PT95923B - Processo para a preparacao de complexos proteicos possuindo actividade do factor viii.c - Google Patents

Description

CHIRON CORPORATION E NOVO NORDISK A/S ¹¹ PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE COMPLEXOS PROTEICOS POSSUINDO ACTIVIDADE DO FACTOR VIII:C

ÂMBITO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a complexos proteicos que possuem actividade de Factor VIII:C, e a métodos para se produzir os referidos complexos por expressão de construção po1inucleotídicas adequadas. Os complexos proteicos são úteis no tratamento da Hemofilia clássica (Tipo A).

ÂMBITO DA PRESENTE INVENÇÃO

A hemofilia A é uma doença hereditária ligada ao cromossoma X que atinge 1-2 individuos do sexo masculino em 10 000. Esta doença é causada por uma ausência ou deficiência de Factor VIII :C. 0 Factor VIII:C consiste numa glicoproteína muito grande (Mr nativi 330K360K), que se encontra presente no plasma em concentrações extremamente baixas. E um elemento necessário para a cascata proteolitica que converte o fibronogénio solúvel em fibrina insolúvel, formando um coágulo para evitar a perda de sangue a partir dos tecidos traumatizados. Descobriu-se no fluxo sanguíneo em associação não covalente com o Factor VIII:R (Factor de von Willebrand) que actua como uma proteína estabilizante de transporte. 0 Factor VIII:C é muito sensível à clivagem pe-2la trombina, plasmina, protease C, e outras proteases desérina.

Isola-se, geralmente a partir do plasma ou de produtos plasmáticos com uma série de polipéptidos aparentados que oscilam entre Mr 160 K-40 K com espécies predominantes de Mr 92 K e Mr 80K-77K. Este complexo tornou a análise da estrutura activa de Factor VIII:C muito difícil.

Factor VIII:C e os polipéptidos relacionados foranrdescritos por F. Rotblat et al, Biochemistry ( 1985) .24:42944300;

G.A. Vehar, Nature (1984) 312:337-342; J.J. Toole et al, Nature ( 1984) 312:342-347; and M.A. Truett e outros, DNA ( 1985) 4:333-349. E. Orr et al, Molecular Genetics of Clotting Factors, p.54, s321, refereriam uma função separadora a região pesadamente glicosilada de Factor VIII:C. A sequência foi referida por O.J.

Toole e outros, supra; W.I. Wood e outros, Nature (1984) 312:330-336 e M.A. Truett e outros, supra. A totalidade da proteína contém três repetições de uma sequência (I), e duas repetições de uma segunda sequência (III). Uma terceira sequência pesadamente glicosilada (II) encontra-se presente entre a segunda e a terceira I repetições e é aparentemente, proteoliticamente clivada para se formarem os polipéptidos Mr 92 K e Mr 80 K. As primeiras duas repetições I formam o domínio A, enquanto que a terceira repetição I e as duas repetições III, formam o domínio C. A sequência II forma o domínio B. Deste modo, a proteína completa possui a estrutura I^-I^-II-Ig-OOO^-III^ (A-B-C), enquanto que os polipéptidos Mr 92 K e Mr 80 K (A e C) possuem, respectivamente, as estruturas ^e I3-1111 -11· 0. Fulcher et al, J.Clin Invest (1185) 76: 1 17-124, sugeriram que com base nos dados anticorpo-epítope com 0 Factor VIII :C, tanto os polipéptidos Mr 92 K como Mr 80 K são necessários para a função do

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Factor VIII:C.

Historicamente, o Factor VIII tem sido iso lado a-partirdo-san gue, numa forma concentrada para tratamento terapêutico da hemofilia- No entanto, devido à preocupação criada pela transmissão de HIV e de outras doenças através do sangue, tem sido desenvolda uma maior actividade no sentido de se providenciar meios alternativos de fornecimento de Factor VIII:C. Reveste-se de grande interesse a possibilidade de se fornecerem composições que possuam actividade de Factor VIIIJC sem a preocupação de existência de transmissão de doenças víricas associadas com o Factor

VIII:C nativo.

Apesar de se produzir, na sua totalidade o Factor VIII:C recombinante humano, é difícil efectuar a sua purificação e a sua caracterização, sendo este instável devido à proteólise. A produção eficiente da molécula completa para uso clínico, é actualmente um facto incerto.

R.L. Burke et al, J. Biol Chem (1986) 261:12574-78, descobriram a expressão de um complexo de Factor VIII:C activo a partir de células transfectadas simultaneamente com polinucleótidos codificados pelos polipeptidos Mr 92 K e Mr 80 K. A proteína obtida demonstrou igual actividade à do Factor VIII:C clonado em toda a sua extensão, expresso sob idênticas condições.

0. Nordfang e outros, J. Biol. Chem (1988), 263:1115-18 descobriram a associação, in vitro, de complexos activos de Factor VIII:C, a partir de preparações de proteína Mr 92 X e de proteína Mr 80 X (FVIII-HC e LC, respectivamente). Para se efectuar uma associação

-4bem sucedida, são necessários iões metálicos bivalentes (especialmente Mn e Ca) e tiões, mas apenas uma pequena quantidade de FVIII-HC pode encontrar-se em associação no FVIII:C activo.

DESCOBERTA DA PRESENTE INVENÇÃO

Actualmente, os presentes inventores descobriram um método aperfeiçoado para a expressão de complexos de proteínas recombinantes com alta estabilidade e com actividade Factor VIII:C. 0 polipéptido Mr 92 K (FVIII-HC) e o polipéptido Mr 80 K (FVIII-LC) expressam-se como dois polipéptidos separados, sob o controlo de promotores separados, dentro da mesma célula hospedeira. Cada um dos polipéptidos expressa-se, preferencialmente, utilizando uma sequência principal que comanda a exportação para o espaço extracelular com clivagem da sequência principal. De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, FVIII-HC pode expressar-se como uma proteína de fusão que possui uma extensão C-terminal. A extensão compreende uma sequência polipéptidica homóloga da sequência N-terminal do domínio B (que pode ser clivada pela trombina), um polipéptido separador de 3 a 100 aminoácidos e uma sequência homóloga da sequência C-terminal do domínio Β. A extensão C-terminal de FVIII-HC origina uma alta produção do polipeptido após expressão nas células hospedeiras eucarióticas. De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, FVIII-HC pode expressar-se sem qualquer extensão C-terminal, na sua forma autêntica, que possui a porção C-terminal correcta, caso em que se evita uma clivagem posterior com trombina, que implicaria o risco de uma posterior degradação. 0 polipéptido fl?

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FVIII-LC expressa-se, preferencialmente como um polipéptido LC, utilizando um péptido principal. 0 polipéptido FVIII-LC é processado e eficientemente segregado com o resíduo aminoácido N-terminal correcto e com a glicosilação correcta. A transfecção conjunta, com polipéptidos que codificam FVIII-HC e FVIII-LC numa célula hospedeira adequada proporciona complexos proteínados recombinantes que possuem a actividade de FVIII:C num elevado grau.

Na presente invenção, o termo pol inucleótido refere-se a uma sequência de ADN ou de ARN, que pode ser de cordão único ou de cordão duplo, (ss ou ds), ou um cordão heteroduplex de ADN-ARN. Na maioria dos casos da presente invenção, os polinucleótidos referir-se-ão a dADNs.

Na presente invenção os termos péptido principal refere-se a uma sequência peptídica reconhecida e que actua de acordo com uma peptidase principal durante a expressão do polipéptido. Os péptidos principais codificam os sítios peptídicos para a clivagem pela peptidase principal, e originam o transporte do polipéptido ligado, através da secreção, para o meio extracelular.

Na presente invenção, a expressão domínio A refere-se à porção de Factor VIII:C humano que constitui a subunidade proteica Mr 92 K. 0 domínio A contém entre cerca de 740 a cerca de 760 aminoácidos, e encontra-se na extremidade N do Factor VIII:C, humano, natural. 0 polipéptido do domínio A estende-se do aminoácido 10, habitualmente do aminoácido 1, até cerca do aminoácido 620, pelo menos, habitualmente até cerca do aminoácido 675, pelo menos, e, ê ainda mais natural estender-se até ao aminoácido 740, pelo menos. 0 polipéptido incluirá, pelo menos, cerca de 85% do domínio A (Wood e outros, supra), de um modo mais habitual, pelo menos cerca de 90%, e, de preferência cerca de pelo menos 100%, e, pode eventualmente incluir uma porção da extremidade N do domínio B, não excedendo, geralmente, o aminoacido 1405. Reveste-se de especial interesse uma cadeia N-terminal que possua a sequência completa do sítio de clivagem da trombina em ^^r9y4Q-Sery^p

Na presente invenção, os termos domínio B referem-se à porção de Factor VIII:C humano natural que é geralmente removida por clivagem intracelular e que é pesadamente glicosilada quando expressa em células de mamíferos, tais como C0S7 e CHO.

domínio B contém uma sequência N-terminal que permite a clivagem do domínio A a partir do domínio B, pela trombina. 0 domínio B também possui um sítio de processamento C-terminal que permite a clivagem do domínio C a partir do precursor A-B, por um enzima localizado no aparelho de Golgi das células dos mamíferos. Nos Exemplos que adiante se fornecem, apresentam-se as sequências N-terminais e C-terminais. Os complexos da presente invenção que não possuem uma porção substancial do domínio B, carecem essencialmente de todo o domínio B, com excepção das sequências N-terminal e C-terminal.

Os termos domínio B referem-se à porção do Factor VlIIrC humano natural, que constitui a extremidade C da proteína total e, é intracelularmente clivado para formar a cadeia leve do Factor VIII:C. A cadeia leve possuirá uma sequência aminoácida substâncialmente idêntica à sequência aminoácida deumpol ipeptido do Factor VIII:C, habitualmente cerca de 80%, pelo menos, de um

modo mais habitual, cerca de pelo menos 90% da cadeia Mr 80 K do Factor VIII:C, iniciando-se, especialmente com o aminoácido 1570, habitualmente com o aminoácido 1600, e especialmente com o aminoácido 1625 e, de um modo ainda mais particular com o aminoácido 1640, preferencialmente aproximadamente com o aminoácido 1649·* amínoácidos e, mais particularmente, ± 1 aminoácido e, continuando, pelo menos até cerca do aminoácido 2300, habitualmente até cerca do 2310, ± 10 amínoácidos, de preferência até 2325, ±5 amínoácidos, e de um modo ainda mais preferencial até ao aminoácido terminal (2332). Geralmente, a cadeia leve possui cerca de 85%, de um modo ainda mais generalizado cerca de pelo menos, 95% dos domínios C1-C2, e de um modo desejável, dos domínios A3-C1-C2.

Na presente invenção os termos conjuntamente expressos, referem-se à expressão simultânea de um polipéptido do domínio A e de um polipéptido do domínio C, no interior da mesma célula hospedeira. Na sequência pol inucleotídica que codifica os domínios A e C podem encontrar-se sequências de expressão ou plasmidos iguais ou diferentes. A expressão conjunta dos domínios A e C permite que ocorra uma multiplicação correcta, que por sua vez proporciona um complexo A-C que possui uma maior actividade e eficiência de secreção.

Na presente invenção, os termos meio de crescimento celular referem-se a qualquer meio adequado para a cultura de c células hospedeiras e inclui meios adequados para se obter a expressão de produtos recombinantes ocorra ou não o actual crescimento celular.

. Os meios de crescimento celular, englobam, geralmente nutrientes e uma fonte de energia metabolizável, em solução aquosa. Se se desejar, os meios de crescimento celular, também podem englobar um composto que inclua a expressão de polipéptidos recombinantes da presente invenção. A selecção de um tal composto indutor depende do promotor seleccionado para controlar a expressão. Outros aditivos típicos incluem a selecção de compostos (isto é, fármacos, ou outros produtos químicos adicionados ao meio para assegurar que apenas as-células hospedeiras transformadas sobreviverão, no meio) e soros, tais como soro de feto de bovino (FBS). Meio isento de soro consiste numa solução que foi enriquecida de tal modo que não é necessário adicionar-se os factores principais presentes no soro, sob a forma de soro. Encontram-se comercialmente disponíveis muitos meios adequados para o crescimento celular.

A expressão polipéptido separador refere-se a uma sequência polipeptidica com cerca de 3 a cerca de 100 ãminoãcidos que não é geralmente homóloga do domínio B do Factor VIII:C humano e que possui menos do que 5 potenciais sítios de glicosilação ligada a N. De um modo preferencial, existirão 2 ou poucos mais desses sítios. Crê-se, actualmente que as grandes dimensões e o elevado grau de glicosilação do domínio B evita a expressão eficiente do polipéptido Mr 92 K. Também se crê que o domínio A pode não se multiplicar correctamente, numa base consistente na ausência do domínio B, pelo que apenas uma pequena percentagem do domínio A é correctamente multiplicada e expressa.

separador polipeptidico, de acordo com o primeiro as-9 pecto da presente invenção proporciona uma extensão C-terminal dó domínio A e, estabiliza, aparentemente, o polipeptido e melhora a secreção na forma activa. Assim, será possível que a utilização de um polipeptido que seja levemente (ou nada) glicosilado evite a construção do separador do domínio por se encontrarem idênticos problemas obstruindo a expressão do Factor VIII:C, na sua totalidade. 0 separador actualmente preferido é derivado de uma charneira da cadeia leve de Ig humana, especialmente de IgA1.

Este separador proporciona uma extensão flexível, sem a adição de um epítope imunogénico ( quando administrada a seres humanos). De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, pode obter-se uma actividade coagulante muito elevada quando se expressa em simultâneo o polipeptido Mr 92 K em que o domínio B foi completamente removido conjuntamente com a cadeia Mr 80 K.

