PL167083B1

PL167083B1 - Sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych bialeko aktywnosci ludzkiego czynnika VIII:C PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL167083B1
Application number: PL90287807A
Authority: PL
Inventors: Barbara Chapman; Rae L Burke; Mirella E Rasmussen; Jan M Mikkelsen
Original assignee: Chiron Corp; Novo Nordisk As
Priority date: 1989-11-17
Filing date: 1990-11-16
Publication date: 1995-07-31
Also published as: NO943949L; DE69032043D1; ATE163194T1; CA2135744A1; KR927003812A; JPH0856656A; AU656311B2; FI944903A0; WO1991007490A1; DE69032043T2; EP0500734B1; HUT70457A; YU78194A; ZA909167B; HU9201629D0; PT95923A; KR960701899A; FI922204A; AU6752590A; NO921946L

Abstract

1. Sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych bialek o aktywnosci ludzkiego czynnika VIII:C, zawierajacego pierwszy polipeptyd homologiczny do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C i drugi polipeptyd wykazujacy homologie do domeny C ludzkiego czynnika VIII:C, lecz pozbawionego calosci lub zasadniczej czesci domeny B ludzkiego czynnika VIII:C, znamienny tym, ze w eukariotycznej stransformowanej komórce gospodarza hodowanej w podlozu do wzrostu komórek wywoluje sie koekspresje pierwszego polinukleotydu kodujacego pierwsza sekwencje sygnalowa zdolna do kierowania sekrecja i pierwszy polipeptyd, zawierajacy pierwszy region o sekwencji aminokwasowej homologicznej do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C, i drugiego polinukleotydu, kodujacego druga sekwencje sygnalowa ludzkiej a 1-antytrypsyny zdolna do kiero- wania sekrecja i drugi polipeptyd o sekwencji aminokwasowej homologicznej z sekwencja aminokwasowa aminokwasów 1649-2322 ludzkiego czynnika VIII:C, i z podloza komórkowego wydziela sie kompleks rekombinowanych bialek. 21. Sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych bialek o aktywnosci ludzkiego czynnika VIII:C zawierajacego pierwszy polipeptyd homologiczny do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C przylaczonego do drugiego polipeptydu wykazujacego homologie do domeny C ludzkiego czynnika VIII:C poprzez odstepnik polipeptydowy inny niz pelnej dlugosci domena B ludzkiego czynnika VIII:C, znamienny tym, ze transformuje sie komórki gospodarza w warunkach pozwalajacych na ekspresje polinukleotydu obejmujacego pierwsza sekwencje kodujaca pierwszy polipeptyd zawierajacy pierwszy homologiczny do domeny A region ludzkiego czynnika VIII:C; druga sekwencje kodujaca drugiego polipeptydu zawierajacy drugi homologiczny do domeny C region ludzkiego czynnika VIII:C oraz trzecia sekwencje kodujaca odstepnik polipeptydowy inny niz pelnej dlugosci domena B ludzkiego czynnika VIII:C, który laczy pierwszy region z drugim regionem, w którym jedna lub wieksza liczba pierwszej sekwencji oraz druga i trzecia sekwencja kodujaca jest operacyjnie przylaczona do sekwencji kontrolnych zdolnych do ukierunkowania ekspresji tego kompleksu bialek po czym tak wytwo- rzony przez ekspresje kompleks rekombinowanych bialek odzyskuje sie z komórki gospodarza. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych białek o aktywności ludzkiego czynnika VIII:C.

Kompleksy białkowe wytworzone sposobem według wynalazku znajdują zastosowanie w leczeniu klasycznej hemofilii (typu A).

Hemofilia typu A jest dziedziczna chorobą związaną z chromosomem X, która dotyka 1 -2 mężczyzn na 10 000. Chorobę powoduje brak lub niedobór czynnika VIII:C. Czynnik VIII:C jest bardzo dużą glikoproteiną (Mr naty wnec cąąstcczki wnnosi 330 kD a - 660 Wa) wystęuujcc ą w osoczu w skrajnie niskich stężeniach. (Mr oznacza względną masę cząsteczkową określoną na podstawie ruchliwości w żelu). Jest on niezbędnym składnikiem proteolitycznej kaskady przekształcającej rozpuszczalny fibrynogen w nierozpuszczalną fibrynę, w wyniku czego powstaje skrzep zapobiegający utracie krwi z uszkodzonej tkanki. W krążącej krwi stwierdza się jego obecność w niekowatencyjnym połączeniu z czynnikiem VIII:R /Czynnikiem Willebranda/działąjącym jako stabilizujące białko nośnikowe. Czynnik VIII:C jest bardzo podatny na trawienie trombiną, plazminą, proteazą C i innymi proteącami serynowymi. Na ogół, izoluje się

167 083 go z osocza lub z produktów osocza jako serie zbliżonych polipeptydów o Mr w zakresie 160 kDa - 40 kDa z dominującymi polipeptydami o Mr wynoszącej 92 kDa - 80 kDa - 77 kDa. Ten złożony obraz czyni analizę struktury aktywnego czynnika VIII:C bardzo trudną.

Czynnik VIII:C 1 zbliżone polipeptydy opisali F.Rotblat i inni, W Biochemistry (1985) 24: 4294-4300; G.A. Vehar i inni, W Nature (1984) 312: 337-342; J.J. Toole i inni, W Nature (1984) 312: 342-347 i M.A. Truett i inni, DNA (1985) 4: 333-349. E.Orr i inni W Molecular Genetics of Clotting Factors, str. 54, s 321, donosili o funkcji silnie glikozylowanego odstępnika regionu czynnika VIII:C. Sekwencję podali J.J. Toole i inni, supra; W.I. Wood i inni, W Nature (1984) 312: 330-336 i M.A. Truett i inni, supra. Białko o pełnej długości zawiera trzy powtórzenia jednej sekwencji (I) i dwa powtórzenia drugiej sekwencji (III). Trzecia, silnie glikozylowana, sekwencja (II) występuje pomiędzy drugim i trzecim powtórzeniem I i ulega najwyraźniej proteolitycznemu trawieniu z wytworzeniem polipeptydów o Mr:92 kDa i Mr:80 kDa. Pierwsze dwa powtórzenia I tworzą domenę A, podczas gdy trzecie powtórzenie I i dwa powtórzenia III tworzą domenę C. Sekwencja II tworzy domenę B. A zatem białko o pełnej długości posiada strukturę I1-l2-II-I3-in1-III2 (A-B-C), podczas gdy polipeptydy o Mr 92 kDa i Mr 80 kDa (A i C) posiadają odpowiednio struktury I1-I2 i I3-III1-III2. C. Fulcher i inni, W J. Clin. Invest. (1985) 76: 117-124, sugerowali w oparciu o dane dotyczące epitopów rozpoznawanych przez przeciwciała dla czynnika VIII:C, że oba polipeptydy o Mr 92 kDa i 80 kDa są niezbędne dla funkcji czynnika VIII:C.

Czynnik VIII:C wyizolowano pierwotnie z krwi, w celu leczenia hemofilii, w formie zatężonej. Jednakże, niepokój związany z przenoszeniem HIV i innych chorób krwi stymulował wysiłki, których celem było zapewnienie alternatywnych źródeł czynnika VIII:C. Szczególne znaczenie ma wytworzenie składników posiadających aktywność czynnika VIII:C bez ryzyka przenoszenia chorób wirusowych związanych z natywnym czynnikiem VIII:C.

Chociaż wytworzono rekombinowany ludzki czynnik VIII:C, o pełnej długości, jest on niestabilny z powodu proteolizy, a jego oczyszczanie i scharakteryzowanie są trudne. Wątpliwe jest obecnie wydajne wytwarzanie cząsteczki o pełnej długości do stosowania klinicznego metodami rekombinacyjnymi.

R. L. Burke i inni, w J. Biol. Chem. (1986) 261: 12574-78 ujawnili ekspresję aktywnego kompleksu czynnika VIII:C z komórek jednocześnie transfekowanych polinukleotydami kodującymi polipeptydy o Mr 92 kDa i Mr 80 kDa. Otrzymane białko wykazywało aktywność równą aktywności sklonowanego czynnika VIII:C o pełnej długości eksprymowanego w podobnych warunkach. C. Nordfang i inni, w J. Biol. Chem (1988) 263:1115-18 ujawnili tworzenie in vitro aktywnych kompleksów czynnika VIII:C z oddzielnych preparatów białka o Mr 92 kDa i białka o M_r 80 kDa (odpowiednio czynnik VIII-HC i LC, przy czym HC oznacza łańcuch ciężki, a LC oznacza łańcuch lekki). Udane tworzenie kompleksów wymaga obecności jonów metali dwuwartościowych (szczególnie Mn i Ca) i związków tiolowych, lecz tylko niewielką ilość czynnika VIII-HC można przeprowadzić w aktywny kompleks czynnika VIII:C.

Sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych białek o aktywności ludzkiego czynnika VIII:C, zawierającego pierwszy polipeptyd homologiczny do domeny A ludzkiego czynnika VIII:Ci drugi polipeptyd wykazujący homologię do domeny C ludzkiego czynnika VIII:C, lecz pozbawionego całości lub zasadniczej części domeny B ludzkiego czynnika VIII:C, według wynalazku polega na tym, że: w eukariotycznej stransformowanej komórce gospodarza hodowanej w podłożu do wzrostu komórek wywołuje się koekspresję pierwszego polinukleotydu kodującego pierwszą sekwencję sygnałową zdolnądo kierowania sekrecją i pierwszy polipeptyd, zawierający pierwszy region o sekwencji aminokwasowej homologicznej do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C, i drugiego polinukleotydu, kodującego drugą sekwencje sygnałową ludzkiej α l-antytrypsyny zdolną do kierowania sekrecją i drugi polipeptyd o sekwencji aminokwasowej homologicznej z sekwencją aminokwasową aminokwasów 1649-2322 ludzkiego czynnika VIII:C, i z podłoża komórkowego wydziela się kompleks rekombinowanych białek.

Sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych białek o aktywności ludzkiego czynnika VIII:C zawierającego pierwszy polipeptyd homologiczny do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C przyłączonego do drugiego polipeptydu wykazującego homologię do domeny C ludzkiego czynnika VIII:C poprzez odstępnik polipeptydowy inny niż pełnej długości domena B

167 083 ludzkiego czynnika VIII:C polega na tym, że:transformuje się komórki gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję polinukleotydu obejmującego pierwszą sekwencję kodującą pierwszy polipeptyd zawierający pierwszy homologiczny do domeny A region ludzkiego czynnika VIII:C, drugą sekwencję kodującą drugiego polipeptydu zawierający drugi homologiczny do domeny C region ludzkiego czynnika VIII:C oraz trzecią sekwencje kodującą odstępnik polipeptydowy inny niż pełnej długości domena B ludzkiego czynnika VIII:C, który łączy pierwszy region z drugim regionem, w którym jedna lub większa liczba pierwszej sekwencji oraz druga i trzecia sekwencja kodująca jest operacyjnie przyłączona do sekwencji kontrolnych zdolnych do ukierunkowania ekspresji tego kompleksu białek po czym tak wytworzony przez ekspresję kompleks rekombinowanych białek odzyskuje się z komórki gospodarza.

Tak więc przedmiotem wynalazku jest ulepszony sposób eksprymowania kompleksów rekombinowanych białek o wyższej stabilności i o aktywności czynnika VIII:C. Polipeptyd o Mr 92 kDa (FVIII-HC) i polipeptyd o Mr 80 kDa eksprymuje się sposobem według wynalazku jako dwa oddzielne polipeptydy pod kontrolą oddzielnych promotorów, w tej samej komórce gospodarza. Każdy polipeptyd korzystnie eksprymuje się stosując sekwencję sygnałową kierującą wydzieniem do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, przy czym sekwencję sygnałową odtrawia się. Zgodnie z pierwszym aspektem wynalazku, FVIII:C eksprymuje się jako białko łączone, posiadające C-końcowe przedłużenie. Przedłużenie zawiera sekwencję polipeptydu homologiczną do sekwencji N-końcowej domenty B (którą można trawić trombiną, odstępnik polipeptydowy o długości 3 do 100 aminokwasów, i sekwencję homologiczną do C-końcowej sekwencji domeny B. Wynikiem C-końcowego przedłużeniajest wysoka wydajność aktywnego polipeptydu eksprymowanego w komórkach eukariotycznego gospodarza. Zgodnie z drugim aspektem wynalazku, eksprymuje się FVIII:C bez C-końcowego przedłużenia, który to FVIII:C posiada w autentycznej postaci poprawny C-koniec, unikając w ten sposób późniejszego trwania trombiną, co niesie ryzyko dalszej degradacji. FVIII-LC korzystnie eksprymuje się jako polipeptyd LC stosując sekwencję sygnałową. Polipeptyd FVIII-LC ulega wydajnemu eksprymowaniu i sekrecji z poprawną N-końcową resztą aminokwasową i poprawną glikozylacją. Kontransfekcja odpowiedniej komórki gospodarza polinukleotydami kodującymi FVIII-HC i FVIII-LC zapewnia wysoką wydajność kompleksów rekombinowanych białek, posiadających aktywność czynnika VIII:C.

W znaczeniu tu stosowanym, termin polinukleotyd oznacza sekwencję DNA lub RNA, który może być jedno- lub dwuniciowy ((ss lub ds) lub heterodupleks DNA-RNA. W większości opisywanych tu przypadków polinukleotyd oznacza dsDNA (dwuniciowy DNA).

W oznaczeniu tu stosowanym, termin peptyd sygnałowy oznacza sekwencję peptydu rozpoznawanego i odtrawianego przez peptydazę sygnałową podczas ekspresji polipeptydu. Peptydy sygnałowe kodują miejsca trawienia peptydu przez peptydazę sygnałową i powodują, że związany z nimi polipeptyd kierowany jest na drogę sekrecji prowadzącą do podłoża zewnątrzkomórkowego.

Termin domena A oznacza tę część ludzkiego czynnika VIII:C, która tworzy podjednostkę białka o Mr 92 kDa. Domena A zawiera od około 740 do około 760 aminokwasów, i znajduje się przy N-końcu natywnego ludzkiego czynnika VIII:C. Polipeptyd domeny A rozciąga się od aminokwasu 10, zazwyczaj od aminokwasu 1, do aminokwasu co najmniej około 620 zazwyczaj co najmniej około 675, częściej co najmniej około 740. Polipeptyd obejmuje co najmniej około 85% domeny A (Wood i inni), supra, częściej co najmniej około 90%, korzystnie około 100%, i ewentualnie zawiera część N-końca domeny B, zazwyczaj nieprzekraczającą aminokwasu około 1405. Przedmiotem szczególnego zainteresowania jest łańcuch N-końcowy, posiadający całą sekwencję aż do miejsca trawienia trombolitycznego przy Arg740-Set74i.

Termin domena B oznacza tę część natywnego ludzkiego czynnika VIII:C, która na ogół usuwana jest przez trawienie wewnątrzkomórkowe, i która ulega silnej glikolizacji podczas ekspresji w komórkach ssaków, takich jak COS7 i CHO. Domena B zawiera sekwencję N-końcową umożliwiającą odtrawienie domeny A od domeny B przez trombinę. Domena B posiada także działające C-końcowe miejsce umożliwiające odtrawienie domeny C od prekursora A-B przez enzym zlokalizowany w aparacie Golgl’ego komórek ssaków. Sekwencje N-końcową i C-końcową przedstawiono poniżej w przykładach wykonania. Kompleksy wytwa167 083 rzane sposobem według wynalazku pozbawione zasadniczej części domeny B, pozbawione są zasadniczo całej domeny B, z wyjątkiem sekwencji N-końcowej i C-końcowej.

