JP2865861B2 - 第▲viii▼:c因子活性を有するタンパク質複合体およびその製法 - Google Patents
第▲viii▼:c因子活性を有するタンパク質複合体およびその製法Info
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Description
および適当なポリヌクレオチド構築物の発現による前記
複合体の製法に関する。タンパク質複合体は古典的(A
型)血友病の治療に有効である。
万人につき1〜2人が苦しんでいる。この疾患は第VII
I:C因子の不足の不存在により起こされる。第VIII:C因
子は非常に大きな糖タンパク質(天然Mr330K−360K)で
あり、非常に低濃度で血漿中に存在する。これは可溶性
フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変え凝血を形成
し傷付いた組織から血液損失を妨げるタンパク質分解カ
スケードにおける必須要素である。血流において、これ
は第VIII:R因子(“フォン ウィレブランド因子”)と
の非共有結合会合で見出され、安定化キャリヤータンパ
ク質として作用する。第VIII:C因子はトロンビン、プラ
スミン、プロテアーゼCおよび他のセリンプロテアーゼ
による分解を非常に受けやすい。これは一般に、血漿ま
たは血漿生成物から、Mr92KおよびMr80K〜77Kの主要種
類を含むMr160K〜40Kの範囲の関連ポリペプチド系列と
して単離される。この複合体パターンは活性第VIII:C因
子の構造の分析を非常に困難にしている。
トブラット(F.Rotblat)ら、Biochemistry(1985)24:
4294〜4300;ジイ.エー.フェアール(G.A.Vehar)ら、
Nature(1984)312:337−342:ジェイ・ジェイ.トゥー
ル(J.J.Toole)ら、Nature(1984)312:342−347;およ
びエム.エー.テュレット(M.A.Truett)ら、DNA(198
5)4:333−349により記載されている。イー.オル(E.O
rr)ら、Molecular Genetics of Clotting Factors,p.5
4.s321は、第VIII:C因子の高度グリコシル化領域に対す
る“スペーサー”機能を報告した。配列は、ジェイ.ジ
ェイ.トゥールら、前出:ダブリュ.アイ.ウッド(W.
I,Wood)ら、Nature(1984)312:330−336;およびエ
ム.エー.テュレットら、前出により報告された。標準
長さのタンパク質は1つの配列(I)の3回の繰り返し
と二番目の配列(III)の2つの繰り返しを含む。第三
の高度にグリコシル化された配列(II)は、二番目と三
番目の繰り返しIの間に存在し、明らかにタンパク質分
解を受けてMr92KとMr80Kポリペプチドを形成する。最初
の2つの繰り返しIはAドメインを形成し、三番目の繰
返しIと2つの繰り返しIIIはCドメインを形成する。
配列IIはBドメインを形成する。したがって、標準長さ
のタンパク質は構造I1−I2−II−I3−III1−III2(A−
B−C)を有し、一方Mr92KおよびMr80Kのポリペプチド
(AおよびC)はそれぞれ構造I1−I2およびI3−III1−
III2を有する。シイ.フルヒャー(C.Fulcher)ら、J.C
lin Invest(1985)76:117−124は、第VIII:C因子との
抗体−エピトープデータに基づいて、Mr92KおよびMr80K
ポリペプチドの両方とも第VIII:C因子機能に対し必要で
あることを示唆している。
血液から歴史的に単離されてきた。しかしながらHIVお
よび他の血液生産性疾患の遺伝に関する心配により第VI
II:C因子の代わりの供給を用意する活動が刺激されてき
た。天然第VIII:C因子に伴なう遺伝的ウィルス性疾患に
ついて心配することなく第VIII:C因子活性を有する組成
物を供給することができることは非常に興味深いことで
ある。
が、精製および特性決定することが困難であり、そして
タンパク質分解のために不安定である。臨床的用途のた
めの標準長さの分子の有効な組換体生産はこの時点では
不確かである。
m(1986)261:12574−78は、Mr92KおよびMr80Kポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドで同時に感染された
細胞から活性第VIII:C因子複合体を発現することを記載
している。得られたタンパク質は同じ条件下で発現した
クローン化した標準長さの第VIII:C因子のものと同じ活
性を示した。オーノルドファング(O.Nordfang)ら、J.
Biol.Chem(1988)263:1115−18はMr92Kタンパク質およ
びMr80Kタンパク質(それぞれF VIII−HCおよび−LC)
の別々の製剤からの活性VIII:C因子複合体のインビトロ
アッセンブリーを記載した。成功したアッセンブリーは
二価金属イオン(特にMnおよびCa)およびチオールを必
要とするが、しかしわずかに少量のF VIII−HCが活性な
F VIII:Cへ複合化されうるだけであった。
有する組換体タンパク質複合体を発現する向上した方法
を発明した。Mr92Kポリペプチド(F VIII−HC)およびM
r80Kポリペプチド(F VIII−LC)が同じ宿主細胞中にて
別々のプロモーターの調節下に2つの別々のポリペプチ
ドとして発現される。各ポリペプチドは、シグナル配列
の分解を伴なって細胞外へ空間への輸送を指図するシグ
ナル配列を用いて発現されるのが好ましい。本発明の第
一の見地によれば、F VIII−HCはC末端延長部を有する
融合タンパク質として発現されうる。延長部はBドメイ
ンN末端配列(これはトロンビンによる分解を許す)と
相同のポリペプチド配列、アミノ酸3〜100個のポリペ
プチドスペーサーおよびC末端Bドメイン配列と相同の
配列からなる。F VIII−HCのC末端延長の結果、真核生
物宿主細胞における発現時に活性ポリペプチドが高い収
率となる。本発明の第二の見地において、F VIII−HC
は、いかなるC末端延長部を有することなく正しいC末
端を有する真正な形で発現され、この場合さらに分解す
る危険性を含む後のトロンビン分解を避ける。F VIII−
LCはシグナルペプチドを用いてLCポリペプチドとして発
現されるのが好ましい。F VIII−LCポリペプチドはプロ
セッシングされ正しいN末端アミノ酸残基および正しい
グリコシル化を有して効率的に分泌される。適当な宿主
細胞中でF VIII−HCおよびF VIII−LCをコードするポリ
ヌクレオチドで同時トランスフェクションとすると第VI
II:C因子活性を有する組換体タンパク質複合体が高収率
が得られる。
もしくは二本鎖(ssもしくはds)でもよいDNAもしくはR
NAの配列またはDNA−RNAヘテロ二重鎖に関するものであ
る。
リペプチド発現の間にシグナルペプチダーゼにより認識
されそして作用されるペプチド配列に関するものであ
る。シグナルペプチドはシグナルペプチダーゼ分解に対
するペプチド部位をコードし、そして接続するポリペプ
チドを細胞外の基質へ導びく分泌経路へ輸送させる。
トを構成するヒト第VIII:C因子の当該部分に関する。A
ドメインは約740〜760個のアミノ酸を含み、天然ヒト第
VIII:C因子のN末端に見出される。Aドメインポリペプ
チドはアミノ酸10個通常はアミノ酸1個から少なくとも
アミノ酸約620個通常は少なくともアミノ酸約675個さら
に通常は少なくともアミノ酸約740個まで延長するであ
ろう。ポリペプチドはAドメインの少なくとも約85%
(ウッドら、前出)、さらに通常は少なくとも約90%、
好ましくは約100%を含み、そして場合によりBドメイ
ンのN末端の一部を含んでもよく、一般にはアミノ酸約
1405を越えない。特に興味があるのは、Arg740−Ser741
に血栓崩壊分解部位に対する完全配列を有するN末端鎖
である。
されそしてたとえばCOS7およびCHOのような哺乳動物細
胞中で発現された場合高度にグリコシル化される天然ヒ
ト第VIII:C因子の当該部分に関する。Bドメインはトロ
ンビンによるBドメインからAドメインの分解を許すN
末端配列を含む。Bドメインはまた哺乳動物細胞のゴル
ジ装置に位置する酵素によりA−B前駆体からCドメイ
ンを分解させるC末端プロセッシング部位を有する。N
末端およびC末端配列の配列は以下の実施例において説
明される。「Bドメインのほとんどのタンパク質」が欠
ける本発明の複合体は、N末端およびC末端を除いてB
ドメインのほとんどすべてを欠いている。
を構成し細胞内部で分解して第VIII:C因子のL鎖を形成
する天然ヒト第VIII:C因子の当該タンパク質に関する。
L鎖は第VIII:C因子ポリペプチドのC末端のアミノ酸配
列とほとんど同じ、一般的には第VIII:C因子Mr80K鎖の
少なくとも約80%さらに一般的には少なくとも約90%の
アミノ酸配列を有し、特にアミノ酸1570、一般的にはア
ミノ酸1600、特にアミノ酸1625、より特にアミノ酸164
0、好ましくは約アミノ酸1649、±10アミノ酸より特に
±アミノ酸で開始し少なくとも約アミノ酸2300、一般的
には2310、±10アミノ酸、好ましくは2325、±5アミノ
酸、より好ましくは末端アミノ酸(2332)で開始するも
のである。一般的には、L鎖はC1−C2ドメイン、好まし
くはA3−C1−C2ドメインの少なくとも約85%、さらに一
般的には少なくとも95%を有するであろう。
胞中におけるAドメインポリペプチドとCドメインポリ
ペプチドの同時発現に関する。AおよびCドメインをコ
ードするポリヌクレオチド配列は同一または異なった発
現カセットまたはプラスミド上にある。AおよびCドメ
インの同時発現は正しい折りたたみを生じることにな
り、その結果より高い活性と分泌効率を有するA−C複
合体を提供する。
を培養するのに適するいずれかの培地に関するものであ
り、実際に細胞「増殖」を生ずるか否かにかかわらず組
