (d) a polynucleotide capable of hybridizing with the polynucleotide of (c) above under stringent conditions and capable of expressing MGAT activity or (e) a polynucleotide of (c) above 80% or more, Preferably, it can be obtained from a transformant having 95% or more of a homologous DNA sequence and carrying a DNA molecule comprising any polynucleotide of a polynucleotide capable of expressing MGAT activity.
  • the transformant can be obtained by transforming an appropriate host with a recombinant expression vector obtained by introducing a DNA molecule capable of expressing the above-mentioned predetermined MGAT activity into an appropriate source vector.
  • a DNA molecule capable of expressing MGAT activity, which is possessed by the transformant, is a polynucleotide having a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2: ⁇ .
  • Other polynucleotides include polynucleotides that can hybridize with the above polynucleotides under stringent conditions and that can express MGAT activity.
  • stringent conditions include the conditions at 50 ° C. in 0.1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS or the conditions at 60 ° C. in 0.2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS.
  • polynucleotides include polynucleotides having a DNA sequence homologous to at least 80%, preferably at least 95%, more preferably at least about 98% with the above polynucleotide and capable of expressing MGAT activity. It is.
  • MGAT activity in these polynucleotides means that a transformant transformed with a recombinant expression vector into which these DNA sequences have been inserted has a MGAT activity as its expression product. Can be expressed.
  • the MGAT activity is measured by a method known per se, for example, by contacting MAG and acyl CoA with the polypeptide of the present invention or the expression product of the present invention, and measuring the amount of DAG produced. It is required by doing.
  • the measurement of MGAT activity can be performed according to the method described in the literature (see, for example, the method of Yen et al. (Proc. Natl. Acad. Sc, USA., 99 (13), 8512-8517 (2002)).
  • Pharmaceutical composition of the present invention Anguo gonist and agonist
  • the present invention provides a substance (antagonist for MGAT2 gene expression) having an action of inhibiting or reducing the enzymatic activity of the polypeptide or expression product of the present invention.
  • the antagonist include antibodies against an expression product obtained from a transformant having the MGAT2 gene, antisense DNA of the MGAT2 gene, and RNA having an interference effect on double-stranded RNA corresponding to the MGAT2 gene. Included.
  • the angonist is useful as an MGAT activity inhibitor for diseases considered to be caused by excessive DAG or TAG production. More specifically, the disease includes hyperlipidemia, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia and the like. Therefore, the above antagonists are useful as lipid metabolism inhibitors. It is also useful as a therapeutic agent for obesity, diabetes, arteriosclerosis and the like. Further, the antagonist can be used also as a MAG bulking agent, and can also be used as an acyl CoA cholesterol lucyl transferase inhibitor or a peroxisome growth factor activated receptor activator.
  • the present invention also provides a substance (agonist against MGAT2 gene expression) having an action of promoting or enhancing the enzymatic activity of the polypeptide or expression product of the present invention.
  • the agonist is used for diseases considered to be caused by insufficient production of DAG or TAG, and more specifically, for diseases in which energy metabolism is elevated, such as alopecia, hypolipoproteinemia, and cancer.
  • it is useful as an MGAT activity promoter. That is, the agonist can be used as a lipid metabolism promoter such as a MAG lowering agent, a DAG or TAG production promoter.
  • the elucidation of the relationship between the MGAT2 gene expression product and MGAT activity found by the present invention can be performed by elucidating, grasping, and understanding various pathological states such as obesity and lipid metabolism abnormality. It provides useful information and means on diagnosis, prevention, treatment, etc.
  • gene of the present invention (hereinafter referred to as “gene of the present invention”) will be described in detail.
  • the gene of the present invention is a gene consisting of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 which encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is shown as a gene consisting of a polynucleotide containing a complementary strand.
  • the gene of the present invention is not particularly limited thereto.
  • “having a certain homology” means that the amino acid sequence and the base sequence have at least 80%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity.
  • the variant of the gene of the present invention includes a DNA sequence encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (modified amino acid sequence).
  • modified amino acid sequence modified amino acid sequence
  • the degree of “deletion, insertion, substitution or addition of amino acids” and their positions are determined by the fact that the modified protein has the same function as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (MGAT2 protein). Is not particularly limited as long as it has the same effect.
  • the term "similar function" means MGAT activity, that is, the action of catalyzing the reaction from MAG to DAG, the action of promoting DAG production or the action of increasing TAG, or the action of accumulating fat in adipose tissue, etc. .
  • the gene encoding the modified amino acid sequence may be a gene capable of detecting the gene of the present invention encoding the amino acid sequence before modification by its use.
  • a gene having a certain homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is defined as having homology to MGAT2 gene and having structural homology.
  • ⁇ means a series of related genes that are recognized as one gene family due to their similarity in gene expression pattern and similarity in biological function. This naturally includes alleles (alleles) of the MGAT2 gene.
  • Amino acid sequence modification (mutation) and the like may occur naturally, for example, due to mutation or post-translational modification. Further, a naturally-derived gene (for example, the human MGAT2 gene of the present invention) can be artificially modified.
  • the gene of the present invention includes all modified genes having the above-mentioned properties, regardless of the cause and means of such modification and mutation.
  • Examples of the above-mentioned artificial means include, for example, Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 ( 1984); Genetic research method 1; Genetic research method II, edited by The Biochemical Society of Japan, p105 (1986)], and chemical synthesis means such as the phosphate triester method and the phosphoramidite method [ ⁇ Am. Chem.
  • DNA can be synthesized by a chemical synthesis such as a phosphoramidite method or a triester method using a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer.
  • the double-stranded fragment is synthesized under complementary conditions by synthesizing a complementary strand.
  • the strand is synthesized either by annealing with the chemically synthesized single strand or by adding the complementary strand to the chemically synthesized single strand using a DNA polymerase with an appropriate primer sequence. can do.
  • a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be exemplified.
  • This DNA sequence shows an example of one combination of codons representing each amino acid residue of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the gene of the present invention is not limited to a DNA molecule consisting of such a specific base sequence, but may have a DNA sequence selected by combining arbitrary codons with each amino acid residue. Codon selection can be performed according to a conventional method. For example, codons can be selected in consideration of the frequency of codon usage of the host used [Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)].
  • the gene of the present invention includes a polynucleotide comprising a DNA sequence having a certain homology with the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a complementary strand thereof.
  • the polynucleotide consisting of the DNA sequence having a certain homology has at least 80% identity, preferably at least 95% identity, more preferably at least 99% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Refers to a polynucleotide having
  • the gene of the present invention can be easily produced by a general genetic engineering technique based on the sequence information on the specific examples of the gene of the present invention disclosed herein.
  • a cDNA library is prepared from a suitable source expressing the gene of the present invention in accordance with a conventional method, and the desired clone is isolated from the library using an appropriate probe antibody specific to the gene of the present invention.
  • Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983), etc. are suitable sources expressing the gene of the present invention.
  • examples of the source of cDNA include various cells and tissues expressing the gene of the present invention, and cultured cells derived therefrom. Isolation of total RNA from these sources, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA and its cloning, etc. can all be carried out according to conventional methods.
  • mRNA or cDNA libraries are commercially available. In the present invention, these commercially available mRNA or cDNA libraries, for example, various mRNA or cDNA libraries commercially available from Clontech Lab. A human small intestinal mRNA or cDNA library can also be used.
  • the method for screening the gene of the present invention from a single cDNA library is not particularly limited, either, and any of various ordinary methods can be used. Specific methods include, for example, a method in which a protein produced by cDNA is subjected to immunoscreening using an antibody specific to the protein, and a corresponding cDNA clone is selected. Examples include a plaque hybridization method and a colony hybridization method using a probe that selectively binds to a DNA sequence, and combinations thereof.
  • DNA chemically synthesized based on information on the DNA sequence of the gene of the present invention is generally used. Further, the gene of the present invention and a fragment thereof which have already been obtained can also be used as the probe. Furthermore, a sense primer and an antisense primer set based on the DNA sequence information of the gene of the present invention can be used as a screening probe.
  • the nucleotide used as the probe is a partial nucleotide corresponding to SEQ ID NO: 2, and is at least 15 continuous DNAs, preferably 100 or more continuous DNAs, more preferably 150 or more continuous DNAs, Even more preferably, it has 200 or more continuous DNAs.
  • the positive clone itself for producing the gene of the present invention can also be used as this probe.
  • a DNAZRNA amplification method by a PCR method can be suitably used.
  • the RACE method Rapid amplification of cDNA ends; Experimental Medicine, 12 (6), 35 (1994)]
  • 5'-RACE method MA Frohman Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)
  • the primer used for performing the PCR method can be appropriately set based on the sequence information of the gene of the present invention revealed by the present invention, and can be synthesized according to a conventional method. Isolation and purification of the DNA / RNA fragment amplified by the PCR method can be performed by a conventional method, for example, by gel electrophoresis.
  • the gene of the present invention or various DNA fragments obtained according to the above method can be prepared by a conventional method, for example, the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)], the Maxam-Gill-Butt method. Enzymology, 65, 499 (1980)], or simply, using a commercially available sequence kit or the like. (6) Use of the gene of the present invention m
  • the presence or absence of expression of the gene of the present invention in an individual or various tissues can be specifically detected.
  • This detection can be performed according to a conventional method. More specifically, the detection is performed by, for example, RT-PCR [Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PGR Protocol, A Guide to methods and
  • a more preferable detection method includes a detection method by RT-PCR.
  • the primer used for detection employing the PCR method is not particularly limited as long as it is specific to the gene of the present invention and can specifically amplify the gene.
  • This primer can be appropriately set based on the sequence information of the gene of the present invention.
  • the primer is a partial sequence of the gene of the present invention having a length of about 10-40 nucleotides, more preferably about 15-30 nucleotides.
  • the gene of the present invention also includes a specific primer for detecting the human MGAT2 gene according to the present invention and a DNA fragment used as Z or a specific probe.
  • the DNA fragment can be defined as a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions.
  • the stringent conditions are ordinary conditions under which a primer or a probe is used.
  • a condition at 50 ° C. in 0.1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS or a condition at 60 ° C. in 0.2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS can be exemplified.
  • Use of ZL gene of the present invention (2) Using the gene of the present invention, an expression product (protein) of the gene of the present invention or a protein containing the same can be easily produced in a large amount and stably in accordance with ordinary genetic engineering techniques.
  • the present invention relates to a protein encoded by the gene of the present invention, a vector for producing the protein, for example, a vector containing the gene of the present invention, an ft main cell transformed with the vector, and culturing the host cell.
  • a vector for producing the protein for example, a vector containing the gene of the present invention, an ft main cell transformed with the vector, and culturing the host cell.
  • the present invention also provides a method for producing the expression product (polypeptide) of the present invention.
  • polypeptide of the present invention a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (human MGAT2 protein) can be mentioned.
  • the polypeptide of the present invention includes not only the MGAT2 protein but also homologs thereof.
  • the homologue include a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having MGAT activity.
  • MGAT activity include an enzymatic action that catalyzes the reaction of MAG to DAG, and consequently a DAG production promoting action or a TAG increasing action or a lipid accumulation action.
  • Specific examples include a gene product of a homolog of the human MGAT2 gene (a human MGAT2 equivalent gene including an allele).
  • Homologs of the polypeptide of the present invention also include yeast, nematode, plant tissue, and mammalian proteins having the same activity as the MGAT2 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • mammals include, for example, humans, pomas, sheep, puppies, dogs, monkeys, cats, bears, rats, and egrets.
  • polypeptide (expressed product) of the present invention can be prepared by a conventional gene recombination technique based on the sequence information of the gene provided by the present invention [for example, Science, 224, 1431 (1984);
  • the method comprises preparing a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene encoding a desired protein in a host cell, introducing this into a host cell, and forming the recombinant DNA.
  • the transformation is performed by culturing the transformant, and then recovering the target protein from the resulting culture.
  • prokaryote and eukaryote can be used as host cells.
  • the prokaryotic host may be any of those generally used, such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and preferably Escherichia coli, especially Escherichia coli K12.
  • Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates and yeast.
  • the former include, for example, COS cells which are monkey cells (Cell, 23: 175 (1981)), Chinese hamster ovary cells and their dihydrofolate reductase-deficient strain CProc. Natl. Acad. Sci., USA. 77: 4216 (1980)], and the latter is preferably a Saccharomyces yeast cell. Of course, it is not limited to these.
  • a promoter and an SD are used upstream of the prokaryotic cell so that the gene of the present invention can be expressed in the vector using a vector capable of replicating in the host cell.
  • Dalgarno sequences, and an expression plasmid provided with an initiation codon (eg, ATG) necessary for initiation of protein synthesis can be suitably used.
  • a plasmid derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC12, etc.
  • P UC13 is often used, it is possible to use various known vectors one is not limited thereto.
  • E. coli Commercially available products of the above-mentioned vectors used in the expression system using E. coli include, for example, pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMA and P2 (New England Biolabs), pET21, pET21 / lacq ( In vitrogen) pBAD / His (lnvitrogen) and the like.
  • the expression vector When a vertebrate cell is used as a host, the expression vector usually has a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence located upstream of the gene of the present invention to be expressed. Which may further have an origin of replication if necessary.
  • Specific examples of the expression vector include, for example, pSV2dhfr [Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)] which has an initial promoter of SV40.
  • various known commercial vectors can be used.
  • vectors used in animal cell-based expression systems include, for example, pEGFP-N, pEGFP-C (Clontrech), plND (lnvitrogen Animal cells such as pcDNA3.1 / His (lnvitrogen), pFastBac HT (Gibc old RL), pAcGHLT (PharMingen), pAc5 V5-His, pMT / V5-His, pMT / Bip / V5 vector for insect cells such as -his (all from Invitrogen).
  • expression vectors when yeast cells are used as a host include, for example, pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)] having a promoter for the acid phosphatase gene. it can.
  • Commercially available expression vectors for yeast cells include, for example, pP for Z (lnvitrogen), pPICZ (Invitrogen), and the like. No particular limitation is imposed on the promoter.
  • trp tryptophan
  • Ipp promoter Ipp promoter
  • lac promoter lac promoter
  • recA promoter lac promoter
  • PPR promoter preferably used.
  • promoter When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like are preferable.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, pH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like can be suitably used.
  • preferred promoters include a promoter derived from SV40, a promoter of a retrovirus, a metamouth thionein promoter, a heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, and a SR. a promoter and the like.
  • a normal fusion protein expression vector can also be preferably used.
  • the vector include pGEX (Promega) for expression as a fusion protein with daltathione-S-transferase (GST).
  • Secretion sequences are known as polynucleotide sequences whose coding sequence for the mature polypeptide assists in the expression and secretion of the polypeptide from the host cell.
  • Such a sequence can also be used for production of the polypeptide of the present invention.
  • a marker sequence used for purification of a fusion mature polypeptide against a bacterial host, and in the case of a mammalian cell, Hemagglutinin (HA) tags can also be used.
  • the method of introducing a desired recombinant DNA (expression vector) into a host cell and the method of transforming the same are not particularly limited, and various general methods can be employed.
  • the transformant can be cultured according to a conventional method.
  • the target protein encoded by the gene designed as desired is expressed and produced (accumulated, secreted) inside, outside, or on the cell membrane of the transformant.
  • various media commonly used depending on the host cell employed can be appropriately selected and used. Culturing can also be performed under conditions suitable for the growth of the host cells.
  • the obtained recombinant protein of the present invention (polypeptide of the present invention) can be subjected, if desired, to various separation procedures utilizing its physical properties, chemical properties and the like [“Biochemical Data Book II”, pp. 1175-1259, 1st ed. 1st Edition, June 23, 1980, issued by Tokyo Chemical Co., Ltd .; see Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.) Can be purified.
  • Examples of the method include ordinary reconstitution treatment, treatment with a protein precipitant (salting out method), centrifugation, osmotic shock method, ultrasonic crushing, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration ), Adsorption chromatography, ion-exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography (HPLC), and various other types of liquid chromatography, dialysis, and combinations thereof.
  • affinity chromatography using a column to which a specific antibody against the polypeptide of the present invention is bound can be exemplified.
  • the DNA sequence of the MGAT2 gene represented by SEQ ID NO: 2 can be used as a suitable one.
  • the gene can be used by appropriately selecting and changing codons indicating each amino acid residue, if desired.
  • the polypeptide of the present invention has a general structure according to the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1. Can be produced by a typical chemical synthesis method. The method includes a method for synthesizing a peptide by a usual liquid phase method and a solid phase method.
  • the peptide synthesis method is based on the amino acid sequence information, and the so-called stepwise gelation method in which each amino acid is sequentially bonded one by one to extend the chain, and a fragment consisting of several amino acids are prepared in advance. And then subjecting each fragment to a force-pulling reaction.
  • the polypeptide of the present invention may be synthesized by any of them. Condensation methods employed for peptide synthesis can also follow conventional methods.
  • azide method for example, azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC + additive (additive; 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxy Succinamide, N-hydroxy-5-norpolene-2,3-dicarpoxyimide) method, the Padward method, and the like.
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • DCC + additive additive; 1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxy Succinamide, N-hydroxy-5-norpolene-2,3-dicarpoxyimide
  • the solvent used in each of these methods can also be appropriately selected from general solvents known to be used in this kind of peptide condensation reaction.
  • Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and a mixed solvent thereof.
  • the hydroxyl group in the amino acid or the peptide which does not participate in the reaction is generally converted into a lower alkyl ester such as methyl ester, ethyl ester or tertiary butyl ester, for example, benzyl ester by esterification.
  • aralkyl esters such as P-methoxybenzyl ester and P-nitrobenzyl ester.
  • amino acid having a functional group in the side chain for example, the hydroxyl group of a tyrosine residue may be protected with an acetyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary butyl group, etc., but such protection is not always required. No need to do.
  • the guanidino group of an arginine residue includes a nitro group, a tosyl group, a P-methoxybenzenesulfonyl group, a methylene-2-sulfonyl group, a benzyloxycarbonyl group, an isoporyloxycarbonyl group, and an adamantylo group. It can be protected by a suitable protecting group such as a xycarbonyl group.
  • Deprotection reactions of these protecting groups in amino acids and peptides having a protecting group and finally obtained polypeptide of the present invention can also be carried out by conventional methods such as a catalytic reduction method, liquid ammonia Z sodium, hydrogen fluoride, It can be carried out according to a method using hydrogen bromide, hydrogen chloride, trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid, methanesulfonic acid or the like.
  • polypeptide of the present invention thus obtained can be obtained by various methods described above, for example, ion exchange resins, partition chromatography, gel chromatography, countercurrent partitioning, and other methods commonly used in the field of peptide chemistry. It can be purified as appropriate.
  • the polypeptide of the present invention can be suitably used as an immunizing antigen for preparing a specific antibody against the polypeptide.
  • an immunizing antigen for preparing a specific antibody against the polypeptide.
  • desired antiserum polyclonal antibody
  • monoclonal antibody monoclonal antibody
  • the method for producing the antibody itself is well understood by those skilled in the art.
  • the production of the antibody of the present invention can also be carried out according to these conventional methods (for example, see “Sequence Chemistry Experiment Course“ Immunoimmune Biochemistry Research Method ”, edited by Biochemical Society of Japan (1986)).
  • the obtained antibody can be used for, for example, purification of the polypeptide of the present invention such as MGAT2 and measurement and identification thereof by immunological techniques. More specifically, since the expression of the gene of the present invention has been confirmed in tissues such as the small intestine, large intestine, and liver, the antibody can be used for measuring the MGAT concentration in these tissues.
  • the antibody or a fragment of the antibody is useful as a substance (antagonist) that exerts an action of inhibiting or reducing the MGAT activity of MGAT2 through, for example, binding to MGAT2. That is, the antibody against the polypeptide of the present invention can suppress the production of DAG and, as a result, the production of TAG, and can suppress the accumulation of lipids in adipose tissue and the like.
  • the above antibody or its fragment it is possible to suppress the action of catalyzing the reaction from MAG to DAG. As a result, MAG in the living body can be increased, and inhibition of acyl-CoA cholesterol acyltransferase and activation of the peroxisome proliferator-activated receptor can be expected.
  • an antibody against the polypeptide of the present invention can also be used, for example, for measuring wild-type MGAT2 and Z or mutant MGAT2. Therefore, the present invention also provides a method for measuring wild-type MGAT2 and Z or mutant MGAT2 using an antibody against the polypeptide of the present invention.
  • the degree of MGAT activity, the degree of lipid metabolism disorder, the degree of dysfunction of the acylglycerol biosynthetic pathway, the degree of hyperlipidemia or the degree of lipoprotein metabolism disorder, etc. can be detected based on the degree of change relative to wild-type MGAT2.
  • Such alterations can also be determined by DNA sequence analysis of the MGAT2 gene according to conventional techniques in the field, but preferably, the difference in amino acid sequence in MGAT2 is determined using an antibody (polyclonal or monoclonal antibody). Alternatively, it can be detected as the presence or absence of MGAT2 itself.
  • MGAT2 antibody is used to immunoprecipitate MGAT2 protein from a biological material sample-containing solution collected from humans, or MGAT2 protein in a biological material sample-containing solution is used. It can be reacted directly with the MGAT2 antibody on Western 'blots or immunoblots of polyacrylamide gels. MGAT2 antibodies can also detect MGAT2 in paraffin or frozen tissue sections using immunohistochemical techniques.
  • More preferred examples related to methods for detecting wild-type MGAT2 or mutants thereof include enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), including sandwich methods using monoclonal and / or polyclonal antibodies. ), Radioimmunoassay (RIA), immunoradiometric assay (IRMA) and immunoenzymatic assay (IEMA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • RIA Radioimmunoassay
  • IRMA immunoradiometric assay
  • IEMA immunoenzymatic assay
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the polypeptide or the expression product of the present invention as an active ingredient (for example, E.g., MGAT2), which promotes MGAT activity specific to the small intestine, liver, and especially the small intestine, which is important in the absorption and resynthesis of lipids. It is effective in various medical fields by utilizing the promoting action and the promoting action of lipid accumulation in adipose tissue.
  • E.g., MGAT2 E.g., MGAT2
  • MGAT2 MGAT2 expression product
  • 2-monoacylglycerol 2-monoacylglycerol
  • Molecules (MAG) can be reacted with radiolabeled acyl-CoA to measure the increase in the amount of synthesized labeled DAG.
  • reaction solution containing the sample 180 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM magnesium chloride, 1 mg / ml ⁇ serum albumin (fatty acid-free), 30 1 // 1 ⁇ 0.2 mm 2 -Monooleoyl glycerol; total volume 100 I
  • the reaction solution containing the sample 180 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM magnesium chloride, 1 mg / ml ⁇ serum albumin (fatty acid-free), 30 1 // 1 ⁇ 0.2 mm 2 -Monooleoyl glycerol; total volume 100 I
  • the polypeptide (expressed product) as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention also includes a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Such salts include, but are not limited to, non-toxic alkali metal salts such as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, normium, and ammonium, alkaline earth metal salts, and ammonium salts, which are prepared by methods well known in the art. Is included. Further, the above-mentioned salts include non-toxic acid addition salts obtained by reacting the polypeptide (expression product) of the present invention with a suitable organic acid or inorganic acid.
  • Non-toxic acid addition salts include, for example, hydrochloride, hydrochloride, Hydrobromide, sulfate, bisulfate, acetate, oxalate, valerate, oleate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, P-toluenesulfonic acid Salt (tosylate), citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, sulfonate, glycolate, maleate, ascorbate, benzenesulfonate, napsylate, etc. Is exemplified.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in a pharmaceutical preparation form by using the polypeptide (expressed product) of the present invention and a salt thereof as an active ingredient and containing a pharmaceutically effective amount thereof together with a suitable pharmaceutical carrier or diluent. You.
  • Pharmaceutical carriers used in the preparation of the pharmaceutical preparation include fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants, lubricants and the like which are usually used according to the form of the preparation.
  • a diluent or excipient can be exemplified. These are appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the obtained preparation.
  • Particularly preferred pharmaceutical preparations include various components used in ordinary protein preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, and surfactants as appropriate. It is prepared by
  • examples of the stabilizer include human serum albumin, common amino acids, saccharides, and cellulose derivatives. These can be used alone or in combination with a surfactant or the like. In particular, this combination may improve the stability of the active ingredient in some cases.
  • the amino acid is not particularly limited and may be, for example, any of glycine, cysteine, dalminic acid and the like.
  • the saccharides are not particularly limited.
  • monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose
  • sugar alcohols such as mannitol, inosyl and xylyl
  • disaccharides such as sucrose, maltose and lactose
  • a polysaccharide such as dextran, hydroxypropyl starch, chondroitin sulfate, or hyaluronic acid, and derivatives thereof.
  • surfactant there is no particular limitation on the surfactant, and both ionic and nonionic surfactants can be used. Specific examples thereof include polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester type, polyoxyethylene alkyl ether type, sorbitan monoacyl ester type, and fatty acid glyceride type. You.
  • cellulose derivative there is no particular limitation on the cellulose derivative, and methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium propyloxymethylcellulose and the like can be used.
  • the amount of the saccharide to be added is suitably about 0.0001 mg or more per g of the active ingredient, preferably about 0.01 to 10 mg.
  • the surfactant is added in an amount of about 1 g of the active ingredient.
  • the appropriate amount of human serum albumin is about 0.0001 mg or more, preferably about 0.001-0.1 mg per active ingredient.
  • the amount of amino acid added is about 0.001-10 mg per 1 g of the active ingredient, and that the amount of cellulose derivative added is about 1 per g of the active ingredient. It is appropriate that the amount be about 0.00001 mg or more, preferably about 0.001-0.1 mg.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation of the present invention is appropriately selected from a wide range. In general, it is appropriate to use about 0.00001-70% by weight, preferably about 0.0001-5% by weight in the preparation.
  • various additives such as a buffer, an isotonic agent, a chelating agent and the like can also be added.
  • the buffer include boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ⁇ -aminocaproic acid, glutamic acid and / or a salt thereof (for example, sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, etc. Alkali metal salts and alkaline earth metal salts).
  • the isotonic agent include sodium chloride, potassium chloride, saccharides, glycerin and the like.
  • the chelating agent include sodium edetate and citric acid.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be prepared in the form of a solution.
  • the preparation can be lyophilized to a state that can be stored, and then dissolved in a buffer solution containing water, fresh saline, or the like, to an appropriate concentration. It is also possible to prepare a lyophilized agent form.
  • the dosage unit form of the pharmaceutical preparation of the present invention can be appropriately selected depending on the purpose of the treatment.
  • Typical examples are solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, granules, capsules, etc.
  • Forms include liquid dosage forms such as solutions, suspensions, emulsions, syrups, elixirs and the like. These are further classified into oral preparations, parenteral preparations, nasal preparations, vaginal preparations, suppositories, sublingual preparations, ointments, etc. according to the administration route, and should be prepared, formed or prepared according to the usual methods. Can be.
  • the above-mentioned excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, porphyrin, crystalline cellulose, caiiic acid, potassium phosphate, etc.
  • Binders such as water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, propyloxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose and polyvinylpyrrolidone; sodium carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, low substitution degree Disintegrators such as hydroxypropyl cell mouth, dried starch, sodium alginate, powdered agar, powdered laminaran, sodium hydrogencarbonate, calcium carbonate; polyoxyethylene sorbitan fat Detergents such as esters, sodium lauryl sulfate, and monoglyceride stearic acid; Deterioration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter, and hydrogenated oil; Absorption promoters such as quaternary ammonium base and sodium lauryl sulfate; Glycerin Adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite, and colloidal citric acid; lubricating agents such as purified talc,
  • tablets can be tablets coated with a usual coating as required, such as sugar-coated tablets, gelatin-coated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, and double tablets or multilayer tablets. it can.
  • excipients such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, and talc
  • binders such as gum arabic powder, tragacanth powder, gelatin, and ethanol
  • Disintegrants such as laminaran and copper can be used.
  • Capsules are usually prepared by mixing the active ingredient of the present invention with the various pharmaceutical carriers exemplified above and filling the mixture into hard gelatin capsules, soft capsules and the like according to a conventional method.
  • Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable solutions including conventional inert diluents, such as water, emulsions, suspensions, syrups, elixirs and the like, as well as wetting agents, emulsions, An auxiliary agent such as a suspending agent can be included, and these are prepared according to a conventional method.
  • liquid dosage forms for parenteral administration such as sterile aqueous to non-aqueous solutions, emulsions and suspensions
  • diluents such as water, ethyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, ethoxylated Vegetable oils such as isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbin fatty acid esters and olive oil can be used, and injectable organic esters such as ethyl oleate can be blended.
  • diluents such as water, ethyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, ethoxylated Vegetable oils such as isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbin fatty acid esters and olive oil
  • injectable organic esters such as ethyl oleate can be blended.
  • These may further contain ordinary solubilizers, buffers, wetting agents, emulsifiers
  • Sterilization can be carried out, for example, by a filtration operation through a bacteria retaining filter, blending of a bactericide, irradiation treatment and heat treatment. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions which can be dissolved in sterile water or a suitable sterilizable medium immediately before use.
  • polyethylene glycol cocoa butter, higher alcohols, higher alcohol esters, gelatin, and semi-synthetic glycerides can be used as the preparation carriers.
  • diluents include, for example, vegetable oils such as white cellulose, paraffin, glycerin, cellulose derivatives, propylene glycol, polyethylene glycol, silicon, bentonite and olive oil. Can be used.
  • composition for nasal or sublingual administration can be prepared according to a conventional method using well-known standard excipients.
  • the drug of the present invention may contain a coloring agent, a preservative, a flavoring agent, a flavoring agent, a sweetening agent, and other pharmaceuticals, if necessary.
  • the administration method of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, gender and other conditions, degree of disease, and the like.
  • tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules and capsules are administered orally, injections are single Or intravenously in admixture with normal rehydration fluids such as glucose or amino acids, and if necessary alone or intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally, suppositories are administered rectally, vaginal Are administered intravaginally, nasal agents are administered intranasally, sublingual agents are administered buccally, and ointments are administered topically transdermally.
  • the amount of the active ingredient to be contained in the above pharmaceutical preparations and the dose thereof are not particularly limited, and may vary widely depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. More appropriately selected.
  • the dose is usually about 0.01 g-10 mg, preferably about 0.1 g-1 mg per kg of body weight per day, and the dosage is about 1 g / day. It can be administered in several divided doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a lipid metabolism promoter based on the fact that the polypeptide of the present invention and an expression product (eg, MGAT2 protein) as active ingredients have MGAT activity.
  • the diseases to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied include various disease symptoms caused by a decrease in lipid as described above, for example, skin diseases, alopecia, hypolipoproteinemia, or host growth such as cancer, thereby increasing energy in living organisms. Disorders with increased catabolism can be mentioned.
  • the expression of the gene of the present invention is observed in tissues such as the small intestine, liver, and large intestine, and all or a part of the antisense DNA of the MGAT2 gene according to the present invention
  • tissues such as the small intestine, liver, and large intestine
  • RNA having a complementary sequence can be produced in the cell, and by inhibiting translation, the expression of the MGAT2 gene can be forcibly suppressed.
  • DAG production in tissues such as the small intestine can be suppressed, and as a result, TAG production can be suppressed, and lipid accumulation in adipose tissue and the like can be suppressed.
  • MAG in the living body is increased as a result, and the inhibitory action of acyl-CoA cholesterol-acyltransferase and the activity of peroxisome growth factor It can be expected to exhibit activated receptor activation activity.
  • a lipid metabolism inhibitor for hyperlipidemia hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia, etc., or obesity, It can be used as an agent for suppressing or improving the progress of diabetes and the like.
  • the present invention also provides such a gene therapy composition or gene therapy agent having an anti-MGAT effect.
  • MAG includes 1-monoacylglycerol, 2-monoacylglycerol and 3-monoacylglycerol and mixtures thereof. Specific examples thereof include 1-monolinolenyl glycerol, 2-monolinolenyl glycerol, 1-monostearoyl glycerol, 2-monostearoyl glycerol, 1-monopalmitoyl glycerol, 2-monopalmitoyl glycerol, and 1-monopalmitoyl glycerol.
  • DAG also includes 1,2-diacylglycerol, 1,3-diacylglycerol and 2,3-diacylglycerol.
  • Specific examples include 1,2-, 1,3- or 2,3-dilinolenyl glycerol, distearoyl glycerol, dipalmityl glycerol, dioleoyl glycerol, dipalmi tolyl glycerol, dieco sapene enoy.
  • Luglycerol and the like can be exemplified.
  • the inhibitory effect of acyl-CoA cholesterol acyltransferase can be measured, for example, according to the method described in JP-A-5-23135.
  • the activity of activating a peroxisome proliferator-activated receptor can be measured, for example, according to the method described in JP-A-2001-354558.
  • the present invention provides a gene therapy vector containing all or a part of the MGAT2 gene, and a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, a cell into which the MGAT2 gene has been introduced by the vector.
  • the present invention relates to a gene therapy vector comprising an antisense gene comprising the whole or part of the antisense DNA of the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, more preferably SEQ ID NO: 2, and The cell into which the antisense gene has been introduced by the vector, the gene therapy vector and the vector A gene therapy agent comprising, as an active ingredient, a cell into which an antisense gene has been introduced.
  • the present invention relates to a gene therapy vector containing an antisense gene comprising all or part of the antisense DNA having the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, and more preferably SEQ ID NO: 2.
  • the cells into which the antisense gene has been introduced by the vector are transferred to skeletal muscle cells or muscle tissue sites of patients with hyperlipidemia, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia, obesity, diabetes, etc. By administering it, it can improve lipid metabolism in these tissues and improve hyperlipidemia, hyperlipidemia, hyperneutral lipemia, hyperVLDLemia, etc.Adipose tissue of obese and diabetic patients, etc. It is intended to provide a method for suppressing lipid metabolism, which comprises suppressing lipid accumulation in blood or improving lipid metabolism in a diabetic patient.
  • the gene therapy of the present invention is directed to a method of producing an MGAT2 gene by using an antisense drug for producing an RNA having a sequence complementary to the intracellular mRNA, inhibiting translation, and suppressing the expression of the MGAT2 gene in cells expressing the MGAT2 gene.