Na presente invenção, com o termo homologia significa identidade ou uma substancial similaridade entre dois polinucleotidos ou dois pol ipéptidos. Determina-se a homologia com base na sequência nucleotídica ou aminoácida do polinucleótido ou do nucleótido. Em termos gerais, não serão diferentes dos aminoácidos naturalmente presentes no Factor VIII:C e nos domínios A e C, habitualmente, mais do que 10, de um modo habitual, mais do que 5% e, de um modo, preferencial mais do que 1% dos aminoácidos. De um modo especial, não mais do que 5%, e mais usualmente, não mais do que 1% serão substituições não se conservarão. As substituições conserváveis incluem:

Gly	Ala;		Lys	Arg;
Val	Ile	Leu;	Asn	Gin;
Asp	Glu;		Phe	Trp

As alterações não conserváveis são, geralmente substituições de um dos aminoácidos anteriores com um aminoácido de um grupo diferentes (como por exemplo a substituição de Asn por Glu), ou a substituição de Cys, Met, His ou Pro, por qualquer dos aminoácidos anteriores.

Os termos quantidade suficiente do complexo proteico da presente invenção, refere-se à quantidade de proteína que é capaz de efectuar um tratamento terapêutico de um indivíduo que possua um distúrbio tratável, do Factor VIII:C humano natural.

De um modo geral, o complexo proteico da presente invenção, é essencialmente tão activo quanto o Factor VIII:C humano nativo e, pode ser administrado em quantidades idênticas. Pode determinar-se a actividade específica do complexo proteínico da presente invenção, de acordo com os métodos conhecidos na especialidade tal como adiante se descreve (utilizando, por exemplo, ensaios COATEST comercialmente disponíveis).

Os termos concentração eficaz refere-se a uma concentração da sequência de expressão que seja capaz de transformar uma célula hospedeira, sob condições de transformação adequadas .

Empregam-se, geralmente construções de ADN para a expressão dos polipéptidos da presente invenção. Cada uma das construções polipeptídicas deverá possuir, no sentido 5’-3’ da transcrição, uma região de iniciação transcricional e uma região de iniciação transferencial, uma região de código do gene estrutural que con.-1 1 d siste numa sequência que codifica a sequência principal do péptido e uma sequência que codifica as cadeias leve ou pesada do Factor VIII:C, seguida de sequências de términus de transcrição e de términus de transferência. A selecção de elementos tão específicos como estes é da competência do especialista.

A região de iniciação pode consistir em diversas sequências diferentes relacionadas com as sequências de iniciação de transcrição e de transferência. Estas sequências incluem sequências intensíficadoras, o sítio de ligação de ARN polimerase, o sítio de captação de ARN, sítios de iniciação de transferência e de ligação ribosómica e, similares. A região de iniciação de transcrição pode ser a região natural associada com o Factor VIII:C ou pode ser uma sequência alternativa para proporcionar uma maior eficiência da transcrição. Podem obter-se as sequências a partir de virus ou genes de mamíferos da célula hospedeira ou de genes de diferentes hospedeiros mamíferos que são activos na célula hospedeira. Isolaram-se numerosas regiões de iniciação de transcrição e demonstrou-se que eram funcionais nas células hospedeiras dos mamíferos. Estas regiões incluem as regiões promotoras primárias, as últimas regiões promotoras, SV40, a principal região final promotora de adenovirus, a região promotora de actina, a região promotora proteica na vizinhança próxima de Mr 72 K do citomegalovirus e, similares.

A região de terminação pode incluir sequências não trans feridas da extremidade 3', uma sequência principal de poliadenilação e similares. Pode obter-se a região de terminação a partir da

-12sequência da extremidade 3', não transferida do cADN natural do Factor VIII :C, ou a partir do mesmo gene estrutural ou de um gene estrutural diferente a partir do qual se obteve a região de iniciação da extremidade 5'. A região 3' não é tão importante para o nível de transcrição como o é a região de iniciação, pelo que esta escolha baseia-se mais numa questão de conveniência do que numa selecção específica.

Os genes estruturais, incluem, habitualmente uma sequência principal que codifica o péptido principal que conduz o polipéptido para o iúmen do retículo endoplásmico, para processamento e maturação. Encontram-se eventualmente, incluídas sequências adicionais que codificam os polipéptidos que se processam após transferência, pelas endopeptidases, em que as endopeptidases clivam uma ponte peptídica, removendo o pró-péptido para dar lugar ao polipéptido maduro. 0 péptido principal pode ser um péptido natural, especialmente para o péptido N-terminal ou pode ser qualquer

X péptido principal que proporcione o processamento e maturação de polipéptidos.

Foram feitas referências a diversos péptidos principais, na respectiva literatura, e incluem sequências tais como as do activadore· do plasminogénio tecidual, cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, glicoproteínas de membranas víricas, tais como as proteínas do vírus Herpes simplex, gB e gD, ¢( ^antitripsina e, similares. Dá-se, actualmente, preferência ao péptido principal ¢/1-antitripsina, para a secreção do polipéptido FVIII:LC devido ao alto nível de expressão do péptido que possui uma sequência

-13N-terminal correcta.

Devem juntar-se as sequências de ADN que codificam a proteína madura e o peptido principal, de modo a formar-se uma sequência de transcrição aberta. Sempre que se encontrem disponíveis sítios de restrição convenientes, devem unir-se, de modo adequado as extremidades coesivas ou complementares. No entanto, na maioria dos casos será necessária a utilização de adaptadores, que recriarão, no adaptador de síntese, porções da sequência de código, tornando possível a ligação, através do adaptador, de uma sequência truncada do gene estrutural e/ou de uma sequência principal truncada, de modo a encontrar-se na sequência de transcrição correcta. Pode efectuar-se o mapa de restrição parcial da sequência principal e do gene estrutural, de modo a identificarem-se os sítios de restrição, especialmente os sítios de restrição únicos que se podem utilizar para se unirem as duas sequências, uma a outra na sequência de transcrição aberta correcta, através de um adaptador adequado. Como alternativa, podem inserir-se sítios de restrição únicos na união da sequência principal e da sequência que codifica o polipeptido maduro, por mutagenese, in vitro.

Os sinais de inicio e de terminus de transcrição farão, normalmente parte do gene estrutural, que proporciona o codão de iniciação para o inicio da transferência e um ou mais codões de iniciação poderão consistir nos primeiros codões das sequências principais. Os codões de terminus de transcrição poderão ser adicionados, conforme adequado, como uma parte da região de ter-14minação ou poderão ser adicionados à região de código, de modo a proporcionarem a extremidade 3' conveniente para o acoplamento da região de terminus de transcrição, proporcionando uma região de terminação completa.

Podem unir-se, utilizando métodos convencionais, as diversas regiões da sequência de expressão, que identificam as sequências nucleotídicas particulares ( a sequência de ácidos nucleicos da região de inicio de transcrição e de transferência, a sequência de ácidos nucleicos do gene estrutural que codifica um dos polipeptidos e que se encontra sob o controlo transcricional e transferencial da região de iniciação, e uma região de terminus de transcrição e de transferência, que controla o processamento do mARN e o terminus da transferência). A sequência obtida, conterá, habitualmente, ou poderá ser modificada, de modo a conter, sítios de restrição, que poderão ser complementarizados, encontrando-se presentes as extremidades complementares coesivas ou salientes.

Efectuar-se-ão, habitualmente as modificações, numa região não codificante, pela introdução de ligantes, de modo a proporcionarem-se as extremidades coesivas desejadas. Ligar-se-ão, habitualmente as extremidades, antes da introdução na célula hospedeira, embora se possa permitir que a célula hospedeira efectue essa ligação.

Pode unir-se a sequência de expressão, a uma ampla variedade de outras sequências, para fins específicos. Quando se pretende a amplificação da quantidade de glicoproteína segregada, pode unir-se a sequência de expressão para o FVIII :C, aleatoriamente a um gene, cujo aumento espontâneo no número de cópias ge-15néticas, se possa seleccionar facilmente, por tratamento adequado. Tais genes incluem o gene da metalotioneina humana, e o gene da di-hidrofolatoredutase, do rato. Colocam-se estes genes em sequências que possuam as suas próprias sequências reguladoras de transcrição e transferência. Seleccionando os clones celulares resistentes a concentrações crescentos de iões de metais pesados ( como por exemplo cãdmio) ou metotrexato, pode amplificar-se, simultaneamente na célula hospedeira o gene de interesse ( a sequência de expressão).

As sequências de expressão referidas podem fazer parte de um vector que compreenda um sistema de replicação funcional, na célula hospedeira, sistema de replicação esse que proporciona uma conservação epissomal estável ou uma integração estável da sequência de expressão no genoma da célula hospedeira. 0 vector também englobará, um marcador para selecção, para se efectuar a selecção das células hospedeiras de mamíferos que contenham construções de ADN e do vector das células hospedeiras que não possuem a construção de ADN e o vector.

Encontra-se disponível uma ampla variedade de sistemas de replicação, que derivam, geralmente, de vírus que infectam as células hospedeiras de mamíferos. Exemplos de sistemas de replicação incluem os sistemas de replicação do Virus Simiano 40, do adenovirus, do virus do papiloma de bovinos, o virus do polioma, o virus de Epstein Barr e, similares.

Os marcadores de selecção que possibilitam a propagação do vector nas células hospedeiras de procariótas podem englobar

-16uma resistência a um biocida, particularmente a um antibiótico, ou complemento da auxotropfia de modo a proporcionar hospedeiros prototróficos. Os genes que se revestem de um interesse especial como marcadores incluem o gene da resistência à canamicina (NPTII), o gene de resistência ao cloranfenicol (CAT), penicílinase (p-lactamase) e, similares.

vector será, geralmente circular, e possuirá um ou mais sítios de restrição que permitirão a inserção de sequências de expressão, passo a passo, ou como uma entidade completa, no vector. Frequentemente, o vector também incluirá, um sistema de replicação e selecção bacteriano, que permitirá a clonagem após cada um dos passos de manipulação. Deste modo, podem preparar-se, quantidades relativamente grandes da construção, em cada uma das fases, podem isolar-se, purificar-se, ensaiar-se para se verificar se se efectuou a ligação conveniente e, utilizá-las, depois, no passo seguinte.

Podem utilizar-se diversas células de mamíferos, nas quais as sequências reguladoras e os sistemas de replicação se encontrem funcionais. Estas células incluem as células C0S7, células do ovário do hamster chinês (CHO), células de rim de rato, células de rim de hamster, células HeLa, células HepG2, ou simi1 ares.

Podem ligar-se as sequências de expressão dos polipeptidos desejados, numa cadeia de ácidos nucleicos ou podem ser proporcionadas em moléculas de ácido nucleico separadas. As sequências de expressão podem ser partes de vectores diferentes ou

-17do mesmo vector. Isto constitui, em primeiro lugar uma questão de conveniência, apesar de nalgumas situações com vectores específicos, se possa dar preferência a uma ou a outra construção.

vector de expressão pode consistir num retrovírus com deficiência de replicação. S.F. Yu e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1986) 83:3194-98, revelaram a construção dos vectores retroviricos de transferências de genes de auto-inactivação (SIN). Criam-se os vectores SIN eliminando as sequências promotoras e intensificadoras da região U3 da extremidade 3' de TLR.

Uma região funcional U3 na extremidade 5' de LTR permite a expressão do genoma virico recombinante em linhas celulares adequadamente embaladas. No entanto, após a expressão do seu ARN genómico e transcrição inversa em cADN, a região U3 da extremidade 5' de LTR do pró-virus original e eliminada e, substituída pela região U3 da extremidade 3' de LTR. Deste modo, quando o vector SIN integra a região não funcional U3 da extremidade 3' de LTR que substitui a região funcional U3 da extremidade 5' de LTR e torna o virus incapaz de expressar a transcrição genómica na sua totalidade.

Introduzem-se as sequências de expressão na célula hospedeira, de acordo com métodos convencionais. Por conveniência, pode empregar-se para a transformação ADN precipitado por fosfato de cálcio ou ADN, na presença de DEAE-dextrano. Um lípido de síntese especialmente útil na transfecção polinucleotídica consiste em cloreto de N-í 1-(2,3-dioleiloxi)propi1 7-N,N,N-trimeti1amónio,

-18que se encontra comercialmente disponível sob o nome de Lipofectin (disponível em BRL, Gaithersburg, MD) e que foi descrito por P.L. Felgner e outros, Proc. Nat Acad Sei USA (1987), 84:7413. Pode empregar-se a transfecção ou a transdução sempre que se encontrem envolvidos virus. 0 modo específico, segundo o qual o hospedeiro é transformado não é crítico, na presente invenção, dependendo substancialmente das sequências de expressão se encontrarem unidas a um sistema de replicação e da natureza do sistema de replicação e dos genes associados.

Depois, efectua-se o desenvolvimento das células transformadas/transfectadas adequado. Obtém-se o produto como um complexo das duas cadeias de FVIII:C, pelo que se podem isolar os meios ou os lisados celulares e, extrair-se e purificar-se o complexo activo Factor VIII:C. Podem utilizar-se diversos métodos para extraeção e purificação, tais como cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta de iões, cromatografia hidrofóbica, electroforese, extraeção solvente-solvente, precipitação selectiva, e similares. 0 modo em especial, segundo o qual o produto é isolado não é crítico, para a presente invenção e selecciona-se de modo a minimizar a desnaturação ou inactivação e a maximizar o isolamento e a elevada pureza do produto activo.

Proporcionam-se composições em que o ensaio de Revestimento possuirá, pelo menos, 0_χ02 U/ml de actividade, habitualmente, pelo menos cerca de 0,2, e de um modo mais habitual, pelo menos cerca de 0,5 U/ml de actividade. Pode purificar-se o produto referido por cromatografia de afinidade, utilizando anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais comandados contra o FVIII-LC, electroforese, extracção, HPLC, etc.

referido método proporciona a produção de um complexo de cadeias pesadas e leves que possuem a actividade do Factor VIII:C. A produção evidencia-se pelos meios condicionados, que se encontram descritos na parte experimental, que terão, pelo menos cerca de 50, habitualmente cerca de 70 U/ml e de um modo mais usual, pelo menos cerca de 300 U/ml de actividade do Factor VIII:C, no ensaio COATEST.