換体生成物の発現を得るために適する培地を含む。細胞
増殖培地は一般に水溶液中に栄養素および代謝可能なエ
ネルギー源を含む。所望により、細胞増殖培地はまた本
発明の組換体ポリペプチドの発現を引き起す化合物をも
含む。このような誘因化合物の選択は発現を調節するた
めに選択されたプロモーターにしたがう。他の代表的添
加物は選択化合物(すなわち、形質転換された宿主細胞
だけが培地中で生き残ることを確実にするために培地へ
添加される薬品または他の化学品)および血清たとえば
ウシ胎児血清(FBS)を含む。「血清不含有培地」は、
血清中に存在する必須の微量因子を血清の形で添加され
る必要のない程度まで供給された溶液である。市販され
ているものから入手可能な多くの適当な細胞増殖培地が
ある。
100のポリペプチド配列に関し、これはヒト第VIII:C因
子Bドメインと一般には相同でなく、そしてN−結合グ
リコシル化の滞在的部位を5個より少なく有するもので
ある。好ましくはこのような部位が2個以下である。現
在、Bドメインのグリコシル化の大きな寸法および高程
度がMr92Kポリペプチドの効果的発現を妨害すると信じ
られている。また、AドメインはBドメインの不存在下
で一定の塩基に正しく折り込まれずこのためAドメイン
のわずかなパーセントだけが正しく折り込まれそして発
現されるとも信じられている。
Aドメインに対しC末端延長部を提供し、明らかにポリ
ペプチドを安定化しそして活性形での分泌を向上する。
すなわち、軽くグリコシル化された(または全くされな
い)ポリペプチドを使用することで標準長さの第VIII:C
因子の発現を遮る同じサイズ問題にAドメイン−スペー
サー構築物が遭遇することを妨げるであろう。現時点で
好ましいスペーサーは、ヒトIgH鎖ヒンジ特にヒトIgA1
から由来するものである。このスペーサーは免疫原性エ
ピトープを添加することなく(ヒトに投与した場合)、
フレキシブルな延長部をもたらす。本発明の第二の見地
によれば、Bドメインが完全に除かれたMr92Kポリペプ
チドをMr80K鎖と一緒に同時発現した場合非常に高くそ
して有効な凝固活性が得られうる。
レオチドまたは2つのポリペプチドの間が同一であるか
またはほとんど相似であることを意味する。一般的に
は、鎖における通常10%以下、さらに通常5%以下、好
ましくは約1%以下のアミノ酸数が第VIII:C因子Aおよ
びCドメインに天然に存在するアミノ酸と異なる。特
に、約5%以下、さらに通常約1%以下が非伝統的置換
基である。伝統的置換には次のようなものが含まれる: GlyAla; LysArg; ValIle Leu; AsnGln;and AspGlu; PheTrpTyr. 非伝統的変化は、前記アミノ酸の1つを異なった基か
らのアミノ酸で置換すること(たとえばGluに対しAsnを
置換すること)または前記アミノ酸のいずれかに対しCy
s,Met,HisまたはProを置換することである。
ヒト第VIII:C因子で治療可能な疾患を有する患者の治療
に効果を及ぼすことのできるタンパク質の量に関する。
一般に、本発明のタンパク質複合体は天然ヒト第VIII:C
因子とほぼ同じ活性であり、そして同様の量で投与され
うる。本発明タンパク質複合体の比活性は以下に記載の
ように当該技術で公知の手段により(たとえば市販され
ているコアテスト分析(Coatestassay)を用いて)測定
される。
細胞を形質転換しうる発現カセットの濃度に関する。
されうる。ポリヌクレオチド構築物の各々は転写の5′
−3′−方向に、転写開始および翻訳開始領域、シグナ
ルペプチド配列をコードする配列からなる領域をコード
する構造遺伝子および第VIII:C因子HまたはL鎖をコー
ドする配列と、それに続く翻訳および転写終結配列を有
する。たとえばこれらの特定要素の選択は当該技術の知
識の範囲内である。
なった配列からなる。これらの配列はエンハンサー配
列、RNAポリメラーゼ結合部位、RNAキャッピング部位、
リボソーム結合および翻訳開始部位等を含む。転写開始
領域は第VIII:C因子と結合する天然領域であるか、また
はより高度の転写効率を提供する代わりの配列である。
配列は哺乳類ウィルスまたは宿主細胞の遺伝子もしくは
異なった哺乳動物宿主からの遺伝子から得られ、これら
は宿主細胞中で活性である。多数の転写開始領域が単離
され哺乳動物宿主細胞中で操作可能であることを示す。
これらの領域には、SV40初期プロモーターおよび後期プ
ロモーター領域、アデノウィルス主要後期プロモーター
領域、アクチンプロモーター領域、サイトメガロウィル
スMr72K即時型初期タンパク質プロモーター領域、メタ
ロチオネインプロモーター等が含まれる。
ナル配列等が含まれる。終結領域は第VIII:C因子天然cD
NAの3′非翻訳配列から得られるか、または5′−開始
領域を得た同じ構造遺伝子または異なった構造遺伝子か
ら得られうる。3′−領域は開始領域のように転写レベ
ルに対し必須であるというわけではなく、このためその
選択は特定の選択より便利さの問題である。
のために小胞体の内腔へポリペプチドを向かわせるシグ
ナルペプチドをコードするリーダー配列が含まれる。場
合によりエンドペプチダーゼにより翻訳後プロセッシン
グされるプロペプチドをコードする追加の配列が含まれ
てもよく、ここでエンドペプチダーゼはペプチド結合を
分解し、プロペプチドを除去して成熟ポリペプチドを生
ずる。シグナルペプチドは天然産生のものでよく、N末
端ペプチドに対しては特にそうであり、またポリペプチ
ドのプロセッシングおよび成熟をもたらすいずれのシグ
ナルペプチドでもよい。
とえば組織プラスミノーゲンアクチベーター、免疫グロ
ブリンH鎖およびL鎖、ウィルス膜糖タンパク質たとえ
ば単純ヘルペスウィルス糖タンパク質gBおよびgD,α1
−抗トリプシン等が含まれる。α1−抗トリプシンシグ
ナルペプチドは、正しいN末端を有するペプチドの高い
レベルの発現のためにF VIII−LCポリペプチドの分泌に
現在のところ必要である。
DNA配列はリーディングフレームにあるように結合され
なければならない。使いやすい制限部位が利用できる場
合、付着末端またはブラントエンドを正しく結合しても
よい。しかしながら、ほとんどはアダプターを使用して
ここでコード配列の一部を合成アダプター中に再形成し
截断構造遺伝子および/または截断シグナル配列をアダ
プターを介して結合し、これにより正しいリーディング
フレームにあるようにする。シグナル配列および構造遺
伝子の部分的制限地図を作り、制限部位特に独特の制限
部位を同定してもよく、これを用いて適当なアダプター
により正しいリーディングフレームに2つの配列を一緒
に連結する。これに代わり、独特の制限部位をシグナル
配列と成熟ポリペプチドコード配列の接合部にインビト
ロ突然変異誘発により挿入してもよい。
始コドンおよび翻訳終結のための1つ以上の停止コドン
を備える構造遺伝子の一部であるのが普通である。開始
コドンはシグナル配列の第一のコドンであろう。停止コ
ドンは終結領域の一部として適当に加えられるかまたは
完全な終結領域を準備するための転写終結領域へ連結す
るための都合の良い3′末端を提供するためにコード領
域へ加えられる。
配列、ポリペプチドの1つをコードする構造遺伝子核酸
配列および開始領域の転写および翻訳対照物、およびmR
NAを翻訳終結のプロセッシングを調節する転写および翻
訳終結領域)は特定のヌクレオチド配列を同定するが、
これを常法により結合してもよい。通常、得られた配列
は制限部位を含むかまたは成分部位を含むように修飾さ
れ、次いで相補的オーバーハングまたは付着末端が存在
する場所でアニールする。修飾はしばしば所望の付着末
端を提供するためのリンカーの導入により非コード領域
にある。宿主細胞が必要な結合をもたらすとはいえ、宿
主細胞導入前に末端を結合するのが一般的である。
てもよい。分泌される糖タンパク質の量の増幅が所望の
場合、F VIII:Cの発現カセットを適当な処置により遺伝
子のコピー数の自然増加が選択される遺伝子に連結され
る。このような遺伝子にはヒトメタロチオネイン遺伝子
およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝式が含まれ
る。これらの遺伝子はこれら自体の転写および翻訳調節
配列を有するカセットに置かれる。重金属イオンCたと
えばカドミウム)またはメトトレキセートの濃度増加に
耐性の細胞クローンを選択することにより、興味ある遺
伝子(発現カセット)が宿主細胞中で同時増殖する。
複製システムからなるベクターの一部であり、この複製
システムは宿主細胞への発現カセットの安定なエピソー
ム維持または取込みをもたらす。ベクターは、DNA構築
物およびベクターを欠失するこれらの宿主細胞からDNA
構築物およびベクターを含む哺乳動物宿主細胞を選択す
るための選択マーカーからなる。
乳動物宿主細胞に感染するウィルスから由来するもので
ある。代表的複製システムにはサルウィルス(Simian v
irus)40、アデノウィルス、ウシ乳頭ウィルス、ポリオ
ーマウィルス、エプスタインバールウィルス等からの複
製システムが含まれる。
る選択マーカーは、生物致死剤特に抗生物質に対する耐
性、または原栄養株宿主を提供するための栄養要求変異
株の相補性を含む。マーカーとして興味深い特定遺伝子
はカナマイシン耐性遺伝子(NPTII)、クロラムフェニ
コール耐性遺伝子(CAT)、ペニシリナーゼ(β−ラク
タマーゼ)等を含む。
トの段階的または完全な物としての挿入を許す1つ以上
の制限部位を有する。しばしば、ベクターは細菌性複製
および選択システムを含み、これはそれぞれの手作業工
程の後でのクローニングを考慮している。この方法で
は、各段階における比較的多量の構築物を調製し、単離
し、精製し、正しい結合が起こっていることを証明する
ために試験し、そして次工程に使用する。
物宿主細胞を使用することができる。このような細胞に
はCOS7細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細
