JP2023537070A - 小胞を標的とするタンパク質及びその使用 - Google Patents

小胞を標的とするタンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

Figure 2023537070000001
本開示は、ペプチド配列が、遺伝子治療を介して産生されるタンパク質をエクソソームへと標的化する、遺伝的障害を処置するための新規方法を提供する。これらのタンパク質を負荷されたエクソソームは、非形質導入細胞に入り、病態を補正し得る。また、遺伝子治療組成物、タンパク質補充療法組成物、医薬組成物、処置の方法及び遺伝子治療組成物の使用及び組み換えタンパク質も開示される。本方法は、インビトロでの組み換えタンパク質収率を向上させるためにも使用され得る。
【選択図】図１

Description

本開示は一般に、遺伝子治療及び遺伝性障害を処置することに関する。
非機能的遺伝子の補充のために及び疾患を引き起こす突然変異の中和のために、遺伝子治療において核酸が日常的に使用され、これらは干渉（ＲＮＡｉ）エフェクター分子を含むＲＮＡ及びＤＮＡの形態であり得る。この有用性にもかかわらず、ネイキッドＤＮＡ及びＲＮＡは、迅速なクリアランス、ヌクレアーゼ、臓器特異的な分布の欠如及び細胞取り込み効率の低さゆえにインビボでの送達が困難であることが知られており、従って、通常は送達のために特定化された遺伝子送達ビヒクルが使用される。ウイルスベクター及び陽イオン性リポソームも送達ビヒクルとして開発されてきた。
これらの既存の技術にもかかわらず、レンチウイルスなどのウイルスのための殆どのウイルスベクターに対する免疫認識及び突然変異誘発組み込み；及びリポソームに対する炎症性の毒性及び迅速なクリアランスを含め、遺伝子治療を制限する顕著な制約が未だに存在する。自然免疫系による認識は急性の炎症反応につながり、このため、日和見感染の望ましくないリスクに患者をさらす可能性がある、現在のストラテジーの取り込み及び再投与問題を克服するための免疫抑制ストラテジーの使用が必要となり得る。送達ビヒクルに対して生成される抗体も、その後の投与において導入遺伝子発現を劇的に低下させる。
特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子治療のために導入遺伝子を送達するために使用されている一タイプである。ＡＡＶは、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス亜科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、ディペンドウイルス属（ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス種のヘルパー依存性ウイルスである。これは、複製のためにヘルパーウイルスを必要とするので、自然感染は、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスへの感染という状況で起こる。ＡＡＶベクターは、遺伝性疾患の処置のために主に使用される、拡張可能であり、効率的であり、非細胞傷害性である遺伝子送達ビヒクルである。いくつかのＡＡＶに基づく遺伝子導入製品が現在、多くの適応に対して臨床試験中であり、レーバー先天黒内障の処置のための新規遺伝子治療である、ボレチジーン・ネパルボベック（ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ）（Ｌｕｘｔｕｒｎａ）の米国ＦＤＡ承認を含め、いくつかのケースでは、臨床開発が後期及び認可に近づいている。様々な障害の処置のためのＡＡＶに基づく遺伝子治療アプローチの見込みにもかかわらず、アデノ随伴ウイルス又はＡＡＶベクターへの曝露後に免疫応答が起こり、これらの防御的反応によって、ＡＡＶベクターの治療効果が制限され得る。液性反応（抗ＡＡＶ中和抗体又はＮＡｂ）は、標的細胞のウイルス形質導入の顕著な低下を引き起こすウイルス中和を生じさせることが多く、それにより、送達される治療ポリペプチドの量が制限される。抗ＡＡＶ中和抗体は、ＡＡＶベクターを効果的に中和し得；これは、ヒト（Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００６；１２：３４２－３４７）、マウス（Ｓｃａｌｌａｎ Ｃ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７：１８１０－１８１７）及び非ヒト霊長類（Ｊｉａｎｇ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８：３３２１－３３２８）において報告されている。ヒトはまた、天然でも野生型ＡＡＶに曝露され、従って、全てのＡＡＶ血清型と交差反応する抗体を発現する。
抗体応答に加えて、ＡＡＶベクターに曝露される個体は、特異的にＡＡＶベクターカプシドに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を発現し得る（Ｌｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４７５，２１７－２２１（２０１１）；Ａｒｒｕｄａ Ｖ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１１５，４６７８－４６８８（２０１０）；Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５，１２１５－１２１８（２００９）；Ｂｏｕｔｉｎ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２１，７０４－７１２（２０１０）；Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９，３８１－３９０（２００９））。これらのＣＴＬ反応は、ＡＡＶベクターで形質導入された細胞のクリアランスに寄与し、その結果、治療効率が限定的となる。ＣＴＬ反応は、ベクター用量依存的に惹起され（Ｌｉ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４７５，２１７－２２１（２０１１）；Ｃｈｅｎ Ｙ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５，１２１５－１２１８（２００９）；Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９，３８１－３９０（２００９））、従って、より低いベクター用量で形質導入効率の高いレベルを達成することの重要性の根拠となる。
免疫応答関連問題を解決する現在の方法は、個体を予備スクリーニングし、ウイルスカプシドに対する中和抗体のタイターが高い者を除外することを伴う。投与のための必要なウイルス負荷量を低下させることによって、カプシドに対する免疫応答の可能性がより低くなる。
遺伝子治療と関連する別の難問は、標的組織の補正が不完全であることである。１００％のウイルス形質導入（少なくとも１つのベクターコピー／関心対象の疾患細胞）は、現在の方法では可能ではない。通常、非分泌タンパク質をコードする遺伝子を用いて形質導入する場合、疾患が改善されるのは、ＡＡＶで送達された遺伝子を受け取り、安定して発現させることが可能な少数の細胞においてのみである。これは、モザイクパターンの部分的補正にしか至らない。理想は、患部組織全体が導入遺伝子産物から利益を受けることが可能となることである。
現在、形質導入を最大化するための唯一の選択肢の１つは、ウイルスベクターが細胞に入る機会を最大化するためにウイルス投与量を増加させることである。これは、投与量が多いほど、重篤な有害事象を含む有害事象の例が多くなることにつながるため、問題である。
形質導入効率を改善するための別の選択肢は、より直接的な投与経路を選択することである。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の場合、遺伝子治療ベクターは、脳脊髄液（ＣＳＦ）に、又はくも膜下腔内（ＩＴ）、頭蓋内（ＩＣ）又は大槽内（ＩＣＭ）経路など、様々な経路で脳に直接注入される。これらの投与経路は、静脈内（ＩＶ）送達とは対照的である。静脈内送達は、ＣＳＦへの送達よりも日常的で安全であり、専門的な医療スタッフが実施する必要はない。しかし、ＡＡＶを含むウイルスベクターは、血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に通過せず、代わりに肝臓及び他の非ＣＮＳ組織に対してより容易に形質導入する。
遺伝子送達技術が向上してきた一方で、形質導入され得ないいくつかの細胞（例えば筋肉サテライト細胞／幹細胞）を含む問題が残っている（Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ ２０１４ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １：１４０３８）。さらに、有効な形質導入は、いくつかの状況、例えば筋肉変性及び線維症において疾患により負の影響を受け得る。しかし、肥満、心疾患及び精神病を含む遺伝学的成分を保持することが示される疾患数の増加とともに、予防的な遺伝学的解決策のための感受性遺伝子の修飾に対する驚異的な可能性があるが、リスクがさらに低下し、長期の持続性が達成される場合のみである。ゆえに、致死的疾患を凌駕して遺伝子治療の使用を拡大するために、良好な送達効率を保持しながら免疫認識及び炎症を回避することが可能である技術を開発することは不可避である。
本開示の一態様は、シグナルドメイン及びエフェクタードメイン（ＥＤ）の１つ以上を含む膜結合型ＥＤタンパク質に関する。いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、エフェクタードメインに直接連結される。いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、少なくとも第１のリンカーペプチドによりエフェクタードメインに連結される。いくつかの実施形態では、シグナルドメインはミリストイル化シグナルドメインである。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも７０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも９０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、ＥＤドメインアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも７０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、ＥＤドメインアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも９０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、ＥＤドメインアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
１つ以上の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ配列を有する。
１つ以上の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３に対する少なくとも９０％の配列類似性を含むアミノ配列を有する。
１つ以上の実施形態では、第１のリンカーペプチドは、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３を含むアミノ配列を有する。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも７０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも９０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
膜結合型ＥＤタンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２を含む。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質は、湾曲感知ドメインをさらに含む。１つ以上の実施形態では、湾曲感知ドメインは、膜結合型ＥＤタンパク質のＣ末端又はＮ末端にある。１つ以上の実施形態では、湾曲感知ドメインは、シグナルドメインとＥＤドメインとの間のリンカーペプチドである。
１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質のＮ末端にはメチオニンがない。
本開示の別の態様は、膜結合型ＥＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。
本開示の別の態様は、小胞を標的とするタンパク質と、関心対象のタンパク質と、を含む融合タンパク質に関する。１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、シグナルドメインとエフェクタードメイン（ＥＤ）とを含む。いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、脂質複合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、エフェクタードメイン（ＥＤ）に直接連結される脂質複合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、少なくとも第２のリンカーペプチドによりエフェクタードメイン（ＥＤ）に連結される脂質複合ドメインを含む。１つ以上の実施形態では、第２のリンカーペプチドは、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３を含むアミノ酸配列を有する。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも７０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも９０％の配列類似性を含む。１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２を含む。１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインは、脂質複合化ドメイン、例えばミリストイル化シグナルドメイン、ＥＳＣＲＴ結合モチーフ、ＭＩＴモチーフ、パルミトイル化シグナルドメイン、プレニル化シグナルドメイン、リソソームシグナルドメイン、グリコシルホスファチジルインシトン（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｓｉｔｏｎ）アンカータンパク質及び免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）分泌シグナルドメインの１つ以上を含む。１つ以上の実施形態では、脂質複合ドメインはミリストイル化シグナルドメインである。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインのアミノ酸配列は、タンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＳＮＸ１又はＢＡＳＰ１ファミリーの１つ以上のミリストイル化シグナルドメインに対する少なくとも７０％の類似性を有する。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインのアミノ酸配列は、タンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１又はＢＡＳＰ１ファミリーのミリストイル化シグナルドメインに対する少なくとも９０％の類似性を有する。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインのアミノ酸配列は、タンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１又はＢＡＳＰ１ファミリーのミリストイル化シグナルドメインに対する１００％の類似性を有する。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質のシグナルドメインのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも７０％の配列類似性を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のシグナルドメインのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも９０％の配列類似性を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のシグナルドメインのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のＥＤドメインのアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも７０％の配列類似性を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のＥＤドメインのアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも９０％の配列類似性を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質のＥＤドメインのアミノ酸配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、Ｎｅｆタンパク質又はそれらの変異体を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、関心対象のタンパク質は、治療用タンパク質である。