Termin domena C oznacza tę część natywnego ludzkiego czynnika VIII:C, która tworzy C-koniec białka o pełnej długości i jest trawiona wewnątrzkomórkowo z wytworzeniem lekkiego łańcucha czynnika VIII:C. Lekki łańcuch posiada sekwencję aminokwasową zasadniczo taką samą, jak sekwencja aminokwasowa C-końca polipeptydu czynnika VIII:C, zazwyczaj co najmniej w około 80% częściej co najmniej w około 90% łańcucha czynnika VIII:C o Mr 80 kDa, często rozpoczynając się aminokwasem 1570, zazwyczaj aminokwasem 1600, często aminokwasem 1625, częściej aminokwasem 1640, korzystnie aminokwasem około 1649 i 10 aminokwasów, zwłaszcza ± 1 aminokwas, i ciągnąc się do aminokwasu co najmniej 2300, zazwyczaj 2310 ± 10 aminokwasów, korzystnie 2325 ± 5 aminokwasów, korzystniej do aminokwasu końcowego (2332). Zazwyczaj lekki łańcuch posiada co najmniej około 85%, częściej co najmniej 95%, domen C1-C2, szczególnie domen A3-C1-C2.

W znaczeniu tu stosowanym, termin koekspresja oznacza jednoczesną ekspresję polipeptydu domeny A i polipeptydu domeny C w tej samej komórce gospodarza. Sekwencje polinukleotydowe kodujące domeny A i C znajdują się w tych samych lub w różnych kasetkach ekspresyjnych lub plazmidach. Koekspresja domen A i C umożliwia wystąpienie właściwej konformacji, co z kolei zapewnia wytwarzanie kompleksów A-C o wyższej aktywności z wyższą wydajnością sekrecji.

W znaczeniu tu stosowanym, termin podłoże do wzrostu komórek oznacza każde podłoże odpowiednie dla hodowli komórek gospodarza, i obejmuje podłoża odpowiednie do uzyskiwania ekspresji rekombinowanych produktów, niezależnie od tego, czy aktualnie ma miejsce wzrost komórek, czy nie. Podłoża do wzrostu komórek obejmują na ogół składniki odżywcze i możliwe do wykorzystania źródła energii w roztworze wodnym. Jeśli jest to pożądane, podłoża do wzrostu komórek mogą także zawierać związek indukujący ekspresję rekombinowanych polipeptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku, wybór takiego indukującego związku zależy od promotora wybranego do kontrolowania ekspresji. Inne typowe dodatki obejmują związki selekcyjne (to jest leki i inne związki chemiczne dodawane do podłóż, aby tylko stransformowane komórki gospodarza mogły przeżyć w podłożu oraz surowicę, taką jak płodowa surowica bydlęca (FBS). Podłoże bez surowicy stanowi roztwór wzbogacony do takiego stopnia, że nie ma potrzeby dodawania niezbędnych czynników śladowych obecnych w surowicy w postaci surowicy. W handlu dostępnych jest wiele odpowiednich podłóż do wzrostu komórek.

Termin odstępnik polipeptydowy oznacza sekwencję polipeptydową o długości około 3 do około 1000 aminokwasów, na ogół niehomologiczną do domeny B ludzkiego czynnika VIII:C, i niosącą mniej niż 5 potencjalnych miejsc N-glikozylacji. Korzystnie, występują 2 lub mniej niż 2 takie miejsca. Obecnie sądzi się, że znaczna wielkość i wysoki stopień glikolizacji domeny B uniemożliwia wydajną ekspresję polipeptydu o Mr 92 K. Sądzi się także, że domena A może nie przybierać właściwej konformacji w nieobecności domeny B, tak że tylko mały procent domeny A przybiera właściwą konformację i ulega poprawnej ekspresji.

Odstępnik polipeptydowy, obecny w kompleksie wytwarzanym sposobem według wynalazku, zapewnia V-końcowe przedłużenie domeny A, i najwyraźniej stabilizuje polipeptyd oraz poprawia sekrecję w aktywnej formie. A zatem, jest możliwe, że stosowanie polipeptydu słabo glikozylowanego (lub nieglikozylowanego wcale) zapobiega w przypadku konstrukcji domena A-odstępnik wystąpienia takich samych problemów związanych z wielkością, jakie powodują hamowanie ekspresji czynnika VIII:C o pełnej długości. Według wynalazku odstępnik otrzymuje się z regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha ludzkich Ig, szczególnie z ludzkiej IgAl. Odstępnik ten zapewnia giętkie przedłużenie, bez dodawania immunogennego epitopu (przy podawaniu ludziom). Według wynalazku, podczas koekspresji polipeptydu o Mr 92 kDa, z którego całkowicie usunięto domenę B, oraz łańcucha o Mr 80 kDa uzyskuje się bardzo wysoką i użyteczną aktywność koagulacyjną.

W znaczeniu tu stosowanym, termin homologia oznacza identyczność lub zasadnicze podobieństwo pomiędzy dwoma polinukleotydami lub dwoma polipeptydami. Homologię określa się na podstawie sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej polinukleotydu lub polipep8

167 083 tydu. W pojęciach ogólnych zazwyczaj nie więcej niż 10%, częściej nie więcej niż 5% liczby, korzystnie nie więcej niż około 1% liczby aminokwasów w łańcuchach różni się od aminokwasów naturalnie występujących w domenach A i C czynnika VIII:C. Zazwyczaj, nie więcej niż około 5%, częściej nie więcej niż około 1% stanowią podstawienia niekonserwatywne.

Podstawienia konserwatywne obejmują:

Gly Ala; Lys Arg;

Val He Leu; Asn Gin 1

Asp Glu; Phe Tip Tyr

Zmiany niekonserwatywne stanowią na ogół podstawienia jednego z powyższych aminokwasów aminokwasem z innej grupy (np. podstawienie Asn zamiast Glu), lub podstawieniami Cys, Met, His lub Pro każdym z powyższych aminokwasów.

Termin dostateczna ilość kompleksu białkowego otrzymanego sposobem według wynalazku oznacza taką ilość białka, która zdolna jest do skutecznego leczenia osobnika cierpiącego na chorobę możliwą do leczenia natywnym ludzkim czynnikiem VIII:C. Na ogół, kompleks białkowy wytworzony sposobem według wynalazku jest zasadniczo tak aktywny, jak natywny ludzki czynnik VIII:C, i podaje się go w podobnych ilościach. Aktywność właściwą kompleksu białkowego wytworzonego sposobem według wynalazku określa się znanymi sposobami, jak opisano poniżej (np. stosując dostępny w handlu test Coatest).

Termin stężenie skuteczne oznacza stężenie kasetki ekspresyjnej wystarczające do stransformowania komórki gospodarza w odpowiednich warunkach transformacji.

Według wynalazku do ekspresji polipeptydów na ogół stosuje się konstrukcje DN N. Aażda z konstrukcji polinukleotydowych posiada, w kierunku transkrypcji 5’ - 3’, regio i inicjacji transkrypcji i region inicjacji translacji, gen strukturalny kodujący region zawierający sekwencję kodującą sygnałową sekwencje peptydu i sekwencje kodującą łańcuchy ciężki lub lekki czynnika VIII:C, po których następują sekwencje terminacji translacji i terminacji transkrypcji. Wybór tych właściwych elementów wchodzi w zakres umiejętności fachowców w tej dziedzinie.

Region inicjacji może zawierać liczne, różne sekwencje związane z inicjacją transkrypcji i translacji. Sekwencje te obejmują sekwencje wzmacniające transkrypcję, miejsce wiązania polimerazy RNA, miejsce tworzenia czapeczki RNA, miejsca wiązania rybosomów i inicjacji translacji, i podobne. Region inicjacji transkrypcji stanowi naturalny region związany z czynnikiem VIII:C, lub alternatywna sekwencja zapewniająca wyższą wydajność transkrypcyjną. Sekwencje otrzymuje się z wirusów ssaków lub z genów komórki gospodarza, bądź z genów innych gospodarz ssaczych, które to geny są aktywne w komórce gospodarza. Wyizolowano szereg regionów transkrypcyjnych i wykazano, że są one funkcjonalne w ssaczych komórkach gospodarza. Regiony te obejmują regiony wczesnego promotora i późnego promotora SV40, region głównego późnego promotora adenowirusa, region promotora aktyny, region promotora wczesnego białka o Mr 72 kDa cytomegalowirusa, promotor metalotioneiny i podobne.

Region terminacji zawiera 3’-końcowe sekwencje nie podlegające translacji sekwencję sygnałową poliadenylacji i podobne. Region terminacji otrzymuje się z 3’-końcowej sekwencji niepodlegającej translacji naturalnego czynnika cDNA czynnika VIII:C, lub pochodzi z tego samego lub innego genu strukturalnego, z którego otrzymuje się 5’-końcowy region inicjacji. Region 3’ nie ma tak zasadniczego znaczenia dla poziomu transkrypcji jak region inicjacji, tak więc jego wybór jest bardziej kwestią wygody niż specyficznej selekcji.

Geny strukturalne zazwyczaj obejmują sekwencję liderową, kodującą peptyd sygnałowy kierujący polipeptyd do świata retikulum endoplazmatycznego w celu procesowania i dojrzewania. Ewentualnie obejmują one także dodatkowe sekwencje, kodujące propeptydy ulegające potranskrypcyjnemu działaniu endopeptydaz, które trawią wiązanie peptydowe, usuwając propeptyd z jednoczesnym wytworzeniem dojrzałego polipeptydu. Peptydem sygnałowym może być peptyd występujący naturalnie, szczególnie w przypadku peptydu N-końcowego, lub może nim być każdy peptyd sygnałowy zapewniający procesowanie i dojrzewanie polipeptydów.

W literaturze donoszono o różnych peptydach sygnałowych, obejmujących takie sekwencje, jak sekwencje tkankowego aktywatora plazminogenu, ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobulin, wirusowych glikoprotein błonowych, takich jak gB i gD, αΐ-antytrypsyny i podobne. Z powodu wysokiego poziomu ekspresji peptydu posiadającego prawidłowy N-koniec, obecnie do sekrecji polipeptydu FVIII-LC stosuje się korzystnie peptyd sygnałowy αΐ-antytrypsyny.

Sekwencje DNA kodujące dojrzałe białko i peptyd sygnałowy muszą być połączone, tak aby znajdowały się w fazie odczytu. Tam gdzie dostępne są dogodne miejsca restrykcyjne, można we właściwy sposób łączyć lepkie lub tępe końce. Częściej jednak stosuje się adaptory - tak gdzie części sekwencji kodującej tworzy się na nowo w syntetycznym adaptorze w taki sposób, że skrócony gen i/lub skróconą sekwencję sygnałową łączy się za pomocą adaptora tak aby znajdowały się we właściwej fazie odczytu. Sekwencję sygnałową i gen strukturalny można częściowo zmapować restrykcyjnie, identyfikując miejsca restrykcyjne, szczególnie występujące z niską częstotliwością, które to miejsca wykorzystuje się do połączenia ze sobą dwóch sekwencji w odpowiedniej fazie odczytu za pomocą odpowiedniego adaptora. Alternatywnie, miejsce restrykcyjne ustawia się, przez mutagenezę in vitro, w miejscu połączenia sekwencji sygnałowej i sekwencji kodującej dojrzały polipeptyd.

Sygnały początku i końca transkrypcji zwykle są częścią genu strukturalnego, zapewniając kodon inicjacji do rozpoczęcia translacji, i jeden lub więcej kodonów stopu do terminacji translacji. Kodony inicjacji stanowią pierwsze kodony sekwencji sygnałowych. Kodony stop dołącza się jako część regionu terminacji, lub dołącza się je do regionu kodującego, otrzymując koniec 3’ dogodny do łączenia z regionem terminacji transkrypcji, co zapewnia wytworzenie pełnego regionu terminacji.

Stosując metody konwencjonalne można łączyć różne regiony kasetki ekspresyjnej,/sekwencję kwasu nukleinowego regionu inicjacji transkrypcji i translacji, sekwencję kwasu nukleinowego genu strukturalnego kodującą jeden z polipeptydów pozostający pod kontrolą regionu inicjacji i region terminacji transkrypcji i translacji, kontrolujący procesowanie mRNA i terminację translacji, stanowiące poszczególne sekwencje nukleotydowe. Zazwyczaj otrzymane sekwencje zawierają, lub tak się je modyfikuje aby zawierały, miejsca restrykcyjne, które można następnie łączyć tam, gdzie obecne są komplementarne odcinki jednoniciowe lub lepkie końce. Modyfikacji często dokonuje się w regionach niekodujących przez wprowadzanie łączników zapewniających pożądane lepkie końce. Końce zazwyczaj liguje się przed wprowadzeniem do komórki gospodarza, chociaż komórka gospodarza może posiadać możliwość przeprowadzenia koniecznej ligacji.

Dla poszczególnych celów kasetki ekspresyjne można łączyć z szerokim wachlarzem innych sekwencji, Jeśli pożądana jest amplifikacja ilości wydzielanej glikoproteiny, kasetkę ekspresyjną FVIII:C łączy się z takim genem, że można przez odpowiednie traktowanie, wywołać spontaniczny wzrost liczby jego kopii. Geny takie obejmują gen ludzkiej metalotioneiny i gen reduktazy dihydrofolianowej myszy. Geny te umieszcza się w kasetkach posiadających swoje własne sekwencje regulatorowe transkrypcji i translacji. Przez selekcję klonów komórkowych opornych na wzrastające stężenia jonów metali ciężkich (przykładowo kadmu) lub metotreksat, gen będący przedmiotem zainteresowania (kasetkę ekspresyjną) koamplifikuje się w komórce gospodarza.

Kaseta ekspresyjna stanowi część wektora zawierającego układ replikacji funkcjonujący w komórce gospodarza, który może zapewniać stabilne utrzymywanie episonu lub integrację kasetki ekspresyjnej z genomem gospodarza. Wektor zawiera także układ marker selekcyjny służący do wyselekcjonowania ssaczych komórek gospodarza zawierających konstrukcję DnA i wektor, spośród tych komórek gospodarza, które pozbawione są konstrukcji DNA i wektora.

Dostępnych jest wiele różnych układów replikacyjnych, na ogół pochodzących z wirusów infekujących ssacze komórki gospodarza. Przykładowe układy replikacyjne obejmują układy replikacyjne wirusa małpiego 40, adenowirusa, wirusa brodawczaka bydła, wirusa polyoma, wirusa Epsteina Barra i podobne.

Markery selekcyjne umożliwiające namnażanie wektora w komórkach gospodarzy prokariotycznych mogą obejmować geny oporności na biocydy, szczególnie na antybiotyki, lub geny uzupełniające auksotrofię, tworząc gospodarza prototroficznego. Poszczególne geny będące przedmiotem zainteresowania jako markery obejmują gen oporności na kanamycynę (NPTII), gen oporności na chloramfenikol (CAT), penicylinazę (p=laktamazę) lub podobne.

167 083

Wektor zazwyczaj jest cząsteczką kołową i posiada jedno, lub większą liczbę miejsc restrykcyjnych umożliwiających wbudowanie do niego kasetki ekspresyjnej odbywające się etapami lub jako kompletnej jednostki. Często wektor zawiera także bakteryjny układ replikacyjny lub selekcyjny umożliwiający klonowanie po każdym z etapów manipulacji materiałem genetycznym. W ten sposób na każdym z etapów można wytworzyć, wyizolować, oczyścić i testować w celu weryfikacji, czy nastąpiło właściwe połączenie, a następnie stosować w następnym etapie, stosunkowo dużą liczbę konstrukcji.