Os complexos que possuem a actividade do Factor VIII:C, produzidos de acordo com a presente invenção, possuem uma diversidade de utilizações como imunogénios, para a produção de anticorpos, para o isolamento do factor de Von Willebrandt, por cromatografia de afinidade, em ensaios de diagnóstico para o Factor VIII:C e para o tratamento de hemofílicos e de outros pacientes que possuam distúrbios da coagulação sanguínea. Podem administrar-se os complexos proteicos referidos, em veículos farmacêuticamente aceitáveis, tais como a água, solução salina, solução salina de fosfato tampão e solução de citrato tampão, em concentrações compreendidas entre cerca de 10-200 U/ml. Ver Patentes dos Estados Unidos N⁹s 3 631 018; 3 652 530 e 4 069 216, quanto aos métodos de administração e quantidades. Também se podem incluir outros aditivos convencionais.

Proporcionam-se os exemplos que se seguem com o objectivo de orientar o especialista, não devendo, de modo algum limitar o âmbito da presente invenção.

-20EXEMPLOS

Os exemplos que a seguir se fornecem, servirão de orientação ao especialista, não podendo de modo algum, limitar o âmbito da presente invenção.

EXEMPLO 1 (Preparação de Plasmidos de Expressão) (A) pSV7d:

Prepararam-se as sequências de expressão utilizando o vector de expressão de células de mamíferos pSV7d (2423 pb).

Construiu-se o plasmido pSV7d (ver Truet e outros, supra), conforme se segue: excisou-se o fragmento BamHI/HindIII de 400 pb, que continha a origem de replicação de SV40 e o primeiro promotor, a partir de pSVgtl (obtido de Paul Berg, Stanford University, Califórnia) e, purificou-se. Excisou-se o fragmento SV40 BclI/BamHI de 240 pb, contendo o sítio de adição múltipla de SV40, a partir de pSV2 /DHFR (Subramani e outros, Molec and Cell Biol (1981), 1:854-864) e, purificou-se. Utilizaram-se os fragmentos através do seguinte ligante:

Stop Codons

2 3

5^{* 1}-AGCTAGATCTCCCGGGTCTAGATAAGTAAT-3¹ TCTAGAGGGCCCAGATCTATTCATTACTAG ι ι I

HindIII BglII Smal Xbal Bell overhang.

-21Este ligante contém cinco sítios de restrição, assim como codões de terminação, nas três sequências de transcrição. Efectuou-se a clonagem do fragmento resultante de 670 pb, contendo a origem de replicação de SV40, o primeiro promotor de SV40, a região de polil ígação com os codões de paragem e o sítio de poliadenilação de SV40, no sítio BamHI de pML, um derivado p pBR322 que possui cerca de 1,5 Kb elimidas (Lusky e Botchan, Cell (1984) 36:391), para se obter pSV6. Eliminaram-se os sítios EcoRI e EcoRV nas sequências PLM de pSV6, por digestão com EcoRI e EcoRV, trataram-se com nuclease Bal31 para se removerem, aproximadamente 200 pb em cada uma das extremidades e, finalmente uniram-se novamente, para proporcionar pSV7a. 0 corte de Bal31 também eliminou um sítio de restrição BamHI que flanqueava a região SV40, a uma distância aproximada de 200 pb do sítio EcoRV. Para se eliminar o segundo sítio BamHI que flanqueava a região SV40, efectuou-se a digestão de pSV7a com NruI, que corta a sequência pLM a montante da origem de replicação.

Os plasmidos pSV7c e pSV7d representam sucessivas substituições de poli1igantes. Em primeiro lugar, efectuou-se a digestão de pSV7b com StuI e com Xbal. Depois, ligaram-se os ligantes seguintes no vector de modo a obter-se pVS7c:

BglII EcoRl· Smal Kpnl Xbal ι titi

5'-AGATCTCGAATTCCCCGGGGGTACCT TCTAGAGCTTAAGGGGCCCCCATGGAGATC

Depois, digeriu-se pVS7c com BgILL e com Xbal e depois ligaram-se com o ligante seguinte, para se obter pSV7d:

BqlII EcoRI Smal Xbal BamHI Sall

I 1 I 1 I 1

5¹I GATCTCGAATTCCCCGGGTCTAGAGGATCCGTCGAC

AGCTTAAGGGGCCCAGATCTCCTAGGCACGTGGATC (B) : pSVF8-92 pSVF8-92 é um plasmido de expressão para a cadeia FVIII :HC de 92 K de Mr. A partir do Sítio BamHI da região de ligação múltipla de pSV7d, pSVF8-92 consiste numa molécula de síntese 1igante-adaptadora de 40 bp, que estende de BamHI até Saci e que codifica os nucleotidos desde -30 a +14 do cADN do Factor VIII:C, (iniciando-se a numeração a partir do primeiro A do sítio de inicio de transferência; a sequência encontra-se indicada adiante, em D, um fragmento de 2267 pb de Saci a HindIII, de ADN de Factor VIII:C contido no plasmido pSVF8-200, que se descreve adiante ( para além do nucleótido +2281) e o plasmido pSV7d, a partir de Hind III até BamHI.

plasmido pVSF8-80 é um plasmido de expressão para a cadeia de FVIII-LC de 80 K de Mr. Iniciando-se no sítio Sall da região de poli-Iigação de pSV7d, o plasmido pSVF8-80 consiste num fragmento de 201 bp de cADN de activador do plasminogénio tecidual, desde os nucleotidos -98 até ao nucleótido +103 relativamente ao codão de partida) e termina no sítio BglII (sequências de tPA fornecidas por S.J. F. Degan e outros, J. Biol. Chem (1986) 261:6972-6985), um fragmento de síntese de 29 bp, que se estende desde BglII até ao adaptador de ligação que codifica os nucleotidos +5002 e +5031 do Factor VIII :C ligado a um fragmento de 2464 pb, Bell de Factor VIII :C, que se estende do sítio Bell

-23-., criado no nucleõtido 5028 do cADN do Factor VIII:C através de uma mutagenese in vitro (Zoiler e Smith, Meth Enzymol (1983) 100:468) (PfiGM7) até a um sítio Bell da região da extremidade 3', não transferida, no nucleótido 7492, e um fragmento de 400 pb da sequência não transferida da extremidade 3 de tPA que se estende do sítio BglII a um sítio PstI, de síntese, originado a partir da clonagem de cADN, seguido da região de ligação múltipla do vector M13mp9 (Vieira e Messing, Gene (1982) e, depois de pSV7 d.

(D) pSVF8-200

Preparou-se, conforme se segue, o vector pSVF8-200, que é um plasmido de expressão para a totalidade do cADN do Factor VIII-C. 0 plasmido pSVF-200 (descrito por Truett e outros), que contém todo o cADN que codifica o Factor VIII :C, e as sequências não transferidas da extremidade 3', sendo as sequências não transferidas da extremidade 5' idênticas às anteriormente descritas para o pSVF8-92.

Efectuou-se a digestão do plasmido pSV7d com BamHI para se efectuar o corte na região de ligação múltipla, a montante do primeiro promotor de SV40. Sintetizaram-se quimicamente e ligaram-se a pSV7d, o adaptador de ligação BamHI-SacI, de 49 pb, que codifica os últimos 30 pb da região não transferida da extremidade 5' e, os primeiros 15 pb da sequência que codifica o Factor VIII:C, humano.

	-35	-30	-25	-20	-15	-10	-5
5'	GATCC TCTCC	AGTTG	AACAT	TTGTA	GCAAT	AAGTC
3'BamHI	G AGAGG	TCAAC	TTGTA	AACAT	CGTTA	TTCAG
Met	•Gin	lie Glu
ATG	CAA	ATA GAG	CT 3'
TAC	GTT	TAT CSacI 5’	[

Este plasmido, após ligado, foi subsequentemente digerido com Saci para se remover o excesso de ligantes e com Sall para se proporcionar a extremidade coesiva.

Ligaram-se, uns aos outros, o fragmento 1, o fragmento de 2,9 K de Saci de pF8-102 que contém a região que codifica a extremidade 5' do Factor VIII:C humano e o fragmento 2, o fragmento de 6,5 K Sacl-Sall de pF8-6,5 que contém a região que codifica a extremidade 3' do factor e o vector modificado pSV7d que contém o adaptador de ligação (ver Truett e outros, supra). Utilizou-se, depois esta mistura de ligação para transformar a E. coli HB101, e seleccionam-se as colónias por resistência à ampici1ina.

Efectuou-se o rastreio de trezentos transformantes por hibridização de colónias em filtros utilizando, como sondas o adaptador BamHI-SacI5' ou o fragmento Saci de 2,9 K. Depois analisaram-se as colónias positivas para as duas sondas por mapa de restrição. Obteve-se o plasmido pSVF8-200 que contém a região completa que codifica o gene do Factor VIII:C humano e uma região não transferida da extremidade 5', fundida de modo adequado no sentido de transcrição com o primeiro precursor de SV4O.

Λ —CLÍ (Ε) Transfecção e cultura de células C0S7:

Transfectaram-se os plasmidos anteriormente descritos em células C0S7 (Guzman, Cell (1981) 23:175) utilizando o método de precipitação simultânea de fosfato de cálcio (van der Eb e Graham, Meth Enzymol (1980) 65:828-39) associado com o tratamento com disfofato de cloroquina (Luthman e Magnusson, Nuc Acids Res (1983) 11:1295-1308) utilizando 50 ^ug de ADN plasmídico por 5 X 10 células, durante 14 horas. Também se pode efectuar a transfecção das células de acordo com o método DEAE-dextrano de Sompayrac e Danna, Poc. Natl Acad Sei USA (1981) 78:7575-78.

Efectuou-se a cultura das células C0S7 em meio de Eagle modificado por Dulbecco, enriquecido com soro de feto de vitela a 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 /jl/ml de estreptomocina, 292 yug/ml de glutamina e 110 pg/ml de piruvato de sódio. Obtiveram-se as amostras a partir da recolha, durante 48 horas, de meio contendo soro, 88 horas após a transfecção.

(F) ENSAIOS

A intervalos específicos de tempo, após a transfecção, removeu-se meio das células e armazenaram-se as alíquotas a -70°C. Ensaiaram-se as amostras quanto à sua capacidade para diminuírem o tempo de tromboplastina parcialmente prolongado de plasma com deficiência de Factor VIII :C, num ensaio de coagulação normalizado (Hardisty e outros, Thromb et Diathesis Haemolog (1962)

-2672:215). Utilizou-se o ensaio COATEST (Rosen e outros, Throm and Haemostasis (1985) 45:818-823), que mede a geração do Factor X (Xa) activado com uma função linear da concentração do fornecimento exógeno de Factor VIII:C, para se verificar os resultados do ensaio de coagulação. Determinou-se a concentração da proteína imunológicamente reactiva, Factor VIII:C aplicando um ensaio radioimunológico (RIA) que se desenvolveu para se detectar o polipéptido Mr 92 K e por um ensaio de imunoabsorção ligado a um enzima (ELISA) específico para o polipéptido de 80 K de Mr (Nordfang e outros, Throm and Haemostasis (1985) 53:346.

Tal como se indica no Quadro 1, a expressão apenas do polipéptido de 92 K de Mr ou do polipéptido de 80 K de Mr não produzir uma actividade detectável apesar de se encontrarem presentes no meio condicionado, níveis individuais elevados de cada uma das proteínas.

Quando se transfectaram as células simultaneamente com os plasmidos pSVF8-92 e pSCF8-80, o meio continha aproximadamente 20 mU/ml de actividade coaguladora. As células simultâneamen te transfectadas com o plasmido pSVF8-200 que codifica a proteína total do Factor VIII:C, segregaram um nível relativo idêntico de actividade coaguladora.

Quando se misturou os meios condicionados dos transfectantes simples pSVF8-92 e pSVF8-80 (utilizando diferentes e diversas condições, conforme se indica no Quadro 1) não foi possível medir-se qualquer actividade.

-27Estes resultados que um complexo dos domínios amino terminal e carboxilo terminal do Factor VIII:C conserva a actividade coaguladora intrínseca e que o domínio interior não é essencial nem para a actividade nem para a associação de um complexo activo a partir de cadeias separadas.

QUADRO 1: Ensaio da Actividade do Factor V1II:C recombinante em meios condicionados de células COS7

Ensaio

LC-ELISA

Actividade do Ensaio Coatest HC-RIA

Plasmido

Coagulação Tempo Actividade

	(seg)	mU/ml	mU/ml	U/ml	U/ml
pSVF8-92	95,7	<0,9	<0,1	0,15	<0,0002
PSVF8-80	97,2	<0,9	<0,1	<0,1	1,36
-pSVF8-92 &	56,1	22,5	20,4	0,05	1,13
pSVF8-20a
PSVF8-200	47,7	70,0	43,2	0,12	0,28
nenhum	94,6	<0,9	<0,1	<0,01	<0,0002
PSVF8-92J +	95,7	<0,9	<0,1	— —
pSVF8-80b

^a transfectaram-se simultaneamente os plasmidos nas mesmas células & transfectaram-se os plasmidos em células separadas e misturaram-se os sobrenadantes 48 horas mais tarde.

Ensaiou-se uma diversidade de condições de mistura, incluindo a incubação prévia durante diversos períodos de tempo superiores a duas horas,a 37°C, 20°Cou4°C na presença ou na ausência de CaClg 10 mM. Os valores referidos neste quadro são representativos dos dados obtidos.

-28No Quadro 1, obteve-se o Tempo de Coagulação e Actividade Coagulante conforme se segue: ensaiaram-se aliquotas de 75 ^il de meios, condicionados pelo crescimento das células C0S7 transfectadas com os plasmidos indicados ou falsamente transfectadas, quanto à sua capacidade para diminuírem o tempo de tromboplastina parcialmente prolongado de plasma deficiente de Factor VIII:C num ensaio constituido por um passo. Resumidamente, incubaram-se 75 jul de Platelina (General Diagnostics), durante 3 minutos a 37°C, seguindo-se-1he a adição de 75 )ul de plasma com carência de Factor VIII:C mais 75 pl da amostra de ensaio durante um período adicional de incubação de 5 minutos a 37°C. Adicionou-se uma aliquota de 75 pl de CaC^ 0,025 M, previamente aquecido e mediu-se o tempo de coagulação com um fibrómetro Becton-Dickinson. Utilizou-se como padrão plasma humano normal diluido em meio de células C0S7. Estabeleceu-se que uma mU de actividade corresponde a aproximadamente 100 pg de proteína Factor VIII:C (Fay e outros, Proc. Nat. Acad Sei USA (1982) 79:7200).