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、リソソームタンパク質を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、ＣＤＫＬ５、アルファ－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、イズロニダーゼ、アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロノヒドロラーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガングリオシドシアリダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、ベータ－Ｄ－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、バッテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ及び他のバッテン関連タンパク質又は酵素的に活性であるそれらの断片を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質のバッテン関連タンパク質は、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質３、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質４、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質５、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質６、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質７、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質８、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１９、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１０、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１３及びセロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１４を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、１つ以上のホルモン及び／又は成長及び／又は分化因子を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質のホルモン及び／又は成長及び／又は分化因子は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）、形質転換増殖因子、ヘレグリン増殖因子、ニューレグリン増殖因子、ＡＲＩＡ増殖因子、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３、ニューロトロフィンＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン、コラプシン、ネトリン－１、ネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ又はチロシンヒドロキシラーゼの１つ以上を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質のホルモン及び／又は成長及び／又は分化因子の形質転換増殖因子は、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－２）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－３）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－４）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－５）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－７）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－８）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－９）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１０）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１２）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１３）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１４）又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１５）を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、１つ以上の免疫系調節タンパク質を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質の免疫系調節タンパク質は、サイトカイン及びリンホカインを含み、サイトカイン及びリンホカインは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１６（ＩＬ－１６）、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－１９（ＩＬ－１９）、インターロイキン－２０（ＩＬ－２０）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）、インターロイキン－２３（ＩＬ－２３）、インターロイキン－２４（ＩＬ－２４）、インターロイキン－２５（ＩＬ－２５）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子又はｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドを含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、１つ以上の免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ ＭＨＣ分子、クラスＩＩ ＭＨＣ分子、改変免疫グロブリン又は改変ＭＨＣ分子を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、１つ以上の補体調節タンパク質を含み、この補体調節タンパク質は、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２又はＣＤ５９を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質又は免疫系タンパク質に対する１つ以上の受容体を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体又はスカベンジャー受容体を含め、コレステロール調節及び／又は脂質調整のための１つ以上の受容体を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体又は他の核内受容体を含め、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーの１つ以上のメンバーを含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニン、ＥＴＳ－ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ－ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ－結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－ボックス結合タンパク質又はウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーを含む１つ以上の転写因子を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ－シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラート、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィン遺伝子産物の１つ以上を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、血友病Ｂ及び血友病Ａを含む血友病の処置のために使用される１つ以上のタンパク質を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、１つ以上の非天然ポリペプチド、例えば挿入、欠失又はアミノ酸置換を含有する非天然のアミノ酸配列を有するキメラ又はハイブリッドポリペプチドなどを含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、単鎖改変免疫グロブリン、アンチセンス分子及び触媒的核酸を含む非天然ポリペプチドを含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、細胞受容体及び「自己」に対する抗体を産生する細胞を含む自己免疫に関する標的に対してブロードベースの（ｂｒｏａｄ ｂａｓｅｄ）防御的免疫応答を付与することにより自己免疫疾患及び障害に罹患する個体を処置するために有用な１つ以上のタンパク質を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質の細胞受容体は、Ｔ細胞受容体を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む。
１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、エクソソーム又は細胞外小胞の１つ以上を標的とする。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、親和性タグ、リンカーペプチド、プロテアーゼ切断部位、分泌シグナルペプチド、細胞標的化ドメイン、レポーター、酵素又はそれらの組み合わせの１つ以上を含む。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上の湾曲感知ドメインを含む。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、第３のリンカーペプチドをさらに含み、この第３のリンカーペプチドは、小胞を標的とするタンパク質と関心対象のタンパク質又は融合タンパク質の末端との間に位置する。いくつかの実施形態では、第３のリンカーペプチドは、スペーサーペプチド、膜貫通ドメイン及び小胞外ドメインの１つ以上を含む。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質のＮ末端は、メチオニンを持たない。
本開示の別の態様は、本明細書中に記載のような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上の脂質と複合化される。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、ミリストイル化により複合化される。融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、パルミトイル化により複合化される。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、プレニル化により複合化される。融合タンパク質のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質により複合化される。
本開示の別の態様は、融合タンパク質を脂質小胞へと再構成することに関する。
本開示の別の態様は、融合タンパク質を発現させ、エクソソームを単離し、融合タンパク質を精製させることを含む、融合タンパク質を作製する方法に関する。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質を作製する方法は、脂質複合化をさらに含む。融合タンパク質を作製する方法のいくつかの実施形態では、ミリストイル化により脂質複合化を行う。融合タンパク質を作製する方法の１つ以上の実施形態では、パルミトイル化により脂質複合化を行う。融合タンパク質を作製する方法のいくつかの実施形態では、プレニル化により脂質複合化を行う。融合タンパク質を作製する方法の１つ以上の実施形態では、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質により脂質複合化を行う。
融合タンパク質を作製する方法の１つ以上の実施形態では、本方法は、融合タンパク質を脂質小胞へと再構成することをさらに含む。
融合タンパク質を作製する方法の１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、間葉系幹細胞、多発性骨髄腫細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＯＳ７細胞、ＨＡＰ１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、マウス初代筋芽細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞又はそれらの変異体において発現される。
本開示の別の態様は、融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体と、を含む製剤処方物に関する。
本開示の別の態様は、疾患又は障害の処置を必要とする患者に製剤処方物を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法に関する。疾患又は障害を処置する方法の１つ以上の実施形態では、製剤処方物は、くも膜下腔内、頭蓋内、大槽内（ｉｎｔｒａ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａｌｌｙ）、静脈内、大槽内、脳室内に又は実質内の１つ以上を介して投与される。
本開示の別の態様は、遺伝子治療送達系と、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、を含む遺伝子治療組成物に関する。この改変タンパク質は、小胞を標的とするタンパク質と、関心対象のタンパク質と、を含む。いくつかの実施形態では、この改変タンパク質は融合タンパク質である。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、遺伝子治療送達系は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－９）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＺＮＦ（ジンクフィンガータンパク質）の１つ以上を含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、遺伝子治療送達系は、ベクター、リポソーム、脂質－核酸ナノ粒子、エクソソーム及び遺伝子編集系の１つ以上を含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、遺伝子治療送達系はウイルスベクターを含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターの１つ以上を含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、ウイルスベクターは、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されるウイルスポリヌクレオチドを含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、ウイルスベクターは、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、ウイルスベクターは、ＳＶ４０イントロン、ポリアデニル化シグナル又は安定化エレメントの１つ以上を含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、遺伝子治療送達系はプロモーターを含む。
遺伝子治療組成物の１つ以上の実施形態では、遺伝子治療送達系は、リーダーシグナルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
本開示の別の態様は、薬学的に許容可能な担体と、遺伝子治療組成物と、を含む遺伝子治療組成物処方物に関する。
本開示の別の態様は、それを必要とする患者に遺伝子治療組成物処方物を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法に関する。
本開示の別の態様は、対象に遺伝子治療組成物処方物を予防的に投与することを含む、疾患又は障害を予防する方法に関する。
疾患又は障害を処置する方法の１つ以上の実施形態では、遺伝子治療組成物は、くも膜下腔内、静脈内、大槽内、脳室内又は実質内の１つ以上を介して投与される。
１つ以上の実施形態では、遺伝子治療組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、頬側投与を介した投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内及び関節内又はそれらの組み合わせで投与される。
ＭＡＲＣＫＳ短縮化及びＭｙｒＥＤの模式図。 短縮されたＭＡＲＣＫＳ変異体及びエクソソームに標的化されたＭｙｒＥｄ。ＣＯＳ－７細胞に対して、短縮されたＭＡＲＣＫＳ変異体又は蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙに融合されたＭｙｒＥＤのうち１つをコードするプラスミドを用いて遺伝子移入を行った。遺伝子移入された細胞に対してｍＣｈｅｒｒｙ（左）及びエクソソームタンパク質ＣＤ６３に対する抗ＣＤ６３抗体（右）を用いて免疫可視化した。 ＭＡＲＣＫＳ変異体又はＭｙｒＥＤを用いたクロスコレクション。Ｃｏｓ－７細胞に対して、ｍＭＡＲＣＫＳ－Ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＤ（ＥＤまでのｍＭＡＲＣＫＳ）、Ｍｙｒ－ｍＭＡＲＣＫＳ－ＥＤ又はＢｉＰａに融合されたｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードするプラスミドを用いて遺伝子移入を行った。遺伝子移入されたＣｏｓ－７細胞（白色）を非遺伝子移入細胞（黒色）と同時培養した。 ＤＩＶ１５初代皮質ニューロン細胞におけるクロスコレクション。Ｃｏｓ－７細胞に対して、ｍＭＡＲＣＫＳ－Ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＤ（ＥＤまでのｍＭＡＲＣＫＳ）、Ｍｙｒ－ｍＭＡＲＣＫＳ－ＥＤ又はＢｉＰａに融合されたｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードするプラスミドを用いて遺伝子移入を行った。遺伝子移入された細胞（白色）を非遺伝子移入ＤＩＶ１５初代皮質ニューロン細胞（黒色）と同時培養した。 ＭｙｒＥＤ変異体の配列アライメント。本開示のために開発された様々なＭｙｒＥＤ配列のアライメント。ミリストイル化シグナル領域、ＳＮＸ１及びＭＡＲＣＫＳ又はＭＬＰ ＥＤドメインに影を付す。 ４８時間におけるエクソソームを標的とするＭｙｒＥＤ変異体。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対して、ｍＣｈｅｒｒｙと融合された、ＭｙｒＧａｇＯｎｌｙ（ＭｙｒＧａｇのみ）、ＭｙｒＥＤ６、ＭｙｒＥＤ７、ＭｙｒＥＤ８、ＭｙｒＥＤ９又はΔ４５－ＭＡＲＣＫＳ－ＥＤをコードするポリヌクレオチドを用いて遺伝子移入を行った。図６Ａは、２４及び４８時間後の馴化培地中での相対蛍光を示す。図６Ｂは、精製エクソソームにおける相対蛍光を示す。図６Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙに対する一次抗体での精製エクソソームのウエスタンブロット分析を示す。 ９６時間におけるエクソソームを標的とするＭｙｒＥＤ変異体。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対して、ｍＣｈｅｒｒｙに融合された、ＭｙｒＥＤ６、ＭｙｒＥＤ７、ＭｙｒＥＤ８、ＭｙｒＥＤ１０、ＭｙｒＥＤ１１、ＭｙｒＥＤ１２、ＭｙｒＥＤ１３、ＭｙｒＥＤ１４、ＭｙｒＥＤ１５、ＭｙｒＥＤ１６、ＭｙｒＥＤ１７、ＭｙｒＥＤ１８、ＭｙｒＥＤ１９、ＭｙｒＥＤ２０、ＭｙｒＥＤ２１、ＭｙｒＥＤ２２、ＭｙｒＥＤ２３、ＭｙｒＥＤ２４、ＭｙｒＥＤ２５又はＭｙｒＥＤ２６をコードするポリヌクレオチドを用いて遺伝子移入を行った。