胞、マウス腎細胞、ハムスター腎細胞、HeLa細胞HepG2
細胞等が含まれる。
緒に連結するかまたは別々の核酸分子に準備される。発
現カセットは異なったベクターの一部または同じベクタ
ーの一部でよい。特定のベクターの状況において構築の
いずれの方法も好ましいとはいえ、主には便宜性の点で
ある。
ス.エフ.ユー(S.F.Yu)ら、Proc Nat Acad Sci USA
(1986)83:3194−98には自己不活性(“SIN")レトロ
ウィルス遺伝子トランスファーベクターの構築について
記載されている。SINベクターは3′LTRのU3領域からの
プロモーターおよびエンハンサー配列を欠失することに
より作られる。5′LTRにおける官能性U3領域は適当に
パッケージした細胞系における組換体ウィルス性ゲノム
の発現を許す。しかしながら、そのゲノムRNAの発現お
よびcDNAへの逆転写時に、本来のプロウィルスの5′LT
RのU3領域が換失しそして3′LTRのU3領域が置換され
る。したがって、SINベクターが組込むと、非官能性
3′LTR U3領域が官能性5′LTR U3領域に代わり、そ
してウィルスが標準長さのゲノム転写物を発現できなく
なる。
−デキストランの存在下にリン酸カルシウム沈でんDNA
またはDNAを形質転換に使用するのが好ましい。ポリヌ
クレオチドトランスフェクションに特に有用な合成脂質
はN−〔1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル〕−
N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリドであり、これ
は名称リポフェクチン(Lipofectin)登録商標(BRL.ガ
イサースブルグ(Gaithersburg)、MD)として市販され
ており、ピィ.エル.フェルガナー(P.L.Felgner)
ら、Proc Nat Acad Sci USA(1987)84:7413により記載
されている。ウィルスが関連する場合、トランスフェク
ションまたは形質導入を使用してもよい。宿主細胞を形
質転換する特定の方法は本発明にとって重要ではなく、
ほとんど発現カセットが複製システムに結合するかどう
かおよび複製システムならびに関連する遺伝子の性質に
よる。
地で増殖する。2つのF VIII:C鎖の複合体として生成物
が得られ、培地または細胞溶解物を単離し、第VIII:C因
子活性複合体を抽出し精製する。抽出および精製のため
に様々な手段が利用でき、たとえばアフィニティクロマ
トグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマ
トグラフィ、電気泳動、溶媒−溶媒抽出、選択的沈降、
等である。生成物を単離する特定の方法は本発明で特に
重要というわけではなく、変性および不活化を最小限に
し高純度活性生成物の単離を最大にするために選択され
る。
とも0.02U/ml、通常は少なくとも約0.2、さらに通常少
なくとも約0.5U/mlの活動度を有するように準備され
る。問題となる生成物は、抗体特にF VIII−LCに対する
モノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラ
フィ、電気泳動、抽出、HPLC等により精製されうる。
びL鎖の複合体の製造を提供する。実験の章で記載した
ように状態調節した培地により製造が明らかになり、こ
れはCoatest分析において第VIII:C因子活性少なくとも
約50、通常は約70mU/ml、さらに通常約300mU/mlを有す
る。
抗体製造のための免疫原として、アフィニティクロマト
グラフィによるフォンウィレブランド因子の単離のた
め、第VIII:C因子に対する診断分析のため、および血友
病患者その他の血液凝固疾患を有する患者の治療に対す
る様々な用途を有する。問題となるタンパク質複合体
を、生理学的に許容されうる担体たとえば水、食塩水、
リン酸緩衝化食塩水、およびクエン酸緩衝化食塩水中
で、約10〜200U/mlの濃度範囲にて投与することができ
る。投与方法および量については米国特許第3631018
号;第3652530号および第4069216号を参照せよ。他の通
常の添加剤もまた含まれる。
に対するさらに進んだ案内を提供するものであり、いず
れにしても本発明を制限するものではない。
実施者に対する案内として準備されたもので、いかなる
方法でも本発明を制限するように構成されるものではな
い。
3bp)を用いて調製した。
うに構築した。SV40オリジンまたは複製物および初期プ
ロモーターを含む400bp BamH I/Hind IIIフラグメント
をpSVgt I(ポールベルグ、カリフォルニア、スタンフ
オードユニバーシティから入手)から切り取りそして調
製した。SV40ポリA添加部位を含む240bp SV40 Bcl I
/BamH IフラグメントをpSV/DHFR(スブラマニ(Subrama
ni)ら、Molec and Cell Biol(1981)1:854−864)か
ら切り取り精製した。以下のリンカーを介してフラグメ
ントを融合した: このリンカーはすべての3つのリーディングフレーム
において5つの制限部位とならびに停止コドンを含む。
得られた複製のSV40オリジン、SV40初期プロモーター、
停止コドンを有するポリリンカーおよびSV40ポリアデニ
ル化部位を含む670bpフラグメントをpML、約1.5Kb欠失
を有するpBR322誘導体(ラスキー(Lusky)およびボッ
チャン(Botchan)、Cell(1984)36:391)のBamH I部
位ヘクローン化してpSV6を得た。pSV6のpML配列におけ
るEcoR IおよびEcoR V部位をEcoR IおよびEcoR Vで消化
することにより排除し、Bal31ヌクレアーゼで処理して
各末端において約200bpを除去し、最後に再連結するとp
SV7aが得られる。Bal31再切断部はまた、EcoR V部位か
らほぼ200bp離れているSV40領域を側面に有する1つのB
amH I制限部位を削除した。第二のSV40領域を側面に有
するBamH I部位を削除するために、pSV7aをNru Iで消化
し、これを複製の起点から上流のpML配列においてカッ
トする。これをブラントエンド連結により再度環化して
pSV7bが得られた。
す。第一に、pSV7bをStu IおよびXba Iで消化した。次
いで、以下のリンカーをベクターへ連結してpSV7cを得
た: その後、pSV7cをBgl IIおよびXba Iで消化し、次いで
以下のリンカーと連結してpSV7dを得た: (B)pSVF8−92 pSVF8−92はMr92K F VIII−HC鎖に対する発現プラス
ミドである。ポリリンカーpSV7dにおけるBamH I部位か
ら出発して、pSVF8−92は、第VIII:C因子cDNAのヌクレ
オチド−30〜+14をコードするBamH IからSac Iまでの4
9bp合成リンカー−アダプター分子(翻訳開始部位の最
初のAから数える;配列を以下の(D)に示す)、以下
に記載するpSVF8−200に含まれる第VIII:C因子DNAから
のHind IIIフラグメントまでの2267bp Sac I(ヌクレ
オチド+2281まで)およびHind IIIからBamH IまでのpS
V7dからなる。
ミドである。ポリリンカーpSV7dにおけるSal I部位から
出発して、pSVF8−80は、ヌクレオチド−98〜+103(出
発コドンと比較して)であってBgl II部位で終結する組
織プラスミノーゲンアクチベーターcDNAの201bpフラグ
メント(tPA配列はエス.ジェイ.エフ.デギャン(S.
J.F.Degan)ら、J.Biol.Chem(1986)261:6972−6985)
に記載されている)と、インビトロ突然変異誘発(ゾラ
ー(Zoller)およびスミス(Smith)、Meth Enzymol(1
983)100:468)(pF8GM7)を介した第VIII:C因子cDNAの
ヌクレオチド5028に作り出されたBcl I部位からヌクレ
オチド7492にある3′非翻訳領域におけるBcl I部位に
わたる第VIII:C因子の2464bp Bcl Iフラグメントに連
結した第VIII:C因子のヌクレオチド+5002〜+5031をコ
ードする29bpの合成Bcl II−Bcl Iリンカーアダプター
と、およびcDNAクローニングから生ずるBgl II部位から
合成Pst I部位にわたるtPA3′非翻訳配列の400bpフラグ
メントと、それに続くベクターM13mp9(ヴイエイラ(Vi
eira)およびメシング(Messing)、Gene(1982)19:25
9)からのポリリンカーと次いでpSV7dとからなる。
対する発現プラスミドである。プラスミドpSVF8−200
(トゥレットらに記載)は完全な第VIII:C因子cDNAコー
ドと3′非翻訳配列をpSVF8−92について上記で記載し
たのと同じ5′非翻訳配列とともに含むものであり、以
下のように調製した。
ーターの下流のポリリンカー領域において切断した。
5′非翻訳領域の最後の30bpとヒト第VIII:C因子コード
配列の最初の15bpをコードする以下の49bp BamH I−Sa
c Iリンカーアダプターを化学的に合成しpSV7dに連結し
た。
過剰のリンカーを除去しそしてSal Iで消化してSac I突
出部を作った。
を含むpF8−102からの2.9KSac Iフラグメントおよびフ
ラグメント2、因子の3′コード領域を含むpF8−6.5か
らの6.5KSac I−Sal Iフラグメントおよびリンカーアダ
プターを含むpSV7d修飾ベクターを一緒に連結した(ト
ゥレットら、前出参照)。この連結混合物を用いて大腸
菌(E.coli)HB101を形質転換し、アンピシリン耐性に
よりコロニーを選択した。
9KSac Iフラグメントを用いてコロニーフィルターハイ
ブリダイゼーションにより300個の形質転換体をスクリ
ーンした。両方のプローブで陽性のコロニーを制御マッ