  • the treatment is performed, for example, by combining the original mRNA of MGAT-expressing cells having the MGAT2 gene with antiserum. Suppresses target gene expression by blocking the transcription or translation process, either by binding a sense gene or by inserting an antisense gene between the DNA duplexes to form a triplex Is the way.
  • an antisense oligonucleotide complementary to the gene mRNA is produced, and the antisense oligonucleotide is supplied to target cells. like this
  • an action of suppressing the expression function of the MGAT2 gene is supplied to target cells, an increase in MGAT activity or lipid in the recipient cells / target cells can be suppressed.
  • a vector or a plasmid containing the antisense oligonucleotide is introduced into a target cell, and the antisense oligonucleotide is extrachromosomally added to the target cell. There is a way to maintain it.
  • the antisense oligonucleotide is incorporated into a vector derived from a retrovirus, an adenovirus, an AAV, etc., and this is incorporated into a cell expressing MGAT activity.
  • the desired MGAT activity can be suppressed or reduced, and thus the effect of suppressing lipid metabolism can be obtained.
  • an antisense oligonucleotide When an antisense oligonucleotide is introduced into a target cell having the MGAT2 gene to suppress the expression of MGAT2, the antisense oligonucleotide does not need to correspond to the entire length of the MGAT2 gene, and the MGAT2 gene is not required.
  • the antisense oligonucleotide may be the above-described variant or a gene consisting of a partial sequence, as long as it retains a function that is substantially the same as the function of suppressing the expression function.
  • vectors for introducing a desired gene for both integration of an antisense oligonucleotide into a vector and maintenance of the vector outside the target cell various vectors already known in the art can be used. Any vector can be used.
  • the vector is, for example, a viral vector or plasmid vector containing a copy of the antisense 'oligonucleotide of MGAT2 linked to an expression control element and capable of expressing the antisense oligonucleotide product in target cells.
  • a viral vector or plasmid vector containing a copy of the antisense 'oligonucleotide of MGAT2 linked to an expression control element and capable of expressing the antisense oligonucleotide product in target cells.
  • Specific examples thereof include, for example, U.S. Pat. And PCT International Publication WO93 / 07282, an expression vector (pWP-7A, pwP-19, pWU-1, pWP-8A, pWP-21 and / or pRSVL) or
  • Vectors prepared using pRC / CMV manufactured by Invitrogen
  • Suitable vectors are various virus vectors described below.
  • a promoter used for a vector used in gene transfer therapy a promoter specific to an affected tissue to be treated for various diseases can be suitably used.
  • colon carboxylate dehydrogenase and the like can be exemplified.
  • albumin, ⁇ -fetoprotein, ⁇ 1-antitrypsin, transferrin, transstyrene and the like can be exemplified.
  • examples thereof include carboxylic acid anhydrase I and an antigen of carcinoembrogen.
  • estrogen for the uterus and placenta, estrogen, aromatase cytochrome ⁇ 450, cholesterol side chain cleavage ⁇ 450, 17alpha-hydroxylase ⁇ 450 and the like can be exemplified.
  • prostate antigen for the prostate, prostate antigen, gp91-fox gene, prostate specific kallikrein and the like can be exemplified.
  • erb-B2, erb-B3, 3-casein, jQ-lactoglobin, whey protein and the like can be exemplified.
  • the activator protein C-globulin can be exemplified.
  • K-14-keratin, human keratin 1 or 6, leucrin and the like can be exemplified.
  • examples include glial fibrillary acidic protein, mature astrocyte specific protein, myelin, tyrosine hydroxylase, arm villin, glucagon, and amyloid polypeptide in the islet of Langerhans.
  • thyroglobulin For the thyroid gland, thyroglobulin, calcitonin, etc. can be exemplified.
  • Monkey For the thyroid gland, thyroglobulin, calcitonin, etc. can be exemplified.
  • kidney renin, liver / bone / kidney alkaline phosphatase, erythropoietin and the like can be exemplified.
  • examples include amylase and chitin.
  • the antisense oligonucleotide to be introduced (the whole or a part of the complementary sequence corresponding to the MGAT2 gene) is, as described above, based on the DNA sequence information of the MGAT2 gene. It can be easily manufactured and obtained by general genetic engineering techniques.
  • the vector for introducing an antisense oligonucleotide is introduced into target cells according to various methods known in the art for introducing DNA into cells, such as electoporation, calcium phosphate coprecipitation, and virus transduction. It can be carried out.
  • Cells transformed with the antisense oligonucleotide of the MGAT2 gene can be used as a drug with MGAT activity in isolation, as a drug to suppress lipid elevation, and as a model for therapeutic research. It can also be used as a system.
  • the antisense-oligonucleotide-introducing vector can be introduced into target cells of a patient by local or systemic injection and administration to a target tissue site of the patient. According to systemic administration, a desired vector can be reached to any cell capable of expressing MGAT mRNA. If the transduced gene is not permanently incorporated into the chromosome of each target cell, the administration can be repeated periodically.
  • the gene therapy method of the present invention includes an in vivo method in which a vector for introducing an antisense oligonucleotide is directly administered into a body, and a method in which a target cell is once extracted from a patient's body and the gene is extracted outside the body. And then ex vivo methods of returning the cells to the body.
  • the gene therapy of the present invention is particularly intended for hyperlipidemia as a lipid metabolism inhibitor, but gene therapy (treatment) is not limited to hyperlipidemia but is associated with hyperlipidemia associated with hyperlipidemia. It can also be used in the treatment of hypertension, hyperVLDLemia, hyperTGemia (hypertriacylglycerolemia), obesity and diabetes and its complications. In addition, not only gene therapy but also, for example, gene labeling can be used.
  • the target cell into which the antisense oligonucleotide is introduced can be appropriately selected depending on the target of gene therapy (treatment).
  • targets include, for example, cells in which MGAT expression as a target cell is observed, particularly small intestine, liver, large intestine tissue, lymphocytes, fat cells, small intestinal mucosal epithelial cells, hepatocytes, fibroblasts, large intestinal mucosal epithelial cells, hematopoiesis
  • targets include stem cells and epidermal cells.
  • Methods for introducing antisense oligonucleotides in gene therapy include viral and non-viral methods.
  • the method of viral introduction can be generally carried out by using a retrovirus vector, for example, in view of the fact that the antisense oligonucleotide of the MGAT2 gene is a foreign substance expressed in normal cells.
  • a method using another viral vector can also be used.
  • Other viral vectors include adenovirus vector, HIV (human immunodeficiency vims) vector, and Aanovirus-associated virus (AAV)> Herilevirus vector, simple virus (HSV) vector and Epstein-Barr virus (EBV) vector.
  • Non-viral methods include calcium phosphate co-precipitation; DNA-encapsulated liposomes are fused with inactivated Sendai virus whose genes have been ruptured by ultraviolet light to form membrane-fused ribosomes, and DNA is fused directly with cell membranes.
  • Fusion liposome method to introduce DNA into cells [Kato, K., et al., J. Biol. Chem., 266, 22071-22074 (1991)]; A method for introducing DNA into cells [ ⁇ ang, NS et al., Proc. Natl. Acad.
  • the ligand-DNA complex method includes, for example, a method using an ashi oral glycoprotein as a ligand targeting an ashi oral glycoprotein receptor expressed by hepatocytes [Wu, et al., J. Biol. Chem., 266 , 14338 (1991); Ferkol, et al., FASEB ⁇ , 7, 1081 -1091 (1993)], and a method using transferrin as a ligand targeting transferrin 'Recept Yuichi strongly expressed in target cells [ Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)].
  • the gene transfer method may be a combination of various biological and physical gene transfer methods as described above as appropriate.
  • Examples of the method by the combination include a method of combining a plasmid DNA of a certain size with a polylysine-conjugated antibody specific to an adenovirus hexon protein.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be introduced by binding the obtained complex to an adenovirus vector and infecting the cell with the thus obtained trimolecular complex. This method allows for efficient binding, internalization, and endosomal degradation before DNA coupled to the adenovirus vector is damaged.
  • the ribosome / DNA complex can mediate gene transfer directly in inpo.
  • the retroviral vector system consists of a viral vector and a helper cell (packaging cell).
  • the helper cells are retroviral structural proteins gag (structural protein in virus particles), pol (reverse transcriptase), env (envelope protein) Cells that have previously expressed a gene such as quality) but have not produced virus particles.
  • virus vectors have packaging signals and LTRs (long terminal repeats), but do not have the structural genes such as gag and poK env necessary for virus replication.
  • the packaging signal is a sequence that serves as a tag during the assembly of the virus particles.
  • the selected gene (neo, hyg) and the desired antisense oligonucleotide for integration (antisense oligonucleotide corresponding to MGAT2) integrated into the cloning site Or fragments thereof) are inserted in place of the viral gene.
  • antisense oligonucleotide corresponding to MGAT2 integrated into the cloning site Or fragments thereof
  • the viral genomic RNA is formed by packaging the vector genomic RNA with the viral structural protein produced by the helper cells, Secreted. After the virus particles as recombinant viruses infect target cells, DNA reverse transcribed from viral genomic RNA is integrated into the cell nucleus, and the antisense gene inserted into the vector acts.
  • a method for increasing the efficiency of introducing a desired gene a method using a fragment containing a cell adhesion domain of fibronectin, a heparin-binding site and a junction segment CHanenberg, H., et al., Exp. Hemat., 23, 747 (1995)).
  • a vector used in the retrovirus vector system for example, a retrovirus derived from mouse leukemia virus [McLachlin, JR, et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38 , 91-135 (1990) 3.
  • adenovirus vector The method of using an adenovirus vector will be described in detail.
  • the construction of the adenovirus vector is described in Berkner, K. S., Curr. Topics Microbiol.
  • the desired exogenous gene expression unit (antisense oligonucleotide for introduction, ie, the antisense oligonucleotide of the MGAT2 gene of the present invention, a promoter for transcribing the antisense oligonucleotide).
  • a plasmid vector containing a portion of adenovirus genomic DNA and a plasmid vector containing a portion of the adenovirus genomic DNA and a plasmid containing the adenovirus genome are simultaneously transfected into, for example, 293 cells. I do.
  • a non-proliferative adenovirus vector of the present invention containing the desired MGAT27 antisense oligonucleotide is obtained.
  • adenovirus genomic DNA can be incorporated into a cosmid vector to create a 3 'adenovirus vector to which a terminal protein has been added.
  • a YAC vector can be used for the production of a recombinant adenovirus vector.
  • AAV adeno-associated virus
  • the AAV is a common virus that has a wide host range and infects a variety of cells.
  • the viral genome consists of linear single-stranded DNA with a size of 4680 bases, and 145 bases at both ends are ITR (inverted). It has a characteristic sequence called terminal repeat). This part of the ITR serves as a replication origin and serves as a primer.
  • the rfR is essential for packaging into virus particles and integration into chromosomal DNA of host cells.
  • the left half of the genome encodes a nonstructural protein, Rep, a regulatory protein that controls replication and transcription.
  • Recombinant MV can be prepared by utilizing the property of AAV to be integrated into chromosomal DNA, and thus a desired gene transfer vector can be prepared. This method is more particularly first, leaving the ITR ends of the 5 1 and 3 'wild-type AAV, the desired conductive therebetween Prepare a plasmid (AAV vector plasmid) into which the necessary antisense oligonucleotide (MGAT2 antisense oligonucleotide) is inserted. On the other hand, the viral proteins required for virus replication and virus particle formation are supplied by another helper plasmid. It is necessary to ensure that no common base sequence exists between the two, and that no wild-type virus due to genetic recombination appears.
  • both plasmids are introduced by, for example, transfection into 293 cells, and further infected with an adenovirus (or a non-proliferative type when 293 cells are used) as a helper virus.
  • an adenovirus or a non-proliferative type when 293 cells are used
  • a helper virus or a non-proliferative type when 293 cells are used
  • recombinant AAV is produced.
  • the cells are recovered by freezing and thawing, and the contaminating adenovirus is inactivated by heating at 56 ° C. If necessary, separate and concentrate the recombinant AAV by ultracentrifugation using cesium chloride. As described above, a desired recombinant MV for gene transfer can be obtained.
  • the EBV vector can be produced, for example, according to the method of Shimizu et al. [Norio Shimizu et al., Cell Engineering, 14 (3), 280-287 (1995)].
  • Epstein-Barr virus was derived from a Burkitt lymphoma in 1964 by Epstein et al. A virus belonging to the family Hiramiaceae isolated from cultured cells of the genus [Kieff, E. and Liebowitz, D .: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp. 1889-1920]. Since the EBV has an activity to transform cells, a virus lacking this transforming activity must be prepared in order to be a vector for gene transfer. This can be done as follows.
  • the EBV genome near the target DNA into which the desired foreign gene is to be incorporated is cloned.
  • the DNA fragment of the exogenous gene and the drug resistance gene are then inserted into the vector to produce a recombinant virus.
  • the recombinant virus-producing vector cut out with an appropriate restriction enzyme is transfected into EBV-positive Akata cells. Recombinant virus generated by homologous recombination can be recovered together with wild-type AkataEBV by stimulating virus production by anti-surface immunoglobulin treatment.
  • non-viral vector in which a desired antisense oligonucleotide is introduced into a target cell without using a recombinant viral vector can be performed, for example, by a gene transfer method using a membrane fusion ribosome.
  • This is a method in which the contents of liposomes are directly introduced into cells by giving membrane liposomes (vesicles composed of lipid bilayers) a fusion activity with the cell membrane.
  • Introduction of the antisense oligonucleotide by the membrane fusion ribosome can be performed, for example, by the method of Nakanishi et al. [Nakanishi, M., et al., Exp. Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi , M., et al., Gene introduction into animal tissues.In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug
  • the outline of the method for introducing antisense oligonucleotides using membrane fusion ribosomes is outlined below.
  • the Sendai virus whose gene has been inactivated by ultraviolet rays is fused with a liposome encapsulating macromolecules such as antisense oligonucleotides and expressed proteins at 37 37.
  • This membrane-fused ribosome has a structure called simulated or virus in which the cavity from the ribosome is inside and the same spike as the virus envelope is outside. Then, the membrane fusion ribosome is purified by sucrose density gradient centrifugation, and adsorbed at 4 ° C to target cultured cells or tissue cells.
  • the contents of the liposome are introduced into the cells, and the desired antisense oligonucleotide can be introduced into the target cells.
  • the lipid used as the ribosome it is preferable to use a 50% (molar ratio) cholesterol, lecithin, and a synthetic phospholipid having a negative charge to prepare a single-layer ribosome having a diameter of 300 nm.
  • a method for introducing an antisense oligonucleotide into a target cell using another ribosome a method for introducing an antisense oligonucleotide using a cationic ribosome can be exemplified.
  • the method is based on the method of Yagi et al. [Yagi, K., et al., BBRC, 196, 1042-1048 (1993)]. This method focuses on the fact that both the plasmid and the cell are negatively charged, giving a positive charge to both the inner and outer surfaces of the liposome membrane, increasing the uptake of the plasmid by static electricity and enhancing the interaction with the cell. Is to try.
  • LV multilamellar large vesicles
  • LV large unilamellar vesicles
  • SUV small unilamellar vesicles
  • the outline of the method for preparing plasmid-embedded cationic MLV is as follows.First, lipid TMAG (N-(-trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-gIutamate chloride), DLPC (dilauroyl phosphatidylcholine) and DOPE (dioleoyl
  • an expression plasmid incorporating an antisense oligonucleotide for expression purpose is added to the above-described cationic MLV at a DNA amount of 0.6 g, liposo-
  • a method of embedding so that the lipid content becomes 30 nmol suspending the suspension in a 2 I phosphate buffered saline solution, and administering it to target cells or patient tissues extracted from a patient every other day.
  • gene therapy is defined in the Ministry of Health and Welfare guidelines as "administration of a gene or a cell into which a gene is introduced into a human body for the purpose of treating a disease".
  • the gene therapy in the present invention is defined in the guidelines.
  • the introduction of the antisense 'oligonucleotide of the MGAT2 gene into the target cells described above allows not only treatment of lipid metabolism disorders including hyperlipidemia, but also a marker gene or a marker. It also includes the introduction of cells into which the gene has been introduced into the human body.
  • a method for introducing a desired gene into a target cell or a target tissue typically includes two types of methods.
  • target cells are collected from a patient to be treated, and the cells are cultured outside the body in the presence of, for example, Inuyu Leukin-2 (1-2).
  • This is a technique (ex vivo method) of introducing the antisense oligonucleotide of the target MGAT2 gene contained in the above and then re-transplanting the obtained cells.
  • the second method is a direct gene transfer method (direct method) in which the target antisense oligonucleotide (the antisense oligonucleotide of the MGAT2 gene) is directly injected into a target site such as the patient's body or skeletal muscle.
  • the first method of the gene therapy is performed, for example, as follows. That is, mononuclear cells collected from a patient are collected from monocytes using a blood separator, and the collected cells are cultured in an appropriate medium such as AIM-V medium for about 72 hours in the presence of IL-2. Add the vector containing the antisense oligonucleotide to be introduced (the antisense oligonucleotide of the MGAT2 gene). To increase the transfection efficiency of antisense oligonucleotide, centrifuge at 2,500 rpm for 1 hour at 32 ° C in the presence of protamine, and then culture for 24 hours at 37 ° C under 10% CO2. Is also good.
  • the cells are further cultured for 48 hours in an AIM-V medium or the like in the presence of IL-2, the cells are washed with saline, the number of viable cells is calculated, and the antisense 'oligonucleotide introduction efficiency' is estimated. If in situ PCR or, for example, the desired subject is suppression of MGAT activity or suppression of DAG production as in the present invention, by measuring the degree of those activities, or by inhibiting the production of TAG or By measuring the production of MAG, the effect of introducing the desired antisense oligonucleotide is confirmed.
  • MGAT2 Gene antisense oligonucleotides MGAT2 Gene antisense
  • the cultured cells into which the (oligonucleotide) has been introduced are returned to the patient by intravenous drip infusion. Gene therapy is performed by repeating such a method at intervals of several weeks to several power months, for example.
  • the dose of the viral vector is appropriately selected depending on the target cells to be introduced.
  • a virus-producing cell containing a retroviral vector containing a target antisense oligonucleotide (an antisense oligonucleotide of MGAT2 gene) and, for example, patient cells are co-cultured. Then, a method of introducing an antisense oligonucleotide (an antisense oligonucleotide of the MGAT2 gene) into a target cell can also be adopted.
  • the target antisense oligonucleotide antisense oligonucleotide of MGAT2 gene
  • MGAT2 gene antisense oligonucleotide It is desirable to confirm in advance the suppression of a certain MGAT activity and the increase or suppression of proliferation of target cells.
  • patients can be treated with, for example, mucosal epithelial tissue cells (MGAT-expressing cells) of the small intestine. ) Is collected, treated with enzymes, etc. to establish cultured cells, and then introduced into established mucosal epithelial tissue cells (MGAT-expressing cells) targeting the desired antisense 'oligonucleotide by, for example, retrovirus, After screening with G418 cells, the expression levels of IL-12 etc. were measured (in vivo) and then released.
  • a preferred method is to inoculate the cells into the small intestine of the patient after performing the radiation treatment.
  • the present invention provides, as an active ingredient, a cell into which an antisense oligonucleotide-introducing vector or an antisense oligonucleotide (an antisense 'oligonucleotide of the MGAT2 gene) has been introduced, and a pharmaceutically effective amount thereof. And a pharmaceutical composition or pharmaceutical preparation (gene therapeutic agent) containing a suitable nontoxic pharmaceutical carrier or diluent.
  • Pharmaceutical carriers that can be used in the pharmaceutical composition (pharmaceutical formulation) of the present invention include fillers, bulking agents, binders, humectants, disintegrants, and surfactants that are generally used depending on the use form of the formulation. And diluents or excipients such as lubricants. These can be appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the obtained preparation.
  • Examples of the dosage unit form of the pharmaceutical preparation of the present invention include those similar to the preparations of the pharmaceutical composition of the present invention and the gene therapy described above. This can be appropriately selected from various forms depending on the purpose of treatment.
  • a pharmaceutical preparation containing a vector for introducing an antisense oligonucleotide may be prepared by embedding the vector in ribosomes or by using a virus including a retrovirus vector containing a desired antisense oligonucleotide. It is prepared in the form of infected cultured cells.
  • phosphate buffered saline pH 7.4
  • Ringer's solution or an injection for intracellular composition. It can be prepared in a form to be administered.
  • the administration method of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, gender and other conditions, degree of disease, and the like.
  • the amount of the active ingredient to be contained in the above pharmaceutical preparations and the dose thereof are not particularly limited, and may vary widely depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. More appropriately selected.
  • the desired antisense-oligonucleotide-containing The dose of the torovirus vector is preferably about 1 ⁇ 10 3 pfu to 1 ⁇ 10 15 pfu per kg of body weight per day, for example, as a retrovirus valency.
  • the preparation may be administered once or several times a day, or may be administered intermittently at intervals of one to several weeks. Preferably, it can be co-administered with a substance that enhances gene transfer efficiency, such as promin, or a preparation containing the same.
  • the various gene therapy described above may be appropriately combined. Can be performed (combined gene therapy), and the above-described gene therapy can be performed in combination with conventional exercise therapy, diet therapy, and the like.
  • the gene therapy of the present invention including its safety, can be performed by referring to the NIH guidelines [Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)].
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, a substance having an activity of inhibiting or reducing MGAT activity by an MGAT2 gene expression inhibitory effect comprising an MGAT2 RNA molecule having an RNA interference effect on the MGAT2 gene, and in particular, Provided is a pharmaceutical composition useful for treatment for improving abnormalities such as lipid metabolism and lipoprotein metabolism in the small intestine.
  • the pharmaceutical composition has an effect of improving abnormalities such as lipid metabolism and lipoprotein metabolism, as well as an effect of inhibiting or reducing the activity of catalyzing the reaction of, for example, acylglycerol biosynthesis, particularly the reaction of MAG to DAG. Therefore, it is effective for prevention and treatment of obesity, diabetes, arteriosclerosis, hyperlipidemia, especially hyperVLDLemia, hypertriglyceridemia and the like.
  • An MGAT2 RNA molecule having an RNA interfering effect on the MGAT2 gene is, in humans, an untranslated region and a translated region excluding the transcribed region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and preferably represented by SEQ ID NO: 2.
  • Base sequence (translation region j) is, in humans, an untranslated region and a translated region excluding the transcribed region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and preferably represented by SEQ ID NO: 2.
  • RNA molecule consisting of a double-stranded RNA sequence corresponding to 531
  • a double-stranded RNA corresponding to the untranslated region and the translated region excluding the transcribed region of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 preferably the base sequence (translated region) represented by SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 5 What is necessary is just to have the whole sequence or partial sequence of the RNA molecule consisting of sequences.
  • the RNA molecule is a partial RNA molecule which is a double-stranded RNA sequence corresponding to at least 15 consecutive DNA sequences in the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3, preferably represented by SEQ ID NO: 3.
  • Partial RNA molecules that are the corresponding double-stranded RNA sequences can be mentioned. All of these have an effect of suppressing or controlling the expression of the MGAT2 gene in target cells.
  • RNA molecule consisting of a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3 can be directly administered to target cells such as small intestinal mucosal epithelial cells in the form of a double-stranded RNA molecule.
  • a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3 consisting of at least 15 consecutive, preferably 18 to 30 consecutive, more preferably 19 to 22 consecutive sequences
  • Target cell directly in the form of a single strand with an RNA molecule at both ends and a nucleotide sequence or non-nucleotide sequence consisting of 5 to several tens of bases for the appropriate fusion or connection at the intermediate portion. It can also be administered using a cell introduction method such as the electoral portion method.
  • non-nucleotide sequence examples include any of PNA, cytoplasmic translocating sequence, decoy sequence, sequence for suppressing interferin induction, sequence having RNase suppressing activity, and the like, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention (pharmaceutical preparation having an RNA interference effect) further comprises a double-stranded RNA sequence corresponding to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 in an appropriate eukaryotic cell expression system. And can be administered to target cells or tissues, particularly small intestinal mucosal epithelial cells, using a cell introduction method such as electroporation.
  • the RNA molecule to be incorporated into the eukaryotic cell-based expression system vector is an RNA molecule consisting of a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3 consisting of at least 15 consecutive DNA sequences, preferably Is a sequence number consisting of 18 to 30 consecutive DNA sequences: an RNA molecule consisting of a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence shown by 3, and more preferably a sequence consisting of 19 to 22 consecutive DNA sequences Any RNA molecule consisting of a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence shown by No. 3 may be used. These RNA molecules are required to have an inter-air-lance effect (RNA cleavage effect) for suppressing or controlling the expression of the MGAT2 gene in target cells.
  • RNA cleavage effect RNA cleavage effect
  • Eukaryotic expression vectors include, for example, retrovirus vectors, adenovirus vectors, vectors derived from adeno-associated virus (AAV), herpes virus vectors, simple herpes virus vectors, and Epstein. -Berwirs (EBV) vectors can be used.
  • non-viral transfer methods include calcium phosphate coprecipitation, a method in which a polynucleotide nucleotide plasmid is coated with gold and physically introduced into cells by high-pressure discharge, and a method in which an oligonucleotide plasmid is directly injected into target organs or Examples include the naked polynucleotide method of injecting into tissues, and the cationic ribosome method of introducing RNA molecules embedded in a multi-layer positively charged liposome into cells.
  • RNA can be in accordance with a general RNA synthesis method.
  • desalting and deprotection can be easily performed by using a volatile buffer when used (2
  • '-ACE technology visit the website of Dharmacon: http://www.dharmacon.com/ and the website of Bridge, its distributor in Japan: http: //www.b-bridge.eom/f home.html).
  • a pharmaceutical composition having an RNA interference effect of the present invention comprising an RNA molecule consisting of a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3 as an active ingredient, can be obtained.
  • the pharmaceutical composition by administration thereof, suppresses MGAT activity, suppresses 7-sylglycerol biosynthesis system, ameliorates lipid metabolism disorder or lipoprotein metabolism disorder, obesity, hyperlipidemia, Hyperlipidemia, hyperVLDLemia, sugar It can prevent or treat urine and arteriosclerosis.
  • the pharmaceutical composition having an RNA interference effect of the present invention can improve lipoprotein metabolism disorder, lipid metabolism disorder, etc., it can be used as a monoacyldarice monosaccharide bulking agent, further, an acyl-CoA cholesteryl-lucyltransferase inhibitor or It is also useful as a peroxisome proliferator-activated receptor activator.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises, as an active ingredient, a vector for introducing an RNA molecule comprising a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a pharmaceutical composition of a cell into which the vector has been introduced.
  • An effective amount is prepared in the form of a formulation containing an appropriate nontoxic pharmaceutical carrier or diluent.
  • Pharmaceutical carriers that can be used in the formulation of the present invention include diluents such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants, and lubricants that are commonly used depending on the form of the formulation. Excipients and the like can be exemplified, and these can be appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the obtained preparation.
  • the preparation of the present invention containing a vector for introducing an RNA molecule as an active ingredient can be prepared in a form embedded in a liposome.
  • the preparation of the present invention containing cells as an active ingredient is prepared in the form of cultured cells. These can be prepared in the form of a mixture in a phosphate buffered saline (pH 7.4), Ringer's solution, or an injection for intracellular composition. It can also be prepared in such a form that it is administered together with a substance that enhances the gene transfer efficiency such as promin.
  • the administration method of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient's age, gender and other conditions, degree of disease, and the like.
  • the amount of the active ingredient to be contained in the pharmaceutical preparation and the dosage thereof are not particularly limited, and may vary over a wide range according to the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. It is appropriately selected.
  • the dose of a retroviral vector containing an RNA molecule consisting of a double-stranded RNA sequence corresponding to the DNA sequence represented by SEQ ID NO: 3 as an active ingredient contained in a pharmaceutical preparation is 1 body weight per day.
  • the titer of the retrovirus is preferably about 1 ⁇ 10 3 pfu to 1 ⁇ 10 15 pfu per kg.
  • about 1 ⁇ 10 4 cells / body to about 1 ⁇ 10 15 cells / body Suitably selected from a range.
  • the present invention provides a method for detecting the presence of the MGAT2 gene that promotes the MGAT activity of a cell.
  • the method involves preparing a biological sample such as blood or serum, extracting nucleic acids as desired, and analyzing the presence or absence of a MGAT2 susceptibility gene in the sample.
  • the present invention provides a method for detecting the level of MGAT activity in cells or tissues, the expression level of MGAT mRNA, the degree of progression to abnormal lipid metabolism or impairment of the function of regulating the acylglycerol biosynthetic pathway, or the method for detecting the presence of the MGAT2 gene as a prognostic indicator.
  • the method comprises preparing a biological sample having a dysregulation of the acylglycerol biosynthetic pathway and determining whether or not the MGAT2 gene is present in the sample, or determining the amount (expression level) of MGAT2 mRNA in the sample. It is performed by measuring.
  • the detection method of the present invention it is possible to obtain the level of MGAT activity in a cell or tissue, the expression level of MGAT mRNA, the degree of progression to a regulatory dysfunction of the acylglycerol biosynthetic pathway, or a prognostic indicator. It becomes.
  • diagnosis of lipid metabolism abnormality, lipoprotein metabolism abnormality, etc. judgment of treatment effect of obesity, arteriosclerosis, diabetes, hyperlipidemia, hyperVLDLemia, hypertriglyceridemia, etc. and prediction of prognosis are possible. It works.
  • a DNA fragment designed to be used for screening and / or amplification of the MGAT2 gene is prepared. More specifically, a DNA fragment having properties as a probe that can be used for, for example, plaque hybridization, colony hybridization, Southern plotting, Northern plotting, etc., is prepared. In addition, a DNA fragment having a property as a probe for obtaining a DNA fragment of all or a part of the MGAT2 gene to be amplified by the polymerase chain reaction (PCR) is prepared.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the above-mentioned probe can be prepared, for example, by preparing a primer having the same sequence as that of the MGAT2 gene and using it as a screening probe to react with a biological sample (nucleic acid sample).
  • a biological sample nucleic acid sample
  • the presence of the MGAT2 gene can be confirmed.
  • the sample may also be prepared by various methods that facilitate the detection of the target sequence, such as denaturation, restriction digestion, electrophoresis or dot blotting.
  • PCR As a screening method for confirming the presence of the MGAT2 gene, it is particularly preferable to use PCR in terms of sensitivity.
  • the method is based on a known method (Science, 230, 1350-1354 (1985)) or a newly developed or future PCR method (for example, Yoshiyuki Sakaki) using the MGAT2 gene fragment as a primer. , Et al., Yodosha, Experimental Medicine, Special Edition, 8 (9) (1990); Protein, nucleic acid, enzyme, extra edition, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 35 (17), (1990)) it can.
  • the DNA fragment used as the primer is chemically synthesized oligo DNA, and the synthesis of these oligo DNAs is performed by an automatic DNA synthesizer, such as a DNA synthesizer.
  • the length of the synthesized primer is preferably about 10-50 nucleotides, more preferably about 15-30 nucleotides.
  • the synthesized primer is a sequence which can distinguish other known similar DNA sequences.
  • the probe used in the above screening method is generally labeled, but may be unlabeled, or may be detected by specific binding to a directly or indirectly labeled ligand.
  • Methods for labeling probes and ligands are known in the art and can follow methods such as, for example, nick 'translation, random priming dam, kinase treatment.
  • the labeling agent for example, any of a radioactive labeling agent, biotin, a fluorescent group, a chemiluminescent group, an enzyme, and an antibody can be used.
  • PCR used for the detection is preferably, for example, RT-PCR, but it is of course possible to appropriately apply various modifications used in the art.
  • MGAT2 gene detection and diagnostic kit
  • the detection of the present invention can be carried out more easily by using a kit.
  • the present invention provides such a kit for detecting the MGAT2 gene.
  • the kit of the present invention contains, as an essential component, a DNA fragment that hybridizes to at least a part or all of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 or its complementary DNA sequence.
  • Others may contain, for example, a labeling agent, reagents essential for PCR (eg, Taq DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate, primers) and the like, similarly to the ordinary reagent kit of this kind.
  • the labeling agent examples include a radioactive isotope and a chemically modified substance such as a fluorescent substance.
  • the DNA fragment itself may be conjugated with the labeling agent in advance.
  • the reagent kit may also contain a suitable reaction diluent, a standard antibody, a buffer, a detergent, a reaction stop solution, etc. for the benefit of performing the measurement.
  • the kit for detecting the MGAT2 gene of the present invention can be used not only for measurement and detection of the MGAT2 gene, but also for diagnosing disorders of lipid metabolism, particularly disorders of biosynthesis of acylglycerol, based on the results of the detection. Therefore, the present invention also provides a kit for diagnosing a disorder of lipid metabolism.
  • the DNA sequence of the MGAT2 gene obtained from the test sample can be directly or indirectly determined, whereby a new MGAT2 homolog having a high homology with the wild-type MGAT2 gene can be obtained.
  • Related genes related to genes can also be found.
  • the present invention also provides a method of screening for a related gene related to the human MGAT2 gene in a test sample by such detection and determination of the DNA sequence of the MGAT2 gene in the test sample.
  • the present invention provides a candidate compound having an action of inhibiting or reducing MGAT activity and a method of screening a candidate compound having an action of promoting or increasing MGAT activity.
  • the method comprises the steps of: preparing an amino acid represented by SEQ ID NO: 1 in the presence and absence of a test substance; 1332
  • 57 Measure the enzymatic activity of a polypeptide consisting of an amino acid sequence or a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added in said amino acid sequence and having MGAT activity.
  • the measured value in the presence of the substance is compared with the measured value in the absence of the test substance, and an inhibitor (including an antagonist) that reduces the activity or an Axerele (one that enhances the activity) reduces the activity.
  • an inhibitor including an antagonist
  • Axerele one that enhances the activity
  • An antibody against the polypeptide of the present invention (for example, MGAT2 or an MGAT2 gene expression product, hereinafter, these are simply referred to as “MGAT2”) is labeled in a test solution containing a test substance.