Stosuje się różne ssacze komórki gospodarza, w których działają sekwencje regulatorowe i układ replikacji. Komórki takie obejmują komórki COS7, komórki jajników chomika chińskiego (CHO), komórki nerki myszy, komórki nerki chomika, komórki HeLa, komórki HepG2 lub podobne.

Kasetki ekspresyjne pożądanych polipeptydów łączy się ze sobą w jeden łańcuch kwasu nukleinowego, lub dostarcza się je jako oddzielcze cząsteczki kwasu nukleinowego. Kasetki ekspresyjne stanowią części różnych wektorów, lub tego samego wektora. Jest to przede wszystkim kwestią wygody, chociaż w pewnych sytuacjach, dla poszczególnych wektorów preferuje się jeden lub drugi sposób konstruowania.

Wektorem ekspresyjnym może być retrowirus defektywny pod względem replikacji. S.F. Yu i inni, w Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986) 83:3194-98, ujawnili konstrukcję samoinaktywujących się (SIN) retrowirusowych wektorów przenoszących geny. Wektory SIN tworzy się przez delecję sekwencji promotora i sekwencji wzmacniającej z regionu U3 3’ LTR. Funkcjonalny region U3 w 5’ LTR pozwala na ekspresję zrekombinowanego genomu wirusowego w liniach komórkowych zdolnych do odpowiedniego upakowania. Jednakże, po ekspresji jego genomowego RNA i odwrotnej transkrypcji na cDNA, region U3 5’ LTR oryginalnego prowirusa ulega delecji, i zastępowany jest przez region U3 3’ LTR A zatem, kiedy wektor SIN ulega integracji, niefunkcjonalny region U3 3’ LTR zastępuje funkcjonalny region U3 5’ LTR i czyni wirusa niezdolnym do ekspresji transkryptu genomowego o pełnej długości.

Kasetki ekspresyjne wprowadza się do komórki gospodarza metodami konwencjonalnymi. Dogodnie, do transformacji stosuje się DNA wytrącony fosforanem wapnia lub DNA w obecności DEAE-dextranu. Syntetycznym lipidem, szczególnie użytecznym do transfekcji polinukleotydowej jest chlorek N-[1-/2,3-dioleiloksy/propylo]-N,N,N-trójmetyloamonowy, który jest dostępny w handlu pod nazwą Lipofectin (firmy BRL, Gaithesburg, MD). Został on opisany przezP.L. Felgnerai innych w Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1987) 84; 7413. W przypadku stosowania wirusów, wykorzystuje się transfekcję lub transdukcję. Szczegółowy sposób, w jaki transformuje się komórkę gospodarza nie ma istotnego znaczenia dla niniejszego wynalazku, zależy on zasadniczo od tego, czy kasetki ekspresyjne połączono z układem replikacji i od charakteru układu replikacji i przyłączonych genów.

Stransformowane /stransfekowane komórki hoduje się następnie w odpowiednim podłożu odżywczym. Produkt otrzymuje się w postaci kompleksu dwóch łańcuchów FVIII:C, tak że można wyizolować podłoże lub lizat komórkowy oraz wyekstrahować i oczyścić aktywny kompleks czynnika VIII:C. Znane są różne sposoby ekstrakcji i oczyszczania, takie jak chromatografia powinowactwa, chromatografia jonowymienna, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, elektroforeza, ekstrakcja rozpuszczalnik-rozpuszczalnik, wybiórcze wytrącanie i podobne. Szczegółowy sposób izolowania produktu nie ma istotnego znaczenia dla niniejszego wynalazku, i wybiera się go pod kątem zminimalizowania denaturacji lub inaktywacji, dążąc do izolowania aktywnego produktu o wysokiej czystości z jak największą wydajnością.

Sposobem według wynalazku wytwarza się kompozycje, które oznaczane za pomocą Coatest posiadają aktywność co najmniej 0,02 U/ml (jednostki/ml) zwykle co najmniej około 0,2 U/ml, częściej co najmniej około 0,5 U/ml. Wytworzony produkt oczyszcza się przy zastosowaniu chromatografii powinowactwa, stosując przeciwciała, zwłaszcza przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko FVIIII-LC, lub zastosowaniu elektroforezy ekstrakcji, metody HPLC i podobnych.

Sposób według wynalazku zapewnia wytwarzanie kompleksów łańcuchów ciężkiego i lekkiego, które posiadają aktywność czynnika VIII:C. O wytwarzaniu pożądanego produktu świadczą podłoża hodowlane - jak opisano w części doświadczalnej - które wykazują

167 083 aktywność czynnika VIII:C wynoszącą co najmniej około 50 mU/ml, zazwyczaj co najmniej około 70 mU/ml, częściej co najmniej około 300 mU/ml w oznaczeniu przy pomocy ^atest,

Kompleksy posiadające aktywność czynnika VIII:C, wytwarzane sposobem według wynalazku, znajdują różnorodne zastosowania jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał, do izolowania czynnika Willebranda metodą chromatografii powinowactwa, w oznaczeniach diagnostycznych czynnika VIII:C oraz do leczenia hemofilików i innych osobników posiadających zaburzenia krzepnięcia krwi. Kompleksy białkowe można podawać w fizjologicznie dopuszczalnych nośnikach, takich jak woda, sól fizjologiczna, sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem i sól fizjologiczna zbuforowana cytrynianem, w stężeniach w zakresie około 10200U/ml. Sposoby podawania i ilości ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3 631 018, 3 652 530 i 4 069 216. Można także włączyć inne konwencjonalne dodatki.

Kompleks rekombinowanych białek o aktywności czynnika VIII:C wytwarzany sposobem według wynalazku może być wykorzystywany do wytwarzania preparatu farmaceutycznego. Przy wytwarzaniu takiego preparatu kompleks ten izoluje się przy zastosowaniu konwencjonalnych etapów chromatograficznych, przykładowo wykorzystując absorbcję przy zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych, miesza się z konwencjonalnymi zaróbkami i liofilizuje się uzyskując trwały preparat. Preparat przed podaniem roztwarza się, stosując odpowiedni, znany nośnik.

Wynalazek zostanie bliżej objaśniony w przykładach wykonania, stanowiących dalszą wskazówkę dla specjalistów w tej dziedzinie, lecz nie ograniczających w żaden sposób zakresu wynalazku.

Przykład I. Przygotowywanie plazmidów ekspresyjnych.

(A) pSV7d

Kasetki ekspresyjne przygotowywano stosując wektor ekspresyjny dla komórek ssaków pSV7d (2423 bp).

Plazmid pSV7d (patrz Truett i inni, supra) skonstruowano następująco: z plazmidu pSVgtI (otrzymanego od Paula Berga, Stanford Un^e^ity, Kalifornia) wycięto i oczyszczono fragment BamHI/HindIII o długości 400 bp, zawierający miejsce początku replikacji i wczesny promotor SV40. Z pSV2 /kHFR/Subramanii i in. Molec. and Cell Biol. (1981) 1: 854-864 /wycięto i oczyszczono fragment Bc1I/BamHI SV40 o długości 240 bp, zawierający miejsce dołączenia poliA SV40. Fragmenty połączono łącznikiem, jak przedstawiono na fig. 1. Łącznik ten zawiera pięć miejsc restrykcyjnych jak również kodony stop we wszystkich trzech fazach odczytu. Otrzymany fragmento długości 670 bp, zawierający miejsce początku replikacji SV40, wczesny promotor SV40, poliłącznik z kodonami stop i miejsce ęnliadenylαcji SV40 sklonowano w miejscu BAMHI, plazmidu pML, pochodnej pBR322 posiadającej wydeletowany odcinek o długości około 1,5 kb (Lusky i Botchan, Cell /1984/ 36:391) otrzymując pSV6. Miejsca EcoRI i EcoRV w sekwencjach pML plazmidu pSV6 wyeliminowano przez trawienie restryktazami EcoRI i EcoRV, traktowano nukleazą Bal 31 w celu usumęcia po około 200 bp z k^^^ce^g^o końca , i na koniec ponownie ligowano otrzymując pSV7a.Wycięcie fragmentu nukleazą Bal 31 wyeliminowało także jedno z miejsc restrykcyjnych BamHI flankujących region SV40, w odległości około 200 bp od miejsca EcoRV. W celu wyeliminowania drugiego miejsca flankującego region SV40, pSV7a trawiono Nrul, która przecina sekwencje pML w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji od miejsca początku replikacji. Plazmid ten przeprowadzono ponownie w formę kołową przez ligację tępych końców otrzymując pSV7b.

pSV7c i pSV7d odpowiadają kolejnym zastąpieniem poliłącznika. Najpierw pSV7b trawiono restryktyzami StuI i XbaI. Następnie ligowano z wektorem łącznik przedstawiony na fig. 2, otrzymując pSV7C. Później, pSV7c trawiono restryktazami BgIII i XbaI, i następnie ligowano z łącznikiem przedstawionym na fig. 3, otrzymując pSV7d.

(B) pSVF8-92.

pSVF8-92 jest plazmidem ekspresyjnym dla łańcucha FVIII-HC o Mr 92 kka. Poczynając od miejsca BamHI w poliłączniku pSV7k, pSVF8-92 składa się z syntetycznej cząsteczki łącznik-adapter o długości 49 bp od miejsca BamHI do SacI kodującej nukleotydy -30 do + 14 ckNA czynnika VIII:C, (numerując od pierwszej A miejsca początku translacji; sekwencję

167 083 przedstawiono na fig. 4), fragment SacI-HindIII o długości 2267 bp z DNA czynnika VIII:C zawarty w opisanym poniżej pSVF8-200 (do nukleotydu +2281), i odcinka pSV7d od miejsca HindIII do miejsca BamHI.

(C) pSVF8-80.

pSVF8-80 jest plazmidem ekspresyjnym dla łańcucha FVIII-LC o Mr 80 kDa. Poczynając od miejsca Sa1I w poliłączniku pSV7d, pSVF8-80 składa się z fragmentu cDNA tkankowego aktywatora plazminogenu o długości 201 bp, od nukleotydu - 98 do+103 (w stosunku do kodonu start), do miejsca BgIII (sekwencje tPA podano w S.J.F. Degan i in., J. Biol. Chem. /1986/ 261: 6972-6985), syntetycznej cząsteczki łącznik-adaptor od miejsca Bg1II do miejsca Bc1I o długości 29bp, kodującej nukleotydy +5002 do +5031 czynnika VIII:C, połączonej z fragmentem Bc1I czynnika VIII:C o długości 2464bp, rozciągającego się od miejsca Bc1I utworzonego przy nukleotydzie 5028 cDNA czynnika VIII:C przez nutagenezę in vitro (Zoller i Smith, Meth. Enzymol. /1983/ 100: 468) (pF8GM7), do miejsca Bc1I w 3’-końcowym regionie niepodlegającym translacji przy nukleotydzie 7492, i fragmentu o długości 400bp 3’-końcowej sekwencji niepodlegającej translacji, rozciągającej się od miejsca BgUI do syntetycznego miejsca PstI utworzonego w wyniku klonowania cDNA, po którym następuje poliłącznik z wektora M13mp9 (Vieira i Messing, Gene /1982/ 19: 259), i następnie pSV7d.

(D) pSVF8-200.

Wektor pSVF8-200 jest plazmidem ekspresyjnym dla cDNA czynnika VIII-C o pełnej długości. Plazmid pSVF8-200 (opisany przez Truetta i in.), który zawiera cDNA kodujący cały czynnik VIII:C i 3’-końcowe sekwencje niepodlegające translacji, z 5’-końcowymi sekwencjami niepodlegającymi translacji takimi samymi jak opisano powyżej dla pSVF8-92, przygotowano w następujący sposób.

Plazmid pSV7d trawiono restryktazą BamHI w celu przecięcia go w regionie poliłącznika w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji od wczesnego promotora SV40. Chemicznie zsyntetyzowano przedstawiony na fig. 4 adaptor łącznikowy BamHI-SacI o długości 49 bp, kodujący co najmniej 30 bp 5’-końcowego regionu niepodlegającego translacji i pierwsze 15 bp sekwencji kodującej ludzki czynnik VIII:C, i ligowano go z pSV7d. Ten zligowany plazmid trawiono następnie restryktazą SacI w celu usunięcia nadmiaru łączników i restryktazą Sa1I w celu zapewnienia lepkich końców Sa1I.

Zligowano ze sobą fragment 1, tj. fragment SacI o długości 2,9 K z pF8-102, zawierający koniec 5’regionu kodującego ludzki czynnik VIII:C i fragment 2, tj. fragment SacI-Sall o długości 6,5 K z pF8-6,5, zawierający koniec 3’ regionu kodującego czynnik, i zmodyfikowany wektor pSV7d zawierający adaptor łącznikowy (patrz Truett i inn, supra). Tę mieszaninę ligacyjną zastosowano następnie do transformacji E. coll HB101, i kolonie selekcjonowano przez oporność na ampicylinę.

Przez hybrydyzację kolonijną na sączkach przetestowano trzysta transformantów, jako sondy stosując 5’-końcowy adaptor BamHI-SacI lub fragment SacI o długości 2,9 K. Kolonie dodatnie w testowaniu obiema sondami analizowano następnie przez mapowanie restrykcyjne. Otrzymano plazmid pSFVF8-200 zawierający cały region kodujący gen ludzkiego czynnika VIII:C i 5’-końcowy region niepodlegający translacji we właściwy sposób połączony w orientacji transkrypcyjnej z wczesnym promotorem SV40.

(E) Transfekcja i hodowla komórek COS7.

Komórki COS7 (Guzman, Cell /1981/23:175) transfekowano przez 14 godzin opisanymi powyżej plazmidami stosując metodę koprecypitacji z fosforanem wapnia (vin der Eb i Graham, Meth. Enzymol. /1980/ 65: 828-39) w połączeniu z traktowaniem difosforanem chlorochiny (Lutzman i Magnusson, Nuc. Acids Res. /1983/ 11: 1295-1308), stosując 50 gg DNA plazmidowego na 5x10⁵ komórek. Komórki można także transfekować metodą z DEAE-dekstranem Sompayraca i Danna, Proc, Nat. Acad. Sci. USA /1981/ 78: 7575-78.

Komórki COS7 hodowano w zmodyfikowanym podłożu Eagle Dulbecco wzbogaconym o 10% płodową surowicę cielęcą, 100 U/ml penicyliny, 100 gg/ml streptomycyny, 292 μg/ml glutaminy i 110 μg/ml pirogronianu sodowego, 88 godzin po transfekcji pobrano próbki z 48-godzinnego podłoża zawierającego surowicę.

167 083 (F) Oznaczenia.

W ściśle określonych odstępach czasu po transfekcji od komórek usuwano podłoże i próbki przechowywano w temperaturze -70°C. Próbki testowano pod kątem ich zdolności do obniżania przedłużonego czasu działania tromboplastyny w osoczu pozbawionym czynnika VIII:C w standardowym oznaczeniu koagulacji (Hardisty i in., Thromb. et Diathesis Haemolag, /1962/ 72: 215). Do weryfikacji wyników oznaczenia koagulacji stosowano bardziej specyficzne oznaczenie przy pomocy Coatest (Rosen i in., Thromb. and Haemostasis /1985/54: 818-823), który mierzy wytwarzanie aktywowanego czynnika X (Xa) jako liniową funkcję stężenia egzogennego czynnika VIII:C. Stężenie immunologicznie reaktywnego białka czynnika VHI:C w podłożu określano stosując oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) do wykrywania polipeptydu o Mr 92 kDa i test ELISA specyficzny wobec polipeptydu o Mr 80 kDa (Nordfang i in., Thromb. and Haemostasis /1985/ 53: 346).