ピングにより分析した。プラスミドpSVF8−200はヒト第
VIII:C因子遺伝子の完全コード領域およびSV40初期プロ
モーターに対し転写方向で正しく融合した5′非翻訳領
域を含むものであるが、これが得られた。
×105細胞を用いて、クロロキニンジホスフェートを用
いた処理(ルスマン(Luthman)およびマグヌッソン(M
agnusson)、NucAcid Res(1983)11:1295−1308)と合
わせてリン酸カルシウム共沈法(ファンデルエブ(Van
der Eb)およびグラハム(Graham)、Meth Enzymol(19
80)65:828−39)を用いてCOS7細胞(グスマン(Guzma
n)、Cell(1981)23:175)へトランスフェクションし
た。細胞もまたソムパイラック(Sompayrac)およびダ
ンナ(Danna)、Proc Nat Acad Sci USA(1981)78;757
5−78のDEAE−デキストラン法によりトランスフェクシ
ョンした。
トレプトマイシン、292μg/mlグルタミンおよび110μg/
mlピルピン酸ナトリウムを供給した。ダルベッコ変性イ
ーグル培地にてCOS7細胞を培養した。トランスフェクシ
ョン後88時間での血清含有培地の48時間採集からサンプ
ルを得た。
胞から除き、アリコートを−70℃で貯蔵した。標準的凝
結分析(ハーディスティ(Hardisty)ら、Thromb et Di
athesis Haemolog(1962)72:215)において、サンプル
を第VIII:C因子欠失血漿の延長された部分的トロンボプ
ラスチン時間を減少しうる能力について試験した。外因
的に供給された第VIII:C因子の濃度の線状関数として活
性化第X因子(Xa)の発生を測定するものであるより特
異的コアテスト分析(ローゼン(Rosen)ら、Thromb an
d haemostasis(1985)54:818−823)を用いて凝結分析
の結果を確かめた。免疫学的反応性第VIII:C因子タンパ
ク質の培地における濃度を、Mr92Kポリペプチドを検出
するために引き出された放射線免疫検定法(RIA)およ
びMr80Kポリペプチド(ノルドファング(Nordfang)
ら、Thromb and Haemostasis(1985)53:346)に対し特
異的な酵素連結イムノソルベントアッセイ(ELISA)に
より測定した。
ポリペプチド単独の発現は、個々のタンパク質の各々が
状態調節された培地において高レベルで存在したとして
も何らの検出可能な活性を作らなかった。細胞をpSVF8
−92およびpSVF8−80プラスミドで同時トランスフェク
ションした場合、培地は凝結活性約20mU/mlを含有して
いた。完全第VIII:C因子タンパク質をコードするプラス
ミドpSVF8−200でトランスフェクションした細胞により
同じ相対レベルの凝結活性が分泌された。
ンしたものからの状態調節した培地を一緒に混合する
(第1表に略記したように幾つかの異なった状態を用い
る)と、何らの活性も測定されなかった。
キシル末端ドメインの複合体が本来的凝結活性を保持
し、内部ドメインは別々の鎖からの活性複合体の活性ま
たはアッセンブリーのいずれに対しても必須ではないこ
とを示している。
れた bプラスミドは別々の細胞へトランスフェクションさ
れ、48時間後に上清液を混合した 様々な混合条件をテストし、たとえば10mM CaCl2の存
在または不存在下に37℃、20℃または4℃にて2時間ま
での様々な時間予備インキュベーションする等を行なっ
た。この表における値は得られたデータの代表的なもの
である。
得た:指示されたプラスミドでトランスフェクションさ
れたまたは偽物でトランスフェクションされたCOS7細胞
の増殖により状態調節された培地75μのアリコート
を、一段階分析により第VIII:C因子欠失血漿の延長され
た部分的トロンボプラスチン時間を減少する能力として
分析した。簡単に言えば、プレートリン(Platelin)
(ジェネラル ダイアグノスティクスGeneral Diagnost
ics)75mlを37℃で3分間インキュベートし、続いて第V
III:C因子欠失血漿75μ+試験サンプル75μをさら
に添加し37℃でさらに5分間インキュベーションした。
予め温めた0.025M CaCl2のアリコート75μを加え、
凝結時間をベクトン−デイキンソン フィブロメーター
で測定した。COS7細胞培地中で希釈した通常のヒト血漿
を標準物として使用した。活性1mUを第VIII:C因子タン
パク質約100pgに相当すると仮定する(ファイ(Fay)
ら、Proc Nat Acad Sci USA(1982)79:7200)。
いて第VIII:C因子の濃度の直線状関数として活性化第X
因子(Xa)の発生を測定した。第Xa因子の濃度を、第Xa
因子に対する合成ペプチド基質からのクロモゲンパラニ
トロアニリンのタンパク質分解により測定する。50mM
トリス−HCl、pH7.3、0.2%BSAで希釈した普通のヒト血
漿を標準物として使用した。
I:C因子阻害IgGを0.1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.8中3.5
μg/mlの濃度で96凹部ポリスチレンミクロタイタープレ
ート上の各凹所へ塗布し、一晩37℃でインキュベーショ
ンした。プレートを0.1M NaCl、0.05%トゥイーン登録
商標20で3回洗浄し、続いて両方とも0.05Mイミダゾー
ル、0.1M NaCl、1%ウシ胎児血清アルブミン、0.05%
トゥイーン登録商標20、pH7.3で希釈された試験培地サ
ンプルおよびヨウ素化第VIII:C因子Mr92Kタンパク質の
混合物でインキュベーションした。第VIII:C因子Mr92K
タンパク質を血漿から単離し、SDS−PAGEおよび銀汚染
法により推定されたように50%以上が均質であった。室
温で16時間インキュベーション後、プレートを洗いそし
て個々の凹部における125Iの量をガンマ計測器で測定し
た。凝結活性0.5単位/mgの比活性を有する中程度に精製
された市販の第VIII:C因子製剤(第VIII因子、ノルディ
スク(NORDISK))を標準物として使用した。この標準
物をWHO第三国際第VIII:C因子標準物に対し基準化し
た。我々はこの中程度に精製した標準物をMr92KRIA活性
/第VIII:C因子凝結活性比1を含むように定義した。
C因子−阻害IgGを0.1M炭酸ナトリウム、pH9.8中に濃度
4.5μg/mlで96凹部PVCミクロタイター板の凹部へ塗布
し、一晩37℃でインキュベートした。凹部を上述のよう
に洗浄し、0.1Mイミダゾール、0.15M NaCl、1%BSA、
0.05%トゥイーン20、pH7.3で希釈されたヒト阻害IgGの
ペルオキシダーゼ抱合体F(ab′)2フラグメントを添
加して室温で16時間最後にインキュベーションした。o
−フェニレンジアミン溶液で色が発現した。普通のヒト
血清を標準物として使用した。
ことを証明するために、第VIII:C因子に特異的な抗体に
よる阻害に対する凝結の感受性を測定した。分析の前
に、状態調節した培地のアリコートを、普通のヒト血清
の希釈物の存在下にまたは第VIII:C因子に対する阻害抗
体の高い力価を発現した血友病患者からの血清の希釈物
の存在下に、37℃で2時間予備インキュベートした。第
2表で示されるように、完全分子ならびにMr92K−80K複
合体の活性は阻害血清により特異的に減少した。Mr80K
種に結合する3つの異なった阻害モノクローナル抗体を
用いて同じ結果が得られた。阻害血清を用いて第VIII:C
因子活性の阻害を以下のように研究した:指示されたCO
S7細胞状態調節化培地160μを、ヒト第VIII:C因子阻
害血清の100培希釈物20μ(ベセスダカ価1500単位)
またはプールした普通のヒト血清の同様希釈物または緩
衝液単独(50mMイミダゾール、0.1M NaCl、100μg/ml
BSA pH7.3)を用いて37℃で2時間インキュベートし
た。次いでこれらのサンプルを上記で概略した残留凝結
活性について分析した。
繰り返した:状態調節した培地100μを、ハイブリテ
ッヒ(Hy−britech)からの抗−第VIII:C因子モノクロ
ーナル抗体の1μg/μ溶液10μ(ベセスダカ価14,0
00単位)または緩衝液のいずれかを用いて37℃で2時間
インキュベートし次いで上述のように分析した。結果を
第3表に示す。
Kタンパク質に特異的なMAbカラム上を通過させることに
より活性種を部分的にCOS7細胞培地から精製した。第4
表に示すように、施こされた活性の約65%がカラムによ
り保持されこの結合物質の50%が活性形で溶出し最初の
培地中5培以上の濃度で溶出した。すなわち、Mr80K種
にだけ特異的な抗体を用いてアフィニティクロマトグラ
フィにより活性複合体を単離することができる。セファ
ロースCL4Bに結合した抗−80Kモノクローナル抗体(56I
gG)(ノルデュファング(Nordfang)ら、Thromb Haemo
stasis(1985)53:346)100μgを、全活性度6.2mU(pS
VF8−92およびpSVF8−80プラスミドで同時トランスフェ
クションしたCOS7細胞から得られたCoatest分析により
測定)を含む培地1.4mlで20℃にて一晩インキュベート
した。インキュベーション後、スラリーをカラムへか
け、流出するフラクションを集めた。カラムを緩衝液A
(50mMイミダゾール、0.1M NaCl、0.1%ナトリウムイ
ンシュリン、0.2%NaN3、pH7.3)300μで洗浄し、次
いで緩衝液B(2.5M NaCl、50%エチレングリコール、
0.5Mイミダゾール、0.1M CaCl2、0.1%ナトリウムイン
シュリン、0.2%NaN3、pH7.3)300μで溶出した。
かまたは完全なタンパク質の全体の約40%を含むリンカ
ー(“B")領域の発現は第VIII:C因子活性にとって必要
ではないということがわかる。個々のMr92KおよびMr80K
領域の同時発現の結果、第VIII:C因子をコードする領域