  • the reaction is performed by competitively reacting with the labeled MGAT2, and measuring the ratio of the labeled MGAT2 bound to the antibody.
  • MGAT2 in a test solution can be quantified by measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after simultaneous or continuous reaction with the MGAT2 antibody.
  • MGAT2 e.g., MGAT activity
  • MGAT activity was determined by measuring and comparing the enzymatic activity of MGAT2 when the substrate was brought into contact with MGAT2 and when the substrate and the candidate compound were brought into contact with MGAT2. It is also possible to screen for candidate compounds that inhibit or enhance (stimulate or activate).
  • the binding between MGAT2 and a ligand can be evaluated in, for example, cells, cell-free preparations, chemical libraries, and natural product mixtures.
  • the agonist (accelerator) or the antagonist (inhibitor) of MGAT activity possessed by MGAT2 may be a natural substrate or ligand, or a structural or functional mimetic thereof.
  • the screening method of the present invention can also be used to identify a compound that binds to MGAT2 to enhance (enzyme activator) or inhibit (enzyme inhibitor) the action of MGAT2.
  • a high-throughput screening technique can be applied. According to the application of this technology, for example, in screening for enzyme activators or inhibitors, synthesis reaction mixtures, cell fractions, such as membranes, cell envelopes, cell walls, or preparations of any of these (MGAT2 With a labeled substrate or ligand of the polypeptide) in the presence or absence of the candidate compound to be screened.
  • the ability of the candidate compound to agonize or antagonize MGAT2 is detected by reduced binding of the labeled ligand or reduced production of product from the substrate.
  • Candidate compounds that bind without inducing the action of MGAT2 are likely to be good enzyme inhibitors.
  • compounds that bind well and increase the rate of production of the product from the substrate are likely to be enzyme activators.
  • Detection of the rate or level of production of the product from the substrate can be determined by a system of repos such as, but not limited to, a colorimetric label, a repo system that responds to changes in polynucleotide or polypeptide activity. Enhancement can be achieved by the integration of one gene and using binding assays known in the art.
  • competitive assays that combine MGAT2 with the polypeptide, natural substrate or ligand or compound that binds to the substrate or ligand mimetic can also be used to screen for enzyme inhibitor compounds.
  • GAT2 can be labeled, for example, with a radioactive or colorimetric compound so that the number of polypeptide molecules bound to the binding molecule can be determined.
  • the test substance (drug candidate compound) to be screened by the screening method of the present invention contains both an inhibitor of MGAT activity (including gonist gonist) and an accelerator of MGAT activity (including agonist).
  • the inhibitor is a substance that reduces the MGAT activity measured by its presence in the screening system of the present invention
  • the accelerator is a substance that increases the MGAT activity measured by its presence.
  • Specific examples of these test substances include, for example, an oligopeptide; a protein; an antibody; a non-peptide compound (a chemically synthesized substance); a fermentation product; a cell extract (a plant extract such as alloidloid and an animal tissue extract). ); Plasma and the like. These substances may be newly developed or known substances.
  • enzyme inhibitors include inorganic or organic low molecular weight compounds that bind to MGAT2 to inhibit or partially or completely block its activity, polypeptides prepared by natural or synthetic or recombinant techniques, Antibodies.
  • an antisense DNA molecule to MGAT2 DNA administered directly into a living body or in a form inserted into a recombinant vector a single-stranded or double-stranded body inserted directly into a living body or into a recombinant vector
  • RNA molecules that have an RNA interference effect on MGAT2 administered in a dendritic form.
  • the enzyme inhibitor may bind to the same site on the binding molecule without inducing the activity induced by MGAT2 and prevent the action of the polypeptide by inhibiting the binding of the above-mentioned organic or inorganic substance.
  • molecular compounds, polypeptides, antibodies, antisense DNA molecules, and RNA molecules with RNA interference effects are also included.
  • Enzyme inhibitors also include those that bind to and occupy the binding site of the enzyme and prevent binding of the polypeptide to cell binding molecules, thereby preventing normal biological activity of the polypeptide or Also included are low molecular weight compounds that reduce.
  • Other enzyme inhibitors include antisense molecules as described above (e.g., Okano, ⁇ Neurochem, 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene).
  • Evaluation of a candidate substance having a promoting action or an inhibitory action on MGAT activity is performed, for example, in a manner that MGAT activity is about 20% or more, If it promotes about 30% or more, more preferably about 50% or more, the candidate substance can be selected as a compound that promotes MGAT activity.
  • MGAT activity If the activity is inhibited by about 20% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more compared to the case of a roll (without test substance), the test substance is selected as a compound that inhibits MGAT activity can do.
  • Inhibitors and activators of MGAT activity are particularly related to fat metabolism, as MGAT is important for chiral micron in the small intestine, formation of VLDL in the liver and energy storage as triacylglycerol in adipose tissue It is useful for treating diseases and the like.
  • inhibition of MGAT activity in the small intestine, liver skin and adipose tissue can have the effect of reducing lipid absorption and plasma triglyceride levels and reducing lipogenesis.
  • hypertriglyceridemia has been shown to be an independent risk factor for atherosclerosis (Kugiyama, K., et al., Circulation
  • the MGAT activator and the MGAT activity inhibitor of the present invention are used by themselves for diseases associated with MGAT activity, for example, altered cell monoglycylglycerol concentration, diacylglycerol concentration or triacyl.
  • Diseases related to glycerol concentration for example, diseases related to abnormal lipid metabolism or abnormal fat absorption; obesity, hyperVLDLemia, hypertrilipidemia, hyperlipidemia, alopecia, skin disease, hypolipoproteinemia It is useful for treating or ameliorating diseases related to lipoprotein secretion and adipogenesis such as diabetes; diseases related to lipid metabolism and fat absorption; and various diseases such as diabetes and arteriosclerosis.
  • Substances that inhibit MGAT activity obtained by the screening method of the present invention are thought to increase cell MAG concentration and decrease cell DAG concentration or cell TAG concentration. Therefore, it is useful as a MAG filler in various fields including the pharmaceutical field.
  • the MAG bulking agent containing the MGAT activity inhibitor as an active ingredient is used as an acyl-CoA cholesterol acyltransferase inhibitor or a peroxisome proliferator-activated receptor activator, for example, arteriosclerosis, lipoprotein metabolism disorder, or lipid metabolism. It can be effectively used as a drug for the prevention and treatment of various diseases presenting abnormalities, obesity, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia, diabetes and arteriosclerosis.
  • MGAT activators MGAT enzyme activity enhancers
  • lipid metabolism accelerators DAG bulking agents, MAG bulking agents, etc.
  • lipoprotein metabolism disorders or lipid metabolism disorders lipid metabolism disorders. It can be used for the prevention and treatment of various diseases presenting, for example, hypolipoproteinemia, hypoVLDLemia, skin disease, and alopecia disease.
  • it can be effectively used as a drug for promoting lipid metabolism in patients and the like in which the energy of the living body is accelerated by the catabolism of a host such as cancer.
  • the activator or inhibitor of MGAT activity used as an active ingredient in the pharmaceutical composition may be a pharmaceutically acceptable salt in some cases.
  • Kind of this salt, preparation method thereof, preparation method of pharmaceutical composition, diluent used in pharmaceutical composition, pharmaceutical carrier such as excipient, dosage unit form of pharmaceutical composition, administration route, administration method, etc. Can be substantially the same as those described in detail in the pharmaceutical composition containing the polypeptide of the present invention as an active ingredient.
  • the amount of the active ingredient to be contained in the pharmaceutical preparation and the dose thereof are not particularly limited, and are appropriately selected from a wide range according to the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. Is done. In general, the dose is about 0.01 g to 10 mg, preferably about 0.1 ma, per kg of body weight per day.
  • the formulation can be administered in one or several divided doses per day.
  • the present invention provides a screening kit for screening a substance that inhibits or stimulates (activates) the enzymatic activity (MGAT activity) of MGAT2.
  • the kit for screening a substance inhibiting or activating MGAT activity comprises a polypeptide of the present invention (for example, a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) or an expression product of the present invention (for example, SEQ ID NO: 2). It is important to include the expressed DNA sequence of the DNA sequence shown) and the substrate component of these enzymes as essential components, and the other components can be the same as those of this kind of screening kit.
  • An example of the screening kit of the present invention includes MGAT2 having MGAT activity and substrates [oleoyl-CoA and 2-monooleoylglycerol], and optional components such as reaction diluent, standard DAG, buffer, and detergent. Those containing various reagents can be mentioned.
  • the labeling agent for the substrate is not limited to a radioisotope, and may be, for example, a chemically modified substance such as a fluorescent substance.
  • the kit may also include cell cultures, reaction diluents, buffers, detergents, etc., as needed, to facilitate the performance of the assay.
  • the (drug candidate compound) is as described above, and these may be new or known.
  • Reaction solution for measurement Reaction solution (180 mM Tris-HCl (pH 7.5), 8 mM magnesium chloride, 1 mg / ml ⁇ serum albumin (fatty acid free), 30 ⁇ ⁇ ⁇ oil CoA, 0.2 mM 2-mono oil Glycerol
  • Protein preparation MGAT2 or its salt or microsomal fraction containing it 3)
  • Labeled substrate 0.2 mM 14 C-labeled oleoyl CoA or 14 C-labeled mono-oleoyl glycerol
  • Screening using the screening kit of the present invention containing the above reagents is specifically performed as follows.
  • TLC thin-layer chromatography
  • the protein content of the test sample is determined by measuring the change in absorbance when Coomassie Blue binds to the protein, and the activity per protein mass is calculated.
  • the present invention relates to biologically active or stable forms of MGAT2 derivatives, or biological agents capable of interacting with the polypeptides of the invention to develop agents that enhance or interfere with MGAT2 function in vivo.
  • the present invention also provides other polypeptides that are highly active (such as structural analogs, for example, an MGAT2 enzyme activator, an MGAT2 enzyme inhibitor, an MGAT2 inhibitor), and a method for producing them.
  • Structural analogs use the three-dimensional structure of the complex with MGAT2 for X-ray crystallography, It can be determined by evening modeling or a combination of these.
  • information on the structure of a structural analog can be obtained by modeling a protein based on the structure of a homologous protein.
  • Examples of a method for obtaining an active or stable form of the MGAT2 derivative include a method of analyzing by an alanine scan. This method involves substituting Ala for an amino acid residue and measuring its effect on the activity of the peptide. By analyzing each amino acid residue constituting the peptide in this way, the activity of the peptide can be determined. And areas that play an important role in stability. By this method, a more active or stable MGAT2 derivative can be designed.
  • anti-idiotypic antibodies By generating anti-idiotypic antibodies to functional pharmacologically active antibodies, it is possible to identify and isolate peptides from a bank of chemically or biologically generated peptides. Therefore, the selected peptides are also expected to act as pharmacores.
  • an improved or stabilized MGAT2 derivative, or a polypeptide having an action as an inactivating agent, an enzyme activator, an enzyme inhibitor or the like having MGAT2 activity can be designed and developed.
  • the cloned MGAT2 sequence also allows one to obtain a sufficient amount of MGAT2 to perform analytical studies such as X-ray crystallography. Furthermore, by providing the polypeptide of the present invention, it is possible to adapt to computer-modeling technology instead of or in addition to X-ray crystallography.
  • MGAT2 gene sequence affects various MGAT2 activities as described above in vivo by preparing MGAT2 gene knockout mice or mutant mice.
  • the function of the MGAT2 gene product and the modified MGAT2 gene product in vivo can be confirmed.
  • the method utilizes homologous recombination of genes to obtain genetic information of an organism. This is a technique for intentional modification, and specific examples include a method using mouse embryonic stem cells (ES cells) (Capeccchi, MR, Science, 244, 1288-1292 (1989)).
  • the method for producing the above mutant mouse is a conventional technique for those skilled in the art (Tetsuo Noda, Ed., Experimental Medicine, extra edition, 14 (20) (1996), Yodosha).
  • MGAT2 Gene and Mutant By adapting the MGAT2 gene, a desired mutant mouse can be easily produced. Therefore, by applying the above technology, it is possible to design and develop drugs (inhibitors, enzyme activators, enzyme inhibitors, etc.) having improved or stable MGAT2 activity.
  • drugs inhibitors, enzyme activators, enzyme inhibitors, etc.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a polypeptide having MGAT activity (for example, human MGAT2), which comprises various diseases (MGAT activity or lipid synthesis) associated with the MGAT2 gene and its product.
  • Disease associated with the regulation of the acylglycerol biosynthesis system in the system for example, a DAG production promoter, a TAG production promoter, etc. for the treatment of hypolipoproteinemia, skin disease, alopecia disease and the like.
  • the polypeptide (or expressed product) which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention has high expression in small intestine, liver and large intestine, which are important tissues for fat absorption and resynthesis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing the polypeptide (expressed product) as an active ingredient can be expected as a lipid metabolism promoter, particularly a MAG lowering agent.
  • the present invention also provides a technique for analyzing the expression level of MGAT2 gene, MGAT activity and the like. This allows the function of related genes to be linked to lipid metabolism-related diseases, especially hyperlipidemia such as obesity, hypertriglyceridemia, and hyperVLDLemia, lipoprotein metabolism disorders, diabetes, and arteriosclerosis. Can be elucidated.
  • hyperlipidemia such as obesity, hypertriglyceridemia, and hyperVLDLemia, lipoprotein metabolism disorders, diabetes, and arteriosclerosis.
  • the present invention can further provide a vector for gene introduction containing the MGAT2 antisense oligonucleotide, a cell into which the vector is introduced, and the like, which are useful for gene therapy.
  • the present invention further provides a candidate compound having an action of inhibiting or activating MGAT2 enzyme activity and a method for screening the same.
  • the candidate compound is useful for the treatment of lipid metabolism disorder or lipoprotein metabolism disorder associated with hyperlipidemia such as obesity, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia, etc., diabetes, arteriosclerosis, skin disease, hair loss disease, etc. Useful. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the results of examining the MGAT activity of the microsomal fraction of human MGAT2-expressing cells by MGAT Atssay by the test according to Example 4.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of examining the inhibitory effect of MGAT2 siRNA by MGAT assay on the sample prepared by the test according to Example 4 by the test according to (1) of Example 7.
  • FIG. 3 is a diagram showing the inhibitory effect of the MGAT2 siRNA vector at the protein level using a Western plot by the test according to Example 7 (2).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of examining the inhibitory effect of the MGAT2 siRNA vector on the sample prepared by the test according to Example 4 by MGAT Atssei by the test according to (2) of Example 7.
  • PCR was performed using mouse genomic DNA and human small intestinal cDNA (human multiple tissue cDNA panel: Clontech, CA) as the types, and PCR was performed (95, 5 min. 95, 30 s, 58 CC, 30 s and 72 CC, 30 s cycles were performed 35 times), the amplified PCR product was excised and purified, and the DNA fragment containing mouse MGAT2 and human MGAT2 was excised. Obtained.
  • the following sequences were used as primers. That is, for human MGAT2 amplification, human MGAT2 (F2) represented by SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 Human MGAT2 (R2) was used. In addition, mouse MGAT2 (F) represented by SEQ ID NO: 9 and mouse MGAT2 (R) represented by SEQ ID NO: 10 were used for amplification of mouse MGAT2. Each of these primers was synthesized using an automatic DNA synthesizer (Applied Biosystems Expedite). The nucleotide sequence was confirmed by the direct sequence method.
  • the obtained DNA fragment was labeled with 32 PdCTP by a random prime method (Prime-It II labeling kit, Stratagene) and used as a probe for Northern plotting.
  • Examples of the membrane include human multiple tissue northern blots # 7760-1 (Clontech, CA) and mouse poly A + Northern Blot-12 major Tissues: ORIGENE TECHNOLOGIES, Inc., Maryland) was used.
  • As a hybridization solution 50% formamide, 5X SSPE, 0.1% SDS, and 2X Denhardt's solution were used. Hive Ridize - Chillon was performed 4 2 ° C De ⁇ .
  • RT-PCR was performed on human MGAT2 using Multiple tissue cDNA panels (Clontech, CA) to analyze the expression tissues.
  • Mouse small intestine tissues were fixed with 4% paraformaldehyde (pH 7.4, RNase free), immersed in 20% sucrose for 10 minutes, and then Tissue-Tek O.C.T.
  • the prepared frozen section was immersed in 0.2N hydrochloric acid to remove endogenous al-force phosphatase, followed by proteolysis of the tissue with proteinase K, and non-specificity of the probe was removed by acetylation. Thereafter, the probe solution was hybridized at 55 ° C for 16 hours.
  • the human MGAT2 cDNA used as type III was prepared by RT-PCR using human skin cDNA as type II.
  • -As set 1 human MGAT2 (EcoRI2) represented by SEQ ID NO: 11 and human MGAT2 (R-Xbal) represented by SEQ ID NO: 12 were used.
  • human MGAT2 (EcoRI2) represented by SEQ ID NO: 11 and human MGAT2 (R-Xhol) represented by SEQ ID NO: 13 were used.
  • human MGAT2 (HindHI) represented by SEQ ID NO: 14 and hMGAT2 (R-Xhol) represented by SEQ ID NO: 13 were used.
  • the PCR reaction was performed at 95 ° C, 2 minutes, 95 ° C, 30 seconds, 58 ° C, 30 seconds, and 72 ° C, 1 minute for 30 cycles.
  • An extension reaction was performed.
  • Each amplified PCR product was purified using a Qiaquick gel extraction kit (QIAGEN).
  • the purified PCR product obtained using Primer Set 1 and the pEF1 / V5-HisA vector are cut with EcoRI and Xbal, and each is ligated to obtain the desired expression vector.
  • EcoRI and Xbal After cutting with EcoRI and Xhol, the purified PCR product obtained using Primer Set 1 and the pEF1 / V5-HisA vector are cut with EcoRI and Xbal, and each is ligated to obtain the desired expression vector. was built.
  • COS1 cells were transfected using 2000 (Lipofectamine 2000: Invitrogen). After two transfections, cells were collected and used for subsequent microsomal fraction preparation.
  • the recombinant proteins obtained according to the above method were human MGAT2 (human MGAT2-His) with a histidine tag added to the C-terminus and human MGAT2 without a tag.
  • human MGAT2 human MGAT2-His
  • human MGAT2 human MGAT2-His
  • a histidine tag added to the C-terminus
  • human MGAT2 without a tag.
  • a pcDNA3.1 (+) vector which did not incorporate the ORF region of human MGAT2 was used.
  • Each cell obtained in (1) above was homogenized with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.25 M sucrose, 1 mM EDTA and 2 mM DTT, and then sonicated on ice for 10 minutes. Then, the mixture was centrifuged at 3000 ⁇ g for 10 minutes to prepare a homogenate of the cells.
  • the supernatant After centrifugation of the obtained supernatant at 10,000 X g, the supernatant is further centrifuged at 100,000 X g. With care, a microsomal precipitate was obtained. The obtained precipitate was suspended in a buffer used for homogenization to obtain a microsome fraction.
  • the microsomal fraction was frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until the assay.
  • MGAT attestation was performed as follows using a homogenate or microsomal fraction of cells as a sample.
  • RI-labeled substrate was used for quantification of MGAT activity.
  • the RI-labeled substrate used was 14 C-labeled oleoyl CoA or 14 C-labeled mono-oleoyl glycerol.
  • the samples were quantified by Bradford's method (Bradford, MM, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)), which measures the change in absorbance when Coomassie Blue binds to the protein. Activity was calculated.
  • FIG. 1 shows the results of examining the MGAT activity of the microsomal fraction of human MGAT2-expressing COS1 cells by MGAT Atsushi.
  • hMGAT2 is the microsomal fraction of human MGAT2-expressing COS1 cells
  • Control is the microsomal fraction of COS1 cells transfected only with cDNA3.1 (+) vector (protein concentration (Combined with hMGAT2 above).
  • the protein indicated by an arrow in the figure is diolein, which is an indicator of MGAT activity.
  • Figure 1 shows the following. That is, in the microsomal fraction of COS1 cells expressing human MGAT2 (hMGAT2) (derived from hMGAT2-expressing cells), an apparent increase in the amount of synthesized dilein was observed as compared with the control. An increase in MGAT activity is confirmed.
  • hMGAT2 human MGAT2
  • human MGAT2 has MGAT activity.
  • the present invention has revealed that human MGAT2 exhibits MGAT activity, and this discovery makes it possible to screen for substances that inhibit or enhance MGAT activity of human MGAT2, and thus, as a lipid metabolism inhibitor, obesity It is thought that a candidate compound that can be used for treatment and prevention of various diseases such as hypertension, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hyperVLDLemia, diabetes, and arteriosclerosis can be provided. In addition, it is considered that a candidate compound that can be used as a lipid metabolism promoter for the treatment and prevention of diseases such as skin diseases and hair loss diseases can be provided.
  • Example 5 Screening of MGAT2 Activity Regulator Using MGAT2 Recombinant Protein Expressing Cells
  • Control i.e., inhibit or inhibit
  • the substance to be augmented can be screened by allowing the test substance to coexist in the above-mentioned MGAT Atssay reaction solution.
  • a microsomal fraction derived from a cell into which a vector corresponding to each of the genes without the gene has been integrated is used as a control.
  • a substance having an inhibitory activity on MGAT2 activity is detected in the above-mentioned screening system as inhibiting the production of 14 C-dioleoylglycerol.
  • a substance that enhances the activity of MGAT2 is detected as an increase in the production of 14 C-dioleoyldaricerol in the above-mentioned screening system.
  • Screening for a substance that regulates (inhibits or enhances) MGAT2 activity can be performed using purified MGAT2 recombinant protein.
  • MGAT2 recombinant protein Purification of the MGAT2 recombinant protein is achieved by solubilization of the microsomal fraction from the microsomal fraction described in Example 5 with a surfactant, and fractionation by various column chromatography and the like.
  • tagged MGAT2 recombinant protein it can be more easily purified.
  • the protein is specifically adsorbed to Ni-NTA Superflow (QIAGEN) via His tag and eluted with imidazole. It can be purified by
  • the MGAT2 or MGAT2 fusion protein thus purified can be used as the above-mentioned screening system enzyme.
  • the control may be a buffer solution and that there is no synthesis of a lipophilic labeling substance by an enzyme other than MGAT2.
  • the latter feature is that radioactivity can be measured with a liquid scintillation counter or the like after the reaction is stopped without using TLC, and the value can be used as MGAT2 activity.
  • siRNA short interfering RNA
  • siRNA SEQ ID NO: 15-344 corresponding to the following specific partial sequence in the DNA sequence encoding mouse MGAT2 shown in SEQ ID NO: 5 was synthesized according to Dharmacon's 2′-ACE technique.
  • SiRNA2 SEQ ID NO: 16: DNA + tt of 270-252 of SEQ ID NO: 5
  • SIRNA3 SEQ ID NO: 17: DNA + tt of 134-152 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNA4 Tori selfie 18: DNA + tt of 152-134 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNA5 System ⁇ No. 19: DNA + tt of 279-297 of SEQ ID NO: 5
  • SIRNA7 SEQ ID NO: 21: DNA + tt of 306-324 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNA8 SEQ ID NO: 22: DNA + tt of 324-306 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNA9 SEQ ID NO: 23: DNA + tt of 360-378 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNAI 0 SEQ ID NO: 24: DNA + tt of 378-360 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNA11 SEQ ID NO: 25: DNA + tt of 373-391 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNAI 2 SEQ ID NO: 26: DNA + tt of 391 -373 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNAI 3 Seihaban 27: DNA + tt of 525-543 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNAI 4 SEQ ID NO: 28: DNA + tt of 543-525 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNA 5 SEQ ID NO: 29: DNA + tt of 621-639 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNAI 7 SEQ ID NO: 31: DNA + tt of 756-774 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNAI 8 SEQ ID NO: 32: DNA + tt of 774-756 of SEQ ID NO: 5
  • SiRNAI 9 SEQ ID NO: 33: SEQ ID NO: 5 858-876 DNA + tt
  • SiRNA20 SEQ ID NO: 34: SEQ ID NO: 5 DNA + tt of 876-858
  • Each siRNA was obtained by incorporating the mouse MGAT2 gene expression vector (mouse MGAT2 ORF (base sequence shown in SEQ ID NO: 5) into the EcoRI / Xhol site of pcDNA3.1).
  • the cDNA was amplified by PCR using type I.) and ribofectamine 2000 fLipofectamine 2000 together with the yeast luciferase expression vector pGL3 (promega). (Invitrogen) was used to transfect COS1 cells. Two days after the transfection, the cells were collected, and a microsomal fraction was prepared from the cells according to Example 4 (2).
  • the EGFP (enhanced green fluorescent protein) gene sequence [GenBank accession No. U57606 (pEGFP-C2): Chrfie, M., et al., Science., 263, 802-805, (1994); Yang, The following siRNA against TT, Nucleic Acids Res., 24, 4592-4593. (1996) (sense strand shown as SEQ ID NO: 35 and antisense strand shown as SEQ ID NO: 36, synthesized in the same manner as above)
  • the microsomal fraction was prepared from the cells obtained in the same manner as in Example 4 (2).
  • the siRNA used is as follows.
  • SiRNA21 SEQ ID NO: 35: DNA of 1089-1 107 of GenBank accession No. U57606
  • SiRNA22 SEQ ID NO: 36: DNA of 1107-1089 of GenBank accession No. 1157606
  • MGAT assay was performed according to Example 4, (3).
  • FIG. 2 shows the results of MGAT activity measurement of the microsomal fraction obtained using the siRNA by MGAT assay in the same manner as in FIG.
  • the left lane is the result of cotransfection of MGAT2 expression vector and MGAT2 siRNA into C0S1 cells (indicated as “mGAT2 + mGAT2siRNA” in the figure), and the right lane is the control.
  • the results obtained by cotransfection of MGAT2 expression vector and siRNA against EGFP into COS1 cells in the figure, indicated as “mGAT2 + EGFPsiRNA”).
  • the peak of zorrain is indicated by an arrow.
  • the signal intensity of the spot in FIG. 2 (the spot appearing at the arrow of the zolein) was measured and analyzed using a BAS5000 image analyzer-1.
  • the results obtained are shown in Table 2 below.
  • MGAT2 in the siRNA column indicates that the MGAT2 expression vector and siRNA for MGAT2 were cotransfected into COS1 cells, and EGFP in the siRNA column was the MGAT2 expression vector as a control.
  • the figure shows cotransfection of siRNA for EGFP into COS1 cells.
  • Mouse H1 promoter see Ame, ⁇ C., et al., J. Biol. Chem., 276, 11092-1 1099 (2001), RNA derived from GeneBank accession No. AF191547, its base sequence is shown in SEQ ID NO: (Shown in 37), the following RNAs each having an antisense strand and a sense strand linked via uuaa corresponding to a specific partial sequence of the gene encoding mouse MGAT2 shown in SEQ ID NO: 5 Fragment of the siRNA integrated into pUC19 An existing vector was made. Construction of this vector followed the method described in the literature
  • RNA fragment a SEQ ID NO: 38: 0 +111133 of 815-793 of SEQ ID NO: 5 + DNA of 793-815 of SEQ ID NO: 5
  • RNA fragment b SEQ ID NO: 39: DNA of 337-315 of SEQ ID NO: 5 + uuaa + 315-337 ⁇ DNA of SEQ ID NO: 5
  • RNA fragment c SEQ ID NO: 40: 453-430 DNA of SEQ ID NO: 5 + uuaa + DNA of 430-453 of SEQ ID NO: 5
  • RNA fragment d SEQ ID NO: 41: DNA of 775-753 of SEQ ID NO: 5 + DNA of uuaa + 753-775 of SEQ ID NO: 5
  • RNA fragment e SEQ ID NO: 42: 0 + 1 ⁇ 33 of 881 -858 of SEQ ID NO: 5 + DNA of 858-881 of SEQ ID NO: 5
  • RNA fragment f SEQ ID NO: 43: 518-495 DNA of SEQ ID NO: 5 + uuaa + DNA of 495-518 of SEQ ID NO: 5
  • RNA fragment g SEQ ID NO: 44: 64-41 DNA of SEQ ID NO: 5 + uuaa + 41-6 DNA of SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NOs: 38-44 show the sequences of RNA molecules that are expected to be expressed in COS1 cells transfected with the respective siRNA expression vectors.
  • siRNA expression vectors were used together with a mouse MGAT2 gene expression vector (described in (1) of Example 7) and firefly luciferase expression vector pGL3 (Promega (pramega)) together with Lipofectamine 2000 (Lipofectamine2000: COS1 cells were transfected using Invitrogen. Two days after transfection, cells were harvested and microsomal fractions were prepared. As a control, an siRNA expression vector containing only the H1 promoter sequence was prepared in the same manner, and cells were used for transfection. Dual-luciferase assay system
  • Western plots were performed as follows. That is, first, the homogenate of the cells expressing the MGAT2 protein was subjected to SDS-PAGE under the conditions of 4-20% gel, 40 mA, 60 min, transferred to a PVDF membrane in a semi-dry method, and the PVDF membrane was removed.
  • siRNA expression vector expected to express the RNA molecule of SEQ ID NO: 38 has the strongest RNA interference effect. That the expression vector suppresses the expression of MGAT protein;
  • FIGS. Figure 3 shows the results of the above Western blot in the mGAT2 expression vector and the control vector (pUC19 vector containing the H1 promoter) (lane ⁇ ⁇ ⁇ ) and the same results in the mGAT2 expression vector + mGAT2 siRNA expression vector. (Lane 2).
  • the numerical values in FIG. 3 indicate the molecular weight (kDa) in the molecular weight marker.
  • the positions indicated by arrows correspond to the molecular weight of MGAT2.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results (MGAT activity) of the MGAT assay of the same sample as tested in FIG.
  • lane 1 is the result obtained using the mMGAT2 expression vector + control vector-1 (pUC19 vector containing the H1 promoter)
  • lane ⁇ is the result obtained using the mMGAT2 expression vector + mMGAT2 siRNA expression vector.
  • the position marked with an arrow is a georain.
  • Figure 3 shows the following. That is, in the COS cells into which the siRNA expression vector prepared for the MGAT2 gene sequence was introduced (lane 2), the signal indicating the MGAT2 protein was clearly reduced as compared to the control (lane 1). Observed.
  • the polypeptide having MGAT activity provided by the present invention provides useful information on elucidation of the regulation function of MGAT in the lipid metabolism pathway, and elucidation of the lipid metabolism mechanism of each tissue if MGAT is expressed in a tissue-specific manner. give. Accordingly, the present invention provides a lipid metabolism improving drug containing the polypeptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate compound having an inhibitory activity against MGAT, for example, which comprises obesity, hyperlipidemia, and high triglyceride based on an action of improving lipid metabolism.
  • MGAT for example, which comprises obesity, hyperlipidemia, and high triglyceride based on an action of improving lipid metabolism.