図７Ａは、４８及び９６時間後の馴化培地における相対蛍光を示す。図７Ｂは、精製エクソソームにおける相対蛍光を示す。図７Ｃは、Ｃｏｓ－７細胞における、ＣＤ６３タンパク質との、ＭｙｒＥＤ１３又はＭｙｒＥＤ１７融合ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の共局在を示す。 ＧＡＡ及びＣＤＫＬ５へのＭｙｒＥＤの適用。ＭｙｒＥＤ１３－ＧＡＡ－ＨＰＣ４タンパク質をコードするコンストラクトを使用して、Ｃｏｓ７細胞に対して遺伝子移入を行った。図８Ａは、ＭｙｒＥＤ１３－ＧＡＡ－ＨＰＣ４タンパク質及びＣＤ６３タンパク質の共局在がＣｏｓ－７であることを示す。ＭｙｒＥＤ１３、ＭｙｒＥＤ１４及びＭｙｒＥＤ１７と融合されるＧＡＡタンパク質をコードするコンストラクトを使用して、細胞に対して遺伝子移入を行った。図８Ｂは、融合タンパク質、ＭｙｒＥＤ１３－ＧＡＡ、ＭｙｒＥＤ１４－ＧＡＡ及びＭｙｒＥＤ１７－ＧＡＡ、標的化エクソソームのウエスタンブロット分析を示す。同様に、ＭｙｒＥＤ１３、ＭｙｒＥＤ１４及びＭｙｒＥＤ１７に融合されたＣＤＫＬ５タンパク質をコードするコンストラクトを使用して、細胞に対して遺伝子移入を行った。図８Ｃは、エクソソームを標的とする、融合タンパク質、ＭｙｒＥＤ１３－ＣＤＫＬ５、ＭｙｒＥＤ１４－ＣＤＫＬ５及びＭｙｒＥＤ１７－ＣＤＫＬ５のウエスタンブロット分析を示す。 肝臓におけるｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰの存在のウエスタンブロット分析。ウエスタンブロット分析を使用して、肝臓におけるｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰ及びＧＡＰＤＨのレベルを分析した。 ＭｙｒＥＤ２７形質導入された胚性脳細胞の蛍光画像分析。ＭｙｒＥＤ２７で形質導入した胚からの脳切片に対して蛍光イメージングを行い、形質導入効率を決定した。ＧＦＰは、遺伝子移入された細胞でのみ発現される。同様に、クロスコレクションを受けた細胞はｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する。従って、図１０Ａは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１０Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１０Ｃは、そのマージ画像を示す。 ＭｙｒＥＤ７７を形質導入された胚性脳細胞の蛍光画像分析。ＭｙｒＥＤ７７を形質導入された胚からの脳切片に対して蛍光イメージングを行い、形質導入効率を決定した。ＧＦＰは、遺伝子移入された細胞でのみ発現される。同様に、クロスコレクションを受けた細胞はｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する。従って、図１１Ａは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１１Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１１Ｃは、そのマージ画像を示す。 ＭｙｒＥＤ８１を形質導入された胚性脳細胞の蛍光画像分析。ＭｙｒＥＤ８１で形質導入された胚からの脳切片に対して蛍光イメージングを行い、形質導入効率を決定した。ＧＦＰは遺伝子移入された細胞でのみ発現される。同様に、クロスコレクションを受けた細胞はｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する。従って、図１２Ａは、ＧＦＰを遺伝子移入細胞を示し、図１２Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１２Ｃは、そのマージ画像を示す。 ＭｙｒＥＤ８８を形質導入された胚性脳細胞の蛍光画像分析。ＭｙｒＥＤ８８で形質導入された胚からの脳切片に対して蛍光イメージングを行い、形質導入効率を決定した。ＧＦＰは遺伝子移入された細胞でのみ発現される。同様に、クロスコレクションを受けた細胞はｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する。従って、図１３Ａは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１３Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１３Ｃは、そのマージ画像を示す。 比較形質導入効率分析。融合タンパク質、ＭｙｒＥＤ２７、ＭｙｒＥＤ７７、ＭｙｒＥＤ８１及びＭｙｒＥＤ８８で形質導入された胚からの脳切片に対して蛍光イメージングを行い、陽性対照ＢｉＰ－ｍＣｈｅｒｒｙと比較して、相対的な形質導入効率を決定した。ＧＦＰは遺伝子移入された細胞でのみ発現される。同様に、クロスコレクションを受けた細胞はｍＣｈｅｒｒｙのみを発現する。従って、図１４Ａ、１４Ｄ、１４Ｇ、１４Ｊ及び１４Ｍは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞、図１４Ｂ、１４Ｅ、１４Ｈ、１４Ｋ及び１４Ｎは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１４Ｃ、１４Ｆ、１４Ｉ、１４Ｌ及び１４Ｏは、そのマージ画像を示す。 ＭｙｒＥＤ５３－６７でのＣＤＫＬ５標的化。図１５Ａは、ＭｙｒＥＤ２７及びＭｙｒＥＤ５４－６７に対する構成成分での比較を示す。図１５Ｂは、様々なエクソソームに標的化される変異体においてＣＤＫＬ５発現（約１１５ｋＤａ）を示すウエスタンブロットである。 ＭｙｒＥＤ５９－６５でのＴＰＰ１標的化。図１６は、様々なエクソソーム標的化変異体においてＴＰＰ１発現（約７５ｋＤａ）及びＣＤ８１発現（テトラスパニンマーカー）を示すウエスタンブロットである。 Ｃ末端エクソソーム標的化タグの試験。図１７Ａは、ＭｙｒＥＤ８１－９４に対する構成成分における比較を示す。図１７Ｂは、様々なエクソソーム標的化される変異体について体積に対して正規化されるＢｉＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＭｙｒＥＤエクソソームを示す。 Ｃ末端エクソソーム標的化タグの試験。図１８は、様々なＣ末端にタグ付加された、エクソソームに標的化される変異体における、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光スクリーニングを示す。 ＭｙｒＥＤでのＧＡＡ標的化。図１９は、Ｃ末端にタグ付加された、エクソソームに標的化される変異体における、ＧＡＡ（約１０５ｋＤａ）及びＣＤ９（約２０ｋＤａ）テトラスパニンマーカー発現を示すウエスタンブロットである。 ＭｙｒＥＤでのＮＡＧＬＵ標的化。図２０は、Ｃ末端にタグ付加された、エクソソームに標的化される変異体における、ＮＡＧＬＵ（約８５ｋＤａ）及びＣＤ９（約２０ｋＤａ）テトラスパニンマーカー発現を示すウエスタンブロットである。ＣＯＶ２ ＮＡＧＬＵ（Ｔ３４３Ｐ／Ａ１８１Ｌ）は、陰性対照とみなした。 ＭｙｒＥＤでのＴＴＰ１標的化。図２１は、Ｃ末端にタグ付加された、エクソソームに標的化される変異体における、ＴＰＰ１（ＨＰＣ４ Ａｂ－約６５ｋＤａ）及びＣＤ９（約２０ｋＤａ）テトラスパニンマーカー発現を示すウエスタンブロットである。ＢｉＰ１タグ付加ＴＰＰ１コンストラクトは、陰性対照とみなした。
本開示のいくつかの代表的な実施形態を記載する前に、本開示が、次の説明で示される構築又は工程段階の詳細に限定されないことを理解されたい。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方式で実施するか又は行うことが可能である。
本開示の様々な実施形態は、エクソソームなどの小胞を介して、細胞に治療用分子を送達することに関する。
本明細書中に記載のように、遺伝子送達のためにエクソソーム又は他の細胞外小胞が使用され得る。エクソソームは、形質膜との多胞体の融合後に細胞外環境に放出されるエンドサイトーシス性の起源の小さな膜結合小胞（３０～１００ｎｍ）である。患者は、酵素補充療法により送達されるタンパク質に対する免疫応答を生じさせ得ることが知られており、これは治療の効果に影響を与える可能性がある（Ｈａｒｍａｔｚ，Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ，２０１５）。身体にとって異質である高レベルの分泌タンパク質は血流に送達された場合、そのタンパク質に対する中和抗体が生じることが多い。これは、特に、生存率及び臨床転帰がより悪くなるような程度まで残留酵素発現がない患者（交差反応性免疫学的物質（ＣＲＩＭ）陰性患者）において当てはまる（Ｋｉｓｈｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．，２０１０）。おそらく、これは、遺伝子治療で送達されるタンパク質に適用される。エクソソームは、タンパク質ペイロードを運ぶ「トロイの木馬」として働く。タンパク質は、小胞内に隠されるので、免疫細胞及び抗体と相互作用不可能である。エクソソームは、身体において細胞によって既に天然に分泌されており、そのため、それらが免疫応答を誘導する可能性はあまりない。タンパク質をエクソソームに標的化することによって、タンパク質は、免疫応答を誘導する可能性がより低くなり、それにより、治療の効力が増強される。
エクソソーム生成は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含む多くの免疫細胞に対して記載されている。Ｂリンパ球及び成熟ＤＣ由来のエクソソームは、ＭＨＣ－ＩＩ、ＭＨＣ－Ｉ、ＣＤ８６及びＩＣＡＭ－１を発現し、実験モデル及び臨床試験において、特異的な抗腫瘍Ｔ細胞傷害性応答及び抗腫瘍免疫を誘導するために使用されてきた。エクソソームが介在する遺伝子送達の可能性は、マウスｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのヒト肥満細胞への送達とともに示されており、神経膠腫由来のエクソソームは、外因性ＤＮＡプラスミドにより産生されるｍＲＮＡを異種細胞に移行させることが明らかになっているが、外因性ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び他の修飾オリゴヌクレオチドの負荷及び送達は今のところ明らかになっていない。
さらに、インビトロで薬物製品をエクソソームへパッキングする現在のアプローチは、エクソソーム製造コストが高いこと及び薬物組み込みにおける効率が比較的低いことを含め、非常に問題が多い。エクソソームは、本質的に不均一であり、その内容に関する現在の知識は乏しく；従って、エクソソームがインビトロで不死化細胞から製造される場合、安定性の懸念が高くなる。個々の組織が、同じ組織に起源を持つエクソソームのみを内部移行させ得る証拠があり、従ってインビトロで製造されたエクソソームは、全ての組織／臓器を効率的に標的とし得ない。
様々な実施形態では、本明細書中で開示される方法及び／又は組成物は、エクソソームなどの小胞を介して治療用カーゴの送達を改善する。
定義
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語及びそれらの変形物は、本明細書中で使用される場合、さらなる作用又は構造の可能性を妨げないオープンエンドな移行句、用語又は単語であるものとする。単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、内容から別段明らかに示されない限り、複数の参照物を含む。本開示はまた、明確に示されても又は示されなくても、本明細書中で与えられる実施形態又は要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
「コード配列」又は「コードする核酸」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を指す。コード配列は、核酸が投与される個体又は哺乳動物の細胞での発現を指示可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに操作可能に連結される開始及び終結シグナルをさらに含み得る。
「相補的」又は「相補性」という用語は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体間のＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ（例えばＡ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）又はフーグスティーン塩基対形成を指す。
「～に直接連結される」という用語は、２つのペプチドがアミド結合を通じて連結され、２つのペプチド間のアミノ酸がない状態を指す。
「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞において存在する場合にコード配列が発現されるように標的タンパク質をコードするコード配列に操作可能に連結される必要な調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。
「断片」という用語は、哺乳動物において機能の実質的なレベルを維持するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその一部を指す。断片は、下で示されるタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列のうち少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。
「遺伝子コンストラクト」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を指示可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含め、調節エレメントに操作可能に連結される開始及び終結シグナルを含む。本明細書中で使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞において存在する場合、コード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に操作可能に連結される必要な調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。
「同一である」又は「同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の内容で本明細書中において使用される場合、配列が特定される領域にわたり同じである残基の特定されるパーセンテージを有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、特定される領域にわたり２つの配列を比較し、両配列において同一である残基が生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を得て、一致した位置の数を特定される領域の位置の総数により除して、その結果に１００を乗じて配列類似性のパーセンテージを得ることにより計算され得る。２つの配列が異なる長さであるか又はアライメントが１つ以上の突出末端を生じ、比較の特定される領域が単一の配列しか含まない場合、単一配列の残基は、分母において含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、同等であるとみなされ得る。同一性は、手作業で又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行われ得る。
「遺伝子治療送達系」という用語は、標的細胞において関心対象の遺伝子が発現されるか又は過剰発現されるように、標的細胞に関心対象の外因性遺伝子を送達するために使用され得る何らかの系を指す。１つ以上の実施形態では、標的細胞は、インビボ患者細胞である。１つ以上の実施形態では、標的細胞は、エクスビボ細胞であり、次に細胞が患者に投与される。
「宿主細胞」という用語は、細胞による物質の産生、例えば遺伝子の細胞による発現、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列、タンパク質又は酵素のために、何れかの方法で、選択され、修飾され、形質転換され、増殖させられ、又は使用され、又は操作される、何れかの臓器の何れかの細胞を意味する。
「ミニ遺伝子」という用語は、導入遺伝子、プロモーター／エンハンサー及び５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲの組み合わせを指し、本明細書中で言及を容易にするために「ミニ遺伝子」と呼ぶ。この開示の教示とともに提供される場合、このようなミニ遺伝子の設計は、従来の技術を用いることにより作成され得る。
「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一緒に共有結合される少なくとも２つのヌクレオチドを指す。単一鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。従って、核酸は、示される単一鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体は、ある種の核酸と同じ目的のために使用され得る。従って、核酸は、実質的に同一である核酸及びその相補体も包含する。単一鎖は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標的配列とハイブリッド形成し得るプローブを提供する。従って、核酸は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。
「操作可能に連結される」という用語は、それが空間的に連結されるプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に配置され得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子と、の間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知のように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なく適応させ得る。
「患者」という用語は、診断、処置又は治療が所望される何れかの哺乳動物対象、特にヒトを指す。処置の目的のための哺乳動物対象は、ヒト、家畜及び研究用動物、動物園の動物、スポーツ用の動物又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルなどを含め、哺乳動物として分類される何れかの動物を指す。哺乳動物対象は、障害がある、胎児、新生児、小児、若年者又は成体であり得る。１つ以上の実施形態では、哺乳動物対象はヒトである。
「ペプチド」、「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の連結される配列を指し、天然、合成若しくは修飾又は天然及び合成の組み合わせであり得る。