全体の発現から得られるものと匹敵する第VIII:C因子活
性のレベルが得られる。これらのタンパク質はインビボ
で集まってカルシウム橋により結合された活性複合体を
形成する。この集合体はB領域の存在を必要とせずそし
てトランスに発現した二本の鎖に対し有効に生ずる。
シグナル配列を有する独立して発現したN末端フラグメ
ントおよびC末端フラグメントを直接作ることにより達
成されうることが明らかである。したがって、第VIII:C
因子は、大きな前駆体をクローン化する必要がなくそし
て第VIII:C因子活性をコードする配列として使用される
ので、より有効に得られうる。したがって、標準長さの
第VIII:C因子タンパク質の適正な成熟に対する能力が欠
けているかもしれない第VIII:C因子の発現に細胞を使用
しうる。
パク質の発現は作られたMr80Kタンパク質の量と比較し
て低かった。Mr92Kタンパク質は明らかにゴルジ経路中
に保持されおよび/または分解され、有効にプロセッシ
ングされまた輸送されない。したがって、構築物をMr92
Kタンパク質のレベルを増加する試みで修飾した。以下
の型の修飾を行なった:第VIII:C因子遺伝子の5′非翻
訳配列における変化;異種5′非翻訳およびリーダー配
列の含有;および3′非翻訳配列における変化。これら
の構築を以下に要約する。
の誘導体であり、この中でpSVF8−92の5′非翻訳配列
の30bpをヒト第VIII:C因子cDNA(ヌクレオチド1〜171;
トゥレットらの第8図参照)の完全な5′非翻訳領域で
置換し、G−C尾部を欠失(部位特異的突然変異誘発)
し、そして3つの塩基が出発ATG(+172位、第8図、ト
ゥレットら、前出)において以下に示すように変化し
て、真核生物細胞における有効なメッセージ翻訳のため
のコザック(Kozak)の好ましい配列と一致する: この変化はシグナルペプチドの二番目のアミノ酸をGl
nからGluへ変化させることである。
ら第VIII:C因子配列の誘導されるポリリンカーをSal I
部位を除いて除去し、そして5′非翻訳領域におけるAT
Gコドン(トゥレットら、前出による41位)をインビト
ロ突然変異誘発によりATTへ変えるpSVF8−92Bの誘導体
である。
の添加。これらのプラスミドはpSVF8−92Bの誘導体であ
り、5′非翻訳配列ならびに天然第VIII:C因子シグナル
配列をヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター(tP
A)cDNAからの類似領域で置換するものである。pSVF8−
92Gにおいて、tPAプレ−プロ領域の最初の35個のアミノ
酸(シグナルおよびプロー配列)を、Mr92Kタンパク質
の最初のアミノ酸(アラニン)を置換したセリンを用い
て第VIII:C因子Mr92Kを成熟するために結合する。pSVF8
−92HにおいてtPAプレ−プロ領域の最初のアミノ酸32個
を結合して第VIII:C因子Mr92Kタンパク質を成熟する。p
SVF8−92Iにおいて、tPAプレ−プロ領域の最初のアミノ
酸23個を結合して第VIII:C因子Mr92Kタンパク質を成熟
する。tPA配列はpSVF8−80に記載されたものと同じであ
る。
域が単純ヘルペスウィルス(HSV−1)gD5′非翻訳配列
75bpおよびHSV−1 gDシグナル配列75bpで置換されて
いるpSVF8−92Gの誘導体である。pSVF8−92JもまたAla
→Ser置換が欠失している(アール.ジェイ.ワトソン
(R.J.Watson)ら、Science(1982)218:381−384)。
ード領域がヒト第VIII:C因子cDNAの翻訳ストップコドン
および天然3′非翻訳配列に直接融合したpSVF8−92Bの
変形である。
2Cの3′非翻訳配列をpSVF8−80の3′非翻訳領域で置
換したpSVF8−92Cの誘導体である。
VF8−80および例1(F)に記載のような第VIII:C因子
活性を試験するための培地とともにCOS7細胞へトランス
フェクションした。
倍良い活性レベルを示した。残りのプラスミドのうち、
pSVF8−92Eが最も良くpSVF8−92Bよりも1.65倍良好であ
ることが明らかであった。pSVF8−92JおよびIもまたpS
VF8−92より実質的により高い発現レベルであり、pSVF8
−92Eと近似している。pSVF8−92Gの発現レベルはpSVF8
−92とほぼ同じで、一方pSVF8−92HのそれはpSVF8−92
よりかなり低かった。pSVF8−92CとpSVF8−92Lの発現レ
ベルはpSVF8−92Eのそれと等しいようである。
チドを作る構築物の調製について記載する。これらの誘
導体は、より安定でありそして/またはL鎖との活性複
合体を効率良く組立てるH鎖を発生させる目的で作られ
る。第VIII:C因子の血漿由来製剤中および標準長さの組
換体第VIII:C因子を発現する細胞からの細胞溶解物およ
び状態調節した培地中で観察された分子種を模倣するよ
うに誘導体を選択する。ほぼ同じサイズのポリペプチド
が標準長さのトロンビン分解により多分生じるであろ
う。
鎖をコードするものであり、Bドメインコード領域の最
初のSac I部位で分解することにより標準長さのcDNAプ
ラスミドpSVF8−302から調製された。オリゴヌクレオチ
ドアダプターを用いて、翻訳ストップコドンが付きそし
てコード配列を第一のBcl I部位で開始する天然ヒト第V
III:C因子非翻訳配列へ融合した。このプラスミドは天
然ヒト第VIII:C因子の最初の978個のアミノ酸とカルボ
キシ末端での4個の置換アミノ酸残基をコードする。
H鎖を提供し、pSVF8−200と同じであるがしかしpSVF8
−92Eの5′非翻訳領域を有する標準長さのクローン(p
SVF8−303と命名)から調製された。pSVF8−303をEcoR
VとSam Iで分解し、ブラントエンドを一緒に連結してpS
VF8−160を形成した。このプラスミドは第VIII:C因子の
最初の1315個のアミノ酸をコードするベクターpSV7d
aポリリンカーの融合の結果8個の置換アミノ酸がカル
ボキシ末端で加わる。
H鎖を提供し、これもまたpSVF8−303から調製された。
pSVF8−303をBgl IIで部分的に消化し、その結果得られ
る6811bpフラグメントをゲル単離し、端部を一緒に連結
してpSVF8−170を形成した。このプラスミドは第VIII:C
因子の最初のアミノ酸1405個をコードし、ベクターpSV7
dのポリリンカーの融合のために11個のアミノ酸のカル
ボキシ延長部を有する。
H鎖を提供し、pSVF8−303から調製された。プラスミド
pSVF8−303をApa Iで消化し,付着端をT4ポリメラーゼ
で満たした。得られた分子をさらにSam Iで消化し、DNA
自体が連結しそして大腸菌HB101中で増殖した。このプ
ラスミドは第VIII:C因子のアミノ末端からの1102個のア
ミノ酸とpSV7dポリリンカーによりコードされるカルボ
キシ末端での追加の5個のアミノ酸をコードする。
8−80および例1に記載の第VIII:C因子活性について試
験された培地とともにCOS7細胞へトランスフェクション
した。
較してかなり低い発現レベルを示した。しかしながら、
興味深いことに、pSVF8−160およびpSVF8−170について
のRIA対Coatest活性の比は約1.8であり、pSVF8−92Eに
ついては7.2である。この結果はこれらのより長いH鎖
誘導体がより高い比活性を有し、すなわちこれらがMr92
K分子自体より一層効率良く活性なサブユニット複合体
を組立てるということを示唆している。また、コアテス
ト活性に対する凝結活性の比は、Mr92Kが2.3であり完全
な分子が1.35であるのに比べて約1.7でH鎖が長くなる
と低くなり、このことはこれらのより長いポリペプチド
がMr92K+Mr80K複合体のものほど活性化されないという
ことを示す。
CHO細胞系の調製について記載する。
デノウィルス−2からの主要後期プロモーター(Ad−ML
P、マップ単位16−27.3)をハツカネズミDHFRcDNA(ジ
ェン.エイチ ヌクバーグ(J.H.Nunberg)ら、Cell(1
980)19:355−64)の5′非翻訳配列と融合することに
より構築した。小さなt抗原遺伝子のイントロンを含み
そしてSV40初期領域転写終結領域を有する初期転写単位
の一部をコードするSV40DNAをpSV2−ネオ(サウザーン
(Southern)およびベルグ(Berg)、J.Mol Appl Gen
(1982)1:327−41)から得、DHFRcDNAの3′非翻訳端
へ融合した。これらの三つの片をpBR322へサブクローン
してプラスミドpAd−DHFRを得た。
遺伝子を有するCHO−DUKX−B11細胞(ウルラウブ(Urla
ub)およびカシン(Chasin)、Proc Nat Acad Sci USA
(1980)77:4216−4220)を、3つのプラスミド':pSVF8
−92C、pSVF8−92EまたはpSVF8−80、およびpAd−DHFR
のリン酸カルシウム共沈を用い続いてグラハムおよびフ
ァンデルエブ(前出)の方法およびウィグラー(Wigle
r)ら、Cell(1978)14:725−731およびルイス(Lewi
s)ら、Somatic Cell Genet(1980)6:333−347に記載
の変法にしたがってトランスフェクションした。共沈物
には各プラスミド10μgまでが含まれていた。ヒポキサ
ンチンおよびチミジンが欠失した培地におけるDHFR(陽
性)表現型の発現について細胞を選択した。
生ずるものを同定後、得られた細胞系をメトトレキセー
ト中で増殖してDHFR遺伝子を増殖し第VIII:C遺伝子を同
時増幅した。濃度0.025〜0.2μMのメトトレキセートを
含む培地に細胞を被覆することにより選択を行なった。
メトトレキセート耐性クローンを再び第VIII:C因子活性
について分析した。
ノルドファンガ(Nordfang)ら、Thromb Haemostas(19