Jak przedstawiono w tabeli 1, ekspresja samego polipeptydu o Mr 92 kDa lub samego polipeptydu o Mr 80 kDa nie powodowała wykrywalnej aktywności, pomimo że w podłożu hodowlanych obecne były wysokie poziomy każdego z osobnych białek. Jeśli komórki kontrasfekowano plazmidami pSVF8-92 i pSVF8-80, podłoża wykazywały aktywność koagulacyjną około 20 mU/ml. Taki sam względny poziom aktywności koagulacyjnej ulegał sekrecji z komórek stransfekowanych plazmidem pSVG8-200 kodującym całe białko czynnika VIII:C.

Kiedy podłoża pochodzące z pojedynczych transfektantów mieszano razem (stosując kilka różnych warunków, jak przedstawiono w tabeli 1), nie stwierdzano żadnej mierzalnej aktywności.

Wyniki te wskazują, że kompleks amino- i karboksykońcowych domen czynnika VIII-C zachowuje właściwą aktywność koagulacyjną, i że środkowa domena nie ma zasadniczego znaczenia dla aktwyności, ani dla tworzenia aktywnego kompleksu z oddzielnych łańcuchów.

Tabela 1

Oznaczenie aktywności rekombinowanego czynnika VIII:C w podłożach hodowlanych komórek COS7

Plazmid	Koagulacja	Aktywność wg Coatest mU/ml	Oznaczenie RIA HC U/ml	Test ELISA LC U/ml
czas (sek)	aktywność mU/ml
pSVF8-92	95,7	<0,9	<0,1	0,15	<0,0002
pSVF8-80	97,2	<0,9	<0,1	<0,01	1,36
pSVF8-92	56,1	22,5	20,4	0,05	1,13
pSVF8-20^a
pSVF8-200	47,0	70,0	43,2	0,12	0,28
brak	94,6	<0,9	<0,1	<0,01	<0,0002
pSVF8-92J+pSVF8-80^b	95,7	<0,9	<0,1	- .	- -

^a plazmidami kotransfekowano te same komórki, ^b plazmidami transfekowano oddzielne komórki, i supernatanty mieszano 48 godzin później.

Testowano połączenie różnych warunków, włącznie z preinkubacją przez różne okresy czasu do 2 godzin w temperaturach37°C, 20°C lub 4°C, w obecności lub nieobecności 10 mM CaCl2. Wartości podane w tej tabeli są reprezentatywne dla otrzymanych danych

Czas koagulacji i aktywność w tabeli 1 otrzymano w następujący sposób: Próbki podłóż, o objętości 75 gl, z hodowli komórek COS7 transfekowanych wskazanymi plazmidami, lub nietransfekowanych, ale z którymi postępowano w sposób analogiczny jak przy transfekcji, oznaczano pod kątem ich zdolności do obniżania przedłużonego czasu działania tromboplastyny w osoczu pozbawionym czynnika VIII:C w jednoetapowym oznaczeniu. W skrócie, 75 μΐ Platelin (General Diagnostics) inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C, po czym dodano 75 μl osocza pozbawionego czynnika VIII:C plus μΐ testowanej próbki na dodatkowe 5 minut inkubacji w temperaturze 37°C. Dodawano uprzednio ogrzaną próbkę 0,025 M CaCl2 o objętości 75 μΐ i mierzono czas krzepnięcia fibrometerem Becton-Dickinson. Jako standard stosowano normalne osocze ludzkie rozcieńczone podłożem z hodowli komórek COS7. Przyjęto,

167 083 że jedna mU aktywności odpowiada około 100 pg białka czynnika VIII:C (Fay i in., Proc. Nat. Acad. Sci. USA /1982/ 79: 7200).

W tabeli 1, do pomiaru wytwarzania zaktywowanego czynnika X (Xa) jako liniowej funkcji stężenia czynnika VIII:C stosowano oznaczenie Coatest (Kabl). Stężenie czynnika Xa mierzy się przez proteolityczne odtrawienie chromogenu para-nitroaniliny od syntetycznego substratu peptydowego czynnika Xa. Jako standard stosowano normalne osocze ludzkie rozcieńczone w 50 mM Tris-HCl, pH 7,3 0,2% BSA.

W oznaczeniu RIA w tabeli 1 oczyszczoną IgG psa hamującą czynnik VIII:C o stężeniu

3.5 gg/ml w 0,1M buforze węglanu sodowego, pH 9,8, opłaszczano studzienki 96-studzienkowej polistyrenowej płytki do mikromiareczkowania przez inkubację przez noc w temperaturze 37°C. Płytki przemywano trzy razy 0,1 M KCL, 0,05% Tween 20, po czym następowała inkubacja z mieszaniną próbek testowanego podłoża i jodowego białka FVIII:C o Mr kDa rozcieńczonych w 0,05 M imidazolu, 0,1 M NaCh, 1% albuminie surowicy bydlęcej, 0,05% Tween 20, pH 7,3. Białko FVIII:C o Mr 92 kDa wyizolowano z osocza i, jak oszacowano przez SDS-PAGE i barwienie srebrem, było ono w ponad 50% homogenne. Po inkubacji przez 16 godzin w temperaturze pokojowej płytki przemywano i w liczniku promieniowania gamma mierzono ilość 125j w pojedynczych studzienkach. Jako standard stosowano częściowo oczyszczony handlowy preparat czynnika VIII:C (Factor VIII, NORDISK) o aktywności właściwej 0,5 jednostki aktywności koagulacyjnej na mg. Standard ten kalibrowano wobec Third International Factor VIII:C standard Światowej Organizacji Zdrowia. Określiliśmy, że nasz częściowo oczyszczony standard posiada stosunek aktywności Mr 92 kDa w RIa aktywność koagulacji czynnika VIII:C równy 1.

W teście ELISA w tabeli 1 oczyszczoną ludzką IgG hamującą czynnik VIII:C o stężeniu

4.5 gg/ml w 0,1M buforze węglanu sodowego, pH 9,8 opłaszczano studzienki 96-studzienkowej płytki PCV do mikromiareczkowania przez inkubację przez noc w temperaturze 37°C. Płytki przemywano jak powyżej i do końcowej 16-godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano skoniugowanych z peroksydazą fragmentów F/ab’/2 ludzkiej hamującej IgG rozcieńczonych w 0,1 M imidazolu, 0,15 M NaCl, 1% BSA, 0,05% Tween 20, pH 7,3. Zabarwienie wywoływano roztworem o-fenylenodiaminy. Jako standard stosowano normalną surowicę ludzką.

Dla potwierdzenia faktu, że obserwowana aktywność koagulacyjna powodowana była czynnikiem VIII:C, określano wrażliwość koagulacji na hamowane przez przeciwciało specyficzne wobec czynnika VIII:C. Przed oznaczeniem, próbki podłóż hodowanych preinkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C w obecności rozcieńczeń normalnej surowicy ludzkiej lub surowicy pochodzącej od chorego na hemofilię, który posiadał rozwinięte wysokie miano przeciwciał hamujących aktywność czynnika VIII:C. Jak przedstawiono w tabeli 2, aktywność całej cząsteczki, jak również aktywność kompleksu 92 kDa - 80 i kDa ulegała specyficznemu obniżaniu przez hamującą surowicę. Takie same wyniki otrzymano stosując trzy różne przeciwciała monoklonalne wiążące się z formą o Mr 80 kDa. Hamowanie aktywności czynnika VIII:C z zastosowaniem surowicy hamującej badano w następujący sposób: 160 gl wskazanego podłoża z hodowli komórek COS7 inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 38°C z 20 gl 100-krotnie rozcieńczonej ludzkiej surowicy hamującej czynnik VIII:C (miano Bethesda 1500 jednostek) lub podobnym rozcieńczeniem normalnej surowicy ludzkiej lub samego buforu (50 mM imidazol, 0,1 M NaCl, 100 gg/ml BSA, pH 7,3). Próbki te następnie oznaczano pod kątem pozostałej aktywności koagulacyjnej, jak przedstawiono powyżej.

Tabela 2

Oznaczenie hamowania koagulacji

Plazmid	Surowica	Czas koagulacji (sek)
1	2	3
pSVF8-80 + pSVF8-92	normalna	51,9
	po immunizacji	74,5
	bufor	54,4

167 083

Tabela 2 (ciąg dalszy)

1	2	3
pSVF8-200	normalna	46,4
	po immunizacji	69,4
	bufor	46,8

Doświadczenia hamowania powtórzono w następujący sposób stosując przeciwciała monoklonalne: 100 μΐ podłoża z hodowli inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C z albo 10 μΐ roztwonr pprzeiwciała monnoiooalneeg anty - ccyynik VIH:C z Hybriteeh o stęężeiu i μg/ml (miano Bethesda 14 000 jednostek ) , albo bufoni, i następnee ^:^η^^:ϋΓ^ο iak opisnno powyżej. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Oznaczenie hamowania koagulacji

Plazmid	Surowica	Czas koagulacji (sek)
pSVF8-92 + pSVF8-80	po immunizacji	72,9
	bufor	48,0
pSVF8-200	po immuaizacji	60,9
	bufor	44,9

W celu wyraźniejszego wykazania istnienia kompleksu dwóch łańcuchów, aktywne formy częściowo oczyszczono z podłoża komórek COS7 przepuszczając przez kolumnę z przeciwciałem monoklonalaym specyficznym wobec części o Mr 80 kDa. Jak przedstawiono w tabeli 4, około 65% nakładanej aktywności ulegało zatrzymaniu na kolumnie, a 50% tego związanego materiału eluowano w formie aktywnej przy pięciokrotnie wyższym stężeniu niż w podłożu początkowym. Poprzez chromatografię powinowactwa, stosując przeciwciała specyficzne wobec jedynie formy o Mr 80 kDa można zatem wyizolować aktywny kompleks. 100 ig przeciwciała mnnoklonalnego anty-80 kDa (55 IgG) (Nordfang i in., Thromb. Haemostasis /1985/ 53: 346) sprzężonego z Sepharose CL4B inkubnoaao przez noc w temperaturze 20°C z 1,4 ml podłoża wykazującego całkowitą aktywność 6,2 mU (mierzone testem Coatest) otrzymanego z komórek COS7 kontransfekowanych plazmidami pSVF8-92 i pSVF8-80. Po inkubacji, zawiesinę nakładano na kolumnę i zbierano frakcję przepływającą bez zatrzymywania. Kolumnę przemywano 300 il Buforu A (50 mM imidazol, 0,1 MNaCl, 0,1% sól sodową insuliny, 0,2 NaN3, pH 7,3), a następnie eluowano Buforem B (2,5 M NaCl, 50% glikol etylenowy, 0,5 M imidazol, 0,1 M CaCh, 0,1% sól sodową insuliny, 0,2% NaN3, pH 7,3).

Tabela 4

Częściowe oczyszczanie aktywnego koagulac^nie kompleksu 92 kDa - 80 kDa

Frakcja	^atest U/ml	ELISA 80 K U/ml
Podłoża	0,0044	0,175
Niewiąza^	0,0017	0,13
Eluat	0,0200	0,76

Podane tu wyniki wykazują, że ekspresja regionu łącznikowego (B), zawierającego 918 aminokwasów, czyli 40% całości nienaruszonego białka, nie jest wymagana dla aktywności czynnika VIII:C. Wynikiem koekspresji pojedynczych regionów o Mr 92 kDa i Mr 80 kDa jest poziom aktywności czynnika VIII:C porównywalny z poziomem otrzymywanym przy ekspresji całego regionu kodującego czynnik VIII:C. Białka te tworzą in yiyo aktywny kompleks połączony mostkiem wapniowym. Tworzenie kompleksu nie wymaga obecności regionu B i wydajnie zachodzi dla dwóch łańcuchów eksprymowanych trans.

167 083

Powyższe wyniki dowodzą, że aktywność czynnika VIII:C osiągnąć można bezpośrednio wytwarzając niezależnie eksprymowane fragment N-końcowy i fragment C-końcowy, z których każdy posiada własną sekwencję sygnałową. Można zatem otrzymać czynnik VIII:C z większą wydajnością, ponieważ nie trzeba klonować i stosować jako sekwencji kodującej aktywność czynnika VIII:C dużego prekursora. Do ekspresji czynnika VIII:C można zatem wykorzystywać komórki niezdolne do przeprowadzania prawidłowego dojrzewania białka czynnika VIII:C o pełnej długości.

Przykład Π. Ekspresja białka o Mr 92 kDa w komórkach COS7 z zastosowaniem konstrukcji pSVF8-92 była niska w porównaniu z ilością wytwarzanego białka o Mr 80 kDa wydaje się, że białko o Mr 92 kDa ulega zatrzymywaniu i/lub degradacji w aspekcie Golgiego, i niie jest wydajnie pi'r^c^e^e;c^\^an^ lub wydzielane. Konstrukcję modyfikowano zztem próbując zwiększyć poziom białka o Mr 92 kDa. Wykonano modyfikację następujących typów: zmiany w 5’-końcowej sekwencji niepodlegającej translacji genu czynnika VIII:C; włączenie heterologicznych sekwencji 5’-końcowej niepodlegającej translacji i liderowej i zmiany w 3’-końcowych sekwencjach niepodlegających translacji. Konstrukcje te opisano poniżej.

(A) . Modyfikacje 5’-końcowego regionu niepodlegającego translacji.

Plazmid pSVF8-92 B. Plazmid ten jest pochodną plazmidu pSVF8-92,w której 30bp 5’-końcowej sekwencji niepodlegającej translacji zastąpiono całym 5’-końcowym regionem niepodlegającym translacji cDNA ludzkiego czynnika VIII:C (nukleotydy 1do 171; patrz fig. 8 w Truett i in., supra), z delecją odcinków G-C (przez ukierunkowaną mutagenezę in vitro), i zmianami trzech zasad przedstawionymi poniżej przy kodonie startu ATG (w pozycji +172, fig 8, Tiruett i in., w celu do sekwencj dla wydajnej translacji w komórkach eukariotycznych:

Czynnik VIII:C: GTCATG CAA consensus Kozaka: ACCATG G

Zmiana ta zmienia drugi aminokwas peptydu sygnałowego z Gln na Glu.

Plazmid psVF8-92E. Plazmid ten jest pochodną plazmidu pSVF8-92B, w której usuwa się poliłącznik pochodzący z 5’pSV7d do sekwencji czynnika VIII:C z wyjątkiem miejsca Sali, a kodon STG w 5’-końcowym regionie siepoZlegającym translacji (przy 41 według Truett i in., supra) zmienia się na ATT przez mutagenezę in vitro.

(B) Dołączanie heterologicznych sekwencji 5’-końcowych.

Plazmidy pSVF8-92G, H i I. Plazmidy te są pochodnymi plazmidu pSVF8-92B, w których 5’-końcowy region niepodlegający translacji, jak również naturalną sekwencję sygnałową czynnika VIII:C zastąpiono analogicznym regionem cDNA ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA). W pSVF8-02G pierwsze 35 aminokwasów (sekwencji sygnałowej i prosekwencji) regionu pre-pro tPA połączono z dojrzałym czynnikiem VIII:C o Mr 92 kDa z seryną podstawioną w miejsce pierwszego aminokwasu (alaniny) białka o Mr 92 kDa w pSVF8-92H pierwsze 32 aminokwasów regionu prepro tPA połączono z dojrzałym białkiem czynnika VIII:C o Mr 92 kDa w pSVF8-92I pierwsze 23 aminokwasów regionu pre-pro-tPA połączono z dojrzałym białkiem czynnika VIII:C o Mr 92 kDa sekwencje tPA są takie same jak opisane dla pSVF8-80.