「薬学的に許容可能な」という用語は、生理学的に許容され、一般的にヒトに投与された時に有害な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦政府又は州政府の規制当局により承認されているか又は米国薬局方若しくは動物及びより具体的にはヒトにおける使用に対する他の一般的に認識される薬局方で挙げられていることを意味する。「担体」という用語は、化合物が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。このような医薬担体は、水及び油などの滅菌性の液体であり得る。水又は水溶液塩類溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液が、好ましくは、特に注射可能な溶液に対して担体として使用される。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」又は他の版において記載される。
「プロモーター」という用語は、酵素ＲＮＡポリメラーゼが結合し、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を開始させるＤＮＡ上の部位を指す。プロモーターは、細胞における核酸の発現を、付与する、活性化する又は増強することが可能である、合成又は天然由来の分子であり得る。プロモーターは、発現をさらに増強するため、及び／又はその空間的な発現及び／又は時間的な発現を変化させるために、１つ以上の特異的な転写調節配列を含み得る。プロモーターは、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも含み得、これは、転写の開始部位から数千塩基対もの距離に位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫及び動物を含む起源由来であり得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織又は臓器に関して、又は発現が起こる発生段階に関して、又は生理的ストレス、病原体、金属イオン若しくは誘導剤などの外部刺激に反応して、構成的又は分化的に遺伝子構成成分の発現を調節し得る。プロモーターの代表例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
「タンパク質補充療法」という用語は、このようなタンパク質において欠失がある個体への外因性の精製タンパク質の導入を指すものとする。投与されるタンパク質は、天然起源から又は組み換え発現により得られ得る。この用語は、そうでなければ、精製タンパク質の投与を必要とするか又はそこから恩恵を受ける個体における精製タンパク質の導入も指す。少なくとも１つの実施形態では、このような個体は、タンパク質欠失が起こっている。導入されたタンパク質は、インビトロで作製された精製組み換えタンパク質又は単離組織若しくは体液、例えば胎盤又は動物の乳汁から、又は植物から精製されたタンパク質であり得る。
「対象」という用語は、本明細書中に記載の組成物を投与可能である哺乳動物を指す。哺乳動物は、例えばヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス又はラットであり得る。１つ以上の実施形態では、対象はヒトである。
「実質的な相同性」又は「実質的な類似性」という用語は、核酸又はそれらの断片を指す場合、別の核酸（又はその相補鎖）とともに適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って最適にアラインされているとき、アラインされる配列の少なくとも約９５～９９％でヌクレオチド配列類似性がある。好ましくは、相同性は、全長配列にわたるか又はそのオープンリーディングフレーム又は少なくとも１５ヌクレオチド長の別の適切な断片にわたる。適切な断片の例は本明細書中に記載されている。
「配列類似性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」又は「パーセント同一である」という用語は、核酸配列に関して、最大の対応性になるようにアラインした場合に同じである２つの配列における残基を指す。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長又はそれらの断片にわたり、アミノ酸配列に対して容易に決定され得る。
「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型とは血清学的に区別されるカプシドを有するＡＡＶに関する特徴である。血清型の違いは、他のＡＡＶと比較した場合の、抗体とＡＡＶとの間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。
交差反応性は一般的には、中和抗体アッセイで測定される。このアッセイについて、ポリクローナル血清は、アデノ随伴ウイルスを使用してウサギ又は他の適切な動物モデルにおいて特異的なＡＡＶに対して作製される。このアッセイにおいて、次に、特異的なＡＡＶに対して作製される血清は、同じ（同種）又は異種ＡＡＶの何れかを中和するその能力において試験される。５０％中和に到達する希釈物は、中和抗体タイターとみなされる。２つのＡＡＶに対して同種タイターにより除される異種タイターの商が逆数で１６より低い場合、これらの２つのベクターは、同じ血清型とみなされる。逆に、同種タイターに対して異種タイターの比率が逆数で１６以上である場合、２つのＡＡＶは異なる血清型とみなされる。
本明細書中で定められる場合、血清型９を形成するために、選択されたＡＡＶカプシドに対して作製される抗体は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７又はＡＡＶ８の何れとも交差反応してはいけない。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ヒトＡＡＶ血清型９として本明細書中で同定される新規血清型のものである。
「治療用タンパク質」という用語は、遺伝性障害を有する患者において遺伝性障害に関連する不完全又は欠損タンパク質を置き換え可能であるタンパク質を指す。
治療用タンパク質は、本明細書中で使用される場合、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦαを含む形質転換増殖因子ａスーパーファミリーの何れか１つ、アクチビン、インヒビン又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１～１５の何れか、増殖因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの何れか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーの何れか１つ、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼを含むが限定されない、ホルモン及び／又は増殖及び／又は分化因子を含み得る。
治療用タンパク質は、本明細書中で使用される場合、サイトカイン及びリンホカイン、例えばトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ－１～ＩＬ－２５（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を含む）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドを含むが限定されない免疫系を調節するタンパク質も含み得る。治療用タンパク質は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子並びに改変免疫グロブリン及びＭＨＣ分子も含むが限定されない。さらに、治療用タンパク質は、本明細書中で使用される場合、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２及びＣＤ５９などの補体調節タンパク質を含む。
治療用タンパク質は、本明細書中で使用される場合、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、制御タンパク質及び免疫系タンパク質に対する受容体の何れか１つも含み得る。本開示は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体及びスカベンジャー受容体を含む、コレステロール調節及び／又は脂質調整のための受容体を包含する。本開示はまた、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体及び他の核内受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物も包含する。さらに、治療用タンパク質は、転写因子、例えばｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニン、ＥＴＳ－ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ－ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－ボックス結合タンパク質、例えば、ＧＡＴＡ－３及びウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーなどを含む。
治療用タンパク質は、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ－シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラート、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィン遺伝子産物も含み得る。治療用タンパク質は、酵素活性欠損の結果生じる様々な状態において有用である、酵素補充療法において有用であり得るなどの酵素も含み得る。非限定の代表的酵素は、ＣＤＫＬ５、アルファ－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、イズロニダーゼ、アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、グリコサミノグリカン アルファ－Ｌ－イズロノヒドロラーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガングリオシドシアリダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、ベータ－Ｄ－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、バッテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ及び他のバッテン関連タンパク質又は酵素的に活性であるそれらの断片を含む。１つ以上の実施形態では、バッテン関連タンパク質は、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質３、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質４、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質５、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質６、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質７、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質８、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１９、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１０、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１３及びセロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１４を含む。
治療用タンパク質は、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）及び血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子及びその変異体、例えばヘテロ二量体の軽鎖及び重鎖及びＢ－欠失ドメインを含む；米国特許第６，２００，５６０号明細書及び米国特許第６，２２１，３４９号明細書）を含む血友病の処置のために使用されるタンパク質も含み得る。
治療用タンパク質は、挿入、欠失又はアミノ酸置換を含有する非天然のアミノ酸配列を有する、キメラ又はハイブリッドポリペプチドなどの、非天然ポリペプチドも含み得る。例えば、単鎖改変免疫グロブリンは、ある特定の免疫不全患者において有用であり得る。他のタイプの非天然の遺伝子配列は、アンチセンス分子及び触媒的核酸、例えばリボザイムを含み、これは、標的の過剰発現を低下させるために使用され得る。
遺伝子発現の低下及び／又は調整は、癌及び乾癬のような、過剰増殖細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置のために特に所望される。治療用タンパク質は、標的抗原及び標的ポリペプチドなどの癌遺伝子産物も含み、標的ポリペプチドは、正常な細胞と比較した場合、過剰増殖性細胞において排他的に又はより高いレベルで産生されるタンパク質を含み、標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ及び転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦなどの癌遺伝子によりコードされるタンパク質を含む。標的抗原としての癌遺伝子産物、抗癌処置及び予防レジメンのための標的ポリペプチドに加えて、治療用タンパク質は、Ｂ細胞リンパ腫により作製される抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域も含み、これらは、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患に対する標的抗原としても使用される。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７－１Ａにより認識されるポリペプチド及び葉酸結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞においてより高いレベルで見出されるポリペプチドなど、標的ポリペプチドとして使用され得る。
他の適切な治療用タンパク質としては、細胞受容体及び「自己」に対する抗体を産生する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対するブロードベースの（ｂｒｏａｄ ｂａｓｅｄ）防御的免疫応答を付与することによって自己免疫疾患及び障害に罹患している個体を処置するために有用であり得るものが挙げられる。Ｔ細胞介在性自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患と関連する炎症カスケードを開始させるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、統計学的に有意に、又は臨床的に有意に、障害の少なくとも１つの態様又はマーカーを阻害する、減弱させる、軽減する、予防する又は変化させることを含む治療効果を得る目的のために、薬剤を投与するか又は手順を遂行することを指す。「処置する」という用語は、根底にある状態に対する治癒を述べるか又は意味するものではなく、むしろ、障害に対する素因を持ち得るがそれを有するものとしてまだ診断されていない患者において起こる障害又は障害の症状を予防すること（例えば、一次障害と関連し得るか又はそれにより引き起こされ得る障害を含み；（ｂ）障害を阻害すること、即ちその発生を抑止すること；（ｃ）障害を緩和すること、即ち障害の退縮を引き起こすこと；及び（ｄ）障害の少なくとも１つの症状を改善することを含む。処置することは、障害の処置又は寛解又は予防における成功の何れかの徴候を指し得、これには、寛解；軽快；症状の減弱又は障害状態を患者にとってより許容可能にすること；変性若しくは減退の速度を緩徐化すること；又は変性の最終点をより衰弱が進んでいない状態にすることなどの、何れかの客観的又は自覚的なパラメーターが含まれる。症状の処置又は寛解は、１つ以上の客観的又は自覚的パラメーターに基づき；これには、医師による検査の結果が含まれる。従って、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、障害と関連する症状又は状態の発症を、予防又は緩徐化するための、それを緩和するか又は抑止するか又は阻害するための、本開示の化合物又は薬剤の投与を含む。
「ベクター」という用語は、治療用遺伝子を細胞に送達する遺伝子治療送達ビヒクル又は担体を指す。ベクターは、遺伝子治療での使用に適切な何れかのベクター、例えば患者の標的細胞への（ポリペプチド又はそれらの変異体をコードする）核酸ポリマーの治療用送達に適切なあらゆるベクターである。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、融合タンパク質が発現され、それがその細胞から分泌される細胞に、融合タンパク質をコードする核酸を送達する。本ベクターは、あらゆるタイプであり得、例えばこれは、プラスミドベクター又はミニサークルＤＮＡであり得る。一般的には、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス又はアデノウイルスに由来し得る。ウイルスベクターは、発現を上昇させ、及び／又はベクターを安定化させるためのさらなるエレメント、例えば、プロモーター（例えば、ハイブリッドＣＢＡプロモーター（ＣＢｈ）及びヒトシナプシン１プロモーター（ｈＳｙｎ１））、ポリアデニル化シグナル（例えばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ））、安定化エレメント（例えばマーモット肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））及び／又はＳＶ４０イントロンなども含み得る。１つ以上の実施形態では、ベクターは、ゲノムにおいて所望の部位で相同組み換えを促進する領域が隣接するポリヌクレオチド配列を含み得、従って所望のタンパク質の発現をもたらす（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２－８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５－４３８；Ｚａｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，２４４，１１３号明細書；及びＰａｔｉ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，２００，８１２号明細書を参照。）。
ＡＡＶベクター
導入遺伝子を送達するためのＡＡＶベクター
様々な実施形態では、遺伝子治療組成物及び／又は方法は、ＡＡＶベクターを利用する。或いは、本明細書中で記載のような他のウイルスベクター又は遺伝子治療送達系が使用され得る。
多くの系統群のうち１つからのＡＡＶベクターは、形質導入のためにインビボで導入遺伝子を送達するために利用され得、その全体において本明細書中に組み込まれる米国特許第７，１９８，９５１号明細書、［Ｊａｍｅｓ Ｗｉｌｓｏｎ特許］において多くの例が詳細に提供される。これらのＡＡＶベクターのゲノム及び本明細書中に記載の製造工程及び当技術分野で公知のものを使用して、本明細書中で提供される導入遺伝子の１つ以上の送達のためのベクターとして組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が作製され得る。