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Abstract

本発明は、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)活性を有し、例えば脂質代謝改善剤などとして有用な蛋白質(酵素)を有効成分とする医薬組成物、該MGAT活性を阻害乃至促進する候補物質のスクリーニング系などを提供するものであり、該医薬組成物は(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列のポリペプチドおよび／または(b)上記(a)のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ(MGAT)活性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分として製剤学的に許容される担体と共に含有する。　

Description

明 細 書
ジァシルグリセロール産生促進剤 技 術 分 野
本発明は、 モノアシルグリセ口一ルァシルトランスフェラーゼ
(Monoacylglycerol acyltransferase ：以下、 「MGAT」 という）活性を有する酵 素を有効成分とする医薬組成物に関する。 また本発明は、 上記酵素活性を阻害 するかまたは促進する作用を有する化合物および上記酵素の阻害作用または活 性化作用を有する化合物のスクリーニング方法にも関している。
背 景 技 術
食物中に含まれる動植物由来のトリアシルグリセロール (中性脂肪ともいう、 triacylglycero 以下 「丁 AG」 という）は、 小腸において大部分が遊離脂肪酸とモ ノアシルグリセロール (以下 「MAG」 という）とに分解される。 これらは、 残存 する TAGと共に、 小腸上皮細胞に吸収される。 吸収された MAGは、 小腸におい て、 MGAT(monoacylglycerol acyltransferase：以下 「MGAT」 という）の活性に よって、 ァシル CoAからァシル基が転移されて、 ジァシルグリセロール
(diacylglycerol, 以下 「DAG」 という）に変換され、 更に、 ジァシルグリセ口一 ルァシルトランスフェラ一ゼ (diacylglycerol acyltransferase：以下 「DGAT」 と いう）の活性によって、 TAGに再合成される。
このように MGATは、 DGATと共に、 生体内での TAGの合成に関与している。
MGATの活性は、 哺乳類の組織では、 肝臓、 小腸、 脂肪細胞に高く、 特に小腸 では、 該 MGAT活性が食物中の TAGの吸収に深く関わっている。
尚、 上記に従い再合成された TAGは、 食物由来のリン脂質、 コレステロール、 蛋白質などと組合されてカイ口ミクロン (ckylomicron)として、 小腸のリンパ管 に分泌される。 このカイロミクロンは、 小腸リンパ管からリンパ管系に入り、 血管に乳液状で分泌され、 脂肪組織の毛細血管に存在するリポ蛋白リパーゼ (LPL)によって分解され、筋肉などの組織に取り込まれてエネルギーとして消費 される。 エネルギーが足りている時には、 皮下組織、 筋肉、 腸間膜組織などの 脂肪組織に運ばれて脂肪として細胞内に貯蔵される。 一方、 遊離脂肪酸は、 脂 肪組織に運ばれて TAGに変る。一般に、脂肪細胞では、その 99%が TAGに変る。 脂肪組織はこの TAGの貯蔵庫、 即ちエネルギー貯蔵庫としての役割を持つ。
DGATに関しては、 1998年に分子生物学的手法を用いてォ.エルカーズ
(Oelkers)らによりヒト遺伝子が同定された (例えば非特許文献 1参照)。 また、 ケ ィシ一ズ (Cases)らによりマウス遺伝子が同定された (例えば非特許文献 2参 照） 。 2000年にケイシ一ズらのグループは、 さらに DGAT遺伝子を欠損させた マウスを作成した。 このマウスは、 小腸での TAGの吸収、 肝臓からの VLDLの放 出はほぼ正常であり、 一方、 脂肪細胞での TAG蓄積、 脂肪重量の減少、 乳腺か らのミルク分泌の消失を報告している (例えば非特許文献 3参照)。 ケイシーズら の報告は、 DGAT遺伝子産物 (DGAT1)が、 肝、 小腸での DGAT活性に主要な役割 を果たしておらず、 DGAT活性を担う別の遺伝子産物が少なくともひとつ存在 することを示唆している。 実際に、 2001年になって、 ケイシーズらによって DGAT1遺伝子と配列においてホモロジ一のない DGAT活性を担う分子、 DGAT2 遺伝子が同定された (例えば非特許文献 4参照)。さらに彼らは DGAT2遺伝子とホ モロジ一のある遺伝子をデータベース中から複数同定している (DGAT candidate genes(DCファミリ一遺伝子)； DC2力ら DC5)。
哺乳類の MGATに関しては、 活性は確認されているものの、 最近まで分子と しての実態は実質的には捉えられていなかった。 2002年になって、 ェン (Yen) らによって DC2に MGAT活性を担う分子の存在することが示された (MGAT1) (例えば非特許文献 5参照)。 しかしながら、 MGAT1遺伝子は、 マウスでは小腸で の発現が見られないとの報告 (非特許文献 5参照)から、 脂質の消化吸収を考慮す ると小腸での MGAT活性を担う他の分子の存在が考えられ、 当業界において、 小腸での MGAT活性を有する新規な物質の特定が望まれている。
-特許文献 1
国際公開第 WO2000/05367号パンフレット (特表 2002-522018号公報） •非特許文献 1
Oelkers, P., et al., J. Biol. Chem., 273 (41) 26765-71 (1998)
•非特許文献 2
Cases. S" et al., Proc Natl Acad Sci U S A.，95 (22) 13018-23 (1998) -非特許文献 3
Smith, S.J.,et al., Nat. Genet. , 25 (1) 87-90 (2000 )
•非特許文献 4
Cases. S.， et al.,丄 Biol. Chem.， 276 (42) 38870-6 (2001)
·非特許文献 5
Yen. CL, et al. Proc Natl Acad Sci ,USA.， 99 (13) 8512-17 (2002)
以上のように、 MGAT活性を示す新たな蛋白質 (酵素)は、脂質代謝経路におけ る MGATによる調節機能の解明、 また、 MGATが組織特異的に発現していれば、 組織別の脂質代謝機構の解明についての有効な情報を与え得る。 また、 MGAT に対して特異的に阻害活性を有する化合物が見出されれば、 該化合物は医薬候 補化合物として、 肥満、 高脂質血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症、 高脂肪酸 血症、 糖尿病、 動脈硬化症などの治療および予防剤の開発に役立つことが期待 できる。
本発明の目的は、 MGAT活性を示す新たな蛋白質およびこれをコードする遺 伝子、 特に小腸での MGAT活性を担う新規な分子を解明することにある。
本発明の他の目的は、 該 MGAT活性を示す蛋白質 （酵素） を有効成分とする 医薬組成物、 特に DAG産生促進剤を提供することにある。
本発明の他の目的は、該 MGAT活性に対するィンヒビター (阻害剤)またはァク セレレー夕一 (促進剤)をスクリ一ニングする方法、および該 MGAT活性に対する アンタゴニストおよびァゴニストを提供することにある。
発 明 の 開 示
本発明者らは、鋭意研究の結果、 既知の DCファミリ一遺伝子のデータをもと にして、 新たに小腸で発現している一つのヒト遺伝子（ 「MGAT2遺伝子」 と命 名)を単離し、 該遺伝子がコードする蛋白質を発現させると共に、 その発現物が MGAT活性を有し、 DAG産生促進剤として有用であることを確認した。 本発明 はこれらの知見を基礎とし、 更に研究を重ねた結果完成されたものである。 本発明は、 下記項 1-17に示される要旨の発明を提供する。
項 1. 以下の (a)または (b)のいずれかのァミノ酸配列からなるポリペプチドを、 製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物： (a)配列番号： 1で示されるアミノ酸配列、
(b)上記 (a)のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つモノァシルグリセロールァシ ルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を有する。
項 2. 以下の )、 （d)または (e)のいずれかのポリヌクレオチドからなる DNA分子 の発現物を、 製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物：
(c)配列番号： 2で示される DNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記 (c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイプリダイズし 得且つモノァシルグリセ口ールァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を発現 可能なポリヌクレオチド、
(e)上記 (c)のポリヌクレオチドと 80%以上相同する DNA配列を有し且つモノァ シルグリセ口ールァシルトランスフェラーゼ (MGAT)活性を発現可能なポリヌ クレオチド。
項 3. 項 1に記載のポリペプチドおよび項 2に記載の発現物からなる群から選択 される少なくとも 1種を、製剤学的に許容される担体と共に含有するジァシルグ リセロール産生促進剤。
項 4. 項 1に記載のポリペプチドおよび項 2に記載の発現物からなる群から選択 される少なくとも 1種の有効量を、処置を要求される患者に投与するジァシルグ リセロール産生促進方法。
項 5. 項 1に記載のポリペプチドおよび項 2に記載の発現物からなる群から選択 される少なくとも 1種の、 ジァシルグリセロール産生促進剤の製造のための使 用。
項 6. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の (a)または (b)のいずれかのァ ミノ酸配列からなるポリペプチドの酵素活性を測定し、 被験物質の存在下にお ける測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活性を低下させ るインヒビ夕一を選択することを特徴とする、 モノァシルグリセロールァシル トランスフエラ一ゼ (MGAT)活性に対するインヒビターをスクリーニングする 方法：
(a)配列番号： 1で示されるアミノ酸配列、 (b)上記 (a)のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたァミノ酸配列からなり且つモノァシルグリセロールァシ ルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を有する。
項 7. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の (a)または (b)のいずれかのァ ミノ酸配列からなるポリぺプチドの酵素活性を測定し、 被験物質の存在下にお ける測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活性を亢進させ るァクセレレ一夕一を選択することを特徴とする、 モノァシルグリセロールァ シルトランスフエラーゼ (MGAT)活性に対するァクセレレ一夕一をスクリー二 ングする方法：
(a)配列番号： 1で示されるアミノ酸配列、
(b)上記 (a)のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたァミノ酸配列からなり且つモノァシルグリセ口一ルァシ ルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を有する。
項 8. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の (c)、 （d)または (e)のいずれか のポリヌクレオチドからなる DNA分子の発現物の酵素活性を測定し、 被験物質 の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活 性を低下させるインヒビ夕一を選択することを特徴とする、 モノァシルグリセ ロールァシルトランスフェラーゼ (MGAT)活性に対するインヒビ夕一をスクリ 一二ングする方法：
(c)配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレオチド、 得且つモノァシルグリセロ一ルァシルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性を発現 可能なポリヌクレオチド、
(e)上記 (c)のポリヌクレオチドと 80%以上相同する DNA配列を有し且つモノァ シルグリセ口—ルァシルトランスフェラーゼ (MGAT)活性を発現可能なポリヌ クレオチド。
項 9. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の )、 （d)または (e)のいずれか のポリヌクレオチドからなる DNA分子の発現物の酵素活性を測定し、 被験物質 の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活 性を亢進させるァクセレレ一夕一を選択することを特徴とする、 モノァシルグ リセロールァシルトランスフェラーゼ (MGAT)活性に対するアクセレレーター をスクリーニングする方法：
(c)配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレオチド、
(d)上記 (c)のポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件でハイプリダイズし 得且つモノァシルグリセロールァシルトランスフェラ一ゼ (MGAT)活性を発現 可能なポリヌクレオチド、
(e)上記 (c)のポリヌクレオチドと 80%以上相同する DNA配列を有し且つモノァ シルグリセ口一ルァシルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性を発現可能なポリヌ クレオチド。
項 10. 項 1に記載のポリペプチドおよび項 2に記載の発現物からなる群から選ば れる少なくとも 1種を、 モノアシルグリセ口一ルァシルトランスフェラ一ゼ (MGAT)の基質と共に構成成分として含有する、モノァシルグリセロールァシル トランスフェラ—ゼ (MGAT)活性に対するインヒビ夕一をスクリーニングする ためのスクリ一ニング用キット。
項 1 1. 項 1に記載のポリペプチドおよび項 2に記載の発現物からなる群から選ば れる少なくとも 1種を、 モノアシルグリセ口ールァシルトランスフェラーゼ (MGAT)の基質と共に構成成分として含有する、モノァシルグリセ口一ルァシル トランスフェラーゼ (MGAT)活性に対するァクセレレ一ターをスクリーニング するためのスクリーニング用キット。
項 12. 以下の (1) _ (3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルダリ セロールァシルトランスフェラ一ゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用 を有する物質を、 製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物： (1 )配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリべプチドに結合する抗体、 (2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するァンチセンス DNA分子、
(3)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列であって且つ RNAインターフェアランス効果を 有する RNA分子。 項 13. 以下の (1)一 (3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルダリ セロールァシルトランスフェラ一ゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用 を有する物質を、 製剤学的に許容される担体と共に含有するモノアシルグリセ ロールァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性抑制剤：
(1 )配列番号： 1で示されるァミノ酸配列からなるポリべプチドに結合する抗体、
(2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するアンチセンス DNA分子、
(3)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列であつて且つ RNAィンタ一フェアランス効果を 有する RNA分子。
項 14. 以下の (1)— (3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルダリ セロールァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用 を有する物質を、 処置を要求される患者に投与するモノアシルグリセロールァ シルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性の抑制方法：
(1)配列番号： 1で示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドに結合する抗体、
(2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するァンチセンス DNA分子、
(3)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列であって且つ RNAインタ一フェアランス効果を 有する RNA分子。
項 15. 以下の (1) _ (3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルダリ セロールァシルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用 を有する物質の、 モノアシルグリセロールァシルトランスフエラーゼ (MGAT) 活性抑制剤の製造のための使用：
(1)配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドに結合する抗体、
(2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するァンチセンス DNA分子、
(3)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列であって且つ RNAインタ一フェアランス効果を 有する RNA分子。
項 16.配列番号： 3または 6で示されるモノァシルグリセロールァシルトランス フェラーゼ (MGAT)遺伝子の転写領域を除く非翻訳領域および翻訳領域に対す る RNAインターフェアランス効果を有する RNA分子。
項 17. 配列番号： 2または 5で示されるモノァシルグリセロールァシルトランス フェラ一ゼ (MGAT)遺伝子の翻訳領域に対する RNAィン夕一フェアランス効果 を有する RNA分子。
また本発明は、 下記項 18-32に示される発明をも提供する。
項 18.項 6-9のいずれかに記載のスクリーニング方法によってスクリーニング されるかまたは項 10もしくは 11に記載のスクリーニング用キットを用いたスク リーニング方法によって得られる、項 1に記載のポリペプチドの酵素活性または 項 2に記載の発現物の酵素活性に対するインヒビター。
項 19. 項 18に記載のインヒビターを製剤学的に許容される担体と共に含有する 脂質代謝抑制剤。
項 20.肥満症、 高脂質血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症、 糖尿病および動脈 硬化症からなる群から選ばれるいずれかを対象疾患とする項 19に記載の脂質代 謝抑制剤。
項 21.配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドに結合する抗 体。
項 22. 少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA 配列に対するァンチセンス DNA分子。
項 23.肥満症、 高脂質血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症、 糖尿病および動脈 硬化症からなる群から選ばれるいずれかを対象疾患とする項 12に記載の医薬組 成物。
項 24.脂質代謝抑制剤である項 12に記載の医薬組成物。
項 25. 項 18に記載のインヒビターおよび項 12に記載の MGAT活性を阻害または 低下させる作用を有する物質からなる群から選ばれる少なくとも 1種を製剤学 的に許容される担体と共に含有するモノアシルグリセロール増量剤。
項 26. 項 18に記載のインヒビターおよび項 12に記載の MGAT活性を阻害または 低下させる作用を有する物質からなる群から選ばれる少なくとも 1種を製剤学 的に許容される担体と共に含有するァシル CoAコレステロールァシルトランス フェラーゼ阻害剤。
項 27. 項 18に記載のィンヒビターおよび項 12に記載の MGAT活性を阻害または 低下させる作用を有する物質からなる群から選ばれる少なくとも 1種を製剤学 的に許容される担体と共に含有するペルォキシソ一ム増殖因子活性化受容体活 性化剤。
項 28. 項 6-9のいずれかに記載のスクリ一ニング方法によってスクリーニング されるかまたは項 10もしくは 11に記載のスクリ.一ニング用キットを用いたスク リ一二ング方法によつて得られる、 項 1に記載のポリぺプチドまたは項 2に記載 の発現物の酵素活性に対するアクセレレーター。
項 29. 項 28に記載のァクセレレ一夕一を製剤学的に許容される担体と共に含有 する脂質代謝促進剤。
項 30. 皮膚疾患および脱毛疾患からなる群から選ばれるいずれかを対象疾患と する項 29に記載の脂質代謝促進剤。
項 31. 項 28に記載のアクセレレーターを製剤学的に許容される担体と共に含有 するモノァシルグリセロール低下剤。
項 32. 項 28に記載のァクセレレ一夕一を製剤学的に許容される担体と共に含有 するジァシルグリセロールまたはトリアシルグリセロール産生促進剤。
さらに本発明は、 下記項 33および 34に示される態様の発明をも提供する。 項 33. 項 1に記載のポリぺプチド（またはそれらの塩)を含む被検液および標識化 された項 1に記載のポリぺプチド (またはそれらの塩)と項 21に記載の抗体とを 競合的に反応させ、 抗体に結合した標識化された上記ポリペプチド (またはその 塩)の割合を測定することを特徴とする、項 1に記載のポリぺプチドの定量方法。 項 34. 項 1に記載のポリペプチド（またはその塩)を含む被検液と、 担体上に不溶 化した項 21に記載の抗体 (第一抗体)および標識化された項 21に記載の抗体 (第二 抗体)とを同時あるいは連続的に反応させた後、 不溶化した担体上の標識活性を 測定することを特徴とする項 1に記載のポリぺプチドの定量方法。 本明細書におけるアミノ酸、 ペプチド、 塩基配列、 核酸などの略号による表 示は、 IUPAC-IUBの規定 UPAC-IUB Communication on Biological
Nomenclature, Eur.丄 Biochem., 138: 9 (1984)〕、 「塩基配列又はアミノ酸配列 を含む明細書等の作成のためのガイドライン」 (特許庁編)および当該分野におけ る慣用記号に従うものとする。
本明細書において遺伝子とは、 2本鎖 DNAのみならず、それを構成するセンス 鎖およびアンチセンス鎖という各 1本鎖 DNAを包含する趣旨であり、その長さに 制限されるものではない。 従って、 本発明の遺伝子 (DNA分子)には、 特に言及 しない限り、 ヒトゲノム DNAを含む 2本鎖 DNA、 cDNAを含む 1本鎖 DNA (センス 鎖)および該センス鎖と相補的な配列を有する 1本鎖 DNA (アンチセンス鎖)並び にこれらの断片のいずれもが含まれる。
また、 本明細書において、 遺伝子 (DNA分子)は、 機能領域の別を問うもので はなく、 発現抑制領域、 コード領域、 リーダ配列、 ェキソンおよびイントロン のいずれか少なくともひとつを含むことができる。
ポリヌクレオチドには、 RNAおよび DNAが含まれる。
DNA分子には、 cDNA、 ゲノム DNAおよび合成 DNAが含まれる。
特定アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレ ォチドには、 それらの断片、 同族体、 誘導体および変異体が含まれる。
ポリヌクレオチドの変異体には、 天然に存在するアレル変異体；天然に存在 しない変異体；欠失、 置換、 付加および挿入がなされた変異体が含まれる。 但 し、 これらの変異体は、 変異前のポリヌクレオチドがコードするポリペプチド の機能を実質的に変更しないポリヌクレオチドをコードするものとする。 ポリペプチドの変異 (アミノ酸配列の改変)は、天然において生じるもの、例え ば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じるものである必要はなく、 天然由来 の遺伝子 (例えば本発明の MGAT2遺伝子)を利用して人為的に生じさせたもので あってもよい。 上記ポリペプチドの変異体には、 アレル体、 ホモログ、 天然の 変異体などであって、 少なくとも 80%、 好ましくは 95%、 より好ましくは 99% が、 変異前のポリペプチドと相同するものが含まれる。
なお、 ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの相同性は、 既知の配列分析ソ フトウエア、例えば FASTAプログラムを使用した測定 (Clustal, V.， Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994)によって解析でき、また SWISSPLOTSによって解析す ることができる。 本明細書における相同性の値は、 上記 FASTAプログラムを用 いた測定法によるものとする。 該相同性検索において最も好ましく簡便な方法 は、 コンピュータ一により読取り可能な媒体 (例えば、 フロッピ一ディスク、
CD-ROM,ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブおよび DVD)中に配 列を記憶させ、 ついでその記憶された配列を使用して、 よく知られた検索手段 で配列デ一夕ベースを検索することである。 公的なデータベースの具体例には 以下のものが含まれる。
· DNA Database of Japan (DDBJ) (http://www.ddbj. nig.ac.jp/);
• Genebank ihttp://www.ncbi.nlm. nih.pov/web/Genebank/lndex.htlm); および
• the European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html)。
多数の種々の検索アルゴリズムが当業者に利用可能であり、その一例として、 BLASTプログラムと称されるプログラム 1式が挙げられる。 5つの BLAST手段が あり、 そのうちの 3っはヌクレオチド配列の照会用に設計されたものであり (BLASTN BLASTXおよび BLASTX)、 2つはアミノ酸配列の照会用に設計され たものである (BLASTPおよび 1"BLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birrenら， Genome Analysis, 1 : 543-559 (1997))。
追加的なプログラム、 例えば配列ァライメントプログラム、 より遠縁の配列 を同定するためのプログラムなどが、 同定された配列の分析のために当技術分 野において利用可能であり、 当業者によく知られている。
前記ポリヌクレオチドの変異体は、 これによりコードされるアミノ酸置換に ついてサイレントまたは保存変異体を意味し、 塩基配列によってコードされる アミノ酸残基が変らない塩基配列の変異を表わす。 保存的なアミノ酸置換の例 は下記表 1に示すとおりである。 表 1
Figure imgf000013_0001
一般にシスティン残基をコードする 1またはそれ以上のコドンは特定のポリ ペプチドのジスフィド結合に影響を与える。
蛋白の特性に変化を与えると一般的に考えられるアミノ酸残基の置換は、 以 下のものである：
a) 親水性残基、 例えば Serまたは Thrの疎水性残基例えば Leu、 lle、 Phe, Val または Alaへの置換、
b) Cysまたは Proの他のアミノ酸残基への置換、
c) 電気的陽性側鎖を有しているアミノ酸残基、 例えば Lys、 Ara, Hisの電気的 陰性残基、 例えば Gluまたは Aspへの置換
d) 非常に大きな側鎖を有しているァミノ酸残基、例えば Pheの Glyのような側鎖 を有しないアミノ酸残基への置換。 (1) 本発明医薬組成物 (ポリペプチド)
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチド (および本発明スク リ一エング方法に利用されるポリペプチド) (以下、 単に 「本発明ポリペプチド」 という）は、 （a)配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列からなる力、、 或いは (b)該 配列番号： 1において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付 加されたアミノ酸配列からなり且つ MGAT活性を有するものである。 該本発明 ポリペプチドは、 例えば、 ヒト細胞、 特にヒト小腸上皮細胞あるいは例えばヒ ト組織、 特に小腸 (十二指腸、 空腸、 回腸)、 肝臓、 大腸を起源として単離された ヒ卜細胞乃至組織由来ポリぺプチドであってもよく、 またそのアミノ酸配列情 報に従って合成して得られるポリペプチドであってもよい。
本発明ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号： 1で表されるものに限定さ れず、 これと一定の相同性を有するものであることができる。 該相同性は、 例 えば約 80%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上であるの がよい。 但し、 かかる一定の相同性を有するアミノ酸配列のポリぺプドは、 配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列のポリぺプチドと実質的に同質の MGAT活性 を有する必要がある。 ここで、 実質的に同質とは、 その活性が性質的に (例えば 生理化学的にまたは薬理学的に)同じであることを示す。 MGAT活性の程度ゃ蛋 白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、 本発明ポリペプチドに含まれる前記 (b)として示す 「配列番号： 1で表 わされるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換 また付加されたアミノ酸配列」 におけるアミノ酸の改変、 即ち 「欠失、 揷入、 置換または付加」 の程度およびそれらの位置は、 改変されたアミノ酸配列のポ リぺプチドが、配列番号： 1で示されるァミノ酸配列からなるポリペプチドと同 質の機能を有する同効物であれば特に制限されない。上記改変の程度は、通常 1 から数個程度であるのが好ましい。 ここで同質とは、 上記した意味である。 ま た前記 (b)に示す本発明ポリペプチドは、 上記した MGAT活性の他に、 例えば蛋 白質の抗原性および免疫原性活性においても、配列番号： 1に示すアミノ酸配列 のポリぺプチドと同質であるのが好ましい。
本発明ポリぺプチドの有する MGAT活性は、 モノァシルグリセロール (MAG) からジァシルグリセロール (DAG)への反応を触媒する作用として把握される か、 またはヒトまたは哺乳動物の脂質代謝において、 特に中性脂肪の蓄積増加 作用として把握される。
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチドの一具体例として は、 後述する実施例に示される 「MGAT2」 と名付けられた PCR産物 (ポリぺプ チド）を挙げることができる。 ヒトの MGAT2遺伝子の DNA配列は、 配列番号： 3 に示すとおりであり（全長 1074 bp)、その ORF(1005 bp)にコードされるアミノ酸 配列は、 配列番号： 1に示すとおり 334アミノ酸配列からなる。 また、 マウスの MGAT2遺伝子の DNA配列は、 配列番号： 6に示すとおりであり（全長 1728 bp)、 その ORF(1005 bp)にコードされるアミノ酸配列は、 配列番号： 4に示すとおり 334アミノ酸配列からなる。 ヒト MGAT2は小腸、 肝臓および大腸にその遺伝子 の発現が認められ、 マウス MGAT2遺伝子は、 小腸の吸収上皮に特異的な発現が 観察される。
尚、 ヒト MGAT2遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列は、 特許文献 1 の段落番号【0223】 から 【0226】 にクローン番号 HP02485として開示されたク ローン (ヒト胃癌 cDNAライブラリ一由来)の ORFにコードされるァミノ酸配列 と一致する。 しかるに、該文献 1の記述によれば、 このクローンの ORFがコード するアミノ酸配列の蛋白質は、 膜貫通型蛋白と推定され、 線虫仮想蛋白質 W01A11.2 (GenBankァクセッション番号 U64852)とアミノ酸配列において 45.5%の類似性を示すものである。 しかるに、 特許文献 1には、 この推定アミノ 酸配列の蛋白質に関して、 これを単離したことも開示されていなければ、 この 蛋白質の特定の用途や有用性などに関する記載も皆無である。
本発明者らは、 MGAT2が MGAT活性を有し、 それ故、 本明細書に開示する、 例えば DAG産生促進剤、 TAG産生促進剤などの新たな医薬用途、 殊に脂質低下 によって生じる各種疾患症状、 例えば皮膚疾患、 脱毛症、 低リポタンパク血症、 癌などの、 宿主増殖により生体エネルギーが異化亢進している患者などへの脂 質代謝促進剤として使用できるという事実を初めて見出したものである。
(2) 本発明医薬組成物 (DNA分子の発現物）
本発明医薬組成物において有効成分とする DNA分子の発現物 (および本発明 スクリーニング方法に利用する同発現物) (以下、 単に 「発現物」 という)は、 （c) 配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレオチド、 （d)上記 (c)のポリヌクレ ォチドとストリンジェントな条件でハイブリダィズし得且つ MGAT活性を発現 可能なポリヌクレオチドまたは (e)上記 (c)のポリヌクレオチドと 80%以上、好ま しくは 95%以上、 相同する DNA配列を有し且つ MGAT活性を発現可能なポリヌ クレオチドのいずれかのポリヌクレオチドからなる DNA分子を保有させた形質 転換体から得ることができる。 該形質転換体は、 上記所定の MGAT活性を発現 可能な DNA分子を適当な起源ベクターに導入して得られる組換え体発現べクタ 一にて、 適当な宿主を形質転換することにより得られる。 該形質転換体の保有 する、 MGAT活性を発現可能な DNA分子 (ポリヌクレオチド)の一具体例としては 配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレオチドを挙げ: δことができる。 他のポリヌクレオチドには、 上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条 件でハイプリダイズし得且つ MGAT活性を発現可能なポリヌクレオチドが包含 される。 ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 0.1 %SDSを含む 0.1 X SSC 中、 50°Cの条件または 0.1 %SDSを含む 0.2XSSC中、 60°Cの条件を挙げること ができる。
更に他のポリヌクレオチドには、 上記ポリヌクレオチドと 80%以上、 好まし くは 95%以上、より好ましくは約 98%以上、相同する DNA配列を有し且つ MGAT 活性を発現可能なポリヌクレオチドが含まれる。
これらのポリヌクレオチドにおける 「MGAT活性を発現可能」 とは、 これら の DNA配列が挿入された組換え体発現べクタ一にて形質転換された形質転換体 が、その発現産物として MGAT活性を有する物質を発現できることを意味する。 なお、 MGAT活性は、 それ自体公知の方法、 例えば MAGおよびァシル CoAを 本発明ポリペプチドまたは本発明発現物と接触させ、 生産される DAG量を測定 することにより求められる。 MGAT活性の測定は、 文献記載の方法に従うこと ができる (例えばェン (Yen)らの方法 (Proc. Natl. Acad. Scに USA., 99 (13), 8512-8517 (2002)参照)。 (3) 本発明医薬組成物 (アン夕ゴニストおよびァゴニスト)
本発明は、 本発明ポリペプチドまたは発現物の酵素活性を阻害するかまたは 低下させる作用を有する物質 (MGAT2遺伝子発現物に対するアンタゴニスト）を 提供する。 該アン夕ゴニストには、 MGAT2遺伝子を保有する形質転換体から得 られる発現物に対する抗体、 MGAT2遺伝子のアンチセンス DNA、 MGAT2遺伝 子に相当する 2本鎖 RNAに対してインターフェアランス効果を有する RNAなど が包含される。
該アン夕ゴニストは、 DAGまたは TAGの産生が過剰となることによって生じ ると考えられる疾患に対して MGAT活性阻害剤として有用である。該疾患には、 より具体的には、 高脂質血症、 高脂肪血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症など が含まれる。従って上記アンタゴニストは、 脂質代謝抑制剤として有用である。 また肥満、 糖尿病、 動脈硬化症などに対する治療剤としても有用である。 更に、 該アンタゴニス卜は、 MAG増量剤としても利用可能であり、 ァシル CoAコレス テロ一ルァシルトランスフェラーゼ阻害剤またはペルォキシソ一ム増殖因子活 性化受容体活性化剤としても利用可能である。
本発明は、 また本発明ポリペプチドまたは発現物の酵素活性を宂進乃至増強 する作用を有する物質 (MGAT2遺伝子発現物に対するァゴニスト)をも提供す る。
該ァゴニストは、 DAGまたは TAGの産生が不足することによって生じると考 えられる疾患、 より具体的には、 脱毛症、 低リポ蛋白血症、 癌のようなェネル ギー代謝が亢進状態にある疾患に対して、 MGAT活性促進剤として有用である。 即ち、 該ァゴ二ストは、 MAG低下剤、 DAGまたは TAG産生促進剤などの脂質代 謝促進剤として利用できる。
以上のように、 本発明によって見出された MGAT2遺伝子の発現物と MGAT活 性との関連の解明は、 肥満、 脂質代謝異常などの各種病理状態の解明、 把握、 診断、 予防、 治療などに関する有用な情報乃至手段を与える。
(4) 本発明ポリペプチドをコードする遺伝子
以下、 本発明ポリペプチドをコードする遺伝子 (以下「本発明遺伝子」 という） にっき詳述する。
本発明遺伝子は、具体的には配列番号： 1で示されるアミノ酸配列をコードす る配列番号： 2の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子、 または該配 列番号： 2で示される塩基配列の相補鎖を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子 として示される。 本発明遺伝子は、 特にこれらに限定されることなく、 例えば、 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列において一定の改変を有するアミノ酸配列 をコードする遺伝子、配列番号： 1で示されるアミノ酸配列と一定の相同性を有 するアミノ酸配列をコードする遺伝子、配列番号： 2で示される塩基配列と一定 の相同性を有する塩基配列の遺伝子であることができる。 ここで 「一定の相同 性を有する」 とは、 アミノ酸配列および塩基配列において、 少なくとも 80%、 好ましくは 95%以上、 より好ましくは 98%以上、 最も好ましくは 99%以上、 の 同一性を有することをいう。
本発明遺伝子の改変体には、 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列において 1 または数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたアミノ酸配列 (改変 されたアミノ酸配列)をコードする DNA配列を含む遺伝子が包含される。 ここ で、 「アミノ酸の欠失、 揷入、 置換または付加」 の程度およびそれらの位置は、 改変された蛋白質が、 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質 (MGAT2蛋白）と同様の機能を有する同効物であれば特に制限されない。また「同 様の機能」 とは、 MGAT活性、 即ち MAGから DAGへの反応を触媒する作用、 結 果としての DAG産生促進作用または TAG増加作用あるいは脂肪組織などへの脂 質蓄積作用を意味する。 なお、 上記改変されたアミノ酸配列をコードする遺伝 子は、 その利用によって改変前のアミノ酸配列をコードする本発明遺伝子が検 出できるものであってもよい。
配列番号： 1で示されるアミノ酸配列と一定の相同性を有する塩基配列の遺伝 子 (MGAT2遺伝子の相同物)とは、 MGAT2遺伝子と配列相同性を有し、構造的特 徵並びに遺伝子発現パターンにおける共通性および生物学的機能の類似性よ り、 ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味する。 こ れには MGAT2遺伝子のァレル体 (対立遺伝子)も当然含まれる。