Plazmid pSVF8-92J. Plazmid ten jest pochodną plazmidu pSVF8-92G, w której 5’-końcowy region tPA zastąpiono 75 bp 5’-końcowej sekwencji niepodlegającej translacji gD wirusa Herpes simplex-1 (HSV-1) i 75 bp sekwencji sygnałowej gD HSV-1. pSVF8-92J pozbawiony jest także podstawienia Ala - Ser (R.J. Watson i in., Science /1982/ 218: 381-384).

(C) Zmiany 3’-końcowego regionu niepodlegającego translacji.

Plazmid pSVF8-92C. Plazmid ten jest odmianą plazmidu pSVF8-92B, w którym region kodujący białko o Mr 92 kDa połączono bezpośrednio z kodonem stopu translacji i naturalnym 3’-końcowymi sekwencjami niepodlegającymi translacji cDNA ludzkiego czynnika VIII:C.

Plazmid pSVF8-92L. Plazmid ten jest pochodna plazmidu pSVF8-92C, w której 3’-końcowy region niepodlegający translacji pSVF8-92C zastąpiono 3’-końcowym regionem niepodlegającym translacji plazmidu pSV8-80.

167 083 (D) Wyniki.

Każdym z plazmidów z powyższych części A-C transfekowano komórki COS7 wraz z plazmidem pSVF8-80 jak opisano w przykładzie I, i podłoża testowano pod kątem aktywności czynnika VIII:C jak w przykładzie I(F).

Pierwszy testowany plazmid, pSVF8-92B, wykazywał poziomy aktywności w zakresie 2do 8-krotnie wyższych niż plazmid pSVF8-92. Z pozostałych plazmidów najlepszym okazał się pSVF8-92E, będący 1,65-krotnie lepszy niż pSVF8-92B. Plazmidy pSVF8-92J i I także wykazywały zasadniczo wyższe poziomy ekspresji niż pSVF8-92, bliskie poziomowi pSVF8-92E. Poziom ekspresji pSVF8-92G jest bliski poziomowi pSVF8-92, podczas gdy poziom pSVF892H był zasadniczo niższy niż pSVF8-92. Poziomy ekspresji zarówno pSVF8-92C, jak i pSVF8-92L okazały się równoważne poziomowi pSVF8-92E.

Przykład III. Przykład ten opisuje przygotowywanie konstrukcji do wytwarzania polipeptydu składającego się z łańcucha o M_r 92 kDa i części domeny B. Pochodne te wykonano próbując uzyskać ciężki łańcuch, który jest bardziej stabilny i/lub wydajniej tworzy aktywny kompleks z lekkim łańcuchem. Pochodne wybrano tak, aby naśladowały formy cząsteczkowe obserwowane w otrzymywanych z osocza preparatach czynnika VIII:C oraz lizatach komórkowych i podłożach z hodowli komórek eksprymujących rekombinowany czynnik VIII:C o pełnej długości. Polipeptydy o w przybliżeniu tej samej wielkości mogą powstawać przez trawienie trombiną czynnika VIII:C o pełnej długości.

(A) pSVF8-92S. Plazmid ten koduje ciężki łańcuch o długości 982 aminokwasów, i przygotowano go z plazmidu pSVF8-302, zawierającego cDNA o pełnej długości, przez trawienie w pierwszym miejscu SacI regionu kodującego domenę B. Do wprowadzenia kodonu stopu translacji i połączenia sekwencji kodującej z naturalną 3’-końcową sekwencją niepodlegającą translacji, rozpoczynającej się w pierwszym miejscu Bali, zastosowano adaptor oligonukleotydowy. Plazmid ten koduje pierwsze 978 aminokwasów natywnego ludzkiego czynnika VIII:C i 4 podstawione reszty aminokwasowe przy końcu karboksylowym.

(B) pSVF8-160. Plazmid ten zapewnia ciężki łańcuch o długości 1323 aminokwasów, i przygotowano go z klonu o pełnej długości (oznaczonego pSVF8-303), podobnego do pSVF8200, lecz posiadającego 5’-końcowy region niepodlegający translacji plazmidu pSVF8-92E, pSVF8-303 trawiono restryktazami Eco RVi SmaI, i ligowano ze sobą tępe końce, pSVF8-160. Plazmid ten koduje pierwsze 1315 aminokwasy czynnika VIII:C. W wyniku dołączenia poliłącznika wektora pSV7d, do końca karboksylowego dołączono osiem podstawionych aminokwasów.

(C) pSVF8-1790. Plazmid ten zapewnia ciężki łańcuch o długości 1416 aminokwasów, i przygotowano go także z plazmidu pSVF8-303, pSVF8-303 strawiono częściowo restryktazą Bglll, i otrzymany fragment o długości 6811 bp wyizolowano z żelu, i ligowano ze sobą końce, tworząc pSVF8-170. Plazmid ten koduje pierwsze 1405 aminokwasy czynnika VIII:C 1, na skutek dołączenia poliłącznika wektora pSV7d, posiada przedłużenie końca karboksylowego o 11 aminokwasów.

(D) pSVF8-120. Plazmid ten zapewnia ciężki łańcuch o długości 1107 aminokwasów, i przygotowano go z plazmidu pSVF8-303. Plazmid pSVF8-303 strawiono restryktazą ApaI, i lepkie końce wypełniono stosując polimerazę T4. Otrzymaną cząsteczkę trawiono dalej restryktazą SmaI, DNA poddawano samoligacji i namnażano w E. coli HB101. Plazmid ten koduje pierwsze 1102 aminokwasy końca aminowego czynnika VIII:C plus 5 dodatkowych aminokwasów, kodowanych przez poliłącznik pSV7d, (E) Wyniki.

Każdy z plazmidów z powyższych części A-D transfekowano komórki COS7 wraz z plazmidem pSVF8-70 jak opisano w przykładzie I i podłoża testowano pod kątem aktywności czynnika VIII:C jak w przykładzie I.

Każdy z tych plazmidów wykazywał zasadniczo obniżone poziomy ekspresji w porównaniu z poziomem ekspresji pSVF8-92E. Co interesujące, mimo tego stosunek aktywności w RIA do aktywności w teście Coatest dla pSVF8-160 i pSVF8-170 wynosi około 1,8, w porównaniu z 7,2 dla pSVF-92E. Wynik ten sugeruje, że te dłuższe pochodne ciężkiego łańcucha posiadają wyższą aktywność, właściwą, tzn. bardziej wydajnie tworzą aktywny kompleks podjednostek

167 083 niż sama cząsteczka o Mr 92 kDa. Stosunek aktywności koagulacyjnej do aktywności w teście Coatest jest niższy dla dłuższych ciężkich łańcuchów i wynosi około 1,7, w porównaniu z 2,3 dla 92 kDa i 1,35 dla całej cząsteczki, sugerując, że te dłuższe polipeptydy tworzą kompleksy, które nie są tak aktywowane, jak kompleks 92 kDa + kDa.

Przykład IV. Przykład ten opisuje przygotowywanie stabilnej linii komórek CHO wytwarzającej kompleks łańcuchów czynnika VIII:C o Mr 92 kDa i Mr 80 kDa.

(A) Przygotowywanie plazmidu kodującego marker selekcyjny.

Przez połączenie głównego promotora fazy późnej adenowirusa-2 (Ad-MLP, jednostki mapowe 16-27,3) z 5’-końcową sekwencją niepodlegającą translacji cDNA DHFR myszy (J.H. Nunberg i in., Cell /1980/ 19: 355-64) skonstruowano plazmid pAd-DHFR, niosący cDNA DHFR myszy. Z pSV2-neo (Southern i Berg, J. Mol. Appl. Gen. /1982/1: 327-41) otrzymano DNA SV40 kodujący część wczesnej jednostki transkrypcyjnej, włącznie z intronem genu małego antygenu t, i posiadający region terminacji transkrypcji wczesnego regionu, i połączono z niepodlegającym translacji końcem 3’ cDNA DHFR. Te trzy segmenty subklonowano w plazmidzie pBR322, otrzymując pAd-DHFR.

(B) Transfekcja i hodowla komórek CHO.

Komórki CHO-DUKX-B11, posiadające niefunkcjonalny gen reduktazy dihydrogolianowej (Urlaub i Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci. USA /1980/ 77:4216-4220) transfekowano koprecypitatem fosforanu wapnia trzech plazmidów: pSVF8-92C. pSVF8-92E lub pSVF8-80 i pAd-DHFR zgodnie z metodą Gragama i Van der Eba, supra, i modyfikacjami opisanymi przez Wiglera i in., Cell(1978) 14: 725-731 i Lewisa i in., Somatic Cell Genet, (1980) 6: 333-347. Koprecypitaty zawierały do 10 μg każdego plazmidu. Komórki selekcjonowano pod kątem ekspresji pozytywnego fenotypu DHFR w podłożu nie zawierającym hipoksantyny i tymidyny.

Po wyizolowaniu klonów DHFR-dodatnich i identyfikacji tych wytwarzających aktywność czynnika VIII:C, uzyskane linie komórkowe hodowano w obecności metotreksatu w celu amplifikacji genów DHFR i koamplifikacji genów czynnika VIII:C. Selekcję tę przeprowadzano przez wysianie komórek na podłoże zawierające metotreksat w stężeniach w zakresie od 0,025 do 0,2 μM. Klony oparte na metotreksat ponownie oznaczono pod kątem aktywności czynnika VIII:C.

(C) Metody oznaczeń.

Podłoża hodowlane w tych DHFR-dodatnich klonów oznaczano stosując test ELISA pod kątem immunoreaktywności lekkiego łańcucha czynnika VIII:C metodą Nordfanga i in., Thromb. Haemosta (1985) 53: 346-50. Immunoreaktywność ciężkiego łańcucha czynnika VIII:C oceniano stosując oznaczenie radioimmunologiczne (RIA) opisane przez R.L. Burkę i in., J. Biol. Chem. (1986) 261: 12574-78. Aktywne kompleksy czynnika VIII:C tworzone przez koekspresję glikoprotein o Mr 92 kDa i 80 kDa mierzono stosując oznaczenie przy pomocy Coatest opisane w przykładzie I.

(D) Linie CHO eksprymujące aktywne kompleksy 92 K - 80 K w tabeli 5 przedstawiono cztery niezależne linie komórkowe jednocześnie eksprymujące produkty wszystkich trzech plazmidów stosowanych do transfecji. Przedstawione w tabeli 5 wartości aktywności czynnika VIII:C są aktywnościami obserwowanymi początkowo. Ekspresja glikoprotein przez stabilne linie komórkowe zazwyczaj poprawia się po pasażu w płynnym podłożu T-75. Przykładowo można to zaobserwować dla linii 10-C2, która ostatecznie wytwarza 200 mU aktywności czynnika VIII:C na ml podłoża hodowlanego (tabela 6). Klonowanie tych stabilnych linii komórkowych wykazuje, że niezależnie eksprymowane łańcuchy ciężki i lekki czynnika VIII:C mogą tworzyć aktywny kompleks i ulegać sekrecji z komórek jajnika chomika chińskiego.

Tabela 5

Linie komórek CHO wytwarzające aktywne kompleksy 92 K - 80 K

Klon	Transfekowany DNA	mU w Coatest/ml
11-D6	pSVF8-92C, pSVF8-80, pAd-DHFR	43
11-D5	pSVF8-92C, pSVF8-80, pAd-CHFR	30
8-C1	pSVF8-92E, pSVF8-80, pAd-DHFR	18,2
10-C2	pSVF8-92E, pSVF8-80, pAd-DHFR	70,0

167 083

Fakt, że linie komórkowe z tabeli 5 można wielokrotnie pasażować bez utraty ekspresji czynnika VIII:C sugeruje, że trzy plazmidy ulegały integracji do chromosomów komórek SHO.Knninczne było następnie, czy ekspresję glikoprotein czynnika VIII:C można zwielokrotnić przez selekcję metotreksatem. Wszystkie cztery z tych linii komórkowych umieszczono w celu przeprowadzenia selekcji w kilku stężeniach metotreksatu. kla każdej linii otrzymano kolonie oporne ^amplifikowane geny kHFR), i testowano je pod kątem aktywności czynnika VIII:C. Oporne na metotreksat klony 11-k5 i 11-k6 traciły zdolność ekspresji czynnika VIII:C lub pozostawała ona niezmieniona. Ekspresja czynnika VIII:C była różna wśród opornych na metotreksat klonach pochodzących z linii 10-C2 i 8-C1 (patrz w tabeli 6).

Przebadano dwadzieścia dwa oporne na metotreksat klony 8-Cl, dane dla 10 z nich przedstawiono w tabeli 6. Zwielokrotnienie było zróżnicowane u różnych klonów, sugerując, że albo jeden z genów podjednostek może ulegać koamplifikacji z kasetką kHFR, albo oba z nich, albo żaden. W przypadku klonów 8C1-A2,8C1-C2 i 8C1-C5 można zaobserwować przykłady tych czterech możliwości. Podobnie, oceniono 30 wyselekcjonowanych metotreksatem pochodnych linii 10-C2, dane dla 20 z nich także przedstawiono w tabeli 6. Obejmują one także szeroki zakres aktywności. W przypadku klonów 10C2-A2, 10C2-D2, 1OC2-B5 i 10C2-C6 zaobserwowano przykłady czterech różnych możliwości koamplifikacji.

Tabela 6

Klon	Stężenie MTX (gM)	Coatest (mU/ml)	LC w ELISA (mU/ml)	HC w RIA (mU/ml)
8-C1	0	18	1275	n.d.
8-C1-A1	0,1	<50	1750	80
8C1-A2	0,1	60	1950	>1306
8C1-A5	0,05	2	100	10
8C1-B3	0,025	33	1950	1000
8C1-B4	0,025	50	3550	820
8C1-B5	0,025	35	1950	>10^0
8C1-C2	0,025	130	13100	>>1660
8C1-C3	0,025	165	3900	>>>1000
8C1-C5	0,025	30	1750	760
10-C2	0	200	1400	700
10C2-A1	0,05	61	1600	400
10C2-A2	0,1	67	6700	700
10C2-A4	0,05	63	2250	1200
10C2-A5	0,05	183	9450	2660
10C2-A6	0,05	320	8600	7400
10C2-B1	0,05	408	8100	4300
10C2-B3	0,05	134	800	9800
10C2-B4	0,05	394	18000	7800
10C2-B5	0,05	461	15000	8400
10C2-B6	0,05	247	2200	9800
10C2-C1	0,1	160	8100	7600
10C2-C2	0,05	228	6000	5600
10C2-C3	0,05	294	14850	2650
10C2-C5	0,05	294	12400	5400
10C2-C6	0,05	100	1350	520
10C2-D2	0,05	496	1560	16400
10C2-k3	0,05	242		2260
10C2-D4	0,05	165	14100	3500
10C2-D5	0,05	316	7800	5200
10C2-D6	0,05	141	1600	6400

167 083

Wśród opisanych w tabeli 6 linii CHO, jedna (10C2-D2) wytwarza 0,5 U/ml aktywnego kompleksu czynnika VIII:C, co stanowi połowę stężenia stwierdzanego w normalnym osoczu ludzkim. W celu analizy i oczyszczania czynnika VIII:C, eksprymujące polipeptydy czynnika VIII:C linie komórek CHO namnażano na skalę laboratoryjną, otrzymując 1-2 literowe ilości płynu z hodowli tkankowych. Oznaczenie tego materiału wykazało, że około 10 do 20% immunoreaktywnego czynnika VIII:C z linii niepoddawanych amplifikacji aktywne jest w teście COATEST. W liniach poddawanych amplifikacji procent aktywnego materiału spada do 2 do 5% całości immunoreaktywnego produktu. Oznacza to, że tylko część ciężkich i lekkich łańcuchów FVIII:C tworzy aktywne kompleksy. Pozostałe mogą występować w postaci wolnych podjednostek lub w formie zdegradowanej.