85)53:346−50の方法により第VIII:C因子L鎖免疫反応
性についてELISAにより分析した。第VIII:C因子H鎖免
疫反応性は、アール.エル.ブルッケ(R.L.Burke)
ら、J.Biol Chem(1986)261:12574−78に記載されたラ
ジオイムノアッセイ(RIA)を用いて評価した。92Kおよ
びKMr糖タンパク質の同時発現により形成される活性第V
III:C因子複合体を実施例1に記載のCOATEST分析により
測定した。
トランスフェクションに使用した3つのプラスミドすべ
ての産生物を同時に発現する4つの独立したCHO細胞系
を示す。第5表に示した第VIII:C因子活性値は初期に観
察されたものである。安定な細胞系による糖タンパク質
の発現は通常T−75フラスコ培地中通過後に向上する。
この例は10−C2系で見られ、最終的に状態調節した培地
1mlにつき第VIII:C因子活性200mUが得られた(第6
表)。これらの安定な細胞系のクローニングは、第VII
I:C因子の独立して発現したHおよびL鎖が活性複合体
を組立てチャイニーズハムスター卵巣細胞により分泌さ
れうることを説明する。
とは、第VIII:C因子発現を損失することなく多くの経路
で第5表の細胞系が増殖しうるという事実により示され
る。第VIII:C因子糖タンパク質の発現がメトトレキセー
ト選択により同時増殖しうる場合測定することが必要で
あった。これら4つの細胞系のすべてをメトトレキセー
トの幾つかの濃度における選択下に置いた。耐性コロニ
ー(増殖したDHFR遺伝子)がach系について得られ、こ
れらを第VIII:C因子活性についてスクリーニングした。
第VIII:C因子の発現はメトトレキセート耐性11−D5およ
び11−D6クローンにおいては失なわれるかまたは変化し
なかった。10−C2および8−C1から導びかれるメトトレ
キセート耐性クローンの間では第VIII:C因子の発現が変
化する(第6表参照)。
そのうち10についてのデータを第6表に報告する。第VI
II:C因子増幅の量がクローン間で変化し、このことはサ
ブユニット遺伝子のいずれか1つがDHFRカセットで同時
増殖されるか、または両方ともが増幅されるか、または
いずれもされないことを示唆する。これら4つの可能性
としてクローン8C1−A2、8C1−C2および8C1−C5を記載
する。同様に、30の10−C2のメトトレキセート選択誘導
体を評価し、そのうち20についてのデータもまた第6表
に示す。これらもまた活性スペクトルを有する。4つの
異なった同時−増幅の可能性の例としてクローン10C2−
A2、10C2−D2、10C2−B5および10C2−C6を記載する。
合体0.5U/mlを作るものがあり、この値は普通のヒト血
漿において見出される濃度の1/2である。第VIII:C因子
物質の分析および精製のために、第VIII:C因子ポリペプ
チドを発現するCHO細胞系を実験室規模での発酵により
増殖し組織培養液1〜2を調製した。この物質の分析
により、非増幅系からの免疫反応性第VIII:C因子の約10
%〜20%がCOATESTにおいて活性であることがわかる。
増幅系において、活性物質の割合は全免疫反応性生成物
の2%〜5%まで低下する。このことは第VIII:C因子の
H鎖およびL鎖のフラクションだけが集まって活性複合
体を組立てることを意味する。残りは遊離したサブユニ
ットとしてまたは分解した形で存在する。
日付でアメリカンタイプカルチュアコレクション(ATC
C)で寄託されそしてそれぞれATCC受入れ番号40222およ
び40223が与えられた。プラスミドpSVF8−200は1985年
7月17日にATCCに寄託されATCC受入れ番号40190が与え
られた。
ミノ酸を修正するためのプラスミドpSVF8−80の修飾に
ついて記載する。工学技術の結果、80KMr糖タンパク質
の独立した分泌に必要なシグナルペプチド(例1)を提
供するものはヒト血漿第VIII:C因子L鎖の普通のアミノ
末端残基をSerで置換したものである。tPAプレ−プロペ
プチド配列を変化する目的で新規プラスミドを作り、そ
のため第VIII:C因子L鎖はタンパク質分解プロセッシン
グ後の突然変異Ser残基の代わりにそのアミノ末端にGlu
残基を有するであろう。
により分泌する前すなわち細胞内で標準長さの第VIII:C
因子前駆体から分解されると考えられている。この分解
はアミノ酸残基1648と1649(Arg−Glu)の間で生じる。
ポリアクリルアミドゲルにおいてL鎖はそれぞれ1つま
たは2つのN−結合オリゴ糖を有するポリペプチドを表
わす77および80KMrバンドの二重線として表われる。L
鎖の独立した分泌は第VIII:C因子cDNAのL鎖コード領域
をtPAのcDNAへ融合することにより達成された。しかし
ながら、tPAシグナルペプチドを供給する方法におい
て、第VIII:C因子L鎖のアミノ末端は天然グルタミン酸
残基からセリンへ突然変異を起こした。この突然変異誘
発組換体L鎖は標準長さの組換体第VIII:C因子から由来
する鎖と同じ分子特性を示すが、以下のような予備的証
拠もある:1)第VIII:C因子前駆体から分解した鎖と同じ
方法で代わりにグリコシル化されないかもしれない、
2)イオン交換およびvWFセファロースクロマトグラフ
ィにより精製する間に異なった挙動を示すかもしれな
い、3)真正L鎖と抗原性が異なるかもしれない。
を放出するために3つのタンパク質分解を必要とする。
以下にtPA−第VIII:C因子80K融合物の領域においてpSVF
8−80のタンパク質コード配列の翻訳を示す: シグナルペプチダーゼ分解は、星印で示したようにSe
r(−13位)またはAla(−8位)のいずれかのカルボキ
シ部位で生ずると考えられてきた。二番目の分解は多分
Arg(−4位、上記◎で示した)のカルボキシ部位で生
じる。三番目のプロセッシング事象はArg−Ser結合での
タンパク質分解でありGly−Ala−Argのトリペプチドを
放出しそして成熟tPAまたは第VIII:C因子L鎖ポリペプ
チドにおけるSer(1位)アミノ末端をそのままにす
る。
コドン(1位)へ変えた。これは最初の2つのタンパク
質分解プロセッシング現象が正常に生ずる努力が行なわ
れ、そしてArg−Gluプロテアーゼが代わりの内容におい
てジペプチドを認識し分解するかどうか、すなわちtPA
トリペプチドが第VIII:C因子Bドメインに対し置換され
る場所を試験する。tPA−80K鎖融合領域を以下に示す。
その他の点ではこのプラスミドはpSVF8−80と同一であ
る。
コドンを欠失し、そしてSer(1位)コドンをGluに対す
るコドンへ変化させた。これは推定されたtPAシグナル
ペプチドのSer23(星印で示す)の後でGlu第VIII:C因子
L鎖残基を置く。Ser23のカルボキシ側におけるシグナ
ルペプチダーゼによる分解により非突然変異株第VIII:C
因子L鎖を放出する。pSVF8−80SのtPA−80K鎖融合領域
を以下に示す。その他の点ではこのプラスミドはpSVF8
−80と同一である。
3つのコドンの欠失をインビトロ突然変異誘発により行
ない、そしてSer(1位)コドンをGluに対する1つへ変
化させた。これを以下に示すpSVF8−80RのtPA−80K鎖融
合領域上に◎で印を付けたtPAプロ−ペプチドのArg32の
後にGluを置く。
テアーゼによる分解によりGluアミノ末端を有する第VII
I:C因子L鎖を放出するという希望で行なわれた。
により欠失させ、Ser(1位)コドンを推定上のtPAシグ
ナルペプチドコード配列のコドン28(Ala)(以下の星
印により示される)の後でGluコドンに代えた。Ala28の
カルボキシ側におけるシグナルペプチダーゼによる分解
で非突然変異誘発第VIII:C因子L鎖を放出する。tPA−8
0K鎖融合領域を以下に示す。その他の点では、このプラ
スミドはpSVF8−80と同一である。
いてトランスフェクションし、状態調節した培地をLC−
ELISAにより分析した。pSVF8−80の4つの誘導体すべて
はC−ELISAにおいて反応性であり様々な抗−第VIII:C
因子L鎖抗体で生合成的に放射能標識化した後免疫沈降
されうる80KMr糖タンパク質をコードする。pSV/8−80R
を除いて、すべての誘導体がpSVF8−80として80K糖タン
パク質のほぼ同じ量を分泌するようになる。pSVF8−80R
でトランスフェクションした細胞からの80K糖タンパク
質の分泌は非常に少なく、通常は他のプラスミドから作
られるものの25%未満である。これに加え、この第VII
I:C因子L鎖の出現はゲル電気泳動で異なり、ここでは
バンドは常に拡散する。
を用いてDUKX−B11CHO細胞へ導入した。L鎖の各タイプ
の製造のために永久細胞系を確立した。CHO細胞におけ
る80KMr糖タンパク質の発現は、分泌される糖タンパク
質の量およびゲル電気泳動上の80Kバンドの出現に関
し、COS7細胞における発現と非常に類似している。pSVF
8−80RでトランスフェクトされたCHO系は、この物質を
分析しない程低いレベルの80K糖タンパク質を作った。
たはトランスフェクションされた(増幅した)CHO細胞
系(pSVF8−80K細胞系10C2B5;pSVF8−80A、細胞系A1N;p
SVF8−80S、細胞系S1R)のいずれかからの状態調節した
培地を調製した。培地は10%FBSを有するDME H12であ
った。第VIII:C因子LCを、イオン交換クロマトグラフィ
とそれに続くアフィニティクロマトグラフィからなる二
段階法により配列決定のため精製した。イオン交換クロ
マトグラフィを以下のように実施した:S−FFセファロー
スカラム(15×0.8cm)を、0.02M MES、0.05M NaCl、
0.01M CaCl2pH5.8、λ20℃=7.2mSで平衡化した。状態
調節した培地(500〜1300ml)をpH5.8まで調整後流速10
0ml/hでカラムへ施こした。カラムを、10カラム容量の
0.05Mイミダゾール、0.05M NaCl、0.01M CaCl2、pH7.