アミノ酸配列の改変 (変異)などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の 修飾などにより生じることがある。 また天然由来の遺伝子 (例えば本発明のヒト MGAT2遺伝子)を人為的に改変することもできる。 本発明遺伝子は、 このよう な改変、 変異の原因および手段を問わず、 上記特性を有する全ての改変遺伝子 を包含する。
上記の人為的手段としては、 例えばサイトスべシフィック ·ミュー夕ゲネシ ス (Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100， 468 (1983)； Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座 1 「遺伝子研究法 II」 、 日本生化学会編，p105 (1986)〕 などの遺伝子工学的手法、 リン酸トリエステル 法、 リン酸ァミダイト法などの化学合成手段 〔丄 Am. Chem. Soc.， 89， 4801 (1967)；同 91 , 3350 (1969)； Science, 150, 178 (1968)； Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981 ) ;同 24， 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。 より具体的には、 DNAの合成は、 ホスホルアミダイト法、 トリエステル法など の化学合成に従うこともでき、 市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装 置を用いて実施することもできる。 二本鎖靳片は、 相補鎖を合成し、 適当な条 件下で該鎖を、 化学合成した一本鎖とァニ一リングさせるか、 または適当なプ ライマ一配列と共に DNAポリメラーゼを用いて、 上記相補鎖を、 化学合成した 一本鎖に付加することによつて合成することができる。
本発明遺伝子 (例えばヒト MGAT2遺伝子)の具体的態様としては、配列番号： 2 に示される塩基配列からなるものを例示できる。 この DNA配列は、配列番号： 1 に示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドの各ァミノ酸残基を示すコドン の一つの組合せ例を示している。 本発明遺伝子は、 かかる特定の塩基配列から なる DNA分子に限らず、 各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、 選択 した DNA配列を有することも可能である。 コドンの選択は、 常法に従うことが できる。 例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮してコドンを選択す ることができる 〔Ncleic Acids Res.， 9，43 (1981)〕 。 本発明遺伝子は、 前記したとおり、配列番号： 2で示される DNA配列と一定の 相同性を有する DNA配列からなるポリヌクレオチドおよびその相補鎖を包含す る。 該一定の相同性を有する DNA配列からなるポリヌクレオチドは、 配列番号 ： 2で示される塩基配列と少なくとも 80%の同一性、 好ましくは少なくとも 95 %の同一性、 さらに好ましくは少なくとも 99%の同一性、 を有するポリヌクレ ォチドを言う。
(5) 本発明ポリペプチドをコードする遺伝子の製造
本発明遺伝子は、 本明細書に開示された本発明遺伝子の具体例についての配 列情報に基いて、 一般的遺伝子工学的手法により容易に製造することができる
[Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実 験講座 「遺伝子研究法 I、 II、 III」 、 日本生化学会編 (1986)など参照〕 。
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従って cDNA ライブラリ一を調製し、 該ライブラリーから本発明遺伝子に特有の適当なプロ —ブゃ抗体を用いて所望クローンを選択することにより製造することができる CProc. Natl. Acad. Sci., USA., 78， 6613 (1981)； Science, 222, 778 (1983)など 参照〕 。
上記において、 cDNAの起源としては、 本発明遺伝子を発現する各種細胞、組 織、 これらに由来する培養細胞などを例示することができる。 これら起源から の全 RNAの分離、 mRNAの分離および精製、 cDNAの取得とそのクロ一ニングな どは、 いずれも常法に従って実施することができる。 mRNAまたは cDNAライブ ラリーは市販されてもおり、 本発明においては、 それら市販の mRNAまたは cDNAライブラリー、 例えばクローンテック社 (Clontech Lab.lnc.)などより巿販 の各種 mRNAまたは cDNAライブラリー、 特にヒ卜の小腸の mRNAまたは cDNA ライブラリーを用いることもできる。
本発明遺伝子を cDNAライブラリ一からスクリ一二ングする方法も、特に制限 されず、 通常の各種の方法に従うことができる。 具体的方法としては、 例えば cDNAによって産生される蛋白質に対して該蛋白質の特異抗体を使用した免疫 的スクリーニングを行って、 対応する cDNAクローンを選択する方法、 目的の DNA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダィゼーショ ン法、 コロニーハイブリダィゼーシヨン法など、 およびこれらの組合せを例示 することができる。
上記方法において用いられるプローブとしては、 本発明遺伝子の DNA配列に 関する情報をもとにして化学合成された DNAなどが一般的である。 また、 既に 取得された本発明遺伝子およびその断片も上記プローブとして利用することが できる。 更に、 本発明遺伝子の DNA配列情報に基づき設定したセンス ·プライ マーおよびアンチセンス ·プライマ一を、 スクリーニング用プローブとして用 いることもできる。
プローブとして用いられるヌクレオチドは、配列番号： 2に対応する部分ヌク レオチドであって、 少なくとも 15個の連続した DNA、 好ましくは 100個以上の 連続した DNA、 より好ましくは 150個以上の連続した DNA、 更により好ましく は 200個以上の連続した DNAを有するものである。 本発明遺伝子の製造のため の陽性クローンそれ自体もこのプローブとして用いることができる。
本発明遺伝子の取得に際しては、 PCR法 [Science, 230， 1350 (1985)〕 によ る DNAZRNA増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリ一から全長の cDNA が得難いような場合には、 RACE法 [Rapid amplification of cDNA ends；実験医 学、 12(6)， 35 (1994)〕、特に 5'-RACE法〔M.A. Frohman, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕 などを採用するのが好適である。
PCR法の実施に用いられるプライマ一は、 本発明によって明らかにされた本 発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、 これは常法に従って合成でき る。 また、 PCR法によって増幅させた DNA/RNA断片の単離、 精製は、 常法に従 い、 例えばゲル電気泳動法などによることができる。
上記方法に従い得られる本発明遺伝子或いは各種 DNA断片は、 常法、 例えば ジデォキシ法 〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)] 、 マキサム-ギル バ一ト法 CMethods in Enzymology, 65，499 (1980)〕 などに従って、 また簡便に は市販のシークェンスキットなどを用いて、 その DNA配列を決定することがで さる。 (6)本発明遺伝子の利用 m
本発明遺伝子の一部または全部の DNA配列は、 これを利用して、 個体もしく は各種組織における本発明遺伝子 (MGAT遺伝子)の発現の有無を特異的に検出 することができる。
この検出は常法に従って実施できる。 より具体的には、 該検出は、 例えば RT-PCR [Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al.， Amplification of RNA. In PGR Protocol, A Guide to methods and
applications, Academic Press, Inc.'SanDiego, 21-27 (1991)〕 による RNA増幅、 ノーザンブロッティング解析 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)] 、 in situ RT-PCR CNucl. Acids Res., 21 , 3159-3166 (1993)3 、 in situ ハイプリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定法、 NASBA法
[Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350， 91 -92 (1991)〕 およ びその他の各種方法に従って実施することができる。 より好適な検出法として は、 RT-PCRによる検出法を挙げることができる。
PCR法を採用する検出に用いられるプライマーは、 本発明遺伝子のみを特異 的に増幅できる該遺伝子に特有のものである限り特に制限はない。 このプライ マーは、 本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。 通常、 該プライマ一は、 10-40ヌクレオチド程度、 より好ましくは 15-30ヌクレオチド 程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列である。 本発明遺伝子には、 本発 明にかかるヒ卜 MGAT2遺伝子を検出するための特異プライマーおよび Zまた は特異プローブとして使用される DNA断片もまた包含される。
当該 DNA断片は、 配列番号： 2で示される塩基配列からなる DNAとストリン ジェントな条件下でハイプリダイズする DNAとして規定することできる。 ここ で、 ストリンジェン卜な条件は、 プライマーまたはプローブが用いられる通常 の条件である。 例えば、 該条件としては、 0.1 %SDSを含む 0.1 X SSC中、 50°C の条件または 0.1 %SDSを含む 0.2 X SSC中、 60°Cの条件を例示することができ る。 ZL 本発明遺伝子の利用 (2) 本発明遺伝子は、 これを利用して通常の遺伝子工学的手法に従って、 本発明 遺伝子の発現物 (蛋白質)またはこれを含む蛋白質を、容易に、大量に且つ安定し て製造することができる。
本発明は、 本発明遺伝子によってコ一ドされる蛋白質、 該蛋白質の製造のた めの、 例えば本発明遺伝子を含有するベクター、 該ベクターによって形質転換 された ft主細胞、該宿主細胞を培養して本発明発現物 (ポリぺプチド)を製造する 方法などをも提供する。
本発明ポリぺプチドの具体的一態様としては、配列番号： 1で示されるァミノ 酸配列からなるポリペプチド（ヒト MGAT2蛋白質)を挙げることができる。 本発 明ポリペプチドには、 該 MGAT2蛋白質のみならず、 その相同物も包含される。 該相同物としては、 配列番号： 1で示されるアミノ酸配列において 1もしくは複 数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり且 つ MGAT活性を有する蛋白質を挙げることができる。 MGAT活性の例としては、 MAGから DAGへの反応を触媒する酵素作用、結果として DAG産生促進作用また は TAG増加作用あるいは脂質蓄積作用を例示できる。具体的には、 ヒト MGAT2 遺伝子の相同物 (アレル体を含むヒト MGAT2同等遺伝子)の遺伝子産物を挙げる ことができる。
本発明ポリペプチドの相同物には、 また、 配列番号： 1に示されるアミノ酸配 列の MGAT2蛋白質と同一活性を有する、 酵母、 線虫、 植物組織、 哺乳動物の蛋 白質も含まれる。 哺乳動物としては、 例えばヒト、 ゥマ、 ヒッジ、 ゥシ、 ィヌ、 サル、 ネコ、 クマ、 ラット、 ゥサギなどを例示できる。
(8)本発明ポリぺプチド ί発現物)の遺伝子工学的製造
本発明ポリぺプチド (発現物)は、本発明により提供される遺伝子の配列情報に 基づいて、 通常の遺伝子組換え技術 〔例えば、 Science, 224， 1431 (1984)；
Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)； Proc. Natl. Acad. Sci" USA., 80, 5990 (1983)など参照〕 に従って調製することができる。
該方法は、 より詳細には、 所望の蛋白質をコードする遺伝子が宿主細胞中で 発現できる組換え DNA (発現ベクター)を作成し、 これを宿主細胞に導入して形 質転換し、 該形質転換体を培養し、 次いで得られる培養物から目的蛋白質を回 収することにより行われる。
宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。 例えば原核生物の宿主としては、 大腸菌、 枯草菌などの一般的に用いられるも ののいずれでもよぐ好適には大腸菌、とりわけェシエリヒア，コリ（Escherichia coli)K12株を例示できる。真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 酵母などの細胞 が含まれる。 前者としては、 例えばサルの細胞である COS細胞 〔Cell，23: 175 (1981)〕 、 チャイニーズ'ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダク 夕一ゼ欠損株 CProc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)] などが、 後者と しては、 サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。 勿論、 これらに 限定される訳ではない。
原核生物細胞を宿主とする場合は、 該宿主細胞中で複製可能なベクターを用 いて、 このべクタ一中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプ 口モーターおよび SD (シャイン ·アンド ·ダルガーノ)配列、 更に蛋白合成開始 に必要な開始コドン (例えば ATG)を付与した発現プラスミドを好適に利用でき る。 上記べクタ一としては、 一般に大腸菌由来のプラスミド、 例えば pBR322、 pBR325、 pUC12、 PUC13などがよく用いられるが、 これらに限定されず既知 の各種のベクタ一を利用することができる。 大腸菌を利用した発現系に利用さ れる上記ベクターの市販品としては、 例えば pGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech社)、 pMAL-C2, pMAし P2(New England Biolabs社)、 pET21 , p ET21 /lacq (I n vitrogen¾) pBAD/His(lnvitrogen社)などを例示できる。
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現べクタ一としては、 通常、 発現しょう とする本発明遺伝子の上流に位置するプロモータ一、 RNAのスプライス部位、 ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、 これは更 に必要により複製起点を有していてもよい。 該発現べクタ一の例としては、 具 体的には、 例えば SV40の初期プロモー夕一を保有する pSV2dhfr 〔Mol. Cell. Biol., 1 : 854 (1981 )] などが例示できる。 上記以外にも既知の各種の市販べクタ —を用いることができる。 動物細胞を利用した発現系に利用されるべクタ一の 市販品としては、 例えば pEGFP-N, pEGFP-C(Clontrech社)、 plND(lnvitrogen 社)、 pcDNA3.1/His(lnvitrogen社)などの動物細胞用ベクター、 pFastBac HT(Gibc旧 RL社)、 pAcGHLT(PharMingen社)、 pAc5 V5-His, pMT/V5-His, pMT/Bip/V5-his (以上 Invitrogen社)などの昆虫細胞用ベクタ一などが挙げられ る。
また、 酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、 例えば 酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを有する pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕 などが例示できる。 市販の酵母細胞用発現べク 夕一には、 例えば pPに Z(lnvitrogen社)、 pPICZ (Invitrogen社)などが含まれる。 プロモータ一としても特に限定なく、 エツシエリヒア属菌を宿主とする場合 は、 例えばトリプトファン (trp)プロモーター、 Ippプロモー夕一、 lacプロモータ 一、 recAプロモーター、 P PRプロモータ一などを好ましく利用できる。 宿主 がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモータ一、 SP02プロモーター、 penP プロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、 例えば pH05プロモータ一、 PGKプロモーター、 GAPプロモ一ター、 ADHプロモ 一ターなどを好適に利用できる。 また、 動物細胞を宿主とする場合の好ましい プロモーターとしては、 SV40由来のプロモータ一、 レトロウイルスのプロモー タ一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒ一卜ショックプロモ一夕一、 サイト メガロウィルスプロモータ一、 SR aプロモーターなどを例示できる。
尚、 本発明遺伝子の発現べクタ一としては、 通常の融合蛋白発現ベクターも 好ましく利用できる。 該ベクタ一の具体例としては、 ダルタチオン- S-トランス フェラ一ゼ (GST)との融合蛋白として発現させるための pGEX(Promega社)な どを例示できる。
成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリぺプチドの発現および 分泌を助けるポリヌクレオチド配列として、 分泌配列、 リーダ配列などが、知ら れている。 本発明ポリペプチドの製造には、 このような配列を利用することも できる。 また、 本発明ポリペプチドの製造には、 細菌宿主に対して融合成熟ポ リぺプチドの精製に使用されるマーカー配列 (へ'キサヒスチジン'タグ、 ヒスチ ジン 'タグ)、 哺乳動物細胞の場合はへマグルチニン (HA) ·タグなどを利用する こともできる。 所望の組換え DNA (発現ベクター)の宿主細胞への導入法およびこれによる形 質転換法としては、 特に限定されず、 一般的な各種方法を採用することができ る。
形質転換体は、 常法に従い培養できる。 該培養により所望の通りに設計され た遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、 形質転換体の細胞内、 細胞外また は細胞膜上に発現、 生産 (蓄積、 分泌)される。
培養に用いられる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種 のものを適宜選択利用できる。 培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施す ることができる。
得られる本発明組換え蛋白質 (本発明ポリペプチド)は、所望により、その物理 的性質、 化学的性質などを利用した各種の分離操作 〔 「生化学データーブック II」 、 1175-1259頁、 第 1版第 1刷、 1980年 6月 23日株式会社東京化学同人発行 ； Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参 照〕 により分離、 精製できる。
該方法としては、 具体的には、 通常の再構成処理、 蛋白沈澱剤による処理 (塩 析法)、 遠心分離、 浸透圧ショック法、 超音波破砕、 限外濾過、 分子篩クロマト グラフィ一 (ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ ―、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー (HPLC)な どの各種液体クロマトグラフィー、 透析法、 これらの組合せが例示できる。 特 に好ましい方法としては、 本発明ポリペプチドに対する特異的な抗体を結合さ せたカラムを利用したァフィ二ティクロマトグラフィーなどを例示することが できる。
本発明ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の設計に際しては、配列番号： 2で示 される MGAT2遺伝子の DNA配列を好適なものとして利用することができる。該 遺伝子は、 所望により、 各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用 することも可能である。
(9 本発明ポリペプチドの化学合成
本発明ポリペプチドは、 配列番号： 1に示すアミノ酸配列情報に従って、 一般 的な化学合成法により製造することができる。 該方法には、 通常の液相法およ び固相法によるべプチド合成法が包含される。
ペプチド合成法は、 より詳しくは、 アミノ酸配列情報に基づいて、 各ァミノ 酸を 1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズェロンゲ ーシヨン法と、 アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、 次いで各フ ラグメントを力ップリング反応させるフラグメント ·コンデンセ一ション法と を包含する。 本発明ポリペプチドの合成は、 そのいずれによってもよい。 ペプチド合成に採用される縮合法も常法に従うことができる。 例えばアジド 法、 混合酸無水物法、 DCC法、 活性エステル法、 酸化還元法、 DPPA (ジフエ二 ルホスホリルアジド)法、 DCC +添加物 (添加物； 1 -ヒドロキシベンゾトリァゾー ル、 N-ヒドロキシサクシンアミド、 N-ヒドロキシ -5-ノルポルネン -2, 3-ジカル ポキシイミドなど)法、 ゥッドワード法などに従うことができる。
これら各方法に利用される溶媒も、 この種ペプチド縮合反応に使用されるこ との知られている一般的なものから適宜選択することができる。 その例として は、 例えばジメチルホルムアミド (DMF)、 ジメチルスルホキシド (DMSO)、 へキ サホスホロアミド、 ジォキサン、 テトラヒドロフラン (THF)、 酢酸ェチルなどお よびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
尚、 上記ペプチド合成反応に際して、 反応に関与しないアミノ酸乃至べプチ ドにおける力ルポキシル基は、 一般にはエステル化により、 例えばメチルエス テル、 ェチルエステル、 第 3級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、 例 えばベンジルエステル、 P-メトキシベンジルエステル、 P-ニトロべンジルエス テルなどのァラルキルエステルなどとして保護することができる。
また、 側鎖に官能基を有するアミノ酸、 例えばチロシン残基の水酸基は、 ァ セチル基、 ベンジル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 第 3級ブチル基などで保 護してもよいが、 必ずしもかかる保護を行う必要はない。 更に、 例えばアルギ ニン残基のグァニジノ基は、 ニトロ基、 トシル基、 P-メトキシベンゼンスルホ ニル基、 メチレン- 2-スルホニル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 イソポル二 ルォキシカルポニル基、 ァダマンチルォキシカルポニル基などの適当な保護基 により保護することができる。 保護基を有するアミノ酸、 ペプチドおよび最終的に得られる本発明ポリぺプ チドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、 慣用される方法、 例えば接触 還元法や、 液体アンモニア Zナトリウム、 フッ化水素、 臭化水素、 塩化水素、 トリフルォロ酢酸、 酢酸、 蟻酸、 メタンスルホン酸などを用いる方法などに従 つて実施することができる。
かくして得られる本発明ポリペプチドは、 前記した各種の方法、 例えばィォ ン交換樹脂、 分配クロマトグラフィー、 ゲルクロマトグラフィー、 向流分配法 などのぺプチド化学の分野で汎用される方法に従つて、 適宜精製することがで きる。
(10) 本発明ポリペプチドに対する抗体
本発明ポリペプチドは、 これに対する特異抗体を作成するための免疫抗原と しても好適に利用することができる。 この抗原を利用することにより、 所望の 抗血清 (ポリクローナル抗体)およびモノクローナル抗体を取得することができ る。
抗体の製造法自体は、 当業者によく理解されているところである。 本発明抗 体の製造もこれらの常法に従うことができる 〔例えば、 続生化学実験講座 「免 疫生化学研究法」 、 日本生化学会編 (1986)など参照〕 。
得られる抗体は、例えば MGAT2などの本発明ポリペプチドの精製およびその 免疫学的手法による測定、識別などに利用することができる。 より具体的には、 本発明遺伝子の発現は小腸、 大腸、 肝臓などの組織において確認されているこ とから、 該抗体は、 これら組織中での MGAT濃度の測定に利用することができ る。
また、 該抗体または該抗体の断片は、 前述したように、 例えば MGAT2との結 合を介して MGAT2の MGAT活性を阻害または低下させる作用を発揮する物質 (アンタゴニスト）として有用である。即ち、本発明ポリペプチドに対する抗体は、 DAG産生を抑制し、 結果として TAG産生を抑制することができ、 ひいては脂肪 組織などへの脂質蓄積を抑制することができる。 また、 上記抗体またはその断 片の利用によれば、 MAGから DAGへの反応を触媒する作用を抑制することかで き、 その結果として、 生体内の MAGを増加させ、 ァシル CoAコレステロールァ シルトランスフェラ一ゼの阻害やペルォキシソ一ム増殖因子活性化受容体の活 性化を行うことが期待できる。
更に、 本発明ポリペプチドに対する抗体は、 例えば野生型 MGAT2および Zま たは変異型 MGAT2の測定に利用することもできる。 従って、 本発明は、 本発明 ポリぺプチドに対する抗体を利用した野生型 MGAT2および Zまたは変異型 MGAT2の測定法をも提供する。
該測定法によって、 変異型 MGAT2に関して、 MGAT活性の程度、 脂質代謝障 害の程度、 ァシルグリセロール生合成経路の機能障害の程度、 あるいは高脂質 血症乃至リポタンパク代謝障害の重症度の程度などを、野生型 MGAT2に対する 変化の程度に基づいて検出することも可能である。 かかる変化は、 この分野に おける慣用技術に従い MGAT2遺伝子の DNA配列分析によっても決定できるが、 好ましくは、抗体 (ポリク口一ナルまたはモノク口一ナル抗体)を用いて、 MGAT2 中のアミノ酸配列の相違または MGAT2自体の有無として検出することができ る。
本発明抗体を利用した測定法の具体例としては、 例えば MGAT2抗体を用い て、 ヒトより採取した生体材料試料含有溶液から MGAT2蛋白質を免疫沈降させ るか、或いは生体材料試料含有溶液の MGAT2蛋白質を直接ポリアクリルアミド ゲルのウェスタン'ブロットまたはィムノブロット上で MGAT2抗体と反応させ ることができる。 また、 MGAT2抗体は、 免疫組織化学的技術を用いてパラフィ ンまたは凍結組織切片中の MGAT2を検出することもできる。
野生型 MGAT2またはその突然変異体を検出する方法に関連するより好まし い具体例としては、 モノク口一ナル抗体および/またはポリクローナル抗体を 用いるサンドイッチ法を含む、 酵素結合ィムノソルベントアツセィ (ELISA)、放 射線免疫検定法 (RIA)、免疫放射線検定法 (IRMA)および免疫酵素法 (IEMA)が含ま れる。
(1 1 ) 本発明医薬組成物の調製
本発明医薬組成物は、 有効成分とする本発明ポリペプチドまたは発現物 (例え ば MGAT2)に特有の前述した作用、 例えば脂質の吸収再合成において重要とさ れる組織である小腸、 肝臓、 大齓 特に小腸に特異的な MGAT活性を促進する 作用、 DAG産生促進作用、 TAG産生促進作用、 脂肪組織などへの脂質蓄積促進 作用を利用して、 各種医療分野において有効である。
本発明医薬組成物の有効成分とするポリペプチド若しくは発現物の奏する MGAT活性を確認する方法としては、 例えば後記実施例に記載されているよう に MGAT2 (MGAT2発現物)に基質としての 2-モノァシルグリセ口ール (MAG)と、 放射線標識したァシル CoAとを反応させ、 合成される標識 DAGの合成量の増加 を測定する方法を挙げることができる。
該方法の一例は次の通りである。即ち、まずサンプルを含む反応液 (180mM ト リス-塩酸 (pH7.5)、 8mM塩化マグネシウム、 1 mg/mlゥシ血清アルブミン (脂肪 酸フリー)、 30 1\/1ォレォィル〇0ん 0.2mM 2-モノォレオイルグリセロール;全量 100 I)を、 37°Cで 10分間反応させ、 反応終了後、 750 lの停止液 (2-プロパノー ル:ヘプタン：蒸留水 = 80:20:2 (v/v)を加えて反応を停止させる。 次いで、 500 I のヘプタンおよび 250 Iの蒸留水を加え、 攪拌、 遠心後、 400 z lの上層をチュ ーブに移し、 減圧下で蒸発乾固する。 これにジェチルエーテルを加え、 脂溶性 の物質を溶解したものを薄層クロマトグラフィ一で展開する。 薄層クロマトグ ラフィ一は、 HPTLCプレート（ガラスプレート）を用い、 ヘプタン:イソプロピル エーテル:酢酸 =30:20:2 (v/v)で展開させる。そして、 MGAT活性の定量のために、 RI標識した基質として、 14C標識ォレオイル CoAまたは14 C標識モノォレオイル グリセロールを反応させて合成された14 C標識ジォレオイルグリセロールの合 成量を BAS-5000ィメ一ジアナライザ一などで測定する。
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチド (発現物)には、その医 薬的に許容される塩もまた包含される。 かかる塩には、 当業界で周知の方法に より調製される、 例えばナトリウム、 カリウム、 リチウム、 カルシウム、 マグ ネシゥム、 ノ リウム、 アンモニゥムなどの無毒性アルカリ金属塩、 アルカリ土 類金属塩、 アンモニゥム塩などが包含される。 更に上記塩には、 本発明ポリべ プチド (発現物)と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も 包含される。 代表的無毒性酸付加塩としては、 例えば塩酸塩、 塩化水素酸塩、 臭化水素酸塩、 硫酸塩、 重硫酸塩、 酢酸塩、 蓚酸塩、 吉草酸塩、 ォレイン酸塩、 ラウリン酸塩、 硼酸塩、 安息香酸塩、 乳酸塩、 リン酸塩、 P-トルエンスルホン 酸塩（トシレート)、 クェン酸塩、 マレイン酸塩、 フマル酸塩、 コハク酸塩、 酒石 酸塩、 スルホン酸塩、 グリコール酸塩、 マレイン酸塩、 ァスコルビン酸塩、 ベ ンゼンスルホン酸塩、 ナプシレートなどが例示される。
本発明医薬組成物は、本発明ポリぺプチド (発現物)およびそれらの塩を活性成 分として、 その薬学的有効量を、 適当な医薬担体ないし希釈剤と共に含有させ て医薬製剤形態に調製される。
該医薬製剤の調製に利用される医薬担体としては、 製剤形態に応じて通常使 用される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 滑沢剤な どの希釈剤或は賦形剤を例示できる。 これらは得られる製剤の投与単位形態に 応じて適宜選択使用される。 特に好ましい医薬製剤は、 通常の蛋白製剤などに 使用される各種の成分、 例えば安定化剤、 殺菌剤、 緩衝剤、 等張化剤、 キレー ト剤、 pH調整剤、 界面活性剤などを適宜使用して調製される。
上記において安定化剤としては、 例えばヒト血清アルブミンや通常のしアミ ノ酸、 糖類、 セルロース誘導体などを例示できる。 これらは単独でまたは界面 活性剤などと組合せて使用できる。 特にこの組合せによれば、 有効成分の安定 性をより向上させ得る場合がある。
レアミノ酸としては、 特に限定はなく、 例えばグリシン、 システィン、 ダル 夕ミン酸などのいずれでもよい。
糖類としても、 特に限定はなく、 例えばグルコース、 マンノース、 ガラクト —ス、 果糖などの単糖類；マンニトール、 イノシ! ル、 キシリ I ルなどの 糖アルコール；ショ糖、 マルト一ス、 乳糖などの二糖類；デキストラン、 ヒド ロキシプロピルスターチ、 コンドロイチン硫酸、 ヒアルロン酸などの多糖類な どおよびそれらの誘導体などを使用できる。
界面活性剤としても、 特に限定はなく、 イオン性および非イオン性界面活性 剤のいずれも使用できる。 その具体例としては、 例えばポリオキシエチレング リコールソルビタンアルキルエステル系、 ポリオキシエチレンアルキルエーテ ル系、 ソルビタンモノァシルエステル系、 脂肪酸グリセリド系などを使用でき る。
セルロース誘導体としても、 特に限定はなく、 メチルセルロース、 ェチルセ ルロース、 ヒドロキシェチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセル口ース、 力ルポキシメチルセルロースナトリウム などを使用できる。
上記糖類の添加量は、有効成分 " g当り約 0.0001 mg程度以上、好ましくは約 0.01-10mg程度の範囲とするのが適当である。 界面活性剤の添加量は、 有効成 分 1 g当り約 0.00001 mg程度以上、 好ましくは約 0.0001 -0.01 mg程度の範囲と するのが適当である。 ヒト血清アルブミンの添加量は、 有効成分 当り約 0.0001 mg程度以上、 好ましくは約 0.001-0.1 mg程度の範囲とするのが適当であ る。 レアミノ酸の添加量は、 有効成分 1 g当り約 0.001-10mg程度とするのが適 当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分 1 g当り約 0.00001 mg 程度以上、 好ましくは約 0.001-0.1 mg程度の範囲とするのが適当である。
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、 広範囲から適宜選択される。 通常、 製剤中に約 0.00001 -70重量％、 好ましくは 0.0001-5重量％程度が含まれ る量とするのが適当である。
本発明医薬製剤中には、 また各種の添加剤、 例えば緩衝剤、 等張化剤、 キレ —ト剤などをも添加することができる。 緩衝剤としては、 ホウ酸、 リン酸、 酢 酸、 クェン酸、 ε -アミノカプロン酸、 グルタミン酸および/またはそれらに対 応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、 カリウム塩、 カルシウム塩、 マグネシ ゥム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)などを例示できる。 等張化 剤としては、 例えば塩ィ匕ナトリウム、 塩化カリウム、 糖類、 グリセリンなどを 例示できる。 またキレート剤としては、 例えばェデト酸ナトリウム、 クェン酸 などを例示できる。
本発明医薬製剤は、 溶液製剤として調製できる他に、 これを凍結乾燥し保存 し得る状態にした後、 用時水、 生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して 適当な濃度に調製される凍結乾燥剤形態とすることも可能である。
本発明医薬製剤の投与単位形態は、 治療目的に応じて適宜選択できる。 その 代表例には、 錠剤、 丸剤、 散剤、 粉末剤、 顆粒剤、 カプセル剤などの固体投与 形態および溶液、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ、 エリキシルなどの液剤投与形態が 含まれる。 これらは更に投与経路に応じて経口剤、 非経口剤、 経鼻剤、 経膣剤、 坐剤、 舌下剤、 軟膏剤などに分類され、 それぞれ通常の方法に従い、 調合、 成 形乃至調製することができる。
例えば、 錠剤の形態に成形するに際しては、 上記製剤担体として例えば乳糖、 白糖、 塩化ナトリウム、 ブドウ糖、 尿素、 デンプン、 炭酸カルシウム、 力オリ ン、 結晶セルロース、 ケィ酸、 リン酸カリウムなどの賦形剤；水、 エタノール、 プロパノール、 単シロップ、 ブドウ糖液、 デンプン液、 ゼラチン溶液、 力ルポ キシメチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メチルセルロース、 ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルポキシメチルセルロースナトリウム、 カルポキシメチルセルロースカルシウム、 低置換度ヒドロキシプロピルセル口 —ス、 乾燥デンプン、 アルギン酸ナトリウム、 カンテン末、 ラミナラン末、 炭 酸水素ナトリウム、 炭酸カルシウムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビ タン脂肪酸エステル類、 ラウリル硫酸ナトリウム、 ステアリン酸モノグリセリ ドなどの界面活性剤； 白糖、 ステアリン、 カカオバター、 水素添加油などの崩 壊抑制剤；第 4級アンモニゥム塩基、 ラウリル硫酸ナトリゥムなどの吸収促進剤 ；グリセリン、 デンプンなどの保湿剤、 デンプン、 乳糖、 カオリン、 ベントナ イト.、 コロイド状ケィ酸などの吸着剤；精製タルク、 ステアリン酸塩、 ホウ酸 末、 ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、 例えば糖衣錠、 ゼラチン被 包錠、 腸溶被錠、 フィルムコーティング錠とすることができ、 また二重錠ない しは多層錠とすることもできる。
丸剤の形態に成形するに際しては、 製剤担体として例えばブドウ糖、 乳糖、 デンプン、 カカオ脂、 硬化植物油、 カオリン、 タルクなどの賦形剤；アラビア ゴム末、 トラガント末、 ゼラチン、 エタノールなどの結合剤； ラミナラン、 力 ンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
カプセル剤は、 常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製 剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、 軟質カプセルなどに充填して調整さ れる。 経口投与用液体投与形態は、 慣用される不活性希釈剤、 例えば水、 を含む医 薬的に許容される溶液、 ェマルジヨン、 懸濁液、 シロップ、 エリキシルなどを 包含し、 更に湿潤剤、 乳剤、 懸濁剤などの助剤を含ませることができ、 これら は常法に従い調製される。
非経口投与用の液体投与投与形態、 例えば滅菌水性乃至非水性溶液、 ェマル ジョン、 懸濁液などへの調製に際しては、 希釈剤として例えば水、 ェチルアル コール、 プロピレングリコ一ル、 ポリエチレングリコール、 エトキシ化イソス テアリルアルコール、 ポリォキシ化ィソステアリルアルコール、 ポリオキシェ チレンソルビ夕ン脂肪酸エステルおよびォリ一ブ油などの植物油などを使用で き、 また注入可能な有機エステル類、 例えばォレイン酸ェチルなどを配合でき る。 これらには更に通常の溶解補助剤、 緩衝剤、 湿潤剤、 乳化剤、 懸濁剤、 保 存剤、 分散剤などを添加することもできる。 滅菌は、 例えばバクテリア保留フ ィルターを通過させる濾過操作、 殺菌剤の配合、 照射処理および加熱処理など により実施できる。 また、 これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に 溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、 製剤担体として、 例えば ポリエチレングリコール、 カカオ脂、 高級アルコール、 高級アルコールのエス テル類、 ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用できる。
ペースト、 クリーム、 ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、 希釈 剤として、 例えば白色ヮセリン、 パラフィン、 グリセリン、 セルロース誘導体、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 シリコン、 ベントナイトお よびォリーブ油などの植物油などを使用できる。
経鼻または舌下投与用組成物は、 周知の標準賦形剤を用いて、 常法に従い調 製することができる。