Plazmidy pSVF8-92 i pSVF8-80 zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC) 24 stycznia 1986 r. i otrzymały odpowiednio numery ATCC 40222i 40 223. Plazmid pSVF8-200 zdeponowano w ATCC 17 lipca 1985 r, i otrzymał numer ATCC 40190.

Przykład V. Przykład ten opisuje modyfikację plazmidu pSVF8-80 w celu poprawy aminokońcowego aminokwasu FVIII:C glikoproteiny lekkiego łańcucha FVIII:C. Konsekwencją wprowadzenia peptydu sygnałowego potrzebnego do niezależnej sekrecji glikoproteiny o Mr 80 kDa (przykład I), jest podstawienie Ser za normalną resztę aminokońcową lekkich łańcuchów FVIII:C z osocza ludzkiego. Próbując zmienić sekwencję peptydu pre-pro tPA wykonano nowe plazmidy, tak aby lekki łańcuch FVIII:C posiadał po proteolitycznym procesowaniu resztę Glu w aminokońcu w miejsce reszty Ser będącej wynikiem mutacji.

Sądzi się, że lekki łańcuch FVIII:C ulega odtrawieniu od prekursora FVIII:C o pełnej długości przed sekrecją, tj. wewnątrzkomórkowo, przez proteazę występującą w aparacie Golgiego. Odtrawienie to następuje pomiędzy resztami aminokwasowymi 1648 i 1649 (ArgGlu). Na żelach poliakryloamidowych łańcuchy pojawiają się jako dwa prążki o Mr 77 kDa i 80 kDa, odpowiadające polipeptydom posiadającym jeden lub dwa oligosacharydy przyłączone N-glikozydowo. Niezależną sekrecję lekkich łańcuchów osiągnięto przez połączenie regionu cDNA FVIII:C kodującego lekki łańcuch z cDNA tPA. W procesie wprowadzenia peptydu sygnałowego tPA, aminokoniec lekkiego łańcucha FVIII:C uległ jednakże mutacji z reszty kwasu glutaminowego w serynę. Chociaż ten zmutowany rekombinowany lekki łańcuch przejawia charakterystykę molekularną podobną do łańcucha otrzymanego z rekombinowanego FVIII:C o pełnej długości, istnieją wstępne dowody, że 1) może nie być on alternatywnie glikozylowany w taki sam sposób jak łańcuch odtrawiony od prekursora FVIII:V, 2) może się inaczej zachowywać podczas oczyszczania przez chromatografię jonowymienną lub na vWF Sepharose i 3) może się różnić antygenowo od autentycznego lekkiego łańcucha.

Sekwencja peptydu pre-pro tPA wymaga trzech etapów trawienia proteolitycznego do uwolnienia dojrzałego polipeptydu. Na fig. 5 przedstawiono translację sekwencji kodującej białko pSVF8-80 w regionie połączenia tPA-FVIH:C 80 kDa. Sądzi się, że trawienie przez peptydazę sygnałową następuje po karboksylowej stronie wskazanych gwiazdkami Ser (pozycja -13) albo Ala (pozycja -8). Drugie trawienie występuje prawdopodobnie po karboksylowej stronie Arg (pozycja -4, na fig. 5 wskazana przez Q). Trzecim etapem procesowania jest proteoliza wiązania Arg-Ser z uwolnieniem tripeptydu Gly-Ala-Arg i pozostawieniem aminokońcowej Ser (pozycja 1) w dojrzałych polipeptydach tPA lub lekkiego łańcucha FVIII:C.

(A) Przygotowanie plazmidów.

(1) pSVF8-80KG.

Kodon Ser (pozycja 1) zmieniono przez ukierunkowaną mutagenezę w kodon Glu (pozycja

1). Wykonano to w celu umożliwienia normalnego zachodzenia pierwszych dwóch pierwszych etapów procesowania proteolitycznego, i sprawdzenia, czy proteaza Arg-Glu może rozpoznawać i odtrawiać dipeptyd jeśli w miejsce domeny B FVIII:C podstawiony jest tripeptyd tPA. Region połączenia tPA-łańcuch 80 K przedstawiono na fig. 6. Poza tym plazmid ten jest identyczny z pSVF8-80.

(2) pSVF8-80S.

Z plazmidu pSVF8-80 wydeletowano przez mutagenezę in vitro dwadzieścia kodonów, i kodon Ser (pozycja 1) zamieniono na kodon Glu. Umiejscawia to resztę Glu lekkiego łańcucha FVIII:C po Ser 23 przypuszczalnego peptydu sygnałowego tPA(wskazanej na fig. 7 przez

167 083 gwiazdkę). Trawienie przez peptydazę sygnałową po karboksylowej stronie Ser 23 uwalnia niezmutowany lekki łańcuch FVIII:C. Region połączenia tPA-łańcuch 80 K pSVF8-80S przedstawiono na fig. 7. Poza tym plazmid ten jest identyczny z pSVF8-80.

(3) pSVF8-80R.

Przez mutagenezę in vitro wykonano delecję trzech kodonów pSVF8-80 w celu usunięcia pro-tripeptydu tPA i kodon Ser (pozycja 1) zamieniono na kodon Glu. Umiejscawia to resztę Glu po Arg32 propeptydu tPA, oznaczonej 0 na preeastawionyna na fig . 8 regionie połączania tPA-łańcuch 80 kDa pSVF8-80R. Konstrukcję tę wykonano w nadziei, że trawienie przez proteazę o dwuzasadowej specyficzności, znajdującą się w aparacie Golgiego, będzie uwalniać lekkie łańcuchy FVIII:C posiadające aminokońcowy Glu.

(4) pSVF8-80A.

Siedem kodonów nSVFg-g0 wydeletowano przez ukierunkowaną mutagenezę, usuwając DNA kodujący przypuszczalną sekwencję pro tPA, i kodon Ser (pozycja 1) po kodonie 28 (Ala) przypuszczalnej sekwencji kodującej peptyd sygnałowy tPA (na fig. 9 wskazany gwiazdką) zastąpiono kodonem Glu. Trawienie przez peptydazę sygnałową po karboksylowej stronie Ala28 uwalnia niezmutowany lekki łańcuch FVIII:C. Region połączenia tPA-łańcuch 80 kDa przedstawiono na fig. 9. Poza tym, plazmid jest identyczny z plazmidem pSVF8-80.

(B) Ekspresja i analiza sekwencji białek (1) Transfekcja komórek COS7

Komórki COS7 transfekowano stosując opisaną w przykładzie I procedurę z DEAE-dekstranem, i w podłożach z hodowli oznaczano lekkie łańcuchy (LC) testem ELISA. Wszystkie cztery pochodne plazmidu pSVF8-80 kodują glikoproteinę LC o Mr 80 kDa reaktywną w teście ELISA i mogącą ulegać, po biosyntetycznym znakowaniu radioaktywnym, immunonrecopitacji z różnymi przeciwciałami anty-lekki łańcuch FVIII:C. Z wyjątkiem pSVF-80R, wszystkie pochodne prowadzą do sekrecji mniej więcej takiej samej ilości gliko^^emy 80 kDa jak pSVF8-80. Sekrecja glikoproteiny 80 kDa z komórek stransfekowanych pSVF8-80R jest bardzo słaba, zazwyczaj niższa niż 25% glikoproteiny wytwarzanej z innych plazmidów. Ponadto, wygląd tego lekkiego łańcucha FVIII:C w elektroforezie żelowej jest inny, prążki są zawsze rozdyfundowane.

(2) Ekspresja z komórkach CHO.

Każdy z tych plazmidów wprowadzono do komórek CHO DUKX-B11 z plazmidem pAd-DHFR, jak opisano w przykładzie IV. Do wytwarzania każdego typu lekkiego łańcucha ustalono stabilne linie komórkowe. Ekspresja glikoprotein o Mr 80 kDajest pod względem ilości glikoproteino ulegającej sekrecji i wyglądu prążków 80 kDa w elektroforezie żelowej bardzo podobna do ekspresji w komórkach COS7. Linie CHO stransfekowane plazmidem pSVF8-80R wytwarzały tak niski poziom glikopret8iny 80K, że analizy tego materiału nie przeprowadzono.

(3) Oczyszczanie i analiza sekwencji aminokwasowej.

Przygotowano podłoża hodowlane albo z transfekcji komórek COS7 (pSVF8-80KG) na dużą skalę, albo ze stransfekowanych (zamplifikowanych) linii komórek cHo (pSVF8-80K, linia komórkowa 10C2B5, pSVF8-80A, linia komórkowa A1N; pSVF8-80S, linia komórkowa SiR). Podłożem było DME H12 z 10% FBS. FVIII-LC oczyszczano do sekwencjonowaniaprzez dwuetapową procedurę obejmującą chromatografię jonowymienną, a następnie chromatografię powinowactwa. Chromatografię jonowymienną przeprowadzano w następujący sposób. Kolumnę z S-FF Sepharose (15x0,7 cm) równoważono 0,02 M MES, 0,05 M NaCl, 0,01 M CaCk, pH 5,8 lambda20°c = 7,2 mS. Podłoże z hodowli (500-1300 ml) nakładano na kolumnę po doprowadzeniu pH do 5,8 z szybkością przepływu 10-0 ml/godzinę. Kolumnę przemywano 10 objętościami 0,05 M imidazolu, 0,05 M NaCl, 0,01 M CaCl2, pH 7,35 lambda20°c = 8,8 mS z szybkością przepływu 200 ml/godzinę. FVIII-LC eluowano przez dodanie do bufora do przemywania 0,1 M CaCl2, szybkość przepływu 50 ml/godzinę. Wszystkie operacje prowadzono w temperaturze 4°C.

Chromatografię powinowactwa przeprowadzano w następujący sposób: Mysie przeciwciało monoklonalne anty-pyilI-LC IgG 56 sprzężono metodą z CNBr z Sepharose 4B z wydajnością 2,5 mg/ml żelu. Eluent zawierający FVIII-LC inkubowano przez noc z immunosorbentem w temperaturze pokojowej, 1 ml żelu na 1000 jednostek FVIII-LC. Żel pakowano

167 083 następnie do kolumny i przemywano 20 objętościami kolumny buforu o niskim stężeniu soli (0,05 M imidazol, 0,15 M NaCl, 0,01 M NaCk, 10% glicerol, 0,02% NaN3, pH 7,3), a następnie 20 objętościami kolumny buforu o wysokim stężeniu soli (0,05 M imidazol, 1,0 M NaCl, 10% glicerol, pH 7,3). FVIII-Lc eluowano z immunosorbentu stosując i M CaCk w 0,05 M imidazolu, 0,15 M NaCl, 10% glicerolu po jednogodzinnej inkubacji. Eluat natychmiast odsalano do roztworu 0,05 M imidazolu, 0,015 M NaCl, 0,01 M CaCk, 10% glicerolu, 0,02% Tween 80, 0,02% NaN3, pH 7,3 na kolumnie Sephadex G-25, i przechowywano w temperaturze -80°C. Analizę N-końcowej sekwencji przeprowadzano w sekwenatorze Applied Biosystems 477A.

Wyniki tej analizy przedstawiono w tabeli 7. Glikoproteina kodowana przez pSVF8-80KG posiada trójpeptydowe przedłużenie aminokońca. Przypuszczalnie jest to trójpeptyd Gly-AlaArg-pro tPA, który nie może ulegać procesowaniu przez proteazę Arg-Glu rozpoznającą domenę B FVIII:C. Dalej, N-końcowe sekwencje ujawniają, że peptyd sygnałowy tPA posiada teraz długość 22 reszt aminokwasowych, z trawieniem przez peptydazę sygnałową następującym po karboksylowej stronie Pro22. Dlatego też, konstrukcje plazmidowe pSVF8-80S i pSVF8-80A, z trawieniami przez peptydazę sygnałową przewidywanymi odpowiednio po Ser23 i Ala28, prowadzą do nieprawidłowych reszt aminokońcowych lekkich łańcuchów 80 kDa.

Tabela 7

N-końcowe sekwencje łańcuchów 80 kDa ze zmodyfikowanymi regionami pre-pro tPA

Plazmid	Sekwencja N-końcowa	Ilość (pmole)
pSVF8-80	X-Ile-X-Arg-Thr-X-Leu-Dln-X-Asp-Gln-	10
pSVF8-80KG	X-X-Arg-Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr-Leu-	20
pSVF8-80S	Ser-Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-	40
pSVF8-80A	X-Gln-Glu-Ile-	40

Wyniki przedstawione w tym przykładzie pokazują trudność przewidywania, w jaki sposób polipeptyd ulegający sekrecji będzie procesowany po transkrypcji i translacji. Modyfikacje sekwencji białek mają nieoczekiwane konsekwencje dla procesowania proteolitycznego i dołączania oligosacharydów, i wpływać mogą na ogólną wydajność sekrecji.

Przykład VI. Przykład ten opisuje sposób ekspresji autentycznych lekkich łańcuchów FVIII:C z zastosowaniem peptydu sygnałowego ludzkiej αΐ-antytrysyny.

A. Przygotowywanie plazmidów.

1. pSVa1 AT.Met.

cDNA kodujący dojrzały polipeptyd ludzkiej αΐ-antytrypsyny można tworzyć stosując fragmenty klonów cDNA z wątroby ludzkiej i syntetyczne oligonukleotydy; całość ligowano w postaci fragmentu BamH1-SalI z plazmidem pBR322 tworząc plazmid pAT(Met) (Rosenberg i in., Nature /1984/ 312; 77-80). Syntetyczny łącznik-adaptor oligonukleotydowy i część klonu cDNA peptyd sygnałowy zastosowano do przyłączenia sekwencji kodującej peptyd sygnałowy, z miejscem restrykcyjnym w końcu 5’ z miejscem BamHI plazmidu pAT(Met). Otrzymany fragment EcoRI-Sall o długości 1271np, kodujący ulegające translacji sekwencje ludzkiej αΐ-antytrypsyny, ligowano w miejscach EcoRI-Sall plazmidu pSV7d (opisanego w przykładzie I), tworząc pSVa1 AT.Met.

2. pSVF8-80AT.

Plazmid pSVa1 AT.Met otworzono w miejscu BamHI występującym w miejscu połączenia kodonów sekwencji peptydu sygnałowego i dojrzałej a 1-antytrypsyny.Lepki koniec tego miejsca restrykcyjnego usunięto nukleazą fasoli pozostawiając kodon GaG (Glu), i sekwencję αΐ-antytrypsyny wydeletowano przez trawienie restryktazą Sali. Sekwencję kodującą 80 K FVIII:C przygotowano do przyłączenia przez mutagenezę in vitro kodonów 1 i 2 plazmidu pSVF8-80, tworząc miejsce EcoRV (które zachowywało kodon 2 jako kodon Ile). Umożliwiało to połączenie sekwencji kodującej lekki łańcuch FVIII:C (jako sekwencji EcoRV-Sa!I począwszy od kodonu 2) we właściwej fazie odczytu z kodonem 1 a2-antytrypsyny, i zastąpienie sekwencji kodującej dojrzałą ludzką a1-antytrypsynę.

167 083

Sekwencję kodującą plazmidu pSVF8-80AT w regionie połączenia przedstawiono wraz z produktem translacji na fig. 10. Z wyjątkiem podstawienia sekwencji kodującej peptyd sygnałowy α1 -antytrypsyny w miejsce sekwencji kodującej pre-pro- tPA, plazmid jest identyczny z pSVF8-80.