No Quadro 1, utilizou-se o ensaio de Coatest (Kabi) para se medir a geração da actividade do Factor X activado (Xa) como uma função linear do Factor VIII:C. Mediu-se a concentração do Factor Xa por clivagem proteolítica do cromogénio para-nitro-anilina a partir de um substracto peptídico de síntese para o Factor Xa. Utilizou-se plasma humano normal diluido em Tris-HCl, a pH 7,3, utilizou-se como padrão, BSA a 0,2%.

Para o ensaio RIA, no Quadro 1, revestiram-se tubos de uma placa de microtitulação de 96 tubos de polistireno com IgG

-29inibidora de Factor VIII:C canino, purificado, numa concentração de 3,5 pg/ml em tampão de carbonato de sódio 0,1 M, a pH 9,8, incubando durante a noite a 37°C. Lavaram-se as placas, três vezes com NaCl 0,1 M, 0,05% de Tween^O, seguindo-se a sua incubação com uma mistura de amostras de meio de ensaio e com a proteína de 92 K de Mr do Factor VIII :C, iodada, ambos diluidos em imidazol 0,05 M, NaCl 0,1 M, albumina de soro de bovino a 1%, 0,05% de Tween®20, a pH 7,3. Isolou-se a proteína de 92 K de Mr do Factor VIII ;C, a partir do plasma, apresentando uma homogeneidade superior a 50%, tal como se havia calculado por SAD-PAGE e coloração com prata. Após incubação durante 15 horas, à temperatura ambiente, lavaram-se as placas e mediu-se a quantidade de I em cada um dos tubos individuais, num contador gama. Utilizou-se como padrão uma preparação comercial intermédia, purificada de Factor VIII:C (Factor VIII, NORDISK) com uma actividade específica de 0,5 unidades de actividade de coagulação por mg. Calibrou-se este padrão em função do terceiro padrão internacional de Factor VIII:C da Organização Mundial de Saúde, Os requerentes definiram que o padrão intermediário purificado continha uma proporção de actividade RIA da proteína de 92 K de Mr/actividade de coagulação do Factor VIII:C de 1.

Para o ensaio ELISA do Quadro 1, revestiram-se tubos de uma placa de microtitulação de PVC de 96 tubos com IgG inibidora do Factor VIII:C humano purificado, numa concentração de 4,5 pg/ml em carbonato de sódio 0,1 M, a pH 9,8, incubando, durante a noite a 37°C. Lavaram-se as placas tal como anteriormente se referiu e adicionaram-se fragmentos F(ab')₂ conjugados com peroxidase da IgG humana diluida em imidazol 0,1 M, NaCl 0,15 M, BSA a 1%, Tween 20 a 0,05%, a pH 7,3, para uma incubação final de 16 horas à temperatura ambiente. Desenvolveu-se a coloração com uma solução de o-fenilenodiamina. Utilizou-se soro humano normal como padrão.

Para se verificar se a actividade coaguladora observado era devida ao Factor VIII:C, determinou-se a sensibilidade de coagulação à inibição pelo anticorpo específico para o Factor VIII:C. Antes de se efectuar o ensaio, incubaram-se préviamente aliquotas de meios condicionados, durante 2 horas, a 37°C na presença de soro humano normal diluido ou de soro diluido, de um indivíduo hemofílico, que desenvolveu uma elevada titulação de anticorpos inibidores para o Factor VIII:C. Tal como se indica no Quadro 2, a actividade da molécula completa, assim como a do complexo 92K-80K de Mr foi específicamente reduzida pelo soro inibidor. Obtiveram-se idênticos resultados três anticorpos monoclonais inibidores diferentes, que se ligaram à espécie Mr de 80K. Estudou-se a inibição do Factor VIII:C utilizando soro inibidor, conforme se segue: incubaram-se 160 pil do meio condicionado das células COS 7 indicadas, com 20 pl de soro inibidor de Factor VIII:C humano siluido 100 vezes (titulação de Bethesda, 1500 unidades) ou com soro humano normal agregado, idênticamente diluido, ou apenas com tampão (imidazol 50 mM, NaCl 0,1 M,

100 pg/ml de BSA, a pH 7,3), durante 2 horas a 37°C. Depois ensaiaram-se estas amostras para se verificar a actividade de coagulação residual tal como se indicou anteriormente.

-31QUADRO 2: Ensaio de Inibição de Coagulação

Plasmido	Soro	Tempo de Coagulação (segundos)
pSVF8-80+ pSVF8-92	Normal	51,9
	Imunizado	74,5
	Tampão	54,4
pSVF8-200	Normal	46,4
	Imunizado	69,4
	Tampão	46,8

Repetiu-se o ensaio de inibição utilizando anticorpos monoclonais, tal como se segue: incubou-se 100 pl de meio condicionado, durante 2 horas, a 37°C com 10 yjl de uma solução de 1 jjg/jul do anticorpo monoclonal anti-Factor VIII:C de Hybritech (titulação Bethesda 14 000 unidades) ou com tampão e, depois ensaiou-se tal como anteriormente referido. Indicam-se os resultados no Quadro 3.

QUADRO 3: Ensaio de Inibição de Coagulação

Plasmido	Soro	Tempo de Coagulação (segundos)
pSVF8-92 + pSVF8-80	Imunizado	72,9
	T ampão	48,0
pSVF8-200	Imunizado	60,9
	Tampão	44,9

Para se demonstrar de um modo mais evidente a existência de um complexo de duas cadeias, purificou-se parcialmente a espécie activa, a partir dos meios de células C0S7, por passagem sobre uma coluna Mab específica para a porção Mr 80K. Tal como se indica no Quadro 4, aproximadamente 65% da actividade aplicada foi retida pela coluna e eluiu-se 50% deste material que se ligou, numa forma activa e numa concentração cinco vezes superior que a existente nos meios iniciais. Deste modo, pode isolar-se um complexo activo por cromatografia de afinidade utilizando um anticorpo específico apenas para a espécie Mr 80. Incubou-se durante a noite, 100 pg de um anticorpo monoclonal anti-80 K (56 IgG) (Nordfang e outros, Thromb Haemostasis (1985) 53:346) ligado a uma coluna de Sepharose CL4B, a 20°C com 1,4 ml de meio contendo um total de 6,2 mU de actividade (medida pelo ensaio Coatest obtido a partir de células transfectadas simultâneamente com os plasmidos pSVF8-92 e pSVF8-80). Após incubação, verteu-se a mistura numa coluna e recolheu-se a fracção fluente. Lavou-se a coluna com 300 μ 1 de Tampão A (imidazol 50 mM, NaCl 0,1 M, insulina sódica 0,1%, NaNg a 0,2%, a pK 7,3) e depois, eluiu-se com 300 pl de Tampão B (NaCl 0,25 M, etileno-glicol a 50%, imidazol 0,5 M, CaClg 0J M, insulina sódica a 0,1%, NaNg a 0,2%, a pH 7,3).

-33QUADRO 4: Purificação Parcial do Complexo Activo de Coagulação Mr 92 K-80 K

Fracção	Coatest U/ml	80 K ELISA U/ml
Meios	,0044	0,175
Fluxo	,0017	0,13
Eluido	.0200	0,76

Os resultados aqui referidos demonstram que a expressão da região de ligação (B, que contém 918 aminoácidos ou cerca de 40% da proteína total Intacta, não é necessária para a actividade do Factor VIII:C. A expressão simultânea das regiões individuais Mr 92 K e 80 K originou um nível de actividade do Factor VIII :C comparável ao obtido a partir da expressão de toda a região que codifica o Factor VIII:C. Estas proteínas reunem-se, in vivo para formar um complexo activo ligado por uma ponte de cálcio. A reunião não necessita da presença da região B e mostra -se eficiente para as duas cadeias expressas em trans.

A partir dos resultados anteriormente expostos, torna-se evidente que se pode atingir a actividade do Factor VIII:C produzindo directamente um fragmento N-terminal e um fragmento C-terminal que se expressam de modo independente, possuindo cada um deles a sua própria sequência principal. Assim, pode obter -se o Factor VIII:C, de um modo mais eficiente, uma vez que o grande precursor não necessita de ser clonado e utilizado como a

-34sequência que codifica a actividade do Factor VIII:C. Deste modo, podem empregar-se células para a expressão do Factor VIII:C que possam apresentar uma deficiente capacidade para a maturação adequada da totalidade da proteína Factor VIII:C.

EXEMPLO 2

A expressão da proteína Mr 92 K nas células C0S7 utilizando a construção pSVF8-92 foi menor, por comparação com a quantidade de proteína Mr 80 K produzida. A proteína Mr 92 é aparentemente retida e/ou degradada no aparelho de Golgi e não é processada nem enviada para o exterior de um modo eficaz. De acordo com o anteriormente exposto, modificou-se a construção, numa tentativa de aumentar o nível de proteína Mr 92 K. Efectuaram-se modificações dos seguintes tipos: modificações na sequência não transferida da extremidade 5' do gene do Factor VIII :C: inclusão de sequências não transferidas e de sequências principais, heterólogas, na extremidade 5'; e alterações nas sequências não trans feridas da extremidade 3'. Resumem-se, a seguir, estas sequências

A) Modificações na Região Não transferida da Extremidade 5'

Plasmido pSVF8-92B. Este plasmido é um derivado de pSVF8 -92, no qual os 30 pb da sequência não transferida da extremidade 5' de pSVf8-92 se encontram substituídos por toda a região não transferida da extremidade 5' do cADN do Factor VIII:C humano (nucleótidos de 1 a 171; ver Fig.8 de Truet e outros, supra), com

-35uma eliminação das extremidades G-C (por mutagenese específica de um sítio, in vitro) e com as três alterações de bases que se indicam abaixo, no codão de partida ATG (na posição +172, Fig.

8, Truett e outros, supra) para as sequências preferidas de Kosak, para uma eficiente transferência da mensagem, nas células eucarioticas.

Factor VIII :C: GTCATG CAA

Consenso de Kozak: ACCATG G

Λ

Estas modificações alteram o segundo aminoácido do pe”ptido principal de Glu para Gin.

Plasmido pSVF8-92E. Este plasmido é um derivado de pSVF8-92B no qual se removeu a região de ligação múltipla derivada da extremidade 5' de pSV7d para as sequências do Factor VIII:C„ com excepção do sítio Sall e de se ter alterado o codão ATG na região não transferida da extremidade 5' (na posição 41, de acordo com Truett e outros, supra) para ATT, por mutagenese, in vitro.

B) Adição de Sequências Heterólogas da Extremidade 5'

Plasmidos p$VF8-92G.H e L· Estes plasmidos são derivados de pSVF8-92B nos quais a região não transcrita da extremidade 5' assim como as sequências principais do Factor VIII:C foram substituídas por uma região análoga do cADN do activador do plasminogénio humano (tPA). Em pSVF8-92G unem-se os primeiros

-35-/ aminoácidos (sequência principal e sequência) da região pre-pro de tPA a Mr 92 K do Factor VIII:C maduro com uma serina substituida pelo primeiro aminoácido (alanina) da proteína Mr 92 K. Em pSVF8-92H juntam-se os primeiros 32 aminoácidos da região pre-pro de tPA com a proteína Mr 92 K do Factor VIII:C maduro. Em pSVF8-92I, juntam-se os primeiros 23 aminoácidos da região pre-pro de tPA com a proteína Mr 92 K do Factor VIII:C maduro. As sequências de tPA são as mesmas que se descreveram para o plasmido pSVF8-80.

Plasmido pSVF8-92J. Este plasmido é um derivado do plasmido pSVF8-92G, no qual a região 5' de tPA se encontra substituida com 75 pb da sequência não transferida da extremidade 5' gD de Herpes simples, virus-1 (HSV-1) e com 75 pb da sequência principal de HSV-1. 0 plasmido pSVF8-92 J não possui, também a substituição Ala --> Ser (R.J. Watsone outros, Science (1982) 218:381-384).

C) Alterações na Região Não transferida da Extremidade 5'

Plasmido pSVF8-92C. Este plasmido é uma variante do plasmido pSVF8-92B, na qual a região que codifica Mr 92 K se encontra directamente fundida com o codão de paragem de transferência e com as sequências naturais não transferidas da extremidade 3' do cADN do Factor VIII:C humano.

Plasmido pSVF8-92L. Este plasmido é um derivado do plasmido pSVF8-92C no qual a região não transferida da extremidade 3'

-37β %

de pSVF8-92C se encontra substituida pela região não transferida da extremidade 3' de pSVF8-80.

D) Resultados

Procedeu-se à transfecção de cada um dos plasmidos das partes A-C, anteriormente referidas em células C0S7, simultaneamente com pSVF8~80, tal como se descreveu no Exemplo 1, e ensaiaram-se os meios quanto à actividade do Factor VIII :C, tal como se referiu no Exemplo 1, F).

plasmido pSVFS-92B, o primeiro que se ensaiou, apresentou niveis de actividade 2 a 8 vezes superiores aos de pSVF8-92. Dos plasmidos restantes, o plasmido pSVF8-92E, pareceu ser o melhor, apresentando niveis de actividade 1,65 superiores ao plasmido pSVF8-92B. Os plasmidos pSVF8-92J e I, também produziram niveis de expressão substancialmente superiores aos de pSVF8-92, encontrando-se próximo dos niveis de pSVF8-92E. 0 nível de expressão de pSVF8-92G aproximava-se do de pSVF8-92, enquanto que o de pSVF8-92H era substancialmente inferior ao de pSVF8-92. Os niveis de expressão de pSVF8-92C e de pSVF8-92L pareciam ser equivalentes ao de pSVF8-92E.