尚、 本発明薬剤中には、 必要に応じて着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤、 甘味 剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がなく、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性別その他の条件、 疾患の程度などに応じて決定される。 例えば錠剤、 丸剤、 液剤、 懸濁剤、 乳剤、 顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、 注射剤は単独 でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、 更 に必要に応じ単独で筋肉内、 皮内、 皮下もしくは腹腔内投与され、 坐剤は直腸 内投与され、 経膣剤は膣内投与され、 経鼻剤は鼻腔内投与され、 舌下剤は口腔 内投与され、 軟膏剤は経皮的に局所投与される。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、 特に限 定されず、 所望の治療効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条 件などに応じて広範囲より適宜選択される。 一般的には、 該投与量は、 通常、 1 日当り体重 1 kg当り、 約 0.01 g-10mg程度、 好ましくは約 0.1 g-1 mg程度とす るのがよく、 該製剤は 1日に 1 -数回に分けて投与することができる。
本発明医薬組成物は、 有効成分とする本発明ポリペプチドおよび発現物 (例え ば MGAT2蛋白質)が MGAT活性を有していることに基づいて、脂質代謝の促進剤 として有用である。 本発明医薬組成物の適用される疾患としては、 上記したよ うに脂質の低下によって生じる各種疾患症状、 例えば皮膚疾患、 脱毛症、 低リ ポタンパク血症、 あるいは癌などの宿主増殖により、 生体のエネルギーの異化 亢進している疾患などを挙げることができる。
(12) 遺伝子治療
後記実施例に示すように、 本発明遺伝子の発現は、 小腸、 肝臓、 大腸などの 組織において認められること力 ^ら、本発明にかかる MGAT2遺伝子のアンチセン ス DNAの全部または一部は、 これを例えば遺伝子発現ベクターの形態で小腸な どの組織細胞内に導入すれば、該細胞内で相補的配列を有する RNAを作り出し、 翻訳を阻害することにより強制的に MGAT2遺伝子の発現を抑制させることが できる。かくして、小腸などの組織における DAG産生を抑制し、結果として TAG 産生を抑制して、 脂肪組織などへの脂質蓄積を抑制することができる。 また、 上記によって、 MAGから DAGへの反応を触媒する作用が抑制されることから、 結果として生体内の MAGが増加し、 ァシル CoAコレステロールァシルトランス フェラーゼの阻害作用や、 ペルォキシソ一ム増殖因子活性化受容体活性化作用 を示すことが期待できる。 このような作用によって、 高脂質血症、 高脂肪血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症などへの脂質代謝抑制剤として、 あるいは肥満、 糖尿病などの進展の抑制または改善剤として利用することができる。本発明は、 このような抗 MGAT作用を有する遺伝子治療用組成物或いは遺伝子治療剤をも 提供する。
上記において MAGには、 1 -モノァシルグリセロール、 2-モノァシルグリセ口 ールおよび 3-モノァシルグリセロールおよびそれらの混合物が含まれる。 その 具体例としては、 1-モノリノレニルグリセロール、 2-モノリノレニルグリセ口 ール、 1-モノステアロイルグリセロール、 2-モノステアロイルグリセロール、 1-モノパルミトイルグリセロール、 2-モノパルミトイルグリセロール、 1-モノォ レオイルグリセロール、 2-モノォレオイルグリセロール、 1-モノパルミトォレ ィルグリセロール、 2-モノパルミトォレイルグリセロール、 1-モノエイコサぺ ン夕エノィルグリセロール、 2-モノエイコサペンタエノィルグリセ口一ルなど を例示できる。
また、 DAGには、 1 ,2-ジァシルグリセ口一ル、 ，3-ジァシルグリセロールおよ び 2,3-ジァシルグリセロールが含まれる。 その具体例としては、 1 ,2-、 1，3-また は 2,3-ジリノレニルグリセロール、ジステアロイルグリセロール、ジパルミトイ ルグリセロール、 ジォレオイルグリセロール、 ジパルミ卜ォレイルグリセロー ジエイコサペン夕エノィルグリセロールなどを例示できる。
本発明において、 ァシル CoAコレステロールァシルトランスフェラ一ゼの阻 害作用は、例えば特開平 5-23135号公報に記載の方法に準じて測定することがで きる。 また本発明において、 ペルォキシゾーム増殖因子活性化受容体活性化作 用は、 例えば特開 2001-354558号公報に記載の方法に準じて測定することがで さる。
本発明は、上述したように、 MGAT2遺伝子の全部または一部を含有する遺伝— 子治療用ベクターおよび該ベクターにより MGAT2遺伝子を導入した細胞を有 効成分とする医薬組成物を提供する。
より詳しくは、 本発明は、 配列番号：3、 より好ましくは配列番号： 2、 で示 される DNA配列のァンチセンス DNAの全部または一部の配列を含むァンチセン ス遺伝子を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該べク夕一によりァンチセン ス遺伝子を導入した細胞並びに該遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによ りアンチセンス遺伝子を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤を提供す る。
また、本発明は、配列番号： 3、 より好ましくは配列番号： 2、 で示される DNA 配列のアンチセンス DNAの全部または一部の配列を含むアンチセンス遺伝子を 含有する遺伝子治療用べクタ一および該ベクタ一によりアンチセンス遺伝子を 導入した細胞を、 高脂質血症、 高脂肪血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症、 肥 満、 糖尿病などの患者の骨格筋細胞または筋肉組織部位に投与することによつ て、 これら組織における脂質代謝を改善し、 高脂質血症、 高脂肪血症、 高中性 脂肪血症、 高 VLDL血症などを改善する力 肥満、 糖尿病患者の脂肪組織などへ の脂質蓄積を抑制するか、 または糖尿病患者の脂質代謝を改善することを特徴 とする脂質代謝抑制方法を提供する。
以下、 かかる遺伝子治療にっき詳述する。 尚、 以下の遺伝子治療の実施にお いては、 化学、 分子生物学、 微生物学、 組換え DNA、 遺伝学および免疫学の慣 用的な方法を用いることができる。 これらは、例えばマニアテイス (Maniatis,T.， et al., Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))、 サムブルック（Sambrook,丄， et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981))、 ァウスベル (Ausbel,F.M.， et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York, (1992))、 グローバ一 (Glover，D.， DNA Cloning'l and ll(Oxford
Press) (1985))、 アナン H (Anand.Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press(1992))> グスリ一 (Guthrie'G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press) (1991))およびフィンク
(Fink.et al. Hum. Gene Ther" 3， 1 1 -19(1992)に記載されている。
本発明遺伝子治療は、 MGAT2遺伝子を発現する細胞において、 細胞内の mRNAに対して相補的配列を持つ RNAを作り出し、翻訳を阻害し、 MGAT2遺伝 子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬による MGAT活性を抑制する方 法、 または血液中または組織における脂質の上昇を抑制する方法を含む。 該治 療法は、 例えば MGAT2遺伝子を有する MGAT発現細胞本来の mRNAとアンチセ ンス遺伝子を結合させるか、 あるいはアンチセンス遺伝子を DNA二重螺旋の間 に入り込ませて三重鎖を形成させることによって、 転写或いは翻訳の過程を阻 害することによって、 標的とする遺伝子の発現を抑制する方法である。 そのた めに、遺伝子の mRNAと相補的なアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを製造し、 該アンチセンス，オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する。 このような
MGAT2遺伝子の発現機能を抑制する作用を標的細胞に供給すれば、受容細胞/ 標的細胞における MGAT活性または脂質の上昇を抑制することができる。 上記 アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する具体例としては、 該 アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを含有するべクタ一またはプラスミドを標 的細胞に導入してその染色体外に該アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを維持 する方法を挙げることができる。
本発明に係わるアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを用いた脂質代謝異常の 遺伝子治療によれば、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 AAV由来のベクタ一 などにアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを組み込み、 これを MGAT活性発現 細胞に感染させて、 アンチセンス ·ォリゴヌクレオチドを過剰発現させること により、 所望の MGAT活性を抑制または低下させることができ、 かくして脂質 代謝抑制効果を得ることができる。
MGAT2遺伝子を有する標的細胞に、 ァンチセンス ·オリゴヌクレオチドを導 入して MGAT2の発現を抑制させる場合、 当該アンチセンス ·オリゴヌクレオチ ドは、 MGAT2遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、 MGAT2遺伝子 の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、 例 えば前記した改変体であっても、 一部配列からなる遺伝子であってもよい。 アンチセンス ·ォリゴヌクレオチドのべクタ一への組み込みおよび該べク夕 一の標的細胞染色体外維持の双方のための、 所望遺伝子導入用べクタ一として は、当該分野において既に知られている各種のベクターをいずれも使用できる。 該ベクタ一は、 例えば、 発現制御エレメントに連結した MGAT2 のアンチセン ス 'オリゴヌクレオチドのコピーを含み、 かつ標的細胞内で当該アンチセンス •オリゴヌクレオチド産物を発現できるウィルスベクターまたはプラスミドべ クタ一である。 その具体例としては、 例えば米国特許第 5252479号明細書およ び PCT国際公開 WO93/07282号明細書に開示された発現ベクター (pWP-7A、 pwP-19、 pWU-1、 pWP-8A、 pWP-21および/または pRSVL)または
pRC/CMV(lnvitrogen社製)などを用いて調製されたベクターを挙げることがで きる。 好適なベクターは後述する各種ウィルス ·ベクターである。
なお、 遺伝子導入治療において用いられるベクタ一に使用されるプロモータ 一としては、 各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用す ることができる。
その具体例としては、 例えば、 小腸に対しては、 ビリン、 ラク夕ーゼ、 アデ ノシンデアミダーゼ、 カルビンディン、 小腸脂肪酸結合蛋白質、 ナトリウムブ ドゥ糖共輸送体などを例示することができる。
大腸に対しては、コロンカルボン酸脱水素酵素などを例示することができる。 肝臓に対しては、 アルブミン、 α -フエトプロテイン、 《1 -アンチトリプシン、 トランスフェリン、 トランススチレンなどを例示することができる。
結腸に対しては、 カルボン酸アンヒドラ一ゼ I、 カルシノエンブロゲンの抗原 などを例示することができる。
子宮および胎盤に対しては、 エストロゲン、 ァロマターゼサイトクローム Ρ450、 コレステロール側鎖切断 Ρ450、 17アルファ一ヒドロキシラ一ゼ Ρ450な どを例示することができる。
前立腺に対しては、 前立腺抗原、 gp91 -フォックス遺伝子、 前立腺特異的カリ クレインなどを例示することができる。
乳房に対しては、 erb-B2、 erb-B3、 ）3 -カゼイン、 jQ -ラクトグロビン、 乳漿蛋 白質などを例示することができる。
肺に対しては、 活性剤蛋白質 Cゥログロブリンなどを例示することができる。 皮膚に対しては、 K-14-ケラチン、 ヒトケラチン 1または 6、 ロイクリンなどを 例示することができる。
脳に対しては、 神経膠繊維質酸性蛋白質、 成熟ァストロサイト特異蛋白質、 ミエリン、 チロシンヒドロキシラーゼ膊臓ヴィリン、 グルカゴン、 ランゲルハ ンス島アミロイドポリペプチドなどを例示することができる。
甲状腺に対しては、 チログロブリン、 カルシトニンなどを例示することがで さる。
骨に対しては、 《1コラーゲン、 ォステオカルシン、 骨シァログリコプロティ ンなどを例示することができる。
腎臓に対してはレニン、 肝臓/骨/腎臓アルカリ性ホスフオタ一ゼ、 エリス ロポェチンなどを例示することができる。
塍臓に対しては、 ァミラ一ゼ、 ΡΑΡ1などを例示することができる。
アンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、 導入さ れるアンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子に対応する相補配列全 部または一部)は、 MGAT2遺伝子の DNA配列情報に基づいて、 前記したように 一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、 取得することができる。
アンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ベクターの標的細胞への導入は、 細胞に DNAを導入する当該分野において既に知られている各種の方法、 例えば エレクト口ポレーシヨン、 リン酸カルシウム共沈法、 ウィルス形質導入などに 従って行うことができる。 MGAT2遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド で形質転換された細胞は、 それ自体単離状態で MGAT活性を有する医薬品とし て、 また脂質の上昇を抑制するための医薬品として、 更に治療研究のためのモ デル系として利用することもできる。
アンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用べクタ一は、 患者の対象とする組 織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより、 患者の標的細胞内 に導入することができる。 全身的投与によれば、 MGATmRNAが発現し得るい ずれの細胞にも所望のベクタ一を到達させることができる。 形質導入された遺 伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれないような場合には、 該投 与を定期的に繰り返すことができる。
本発明の遺伝子治療方法は、 アンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用べク ターを直接体内に投与するィンビポ (in vivo)法と、患者の体内より一旦標的とす る細胞を取り出して、 体外で遺伝子を導入し、 その後、 該細胞を体内に戻すェ クスビポ (ex vivo)法の両者を包含する。
MGAT2遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入し て、 RNA鎖を切断する活性分子であるリポザィムによる遺伝子治療も可能であ る。
本発明遺伝子治療は、 特に脂質代謝抑制剤として、 高脂質血症を対象とする ものであるが、遺伝子治療 (処置)は、高脂質血症以外にも高脂質血症と関連する 高リポ蛋白血症、 高 VLDL血症、 高 TG血症 (高トリアシルグリセロール血症)、 肥 満および糖尿病とその合併症などの治療を対象とすることもできる。 また、 遺 伝子治療に限らず、 例えば遺伝子標識をもその目的とすることができる。
アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療 (処置） の対象により適宜選択することができる。 該対象としては、 例えば、 標的細胞 としての MGAT発現が認められる細胞、 特に小腸、 肝臓、 大腸組織、 リンパ球、 脂肪細胞、 小腸粘膜上皮細胞、 肝細胞、 繊維芽細胞、 大腸粘膜上皮細胞、 造血 幹細胞、 表皮系細胞などを挙げることができる。
遺伝子治療におけるアンチセンス ·オリゴヌクレオチドの導入方法には、 ゥ ィルス的導入方法と非ウィルス的導入方法が含まれる。
ウィルス的導入方法は、 例えば MGAT2遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレ ォチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、 一般にはレトロ ウィルスベクターを用いる方法によることができる。 他のウィルスベクターを 用いる方法によることもできる。 他のウィルスベクタ一としては、 アデノウィ ルスベクター、 HIV (human immunodeficiency vims)ベクター、 ァァノ随伴ウイ リレスベクター (AAV, adeno-associated virus) > へリレぺスゥイリレスべクタ一、 単 純へルぺスウィルス (HSV)ベクタ一およびェプス夕イン-バ一ウィルス (EBV, Epstein-Barr virus)ベクターなどが挙げられる。
非ウィルス的導入方法としては、 リン酸カルシウム共沈法； DNAを封入した リポソームと予め紫外線で遺伝子を破壌した不活性化センダイウィルスを融合 させて膜融合リボソームを作成し、 細胞膜と直接融合させて DNAを細胞内に導 入する膜融合リポソーム法 〔Kato, K.， et al.， J. Biol. Chem. ,266,22071-22074 (1991)] ；プラスミド DNAを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内 に DNAを導入する方法 〔丫 ang， N. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 9568-9572 (1990)] ；プラスミド DNAを直接インビボで臓器や標的組織に注入 するネィキッド (naked)DNA法 [Wolff,丄 A.， et al., Science, 247, 1465-1467 (1990)〕 ；多重膜正電荷リポソ一ムに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチォ ニック · リボソーム法 〔八木国夫， 医学のあゆみ， Vol.175， Νο·9， 635-637 (1995)〕 ；特定細胞のみに遺伝子を導入し、 他の細胞に入らないようにするた めに、 目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドを DNAと結合 させてそれを投与するリガンド -DNA複合体法 〔Frindeis， et al., Trends
Biotechnol., 11 , 202 (1993); Miller, et al., FASEB丄， 9, 190 (1995)3 などを挙げ ることができる。
該リガンド -DNA複合体法には、例えば肝細胞が発現するァシァ口糖蛋白レセ プタ—をターゲットとしてァシァ口糖蛋白をリガンドとして用いる方法 〔Wu, et al., J. Biol. Chem., 266, 14338 (1991); Ferkol, et aに, FASEB丄， 7, 1081 -1091 (1993)〕 や、 標的細胞が強く発現しているトランスフェリン 'レセプ夕一を標 的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法 〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)〕 などが含まれる。
また、 遺伝子導入法は、 上記の如き各種の生物学的および物理学的遺伝子導 入法を適宜組合せたものであってもよい。 該組合せによる方法としては、 例え ばあるサイズのプラスミド DNAをアデノウイルス ·へキソン蛋白質に特異的な ポリリジン抱合抗体と組合せる方法を例示できる。 該方法によれば、 得られる 複合体がアデノウイルスベクターに結合し、 かくして得られる三分子複合体を 細胞に感染させることにより本発明アンチセンス ·オリゴヌクレオチドの導入 を行い得る。 この方法では、 アデノアイルスベクターにカップリングした DNA が損傷される前に、 効率的な結合、 内在化およびエンドソーム分解が可能とな る。 また、 リボソーム/ DNA複合体は、 直接インピポにて遺伝子導入を媒介でき る。
以下、 具体的なアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用ウィルスベクタ一 の作成法並びに標的細胞または標的組織へのアンチセンス ·オリゴヌクレオチ ドの導入法について述べる。
レトロウイルスベクター ·システムは、 ウィルスベクターとヘルパ一細胞 (パ ッケ一ジング細胞)からなつている。 ここでヘルパー細胞は、 レトロウイルスの 構造蛋白質 gag (ウィルス粒子内の構造蛋白質)、 pol (逆転写酵素)、 env (外被蛋白 質)などの遺伝子を予め発現しているが、 ウィルス粒子を生成していない細胞を 言う。一方、ウィルスベクタ一は、パッケージングシグナルや LTR(long terminal repeats)を有しているが、 ウィルス複製に必要な gag、 poK envなどの構造遺伝 子を持っていない。 パッケージングシグナルはウィルス粒子のアセンブリーの 際にタグとなる配列で、 選択遺伝子 (neo， hyg)とクローニングサイトに組込ま れた所望の導入用アンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2 に対応するアン チセンス ·オリゴヌクレオチドまたはその断片)がウィルス遺伝子の代りに揷入 される。 ここで高力価のウィルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短く すること、 パッケージングシグナルを gag遺伝子の一部を含めて広くとること、 gag遺伝子の ATGを残さないことなどが重要である。
所望の MGAT2遺伝子のアンチセンス 'オリゴヌクレオチドを組み込んだべク ター DNAをヘルパー細胞に移入することによって、 ヘルパー細胞が作っている ゥィルス構造蛋白質によりベクターゲノム RNAがパッケージされてウィルス粒 子が形成され、 分泌される。 組換えウィルスとしてのウィルス粒子は、 標的細 胞に感染した後、 ウィルスゲノム RNAから逆転写された DNAが細胞核に組み込 まれ、 ベクター内に挿入されたアンチセンス遺伝子が作用する。
尚、 所望の遺伝子の導入効率を上げる方法として、 フイブロネクチンの細胞 接着ドメインとへパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法 CHanenberg, H.， et al., Exp.Hemat., 23, 747 (1995))を採用することもできる。 なお、 レトロウイルスベクター ·システムにおいて用いられるベクタ一とし ては、例えばマウスの白血病ウィルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin， J. R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91 -135 (1990)3 を例示する ことができる。
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、 該アデノウィル スベクターの作成は、 バークネル 〔Berkner， K. し.， Curr. Topics Microbiol.
Immunol., 158， 39-66 (1992)〕 、 瀬戸口康弘ら (Setoguchi.Y., et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)] 、 鐘カ江裕美ら 〔実験医学， 12,28-34 (1994)〕 およびケナー ら [Ketner, G.， et al" Proc. Natl. Acad. Scに， USA., 91， 6186-6190 (1994)〕 の方 法に準じて行うことができる。 例えば、 非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、 まずアデノウィ ルスの初期遺伝子の E1および/または E3遺伝子領域を除去する。次に、 目的とす る所望の外来遺伝子発現単位 (目的とする導入用ァンチセンス ·オリゴヌクレオ チド、 即ち本発明 MGAT2遺伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド、 該アン チセンス ·ォリゴヌクレオチドを転写するためのプロモータ一、 転写された遺 伝子の安定性を賦与するポリ Aから構成)およびアデノウィルスゲノム DNAの一 部を含むプラスミドベクタ一と、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、 例えば 293細胞に同時にトランスフエクションする。 この 2者間で相同性組換え を起こさせて、遺伝子発現単位と E1とを置換することにより、所望の MGAT2 7 ンチセンス ·オリゴヌクレオチドを包含する本発明ベクターである非増殖性ァ デノウィルスベクターを作成することができる。 また、 コスミドベクタ一にァ デノウィルスゲノム DNAを組み込んで、 末端蛋白質を付加した 3'側アデノウィ ルスべクタ一を作成することもできる。 更に組換えアデノウイルスベクタ一の 作成には、 YACベクターも利用可能である。
アデノ随伴ウィルス (AAV)ベクタ一の製造につき概略すると、 AAVはアデノウ ィルスの培養系に混入してくる小型のウィルスとして発見された。 これには、 ウィルス複製にヘルパーウィルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖する パルポウィルス属と、 ヘルパーウィルスを必要とするディベンドウィルス属の 存在が確認されている。 該 AAVは宿主域が広く、 種々の細胞に感染するありふ れたウィルスであり、 ウィルスゲノムは大きさが 4680塩基の線状一本鎖 DNAか らなり、 その両端の 145塩基が ITR (inverted terminal repeat)と呼ばれる特徴的 な配列を持って存在している。 この ITRの部分が複製開始点となり、 プライマー の役割をなす。 更にウィルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体 DNA への組込みにも、 該 rfRが必須となる。 また、 ウィルス蛋白質に関しては、 ゲノ ムの左半分が非構造蛋白質、 即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白質の Repを コードしている。
組換え MVの作成は、 AAVが染色体 DNAに組み込まれる性質を利用して行う ことができ、 かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。 この方法は、 より詳しくは、 まず野生型 AAVの 51と 3'の両端の ITRを残し、 その間に所望の導 入用アンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2アンチセンス ·オリゴヌクレ ォチド）を挿入したプラスミド (AAVベクタープラスミド)を作成する。 一方、 ゥ ィルス複製やウィルス粒子の形成に必要とされるウィルス蛋白質は、 別のヘル パープラスミドにより供給させる。 この両者の間には共通の塩基配列が存在し ないようにし、 遺伝子組換えによる野生型ウィルスが出現しないようにする必 要がある。その後、両者のプラスミドを例えば 293細胞へのトランスフエクショ ンにより導入し、 さらにヘルパーウィルスとしてアデノウィルス (293細胞を用 いる場合は非増殖型のものでもよい)を感染させると、 非増殖性の所望の組換え AAVが産生される。 続いて、 この組換え AAVは核内に存在するので、 細胞を凍 結融解して回収し、 混入するアデノウイルスを 56°C加熱により失活させる。 更 に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換え AAVを分離濃縮す る。 上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換え MVを得ることができる。
EBVベクターの製造は、 例えば清水らの方法に準じて行うことができる 〔清 水則夫ら、 細胞工学， 14(3), 280-287 (1995)〕 。
本発明のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用 EBVベクターの製造につ き概略すると、 EBウィルス (Epstein-Barr virus: EBV)は、 1964年にェプスタイ ン (Epstein)らによりバ一キット (Burkitt)リンパ腫由来の培養細胞より分離され たへルぺス科に属するウィルスである 〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990， pp.1889-1920〕 。 該 EBVには細胞をト ランスフォームする活性があるので、 遺伝子導入用べクタ一とするためには、 このトランスフォーム活性を欠いたウィルスを調製しなければならない。 これ は次の如くして実施できる。
即ち、 まず、 所望の外来遺伝子を組み込む標的 DNA近傍の EBVゲノムをクロ —ニングする。 そこに外来遺伝子の DNA断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、 組換 えウィルス作製用ベクターとする。 次いで適当な制限酵素により切り出された 組換えウィルス作製用べクタ一を EBV陽性 Akata細胞にトランスフエクトする。 相同組換えにより生じた組換えウィルスは抗表面免疫グロブリン処理によるゥ ィルス産生刺激により野生型 AkataEBVとともに回収できる。 これを EBV陰性 Akata細胞に感染し、 薬剤存在下で耐性株を選択することにより、 野生型 EBVが 共存しない所望の組換えウィルスのみが感染した Akata細胞を得ることができ る。 さらに組換えウィルス感染 Akata細胞にウィルス活性を誘導することによ り、 目的とする大量の組換えウィルスベクタ一を産生することができる。
組換えウィルスベクターを用いることなく所望のアンチセンス ·オリゴヌク レオチドを標的細胞に導入する、 非ウィルスベクターの製造は、 例えば膜融合 リボソームによる遺伝子導入法により実施することができる。 これは膜リポソ —ム (脂質二重膜からなる小胞)に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リ ポソ一ムの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
上記膜融合リボソームによるアンチセンス ·オリゴヌクレオチドの導入は、 例えば中西らの方法によって行うことができる 〔Nakanishi， M.， et al., Exp. Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi, M.， et al., Gene introduction into animal tissues. In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug
Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh.
Amsterdam, 1995, pp.337-349] 。
以下、 膜融合リボソームによるアンチセンス ·ォリゴヌクレオチドの導入法 にっき概略する。 紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウィルスと所望のァ ンチセンス ·オリゴヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入したリ ポソ一ムを 37^で融合させる。 この膜融合リボソームは、 内側にリボソーム由 来の空洞を、 外側にウィルス ·エンベロープと同じスパイクがある疑似またィ ルスともよばれる構造を有している。 次いで、 膜融合リボソームをショ糖密度 勾配遠心法で精製後、 標的とする培養細胞または組織細胞に 4°Cで吸着させる。 次いで 37 にするとリポソ一ムの内容物が細胞に導入され、 所望のアンチセン ス ·ォリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できる。 ここでリボソームとして用 いられる脂質としては、 50% (モル比)コレステロールとレシチンおよび陰電荷 をもつ合成リン脂質で、直径 300nmの 1枚膜リボソームを作製して使用するのが 好ましい。
また、 別のリボソームを用いてアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを標的細 胞に導入する方法としては、 カチォニック ·リボソームによるアンチセンス · オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。 該方法は、 八木らの方法に 準じて実施できる 〔Yagi， K.， et al.， B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)〕 。 この方 法は、 プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、 リポソ一ム膜の 内外両面に正の電荷を与え、 静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、 細胞との相互作用を高めようとするものである。 ここで用いられるリポソ一ム は正荷電を有する多重膜の大きなリポソ一ム (multilamellar large vesicles: LV) が有用であるが、 大きな 1枚膜リポソ一ム (large unilamellar vesicles: LUV)や小 さな 1枚膜リボソーム (small unilamellar vesicles: SUV)を使用してプラスミドと の複合体を作製し、 所望のアンチセンス ·ォリゴヌクレオチドを導入すること も可能である。
プラスミト包埋カチォニック MLVの調製法について概略すると、 これはまず 脂質 TMAG (N-( -trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-gIutamate chloride)、 DLPC (dilauroyl phosphatidylcholine)および DOPE (dioleoyl
phosphatidylethanolamine)をモル比が 1： 2： 2となる割合で含むクロロホルム溶 液 (脂質濃度として 1 mM)を調製する。 次いで総量 i molの脂質をスピッツ型試 験管に入れ、 ロータリーエバポレー夕一でクロ口ホルムを減圧除去して脂質薄 膜を調製する。 更に減圧下にクロ口ホルムを完全に除去し、 乾燥させる。 次い で 20 gの遺伝子導入用プラスミドを含む 0.5mlのダルベッコのリン酸緩衝生理 食塩液- Mg、 Ca含有を添加し、 窒素ガス置換後、 2分間ポルテックスミキサーに より攪袢して、 所望のアンチセンス ·オリゴヌクレオチドを含有するプラスミ ド包埋カチォニック MLV懸濁液を得ることができる。
上記で得られたプラスミド包埋力チォニック MLVを遺伝子治療剤として使用 する一例としては、 例えば発現目的アンチセンス ·ォリゴヌクレオチドを組み 込んだ発現プラスミドを上記カチォニック MLVに DNA量として 0.6 g、 リポソ —ム脂質量として 30nmolになるように包埋し、 これを 2 Iのリン酸緩衝生理食 塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与 する方法が例示できる。
ところで、 遺伝子治療とは 「疾病の治療を目的として、 遺伝子または遺伝子 を導入した細胞をヒ卜の体内に投与すること」 と厚生省ガイドラインに定義さ れている。 しかしながら、 本発明における遺伝子治療とは、 該ガイドラインの 定義に加えて、 前記した標的細胞に MGAT2遺伝子のアンチセンス'オリゴヌク レオチドを導入することによつて高脂質血症を始めとする脂質代謝異常の治療 のみならず、 更に標識となる遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞を ヒト体内に導入することも含むものとする。
本発明の遺伝子治療において、 所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導 入方法には、 代表的には 2種類の方法が含まれる。
その第 1法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外 で例えばィン夕一ロイキン- 2(1し 2)などの添加の下で培養し、 レトロウイルスべ クターに含まれる目的とする MGAT2遺伝子のアンチセンス ·ォリゴヌクレオチ ドを導入した後、 得られる細胞を再移植する手法 (ex vivo法)である。
第 2法は、 目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子のアンチセ ンス ·オリゴヌクレオチド)を直接患者の体内や骨格筋などの標的部位に注入す る遺伝子直接導入法 (直接法)である。
上記遺伝子治療の第 1法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。 即ち、 患者から採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取し、 分 取細胞を IL-2の存在下に AIM-V培地などの適当な培地で 72時間程度培養し、導入 すべきアンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子のアンチセンス ·ォ リゴヌクレオチド）を含有するべクタ一を加える。 アンチセンス ·オリゴヌクレ ォチドの導入効率をあげるために、 プロタミン存在下に 32°Cで 1時間、 2500回 転にて遠心分離した後、 37°Cで 10%炭酸ガス条件下で 24時間培養してもよい。 この操作を数回繰り返した後、 更に IL-2存在下に AIM-V培地などで 48時間培養 し、 細胞を生理食塩水で洗浄し、 生細胞数を算定し、 アンチセンス 'オリゴヌ クレオチド導入効率を前記 in situ PCRや、 例えば所望の対象が本発明のように MGAT活性の抑制や DAGの産生の抑制であれば、 それらの活性の程度を測定す ることにより、 あるいは TAGの産生抑制作用または MAGの産生作用を測定する ことにより、 目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチドの導入効果を確認する。 また、 培養細胞中の細菌 ·真菌培養、 マイコプラズマの感染の有無、 エンド トキシンの検索などの安全度のチェックを行い、 安全性を確認した後、 予測さ れる効果用量のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子のアンチセ ンス ·オリゴヌクレオチド)が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻 す。 かかる方法を、 例えば数週間から数力月間隔で繰り返することにより遺伝 子治療が施される。
ここでウィルスベクターの投与量は、 導入する標的細胞により適宜選択され る。 通常、 ウィルス価として、 例えば標的細胞 1 X 108細胞に対して 1 X 103cfuか ら 1 X 108cfuの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
上記第 1法の別法として、 目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺 伝子のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド）を含有するレトロウイルスベクタ一 を含有するウィルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、 目的とする 細胞へアンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子のアンチセンス ·ォ リゴヌクレオチド)を導入する方法を採用することもできる。
遺伝子治療の第 2法 (直接法)の実施に当たっては、 遺伝子導入法によって実際 に目的のアンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子のアンチセンス · オリゴヌクレオチド)が導入されるか否かを、 体外における予備実験、 例えばべ クタ一遺伝子 cDNAの PCRによる検索や in situPCRによって、予め確認しておく か、 あるいは目的アンチセンス ·オリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子のアンチ センス ·オリゴヌクレオチド)の導入に基づく所望の治療効果である MGAT活性 の抑制や標的細胞の増殖増加乃至増殖抑制などを予め確認しておくことが望ま しい。 また、 ウィルスベクタ一を用いる場合は、 増殖性レトロウイルスなどの 検索を PCRで行う力 逆転写酵素活性を測定するか、 あるいは膜蛋白 (env)遺伝 子を PCRでモニターするなどにより、 遺伝子治療に際してアンチセンス ·オリ ゴヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要であることはいうまで もない。