B. Ekspresja i analiza sekwencji aminokwasowej

1. Ekspresja plazmidu pSVF8-80AT w komórkach COS7

Komórki COS7 transfekowano plazmidem pSVF8-80AT i plazmidem ekspresyjnym dla ciężkiego łańcucha, zazwyczaj pSVF8-92C. W podłożach z hodowli oznaczano lekkie (LC) i ciężkie (HC) łańcuchy testem ELISA i przeprowadzano test COATEST. Transfekowane komórki znakowano także radioaktywną Met, tak że biosyntetycznie znakowane radioaktywnie lekkie łańcuchy FVIII:C można było poddawać immunoprecypitacji i uwidaczniać po elektroforezie na żelu pollakryloamidowym. Plazmid SVF8-80AT kieruje syntezą lekkich łańcuchów FVIII:C, które widoczne są jako dwa prążki o Mr 77 i 80 kDa. Ilość wytwarzana w komórkach COS7 jest taka samajak dlapSVF8-80. Koekspresja z pSVF8-92, lub innym plazmidem ciężkiego łańcucha FVIII:C, prowadzi do wytwarzania aktywnych kompleksów FviII:C o aktywności mierzonej w teście COATEST.

2.0czyszczanie i analiza sekwencji aminokwasowej.

Materiał do oczyszczania przygotowano przez transfekcję komórek COS7 w kolbach z T-175, stosując podwyższoną gęstość komórek i obniżone stężenie difosforanu Chlorochiny. Podłoża zbierano 60 godzin po transfekcji. Oczyszczanie i analizę sekwencji aminokwasowej przeprowadzanojak opisano w przykładzie V. Wyniki analizy sekwencji aminokwasowej (tabela

8) wskazują, że lekki łańcuch VIII:C kodowany przez pSVF8-AT posiada taką samą sekwencję aminokwasową jak autentyczny lekki łańcuch FVIII:C z osocza ludzkiego.

Tabela 8

N-końcowa sekwencja łańcuchów 80 kDa ulegających sekrecji przy zastosowaniu peptydu sygnałowego α1-antytrypsyny

Plazmid	Sekwencja N-końcowa	Ilość (pmole)
pSVF8-80	X-Ile-X-Arg-Thr-X-Leu-Gln-X-Asp-Gln-	10
pSVF8-80AT	Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-X-Leu-Gln-Ser-Asp-Gln	10

3. Tworzenie in vitro kompleksów przez lekkie łańcuchy FVIII:C 80 AT.

Zdolność lekkich łańcuchów FVIII:C 80 AT do łączenia się in vitro z oczyszczonymi ciężkimi łańcuchami FVIII:C testowano w doświadczeniu przedstawionym w tabeli 9. Oczyszczone lekkie łańcuchy DVIII:C inkubowano w stężeniu 3,7 U.ml z oczyszczonymi rekombinowanymi ciężkimi łańcuchami (z ludzkiego FVIII:C o pełnej długości) w stężeniu 17 U/ml w buforze zawierającym 50 mM Mn²⁺ i 150 β-merkaptoetanol. Jako kontrolę, umożliwiano ponowną asocjację oczyszczonych ciężkich i lekkich łańcuchów w tych samych warunkach, i ilość wytworzonego aktywnego FVIII:C oznaczano w teście CATEST. Wyniki te sugerują, że lekki łańcuch FVIII:C 80AT może łączyć się in vitro z oczyszczonym rekombinowanym ciężkim łańcuchem.

Tabela 9

Łączenie in vitro rekombinowanych lekkich łańcuchów FVIII:C z ciężkimi łańcuchami

Oczyszczony FVIII-LC	Oczyszczony FVIII-HC	Procent aktywności kontrolnej
80AT	o pełnej długości	86
80S	o pełnej długości	51
80A	o pełnej długości	92
80KG	o pełnej długości	233

167 083

Przykład VII. Przykład ten opisuje plazmidy do poprawionej ekspresji ciężkiego łańcucha czynnika VIII:C. W celu zwiększenia wydajności transkrypcji i stabilności matrycowego RNA wykonano modyfikacje sekwencji DNA odpowiedzialnych za inicjację transkrypcji i sekwencji niekodujących. c^^^^k^^gco łańcucha modyfikuje się przez karboksylokońcowe przedłużenie złożone z odcinków domeny B połączonych krótkim peptydem. Robi się to w celu otrzymania ciężkiego łańcucha, który ulega bardziej wydajnej sekrecji z komórek, jest bardziej stabilny w podłożu hodowli tkankowej i wydajniej tworzy kompleks z lekkim łańcuchem.

A. Przygotowywanie plazmidów.

1. pCMVF8-92/6x

W celu poprawienia poziomu transkrypcji i stabilności matrycowego RNA ciężkiego łańcucha czynnika VIII:C o M_r 92 kDa, wczesny region inicjacji transkrypcji SV40 zastąpiono sekwencjami regionu wczesnego cytomegalowirusa ludzkiego (Boshart i in., Cell /1985/ 4: 521-530). Ponadto 5’-końcowe sekwencje niepodlegające translacji składające się z wczesnego regionu SV40 do matrycowego RNA zastąpiono 5’-knńcowymi sekwencjami niepodlegającymi translacji genu 1E1 HCMV, włącznie z pierwszym intranem. Intron ten włączono zakładając, że transkrypty po wycinaniu/składaniu genu prowadzą do szybszego procesowania i bardziej stabilnego MRNA. Wektor ekspresyjny posiada także miejsce początku replikacji SV40 w celu umożliwienia szybkiej ekspresji w komórkach COS7, i gen bakteryjnej β-laktamazy w celu umożliwienia klonowania DNA przez selekcję na oporność na ampicylinę.

Plazmid skonstruowano z fragmentu SalI-PvuI o długości 700 bp plazmidu pSV7d (opisanego w przykładzie I) zawierającego region poliadenylacji SV40, fragmentu PvuI-EcoRI o długości 1400 bp (wypełnionego za pomocą poliamerazy Klenowa) plazmidu pSVT2 (Myers i in., Cell /1981/ 25:373-84; Rio i in., Cell /1983/ 32:1227-40) dostarczającego miejsca początku replikacji SV40 i genu β-laktamazy, fragmentu SspI-Sall o długości 1700 bp pochodzącego z plazmidowego subklonu ludzkiego cytomegalowirusa (szczep Towne), do którego przez mutagenezę in vitro wprowadzono miejsce Sali blisko miejsca startu translacji białka 1E1, 1 fragmentu Sall-Sall plazmidu pSVF8-92C (opisanego w przykładzie II) o długości 4300bp, zawierającego cDNA dokujący glikoproteinę czynnika o Mr 92 kDa czynnika VII:C.

2. pSVF8-92te.

Plazmid ten jest pochodną plazmidu pSVF8-92C, kodującą rekombiaowanb ciężki łańcuch z C-końcowym przedłużeniem składającym się z N-końcowych i C-końcowych reszt aminokwasowych domeny centralnej (β) prekursora czynnika VIII:C, połączonych peptydem zawiasowym, homologicznym do regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha α ludzkiej immuaoglobuliny. Złożony jest on z fragmentu HindnI-Sall plazmidu pSVF8-92C o długości 4900, do którego wbudowano przedstawiony na fig. 11 syntetyczny łączaik-adapsor o długości 110 bp. Łącznik-adaptor koduje karboksylokońcowe przedłużenie o 34 reszty aminokwasowe i jedno potencjalne miejsce N-glikozylacji. Peptyd C-końcowy powinien zwiększyć masę cząsteczkową ciężkiego łańcucha do Mr około 96 kDa, a jeśli jest glikozylowany, do Mr 99 kDa.

B. Oznaczanie antygenu ciężkiego łańcucha FVIII:C i tworzenia kompleksu FVIII:C.

Aktywność kofaktorów kompleksu lekki łańcuch - ciężki łańcuch FVIII:C oceniano stosując dostępny w handlu zestaw testu KabiVitrum (COATEST). Ilość immunoreaktywaego lekkiego łańcucha FVIII:C mierzono w teście ELISA stosując przeciwciała opłaszczające HZ i przeciwciała skoniugowane z peroksydazą z Nordisk Genofte. Immunoreaktywność określano ilościowo stosując test ELISA opracowany przez Nordisk Genofte, wykorzystujący ludzkie przeciwciała poligonalne (EIgG).

C. Szybka ekspresja pCMVF8-92/6x.

Komórki COS7 koaSrasfekowαao plazmidem pCMVF8 i różnymi plazmidami dla lekkiego łańcucha FVIII:C (opisanymi w przykładzie V) stosując procedurę z DEAE-dekstraaem. Próbkę wyników tych transfekcji przedstawiono w tabeli 10. Dane sugerują, że dodanie sekwencji promoSorowej/wymacniającej transkrypcję 1E1 CMV i 5’-końcowej sekwencji niepodlegającej translacji genu 1E1 daje 2,5-kroSaą (średnio) poprawę ekspresji ciężkiego łańcucha FVIII:C.

167 083

Tabela 10

Ekspresja pCMVF8-92/6x w stosunku do pSVF8-92C w komórkach COS7

Plazmid dla HC	Plazmid dla LC	Aktywność FVIII:C (mU/ml)
COAa	RIA HC^b
pSVF8-92C	pSVF8-80	46	160
pSVF8-92C	-80A	34	72
pSVF8-92C	-80R	61	310
pSVF8-92C	-80S	31	46
pCMVF-92/6x	-80	87	290
pCMVF8-92.6x	-80A	131	140
pCMVF8-92/6x	-80R	178	330
pCMVF8-92/6x	-80S	114	690

a Oznaczenie testem Coatest, ^b Oznaczenie radioimmunologiczne ciężkiego łańcucha.

D. Szybka ekspresja plazmidu pSVF8-92te w komórkach COS7.

W tabeli 11 przedstawiono wyniki kontransfekcji komórek COS7 plazmidem pSVF892φ z plazmidem ekspresyjnym dla lekkiego łańcucha czynnika VIII:C (pSVF8-80AT, opisany w przykładzie VI). Ciężki łańcuch 92tp ulega sekrecji na wyższym poziomie niż ciężki łańcuch 92C, który posiada jednoaminokwasowe (Ser) przedłużenie karboksylokońcowe. Stosunek aktywności określanej w teście COATEST (COA) do ilości glikoproteiny reaktywnej w teście ELISA (miara tworzenia kompleksu) jest wyższy dla łańcuchów 92φ niż dla łańcuchów 92C. Ponadto, ciężki łańcuch 92tp ulga dobrze sekrecji do podłoża bez surowicy, i wydaje się, że jest stabilny, ze stosunkiem aktywności do ilości prawie takim samym jak w 10% FBS. Wyniki te wykazują, że to karboksylokońcowe, 34-aminokwasowe przedłużenie poprawia sekrecję i stabilizuje rekombinowany ciężki łańcuch FVIII:C.

Tabela 11

Ekspresja plazmidu pSVF8-92te w komórkach COS7

Doświad- czenie	Podłoże	Plazmid	Plazmid 2	mU/mL FVIII
COATEST	LCa	HCb
1	10% FBS	pSVF8-92tp	pSVF8-80AT	41	487	98
		pSVF8-92C	pSVF8-80AT	23	442	49
2	10% FBS	pSVF8-92tp	pSVF8-80AT	80	484	162
		pSVF8-92C	pSVF8-80AT	30	639	90
3	KB CHO	pSVF8-92t3	pSVF8-80AT	38	262	125

Monowarstwy komórek COS7 w dwóch powtórzeniach eksponowano na DNA w DEAE-Zekstranie, przemywano i przez 8 godzin traktowano podłożem zawierającym difosforjn chlorochiny. Komórki przemywano w celu usunięcia związku, następnie pokrywano na 12-16 godzin 5 ml DME H21 zawierającym 10% FBS i pokrywano HB CHO z Hana Biologicals. Podłoża z hodowli oznaczano pod względem aktywność FVIII:C jak opisano.

a testem ELISA specyficznym dla lekkiego łańcucha, b testem ELISA specyficznym dla ciężkiego łańcucha.

Chociaż powyższy wynalazek, w celu lepszego zrozumienia, opisano szczegółowo przez podanie ilustrujących go przykładów, jest oczywiste, że w zakresie dołączonych zastrzeżeń można dokonywać jego zmian i modyfikacji.

167 083

Przykład VIII. Przykład ten opisuje sposób eksprymowania ciężkiego łańcucha FVIII:C posiadającego w C-końcu Arg740.

A. Przygotowywanie plazmidu pCMVF-92R.

Ciężki łańcuch FVIII:C kodowany przez plazmid pCMVF8-92/6x posiada jako przedłużenie C-końcowe Ser741· W celu otrzymania ciężkiego łańcucha FVIII:C z Arg740jako C-końcem, oczyszczono fragment BamHI plazmidu pCMVF8-92/6x o długości 1588 bp, kodujący koniec 3’ sekwencji kodującej pochodzącej z pCMVF8-92C. Fragment ten sklonowano w m13mp 18 i przez mutagenezę in vitro kodon Ser741 zmieniono w kodon stopu translacji. Plazmid ekspresyjny pCMVF8-92R tworzono przez klonowanie zmutagenizowanego fragmentu BamHI we fragmencie BamHI o długości 5840 bp oryginalnego wektora. Dzięki tej procedurze wydeletowano 680 bp 3’-końcowej sekwencji niepodlegającej translacji FVIII:C.

B. Szybka ekspresja plazmidu pCMVF8-92R w komórkach COS7.

Komórki COS7 kontransfekowano plazmidem pCMVF8-92R z plazmidem dla lekkiego łańcucha FVIII:C pSVF8-80AT (opisanym w przykładzie VI), stosując technikę z fosforanem wapnia (Graham i ven der Eb, Virol. /1973/ 52:456-67). Podłoża zmieniano 18 i 42 godziny po transfekcji. Próbki podłóż do oznaczeń pobierano 66 godzin po transfekcji. Wyniki tych oznaczeń przedstawiono poniżej w tabeli 12. Dane wykazują, że jeśli plazmid pCVF8-92R kontransfekowano z plazmidem zapewniającym ekspresję lekkiego łańcucha FVIII, pojawiała się aktywność FVIII:C.

Tabela 12

Koekspresja plazmidów pCMVF8-92R i pSVF8-80AT

Transfekcja	COA (mU/ml)	HC:Ag (mU/ml)	LC:AG (mU/ml)
A	243	400	990
B	263	460	1190

Plazmidy pSVF8-92 i pSVF8-80 zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC) 24 stycznia 1986 r. i otrzymały one odpowiednio numery ATCC 40222 i 40223. Plazmid pSVF8-200 i pSVF8-80 zdeponowano w ATCC 17 lipca 1985 r. i otrzymał on numer ATCC 40190.