EXEMPLO 3

Neste Exemplo descreve-se a preparação de construções para a produção de pol ipè'ptidos que consistem na cadeia Mr de 92 K e de uma porção do domínio B. Fabricaram-se estes derivados numa tentativa de se desenvolver uma cadeia pesada que fosse mais estável e/ou reunisse uma maior eficiência num complexo activo com a cadeia leve. Escolheram-se os derivados para minar uma espécie molecular que se havia observado nas preparações de Factor VIIIzC derivadas de plasma e nos lisados celulares e meios condicionados de células que expressavam a totalidade do Factor VIIIzC, recombinante. Poderiam obter-se, possivelmente, polipéptidos do mesmo tamanho, por clivagens de trombina da totalidade do Factor VIIIzC.

A) PSVF8-92Sz Este plasmido codifica uma cadeia pesada de 982 aminoácidos, e foi preparado a partir do cADN do plasmido pSVF8-302, por clivagem no primeiro sítio Saci da região que codifica o domínio B. Utilizou-se um adaptador oligonucleotídico para sz instalar um codão de paragem de transferência e para se fundir a sequência que codifica a sequência não transferida da extremidade 3' do Factor VIIIzC humano, natural, principiando pelo primeiro sítio Bali. Este plasmido codifica os primeiros 978 aminoácidos do Factor VIIIzC humano, original e 4 resíduos aminoácidos substituídos na extremidade carboxi.

B) pSVF8-160z Este plasmido proporciona uma cadeia pesada de 1323 aminoácidos e preparou-se a partir da totalidade de um clone (designado por pSVF8-303) idêntico a pSVF8-200, mas que possui a região não transferida da extremidade 5' de pSVF8-92E. Clivou-se o plasmido pSVF8-303 com EcoRV e com Smal e ligaram-se as extremidades complementares para se formar pSVF8-160.

Este plasmido codifica os primeiros 1315 aminoácidos do Factor

-39//

V111:C- Adicionaram-se oito aminoácidos substituidos à extremidade carboxilo, como resultado da fusão de região da ligação múltipla ao vector pSV7d.

C) p5VF8-1970: Este plasmido proporciona uma cadeia pesada de 1416 aminoácidos e também é preparado a partir do plasmido pSVF8-303. Efectuou-se a digestão parcial do plasmido pSVF8-303 com BglII, e isolou-se sobre gel o fragmento resultante, de 6811 pb e, ligaram-se as extremidades uma à outra, para se formar o plasmido pSVF8-170. Este plasmido codifica os primeiros 1405 aminoácidos do Factor VIII:C e possui uma extensão na extremidade carboxilo de 11 aminoácidos devida à fusão da região de clonagem múltipla do vector pSV7d.

D) pSVF8-120: Este plasmido proporciona uma cadeia pesada de 1107 aminoácidos e preparou-se a partir de pSVF8-303. Digeriu-se o plasmido pSVF8-303 com Apal e complementarizaram-se as extremidades coesivas com polimerase T4. Digeriu-se, depois, a molécula resultante com Smal, auto-1igou-se o ADN e propagou-se na E. coli HB 101. Este plasmido codifica 1102 aminoácidos a partir da extremidade amino do Factor VIII :C, mais cinco aminoácidos adicionais na extremidade carboxilo, codificados pela região de ligação múltipla de pSV7d.

E) Resultados

Transfectaram-se cada um dos plasmidos das partes A-D, para células C0S7, conjuntamente com pSVF8-80, tal como se des-40creveu no Exemplo 1, e ensaiaram-se os meios quanto à actividade do Factor VIII:C, tal como no Exemplo 1.

Todos estes plasmidos apresentam níveis de expressão substancialmente reduzidos em comparação com o de pSVF8-92E. E interessante verificar que, a proporção de actividade do ensaio RIA para o ensaio Coatest, foi de cerca de 1,8 para pSVF8-16Q e para pSVF8-170, em comparação com 7,2 para o pSVF8-92E. Estes resultados sugerem que estes derivados de cadeias pesadas mais longas possuem uma actividade específica superior, isto é, associam-se de um modo mais eficiente em complexos subunitários activos que a própria molécula de mr 92 K. A proporção de actividade de coagulação para a actividade do ensaio Coatest também foi inferior para as cadeias pesadas mais longas, cerca de 1,7, em comparação com 2,3 para Mr 92 K e 1,35 para a molécula completa, o que sugere estes pe'ptidos mais longos formam complexos que não são activados tal como o complexo Mr 92 K + Mr 80 K.

EXEMPLO 4

Neste Exemplo descreve-se a preparação de linhas celulares, CHO, estáveis que produzem o complexo Mr 92 K-80 K do Factor VIII:C.

A) Preparação de um Plasmido que Codifica um Marcador Seleccionável

Construiu-se o plasmido pAD-DHFR, portador do cADN de DHFR de murino, fundindo o último promotor principal do adeno-41 virus -2 (AdMLP, unidades map 16-27,3) com as sequências da região não transferida da extremidade 5' do cADN do rato (J.H. Nunberg e outros, Cel 1 ( 1980) 19:355-64). Obteve-se a partir de pSV2-neo (Southern e Berg, J. Mol Appl Gen (1982) J_:327-41 ) o ADN de SV40 que codifica parte da primeira unidade de transcrição, incluindo o intrão do pequeno antigeno, t, e que possui a região de terminus transcricional da primeira região de SV40 e, fundiu-se com a extremidade não transferida da extremidade 3' de cADN de DHFR. Subclonaram-se estes três segmentos no interior do plasmido pBR322 para se obter o plasmido pAd-DHFR.

B) Transfecção e Cultura de Células CHQ

Transfectaram-se as células CHO-DUKX-B11, portadoras dos genes não funcionais para a di-hidrofolato-redutase (Urlaub e Chasin, Proc. Nat. Acad Sei USA (1908) 77:4216-4220), com um precipitado simultâneo de fosfato de cálcio de três plasmidos: pSVF8-92C, pSVF8-92E, ou pSVF8-80 e com pAD-DHFR, seguindo o método de Graham e Van der Eb, supra, e as modificações descritas por Wigler e outros, Cel 1 ( 1978) J_4:725-731 e Lewis e outros SomaticCelI Genet ( 1980) 6/.333-347. Os Co-precipitados continham mais de 10 pg de cada um dos plasmidos. Seleccionaram-se as células quanto à expressão do fenótipo de DHFR (positiva) num meio com carências de hipoxantina e de timidina.

Após terem-se isolado os clones positivos, e identificação daqueles que produziam actividade de Factor VIII:C, desen-42-/ // volveram-se as linhas celulares resultantes em metotrexato para se amplificarem os genes DHFR e se amplicarem simultaneamente os genes do Factor VlIIrC. Efectuou-se esta selecção colocando as células num meio contendo metotrexato em concentrações compreendidas entre 0,025 e 0,2 yuM. Ensaiaram-se novamente os clones resistentes ao metotrexato, quando à actividade do Factor VlIIrC.

C) Métodos de Ensaio

Ensaiaram-se os meios condicionados, a partir destes clones positivos de DHFR, de acordo com um ensaio ELISA para se certificar a imunoreactividade da cadeia leve do Factor VlIIrC, de acordo com o método de Nordfang e outros, Thromb Haemostras (1985) 53:346-50. Avaliou-se a imunoreactividade da cadeia pesada do factor VlIIrC utilizando um ensaio radio-imunológico (RIA) descrito por R.L. Burke e outros, J. Biol Chem (1983)

261:12574-78. Mediram-se os complexos do Factor VlIIrC formados por expressão conjunta das glicoproteínas Mr de 92 K e de 80 K, utilizando um ensaio Coatest que se descreveu no Exemplo 1.

D) Linhas CHO que expressam Complexos Activos de 92 K-80 K de Mr

No Quadro 5, indicam-se quatro linhas celulares CHO indendentes, que expressam simultaneamente produtos dos três plasmidos que se utilizaram para transfecção. Os valores de actividade do Factor VlIIrC, que se indicam no Quadro 5, foram os ini-43cialmente observados. A expressão das gl icoproteínas por linhas celulares estáveis, melhora, habitualmente após a passagem em culturas em balões T-75. Pode observar-se um exemplo deste facto na linha celular 10-C2 que produziu por último 200 mU de actividade do Factor VIII:C por mililitro de meio condicionado (Quadro 6). A clonagem destas células estáveis demonstra que se podem reunir as cadeias pesada e leve de Factor VIII:C, que se expressam de modo independente, num complexo activo e que podem ser segregadas pelas células do ovário do hamster chinês.

Quadro 5: Linhas Celulares CHO que Produzem Complexos 92K-80K activos

Clone	ADN Transfectado	mU Coatest/ml
11-D6	pSVF8-92C, pSVF8-80, pAd-DHFR	43
11-D5	PSVF8-92C, pSVF8-80, pAd-DHFR	30
8-C1	pSVF8-92E, pSVF8-80, pAd-DHFR	18,2
10-C2	PSVF8-92E, pSVF8-80, pAD-DHFR	70,0

facto das linhas celulares do Quadro 5 se poderem desenvolver mediante diversas passagens sem perda da expressão do Factor VIII:C, sugere que os três plasmidos foram integrados nos cromossomas das células CHO. Assim, tornou-se necessário determinar se a expressão das glicoproteínas do Factor VIII:C podiam ser conjuntamente amplificadas por selecção com metotrexato. Colocaram-se estas quatro linhas celulares para selecção em diversas concentrações de metotrexato. Obtiveram-se as colónias resistentes (genes DHFR amplificados), para cada uma das linhas, e efectuou-se o seu rastreio quanto à actividade do Factor VIII :C. Perdeu-se, ou não se modificou a expressão do

Factor VIII:C, nos clones 11-D5 e 11-D6 resistentes ao metotrexato. A expressão do Factor VIII:C oscilou entre os clones resistentes ao metotrexato derivados de 10-C2 e de 8-C1 (indicados no Quadro 6),

Examinaram-se vinte e dois clones 8-G1, resistentes ao metotrexato, encontrando-se indicados no Quadro 6 os dados referentes a 10 desses clones. A quantidade de amplificação do Factor VIII:C oscilou entre os clones, sugerindo a possibilidade de um dos genes subunitários ter sido amplificado conjuntamente com a sequência de DHFR, ou os dois, ou nenhum deles. Note-se os clones 8C1-A2, 8C1-C2 e 8C1-C5 como exemplos destas quatro possibilidades, de modo idêntico, examinaram-se 30 derivados de 10-C2, seleccionados por metotrexato, -indicando-se, também, no Quadro 6, os dados de 20 destes derivados. Este contém também um espectro de actividade. Salientam-se os clones 10C2-A2, 10C2-D2, 10C2-B5 e 10C2-C6 como exemplos de quatro diferentes possibilidades de co-amplificação.

-45Quadro 5

Clone	Cone.MTX (/JM)	Coatest (mU/ml)	LC-ELISA (mU/ml)	HC-RIA (mU/ml)
8-C1	0	18	1275	n.d.
8-C1-A1	0,1	<50	1750	80
8C1-A2	0,1	60	1950	>1000
8C1-A5	0,05 '	2	100	10
8C1-B3	0,025	33	1950	1000
8C1-B4	0,025	50	3550	820
8C1-B5	0,025	35	1950	>1000
8C1-C2	0,025	130	13100	»1000
8C1-C3	0,025	165	3900	>»1000
8C1-C5	0,025	30	1750	760
10-C2	0	200	1400	700
10C2-A1	0,05	61	1600	400
10C2-A2	0,1	67	6700	700
10C2-A4	0,05	63	2250	1200
10C2-A5	0,05	183	9450	2660
10C2-A6	0,05	320	8600	7400
10C2-B1	0,05	408	8100	4300
10C2-B3	0,05	134	800	9800
10C2-B4	0,05	394	18000	7800
10C2-B5	0,05	461	15000	8400
10C2-B6	0,05	247	2200	9800
10C2-C1	0,1	160	8100	7600
10C2-C2	0,05	228	6000	5600
10C2-C3	0,05	294	14850	2650
10C2-C5	0,05	294	12400	5400
10C2-C6	0,05	100	1350	520
10C2-D2	0,05	496	1560	16400
10C2-D3	0,05	242	10200	2260
10C2-D4	0,05	165	14100	3500
10C2-D5	0,05	316	7800	5200
10C2-06	0,05	141	1600	6400

-46Entre as linhas CHO descritas no Quadro 6, existe uma (10C2-D2) que produz 0,5 U/ml de complexo Factor VIII:C activo, que consiste em metade da concentração encontrada no plasma humano normal. Para análise e purificação do material do Factor VIII:C, desenvolv.eram-se as linhas celulares CHO que expressam os polipéptidos do Factor VÍII:C, por fermentação à escala laboratorial para se produzir 1-2 litros de fluído de cultura de tecidos. 0 ensaio deste material demonstrou que aproximadamente 10% a 20% de Factor VIII:C imunoreactivo, a partir das linhas não amplificadas é activo no ensaio Coatest. Nas linhas amplificadas, a percentagem de material activo desceu de 2% para 1% do produto imuno-reactivo total. Isto significa que apenas uma fracção das cadeias pesada e leve do Factor VIII:C se associou em complexos activos. 0 restante pode existir na forma de subunidades livres ou em formas degradadas.

Depositaram-se os plasmidos pSVF8-92 e p$VF8-80 no American Type Culture Collection (ATCC) em 24 de Janeiro de 1986 tendo-lhes sido atribuídos, respectivamente, os números de acesso 40222 e 40223. Depositou-se o plasmido pSVF8-200 no ATCC em 17 de Julho de 1985, tendo-lhe sido atribuído o número de depósito no ATCC 40190.