本発明遺伝子治療において、 肥満、 動脈硬化症、 糖尿病、 高脂質血症、 特に 高 VLDL血症、 高中性脂肪血症を対象とする場合は、 患者から例えば小腸の粘膜 上皮組織細胞 (MGAT発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立 した後、 例えばレトロウイルスにて所望のアンチセンス 'オリゴヌクレオチド を標的とする樹立された粘膜上皮組織細胞 (MGAT発現細胞)に導入し、 G418細 胞にてスクリーニングした後、 IL-12などの発現量を測定 (in vivo)し、 次いで放 射線処理を施した後、 該細胞を患者の小腸に接種する方法を好ましい方法とし て挙げることができる。
(13) 遺伝子治療剤の調製
本発明は、 アンチセンス ·ォリゴヌクレオチド導入用べクタ一またはアンチ センス ·ォリゴヌクレオチド (MGAT2遺伝子のアンチセンス 'オリゴヌクレオ チド)が導入された細胞を活性成分とし、 それらの薬学的有効量を、 適当な無毒 性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤 (遺伝子 治療剤)を提供する。
本発明の医薬組成物 (医薬製剤)に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形 態に応じて通常使用される、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面 活性剤、 滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示できる。 これらは得られ る製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、 前記した本発明医薬組成物の調製 および遺伝子治療の各項で述べたものと同様のものを挙げることができる。 こ れは治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
例えば、 アンチセンス ·オリゴヌクレオチド導入用べクタ一を含む医薬製剤 は、 該ベクターをリボソームに包埋された形態あるいは所望のアンチセンス · ォリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウィルスによ つて感染された培養細胞の形態に調製される。
これらは、 リン酸緩衝生理食塩液 (pH7.4)、 リンゲル液、 細胞内組成液用注射 剤中に配合した形態などに調製することもでき、 またプロ夕ミンなどの遺伝子 導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。 上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がなく、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性別その他の条件、 疾患の程度などに応じて決定される。
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、 特に限 定されず、 所望の治療効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条 件などに応じて広範囲より適宜選択される。
一般には、 医薬製剤としての所望アンチセンス ·オリゴヌクレオチド含有レ トロウィルスベクターの投与量は、 1日当り体重 1 kg当り、 例えばレトロウィル スのカ価として約 1 X 103pfuから 1 X 1015pfu程度とするのがよい。 また所望の導 入用アンチセンス ·オリゴヌクレオチドが導入された細胞の場合は、 1 X 104細 胞 /bodyから 1 X 1015細胞/ body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
該製剤は 1日に 1回または数回に分けて投与することもでき、 1から数週間間隔 で間欠的に投与することもできる。 尚、 好ましくは、 プロ夕ミンなど遺伝子導 入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
本発明に従う遺伝子治療を肥満、 糖尿病、 動脈硬化症、 高脂質血症、 特に高 VLDL血症、 高中性脂肪血症の治療に適用する場合は、 前記した種々の遺伝子治 療を適宜組合わせて行う (結合遺伝子治療)こともでき、 前記した遺伝子治療に、 従来の運動療法、 食事療法、 などを組合わせて行うこともできる。 さらに本発 明遺伝子治療は、その安全性を含めて、 NIHのガイドラインを参考にして実施す ること力 Sできる [Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕 。
(14) RNAインターフェアランス効果
本発明は、 MGAT2遺伝子に対する RNAインタ一フェアランス効果を有する MGAT2 RNA分子からなる MGAT2遺伝子の発現抑制効果により、 MGAT活性を 阻害または低下させる作用を有する物質を有効成分として含有する医薬組成 物、 特に小腸における脂質代謝、 リポ蛋白代謝などの異常を改善するための処 置などに有用な医薬組成物を提供する。
該医薬組成物は、 脂質代謝、 リポ蛋白代謝などの異常の改善作用を奏するに 加えて、 例えばァシルグリセロール生合成経系、 特に MAGから DAGへの反応を 触媒する作用を阻害または低下させる作用を奏し得るものであり、 それ故、 肥 満、 糖尿病、 動脈硬化症、 高脂質血症、 特に高 VLDL血症、 高中性脂肪血症など 予防および治療に有効である。
MGAT2遺伝子に対する RN Aィンターフェアランス効果を有する MGAT2 RNA分子は、 ヒトの場合、 配列番号： 3で示される塩基配列の転写領域を除く非 翻訳領域および翻訳領域、 好ましくは配列番号： 2で示される塩基配列 (翻訳領 j
51 域)に相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子の全配列または部分配列を有す るものであればよい。 またマウスの場合、 配列番号： 6で示される塩基配列の転 写領域を除く非翻訳領域および翻訳領域、好ましくは配列番号： 5で示される塩 基配列 (翻訳領域)に相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子の全配列または 部分配列を有するものであればよい。 これらは、 MGAT活性を阻害または低下 させる作用を有する限りその配列長に制限はない。通常、該 RNA分子としては、 配列番号： 3で示される DNA配列中の少なくとも連続する 15の DNA配列に相当 する 2本鎖 RNA配列である部分 RNA分子、 好ましくは、 配列番号： 3で示される DNA配列中の連続する 18〜30の DNA配列に相当する 2本鎖 RNA配列である部分 RNA分子、 より好ましくは、 配列番号： 3で示される DNA配列中の連続する 19 〜22の DNA配列に相当する 2本鎖 RNA配列である部分 RNA分子を挙げることが できる。 これらはいずれも標的細胞内において MGAT2遺伝子の発現を抑制また は制御するイン夕一フェアランス効果を有する。該配列番号： 3で示される DNA 配列に相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子は、 二本鎖 RNA分子の形態に て、 小腸粘膜上皮細胞などの標的細胞に直接投与することができる。 また、 少 なくとも連続する 15の、 好ましくは連続する 18〜30の、 より好ましくは連続す る 19〜22の配列からなる配列番号： 3で示される DNA配列に相当する 2本鎖 RNA 配列からなる RNA分子を両末端として、 その中間部に適当な融合あるいは接続 のための 5塩基〜数十塩基からなるヌクレオチド配列または非ヌクレオチド配 列を介在させた一本鎖の形態にて、 直接標的細胞内にエレクト口ポーション法 などの細胞導入方法を用いて投与することもできる。
上記非ヌクレオチド配列としては、 PNA、 細胞質移行性配列、 デコイ配列、 インターフエ口ン誘導抑制配列、 RNase抑制活性を有する配列などのいずれか またはそれらの組合わせを挙げることができる。
本発明医薬組成物 (RNAインターフェアランス効果を奏する医薬製剤)は、 ま た、 配列番号： 3で示される塩基配列に相当する 2本鎖 RNA配列を、 適当な真核 細胞系の発現系べクタ一に組み込み、 標的細胞または組織、 特に小腸粘膜上皮 細胞に、 エレクトロボ一シヨン法などの細胞導入方法を用いて、 投与すること ができる。 真核細胞系の発現系べクタ一に組み込まれる RNA分子は、 少なくとも連続す る 15の DNA配列からなる配列番号： 3で示される DNA配列に相当する 2本鎖 RNA 配列からなる RNA分子、好ましくは連続する 18〜30の DNA配列からなる配列番 号： 3で示される DNA配列に相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子、 より好 ましくは連続する 19〜22の DNA配列からなる配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子であればよい。 これらの RNA分子 は、標的細胞内において MGAT2遺伝子の発現を抑制または制御するィンターフ エアランス効果 (RNA切断効果)を有することを必須とする。
また真核細胞系の発現系べクタ一としては、例えばレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルス (AAV)由来のベクタ一、ヘルぺス ウィルスベクタ一、 単純へルぺスウィルスベクター、 ェプスタイン-バーウィル ス (EBV)ベクターなどを利用することができる。
非ウィルス的導入法としては、 リン酸カルシウム共沈法、 ポリヌクレオチド ヌクレオチドのプラスミドを金でコ一トして高圧放電によって物理的に細胞内 に導入する方法、 オリゴヌクレオチドのプラスミドを直接インピポで標的臓器 や組織に注入するネィキッド (naked)ポリヌクレオチド法、多重膜正電荷リポソ ームに包埋した RNA分子を細胞に導入するカチォニック ·リボソーム法など例 示することができる。
上記において、 RNAの合成は一般的な RNAの合成法に従うことができる。 例 えば Dharmacon社の 2'-ACE合成 RNAォリゴヌクレオチドとして、 2'位を保護し た後、 使用時に揮発性バッファーを使用することにより、 容易に脱塩 ·脱保護 を行うことができる (2'-ACE技術については、 Dharmacon社のホームページ： http：〃 www.dharmacon.com/およびその日本での代理店である Bridge社のホー ムページ： http://www.b-bridge.eom/f一 home.html参照)。
かくして、 配列番号： 3で示される DNA配列に相当する 2本鎖 RNA配列からな る RNA分子を有効成分とする本発明 RNAィンターフェアランス効果を有する医 薬組成物を得ることができる。 該医薬組成物は、 その投与により、 MGAT活性 を抑制し、 7シルグリセ口ール生合成系を抑制し、 脂質代謝異常またはリポ蛋 白代謝異常を改善し、 肥満症、 高脂質血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症、 糖 尿病、 動脈硬化症を予防または治療することができる。
本発明の RNAインターフェアランス効果を有する医薬組成物は、上記の通り、 リポ蛋白代謝異常、 脂質代謝異常などを改善できることから、 モノァシルダリ セ口一ル増量剤、 さらにァシル CoAコレステロ一ルァシルトランスフェラーゼ 阻害剤またはペルォキシゾーム増殖因子活性化受容体活性化剤としても有用で ある。
本発明医薬組成物は、その活性成分として配列番号： 3で示される DNA配列に 相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子の導入用ベクタ一または該べクタ一 を導入された細胞の薬学的有効量を、 適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と 共に含有する製剤形態に調製される。
本発明製剤に利用できる医薬担体としては、 製剤形態に応じて、 通常使用さ れる、 充填剤、 増量剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壊剤、 表面活性剤、 滑沢剤などの 希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、 これらは得られる製剤の投与単位形態に 応じて適宜選択使用できる。
例えば、 RNA分子の導入用べクタ一を活性成分とする本発明製剤は、 リポソ ームに包埋された形態に調製することができる。 また、 細胞を活性成分とする 本発明製剤は、 培養細胞の形態に調製される。 これらは、 リン酸緩衝生理食塩 液 (pH7.4)、 リンゲル液、 細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製す ることもできる。 プロ夕ミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与さ れるような形態に調製することもできる。
' 上記医薬製剤の投与方法は、 特に制限がなく、 各種製剤形態、 患者の年齢、 性別その他の条件、 疾患の程度などに応じて決定される。 上記医薬製剤中に含 有されるべき有効成分の量およびその投与量は、 特に限定されず、 所望の治療 効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条件などに応じて広範囲 より適宜選択される。
一般に、 医薬製剤中に含有される活性成分としての配列番号： 3で示される DNA配列に相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子を含有するレトロウィル スベクターの投与量は、 1日当り体重 1 kg当り、 例えばレトロウイルスの力価と して約 1 X 103pfuから 1 X 1015pfu程度とするのがよい。 また、 配列番号： 3で示される DNA配列に相当する 2本鎖 RNA配列からなる RNA分子が導入された細胞の場合は、 1 X 104細胞/ bodyから 1 X 1015細胞/ body程 度の範囲から選ばれるのが適当である。 (15) MGAT2遺伝子の検出
本発明は、 細胞の MGAT活性を促す MGAT2遺伝子の存在を検出する方法を提 供する。 該方法は、 血液または血清のごとき生物学的試料を調製し、 所望によ り核酸を抽出し、該試料中に MGAT2の感受性遺伝子が,存在する否かを分析する ものである。
また、 本発明は、 細胞または組織における MGAT活性レベル、 MGAT mRNA の発現レベル、 脂質代謝異常あるいはァシルグリセロール生合成経路調節機能 障害への進行の程度または予後指標としての MGAT2遺伝子の存在の検出方法 を提供する。 該方法は、 ァシルグリセロール生合成経路調節障害を有する生物 学的試料を調製し、 該試料中に MGAT2遺伝子が存在するか否かを、 あるいは該 試料中の MGAT2 mRNAの量 (発現レベル)を測定することにより実施される。 本発明検出方法の実施によって、 細胞または組織における MGAT活性のレべ ル、 MGAT mRNAの発現レベル、 ァシルグリセ口一ル生合成経路の調節機能障 害への進行の程度または予後指標を得ることが可能となる。 また、 例えば脂質 代謝異常、 リポ蛋白代謝異常などの診断、 肥満、 動脈硬化症、 糖尿病、 高脂質 血症、 高 VLDL血症、 高中性脂肪血症などの治療効果の判定乃至予後の予測が可 能となる。
該検出方法においては、 先ず MGAT活性を有する患者由来の試料から得られ た MGAT2遺伝子に関する情報を基に、 MGAT2遺伝子のスクリーニングおよび ノまたはその増幅に利用できるように設計した DNA断片を作成する。 より具体 的には、 例えばプラークハイブリダィゼーシヨン、 コロニーハイブリダィゼー シヨン、 サザンプロット法、 ノーザンプロット法などに利用できるプローブと しての性質を有する DNA断片を作成する。 また、 ポリメラ一ゼ連鎖反応 (PCR) により増幅させる MGAT2遺伝子の全部または一部の DNA断片を得るためのプ ローブとしての性質を有する DNA断片を作成する。 „〜m
PCT/JP2003/011332
55 上記プロ一ブは、 例えば MGAT2遺伝子と同じ配列を持つプライマーを作成 し、 これをスクリーニング用プローブとして用いて、 生物学的試料 (核酸試料） と反応させることにより作成できる。 該プローブの利用によって、 試料中の
MGAT2遺伝子の存在を確認できる。該試料は、 また標的配列の検出を容易にす る種々の方法、 例えば変性、 制限消化、 電気泳動またはドットブロッテイング で調製されたものであってもよい。
MGAT2遺伝子の存在確認のためのスクリーニング方法は、特に PCRを用いる のが感度の点から好ましい。 該方法は、 MGAT2遺伝子断片をプライマーとして 用いて、従来公知の方法 (Science, 230， 1350-1354(1985))や新たに開発された或 いは将来使用される PCRの変法 (例えば榊佳之、 ほか編、 羊土社、 実験医学、 増刊, 8(9) (1990)；蛋白質 ·核酸 ·酵素、 臨時増刊、共立出版 (株)， 35(17), (1990)) に従い実施することができる。
プライマ一として使用される DNA断片は、 化学合成したオリゴ DNAであり、 これらオリゴ DNAの合成は、 自動 DNA合成装置など、 例えば DNA合成装置
(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: フアルマシア社製)を使用して実施し得 る。 合成されるプライマー (センスプライマ一またはアンチセンスプライマー) の長さは約 10-50ヌクレオチド程度であるのが好ましく、 より好ましくは 15-30 ヌクレオチド程度である。 また、 合成されるプライマ一は、 特に他の公知の類 似する DNA配列を区別できる配列であるのが好ましい。
上記スクリーニング方法に用いられるプローブは、 通常、 標識されるのが普 通であるが、 非標識であってもよく、 直接的または間接的に標識したリガンド との特異的結合によって検出してもよい。 プローブおよびリガンドを標識する 方法は、 当該技術分野で知られており、 例えばニック ' トランスレーション、 ランダム ·プライミンダム、 キナ一ゼ処理のような方法に従うことができる。 標識剤としても、 例えば放射性標識剤、 ピオチン、 蛍光性基、 化学発光基、 酵 素、 抗体などのいずれをも利用することかできる。
検出のために用いる PCRは、 例えば RT-PCRが好ましいが、 当該分野で用い られる種々の変法を適宜応用することも勿論可能である。 (16) MGAT2遺伝子検出用および診断用キット
本発明検出は、 キットを利用することによってより簡便に実施することがで きる。 本発明は、 このような MGAT2遺伝子の検出用キットを提供する。
本発明キットは、少なくとも配列番号： 2に示される DNA配列もしくはその相 補的 DNA配列の一部または全てにハイブリダィズする DNA断片を必須構成成分 として含むことを必須要件とする。 他は、 通常のこの種試薬キットと同様に、 例えば標識剤、 PCRに必須の試薬 (例えば TaqDNAポリメラーゼ、 デォキシヌク レオチド三リン酸、 プライマー)などを含むことができる。
標識剤としては、 放射性同位元素、 蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げ られるが、 DNA断片自身が予め標識剤とコンジュゲートされていてもよい。 更 に当該試薬キットには、 測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、 標準抗 体、 緩衝液、 洗浄剤、 反応停止液などが含ませることもできる。
本発明 MGAT2遺伝子検出用キットは、 MGAT2遺伝子の測定、 検出に利用で きるのみならず、 この検出結果に基づいて、 脂質代謝障害、 特にァシルグリセ ロール生合成障害の診断を行うことができる。 従って本発明は脂質代謝障害の 診断用キットをも提供する。
本発明に従う検出方法では、被検試料から得られる MGAT2遺伝子の DNA配列 を直接的もしくは間接的に決定することができ、 これにより野生型 MGAT2遺伝 子と相同性の高い相同物である新たな MGAT2遺伝子に関連する関連遺伝子を 見出すこともできる。本発明はかかる検出と被検試料中の MGAT2遺伝子の DNA 配列の決定によって、被検試料中のヒト MGAT2遺伝子に関連する関連遺伝子の スクリーニング方法をも提供する。
(17) MGAT活性阻害物質 (アン夕ゴニストを含む)および亢進物質 (ァゴニスト を含む)のスクリーニング
本発明は、 MGAT活性を阻害または低下させる作用を有する候補化合物およ び MG AT活性を促進または上昇させる作用を有する候補化合物をスクリーニン グする方法を提供する。
該方法は、 被験物質の存在下および非存在下に、 配列番号： 1で示されるアミ 1332
57 ノ酸配列からなるポリぺプチドまたは該アミノ酸配列において 1若しくは複数 個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ MGAT活性を有するポリペプチドの酵素活性を測定し、 被験物質の存在下にお ける測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活性を低下させ るインヒビ夕一 (アンタゴニストを含む)または該活性を亢進させるァクセレレ 一夕一 (ァゴ二ストを含む)を選択することを特徴とする、 MGAT活性に対するィ ンヒビ夕一またはアクセレレーターをスクリーニングする方法である。
該スクリーニング方法の代表的一例は、 より詳しくは、 本発明ポリペプチド (例えば MGAT2もしくは MGAT2遺伝子発現物、 以下、 これらを単に 「MGAT2」 という）に対する抗体を、 被験物質を含む被検液中で標識化された MGAT2と競 合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された MGAT2の割合を測定すること により実施される。
また被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された別の異なる抗
MGAT2抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤 の活性を測定することによって、被検液中の MGAT2を定量することも可能であ る。
さらに、 MGAT2に基質を接触させた場合と MGAT2に基質および候補化合物 を接触させた場合における、 MGAT2の酵素活性を測定して比較することによつ て、 MGAT2の酵素活性 (例えば MGAT活性)を阻害または亢進 (刺激もしくは活性 化)する候補化合物をスクリーニングすることも可能である。
本発明スクリーニング方法によれば、 MGAT2とリガンドとの結合を、 例えば 細胞、 無細胞調製物、 化学ライブラリ一および天然物混合物中で評価すること ができる。
MGAT2が有する MGAT活性のァゴニスト（アクセレレーター)またはアン夕ゴ 二スト (インヒビター)は、天然の基質またはリガンドであってもよく、それらの 構造的または機能的模擬体であってもよい。
本発明スクリーニング方法はまた、 MGAT2に結合して該 MGAT2の作用を増 強 (酵素活性化剤)または阻害 (酵素阻害剤)する化合物を同定するために利用す ることもできる。 本発明スクリーニング方法においては、 ハイスループットスクリーニング技 術を応用することができる。 この技術の応用によれば、 例えば、 酵素活性化剤 または酵素阻害剤に関するスクリーニングにおいては、 合成反応混合物、 細胞 画分、.例えば膜、 細胞エンベロープ、 細胞壁、 またはこれらのいずれかの調製 物 (MGAT2と該ポリペプチドの標識基質またはリガンドを含むもの)を、 スクリ 一二ングされる候補化合物の存在下または非存在下でィンキュベ一トする。 該 候補化合物が MGAT2を作動させるまたは拮抗する能力は、該標識リガンドの結 合の減少または該基質からの産物の産生の減少により検出される。 MGAT2の作 用を誘導することなく結合する候補化合物が、 良好な酵素阻害剤である可能性 が高い。一方、 十分に結合し基質からの産物の産生速度を増加させる化合物は、 酵素活性化剤である可能性が高い。 基質からの産物の産生の速度またはレベル の検出は、比色標識など (これに限定されるものではない)のレポ一夕一系、ポリ ヌクレオチドまたはポリぺプチド活性の変化に応答するレポ一夕一遺伝子の組 込みおよび当技術分野で公知の結合アツセィを用いることにより増強されう る。
また、 MGAT2を、 該ポリペプチド、 天然基質もしくはリガンドまたは基質も しくはリガンド模擬体に結合する化合物と組合せる競合アツセィも、 酵素阻害 剤化合物のスクリーニングに用いることができる。 該酵素阻害剤の有効性の評 価には、 該結合分子に結合したポリぺプチド分子の数が測定され得るように、 GAT2を例えば放射能または比色性化合物により標識することができる。
(18) MGAT活性阻害物質 (アンタゴニストを含む)および亢進物質 (ァゴニスト を含む）
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質 (薬剤候 補化合物)は、 MGAT活性のインヒビ夕一 (アン夕ゴニストを含む)および MGAT 活性のアクセレレーター (ァゴ二ストを含む)の両者を含んでいる。即ち、インヒ ビ夕一は、 本発明スクリーニング系において、 その存在によって測定される MGAT活性を低下させる物質であり、 アクセレレーターは、 逆にその存在によ つて測定される MGAT活性を上昇させる物質である。 これら被験物質の具体例には、 例えばオリゴぺプチド；蛋白質；抗体；非べ プチド性化合物 (化学合成物質）；発酵生産物；細胞抽出液 (アル力ロイドなどの 植物抽出液および動物組織抽出液）；血漿などが含まれる。 これらの物質は新た に開発されたものであっても、 既知物質であってもよい。
また、酵素阻害物質には、 MGAT2に結合してその活性を阻害しまたは部分的 もしくは完全に遮断する無機または有機の低分子化合物、 天然もしくは合成の または遺伝子組換え技術により調製されたポリペプチド、抗体などが含まれる。 更に、 生体内に直接にまたは組換えベクターに挿入された形態で投与される MGAT2 DNAに対するアンチセンス DNA分子、 生体内に直接にまたは組換えべ クタ一に挿入された一本鎖または二本鎖状の形態で投与される MGAT2に対す る RNAインターフェアランス効果を有する RNA分子も含まれる。
また、酵素阻害物質には、 MGAT2により誘導される活性を誘導することなく 結合分子上の同一部位に結合して該ポリペプチドの作用をその結合の阻止によ り妨げる上記した有機または無機の低分子化合物、 ポリペプチド、 抗体、 アン チセンス DN A分子、 RNAイン夕一フェアランス効果を有する RNA分子も含まれ る。
また、 酵素阻害物質には、 該酵素の結合部位に結合しそれを占拠して細胞結 合分子に対する該ポリぺプチドの結合を妨げて該ポリぺプチドの正常な生物学 的活性を妨げるかまたは減少させる低分子化合物も含まれる。 他の酵素阻害物 質には、 上記したようにアンチセンス分子 (例えば、 Okano,丄 Neurochem, 56:560 (1991 ); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene
Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)を参照)および RNAィンターフ エアランス効果を有する RNA分子 (例えば、 McCaffrey, A. P., et al., Nature, 418, 38-39 (2002)を参照)も含まれる。
本発明スクリーニング方法に従ってスクリーニングされる MGAT活性の促進 作用または阻害作用を有する候補物質の評価は、 例えば、 MGAT活性がコント ロール (被験物質非存在)の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは約 30%以上、 より好ましくは約 50%以上促進している場合、 該候補物質は MGAT活性を促進 する化合物として選択することができる。 一方、 例えば、 MGAT活性がコント ロール (被験物質非存在)の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは約 30%以上、 より好ましくは約 50 %以上阻害されている場合、 該被験物質は MGAT活性を阻 害する化合物として選択することができる。
MGATは小腸内のカイ口ミクロン、肝臓内の VLDLの形成および脂肪組織内の トリァシルグリセロールとしてのエネルギーの貯蔵に重要であるため、 MGAT 活性の阻害剤および活性化剤は特に脂肪代謝に関連する疾患などの処置に有用 である。 例えば、 小腸、 肝齓 皮膚および脂肪組織内の MGAT活性の阻害は、 脂質吸収および血漿トリグリセリドレベルを減少させ、 脂肪生合成を減少させ る効果を奏し得る。 更に、 高中性脂肪血症は、 ァテローム性動脈硬化症の独立 した危険因子であることが示されており（Kugiyama, K.， et al.， Circulation
97:2519-2526 (1998))、 冠状動脈疾患のリスクの増大に関するマーカーであり、 いくつかの血管内皮細胞内の粥状硬化形成因子に関するマ一カーとして働きう ることが知られている (Grundy, S. M" Am. J. Cardiol, 81 :18B-25B (1998))。 ま た、 MGAT活性の阻害は、 腸脂肪吸収の制御、 トリァシルグリセロールに富む リポ蛋白分泌の改変、 血清トリアシルグリセロールの制御および脂肪生成の減 少につながることが知られている (Owen MRら， Biochem J 323:17-21 (1997)， Jamdar SCおよび Cao WF , Biochem Biophys Acta 1255:237-243(1995)) 0 これ らのことから、 MGAT活性を阻害する化合物は、 高中性脂肪血症、 冠状動脈疾 患などの処置に有効である。
以上のように、 本発明の MGAT活性化剤および MGAT活性阻害剤はそれら自 体が、 MGAT活性に関連した疾患、 例えば変化した細胞モノァシルグリセロー ル濃度、 ジァシルグリセロール濃度またはトリァシルグリセロール濃度に関連 した疾患；例えば異常な脂質代謝や異常な脂肪吸収に関連した疾患；肥満、 高 VLDL血症、 高中性脂肪血症、 高脂質血症、 脱毛症、 皮膚疾患、 低リポ蛋白血症 などのリポ蛋白分泌および脂肪生成に関連した疾患；脂質代謝や脂肪吸収に関 連した疾患；糖尿病、 動脈硬化症などの各種疾患の治療または改善に有用であ る。
本発明スクリーニング方法により得られる MGAT活性を阻害する物質は、 細 胞 MAG濃度を増加し、細胞 DAG濃度または細胞 TAG濃度を低下させると考えら れることから、 MAG増量剤として、 医薬品分野をはじめとする各種の分野で有 用である。
該 MGAT活性阻害物質を有効成分とする MAG増量剤は、 ァシル CoAコレステ ロールァシルトランスフェラーゼ阻害剤またはペルォキシゾーム増殖因子活性 化受容体活性化剤として、 例えば動脈硬化症やリボタンパク代謝異常または脂 質代謝異常を呈する各種疾患、 肥満症、 高脂質血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL 血症、 糖尿病および動脈硬化症の予防 ·治療のための医薬として有効に利用す ることができる。
また、 MGAT活性の活性化物質を有効成分とする MGAT活性化剤 (MGAT酵素 活性促進剤)は、 脂質代謝促進剤、 DAG増量剤、 MAG増量剤などとして、 リポ 夕ンパク代謝異常または脂質代謝異常を呈する各種疾患、 例えば低リポ夕ンパ ク血症、 低 VLDL血症、 皮膚疾患、 脱毛疾患などの予防および治療のために利用 することができる。 また癌などの宿主増殖により生体のエネルギーが異化亢進 している患者などに対して脂質代謝促進用の医薬としても有効に利用すること ができる。
上記 MAG増量剤、 ァシル CoAコレステロールァシルトランスフェラーゼ阻害 剤およぴペルォキシゾーム増殖因子活性化受容体活性化剤、 脂質代謝改善剤、 DAG増量剤、 MAG増量剤などは、それぞれの作用を示す有効量を適当な製剤学 的担体と共に含有する医薬組成物として、上記各疾患に適用することができる。 該医薬組成物 (医薬製剤)において有効成分として利用する MGAT活性の活性 化物質乃至阻害物質は、医薬的に許容される塩とすることができる場合がある。 この塩の種類、 その調製法、 医薬組成物の調製法、 医薬組成物に利用される希 釈剤、 賦形剤などの医薬担体、 医薬組成物の投与単位形態、 投与経路、 投与方 法などは、 前記本発明ポリぺプチドを有効成分とする医薬組成物において詳述 したそれらと、 略同様のものとすることができる。
医薬製剤中に含有させるべき有効成分の量およびその投与量は、 特に限定さ れず、 所望の治療効果、 投与法、 治療期間、 患者の年齢、 性別その他の条件な どに応じて広範囲より適宜選択される。 一般には、 投与量は、 1日当り体重 1 kg 当り、 約 0.01 g-10mg程度、 好ましくは約 0.1 ma程度とするのがよく、 該 製剤は 1日に 1 -数回に分けて投与することができる。
(19) スクリーニング用キット
本発明は、 MGAT2の酵素活性 (MGAT活性)を阻害または刺激 (活性化)する物質 をスクリーニングするためのスクリーニング用キットを提供する。
該 MGAT活性阻害または活性化物質のスクリーニング用キットは、 本発明ポ リペプチド (例えば、 配列番号： 1に示されるアミノ酸配列を有するポリべプチ ド)または本発明発現物 (例えば、 配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレ ォチドの発現物)と、 これら酵素の基質成分を必須構成成分として含むことが重 要であって、 他はこの種スクリーニング用キットと同様とすることができる。 本発明スクリーニング用キッ卜の一例としては、 MGAT活性を有する MGAT2 および基質 [ォレオイル CoAおよび 2-モノォレオイルグリセロール] と共に、 任意成分として、 反応希釈液、 標準 DAG、 緩衝液、 洗浄剤などの各種試薬類を 含むものを挙げることができる。 MGAT活性を測定するためには、 標識した基 質 4C標識ォレオイル CoAあるいは1 4 C標識モノォレオイルグリセロール)を 用いることができる。 ここで、 基質の標識剤は、 放射性同位元素に限らず、 例 えば蛍光物質などの化学修飾物質などであってもよい。
本キットは、 測定の実施の便益のために、 必要に応じて、 細胞培養液、 反応 希釈液、 緩衝液、 洗浄剤などを含むこともできる。
本発明スクリーニング用キットを利用してスクリーニングされる被験物質
(薬剤候補化合物)は、 前述した通りであり、 これらは新規であってもよく、公知 であってもよい。
本発明スクリーニング用キッ卜に配合できる試薬類の具体例としては、 次の ものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬類〕
1)測定用反応液：反応液 (180mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 8mM塩化マグネシウム、 1 mg/mlゥシ血清アルブミン (脂肪酸フリー)、 30 Μォレオイル CoA、 0.2mM 2- モノォレオイルグリセロール
2)蛋白質標品： MGAT2またはその塩或いはそれを含むミクロゾーム画分 3)標識基質： 0.2mM 14C標識ォレオイル CoAあるいは14 C標識モノォレオイルグ リセロール
4)停止液： 2-プロパノール:ヘプタン:蒸留水 =80:20:2(v/v)混液
5)展開液：ヘプタン:イソプロピルエーテル:酢酸 =30:20:2(v/v)混液
上記試薬類を含む本発明スクリーニング用キットを利用したスクリーニング は、 具体的には、 次のごとくして実施される。
即ち、 MGAT2(蛋白質標品)を含む被検サンプルを、 測定用反応液 (180mMト リス-塩酸 (pH7.5)、 8mM塩ィ匕マグネシウム、 1 mg/mlゥシ血清アルブミン (脂肪酸 フリー)、 30 x Mォレオイル CoA、 0.2mM 2-モノォレオイルグリセロール： 全量 100 l)に加えて、 37°Cで 10分間反応させる。 反応終了後、 750 lの停止液 (2- プロパノール:ヘプ夕ン:蒸留水 =80:20:2(v/v))を加えて反応を停止させる。 次い で、 500 Iのヘプタンおよび 250 lの蒸留水を加えて攪拌、遠心後、 400 Iの上 層をチューブに移し、 減圧下で蒸発乾固する。 これにジェチルエーテルを加え、 脂溶性の物質を溶解したものを薄層クロマトグラフィー (TLC)で展開する。 TLC は HPTLCプレートシリカゲル (Silica gel)60F254(10 x 10 cm)を用い、 ヘプタン： イソプロピルエーテル:酢酸 =30:20:2(v/v)で展開する。 MGAT活性の定量は、 RI 標識 ¾質として14 C標識ォレオイル CoAあるいは14 C標識モノォレオイルグリセ ロールを用いて、 14C標識ジォレオイルグリセ口一ルの合成を、 BAS-5000ィメ ージアナライザ一で測定することにより実施する。
尚、 被検サンプルの蛋白質量を、 クマ一シーブルーが蛋白質と結合する際の 吸光の変化を測定することにより求めて、 蛋白質量当たりの活性を算出する。
(20) 本発明ポリペプチドの相互作用物質など
本発明は、 より活性または安定した形態の MGAT2誘導体、 またはインビポ (in vivo)で MGAT2の機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を開発するために本発 明ポリぺプチドと相互作用し得る生物学的に活性な他のポリぺプチド (構造ァ ナログ、 例えば MGAT2酵素活性化剤、 MGAT2酵素阻害剤、 MGAT2インヒビタ —など)およびそれらの製造法を提供する。
構造アナログは、 MGAT2との複合体の三次元構造を X線結晶学、 コンビユー 夕一モデリングまたはこれらを組合わせた方法によって決定することができ る。 また、 構造アナログの構造に関する情報は、 相同性蛋白質の構造に基づく 蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
活性または安定した形態の MGAT2誘導体を得る方法としては、例えばァラニ ン ·スキャンによって分析する方法を挙げることができる。 該方法は、 ァミノ 酸残基を Alaで置換し、 ぺプチドの活性に対するその影響を測定する方法であ り、 ペプチドを構成する各アミノ酸残基をこのように分析することによって、 当該ペプチドの活性や安定性に重要な役割を担う領域を決定することができ る。 該方法によって、 より活性なまたは安定な MGAT2誘導体を設計することが できる。
また、 機能性アツセィによって選択した標的特異的抗体を単離し、 次いでそ の結晶構造を解析することも可能である。 このアプローチにより、 続く薬剤の 設計の基本となるファ一マコア (pharmacore)を得ることができる。
機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗ィディォタイプ抗体を生成させる ことによって、 化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりぺプチ ドを同定したり単離したりすることが可能である。 故に選択されたペプチドも ファ一マコアとして作用すると予測される。
かくして改善されたもしくは安定化された MGAT2誘導体、 または MGAT2活 性のインヒピ夕一、 酵素活性化剤、 酵素阻害剤などとしての作用を有するポリ ペプチドを設計 ·開発することができる。
クローン化 MGAT2配列によって、十分な量の MGAT2を入手して、 X線結晶学 のような分析研究を行うこともできる。 さらに、 本発明ポリペプチドの提供に より、 X線結晶学に代えるかまたはこれに加えてコンピュータ—モデリング技術 に適応可能である。
また本発明によれば、 MGAT2遺伝子ノックアウト 'マウスあるいは変異マウ スを作成することによつて MGAT2遺伝子配列のどの部位が生体内で上記した ような多様な MGAT2活性に影響を与えるかどう力、 即ち MGAT2遺伝子産物並 びに改変 MGAT2遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認する ことができる。 該方法は、 遺伝子の相同組換えを利用して、 生物の遺伝情報を 意図的に修飾する技術であり、 具体的にはマウスの胚性幹細胞 (ES細胞)を用い た方法を例示できる (Capeccchi, M. R.， Science, 244, 1288-1292 (1989))。 尚、 上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり (野田哲生編、 実験医学,増刊， 14 (20) (1996)、 羊土社)、 この技術にヒト野性型 MGAT2遺伝子および変異 MGAT2遺伝子を適応することによって、 容易に所望 の変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、 改善された MGAT2 活性もしくは安定な MGAT2活性を有する薬剤 (ィンヒビター、 酵素活性化剤、 酵素阻害剤など)を設計 ·開発することができる。 発 明 の 効 果
本発明は、 MGAT活性を有するポリペプチド (例えばヒト MGAT2)を含む医薬 組成物を提供するものであり、 該組成物は、 MGAT2遺伝子およびその産物が関 与する各種の疾患 (MGAT活性または脂質合成系におけるァシルグリセロール生 合成系の調節に関連する疾患)、 例えば、 低リポ蛋白血症、 皮膚疾患、 脱毛疾患 などの処置のための DAG産生促進剤、 TAG産生促進剤などとして有用である。 また、本発明医薬組成物の有効成分であるポリペプチド (または発現物)は、脂 質の吸収再合成に重要な組織である小腸、 肝臓および大腸においてその発現が 高い。 従って、 これら組織およびその周辺組織における MGAT活性を促進し、 脂質合成系におけるァシルグリセロール生合成系を促進し、 また脂質代謝にお ける脂質の再合成調節に対して促進的に作用すると考えられる。このことから、 該ポリべプチド (発現物)を有効成分とする本発明医薬組成物は、 脂質代謝促進 薬、 殊に MAG低下剤として期待できる。