Ｉ．系統群
系統群は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づき、（少なくとも１０００のレプリケートのうち）少なくとも７５％のブートストラップ値による近隣結合アルゴリズム及び０．０５を超えないポアソン補正距離測定を使用して判断した場合に互いに系統学的に関連するＡＡＶの群である。
近隣結合アルゴリズムは、文献において広範に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００））を参照。このアルゴリズムを実行するために使用され得るコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、改変されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実行する。これらの技術及びコンピュータプログラム及びＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが本明細書中で同定された系統群の１つに含有されるか、別の系統群に含有されるか又はこれらの系統群の外側にあるか否かを容易に判断し得る。
本明細書中で定められる系統群が主に天然のＡＡＶ ｖｐ１カプシドに基づく一方で、系統群は、天然のＡＡＶに限定されない。系統群は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアライメントに基づき、（少なくとも１０００個の複製物のうち）少なくとも７５％での近隣結合アルゴリズム及び０．０５を超えないポアソン補正距離測定を使用して判断した場合に系統学的に関連する、組み換え、修飾又は改変型の、キメラ、ハイブリッド、合成、人工的ＡＡＶなどを含むが限定されない、非天然のＡＡＶを包含し得る。
本明細書中に記載の系統群は、系統群Ａ（ＡＡＶ１及びＡＡＶ６により代表される）、系統群Ｂ（ＡＡＶ２により代表される）及び系統群Ｃ（ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッドにより代表される）、系統群Ｄ（ＡＡＶ７により代表される）、系統群Ｅ（ＡＡＶ８により代表される）及び系統群Ｆ（ヒトＡＡＶ９により代表される）を含む。
系統群Ｂ（ＡＡＶ２）及び系統群Ｃ（ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド）は、ヒトにおいて見出される最も多いものである（ＡＡＶ２の場合は１２名の個体からの２２の分離株及び系統群Ｃの場合の８名の個体からの１７の分離株）。
系統群Ａ（ＡＡＶ１及びＡＡＶ６により代表される）
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１及びＡＡＶ６を含む、系統群Ａのものを含み得る。例えば、国際公開第００／２８０６１号パンフレット、２０００年５月１８日；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７２（１）：３０９－３１９（１９９８年１月）を参照。さらに、この系統群は、米国特許第７，１９８，９５１号明細書に記載のＡＡＶを含有する。
系統群Ｂ（ＡＡＶ２系統群）
１つ以上の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２及び米国特許第７，１９８，９５１号明細書に記載のものを含む系統群Ｂのものを含む。一実施形態では、この系統群のメンバーの１つ以上は、ＡＡＶ２カプシドのｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３の全長にわたり少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性又は少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドを有する。
系統群Ｃ（ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド系統群）
１つ以上の実施形態では、ＡＡＶベクターは、系統群Ｃのものを含み、以前に公開されたＡＡＶ２及びＡＡＶ３のハイブリッドであるＡＡＶ及び米国特許第７，１９８，９５１号明細書に記載のものを含有することを特徴とする。一実施形態では、この系統群のメンバーの１つ以上は、ｈｕ．４及び／又はｈｕ．２カプシドのｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３の全長にわたり少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性又は少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドを有する。
系統群Ｄ（ＡＡＶ７系統群）
１つ以上の実施形態では、ＡＡＶベクターは、系統群Ｄのものを含み、これは、米国特許第７，１９８，９５１号明細書に記載のＡＡＶ７を含む。一実施形態では、この系統群のメンバーの１つ以上は、ＡＡＶ７カプシドのｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３の全長にわたり少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性又は少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドを有する。
系統群Ｅ（ＡＡＶ８系統群）
１つ以上の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８及び米国特許第書７，１９８，９５１号明細書に記載のものを含む、系統群Ｅのものを含む。一実施形態では、この系統群のメンバーの１つ以上は、ＡＡＶ８カプシドのｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３の全長にわたり少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性又は少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドを有する。１つ以上の実施形態では、ＡＡＶベクターは、米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２Ａ１号明細書（２００３年７月２４日）に記載のような系統群Ｅのものを含む。
系統群Ｆ（ＡＡＶ９系統群）
１つ以上の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９及び米国特許第７，１９８，９５１号明細書に記載のものを含む、系統群Ｆのものを含む。一実施形態では、この系統群のメンバーの１つ以上は、ＡＡＶ９カプシドのｖｐ１、ｖｐ２又はｖｐ３の全長にわたり少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性又は少なくとも９７％の同一性のアミノ酸同一性を有するカプシドを有する。
ＡＡＶ系統群は、ウイルスベクターの作製のための及び標的化分子の作製のための関連ＡＡＶの既製のコレクションの提供を含め、様々な目的のために有用である。これらの系統群はまた、当業者にとって容易に明らかになる様々な目的のためのツールとしても使用され得る。
導入遺伝子
導入遺伝子は、導入遺伝子に隣接するベクター配列にとって異種である核酸配列であり、この核酸配列は、関心対象の、ポリペプチド、タンパク質又は他の生成物をコードする。核酸コード配列は、宿主細胞での導入遺伝子転写、翻訳及び／又は発現を可能にするように、調節性の構成成分に操作可能に連結され得る。
導入遺伝子は、正常な遺伝子が正常なレベル未満で発現される欠失又は機能的な遺伝子産物が発現されない欠失を含み得る遺伝子欠失を補正又は改良するために使用され得る。或いは、導入遺伝子は、細胞タイプにおいて又は宿主においてネイティブに発現されない生成物を細胞に提供し得る。好ましいタイプの導入遺伝子配列は、宿主細胞において発現される治療用タンパク質又はポリペプチドをコードする。１つ以上の実施形態では、複数の導入遺伝子が使用される。ある種の状況において、タンパク質の各サブユニットをコードするか又は異なるペプチド若しくはタンパク質をコードするために、異なる導入遺伝子が使用され得る。これは、例えば免疫グロブリン、血小板由来増殖因子又はジストロフィンタンパク質に対してなど、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大きい場合に望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を産生するために、異なるサブユニットのそれぞれを含有する組み換えウイルスを細胞に感染させる。或いは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によりコードされ得る。この場合、単一の導入遺伝子はサブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡを含み、各サブユニットに対するＤＮＡは、内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードするＤＮＡのサイズ、例えばサブユニットをコードするＤＮＡの全体のサイズ、が小さく、ＩＲＥＳが５キロベース未満である場合に望ましい。ＩＲＥＳに対する代替物として、ＤＮＡは、２Ａペプチドをコードする配列により分離され得、これは、翻訳後事象において自己切断する。例えば、Ｍ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ １）：１３－２１（Ｊａｎｕａｒｙ １９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４－８７３（Ｊｕｎｅ ２００１）；Ｋｌｕｍｐ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１－８１７（Ｍａｙ ２００１）を参照。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも顕著に小さく、それにより、スペースが限定要素である場合、使用に非常に適するようになる。より頻繁に、導入遺伝子が大きい場合、複数のサブユニットからなるか、又は２つの導入遺伝子が同時送達される。いくつかの実施形態では、所望の導入遺伝子又はサブユニットを保有するｒＡＡＶは、単一のベクターゲノムを形成するためにインビボでそれらがコンカタマー化することを可能にするために同時投与され得る。このような実施形態では、第１のＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得、第２のＡＡＶは、宿主細胞での同時発現のために異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得る。しかし、選択される導入遺伝子は、何らかの生物学的に活性のある産物又は他の生成物、例えば試験のために所望される生成物をコードし得る。
治療用導入遺伝子
導入遺伝子によりコードされる有用な治療用生成物は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦαを含む形質転換増殖因子ａスーパーファミリーのうち何れか１つ、アクチビン、インヒビン又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１～１５のうち何れか、増殖因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのうち何れか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうち何れか１つ、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼを含むが限定されない、ホルモン及び／又は成長及び／又は分化因子を含む。
他の有用な導入遺伝子産物としては、サイトカイン及びリンホカイン、例えばトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ－１～ＩＬ－２５（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を含む）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドを含むが限定されない、免疫系を調節するタンパク質が挙げられる。免疫系により産生される遺伝子産物も本発明で有用である。これらは、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子並びに改変免疫グロブリン及びＭＨＣ分子を含むが限定されない。有用な遺伝子産物としては、補体調節タンパク質、例えば補体調節タンパク質、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２及びＣＤ５９など、も挙げられる。
さらに他の有用な遺伝子産物としては、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質及び免疫系タンパク質に対する受容体のうち何れか１つが挙げられる。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体及びスカベンジャー受容体を含む、コレステロール調節及び／又は脂質調整のための受容体を包含する。本発明はまた、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー、ビタミンＤ受容体及び他の核内受容体のメンバーなどの遺伝子産物も包含する。さらに、有用な遺伝子産物としては、転写因子、例えばｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニン、ＥＴＳ－ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ－ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ－結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－ボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ－３及びウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーなどが挙げられる。
他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ－シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラート、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィン遺伝子産物が挙げられる。さらに他の有用な遺伝子産物としては、酵素の不十分な活性の結果生じる様々な状態において有用である酵素補充療法において有用であり得るものなどの酵素が挙げられる。例えば、マンノース－６－リン酸を含有する酵素は、リソソーム貯蔵疾患に対する治療において利用され得る（例えば、適切な遺伝子はβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものを含む）。
さらに他の有用な遺伝子産物としては、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）及び血友病Ａを含む血友病の処置のために使用されるものが挙げられる（第ＶＩＩＩ因子及びその変異体、例えばヘテロ二量体の軽鎖及び重鎖及びＢ－欠失ドメインなどを含む；米国特許第６，２００，５６０号明細書及び米国特許第６，２２１，３４９号明細書）。第ＶＩＩＩ因子遺伝子は２３５１個のアミノ酸をコードし、このタンパク質は、Ａ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２としてアミノから末端カルボキシ末端で指定される６個のドメインを有する［Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０（１９８４）；Ｖｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３７（１９８４）；及びＴｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：３３７（１９８４）］。ヒト第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１、Ａ２及びＢドメインを含有する重鎖及びＡ３、Ｃ１及びＣ２ドメインを含有する軽鎖を主に含むヘテロ二量体を生じさせるために、細胞内で処理される。単鎖ポリペプチド及びヘテロ二量体の両方が、Ａ２ドメインとＢドメインとの間でトロンビン切断により活性化されるまで、不活性前駆体として血漿中で循環し、これはＢドメインを放出し、その結果、Ａ１及びＡ２ドメインからなる重鎖が得られる。Ｂドメインは、タンパク質の活性化された凝血原の形態で欠失させられる。さらに、ネイティブタンパク質において、Ｂドメインに隣接する２本のポリペプチド鎖（「ａ」及び「ｂ」）は、二価カルシウム陽イオンに結合される。
いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子は、１０個のアミノ酸シグナル配列並びにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列をコードする第ＶＩＩＩ因子重鎖の最初の５７塩基対を含む。代替的な実施形態では、ミニ遺伝子は、Ａ１及びＡ２ドメイン、並びにＢドメインのＮ末端からの５個のアミノ酸及び／又はＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸並びにＡ３、Ｃｌ及びＣ２ドメインをさらに含む。また他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、Ｂドメインの１４個のアミノ酸をコードする４２個の核酸により分離される単一ミニ遺伝子において提供される［米国特許第６，２００，５６０号明細書］。
本明細書中で使用される場合、ＡＡＶベクターの治療的有効量は、対象の血液が凝固するためにかかる時間を短縮するために十分な量の第ＶＩＩＩ因子を産生するＡＡＶベクターの量である。一般に、第ＶＩＩＩ因子が正常レベルの１％未満である重篤な血友病の全血凝固時間は、非血友病の場合およそ１０分間であるのに対して、６０分を超える。