EXEMPLO -5

Neste Exemplo descreve-se a modificação do plasmido pSVF8-80 para se corrigir o aminoácido amino-terminal da glicoproteína da cadeia leve do Factor VIII:C. Uma consequência de engenharia, que proporciona o péptido principal necessário para a secreção indepedente da glicoproteína de 80 K de Mr (Exemplo

1) consiste na substituição da Ser pelo resíduo aminoterminal das cadeias leves do Factor VIII:C do plasma humano normal. Construiram-se os novos plasmidos, numa tentativa de se alterar a sequência peptídica pre-pro de tPA, de tal modo que a cadeia leve de FVIII:C possuisse o resíduo Glu na sua extremidade amino em vez do resíduo Ser mutante, após o processamento proteolítico.

Sabe-se que a cadeia leve do FVIII:C é clivada do precursor da extensão total de FVIII:C antes da secreção, Isto é, intracelularmente, por uma protease residente no aparelho de Golgi. Esta clivagem ocorre entre os resíduos aminoácidos 1648 e 1649 (Arg-Glu). Sobre geles de poliacrilamida, as cadeias leves surgem como um dupleto de bandas de 77 K e de 80 K de Mr, que representam polípéptidos que possuem um ou dois oligossacarideos ligados a N. Conseguiu-se a secreção independente das cadeias leves por fusão da região que codifica a cadeia leve de cADN de FVIII:C com o cADN de tPA. No entanto, no processo de fornecimento do péptido principal de tPA, efectuou-se uma mutação da extremidade amino da cadeia leve de FVIII:C, do resíduo original de ácido glutâmico, para uma serina. Apesar desta cadeia leve mutante, recombinante apresentar características idênticas à cadeia derivada da totalidade de FVIIIzC recombinante, existe uma evidência preliminar de que 1) não pode ser alternativamente glicosilada do mesmo modo que a cadeia clivada a partir do precursor de FVIII :C, 2) pode comportar-se de modo diferente durante a purificação por permuta iónica e por cromatografia numa coluna

-48- /

Sepharose vWF e, 3) pode ser antigenicamente diferente da cadeia leve autêntica.

A sequência peptídica pre-pro de tPA necessita de três clivagens proteolíticas para libertar o polipeptido maduro. A seguir, indica-se a transferência da sequência que codifica a

proteína de pSVF8-80 na região da pSVF8-80:

fusão tPA-FVIII:C 80 K:

-35

-30

-25

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys

Vai

Leu

Leu

Leu

ATG

GAT

GCA

ATG

AAG

AGA

GGG

CTC

TGC

TGC

TGT

GTG

CTG

CTG

Cys

-20 Gly

Ala

Vai

Phe

Vai

-15 Ser

Pro

* Ser

Gin

Glu

-10 Ile

His

* Ala

TGT

GGA

GCA

GTC

TTC

GTT

TCG

CCC

AGC

CAG

GAA

ATC

CAT

GCC

Arg

Phe

-5 Arg

€ Arg

Gly

Ala

Arg

1 Ser

Ile

Thr

Arg

5 Thr

Thr

Leu

CGA

TTC

AGA

AGA

GGA

GCC

AGA

TCT

ATA

ACT

CGT

ACT

CTT

CAG

10

Gin

Ser

Asp

CAG

TCT

GAT

Sabe-se que a clivagem da peptidase principal se realiza no lado carboxi quer de Ser (posição 13) ou de Ala (posição 8), indicada por asteriscos. A segunda clivagem ocorre, provavelmente no lado carboxi de Arg (posição 4, indicado pelo anterior símbolog). 0 terceiro processamento é a proteólise da ponte Arg-Ser para se libertar o tripéptido Gly-Ala-Arg, deixando uma

V..r$

Ser (posição 1) na extremidade amino-terminal dos polipéptidos da cadeia leve de tPA maduro ou do FVIII:C maduro.

A) Preparação de plasmidos

1) pSVF9-80KG:

Substituiu-se o codão da Ser (posição 1) por mutagenese comandada de um sítio para o codão Glu (posição 1). Efectuou-se esta modificação num esforço para permitir a normal ocorrência dos dois primeiros processamentos proteolíticos e para se verificar se a protease Arg-Glu podia reconhecer e clivar o dipeptido num contexto alterado, isto é, se o tripéptido de tPA é substituído pelo domínio B de FVIII :C. A seguir indica-se a região de fusão da cadeia de 80 K de tPA. De outro modo este plasmido é idêntico a pSVF8-80.

pSVF8-8QKG:

-35

-30

-25

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys

Val

Leu

Leu

Leu

ATG

GAT

GCA

ATG

AAG

AGA

GGG

CTC

TGC

TGC

TGT

GTG

CTG

CTG

-20

-15

*

-10

*

Cys

Gly

Ala

Val

Phe

Val

Ser

Pro

Ser

Gin

Glu

Ile

His

Ala

TGT

GGA

GCA

GTC

TTC

GTT

TCG

CCC

AGC

CAG

GAA

ATC

CAT

GCC

-5

ê

1

5

Arg

Phe

Arg

Arg

Gly

Ala

Arg

Glu

Ile

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu

CGA

TTC

AGA

AGA

GGA

GCC

AGA

GAA

ATA

ACT

CGT

ACT

CTT

CAG

Gin Ser Asp CAG TCT GAT

-502) pSVF8-80S:

Eliminaram-se doze codões de pSVF8-80, por mutagenese, in vitro, e substituiu-se o codão para Ser (posição 1) por um codão para Glu. Esta operação coloca o resíduo Glu da cadeia leve do FVIIIzC, depois de Ser23 do péptido principal pressuposto de tPA (indicado por um asterisco). A clivagem pela peptidase principal no lado carboxi, de Ser 23 produz a cadeia leve não mutante de FVIII:C. Indica-se, adiante a região de

fusão da cadeia 80 K de tPA de pSVF8-80S. De outro modo este

plasmido é idêntico PSVF8-80S:

a pSVF8-80.

-23

-20

-15

-10

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys

Vai

Leu

Leu

Leu

ATG

GAT

GCA

ATG

AAG

AGA

GGG

CTC

TGC

TGC

TGT

GTG

CTG

CTG

Cys

Gly

Ala

Vai

-5 Phe

Vai

Ser

Pro

* Ser

1 Glu

Ile

Thr

Arg

5 Thr

TGT

GGA

GCA

GTC

TTC

GTT

TCG

CCC

AGC

GAG

ATA

ACT

CGT

ACT

10

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp

Gin

Glu

Glu

Ile

Asp

Tyr

Asp

Asp

Thr

CTT

CAG

CAG

TCT

CAT

CAA

CAG

GAA

ATT

GAC

TAT

GAT

GAT

ACC

3) pSVF8-80R:

Efectuou-se, uma eliminação de três codões de pSVF8-80, para se remover o pro-tripeptido de tPA por mutagenese in vitro e substituiu-se o codão Ser (posição 1) por um codão para

-51Glu. Esta operação fez com que ficasse colocado um resíduo Glu, após Arg 32 do pró-péptido de tPA, marcado com (3 na região de fusão da cadeia de 80 K de tPA de pSVF8-80R que se indica a seguir:

PSVF8-80R:

-32

-30

-25

-20

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys

Vai

Leu

Leu

Leu

ATG

GAT

GCA

ATG

AAG

AGA

GGG

CTC

TGC

TGC

TGT

GTG

CTG

CTG

-15

-10

-5 .

Cys

Gly

Ala

Vai

Phe

Vai

Ser

Pro

Ser

Gin

Glu

I le

Hi s

Ala

TGT

GGA

GCA

GTC

TTC

GTT

TCG

CCC

AGC

CAG

GAA

ATC

CAT

GCC

Q.

1

10

Arg

Phe

Arg

Arg

Glu

11 e

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp

CGA

TTC

AGA

AGA

GAG

ATA

ACT

CGT

ACT

CTT

CAG

CAG

TCT

GAT

Efectuou

i-se

esta

, construção

na

esperança

de

que

a c 1 i -

vagem com uma protease residente no aparelho e Golgi, com especificidade dibásica, produzisse cadeias leves de FVIII:C, possuindo Glu na extremidade amino.

4) PSVF8-80A:

Eliminaram-se sete codões por mutagenese comandada de um sítio, removendo o ADN codifica a sequência putativa pro de tPa, e substituindo o codão de Ser (posição 1) por um codão para Glu após o codão 28 (Ala) da sequência que codifica o peptido principal pressuposto de tPA (indicado adiante por asterisco). A clivagem pela peptidase principal no lado carboxi de

-52- /A.

.Á

Ala 28 com produção da cadeia leve não mutante de FVIIIxC. Indica-se a seguir a região de fusão da tPA-cadeia 80 K.

PSVF8-80A:

-28

-25

-20

-15

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys

Vai

Leu

Leu

Leu

ATG

GAT

GCA

ATG

AAG

AGA

GGG

CTC

TGC

TGC

TGT

GTG

CTG

CTG

-10

-5

*

Cys

Gly

Ala

Vai

Phe

Vai

Ser

Pro

Ser

Gin

Glu

11 e

His

Ala

TGT

GGA

GCA

GTC

TTC

GTT

TCG

CCC

AGC

CAG

GAA

ATC

CAT

GCC

1

10

Glu

Ile

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu

Gin

Ser

Asp

Gin

Glu

Glu

Ile

GAG

ATA

ACT

CGT

ACT

CTT

CAG

CAG

TCT

GAT

CAA

GAC

GAA

ATT

B) Expressão e Análise da Sequência das Proteínas

1) Transfecção nas células C0S7:

Transfectaram-se as células C0S7 utilizando o procedimento DEAE-dextrano, descrito no Exemplo 1, e ensaiaram-se os meios condicionados por LC-ELISA. Os quatro derivados de pSVF8-80 codificavam glicoproteínas Mr 80 K que reagiam no LC-ELISA e que podiam imunoprecipitar-se após marcação radioactiva de biossintética com diversos anticorpos da cadeia leve anti-FVIII:C. Excepto para pSV/8-80R, todos os derivados levaram à secreção da mesma quantidade de glicoproteína de 80K, tal como 0SVF8-8O.

A secreção da glicoproteína 80 K a partir das células transfectadas com pSVF8-80R foi muito fraca, de um modo geral, inferior a 25% da produzida a partir dos outros plasmidos. Para além disto, a aparência desta cadeia leve de FVIIIiC é diferente na electroforese sobre gel, em que as bandas se apresentam sempre difusas

2) Expressão nas Células C0S7:

Introduziu-se cada um destes plasmidos em células CHO DKX-B11 com pAD-DHFR, tal como se descreveu no Exemplo 4. Estipularam-se linhas celulares permanentes para a produção de cada um dos tipos de cadeia leve. A expressão das glicoproteínas Mr de 80 K nas células CHO, foi muito parecida com a expressão nas células C0S7, no que se refere às quantidades de glicoproteína segregada e do aparecimento de bandas de 80 K na electroforese sobre gel. As linhas CHO transfectadas com pSVF8-80R produziram um nível tão ínfimo de glicoproteína de 80 K que não se efectuou a análise deste material.

3) Purificação e Anál.ise Sequencial dos Aminoâcidos

Prepararam-se meios condicionados de transfecções em larga escala de C0S7 (pSVF8-80KG), ou de linhas celulares CHO transfectadas (amplificadas) (pSVF8-80K, linha celular 10C285; pSVF8-80A, linha celular A1N; pSVF8-80S, linha celular S1R).

meio foi DME H12 com 10% de FBS. Purificou-se FVIIIzLC para sequênciação, de acordo com um procedimento constituído por dois passos que consistia numa cromatografia por permuta de iões seguida de uma cromatograf ia de afinidade. Efectuou-se a croma-54tografia de permuta de iões, conforme se segue: Equilibrou-se uma coluna de S-FF Sepharose (15 X 0,8 cm) com MES 0,02M,

NaCl 0,05 M, CaCl₂ 0,01 M, a pH 5,8, 1ambda 20°C=7,2 mS. Aplicou-se o meio condicionado (500-1300 ml) na coluna após ter-se ajustado o pH para 5,8 com um débito de 100 ml/h. Lavou-se a coluna com 10 volumes de coluna de imidazol 0,05 M, NaCl 0,05 M, CaCl^ 0,01 M, a pH 7,35, lambda 20°C = 8,8 mS a um débito de 200 ml/h. Eluiu-se o FVIII :LC por adição de CaCl₂ 0,1 M ao tampão de lavagem, a um débito de 50 ml/h. Efectuaram-se todas as operações a 4°C.

Efectuou-se a cromatografia de afinidade conforme se segue: acoplou-se o anticorpo monoclonal de murino, 56-IgG, anti-FVI11:LC a Sepharose 4B, de acordo com o método de CNBr, a uma densidade de 2,5 mg/ml de gel. Incubou-se o eluido contendo FVIII:LC com o imunoabsorvente, durante a noite, à temperatura ambiente, 1 ml de gel por 1000unidades de FVIII:LC. Depois, introduziu-se o gel numa coluna e lavou-se com 20 volumes de coluna de um tampão salino inferior ( imidazol 0,05 M, NaCl 0,05M, CaCl₂ 0,01M, 10% de glicerol, 0,02% de NaNg, a pH 7,3), seguindo-se-lhe 20 volumes de coluna de um tampão salino superior (imi dazol 0,05 M, NaCl 1,0M, 10% de glicerol, a pH 7,3). Eluiu-se FVIII:LC a partir do imunoabsorvente, utilizando CaCl₂ 1M em imidazol 0,05 M, NaCl 0,15 M, 10% de glicerol após uma hora de incubação. Dessalinizou-se, imediatamente o eluido numa coluna Sephadex G-25, numa solução de imidazol 0,05 M, NaCl 0,15 M, CaCl₂ 0,01M, 10% de glicerol, 0,2% de Tween 80, NaN₃ a 0,02%, a pH 7,3 e armazenou-se a -80°C. Efectuou-se a análise da sequên-55 cia N-terminal num sequenciador dos Applied Byosistem, 477A

Os resultados desta análise indicam-se no Quadro 7.