本発明は、 また MGAT2遺伝子の発現量や MGAT活性などの解析を行う技術を 提供するものである。 これにより、 関連遺伝子の機能と脂質代謝関連疾患、 特 に肥満、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症などの高脂質血症、 リポ蛋白代謝異常疾 患、 糖尿病、 動脈硬化症などとの関連を解明できる。
本発明は、 更に MGAT2アンチセンス ·オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子 導入用べクタ一、 該ベクタ一を導入した細胞などを提供でき、 これらは遺伝子 治療に有用である。 本発明は、更に加えて MGAT2の酵素活性を阻害するかまたは活性化する作用 を奏する候補化合物およびそのスクリーニング方法を提供する。 該候補化合物 は、 肥満、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症などの高脂質血症に関連する脂質代謝 異常あるいはリポ蛋白代謝異常、 糖尿病、 動脈硬化症、 皮膚疾患、 脱毛疾患な どの治療に有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 4に従う試験によって、 ヒト MGAT2発現細胞のミクロソ一ム画 分の MGATアツセィによる MGAT活性を調べた結果を示す図である。
図 2は、実施例 4に従う試験によって調製したサンプルについて、実施例 7の (1) に従う試験によって MGATァッセィにより MGAT2 siRNAの抑制効果を調べた 結果を示す図である。
図 3は、 実施例 7の (2)に従う試験によって、 MGAT2 siRNAベクターの抑制効 果を、 蛋白質レベルでウエスタンプロットを用いて、 示した図である。
図 4は、実施例 4に従う試験によって調製したサンプルについて、実施例 7の (2) に従う試験によって MGATアツセィにより MGAT2 siRNAベクターの抑制効果 を調べた結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらに限 定されるものではない。
実施例 1 ノーザンプロット分析
マウスのゲノム DNAおよびヒ卜の小腸 cDNA (ヒト複数組織 cDNAパネル： human multiple tissue cDNA panel: クローンテッり (Clontech, CA)¾)をそ Πそ れ铸型として、 PCRを行い (95 ， 5分、 95で， 30秒、 58°C， 30秒および 72°C， 30 秒のサイクルを 35サイクル実施)、 増幅された PCR産物を切出し、 精製して、 マ ウス MGAT2およびヒト MGAT2を含む DNA断片を得た。
尚、 プライマ一としては、 次の配列を用いた。 即ち、 ヒト MGAT2増幅のため に、 配列番号： 7で示される human MGAT2 (F2)および配列番号： 8で示される human MGAT2 (R2)を用いた。 また、 マウス MGAT2増幅のために、 配列番号： 9で示される mouse MGAT2 (F)および配列番号： 10で示される mouse MGAT2 (R)を用いた。 これらの各プライマーは、 自動 DNA合成装置 (Applied Biosystems Expedite)により合成した。 また、 塩基配列は、 ダイレクトシークェンス法によ り確認した。
得られた DNA断片をランダム ·プライム法により32 PdCTPで標識し (Prime-It II labeling kit, ストラタジーン社)、ノーザンプロッティングのプローブとして用 いた。 メンブレンとしては、 ヒト複数組織ノーザンブロット (human multiple tissue northern blots #7760-1 :クローンテック（Clontech, CA)社)およびマウス · ポリ A+ノーザンブロット- 12主要組織 (Mouse polyA+ Northern Blot-12 major Tissues: オリジーン ·テクノロジ一ズ (ORIGENE TECHNOLOGIES, Inc., Maryland)社)を使用した。 ハイブリダィズ溶液としては、 50%ホルムアミド、 5 X SSPE、 0.1 %SDS、 2Xデンハルト液 (Denhardt's solution)を用いた。 ハイブ リダィゼ—シヨンは、 42°Cでー晚行った。 翌日、 2 XSSC/0.1 %SDS溶液を用レ て、 室温で 5分の洗浄を 3回行った後、 0.1 X SSC/0.1 %SDS溶液を用いて、 50°C で 10分間洗浄した。 その後、 18時間、 X線フィルムを露光させた。
上記に従うノーザンプロット分析の結果、 ヒト MGAT2は、 肝臓、 大腸および 小腸でその発現が認められた。 一方、 マウス MGAT2は、 腎臓および小腸でその 発現が強く、 胃、 肝臓でもわずかに発現することが確認された。 実施例 2 RT-PCR
ヒト MGAT2について、複数組織 cDNAパネル (Multiple tissue cDNA panels: ク 口一ンテック (Clontech， CA)社)を用いて RT-PCRを行い、その発現組織を解析し た。
上記 RT-PCRの結果、 実施例 1に示したノーザンプロット分析の結果と同様 に、 ヒト MGAT2は、 肝臓、 腎臓、 大腸および小腸で発現することを確認した。 なお、 PCRにより増幅された cDNA断片の塩基配列は、ダイレクトシ一クェン ス法により確認した。 実施例 3 イン ·サイチュ ·ハイブリダイゼーション (in situ hybridization)
MGAT2が小腸のどの位置で発現しているかを調べる目的で、マウス小腸のィ ン ·サイチュ ·ハイブリダィゼーションを次の通り行った。
マウス小腸組織を、 4%パラフオルムアルデヒド (pH7.4、 RNaseフリ一)にて 固定し、 20%ショ糖に一晚浸漬後、 Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura
Finetechnical Co., Ltd., Tokyo, Japan)にて包埋し、 凍結切片を作製した。 作製 した凍結切片を内因性アル力リフォスファターゼ除去のため 0.2N塩酸に浸漬 し、続いて、 プロテナ一ゼ Kにて組織の蛋白分解を行い、 ァセチル化によりプロ —ブの非特異性を除去した後、 プローブ溶液を 55°Cで 16時間ハイプリダイズし た。
プロッキング後、 アル力リフォスファターゼ標識 Dig抗体にて発色操作を行 い、グリセリンに封入して標本とした。
尚、 コントロールには、 ORFの 5'末端から 292塩基対を起点として、 3'末端側 の 492塩基対のセンス鎖プローブを用いた。
その結果、アンチセンスプローブ (494塩基長)において、マウス小腸 (十二指腸、 空腸、回腸)の吸収上皮に特異的な発現を認めた。発現の強度は空腸で最も強く、 十二指腸、 回腸の順であった。
上記の結果から、 MGAT2遺伝子がコードする蛋白質は、 小腸 MGAT活性を担 う分子と考えられる。 実施例 4 組換え体ヒト MGAT2の発現
(1)発現ベクターの構築
ヒト MGAT2組換え蛋白質を発現させるために、 （A)： pEF1 V5-HisA (インビト ロゲン (Invitrogen)社)および (B)： pcDNA3.1 (+) (インビトロゲン社製)をべクタ 一として用いて、 これら各ベクターの所定制限酵素切断サイトに、 ヒト MGAT2 の ORF (配列番号 2で示される塩基配列)を組み込んだ。
ヒト MGAT2の cDNAを铸型として、 以下の 3組のプライマ一セットを用いて PCR反応を行った。 铸型として用いたヒト MGAT2の cDNAは、 ヒト皮膚 cDNA を铸型とした RT-PCRにより調製した。 -セット 1としては、 配列番号： 1 1で示される human MGAT2 (EcoRI2)および配列番号： 12で示される human MGAT2 (R-Xbal)を用いた。 プ ライマ一セット 2としては、 配列番号： 1 1で示される human MGAT2 (EcoRI2) および配列番号： 13で示される human MGAT2 (R-Xhol)を用いた。 また、 プラ イマ一セット 3としては、 配列番号： 14で示される human MGAT2 (HindHI)およ び配列番号： 13で示される hMGAT2 (R-Xhol)を用いた。
PCR反応は、 95°C，2分、 95°C, 30秒、 58°C, 30秒および 72°C， 1分を 1サイクル として、 30サイクル行い、 最終的に 72°C， 3分の伸長反応を行った。 増幅された 各 PCR産物は、 Qiaquick gel extraction kit (QIAGEN)を用いてそれぞれ精製し た。
プライマ一セット 2を用いて得られた精製 PCR産物と pcDNA3.1 (+)とを
EcoRIと Xholで切断し、 また、 プライマ一セット 1を用いて得られた精製 PCR産 物と pEF1/V5-HisAベクターとを EcoRIと Xbalで切断し、 それぞれを連結させて 所望の発現べクタ一を構築した。
かくして得られた 2種の発現べクタ一を、 それぞれリポフエクタミン
2000(Lipofectamine 2000: インビトロゲン (Invitrogen)社)を用いて、 COS1細胞 にトランスフエクシヨンした。トランスフエクションの 2曰後に、細胞を回収し、 引き続くミクロソーム画分の調製に用いた。
尚、上記方法に従って得られる組換え蛋白質は、それぞれ C末端にヒスチジン タグの付加したヒト MGAT2(human MGAT2-His)およびタグなしのヒト MGAT2 であった。 また、 コント口一ルとしては、 ヒト MGAT2の ORF領域を組み込んで いない pcDNA3.1 (+)ベクタ一を用いた。
(2)ミクロゾーム画分の調製
上記 (1 )で得られた各細胞を、 0.25Mショ糖、 1 mM EDTAおよび 2mM DTTを 含む 50mMトリス-塩酸緩衝液 (pH7.5)とともにホモジェナイズした後、氷上で 10 分間超音波処理を行い、 次いで 3000X gで 10分遠心して、 細胞のホモジエネ一 トを調製した。
また得られた上清を、 10000 X gで遠心後、 その上清をさらに 100000 X gで遠 心して、 ミクロゾームの沈殿を得た。 得られた沈殿物を、 ホモジェナイズに用 いた緩衝液に懸濁させて、 ミクロソーム画分とした。
尚、すぐにアツセィを行わない場合、 ミクロゾーム画分は液体窒素で凍結し、 アツセィ時まで- 80°Cで保存した。
(3)MGATアツセィ
細胞のホモジエネ一トあるいはミクロゾーム画分をサンプルとして、 以下の 通り、 MGATアツセィを行った。
即ち、 上記で得られた各サンプル Iの範囲の所定量を含む反応液
(180mMトリス-塩酸 (pH7.5)、 8mM塩化マグネシウム、 1 mg/mlゥシ血清アルブ ミン (脂肪酸フリー標品：シグマ社)、 30 Mォレオイル CoA、 0.2mM 2-モノォ レオイルグリセロール (シグマ社)全量 100 Iを、 37°Cで 10分間反応させた。 反 応終了後、 750 ^ Iの停止液 (2-プロパノ一ル:ヘプタン： 蒸留水 =80:20:2(v/v)を加 えて反応を停止させた。 次いで、 500 Iのヘプタンおよび 250 Iの蒸留水を加 え、 攪拌、 遠心後、 400 Iの上層をチューブに移し、 減圧下で蒸発乾固した。 これにジェチルエーテルを加えて脂溶性の物質を溶解したものを、 薄層クロマ トグラフィ一(Thin Layer Chromatography: TLC)で展開した。 TLCは
HPTLC(High Perfomance TLC)プレート（ガラスプレート）シリカゲル (Silica gel)60F254(10 X 10 cm) (関東化学株式会社)を用いて、ヘプタン:ィソプロピルェ —テル:酢酸 =30:20:2(v/v)で展開した。
MGAT活性の定量のために RI標識した基質を用いた。 用いた RI標識基質は、 14C標識ォレオイル CoAあるいは14 C標識モノォレオイルグリセロール
(American Radiolabeled Chemicals, Inc.社， USA)であり、 14C標識ジォレオイルグ リセ口ールの合成を BAS-5000ィメ一ジアナライザ一 (富士フィルム社)で測定し た。
サンプルは、 クマージ一ブルーが蛋白質と結合する際の吸光の変化を測定す る Bradfordの方法 (Bradford, M.M.,Anal. Biochem., 72,248(1976))により蛋白質 の定量を行い、 蛋白質量当たりの MGAT活性を算出した。
得られた結果を図 1に示す。 図 1は、ヒト MGAT2発現 COS1細胞のミクロゾーム画分の MGATアツセィによ る MGAT活性を調べた結果を示す図である。図中、 「hMGAT2」は、.ヒト MGAT2 発現 COS1細胞のミクロソ一ム画分であり、 「Control」 は、 cDNA3.1 (+)ベクタ —のみを導入した COS1細胞のミクロゾーム画分 (蛋白質濃度を上記 hMGAT2と 合わせた)である。 また、 図中に矢印を付して示した蛋白は MGAT活性の指標と するジォレイン (diolein)である。
図 1より次のことが判る。 即ち、 ヒト MGAT2(hMGAT2)を発現させた COS1細 胞のミクロゾーム画分 (hMGAT2発現細胞由来)では、コントロールと比較して明 らかにジ才レインの合成量の増加が観察され、 このことから MGAT活性の増加 が確認される。
なお、 MGAT活性の増加は、 細胞ホモジェネートを用いた同実験の結果にお いても同様に確認された。 また、 hMGAT2に代えてヒト MGAT2-Hisを発現させ た場合も、 同様の MGAT活性の増加が確認された。
これらの結果から、 ヒト MGAT2は MGAT活性を有することが確認された。 本発明によって、 ヒト MGAT2が MGAT活性を示すことが明らかになり、 この 発見によって、 ヒト MGAT2の MGAT活性を阻害するか亢進する物質のスクリー ニングが可能となり、 かくして.、 脂質代謝抑制剤として、 肥満症、 高脂質血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症、 糖尿病、 動脈硬化症などの各種疾患に対する治 療および予防に利用できる候補化合物が提供できると考えられる。 また、 脂質 代謝促進剤として、 皮膚疾患、 脱毛疾患などの疾患に対する治療および予防に 利用できる候補化合物が提供できると考えられる。 実施例 5 MGAT2組換え蛋白質発現細胞を利用した MGAT2活性制御物質のス クリーニング
MGAT2あるいは MGAT2に任意のタグを融合させた MGAT活性を有する融合 蛋白質または MGAT活性を担う MGAT2部分べプチドを発現させた COS1細胞よ り得られたミクロソ一ム画分の MGAT活性を制御 (阻害あるいは増強)する物質 は、 上記の MGATアツセィ系の反応液に被験物質を共存させることでスクリ一 ニングすることが可能である。 コントロールには、 遺伝子を組み込んでいないそれぞれに対応するべクタ一 を組み込んだ細胞由来のミクロゾーム画分を用いる。
MGAT2活性の阻害活性を有する物質は、 上記スクリーニング系において、 14C-ジォレオイルグリセ口一ルの産生抑制として検出される。 また、 MGAT2活 性を増強する物質は、 上記スクリーニング系において、 14C-ジォレオイルダリ セロールの産生増加として検出される。 実施例 6 MGAT2組換え蛋白質を利用した MGAT2活性制御物質のスクリ一二 ング
MGAT2活性を制御 (阻害あるいは増強)する物質のスクリーニングは、 精製し た MGAT2組換え蛋白質を用いて行うことができる。
MGAT2組換え蛋白質の精製は、 実施例 5に記載のミクロソーム画分からの界 面活性剤による可溶化や、 種々のカラムクロマトグラフィーなどによる分画に より達成される。 また、 タグ付き MGAT2組換え蛋白質の場合は、 さらに容易に 精製することができる。 例えば、 Hisタグ融合 MGAT2組換え蛋白質では、 該蛋 白質を上記可溶化後に、 Ni-NTA Superflow(QIAGEN社)に、 Hisタグを介して特 異的に吸着させ、 ィミダゾ一ルにて溶出させることにより精製することが可能 である。
このようにして精製した MGAT2あるいは MGAT2融合蛋白質は、 上記スクリ —ニング系の酵素として利用することができる。 この場合のメリットは、 コン トロールが緩衝液でよいこと、 MGAT2以外の酵素などによる脂溶性標識物質の 合成がないことなどが挙げられる。 特に後者の特徴は、 TLCを行わずに、 反応 停止後に液体シンチレ一ションカウンタ一などで放射能を測定し、 その値を MGAT2活性とすることができる点にある。 実施例 7 RNAィンターフェアランス効果を有する RNA分子による MGAT遺伝 子の発現制御
(1 ) siRNA (short interfering RNA)による MGAT遺伝子の発現抑制
MGAT活性が siRNAによつてその活性を抑制されることを以下の通り検討し た。
即ち、 配列番号： 5で示されるマウス MGAT2をコードする DNA配列中の以下 に示す特定部分配列に対する siRNA (配列番号： 15-34)を Dharmacon社の 2'-ACE 技術に従い合成した。
· SSiiRRNNAAII ::配配列列番番号号： 15: 配列番号: 5の 252-270の DNA+tt
SiRNA2:配列番号 16： 配列番号: 5の 270-252の DNA+tt
SIRNA3:配列番号 17:配列番号: 5の 134-152の DNA+tt
SiRNA4:酉己歹幡号 18：配列番号: 5の 152-134の DNA+tt
SiRNA5:配歹 ϋ番号 19: 配列番号: 5の 279-297の DNA+tt
· SSiiRRNNAA66::配配列列番番号号： 20: 配列番号: 5の 297-279の DNA+tt
SIRNA7:配列番号 21：配列番号: 5の 306-324の DNA+tt
SiRNA8:配列番号 22： 配列番号: 5の 324-306の DNA+tt
SiRNA9:配列番号 23： 配列番号: 5の 360-378の DNA+tt
SiRNAI 0:配列番号 24： 配列番号: 5の 378-360の DNA+tt
SiRNA11： 配列番号 25: 配列番号: 5の 373-391の DNA+tt
SiRNAI 2: 配列番号 26：配列番号: 5の 391 -373の DNA+tt
SiRNAI 3: 配歹幡号 27： 配列番号: 5の 525-543の DNA+tt
SiRNAI 4: 配列番号 28： 配列番号: 5の 543-525の DNA+tt
SiRNA 5: 配列番号 29: 配列番号: 5の 621 -639の DNA+tt
- SSiiRRNNAAII 66：: 配配列列番番号号： 30: 配列番号: 5の 639-621の DNA+tt
SiRNAI 7: 配列番号 31： 配列番号: 5の 756-774の DNA+tt
SiRNAI 8: 配列番号 32： 配列番号: 5の 774-756の DNA+tt
SiRNAI 9: 配列番号 33: 配列番号: 5の 858-876の DNA+tt
SiRNA20: 配列番号 34: 配列番号: 5の 876-858の DNA+tt
各々の siRNAを、 マウス MGAT2遺伝子発現べクタ一 (pcDNA3.1の EcoRI/Xhol サイトにマウス MGAT2の ORF (配列番号： 5で示される塩基配列） を組み込ん だもの。 なお、 マウス MGAT2遺伝子はマウス小腸 cDNAを铸型として PCRで増 幅した。 ） およびホ夕ルルシフェラ一ゼ発現ベクター pGL3(プロメガ (promega) 社)と共に、 リボフェクタミン 2000 fLipofectamine2000: (Invitrogen)社)を用いて、 COS1細胞にトランスフエクシヨンした。 トランスフ ェクシヨンの 2日後に、 細胞を回収し、 該細胞から実施例 4の (2)に従ってミクロ ソーム画分を調製した。
コン卜ロールとして、 EGFP (enhanced green fluorescent protein)遺伝子配列 [GenBank accession No. U57606 (pEGFP-C2): Chrfie, M., et al., Science., 263， 802-805, (1994); Yang, T. T., Nucleic Acids Res., 24, 4592-4593. (1996)〗に対 する以下の siRNA (配列番号： 35として示すセンス鎖および配列番号： 36とし て示すアンチセンス鎖、 前記と同様にして合成した） を用いて、 同様にして得 た細胞を実施例 4の (2)に従ってミクロゾーム画分を調製した。用いた siRNAは次 の通りである。
• SiRNA21 : 配列番号： 35: GenBank accession No. U57606の 1089-1 107の DNA
• SiRNA22:配列番号： 36: GenBank accession No. 1157606の1107-1089の DNA
ホ夕ルルシフェラーゼ活性は、 デュアルルシフェラーゼ定量システム
(Dual-Luciferase Reporter Assay System: ブロメガ (promega)社) を用いて測 定し、 サンプル間のトランスフエクシヨン効率差の標準化に用いた。
MGATァッセィは実施例 4の (3)に従って実施した。
上記試験の結果、 配列番号： 15および 16に示すセンス鎖 (siRNAI)およびアン チセンス鎖 (siRNA2)からなる RNA配列の siRNAが、 最も強い RNAインターフエ ァランス効果を有することが判った。 該 siRNAを用いて得られたミクロソ一ム 画分の MGATァッセィによる MGAT活性測定結果を図 1と同様にして図 2に示 す。
図 2中、 左のレーン① MGAT2発現ベクターと MGAT2に対する siRNAを C0S1 細胞にコトランスフエクシヨンしたもの (図中、 「mGAT2+mGAT2siRNA」 と表 示)の結果であり、 右のレーン②は、 コントロールとして MGAT2発現ベクター と EGFPに対する siRNAを COS1細胞にコトランスフエクションしたもの (図中、 「mGAT2+EGFPsiRNA」 と表示)の結果である。 また図中、 ジォレインのピー クを矢印にて表示した。 さらに実施例 4の (3)に記載の方法に従い BAS5000ィメ一ジアナライザ一にて 図 2のスポット (ジォレインの矢印部分に現れるスポット）のシグナル強度を測 定、 解析した。 得られた結果 (MGAT2siRNAによる MGAT活性抑制効果)を下記 表 2に示す。
表 2
Figure imgf000076_0001
表中、 siRNAの欄の MGAT2は、 MGAT2発現べクタ一と MGAT2に対する siRNA を COS1細胞にコトランスフエクシヨンしたものを示し、 同 siRNAの欄の EGFP は、コント口一ルとしての MGAT2発現ベクターと EGFPに対する siRNAを COS1 細胞にコトランスフエクシヨンしたものを示す。
該表 2に示されるとおり、 コントロールである EGFPに対する siRNAを導入し た細胞ミクロゾーム画分のジォレイン産生の割合を 100 %としたとき、 MGAT2 に対する siRNAを導入した細胞ミクロソーム画分のジォレイン産生の割合は 7.6%であり、 MGAT活性が抑制されていることが明らかである。
表 2および図 2に示された結果から、 MGAT遺伝子配列に対して作製した siRNA (mMGAT2siRNA)を導入した COS1細胞では、コントロ一ル (EGFPsiRNA を導入した COS1細胞)と比較してジォレインの合成量の著しい低下力観察さ れ、 このことから、 MGAT活性の抑制が確認できた。 この結果は、 siRNA用い て MGAT活性を抑制できることを明らかにするものである。
(2) siRNA発現べクターによる MGAT遺伝子の発現抑制
マウス H1プロモーター (Ame,丄 C.,et al.， J.Biol.Chem., 276, 11092-1 1099 (2001)参照、 GeneBank accession No. AF191547に由来する RNA、 その塩基配 列を配列番号： 37に示す)の直下に、 配列番号： 5に示されるマウス MGAT2をコ 一ドする遺伝子の特定の部分配列に相当するアンチセンス鎖とセンス鎖とを uuaaを介してつないだ以下に示す各 RNA断片を、 pUC19に組み込んだ siRNA発 現べクタ一を作製した。 このベクターの作製は文献記載の方法に従った
(Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R., Science, 296, 550-553 (2002))。 ' RNA断片 a: 配列番号： 38:配列番号: 5の 815-793の0 +111133+配列番号:5の 793-815の DNA
· RNA断片 b: 配列番号： 39: 配列番号: 5の 337-315のDNA+uuaa+配列番号:5の 315-337©DNA
• RNA斬片 c:配列番号： 40:配列番号: 5の 453-430の DNA+uuaa+配列番号: 5の 430-453の DNA
• RNA断片 d:配列番号： 41 : 配列番号: 5の 775-753の DNA+uuaa+配列番号: 5の 753-775の DNA
• RNA断片 e:配列番号： 42:配列番号: 5の 881 -858の0 +1^33+配列番号:5の 858-881の DNA
• RNA断片 f: 配列番号： 43: 配列番号: 5の 518-495のDNA+uuaa+配列番号:5の 495-518の DNA
· RNA断片 g:配列番号： 44:配列番号: 5の 64-41の DNA+uuaa+配列番号: 5の 41-6 DNA
なお上記配列番号： 38-44は、 それぞれ各 siRNA発現べクタ一をトランスフエ クトした COS1細胞が細胞内で発現すると予想される RNA分子の配列を示すも のである。
作製した各 siRNA発現べクタ一をマウス MGAT2遺伝子発現べクタ一 （実施例 7の (1)に記載のもの） 、 ホタルルシフェラ一ゼ発現ベクター pGL3 (プロメガ (pramega)社） と共にリポフエクタミン 2000 (Lipofectamine2000:インビトロ ゲン （Invitrogen) 社） を用いて、 COS1細胞にトランスフエクシヨンした。 ト ランスフエクシヨンの 2日後に、 細胞を回収し、 ミクロソ一ム画分を調整した。 コントロールとして H1プロモータ一配列のみを含む siRNA発現ベクターを同 様にして調製し、 このものを用いて細胞のトランスフエクションを行った。 ホ夕ルルシフェラーゼ活性は、 デュアルルシフェラーゼ定量システム
(Dual-Luciferase Reporter Assay System: プロメガ (promega)社） を用いて測 定し、 サンプル間のトランスフエクシヨン効率差の標準化に用いた。 ウエスタンブロットの抗体としては、 MGAT2アミノ酸配列 (配列番号： 1およ び 4)の一部分 (320-334aa)をべプチド合成し、 得られたぺプチドを抗原として、 ゥサギに免疫し、 免疫開始後 49日目に回収した血清 （ペプチド抗体） を利用し た。
ウエスタンプロットは、 次の通り実施した。 即ち、 まず MGAT2蛋白質を発現 させた細胞のホモジェネートを 4-20%ゲル、 40mA、 60minの条件で SDS-PAGE を行い、 セミドライ方式で PVDF膜へ写し取り、 その PVDF膜をー晚
2%BSA/D-PBSにてブロッキングした後、 2%スキムミルク /D-PBSにて更にブ口 ッキング （室温にて 30min) し、 続いて上記で作製したペプチド抗体を 1/1000 濃度で反応させ （0.5%スキムミルク/ D-PBS入りの溶液にて室温 1時間処理） 、 その後、 二次抗体としての HRP (ホースラディッシュペルォキシダーゼ) 標識 された抗ゥサギ IgG抗体を反応 （0.5%スキムミルク/ D-PBS入りの溶液にて室温 1時間処理） させ、 最後に ECL (アマシャム） 発色キットにて発色させること により、 発色したスポットを検出した。
MGATアツセィは、 実施例 4の (3)と同様にして行った。
上記試験の結果、配列番号： 38の RNA分子を発現することが予想される siRNA 発現ベクターが、 最も強い RNAインタ一フェアランス効果を有することが確認 された。 該発現ベクターが MGAT蛋白質の発現を抑制することおよびその
MGAT活性を抑制することは、 図 3および図 4に示す結果から明らかである。 図 3は、 mGAT2発現べクタ一十コントロールべクタ一 (H1プロモー夕一を含む pUC19ベクター)における上記ウエスタンブロットの結果 (レーン①)および mGAT2発現べク夕一 + mGAT2siRNA発現べクタ一における同結果 (レーン②） を示す図である。図 3中の数値は分子量マ一カーにおける分子量（kDa) を示す。 また矢印を付して示した位置が MGAT2の分子量に相当する。
図 4は、 図 3において試験したと同一サンプルの MGATアツセィの結果 (MGAT 活性)を示す図である。 図 4中、 レーン①は mMGAT2発現べクタ一 +コントロー ルベクタ一 (H1プロモーターを含む pUC19ベクター)を用いた結果であり、 レ一 ン②は mMGAT2発現ベクター +mMGAT2siRNA発現べクタ一の結果である。 ま た矢印を付した位置がジォレインである。 図 3より次のことが判る。 即ち、 MGAT2遺伝子配列に対して作製された siRNA発現べクタ一を導入した COS細胞 (レーン②)では、 MGAT2蛋白質を示す シグナルがコントロール (レーン①)と比較して明らかに減少していることが観 察される。
また図 4より、 MGAT2活性においても、 コントロール (レーン①〉と比較して、 レーン②では 20%まで （BAS5000イメージアナライザーの測定による） ジォレ ィンの合成量の低下が観察され、 MGAT活性の抑制が確認できる。
これらの結果から、 siRNA発現ベクター用いて MGAT2活性を抑制することが 可能であることが確認できる。 産業上の利用可能性
本発明により提供される MGAT活性を有するポリぺプチドは、 脂質代謝経路 における MGATによる調節機能の解明、 MGATが組織特異的に発現していれば 組織別の脂質代謝機構の解明について有用な情報を与える。 従って、 本発明は 該ポリぺプチドを有効成分として含有する脂質代謝改善薬を提供する。
また、 本発明は MGATに対して例えば阻害活性を有する侯補化合物のスクリ —ニング方法を提供するものであり、 該技術は、 脂質の代謝改善作用に基づく 肥満、 高脂質血症、 高中性脂肪血症、 高 VLDL血症、 高脂肪酸血症、 糖尿病、 動 脈硬化症などの治療および予防剤の開発に役立つ。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の (a)または (b)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを、 製 剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物：
(a)配列番号： 1で示されるアミノ酸配列、
(b)上記 (a)のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 揷入、 置換または付加されたァミノ酸配列からなり且つモノァシルグリセ口一ルァシ ルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を有する。
2. 以下の )、 （d)または (e)のいずれかのポリヌクレオチドからなる DNA分子の 発現物を、 製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物：
(c)配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレオチド、
(d)上記 (c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイプリダイズし 得且つモノァシルグリセロールァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を発現 可能なポリヌクレオチド、
(e)上記 (c)のポリヌクレオチドと 80 %以上相同する DNA配列を有し且つモノァ シルグリセ口ールァシルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性を発現可能なポリヌ クレオチド。
3. 請求項 1に記載のポリぺプチドおよび請求項 2に記載の発現物からなる群か ら選択される少なくとも 1種を、製剤学的に許容される担体と共に含有するジァ シルグリセロール産生促進剤。
4. 請求項 1に記載のポリぺプチドおよび請求項 2に記載の発現物からなる群か ら選択される少なくとも 1種の有効量を、処置を要求される患者に投与するジァ シルグリセロール産生促進方法。
5. 請求項 1に記載のポリぺプチドおよび請求項 2に記載の発現物からなる群か ら選択される少なくとも 1種の、ジァシルグリセロール産生促進剤の製造のため の使用。
6. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の (a)または (b)のいずれかのアミ ノ酸配列からなるポリべプチドの酵素活性を測定し、 被験物質の存在下におけ る測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活性を低下させる インヒビターを選択することを特徵とする、 モノアシルグリセ口ールァシルト ランスフェラーゼ (MGAT)活性に対するィンヒビ夕一をスクリーニングする方 法：
(a)配列番号： 1で示されるアミノ酸配列、
(b)上記 (a)のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたァミノ酸配列からなり且つモノァシルグリセロールァシ ルトランスフェラーゼ (MGAT)活性を有する。
7. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の (a)または (b)のいずれかのアミ ノ酸配列からなるポリペプチドの酵素活性を測定し、 被験物質の存在下におけ る測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活性を亢進させる アクセレレーターを選択することを特徵とする、 モノアシルグリセ口一ルァシ ルトランスフエラーゼ (MGAT)活性に対するアクセレレーターをスクリーニン グする方法：
(a)配列番号： 1で示されるアミノ酸配列、
(b)上記 (a)のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたァミノ酸配列からなり且つモノァシルグリセ口ールァシ ルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性を有する
8. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の (c)、 （d)または (e)のいずれかの ポリヌクレオチドからなる DNA分子の発現物の酵素活性を測定し、 被験物質の 存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活性 を低下させるインヒピターを選択することを特徵とする、 モノァシルグリセ口 —ルァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性に対するィンヒビターをスクリー ニングする方法： (c)配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレオチド、
(d)上記 (c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイプリダイズし 得且つモノァシルグリセ口—ルァシルトランスフェラ—ゼ (MGAT)活性を発現 可能なポリヌクレオチド、
(e)上記 (c)のポリヌクレオチドと 80%以上相同する DNA配列を有し且つモノァ シルグリセロールァシルトランスフェラーゼ (MGAT)活性を発現可能なポリヌ クレオチド。
9. 被験物質の存在下および非存在下に、 以下の )、 （d)または (e)のいずれかの ポリヌクレオチドからなる DNA分子の発現物の酵素活性を測定し、 被験物質の 存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比し、 該活性 を亢進させるアクセレレーターを選択することを特徴とする、 モノァシルダリ セ口一ルァシルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性に対するァクセレレ一夕一を スクリーニングする方法：
(c)配列番号： 2で示される DNA配列のポリヌクレオチド、
(d)上記 (c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし 得且つモノァシルグリセ口一ルァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を発現 可能なポリヌクレオチド、
(e)上記 (c)のポリヌクレオチドと 80%以上相同する DNA配列を有し且つモノァ シルグリセ口一ルァシルトランスフェラ一ゼ (MGAT)活性を発現可能なポリヌ クレオチド。
10. 請求項 1に記載のポリぺプチドおよび請求項 2に記載の発現物からなる群か ら選ばれる少なくとも 1種を、モノァシルグリセロールァシルトランスフェラ一 ゼ (MGAT)の基質と共に構成成分として含有する、モノァシルグリセ口一ルァシ ルトランスフェラーゼ (MGAT)活性に対するインヒビターをスクリーニングす るためのスクリーニング用キッ卜。
1 1. 請求項 1に記載のポリぺプチドおよび請求項 2に記載の発現物からなる群か ら選ばれる少なくとも 1種を、モノァシルグリセロールァシルトランスフェラ一 ゼ (MGAT)の基質と共に構成成分として含有する、モノアシルグリセロールァシ ルトランスフェラーゼ (MGAT)活性に対するアクセレレーターをスクリ一ニン グするためのスクリーニング用キット。
12. 以下の (1 ) _ (3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルグリセ ロールァシルトランスフエラ一ゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用を 有する物質を、 製剤学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物：
(1 )配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体、
(2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するァンチセンス DNA分子、
(3)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列であって且つ RNAイン夕一フェアランス効果を有す る RNA分子。
13. 以下の (1)— (3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルグリセ ロールァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用を 有する物質を、 製剤学的に許容される担体と共に含有するモノアシルグリセ口 ールァシルトランスフェラ一ゼ (MGAT)活性抑制剤：
(1)配列番号： 1で示されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドに結合する抗体、
(2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するァンチセンス DNA分子、
(3)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列であって且つ RNAインターフェアランス効果を有す る RNA分子。
14. 以下の (1)ー(3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルグリセ ロールァシルトランスフエラーゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用を 有する物質を、 処置を要求される患者に投与するモノアシルグリセロールァシ エラ一ゼ (MGAT)活性の抑制方法：
(1 )配列番号： 1で示されるァミノ酸配列からなるポリべプチドに結合する抗体、
(2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するァンチセンス DNA分子、
(3)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 相当する 2本鎖 RNA配列であって且つ RNAインターフェアランス効果を有す る RNA分子。
15. 以下の (1) _ (3)からなる群から選ばれる少なくとも 1種のモノァシルグリセ ロールァシルトランスフェラーゼ (MGAT)活性を阻害または低下させる作用を 有する物質の、モノアシルグリセ口ールァシルトランスフェラ一ゼ (MGAT)活性 抑制剤の製造のための使用：
(1 )配列番号： 1で示されるアミノ酸配列からなるポリべプチドに結合する抗体、
(2)少なくとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に対するァンチセンス DNA分子、
(3)少なぐとも連続する 15の塩基長からなる、 配列番号： 3で示される DNA配列 に相当する 2本鎖 RNA配列であって且つ RNAインタ一フェアランス効果を有す る RNA分子。
16. 配列番号： 3または 6で示されるモノァシルグリセロールァシルトランスフ エラ一ゼ (MGAT)遺伝子の転写領域を除く非翻訳領域および翻訳領域に対する RN Aィンタ一フェアランス効果を有する RNA分子。
17. 配列番号： 2または 5で示されるモノァシルグリセロールァシルトランスフ エラーゼ (MGAT)遺伝子の翻訳領域に対する RNAィンタ一フェアランス効果を 有する RNA分子。
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