35、λ20℃=8.8mSを用い流速200ml/hで洗浄した。F VI
II−LCを0.1M CaCl2の添加により洗浄緩衝液へ流速50m
l/hで溶出した。すべての操作を4℃で行なった。
た:ネズミ科モノクローナル抗−F VIII−LC抗体56−Ig
GをCNBr法によりセファロース4Bへ結合し密度2.5mg/ml
ゲルとした。F VIII−LC含有溶出液を、室温にて一晩、
F VIII−LC1000Uにつきゲル1mlで免疫吸着によりインキ
ュベートいた。次いでゲルをカラムにパックし、低塩分
緩衝液(0.05Mイミダゾール、0.15M NaCl、0.01M CaC
l2、10%グリセロール、0.02%NaN3、pH7.3)20カラム
容量次いで高塩分緩衝液(0.05Mイミダゾール、1.0M N
aCl、10%グリセロール、pH7.3)20カラム容量で洗浄し
た。1時間インキュベート後、0.05Mイミダゾール、0.1
5M NaCl、10%グリセロール中1M CaCl2を用いて免疫
吸着からF VIII−LCを溶出した。溶出液をただちにセフ
ァデックスG−25カラム中で0.05Mイミダゾール、0.15M
NaCl、0.01M CaCl2、10%グリセロール、0.02%トゥ
イーン80、0.02%NaN3、pH7.3の溶液へ脱塩化し、−80
℃で貯蔵した。N−末端配列分析をアプライドバイオシ
ステム477Aシークエンサーで行なった。
コード化される80K糖タンパク質はそのアミノ末端にト
リペプチド延長部を有する。多分これはtPAプロトリペ
プチドGly−Ala−Argであり、これはF VIII:C Bドメ
インを認識するArg−Gluプロテアーゼによるプロセッシ
ングができない。さらに、N末端配列は、tPAのシグナ
ルペプチドが実際にアミノ酸残基22個の長さであり、シ
グナルペプチダーゼ分解がPro22のカルボキシ側で生ず
ることを明らかにする。それゆえ、Ser23およびAla28の
後でシグナルペプチダーゼ分解を内包するプラスミド構
築物pSVF8−80SおよびpSVF8−80Aはそれぞれ80KL鎖にお
いて間違ったアミノ末端残基を導入する。
写および翻訳に続いてどうやってプロセッシングされる
かを断言することの困難さが明らかである。タンパク質
配列の修飾はタンパク質分解プロセッシングおよびオリ
ゴ糖追加についての予期せぬ配列を有し、そして分泌の
総体的効率に影響を及ぼすことができる。
を用いた真正F VIII−CL鎖の発現方法について記載す
る。
るcDNAを、ヒト肝臓cDNAクローンおよび合成オリゴヌク
レオチドのフラグメントを用いて組立てた;組立物をBa
mH I−Sal IフラグメントとしてpBR322へ連結してプラ
スミドpAT(Met)を作った(ローゼンベルグ(Rosenber
g)ら、Nature(1984)、312:77−80)。合成オリゴヌ
クレオチドリンカー−アダプターおよびシグナルペプチ
ドをコードするcDNAクローンの一部を用いてシグナルペ
プチドコード配列を5′端部におけるEcoR I制限部位と
ともにpAT(Met)のBamH I部位へ接続させる。得られた
127bpEocR I−Sal Iフラグメントはヒトα1−抗トリプ
シンの翻訳配列をコードしており、これをpSV7d(例1
に記載)のEcoR I−Sal I部位へ連結してpSVα1AT−Met
とした。
れはシグナルペプチドと成熟α1−アンチトリプシン配
列のコドンの間の境界で起きる。この制限部位の結合端
をヤエナリ(mung bean)ヌクレアーゼで除去してGAG
(Glu)コドンを放出し、そしてα1−抗トリプシン配
列をSal Iで消化することにより欠失した。F VIII:C80K
のコード配列は付着のためにpSVF8−80のコドン1およ
び2のインビトロ突然変異誘発により調製されEcoR V部
位(これはIleコドンとしてコドン2を保存する)を形
成した。これによりF VIII:CL鎖コード領域(コドン2
で出発するEcoR V−Sal I配列として)が正しいリーデ
ィングフレームにてα1−抗トリプシンのコドン1に融
合し、そして成熟ヒトα1−抗トリプシンのコード配列
を置換する。
ように翻訳される。tPAプレ−プロコード配列のための
α1−抗トリプシンシグナルペプチドコード配列の置換
を除いて、このプラスミドはpSVF8−80と同一である。
通常pSVF8−92Cでトランスフェクションした。状態調節
した培地をLC−ELISA、HC−ELISAおよびCOATESTにより
分析した。トランスフェクションした細胞をまた放射性
Metで標識化し、生合成された放射性標識化F VIII:CL鎖
を免疫沈降させそしてポリアクリルアミドゲル電気泳動
の後で可視化した。プラスミドSVF8−80ATはF VIII:CL
鎖の合成を示しこれは77−80KMrの二本鎖として表われ
る。COS7細胞において作られた量はpSVF8−80について
と同じ量である。pSVF8−92Cまたは他のF VIII:CH鎖プ
ラスミドとの同時発現は、COATEST分析において測定さ
れる活性F VIII:C複合体の製造を導びく。
濃度を低下させて、T−175フラスコ中COS7細胞のトラ
ンスフェクションにより精製のための物質を調製した。
トランスフェクションしてから60時間後、状態調節した
培地を集めた:精製およびアミノ酸配列分析を例5に記
載のように行なった。アミノ末端配列分析の結果(第8
表)により、pSVF8−80ATによりコードされるF VIII:CL
鎖が真正なヒト血漿F VIII:CL鎖と同じアミノ末端配列
を有することがわかる。
CH鎖との組換能力を第9表に示す実験で試験した。精製
したF VIII:CL鎖を、50mM Mn+2および150μMβ−メル
カプトエタノールを含む緩衝液中17U/mlで精製した組換
体(標準長さのヒトF VIII:Cから)とともに3.7U/mlの
濃度でインキュベートした。対照として、精製した組換
体HおよびL鎖を同じ条件下で再会合させ、作られた活
性F VIII:Cの量をCOATESTにより分析した。これらの結
果により80ATF VIII:CL鎖がインビトロで精製された組
換体H鎖と結合しうることがわかる。
ドについて記載する。メッセンジャーRNAの転写効率お
よび安定性を向上するために、転写開始の原因であるDN
A配列および非コード配列における修飾を行なった。短
かいペプチドが結合したBドメインのセグメントからな
るカルボキシ末端延長部によりH鎖糖タンパク質を修飾
した。これはより効率的に細胞から分泌され、組織培地
においてより安定であり、そしてL鎖とともにより効率
良く組立てるH鎖を得るために行なわれる。
転写レベルおよび安定性を向上する試みで、SV40初期転
写開始領域を、ヒトサイトメガロウィルス即時型領域
(ボスハート(Boshart)ら、Cell(1985)4:521−53
0)により置換した。さらに、SV40初期領域によりメッ
センジャーRNAへ寄与された5′非翻訳配列を、その最
初のイントロンを含むHCMV 1E1遺伝子の5′非翻訳配
列で置換した。このイントロンは、切り出された転写物
がより迅速なプロセッシングおよびより安定なmRNAを導
びくという仮定に含まれる。発現ベクターはまたCOS7細
胞における一時的発現を許す複製のSV40開始点およびア
ンピシリン耐性について選択することによりDNAクロー
ニングを許す細菌性β−ラクタマーゼ遺伝子を有する。
(例1に記載)の700bpSal I−Pvu Iフラグメント、SV4
0の複製開始点とβ−ラクタマーゼ遺伝子の残りを提供
するpSVT2(メイヤー(Myers)ら、Cell(1981)25:373
−84;リオ(Rio)ら、Cell(1983)32:1277−40)の140
0bpPvu I−EcoR I(クレノウポリメラーゼで満たされ
た)、Sal I部位がインビトロ突然変異誘発により1E1タ
ンパク質についての翻訳開始部位の近くに導入されたヒ
トサイトメガロウィルス(タウネ(Towne)菌株)のプ
ラスミドサブクローンから由来する1700bpSsp I−Sal
I、および第VIII:C因子92KMr糖タンパク質をコードする
cDNAを含むpSVF8−92C(例2に記載)の4300bpSal I−S
al Iフラグメントから構築された。
と相同のペプチドヒンジペプチドにより連結した第VII
I:C因子前駆体の中心(B)ドメインのN末端およびC
末端アミノ酸残基からなるC末端延長部を有する92KMr
組換体H鎖をコードするpSVF8−92Cの誘導体である。こ
れはpSVF8−92Cからの4900bpHind III−Sal Iフラグメ
ントからなり、110bpHind III−Sal I合成リンカー−ア
ダプターをこれへ挿入する(以下に示す)。
らなるカルボキシ末端延長部およびN−連結グリコシル
化の1つの可能性ある基をコードする。C末端ペプチド
はH鎖の分子量をほぼ96KMrまで上昇させ、これがグリ
コシル化されている場合は約99KMrまで上昇させる。
形成 F VIII:CL鎖H鎖複合体の補因子活性を、カビビトラ
ム(Kabivitrum)からの市販されている試験キット(CO
ATEST)を用いて評価した。免疫反応性F VIII:CL鎖をノ
ルディスクゲントフテ(Nordisk Gentofte)からのHZ
IgGコーティング抗体およびペルオキシダーゼ抱合抗体
を用いてELISAにより測定した。F VIII:CH鎖免疫反応性
をノルディスクゲントフテで開発したELISAを用いて定
量化し、これは阻害患者からのヒトポリクローナル(E
−IgG)を使用する。
ミドを様々なF VIII:CL鎖プラスミド(例5に記載)でC
OS7細胞へ同時トランスフェクトした。これらのトラン
スフェクションからの結果のサンプルを第10表に示す。
データによれば、CMV 1E1 プロモーター/エンハンサ
ーおよび1E1遺伝子の5′非翻訳配列を添加するとF VII
I:CH鎖発現において2.5倍の向上(平均)が得られるこ
とがわかる。
−80AT、例6に記載)を用いたCOS7細胞へのpSVF8−92t
β同時トランスフェクションの結果を示す。92tβH鎖
は92CH鎖より高いレベルで分泌され、これはシグナルア
ミノ酸(Ser)カルボキシ末端延長部を有するCOATEST
(COA)活性のELISA反応性糖タンパク質との比(複合体
形成の測定値)は92C鎖より92tβ鎖についての方が大き
い。さらに、92tβH鎖は血清不含有培地中で良く分泌
され安定であるようであり、タンパク質に対する活性の
比は10%FBS中とほとんど同じである。これらの結果に
より、この34個のアミノ酸カルボキシ末端延長部が分泌
を向上しそして組換体F VIII:CH鎖を安定化することが
明らかである。