A glicoproteína de 80 K codificada pelo pSVF8-80K possui uma extensão tripeptídica na sua extremidadeamino. Presume-se que seja o tripéptido pro de tPA, Gly-Ala-Arg, que não pode ser processado pela Arg-Glu protease que reconhece o domínio B de FVIII:C. Para além disso, as sequências N-terminais revelam que o péptido principal de tPA é constituido, actualmente por 22 resíduos aminoácidos em comprimento, com uma clivagem no péptido principal que se verifica no lado carboxi de Pro22. Deste modo, as construções plasmídicas pSVF8-80S e pSVF8-80A, existentes após a clivagem pela pe^ptidase principal, depois de Ser23 e de Ala28, respectivamente, levam a resíduos amino-terminais incorrectos nas cadeias leves de 80K.

Quadro 7: Sequências N-terminais das Cadeias 80 K com Regiões Pre-Pro de tPA Modificadas

... I¹ I ' I

Plasmido Sequência N-terminal Quantidade (pmol)

PSVF8-80	X- Ile-X-Arg-Thr-X-Leu-Gln-X-Asp-Gln-	10
pSVF8-80KG	X-X-Arg-Glu-11e-Thr-Arg-Thr-Thr-Leu-	20
pSVF8-80S	Ser-Glu-I1e-Thr-Arg-Thr-	40
pSVF8-80A	X-Gln-Glu-Ile-	40

-56Os resultados apresentados neste Exemplo revelam a dificuldade de pressupor como se processará a secreção de um polípéptido, a seguir à transcrição e à transferência. As modificações da sequência da proteína originam consequências inesperadas por processamento proteolítico e por adição de oligossacarideos e podem afectar a totalidade da eficiência de secreção.

EXEMPLO 6

Neste Exemplo descreve-se um método para expressão das autênticas cadeias leves de FVIII:C, utilizando o péptído principal de o(1-anti-tripsina humana.

A) Preparação de Plasmidos

1. pSV lAT.Met

Reuniu-se cADN que codifica o polipeptido o(1-anti-tripsina humana, maduro, utilizando fragmentos de clones de cADN de figado humano e um oligonucleotido de síntese; ligou-se este conjunto como um fragmento de BamH1-SalI no interior de pBR322 para se produzir o plasmido pAT (Met) (Rosenberg e outros, Nature (1984) 312:77-80). Utilizou-se um adaptador de ligação oligonucleotídico de síntese e parte de um clone de cADN que codificava o péptído principal, para ligar a sequência que codifica o péptído principal, com um sítio de restrição EcoRI na extemidade 5' ao sítio BamHI de pAT (Met). Ligou-se o fragmento resultante, EcoRI-SalI, de 1271 pb, que codificava as sequências transferidas da<yl-anti-57-tripsina humana, nos sítios EcoRI-SalI de pSV7d (descritos no exemplo 1), para se produzir pSV.o(1AT.Met.

2.p$VF8-80AT

Abriu-se o plasmido pSVci(1AT.Met no sítio BamHI, o que ocorreu no limite entre os codões do peptido principal e as sequências maduras de 0(1-anti-tripsina. Removeram-se as extremidades coesivas destes sítios de restrição com nuclease de semente de mungo, para fazer sair o codão GAG(Glu) e eliminou-se a sequência de p/1-anti-tripsina por digestão com Sall. Preparou-se a sequência de código de FVIII:C 80 K, por ligação, por mutaganese in vitro, dos codões 1 e 2 de pSVF8-80 para se formar 0 sítio EcoRV ( que conserva 0 codão 2 como um codão lie). Esta operação permitiu que a sequência que codifica a cadeia leve de FVIII:C (como uma sequência EcoRI-SalI com inicio ag no codão 2) se fundisse na sequência de transcrição correcta com 0 codão 1 de c<1-anti-tripsina e substituísse a sequência que codifica ap(1-anti-tripsina humana madura.

Indica-se, a seguir, transferida, a sequência que codifica pSVF8-80AT na região de fusão. Com excepção das substituições da sequência peptídica principal que codifica <j(1-anti-tripsina pela sequência que codifica as sequências pre-pro de tPA, este plasmido é idêntico ao pSVF8-80.

:8-80AT

(Regi

,ão '

termi

'nal

amir

io)

-24

-20

-15

-10

Met

Pro

Ser

Ser

Vai

Ser

Trp

Gly

Ile

Leu

Leu

Leu

A1 a

Gly

Leu

ATG

CCC

TCG

AGC

GTC

TCG

TGG

GGC

ATC

CTC

CTG

CTG

GCA

GGC

CTG

-5

1

5

Cys

Cys

Leu

Vai

Pro

Vai

Ser

Leu

Ala

Glu

Ile

Thr

Arg

Thr

Thr

TGC

TGC

CTG

GTC

CCT

GTC

TCC

CTG

GCT

GAG

ATC

ACT

GCT

ACT

ACT

10

15

20

Leu

Gin

Ser

Asp

Gin

GIu

Glu

Ile

Asp

Tyr

Asp

Asp

Thr

Ile

Ser

CTT

CAG

TCT

GAT

CAA

GAG

GAA

ATT

GAC

TAT

GAT

GAT

ACC

ATA

TCA

Β) Expressão e Análise da Sequência Aminoácida

1. Expressão de pSVF8-8QAT nas células COS7

Transfectaram-se células C0S7 com pSVF8-80AT e com um plasmido de expressão de cadeia pesada, habitualmente o plasmido pSVF8-92C. Ensaiaram-se os meios condicionados por LC-ELISA,

HC-ELISA e COATEST. Também se marcaram as células transfectadas com Met radioactiva, de tal modo que se pudessem imunoprecipitar e visualizar após electroforese sobre gel de poliacri1amida as cadeias leves de FVIIIzC biossinteticamente radiomarcadas. 0 plasmido SVF8-80AT comanda a síntese das cadeias leves de FVIIIzC que surgem como um dupleto de 70-80 K de Mr. A quantidade produzida nas células C0S7 é idêntica à de pSVF8-80. A Co-expressão com pSVF8-92C ou com outros plasmidos de cadeias pesadas de FVIIIzC, levou à produção de complexos activos de FVIIIzC que se mediram por ensaio COATEST.

-592. Purificação e Análise da Sequência Aminoácida

Preparou-se o material para purificação por transfecção de células C0S7 em balões T-175, utilizando concentrações celulares crescentes e concentrações decrescentes de difosfato de cloroquina. Recolheu-se o meio condicionado 60 horas após a transfecção. Efectuaram-se a purificação e a análise aminoácida, tal como se descreveu no Exemplo 5. Os resultados da sequência amino-termínal (Quadro 8) indicam que a cadeia leve de FVIIIrC codificada pelo pSVF8-80AT possui a mesma sequência amino-terminal da cadeia leve autêntica de FVIIIrC do plasma humano.

Quadro 8: Sequência N-terminal das Cadelas 80 K Segregadas

Utilizando um Pêptido Principal o( 1-Anti-Tripsinico

Plasmido Sequência N-terminal Quantidade (pmol)

PSVF8-80 X-Ile-X-Arg-Thr-X-Leu-Gln-X-Asp-Gln- 10 pSVF8-8QAT Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-X-Leu-Gln-Ser-Asp-GIn 10

3. Reunião, in vitro, de cadeias leves de FVIIIrC de 80AT

Ensaiou-se a capacidade das cadeias leves de FVIIIrC de 80 AT, para se recombinarem com cadeias pesadas de FVIIIrC purificadas, in vitro, numa experiência que se encontra indicada no Quadro 9. Incubaram-se cadeias leves de FVIIIrC purificadas em concentrações de 3,7 U/ml com cadeias pesadas ( da totalidade da extensão de FVIIIrC, humano) purificadas, recombiy

-60VI-- -«.-.TípF nantes, numa concentração de 17 U/ml, em tampão que continha Mn⁺² 50 nM e 150 yjM de mercaptoetanol. Como controlo, deixaram-se as cadeias leves e pesadas purificadas, recombinantes, reassociarem-se sob as mesmas condições e ensaiou-se a quantidade de FVIII:C activo produzido, por COATEST. Estes resultados sugerem que a cadeia leve de FVIII:C de 80AT pode combinar-se, in vitro, com a cadeia pesada recombinante, purificada.

Quadro 9: Combinação das Cadeias Leves Recombinates de FVIII:C com Cadeias Pesadas, in vitro

Purificado	Purificado	Percentagem de Acti-
FVIII-LC	FVIII-HC	vidade de Controlo
80AT	Totalmente	86
80S	T otalmente	51
80A	Totalmente	92
80KG	Totalmente	233

EXEMPLO 7

Neste Exemplo descrevem-se plasmidos para melhoramento da expressão da cadeia pesada do Factor VIII:C. Efectuaram-se modificações nas sequências de ADN responsáveis pela iniciação de transcrição e nas sequências não codificantes, no sentido de se aumentar a eficiência de transcrição e a estabilidade do ARN mensageiro. Modificou-se a glicoproteína da cadeia pesada por uma extensão carboxi-terminal composta de segmentos B unidos a um pequeno pêptido. Efectuou-se esta operação no sentido de se

-61obter uma cadeia pesada que fosse agregada de um modo mais eficaz, a partir das células, fosse mais estável num meio de cultura de tecidos e se unisse de um modo mais eficaz com a cadeia leve.

A. Preparação de plasmidos 1. pCMVF8-92/6x

Num esforço para se melhorar o nível de transcrição e a estabilidade do ARN mensageiro da cadeia pesada de MR de 92 K de FVII1:C, substituiu-se a primeira região de iniciação de transcrição de SV40, por sequências da região imediata à primeira região do citomegalovirus humano (Boshart e outros, Cei1 (1985) £:521-530). Para além disso, as sequências não transferidas da extremidade 5' para as quais contribuiu a primeira região de SV40, para o ARN mensageiro, foram substituídas pelas sequências não transferidas da extremidade 5' do gene 1E1 de HCMV, incluindo o seu primeiro intrão. Incluiu-se este intrão partindo do principio que a união das transcrições conduzidas a um mais rápido processamento de mARN e a um mARN mais estável. 0 vector de expressão também possuia a sua origem de replicação para permitir a transição da expressão nas células C0S7, e um gene bacteriano de β-lactamase para permitir a clonagem do ADN por selecção de resistência à ampicilina.

Construiram-se os plasmidos a partir de um fragmento Sall-Pvul de 700 pb de pSV7d (descrito no Exemplo 1) que continha a região de poliadeni1 ação de SV40, um fragmento Pvul-EcoRI de 1400 pb (complementarizado com polimerase Klenow) de pSVT2 ^Z' A (Myers e outros, Cell (1981) 25:373-84; Rio e outros, Cell ( 1983) 32.-1227-49) que proporcionou a origem de replioação de SV40 e a parte restante do gene da β-lactamase, um fragmento Sspl-Sall de 1700 pb, derivado de um subclone plasmídico do citomegalovirus humano (estirpe Towne) no qual o sítio Sall tinha sido introduzido por mutagenese, in vitro, próximo do sítio de inicio de transferência, pela proteína 1E1, e o fragmento Sall-Sall de 4300 pb de pSVF8-92C (descrito no Exemplo 2), contendo o cADN que codifica a glicoproteína Mr de 92 K do Factor VIII:C.

2. pSVF8-92t^3

Este plasmido é um derivado de pSVF8-92C que codifica a cadeia pesada recombinante de Mr de 92 K com uma extensão C-terminal constituída pelos resíduos aminoácidos N-terminais e C-terminais do domínio central (B) do precursor do Factor VIII :C ligado por um homólogo do peptido da charneira peptídica à da cadeia pesada#¹ da imunoglobulina humana. Isto é composto por um fragmento HindIII-SalI, de 4900 pb, de pSVF8-92C, no qual se inseriu um adaptador de ligação sintético de 110 bp, HindIII-Sall (indicado a seguir).

<--Extremidade N do Domínio B-SerPheSerGlnAsnSerArgHi sProSerThrArgGlnLysGlnPheAsnAla AGCTTCTCCCAGAATTCTAGACACCCTAGCACTAGGCAAAAGCAATTTAATGCC

AGAGGGTCTTAAGATCTGTGGGATCGTGATCCGTTTTCGTTAAATTACGG

HinDIII EcoRI Xbal ^><_ Charneira de-><- Extremidade C do domínio B

ThrProProThrProProThrProProValLeuLysArgHisGlnArgOP 0C

ACCCCTCCTACACCACCAACCCCACCAGTACTGAAACGCCATCAACGGTGATAAG tggggaggatgtggtggttggggtggtcatgactttgcggtagttgccãctãTTcagct

Seal

Sall

-630 adaptador de ligação codifica uma extensão carboxi-terminal de 34 resíduos aminoácidos adicionais e um sítio potencial de glicosilação ligado a N. 0 péptido C-terminal poderia aumentar o peso molecular da cadeia pesada para, aproximadamente, 96 K de Mr e para cerca de 99 K Mrse fosse glicosilado.

B. Ensaio para a formação da cadeia pesada de FVIII :C e do complexo FVI1I:C

A actividade do cofactor do complexo cadeia leve-cadeia pesada de FVIII:C, foi avaliado, utilizando um conjunto de ensaio comercialmente disponível, de KabiVitrum (COATEST). Mediu-se a imuno-reactividade da cadeia leve de FVIIIrC, de acordo com um ensaio ELISA, utilizando o anticorpo de revestimento Hz IgG e anticorpos conjugados com peroxidase de Nordisk Gentofte.. Quantificou-se a imuno-reactividade da cadeia pesada de FVIII :C utilizando um ELISA desenvolvido em Nordisk Gentofte, que utiliza anticorpos policlonais humanos de um paciente inibidor (E-IgG).

C: Expressão Transitória de pCMVF8-92/6x

Efectuou-se a transfecção simultânea do plasmido pCMVF8-92/6x com diversos plasmidos de cadeia pesada de FVIII:C (descritos no Exemplo 5) nas células C0S7, utilizando o procedimento de DEAE-dextrano. No Quadro 10, apresenta-se uma amostragem dos resultados destas transfecções. Os dados sugerem que a adição do promotor/intensificador CMV 1E1 e das sequências não transferidas da extremidade 5' do gene de 1E1, proporcionou um melhoramento 2,5 vezes ( em média na expressão da cadeia pesada de FVIII:C).