本発明は、何れかの特異的な第ＶＩＩＩ因子配列に限定されない。第ＶＩＩＩ因子の多くの天然及び組み換え形態が単離され、生成されている。第ＶＩＩ因子の天然の及び組み換え形態の例は、米国特許第５，５６３，０４５号明細書、同第５，４５１，５２１号明細書、同第５，４２２，２６０号明細書、同第５，００４，８０３号明細書、同第４，７５７，００６号明細書、同第５，６６１，００８号明細書、同第５，７８９，２０３号明細書、同第５，６８１，７４６号明細書、同第５，５９５，８８６号明細書、同第５，０４５，４５５号明細書、同第５，６６８，１０８号明細書、同第５，６３３，１５０号明細書、同第５，６９３，４９９号明細書、同第５，５８７，３１０号明細書、同第５，１７１，８４４号明細書、同第５，１４９，６３７号明細書、同第５，１１２，９５０号明細書、同第４，８８６，８７６号明細書；国際公開第９４／１１５０３号パンフレット、同第８７／０７１４４号パンフレット、同第９２／１６５５７号パンフレット、同第９１／０９１２２号パンフレット、同第９７／０３１９５号パンフレット、同第９６／２１０３５号パンフレット及び同第９１／０７４９０号パンフレット；欧州特許出願第ＥＰ０６７２１３８号明細書、同第０２７０６１８、同第０１８２４４８、同第０１６２０６７号明細書、同第０７８６４７４号明細書、同第０５３３８６２号明細書、同第０５０６７５７号明細書、同第０８７４０５７号明細書、同第０７９５０２１号明細書、同第０６７０３３２号明細書、同第０５００７３４号明細書、同第０２３２１１２号明細書及び同第０１６０４５７号明細書；Ｓａｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＸＸｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄ．Ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ（１９９２）及びＬｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１９（１９９５）を含む、特許及び科学文献で見出され得る。
上記第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列は、組み換え法を使用して、又はそれを含むことが知られるベクターからの配列を導き出すことによって、得ることができる。さらに、所望の配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのフェノール抽出及びＰＣＲなどの標準的技術を使用して、細胞及びそれを含有する組織から直接単離され得る［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照］。ヌクレオチド配列は、クローニングではなく合成によっても作製され得る。標準的方法により調製され、完全なコード配列に組み立てられた重複オリゴヌクレオチドから、完全な配列を組み立て得る［例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５７（１９８１）；Ｎａｍｂａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；及びＪａｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）を参照］。
さらに、本発明はヒト第ＶＩＩＩ因子に限定されない。実際に、本発明は、コンパニオン動物（例えばイヌ、ネコ及びウマ）、家畜（例えばウシ、ヤギ及びヒツジ）、実験用動物、海洋哺乳動物、大型ネコ科動物などを含むが限定されない、ヒト以外の動物由来の第ＶＩＩＩ因子を包含するものとする。
ＡＡＶベクターは、それ自身生物学的に活性がなく、さらに対象に投与されたときに血液凝固時間を改善するか又は回復させる、第ＶＩＩＩ因子の断片をコードする核酸を含有し得る。例えば、上で論じているように、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、２本のポリペプチド鎖：処理中に切断されるＢ－ドメインにより分離される重鎖及び軽鎖を含む。本発明により明らかになるように、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び軽鎖での同時遺伝子導入レシピエント細胞は、生物学的に活性のある第ＶＩＩＩ因子の発現につながる。殆どの血友病が鎖のうち一方（例えば重鎖又は軽鎖）のみで突然変異又は欠失を含有するので、患者において欠損がある鎖のみを投与して、他の鎖を供給することが可能であり得る。
他の有用な遺伝子産物は、非天然ポリペプチド、例えば、挿入、欠失又はアミノ酸置換を含有する非天然のアミノ酸配列を有するキメラ又はハイブリッドポリペプチドを含む。例えば、単鎖改変免疫グロブリンは、ある種の免疫無防備状態の患者において有用であり得る。他のタイプの非天然の遺伝子配列は、標的の過剰発現を低下させるために使用され得るアンチセンス分子及び触媒的核酸、例えばリボザイムを含む。
遺伝子の発現の低下及び／又は調整は、癌及び乾癬のような過剰増殖する細胞を特徴とする過剰増殖状態の処置のために特に所望される。標的ポリペプチドは、正常な細胞と比較した場合、過剰増殖性細胞において排他的に又はより高レベルで産生されるポリペプチドを含む。標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ及び転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦなどの癌遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌処置及び予防的レジメンのための標的ポリペプチドは、Ｂ細胞リンパ腫により生成される抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を含み、いくつかの実施形態では、自己免疫疾患に対する標的抗原としても使用される。モノクローナル抗体１７－１Ａ及び葉酸結合ポリペプチドにより認識されるポリペプチドを含む、腫瘍細胞においてより高いレベルで見出されるポリペプチドなどの標的ポリペプチドとして他の腫瘍関連ポリペプチドを使用し得る。
他の適切な治療用ポリペプチド及びタンパク質は、細胞受容体及び「自己」に対する抗体を産生する細胞を含む自己免疫と関連する標的に対するブロードベースの（ｂｒｏａｄ ｂａｓｅｄ）防御的免疫応答を付与することによって自己免疫疾患及び障害に罹患している個体を処置するために有用であり得るものを含む。Ｔ細胞介在性自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患のそれぞれは、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始させるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を特徴とする。
エクソソーム及び小胞を標的とするタンパク質
小胞は、エクソソーム及び細胞外小胞を含む。エクソソームは、３０～１３０ｎｍの小型の膜結合小胞であり、細胞内の多胞体（ＭＶＢ）に、又は直接形質膜から細胞外のスペースに、の何れかで、細胞質から出芽する。ＭＶＢは、エンドサイトーシス経路の一部であり、形質膜と融合した後、エクソソームのそれらのカーゴを細胞外スペースに放出し得る。
多くのタンパク質がエクソソームと会合することが知られており；エクソソームが形成される場合にエクソソームに組み込まれる。本発明による使用のための好ましいタンパク質は、膜貫通タンパク質又は膜関連タンパク質であるものである。例としては、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ－１、インテグリンアルファ４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１アルファ及びベータ、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢ、ＣＤ３イプシロン及びゼータ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ構成成分、ＴＣＲベータ及びテトラスパニンが挙げられるが限定されない。本発明の特に好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３から選択される。
Ｎｅｆタンパク質及び変異体
Ｎｅｆは、ＨＩＶ及びＳＩＶなど、霊長類レンチウイルスにより発現されるタンパク質である。Ｎｅｆは、エクソソームと関連して分泌されることが知られており、ＨＩＶ感染細胞の表面上に存在することも示されている。
Ｎｅｆタンパク質は、導入遺伝子に融合され得る。いくつかの実施形態では、Ｎｅｆタンパク質はその断片であり、アミノ酸１～７０、１～７５、１～８０、１～８５、１～９０、１～９５、１～１００、１～１０５、１～１１０、１～１１５、１～１２０、１～１２５、１～１３０、１～１３５、１～１４０、１～１４５、１～１５０、１～１５５、１～１６０、１～１６５、１～１７０、１～１７５、１～１８０、１～１８５、１～１９０、１～１９５、１～２００又は１～２０５の断片であり得る。好ましくは、断片は１～７０ａａである。Ｎｅｆタンパク質は、Ｇ３Ｃ、Ｖ１５３Ｌ、Ｅ１７７Ｇ又はそれらの組み合わせを含む突然変異型であり得、好ましくは全ての３つの点突然変異を含み、これはＮｅｆｍｕｔと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｎｅｆタンパク質又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。
膜結合型ＥＤタンパク質及び変異体
本開示の一態様は、膜結合型ＥＤタンパク質及びその変異体を記載する。いくつかの実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質は、シグナルドメイン、湾曲感知ドメイン及びエフェクタードメイン（ＥＤドメイン）の１つ以上を含む。
タンパク質のＭＡＲＣＫＳ（ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質）ファミリーは、エクソソームと会合することが知られている。従って、いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、シグナルドメイン、湾曲感知ドメイン及びエフェクタードメイン（ＥＤドメイン）の１つ以上を含み、シグナルドメインは、ミリストイル化シグナルドメインを含む。
タンパク質のＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１又はＭＡＲＣＫＳＬ１（ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質）ファミリーは、マクロファージと会合することが知られている。ＭＡＲＣＫＳタンパク質と同様に、いくつかの実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１もまた、シグナルドメイン、湾曲感知ドメイン及びエフェクタードメイン（ＥＤドメイン）の１つ以上を含み、シグナルドメインは、ミリストイル化シグナルドメインを含む。
タンパク質のＢＡＳＰ１ファミリーもエクソソームと会合することが知られている。ＢＡＳＰ１タンパク質は、神経組織で主に見出される。ＭＡＲＣＫＳタンパク質と同様に、いくつかの実施形態では、ＢＡＳＰ１タンパク質もまた、シグナルドメイン、湾曲感知ドメイン及びエフェクタードメイン（ＥＤドメイン）の１つ以上を含み、シグナルドメインは、ミリストイル化シグナルドメインを含む。
１つ以上の実施形態は、膜結合型ＥＤタンパク質を含み、膜結合型ＥＤタンパク質は、シグナルドメイン及びＥＤドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、膜結合型ＥＤタンパク質のＮ末端上にある。いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、ＥＤドメインに直接連結される。いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、第１のリンカーペプチドによりＥＤドメインに連結される。第１のリンカーペプチドは、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３に従うアミノ配列を有する。
本開示は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１及びＢＡＳＰ１タンパク質の変異体を提供する。従って、１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質は、ＭｙｒＥＤタンパク質を含み、ＭｙｒＥＤタンパク質は、ミリストイル化シグナルドメイン及びＥＤドメインを含む。
いくつかの実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質は、ＢｉＰＥＤタンパク質を含み、ＢｉＰＥＤタンパク質は、ＢｉＰ分泌シグナルドメイン及びＥＤドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＢｉＰ分泌シグナルドメインは、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のアミノ酸配列類似性を含む。
シグナルドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５のアミノ酸配列の何れか１つに対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を含み得る。本開示は、得られるポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。或いは、シグナルドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５のアミノ酸配列の何れか１つを含み得る。本開示は、得られるポリペプチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５の何れか１つであるようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、ミリストイル化シグナルドメインを含む。
いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、ネイティブにグリコシル化されたタンパク質リーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、ネイティブにグリコシル化されたタンパク質リーダー配列は、ネプリライシン、バスーン（ｂａｓｓｏｏｎ）、ヒトＢ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ、アヒルＢ型肝炎ウイルスｐｒｅＳ、ラッサエンベロープ、マチュポエンベロープ又はそれらの組み合わせ由来である。
ファルネシル化は、ミリストイル化と同様の膜結合強度があるＣ末端脂質付加の一タイプである。Ｍａｒｃｋｓ ＥＤドメイン機能を連想させるファルネシル化システイン付近にリジンリッチ領域があるＫＲＡＳ４ｂの一次配列は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質と同様に機能する。ＫＲＡＳ４ｂは、膜への結合からそれを隔絶するカルシウム依存的な方式でカルモジュリンと相互作用する。従って、いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、ＫＲＡＳ４ｂ又はその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ４ｂ又はその変異体は、ＫＲＡＳ４ｂに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性の配列を含む。１つ以上の実施形態では、ＫＲＡＳ４ｂ配列はＣＶＩＭ（配列番号１６５）を含む。ＫＲＡＳ４ｂ及びＭａｒｃｋｓからの最小化ＥＤドメインを統合する一連の配列（ＭＹＲＥＤ８８－９３）を作製し、試験した（配列番号１１８～１２３及び１４０～１４２）。
グリピエーション（Ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）は、タンパク質に対する強い膜アンカー、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）の付加である。従って、いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、ＧＰＩを繋留するシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＰＩを繋留するシグナルペプチドは、ＣＯＢＬ９＿ＡＲＡＴＨからのＧＰＩ繋留シグナルを含む。ＣＯＢＬ９＿ＡＲＡＴＨは、アラドプシス・タリアナ（Ａｒａｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＣＯＢＲＡ様タンパク質９であり、ミクロフィブリルの配向及びセルロース結晶化度に寄与することが示されている。
ＥＤドメインは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を含み得る。本開示は、得られたポリペプチドが配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
或いは、ＥＤドメインは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０のアミノ酸配列のうち何れか１つを含む。本開示は、得られたポリペプチド配列が配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のうち何れか１つとなるようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
膜結合型ＥＤタンパク質、アミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を含む。或いは、本開示は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２を含む膜結合型ＥＤアミノ酸配列を提供する。１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３８ではない。
本開示は、得られたポリペプチドが配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。或いは、本開示は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。１つ以上の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３８の膜結合型ＥＤをコードしない。
融合タンパク質
本開示の一態様は、小胞を標的とするタンパク質と、関心対象のタンパク質と、を含む融合タンパク質を含む。１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、エクソソーム及び細胞外小胞の１つ以上を標的とする。