167 083

Kodony ferminacyjne 1 2 3

5-AGCTAGATCTCCCGGGTCWWM-3'

TCTAGAGGGCCC^GATCTATTCATTACTAG

Hind ΠΙ Bgl li Sma I Xba I Bel I koniec wystający

Fig. 1

BgIII EcoRI Smal KpnI Xbal

5‘-AGATCTCGAATTCCCCGGGGGTACCT

TCTAGAGCTTAAGGGGCCCCCATGGAGATC

Fig. 2

BgIII EcoRI Smal Xbal BamHI Sali

5'-GATCTCGAATTCCCCGGGTCTAGAGGATCCGTCGAC

AGCTTAAGGGGCCCAGATCTCCTAGGCACGTGGATC

Fig.3

-35 -30 -25 -20 -15 -10 -5

5’ GATCC TC TCC AGTTG AACAT TTGTA GCAAT AAGTC 3’ BamHI G AGAGG TCAAC TTGTA AACAT CGTTA TTCAG

Met Gin Jle Glu

ATG CAA ATA GAG CT 3’

TAC GTT TAT CSac 1 5*

Fig.4

-SU <□

i/r

	_J o	o Τ’	UJ	L_ h— LH JC O h- C
LD	sfe		_2<	σν 3? o
> ł—		OO	C o
	l/l Ηη ιΞΤΊ—		c P oo	·— -C P H- C
	ui M >P uj 1—	-X	<_ »-J ojO <Z)C	0)^ =?C
	33 UJ		O UJ	£— h—
	QJ h—		U. UJ	OJ UJ
	—I UJ		O. uj	v— CZ) H-
	»g O O	ι_η V	«- o ω o GOł—	b3 c c	in σ.
O m			Z3t	-2B	uZ
1	<c c		> o	CO

£<?	OJ UJ _C h-		^o
±?c	Q_ ł—		o o
tr P OJ H-		au
Σ. C	>o	< <
jsS	a łj	LH l	CTlC t-C
< o	co	CC
CLI-—	O		OJ UJ
(/) <c C O	S⁴ 08		XZ h— O. l·—
±- P	</)		pc
ς: «5			C v~J

Gin Ser Asp CAG TCT GAT

167 083

O

V

O L-J “S LJ <£ O sS tn (Ξ £S && -£ θ'!— o c 3* oo s- M ^ωϊ3 (ZI

§.

J=. V_J b~ <

oj g£ =C<

3S o

ΊΓ

I

LH

Ύ

I

LJ *-o

>*o o o	yj &S V t/)fx	cn<t tZ o c <x
		O LJ <o
o 2r<	OJ LJ ńżt	_>*o oo
O z; <E	dH >O	C7»<C <$J U. o <x <c
*2 <r o	o <£ <o	CJ1*5 i <c <c	CX\|-—
8½ < o	8^e§ i OO	OJ LJ £ t	L_ I— oj O (Z)F-
o f !<	<L-J h-	<C LJ	ś§

Fig.6

167 083

o □,□ V .3 b	i_n	Jeb	<= OJ JZ UJ 1— <X
3 £ —i uj		<X UJ	Q-l— IZ) <f <3
□ O OJ h—J O		5= *— fE	o-l— <3
₅£		=2^
&£	*“	OO	cxuj (Zł <r <3
lq y v cyi=:	*	l_ cu o O9<
Z3 UJ .3b		P uj oźa	a§
>>S2 O £5		fcS 09 h-	o o
zi		3t > o	o 3
	lh 1	OJ <_j Q_ 1—	O O-H^ ?= <Z> <T <3

cn

O-*- o .sS <o <3 m o Ki ω Fi ΣΖ<

α£ >5 α< < o _^o o o oj O 09 ł—

-£< o uj <?

UJ

m

Osi i

T

CSI m

i

30	O vj LH LJ 1 <X O	?2 5ri< <3
3g	</łh= fS	C. I_ 3μ
3 O 35	<dP	O >
j3\|5	o o	3 «3
«/) erp	o	£ Ej
	1 t/)<
Zf SJ 3b	OUJ tfcb	s?t5 <s	00
>s}5 □ 8		Jc t3 μ- <c	• σι • «»
E*S <<	£5	ω<?;	LŁ_
&<? —· <t	W_U £i=	_, o o o
1ΰ£	LD -=; LJ	cn<£ CD c. O <L <C
c< <x o	o<	CTS<T fc: o < <T
<t o
CXht/ł <f <s	>>3 o o
o		£§

Ϊ(Π 083 ι_η *Γ ζο ο _3b ο <ΓΟ

>Lo

Ο tZłJO C>i >40 !□ ι;

ω ί— —ι ν—» •^S □ a cnC c. Ο < C ι/> <3 >>«

Y2Q

m ι—

3t= > ο ω %__>

śit


feb GO (= 3 § 3 S3	σ'
.33	en • «*
ht	LL>

ιη -+- ο csi cli ι— ¹ Σ<

ϋ <1 — UJ <ϋ ο-ι— (Λ <Τ <3 ο ti >5

-2S

CO o o rtj

J—- <£ cni—

3? 5

C uj

b οο

CSI

I

Ο £»5

167 083

ιη

ΊΓ

O

CsJ

I

5S	p~		ag
	Lni£§	O CM	cu
<o	£5		(— <
			^at? «5£g
	cu H =c5		Q.H=
3g	22 s r- oo		«-t=
OjS-^			CXVJ
-i3	=ϊδ	tn	•gg
	3g		—> <£
	s~ u/		.2$ o o
«-Ο	-=s M
	£fe		OO
	Ψ 2fc CL l_J		c<T -S <· O u->
ωο G0<	ϋί^ >o	o	CLb(Λ C <o
	ZJgJ ±ifc		fcb CZ) H-
£S	1—1 l·—		3§
-4-0 OJh= Σ<	VJ h™		3E

Fig.10

167 083

Ofc

cn

Η· <X

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych białek o aktywności ludzkiego czynnika VIII:C, zawierającego pierwszy polipeptyd homologiczny do domeny A ludzkiego czynnika VIH:C i drugi polipeptyd wykazujący homologię do domeny C ludzkiego czynnika VIII:C, lecz pozbawionego całości lub zasadniczej części domeny B ludzkiego czynnika VIII:C, znamienny tym, że w eukariotycznej stransformowanej komórce gospodarza hodowanej w podłożu do wzrostu komórek wywołuje się koekspresję pierwszego polinukleotydu kodującego pierwszą sekwencję sygnałową zdolną do kierowania sekrecją i pierwszy polipeptyd, zawierający pierwszy region o sekwencji aminokwasowej homologicznej do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C, i drugiego polinukleotydu, kodującego drugą sekwencję sygnałową ludzkiej αΐ-antytrypsyny zdolną do kierowania sekrecją i drugi polipeptyd o sekwencji aminokwasowej homologicznej z sekwencją aminokwasową aminokwasów 1649-2322 ludzkiego czynnika VIII:C, i z podłoża komórkowego wydziela się kompleks rekombinowanych białek.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się kompleks, w którym nie więcej niż 5% liczby aminokwasów sekwencji aminokwasowej różni się od naturalnie występującej sekwencji aminokwasowej domeny A i C czynnika VIII:C.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową polipeptydu taką samą, jak sekwencja aminokwasowa aminokwasów 1-740 ludzkiego czynnika VIII:C.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polinukleotyd kodujący sekwencje aminokwasową polipeptydu taką samą, jak sekwencja aminokwasowa aminokwasów 1-1102 ludzkiego czynnika VIII:C.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową polipeptydu taką samą, jak sekwencja aminokwasowa aminokwasów ^^1315 ludzkiego czynnika VIII:C.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową polipeptydu taką samą, jak sekwencja aminokwasowa aminokwasów ^^1405 ludzkiego czynnika VIII:C.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polipeptyd zawierający dodatkowo dragi region obejmujący N-końcową sekwencję domeny B ludzkiego czynnika VIII:C; odstępnik polipeptydowy o długości od około 3 do około 100 aminokwasów, który ma mniej niż 5 miejsc N-glikozylacji; i C-końcową sekwencję domeny B ludzkiego czynnika VIII:C.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd o sekwencji aminokwasowej N-końcowej sekwencji domeny B ludzkiego czynnika VIII:C, obejmującej sekwencję: Ser-Phe-Ser-Gln-Asn-Ser-Arg-His-Pro-Ser-Thr-Arg-Gln-Lys-Gln-Phe-Asn-AlaThr.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd, w którym odstępnik polipeptydowy obejmuje peptyd homologiczny do regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha ludzkiej Ig.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd, w którym sekwencja aminokwasowa odstępnika polipeptydowego obejmuje Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Thr.
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd, w którym C-końcowa sekwencja domeny B obejmuje Pro-Pro-Val-Leu-Lys-Arg-His-Gln-Arg.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polinukleotyd, obejmujący dodatkowo 5’-końcową sekwencję DNA niepodlegającą translacji, zwiększającą ekspresję pierwszego polipeptydu, która to 5’-końcowa sekwencja niepodlegająca translacji znajduje się przy końcu 5’-pierwszego regionu i która obejmuje sekwencję niepodlegającą

167 083 translacji wybraną z grupy obejmującej 5’-końcowy niepodlegający translacji DNA ludzkiego czynnika VIII:C; 5’-końcowy niepodlegający translacji DNA antygenu t SV40 i 5’-końcowy niepodlegający translacji DNA białka 1E1 ludzkiego cytomegalowirusa; lub pierwszy polinukleotyd, obejmujący dodatkowo3’-końcową sekwencję DNA niepodlegającą translacji wzmacniającą ekspresję pierwszego polipeptydu, która to 3’-końcowa sekwencja niepodlegająca translacji znajduje się przy końcu 3’-regionu kodującego polipeptyd i która obejmuje 3’-końcową sekwencję DNA niepodlegającą translacji, wybieraną z grupy obejmującej 3’-końcowy niepodlegający translacji DNA ludzkiego czynnika VIII:C; 3’-końcowy niepodlegający translacji DNA ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu i 3’-końcowy niepodlegający translacji DNA antygenu t SV40.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję sygnałową α 1 -antytrypsyny obejmującą N-Met-Pro-Ser-Ser-Val-Ser-Trp-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Ala-GlyLeu-Cys-Cys-Leu-Val-Pro-Val-Ser-Leu-Ala.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się drugi polinukleotyd obejmujący ponadto 5’-końcową sekwencję DNA niepodlegającą translacji, zwiększającą ekspresję drugiego polipeptydu, która to 5’-końcowa sekwencja niepodlegająca translacji znajduje się przy końcu 5’-drugiego regionu, i która obejmuje 5’-końcową sekwencję DNA niepodlegającą translacji wybraną z grupy obejmującej 5’-końcowy niepodlegający translacji DNA ludzkiego czynnika VIII:C; 5’-końcowy niepodlegający translacji DNA antygenu t SV40 i 5’-końcowy niepodlegający translacji DNA białka 1E1 ludzkiego cytomegalowirusa; lub polinukleotyd obejmujący ponadto 3’-końcową sekwencję DNA niepodlegającą translacji, wzmacniającą ekspresję drugiego polipeptydu, która to 3’-końcowa sekwencja niepodlegająca translacji znajduje się przy końcu 3’-regionu kodującego polipeptyd, i która obejmuje 3’-końcową sekwencję DNA niepodlegająca translacji, wybraną z grupy obejmującej 3’-końcowy niepodlegający translacji DNA ludzkiego czynnika VIII:C; 3’-końcowy niepodlegający translacji DNA ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu i 3’-końcowy niepodlegający translacji DNA antygenu t SV40.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako eukariotyczną stransformowaną komórkę gospodarza stosuje się komórkę ssaczą.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polinukleotyd i drugi polinukleotyd w oddzielnych plazmidach ekspresyjnych.
17. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polinukleotyd i drugi polinukleotyd w oddzielnych plazmidach ekspresyjnych.
18. Sposób według zastrz. 1 ,znamienny tym, że transformuje się eukariotyczną komórkę gospodarza kompozycją DNA powodującą ekspresję kompleksu rekombinowanego białka o aktywności ludzkiego czynnika VIII:C, przy czym ta kompozycja DNA zawiera pierwszą kasetę ekspresyjną obejmującą pierwszy polinukleotyd kodujący pierwszą sekwencję sygnałową zdolną do kierowania sekrecją pierwszego polipeptydu, obejmującego pierwszy region, o sekwencji aminokwasowej homologicznej do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C; i drugą kasetkę ekspresyjną obejmującą drugi polinukleotyd kodujący drugą sekwencję sygnałową zdolną do kierowania sekrecją i drugi polipeptyd o sekwencji aminokwasowej homologicznej do domeny C ludzkiego czynnika VIII:C, po czym powoduje się koekspresję rekombinantowego kompleksu białka, hodując transformowaną komórkę gospodarza na podłożu do wzrostu komórek i wydziela się z tego podłoża otrzymany kompleks rekombinowanego białka.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że stosuje się kompozycję DNA, w której pierwszy polinukleotyd obejmuje ponadto drugi region obejmujący N-końcową sekwencje domeny B ludzkiego czynnika VIII-C, odstępnik polipeptydowy o długości około 3 do 40 aminokwasów, który ma mniej niż 5 miejsc N-glikozylacji i C-końcową sekwencje sygnałową domeny B ludzkiego czynnika VIII:C.
20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że stosuje się kompozycję DNA, w której pierwsza kasetka polinukleotydowa koduje polipeptyd obejmujący co najmniej około 90% aminokwasów 1-740 sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VIII:C, a druga kasetka polinukleotydowa koduje polipeptyd obejmujący co najmniej około 90% aminokwasów 16492332 sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VIII:C.

167 083
21. Sposób wytwarzania kompleksu rekombinowanych białek o aktywności ludzkiego czynnika VIII:C zawierającego pierwszy polipeptyd homologiczny do domeny A ludzkiego czynnika VIII:C przyłączonego do drugiego polipeptydu wykazującego homologię do domeny C ludzkiego czynnika VIII:C poprzez odstępnik polipeptydowy inny niż pełnej długości domena B ludzkiego czynnika VIII:C, znamienny tym, że transformuje się komórki gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję polinukleotydu obejmującego pierwszą sekwencję kodującą pierwszy polipeptyd zawierający pierwszy homologiczny do domeny A region ludzkiego czynnika VIII:C; drugą sekwencję kodującą drugiego polipeptydu zawierający drugi homologiczny do domeny C region ludzkiego czynnika VIII:C oraz trzecią sekwencje kodującą odstępnik polipeptydowy inny niż pełnej długości domena B ludzkiego czynnika VIII: C, który łączy pierwszy region z drugim regionem, w którym jedna lub większa liczba pierwszej sekwencji oraz druga i trzecia sekwencja kodująca jest operacyjnie przyłączona do sekwencji kontrolnych zdolnych do ukierunkowania ekspresji tego kompleksu białek po czym tak wytworzony przez ekspresję kompleks rekombinowanych białek odzyskuje się z komórki gospodarza.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że stosuje się odstępnik polipeptydowy zawierający peptyd homologiczny do regionu zawiasowego ciężkiego łańcucha ludzkiej Ig.
23. Sposób według zastrz. 22. znamienny tym, że stosuje się odstępnik polipeptydowy sekwencji aminokwasowej obejmującej Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Thr.
24. Sposób według zastrz. 21, albo 22, albo 23, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polipeptyd zawierający co najmniej około 90% sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VIII:C o aminokwasach 1-740 i drugi polipeptyd obejmujący co najmniej około 90% sekwencji aminokwasowej ludzkiego czynnika VHI:C o aminokwasach 1649-2332.
25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że stosuje się pierwszy i drugi polipeptyd różniące się, od naturalnie występujących sekwencji odpowiednio domeny A i C czynnika VHI:C o nie więcej niż 5% liczby aminokwasów.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się drugi polipeptyd o sekwencji aminokwasowej takiej samej jak sekwencja aminokwasów 1649-2322 ludzkiego czynnika VIII:C.
27. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polipeptyd o sekwencji aminokwasowej takie samej jak sekwencja aminokwasów 1-740 ludzkiego czynnika VIII:C.
28. Sposób według zastrz. 21, albo 22, albo 23, albo 24, albo 25, albo 26, albo 27, znamienny tym, że jako transformowaną komórkę gospodarza stosuje się komórkę eukariotyczną.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę ssaczą.