Quadro 10: Expressão nas células C0S7 de pCi»ivrô-92/6x Versus pSVF8-92C

HC-P1asmido	LC-PIasmido	Actividade do FVIII:C	(mU/ml)
cw	lTC-RIA'b·
PSVF8-92C	PSVF8-80	46	160
PSVF8-92C	-80A	34	72
pSVF8-92C	-80R	61	310
pSVF8-92C	-80S	31	46
pCMVF8-92/6x	-80	87	290
pCMVF8-92/6x	-80A	131	140
pCMVF8-92/6x	-80R	178	330
pCMVF8-92/6x	-80S	114	690

a) Ensaio COATEST

b) Ensaio Radio-imunológico para a cadeia pesada

Expressão transitória nas células C0S7 de pSVF8-92t/3

No Quadro 11, indicam-se os resultados da transfecção simultânea de pSVF8-92t^ com um plasmido de expressão (pSVF8-80AT, descrito no Exemplo 6) da cadeia leve do Factor VIII:C, nas células C0S7. A cadeia pesada de 92t^ é segregada a níveis superiores aos níveis da cadeia pesada de 92C, que possui um único aminoácido (Ser) na extensão carboxi-terminal. A proporção da actividade do COATEST (COA) para a g1icoproteína reactiva do ELISA ·»' /

(uma medida de formação do complexo) foi superior nas cadeias 92tdo que nas cadeias de 92C.

Para além disso, a cadeia 92t^ é bem secretada em meio isento de soro e parece ser estável, numa proporção de actividade de proteína próximo do mesmo em FBS a 10%. Estes resultados demonstram que esta extensão carboxi-terminal de 34 aminoácidos melhora a secreção e estabiliza a cadeia pesada recombinante de FVIII:C.

	Quadro	11: Expressão	de pSVF8-92tf	nas cé	lulas	C0S7
Exp	Medio	Plasmido 1	Plasmido 2	mU/ml	FVIII
				COATEST	LCa	HCb
1	10% FBS	pSVF8-92tp	pSVF8-80AT	41	487	98
		PSVF8-92C	pSVF8-80AT	23	442	49
2	10% FBS	pSVF8-92tp	pSVF8-80AT	80	484	162
		pSVF8-92C	pSVF8-80AT	30	639	90
3	HB CHQ	pSVF8-92tp	pSVF8-80AT	38	262	125

Expuseram-se monocamadas de células C0S7 em duplicado a ADN em DEAE-dextrano, lavaram-se e trataram-se com meio contendo difofato de cloroquina, durante 8 horas. Lavaram-se as células para se remover o fármaco e, depois cobriram-se com 5 ml de DME H21 contendo FBS a 10% 12-16 horas e recobriram-se com HB CHO® de Ana Biologicals.

Ensaiaram-se os meios condicionados quanto à actividade de FVIII:C, tal como se descreveu.

^a por um ensaio ELISA específico para a cadeia leve ^b por um ensaio ELISA específico para a cadeia pesada.

-67-/ /

Embora se tenha efectuado a descrição da presente invenção, com alguns detalhes, a título ilustrativo e exemplificativo, com a finalidade de se tornar mais facilmente compreensível, é obvio que se poderão efectuar determinadas alterações e modificações, no que se encontram abrangidas pelo âmbito das reivindicações em anexo.

EXEMPLO 8

Neste Exemplo descreve-se um método para a expressão da cadeia pesada de FVIII:C, que possui Arg_74Q na extremidade C.

A. Preparação do plasmido pCMVF8-92R

A cadeia pesada de FVIII:C codificada pelo plasmido pCMVF-8-92/6x possui Ser?^ como uma extensão C-terminal. No sentido de se obter uma cadeia pesada com Arg_74Q, como a extremidade C, purificou-se um fragmento BamHI de 1588 pb de pCMVF8-92/6x, que codificava a extremidade 3' da sequência de código derivada de pSVF8-92C. Clonou-se este fragmento no m13mp18 e substituiu-se o resíduo Ser^^ por um codão de paragem de transferência, por mutagenese, in vitro. Reuniu-se o plasmido de expressão pCMVF8-92R, por clonagem do fragmento BamHI submetido a mutagenese, no fragmento BamHI de 5840 pb do vector original.

De acordo com este procedimento, eliminaram-se 580 pb de sequências não transferidas da extremidade 3' de FVIII:C.

-68«S.

B. Expressão Transitória nas Células C0S7 de pCMF8-92R

Transfectou-se simultâeamente o plasmido pCMF8-92R com o plasmido pSVF8-80AT da cadeia leve de FVIII:C (descrito no Exemplo 6), nas células C0S7, utilizando a técnica do fosfato de cálcio (Graham e van der Eb, Virol ( 1973) 52.:456-67). Mudaram-se os meios 18 e 42 horas após a transfecção. Recolheram-se as amostras dos meios para os ensaios 66 horas após a transfecção.

No Quadro 12, indicam-se os resultados desses ensaios. Os dados demonstram que a actividade de FVIII:C se originou quando pCMVF8-92R foi transfectado simultaneamente com um plasmido que proporcionou a expressão de FVIII:LC.

Quadro 12: Expressão Simultânea de pCMVF8-92R e de pSVF8-80AT

Transfecção	COA (mU/ml)	HC:Ag (mU/ml)	LC:AG (mU/ml)
A	243	400	990
B	263	460	1190

Depositaram-se os plasmidos pSVF8-92 e pSVF8-80 no American Type Culture Collection (ATCC) em 24 de Janeiro de 1986, tendo-lhes sido atribuídos, respectivamente, os números de Acesso do ATCC 40222 e 40223. Depositou-se o plasmido pSVF8-200 no ATCC em 17 de Julho de 1985, tendo-lhe sido atribuído o número de Acesso do ATCC 40190.

Claims (24)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de um complexo proteico recombinante possuindo actividade do Factor VIII:C humano, cons tituido por um primeiro polipéptido homólogo ao domínio A do Factor VIII:C, e um segundo polipéptido possuindo homologia ao domínio C do Factor VIII:C humano, mas sem toda ou uma porção substancial do domínio B do Factor VIII:C humano, caracterizado por:

   se co-exprimir numa célula hospedeira transformante euca riotica cultivada num meio de desenvolvimento de célu-70(a) um primeiro polinucleotido gue codifica, (i) uma primeira sequência de sinal susceptível de secreção orientadora, e (ii) um primeiro polipeptido constituído por:

   uma primeira região possuindo uma sequência de aminoãcidos homólogos ao domínio A do Factor VIII:C hu mano e (b) um segundo polinucleotido que codifica (i) uma segunda sequência de sinal susceptível de secreção orientadora, e (ii) um segundo polipeptido possuindo uma sequência de aminoácidos homólogos ao domínio C do Factor VIII:C humano; e se obter o complexo proteico recombinante segregado a partir do meio das células referido.
2. 2.- Processo-de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de no máximo cerca de 5% dos aminoácidos da sequência de aminoácido referida diferir da sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente dos domínios A e C do Factor

   VIII:C.
3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos do polipeptido codificado pelo segundo polinucleotido ser a mesma que a se-71quência de aminoâcidos dos aminoâcidos 1649-2322 do Factor VIII:C humano.
4. 4.- Processo de acordo com a reivindicação 3,- caracteri zado pelo facto de a sequência de aminoâcidos do polipeptido co dificado pelo primeiro polinucleotido ser a mesma que a sequência de aminoâcidos dos aminoâcidos 1-740 do Factor VIII:C humano .
5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri zado pelo facto de a sequência de aminoâcidos do polipeptido co dificado pelo primeiro polinucleotido ser a mesma que a sequência de aminoâcidos dos aminoâcidos 1-1102 do Factor VIII:C huma no.
6. 6.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri zado pelo facto de a sequência de aminoâcidos do polipeptido co dificado pelo primeiro polinucleotido ser a mesma que a sequência de aminoâcidos dos aminoâcidos 1-1315 do Factor VIII:C huma no.
7. 7.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri zado pelo facto de a sequência de aminoâcidos do polipeptido co dificado pelo primeiro polinucleotido ser a mesma que a sequência de aminoâcidos dos aminoâcidos 1-1405 do Factor VIII:C huma

   4' .¾
8. 8-- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o primeiro polipeptido ser constituído adicionalmente por:

   uma segunda região compreendendo (a), a sequência N-ter minai do domínio B do Factor VIII:C humano; (b), um espaçador de polipeptidos de 3 a 100 aminoácidos aproxima damente a qual possui menos do que 5 sítios de N-glicosilação ligada; e (c), a sequência C-terminal do domínio

   B·do Factor. VIII:C humano.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos da sequência

   N-terminal do domínio B do Factor VIII:C humano ser constituída por Ser-Phe-Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-His-Pro-Ser-Thr:—Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn-Ala-Thr.
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido espaçador polipeptídico ser constituído por um peptido homólogo â região de articulação da cadeia pesada Ig humana.
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a sequência de aminoácidos do espaçador

    -73polipeptídico ser constituída por Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Thr.
12. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a sequência C-terminal do domínio B ser constituída por Pro-Pro-Val-Leu-Lys-Arg-His-Gln-Arg.
13. 13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o primeiro polinucleótido ser constituí do adicionalmente por:

    (a) uma sequência de ADN inalterada 5' que aumenta a ex pressão do primeiro polipeptido, em que a referida sequência inalterada 5' estã na posição 5' na referida primeira região, em que o ADN inalterado 5 ’ é seleccionado entre o grupo constituído por ADN inal terado 5' do Factor VIII:C humano, ADN inalterado 5’ do antigénio SV40 t, e ADN inalterado 5' da proteína citomegalovírus 1E1 humana, ou (b) uma sequência de ADN inalterada 3' que intensifica a expressão do primeiro polipeptido, em que a referida sequência inalterada 3' está na posição 3 ’ da região codificadora do polipeptido, em. que o referi, do ADN inalterado 3’ é seleccionado entre o grupo constituído pelo ADN inalterado 3' do Factor VIII:C humano, ADN inalterado 3' do activador de plasminogénio de tecido humano, e ADN inalterado 3' do t-an-Ίϊtigénio SV40.
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a referida segunda sequência de sinal ser constituída pela sequência de sinal de CX1-antitripsina humana.
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado pelo facto de a referida sequência de sinal 1-antitripsina ser constituída por N-Met-Pro-Ser-Ser-Val-Ser-Trp-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Cys-Cys-Leu-Val-Pro-Val-Ser-Leu-Ala.
16. 16. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o referido segundo polinucleotido ser constituído adicionalmente por:

    (a) uma sequência de ADN inalterada 5' que aumenta a ex pressão do referido segundo polipéptido, em que a referida sequência inalterada 5' estã na posição 5¹ da segunda região, em que o referido ADN inalterado 5' é seleccionado entre o grupo constituído por ADN inalterado 5' do Factor VIII:C humano, ADN inaltera do 5 ’ de t-antigénio SV40, e ADN inalterado 5’ de proteína 1E1 de citomegalovírus humano; ou (b) uma sequência de ADN inalterado 3 ' que intensifica // y

    fí a expressão do segundo polipéptido, em que a referida sequência inalterada 3' estã na posição 3’ da região codificadora do polipéptido, em que o ADN inalterado 3' referido é seleccionado entre o grupo constituído por ADN.inalterado 3' do Factor VIII:C humano,. ADN inalterado 3' do activador de plasminogénio de tecido humano, e ADN inalterado 3’ de t-an tigénio SV40.
17. 17. - Processo de acordo com a reivindicação. 1, caracte rizado por a célula hospedeira transformante eucariótica ser uma célula de mamífero.
18. 18. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de o primeiro polinucleotido e o segundo polinucleotido estarem em plasmídeos de expressão separada.
19. 19. - Processo de acordo com a reivindicação. 8, caracte rizado pelo facto de o primeiro polinucleotido e o segundo polinucleotido estarem em plasmídeos de expressão separada.
20. 20. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um complexo proteico, quando preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1, com um veículo fisio

    -76ente aceitável.
21. 21. - Processo para a preparação de uma composição farca, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantiactiva de um complexo proteico, quando preparado pelo c de acordo com a reivindicação 8, com um veículo fisio ente aceitável.
22. 22. - Processo para a preparação de uma composição de í. transformar uma célula hospedeira eucariótica para z a expressão de um complexo proteico recombinante pos. Actividade do Factor VIII:C humano, caracterizado pelo >. se incorporar:

    ima primeira cassete de expressão, compreendendo a referida primeira cassete de expressão um primeiro polilucleotido que codifica uma primeira sequência de silal susceptivel de secreção orientadora de um primeiro polipéptido compreendendo uma primeira região possuindo ima sequência de aminoácidos homóloga â do domínio A do ^?actor VIII:C humano; e - .

    ima segunda cassete de expressão, compreendendo a refe:ida segunda cassete de. expressão um segundo polinucleo :ido que codifica uma segunda sequência de sinal suscep 'ível de secreção orientadora e um segundo polipéptido mínio G do Factor VIII:C humano.
23. 23,- Processo de acordo com a reivindicação 22, caracte rizado pelo facto de o referido primeiro polinucleotido ser constituído adicionalmente por:

    uma segunda região compreendendo a sequência N-terminal do domínio B do Factor VIII:C humano, um espaçador polipeptídico de 3 a 40 aminoácidos aproximadamente a qual tem menos do que 5 sítios de N-glicosilação ligada, e a sequência de sinal C-terminal do domínio B do Factor VIII:C humano.
24. 24,- Processo de acordo com a reivindicação 22, caracte rizado por o primeiro polinucleotido de cassete codificar um po lipeptido..compreendendo pelo menos cerca de 90% da sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1-740 do Factor VIII:C humano e o referido segundo polinucleotido de cassete codificar um polipeg tido compreendendo pelo menos cerca de 90% da sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1649-2332 do Factor VIII:C humano.

    4- Agente Oficial da Preprieclade incusm^i