様々な実施形態では、融合タンパク質の小胞を標的とするタンパク質は、脂質複合ドメインと、エフェクタードメイン（ＥＤ）と、を含む。いくつかの実施形態では、脂質複合ドメインは、エフェクタードメイン（ＥＤ）に直接連結される。いくつかの実施形態では、脂質複合ドメインは、第２のリンカーペプチドによりエフェクタードメイン（ＥＤ）に連結される。１つ以上の実施形態では、第２のリンカーペプチは、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３を含むアミノ酸配列を有する。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、膜結合型ＥＤタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質は、シグナルドメインと、ＥＤドメインと、を含む。１つ以上の実施形態では、関心対象のタンパク質は、膜結合型ＥＤタンパク質のＣ末端又はＮ末端に存在する。１つ以上の実施形態では、関心対象のタンパク質は、シグナルドメインのＣ末端にある。１つ以上の実施形態では、関心対象のタンパク質は、ＥＤドメインのＣ末端又はＮ末端に存在する。いくつかの実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質は、ＭｙｒＥＤタンパク質を含む。１つ以上の実施形態では、ＭｙｒＥＤタンパク質は、ミリストイル化シグナルドメインと、ＥＤドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質は、ＢｉＰＥＤタンパク質を含む。１つ以上の実施形態では、ＢｉＰＥＤタンパク質は、ＢｉＰ分泌シグナルドメインと、ＥＤドメインと、を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインは、脂質複合ドメイン、例えばミリストイル化シグナルドメイン、パルミトイル化シグナルドメイン、プレニル化シグナルドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質及びＢｉＰ分泌シグナルドメインの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、脂質複合ドメインは、ミリストイル化シグナルドメインである。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインは、タンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１又はＢＡＳＰ１ファミリーのミリストイル化シグナルドメインに対する少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の配列類似性を有する。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインをコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチドがタンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１又はＢＡＳＰ１ファミリーのミリストイル化シグナルドメインに対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、ＫＲＡＳ４ｂに対する、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の配列類似性を有する。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインをコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチドがＫＲＡＳ４ｂに対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含む。１つ以上の実施形態では、シグナルドメインは、配列ＣＶＩＭ（配列番号１６５）を含む。
いくつかの実施形態では、シグナルドメインは、ＧＰＩ繋留シグナルペプチドに対する少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の配列類似性を有する。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインをコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチドがＧＰＩ繋留シグナルペプチドに対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の配列類似性を有するような、ヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質のより多くの実施形態のうち１つでは（Ｉｎ ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、シグナルドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５のアミノ酸配列の何れか１つに対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を含む。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインをコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質のより多くの実施形態のうち１つでは（Ｉｎ ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、シグナルドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５のアミノ酸配列の何れか１つを含む。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、シグナルドメインをコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５の何れか１つであるようなヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質のより多くの実施形態のうち１つでは（Ｉｎ ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＤドメインは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を含む。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、ＥＤドメインをコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチドが配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質のより多くの実施形態のうち１つでは（Ｉｎ ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＤドメインは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０のアミノ酸配列のうち何れか１つを含む。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、ＥＤドメインをコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチド配列が配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０の何れか１つであるようなヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質アミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を含む。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチドが配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列類似性を有するようなヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質アミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２を含む。融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、膜結合型ＥＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、得られたポリペプチドが配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２の何れか１つであるようなヌクレオチド配列を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、小胞を標的とするタンパク質は、Ｎｅｆタンパク質を含み、小胞はエクソソーム又は細胞外小胞である。１つ以上の実施形態では、関心対象のタンパク質は、Ｎｅｆタンパク質のＣ末端又はＮ末端に存在する。Ｎｅｆタンパク質は、導入遺伝子に融合され得る。１つ以上の実施形態では、Ｎｅｆタンパク質はその断片であり、これは、アミノ酸１～７０、１～７５、１～８０、１～８５、１～９０、１～９５、１～１００、１～１０５、１～１１０、１～１１５、１～１２０、１～１２５、１～１３０、１～１３５、１～１４０、１～１４５、１～１５０、１～１５５、１～１６０、１～１６５、１～１７０、１～１７５、１～１８０、１～１８５、１～１９０、１～１９５、１～２００又は１～２０５の断片であり得る。好ましくは、断片は１～７０ａａである。Ｎｅｆタンパク質は、Ｇ３Ｃ、Ｖ１５３Ｌ、Ｅ１７７Ｇ又はそれらの組み合わせを含む突然変異バージョンであり得、好ましくはＮｅｆｍｕｔと呼ばれる全ての３点突然変異を含む。
融合タンパク質の１つ以上の実施形態では、関心対象のタンパク質は、治療用タンパク質を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、ホルモン及び増殖及び分化因子、例えばインスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦαを含む形質転換増殖因子ａスーパーファミリーのうち何れか１つ、アクチビン、インヒビン又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ１～１５のうち何れか、増殖因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのうち何れか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン ＮＴ－３及びＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうち何れか１つ、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ及びチロシンヒドロキシラーゼなどを含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、免疫系調節タンパク質を含み、この調節タンパク質は、サイトカイン及びリンホカイン、例えばトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ－１～ＩＬ－２５（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８を含む）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドなどを含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩＭＨＣ分子、並びに改変免疫グロブリン及びＭＨＣ分子を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、補体調節タンパク質を含み、補体調節タンパク質は、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２及びＣＤ５９を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質及び免疫系タンパク質に対する受容体を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体及びスカベンジャー受容体を含め、コレステロール調節及び／又は脂質調整のための受容体を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体及び他の核内受容体を含め、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーを含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニン、ＥＴＳ－ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ－ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ－結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－ボックス結合タンパク質及びウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーなどの転写因子を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ－シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラート、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィン遺伝子産物を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、ＣＤＫＬ５、アルファ－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、イズロニダーゼ、アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロノヒドロラーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガングリオシドシアリダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、ベータ－Ｄ－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、バッテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ及び他のバッテン関連タンパク質又は酵素的に活性であるそれらの断片を含む。１つ以上の実施形態では、バッテン関連タンパク質は、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質３、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質４、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質５、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質６、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質７、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質８、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１９、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１０、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１３及びセロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１４を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、血友病Ｂ及び血友病Ａを含む血友病の処置のために使用されるタンパク質を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、非天然ポリペプチド、例えば挿入、欠失又はアミノ酸置換を含有する非天然のアミノ酸配列を有するキメラ又はハイブリッドポリペプチドを含む。１つ以上の実施形態では、非天然ポリペプチドは、単鎖改変免疫グロブリン、アンチセンス分子及び触媒的核酸を含む。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、標的抗原及び標的ポリペプチドを含む癌遺伝子産物を含み、標的ポリペプチドは、正常な細胞と比較した場合、過剰増殖性細胞において排他的に又はより高レベルで産生されるタンパク質を含み、標的抗原は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ及び転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦを含む、癌遺伝子によりコードされるタンパク質を含む。１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、Ｂ細胞リンパ腫により産生される抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域を含む。１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、他の腫瘍関連ポリペプチドを含み、このポリペプチドは、モノクローナル抗体１７－１Ａにより認識されるポリペプチド及び葉酸結合ポリペプチドを含め、腫瘍細胞においてより高いレベルで見出される。
１つ以上の実施形態では、治療用タンパク質は、細胞受容体及び「自己」に対する抗体を産生する細胞を含む自己免疫と関連する標的に対してブロードベースの（ｂｒｏａｄ ｂａｓｅｄ）防御的免疫応答を付与することによって自己免疫疾患及び障害に罹患している個体を処置するために有用であるタンパク質を含む。１つ以上の実施形態では、自己免疫に関連する細胞はＴ細胞である。１つ以上の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は第３のリンカーペプチドを含み、この第３のリンカーペプチドは、小胞を標的とするタンパク質と関心対象のタンパク質との間に位置する。いくつかの実施形態では、第３のリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端に位置する。
いくつかの実施形態では、第３のリンカーペプチドは、スペーサーペプチド、膜貫通ドメイン及び小胞外ドメインの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では，第３のリンカーペプチドは、親和性タグ、コネクターペプチド、プロテアーゼ切断部位、分泌シグナルペプチド、細胞標的化ドメイン、レポーター、酵素又はそれらの組み合わせの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、親和性タグは、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ、ポリヒスチジン、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ及びＧＦＰの１つ以上であり得る。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、複数のエフェクタードメイン（ＥＤ）を含む。いくつかの実施形態では、複数のエフェクタードメイン（ＥＤ）は、第１のエフェクタードメイン（ＥＤ）と、第２のエフェクタードメイン（ＥＤ）と、を含む。いくつかの実施形態では、第１のエフェクタードメイン（ＥＤ）は、第２のエフェクタードメイン（ＥＤ）に直接的に連結される。いくつかの実施形態では、第１のエフェクタードメイン（ＥＤ）は、リンカーペプチドを介して第２のエフェクタードメイン（ＥＤ）に連結される。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解性の切断部位は、融合タンパク質の合成又は精製と組み合わせて、親和性タグを含む、小胞標的化タンパク質及び／又は他のペプチド機能ドメインからの関心対象のタンパク質の放出を促進するために、融合タンパク質になるように改変され得る。代表的なプロテアーゼ切断部位としては、トロンビン、フューリン、第Ｘａ因子、メタロプロテアーゼ、エンテロキナーゼ及びカテプシンに感受性がある切断部位が挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態では、切断部位は、リソクリーブ（ｌｙｓｏｃｌｅａｖｅ）部位を含む。リソクリーブ（ｌｙｓｏｃｌｅａｖｅ）部位は、未知のリソソームプロテアーゼに対して感受性がある。