DNAへ暴露し、洗浄しそしてクロロキニンジホスフェー
ト含有培地で8時間処理した。細胞を洗浄して薬品を除
き、10%FBS含有DME H21 5mlで12〜16時間被覆し、次
いでハナ バイオケミカルズ(Hana Biochemicals)か
らのHB CHO登録商標でオーバーレイした。状態調節した
培地を記載したようにF VIII:C活性について分析した。
述の発明を詳細に記載したが、一定の変化および修飾は
添付の請求の範囲の範囲内で実施される。
現のための方法を記載する。
CH鎖はC末端延長部としてSer741を有する。C末端とし
てArg740を有するF VIII:CH鎖を得るために、pSVF8−92
Cから由来するコード配列の3′端部をコードするpCMVF
8−92/6Xの1588bpBamH Iフラグメントを精製した。この
フラグメントをm13mp18にクローン化し、Ser741残基を
インビトロ突然変異誘発により翻訳ストップコドンヘ変
える。pCMVF8−92R発現プラスミドを、オリジナルのベ
クターの5840bpBamH Iフラグメントへ突然変異誘発化フ
ラグメントをクローニングすることにより組立てた。こ
の方法によりF VIII:C3′非翻訳配列の680bpが欠失し
た。
ラハムおよびファンデルエブ、Virol(1973)52:456−6
7)を用いてF VIII:CL鎖プラスミド(pSVF8−80AT)
(例6に記載)でCOS7細胞へ同時トランスフェクション
した。培地をトランスフェクション後18および42時間で
培地を変えた、分析のための培地サンプルをトランスフ
ェクション後66時間で集めた。これらの分析の結果を以
下の第12表に示す。データによりpCMVF8−92RがF VIII
LCの発現を提供するプラスミドで同時トランスフェクト
するとF VIII:C活性が生じることがわかる。
日付でアメリカンタイプカルチュアコレクション(ATC
C)にブタペスト条約に基き国際寄託し、ATCC受入れ番
号40222および40223がそれぞれ与えられた。プラスミド
pSVF8−200を1985年7月17日付でATCCに寄託し、ATCC受
入れ番号40190が与えられた。
Claims (22)
- 【請求項1】ヒト第VIII:C因子活性を有する組換体タン
パク質複合体の製造方法であって、前記複合体がヒト第
VIII:C因子のAドメインと相同の第一のポリペプチドお
よびヒト第VIII:C因子のCドメインと相同性を有する第
二のポリペプチドを含んでなり、しかしヒト第VIII:C因
子のBドメインのすべてまたはほとんどの部分を欠失す
るものであり、該方法が次の工程: 細胞増殖培地中にて培養される真核生物形質転換宿主細
胞において (a)(i)分泌を指図しうる第一のシグナル配列、お
よび(ii)ヒト第VIII:C因子のAドメインと相同のアミ
ノ酸配列を有する第一の領域を含んでなる第一のポリペ
プチドをコードする第一のポリヌクレオチド、および (b)(i)分泌を指図しうるヒトα1−アンチトリプ
シンのシグナル配列、および(ii)ヒト第VIII:C因子の
アミノ酸1649〜2332のアミノ酸配列と相同のアミノ酸配
列を有する第二のポリペプチドをコードする第二のポリ
ヌクレオチドを同時発現し:そして 分泌された組換体タンパク質複合体を前記細胞培地から
得る、 ことからなる前記方法。 - 【請求項2】前記アミノ酸配列のアミノ酸の数の約5%
以下が第VIII:C因子AおよびCドメインの天然アミノ酸
配列と異なる請求の範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項3】第一のポリヌクレオチドによりコードされ
たポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第VIII:C因子のア
ミノ酸1〜740のアミノ酸配列と同じである請求の範囲
第1項に記載の方法。 - 【請求項4】第一のポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第VIII:C因子のア
ミノ酸1〜1102のアミノ酸配列と同じである請求の範囲
第3項に記載の方法。 - 【請求項5】第一のポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第VIII:C因子のア
ミノ酸1〜1315のアミノ酸配列と同じである請求の範囲
第4項に記載の方法。 - 【請求項6】第一のポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列がヒト第VIII:C因子のア
ミノ酸1〜1405のアミノ酸配列と同じである請求の範囲
第5項に記載の方法。 - 【請求項7】前記第一のポリペプチドがさらに、 (a)ヒト第VIII:C因子のBドメインのN末端配列;
(b)N−結合グリコシル化部位5個未満を有する3〜
100のアミノ酸のポリペプチドスペーサー;および
(c)ヒト第VIII:C因子のBドメインのC末端配列とを
含んでなる第二の領域を含む請求の範囲第1項に記載の
方法。 - 【請求項8】ヒト第VIII:C因子のBドメインのN末端配
列のアミノ酸配列がSer−Phe−Ser−Gln−Asn−Ser−Ar
g−His−Pro−Ser−Thr−Arg−Gln−Lys−Gln−Phe−As
n−Ala−Thrを含んでなる請求の範囲第7項に記載の方
法。 - 【請求項9】前記ポリペプチドスペーサーがヒトIgH鎖
ヒンジ領域と相同のペプチドを含んでなる請求の範囲第
7項に記載の方法。 - 【請求項10】ポリペプチドスペーサーのアミノ酸配列
がPro−Pro−Thr−Pro−Pro−Thrを含んでなる請求の範
囲第9項に記載の方法。 - 【請求項11】BドメインのC末端配列がPro−Pro−Va
l−Leu−Lys−Arg−His−Gln−Argを含んでなる請求の
範囲第7項に記載の方法。 - 【請求項12】第一のポリヌクレオチドがさらに、 (a)第一のポリペプチドの発現を増強する5′非翻訳
DNA配列であって、その際前記5′非翻訳配列は前記第
一の領域に対し5′に位置し、そしてその際前記5′非
翻訳DNAはヒト第VIII:C因子5′非翻訳DNA、SV40t抗原
5′非翻訳DNA、およびヒトサイトメガロウィルス1E1タ
ンパク質5′非翻訳DNAからなる群から選択されるも
の;または (b)第一のポリペプチドの発現を強化する3′非翻訳
DNA配列であって、その際前記3′非翻訳配列が前記ポ
リペプチドコード領域に対し3′に位置し、その際前記
3′非翻訳DNAはヒト第VIII:C因子3′非翻訳DNA、ヒト
組織プラスミノーゲンアクチベーター3′非翻訳DNAお
よびSV40t抗原3′非翻訳DNAからなる群から選択される
もの を含む請求の範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項13】前記α1−アンチトリプシンシグナル配
列がN−Met−Pro−Ser−Ser−Val−Ser−Trp−Gly−Il
e−Leu−Leu−Leu−Ala−Gly−Leu−Cys−Cys−Leu−Va
l−Pro−Val−Ser−Leu−Alaを含んでなる請求の範囲第
11項に記載の方法。 - 【請求項14】前記第二のポリヌクレオチドがさらに、 (a)前記第二のポリペプチドの発現を増強する5′非
翻訳DNA配列であって、前記5′非翻訳配列が前記第二
の領域に対し5′に位置し、その際前記5′非翻訳のDN
Aはヒト第VIII:C因子5′非翻訳DNA、SV40t抗原5′非
翻訳DNA、およびヒトサイトメガロウィルス1E1タンパク
質5′非翻訳DNAからなる群から選択されるもの;また
は (b)第二のポリペプチドの発現を強化する3′非翻訳
DNA配列であって、前記3′非翻訳配列が前記ポリペプ
チドコード領域に対し3′に位置し、その際前記3′非
翻訳DNAはヒト第VIII:C因子3′非翻訳DNA、ヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター3′非翻訳DNAおよびSV4
0t−抗原3′非翻訳DNAからなる群から選択されるもの を含む請求の範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項15】真核生物形質転換体宿主細胞が哺乳動物
細胞である請求の範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項16】第一のポリヌクレオチドおよび第二のポ
リヌクレオチドが別々の発現プラスミド中にある請求の
範囲第1項に記載の方法。 - 【請求項17】第一のポリヌクレオチドおよび第二のポ
リヌクレオチドが別々の発現プラスミド中にある請求の
範囲第7項に記載の方法。 - 【請求項18】ヒト第VIII:C因子活性を有する組換体タ
ンパク質複合体の発現を得るために真核生物宿主細胞を
形質転換するためのDNA組成物であって、 第一の発現カセットであって、分泌を指図しうる第一の
シグナル配列およびヒト第VIII:C因子のAドメインと相
同のアミノ酸配列を有する第一の領域を含んでなる第一
のポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドを
含んでなる発現カセット、および 第二の発現カセットであって、分泌を指図しうるヒトα
1−アンチトリプシンのシグナル配列およびヒト第VII
I:C因子のアミノ酸1649〜2332のアミノ酸と相同のアミ
ノ酸配列を有する第二のポリペプチドをコードする第二
のポリヌクレオチドを含んでなる発現カセット、 を含んでなる前記DNA組成物。 - 【請求項19】前記第一のポリヌクレオチドがさらに、 ヒト第VIII:C因子のBドメインのN末端配列、N結合グ
リコシル化部位5個未満を有するアミノ酸3〜40個のポ
リペプチドスペーサーおよびヒト第VIII:C因子のBドメ
インのC末端シグナル配列からなる第二の領域 を含む請求の範囲第18項に記載のDNA組成物。 - 【請求項20】前記第一のカセットポリヌクレオチドが
ヒト第VIII:C因子アミノ酸1〜740のアミノ酸配列の少
なくとも約90%を含んでなるポリペプチドをコードし、
前記第二のカセットポリヌクレオチドがヒト第VIII:C因
子アミノ酸1649〜2332のアミノ酸配列の少なくとも約90
%を含んでなるポリペプチドをコードする請求の範囲第
18項に記載のDNA組成物。 - 【請求項21】請求の範囲第18項に記載のDNA組成物を
含む宿主哺乳動物細胞。 - 【請求項22】請求の範囲第19項に記載のDNA組成物を
含む宿主哺乳動物細胞。
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