細胞標的化ドメインは、細胞タイプ特異的な又は細胞分化特異的な標的化を付与するアミノ酸配列を含み得る。細胞標的化ドメインは、融合タンパク質に組み込まれ得るか、又は同時発現される膜結合エクソソームマーカータンパク質に融合され得る。好ましくは、細胞標的化ドメインは、膜結合タンパク質において細胞外ドメインに融合される。細胞標的化ドメインは、抗体又は抗体誘導体、ペプチドリガンド、受容体リガンド、受容体断片、ホルモンなどを含み得る。代表的な膜結合エクソソームマーカータンパク質としては、とりわけ、テトラスパニン、例えばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２及びＣＤ１５１など、及び様々なＧＰＩ（グリセロール－ホスファチジルイノシトール）－繋留タンパク質が挙げられるが限定されない。
代表的な抗体又は抗体由来の細胞標的化ドメインは、ＩｇＧ、抗体可変領域；単離ＣＤＲ領域；抗原結合部位を形成するための２つのドメイン間での会合を可能にするペプチドリンカーにより連結されるＶＨ及びＶＬドメインを含む単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二特異性ｓｃＦｖ二量体；ＶＨ又はＶＬドメインからなる、ＣＨ３ドメインに連結されるｓｃＦｖを含むミニボディー、単鎖ダイアボディー断片、ｄＡｂ断片；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での数個の残基の付加によりＦａｂ断片とは異なるＦａｂ’断片；定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である、Ｆａｂ’－ＳＨ断片；Ｆ（ａｂ’）２、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；その誘導体及び抗原－結合機能を保持する何らかの他の抗体断片からなる群の何れかのメンバーを含み得る。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディー分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化され得る。抗体由来標的化剤を使用する場合、その中の細胞標的化ドメイン及び／又はＦｃ領域の何れか又は全てが、当業者にとって周知の方法を使用して「ヒト化」され得る。
本発明の融合タンパク質における機能ドメインは、互いに関連する各ペプチド部分の独立した折り畳みを促進し、融合タンパク質における個々のペプチド部分が互いに妨害しないことを確実にするために、スペーサーによって互いから分離され得る。スペーサーは、何れかのアミノ酸又はその混合物を含み得る。好ましくは、選択されるスペーサーは、タンパク質の柔軟性を向上させ、拡大された立体構造の採用を促進する。好ましいペプチドスペーサーは、プロリン、リジン、グリシン、アラニン及びセリン又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、リンカーは、グリシンリッチリンカーである。
スペーサー配列は一般的に、１～１０アミノ酸長、一般的には１～８アミノ酸長、例えば２、３又は４アミノ酸長などである。スペーサーにおける組み込みに適切なアミノ酸は、アラニン、アルギニン、セリン又はグリシンである。適切なスペーサーは、Ａｌａ－Ａｒｇ及びＳｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙを含む。本発明の実施において、標的化する部分は、ｒＡＡＶ－導入遺伝子で形質導入された細胞内での標的化部分とエクソソーム性膜貫通タンパク質とを含む融合タンパク質の発現によって、エクソソームに導入され、従ってインビボでエクソソームを生成させる。細胞においてこの融合タンパク質を発現させることによって、エクソソームが細胞から生成されるとき、融合タンパク質がエクソソームに組み込まれることが可能になる。特定の実施形態では、スペーサーは、４アミノ酸ペプチドである。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上の湾曲感知ドメインを含み得る。１つ以上の実施形態では、湾曲感知ドメインは、ＳＮＸ－１湾曲感知ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＸ－１湾曲感知ドメインは、配列番号１５４による配列を含む。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質のＮ末端はメチオニンを持たない。
本開示は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列も提供する。
当業者は、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を容易に生じさせ得る。またポリヌクレオチド配列も、市販の製品を使用して、標的細胞において発現のためにコドン最適化され得る。本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列、例えば、遺伝子、分泌シグナルペプチド遺伝子の発現を指示するプロモーターに操作可能に連結され得る。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、脂質に複合化される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ミリストイル化、パルミトイル化、プレニル化又はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質により複合化される。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、脂質小胞にさらに再構成される。
融合タンパク質の発現
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質を作製する方法は、宿主細胞に対して遺伝子移入を行い、宿主細胞が融合タンパク質を一過性に発現することを可能にし、エクソソームを単離し、融合タンパク質を精製することを含む。１つ以上の実施形態では、精製された融合タンパク質がエクソソームに負荷される。１つ以上の実施形態では、エクソソームは、外因的に生成される。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞において発現される。１つ以上の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＰＣ１２細胞、ＨＡＰ１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、マウス初代筋芽細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞又はエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞の何れか１つを含む。１つ以上の実施形態では、融合タンパク質を発現するために無細胞発現合成が使用される。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質発現細胞は、エクソソームの生成を増加させるために誘導される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質発現細胞は、Ｎ－メチルドーパミン及び／又はノルエピネフリンで誘導される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質発現細胞は、細胞傷害剤で誘導される。いくつかの実施形態では、細胞傷害剤はメルファランを含む。
１つ以上の実施形態では、適切なベクターを使用して宿主細胞に対して遺伝子移入を行い、このベクターは、ウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニア、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス及びレトロウイルス、パルボウイルス、レンチウイルスなど）バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ脂質複合体及び一般的に様々な真核及び原核宿主において発現について記載されており、遺伝子治療のため並びに単純なタンパク質発現のために使用され得る当技術分野で使用される他の組み換えビヒクルを含む。
調節エレメント
導入遺伝子に加えて、ミニ遺伝子はまた、プラスミドベクターで遺伝子移入されるか又は本発明により作製されるウイルスを感染させられる細胞においてその転写、翻訳及び／又は発現を可能にする方式で、導入遺伝子に操作可能に連結される従来からの制御エレメントも含み得る。本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結される」配列は、関心対象の遺伝子と隣接する発現制御配列及び関心対象の遺伝子を制御するためにトランスで又は少し離れて作用する発現制御配列の両方を含む。
発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（即ちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；及び必要に応じて、コードされる産物の分泌を増強する配列を含む。ネイティブ、構成的、誘導性及び／又は組織特異的であるプロモーターを含む多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、利用され得る。
構成的なプロモーターの例としては、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーとともに）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、１３－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられるが限定されない。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子又は特異的な生理学的状態の存在、例えば急性期、細胞の特定の分化状態により調節され得るか又は複製する細胞においてのみ調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導性系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄを含むが限定されない様々な市販の供給元から利用可能である。多くの他の系が記載されており、当業者により容易に選択され得る。外部から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）－誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際公開第９８／１００８８号パンフレット］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン－抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９（１９９５），Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８（１９９８）も参照］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３（１９９７）及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１（１９９７）］及びラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２（１９９７）］が挙げられる。この内容において有用であり得る他のタイプの誘導性プロモーターは、特異的な生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により又は複製する細胞のみで調節されるものである。
別の実施形態では、導入遺伝子に対するネイティブプロモーターが使用される。ネイティブプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブ発現を模倣すべきことが望ましい場合に好ましいものであり得る。導入遺伝子の発現が、時間的に又は発生的に又は組織特異的に又は特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない場合、ネイティブプロモーターが使用され得る。さらなる実施形態では、ネイティブ発現を模倣するために、他のネイティブ発現制御エレメント、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位又はＫｏｚａｋコンセンサス配列も使用され得る。
導入遺伝子の別の実施形態は、組織特異的なプロモーターに操作可能に連結される遺伝子を含む。例えば、骨格筋における発現が所望される場合、筋肉で活性であるプロモーターを使用すべきである。これらには、骨格β－アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのプロモーター並びに天然のプロモーターより高い活性を有する合成筋肉プロモーターが含まれる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１－２４５（１９９９）を参照）。組織特異的であるプロモーターの例は、とりわけ、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２（１９９７）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロプロテイン（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、神経、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなど（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））及びニューロン特異的なｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））に対して知られている。
任意選択的に、プラスミドを保有する治療的に有用な導入遺伝子はまた、選択可能マーカーも含み得るか、又はレポーター遺伝子は、とりわけ、ジェネテシン、ハイグロマイシン又はプリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を含み得る。このような選択可能なレポーター又はマーカー遺伝子（好ましくは本発明の方法によりレスキューしようとするウイルスゲノムの外側に位置する）は、アンピシリン耐性など、細菌細胞においてプラスミドの存在をシグナル伝達するために使用され得る。プラスミドの他の構成成分は、複製起点を含み得る。これら及び他のプロモーター及びベクターエレメントの選択は、従来ものであり、多くのこのような配列が利用可能である［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ及びそこで引用される参考文献を参照］。
パッケージング宿主細胞に対するミニ遺伝子の送達
ミニ遺伝子は、宿主細胞に送達される、何れかの適切なベクター、例えばプラスミドにより運ばれ得る。本発明において有用なプラスミドは、それらが複製及び任意選択的に原核細胞、哺乳動物細胞又は両方での組み込みに適切であるように改変される。これらのプラスミド（又は５’ＡＡＶ ＩＴＲ－異種分子－３’ＡＡＶ ＩＴＲを運ぶ他のベクター）は、真核及び／又は原核においてミニ遺伝子の複製を可能にする配列及びこれらの系に対する選択マーカーを含有する。選択可能マーカー又はレポーター遺伝子は、とりわけ、ジェネテシン、ハイグロマイシン又はプリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を含み得る。このプラスミドは、アンピシリン耐性など、細菌細胞においてベクターの存在をシグナル伝達するために使用され得るある種の選択可能レポーター又はマーカー遺伝子も含有し得る。プラスミドの他の構成成分は、複製起点及びアンプリコン、例えばエプスタインバーウイルス核抗原を使用するアンプリコン系を含み得る。このアンプリコン系又は他の同様のアンプリコン構成成分は、細胞において高コピーのエピソーム複製を可能にする。好ましくは、ミニ遺伝子を保有する分子を細胞に遺伝子移入し、これが一過性に存在し得る。或いは、ミニ遺伝子（５’ＡＡＶ ＩＴＲ－異種分子－３’ＩＴＲを保有する）は、染色体に又はエピソームとしての何れかで、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれ得る。特定の実施形態では、ミニ遺伝子は、任意選択的に頭－頭、頭－尾又は尾－尾コンカテマーで、複数コピーで存在し得る。適切な遺伝子移入技術は公知であり、宿主細胞へミニ遺伝子を送達するために容易に利用され得る。
一般に、遺伝子移入によりミニ遺伝子を含むベクターを送達する場合、このベクターは、約５μｇ～約１００μｇ ＤＮＡ、約１０μｇ～約５０μｇ ＤＮＡの量で約１ｘ１０４個～約１ｘ１０１３個の細胞又は約１ｘ１０５個の細胞に送達される。しかし、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されるベクター、送達方法及び選択される宿主細胞などの因子を考慮して調整され得る。
Ａ．Ｒｅｐ及びＣａｐ配列
ミニ遺伝子に加えて、パッケージング宿主細胞は、宿主細胞における新規ＡＡＶカプシドタンパク質（又はそれらの断片を含むカプシドタンパク質）の発現を推進する配列及びミニ遺伝子において見出されるＡＡＶ ＩＴＲのソースと同じソース、又は交差補完的なソースのｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶ ｃａｐ及びｒｅｐ配列は、上記のようなＡＡＶソースから独立に得られ得、上記のような当業者にとって公知である何れかの方式で宿主細胞に導入され得る。さらに、（例えばＡＡＶ９／ＨＵ．１４カプシド）においてＡＡＶベクターをシュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏ ｔｙｐｉｎｇ）する場合、必須のｒｅｐタンパク質のそれぞれをコードする配列は、異なるＡＡＶソース（例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８）により供給され得る。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２由来であり得、一方でｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８由来であり得る。
一実施形態では、宿主細胞は、上記のものなどの適切なプロモーターの制御下で、カプシドタンパク質を安定的に含有する。最も望ましくは、この実施形態では、カプシドタンパク質は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、カプシドタンパク質は、トランスで宿主細胞に供給される。トランスで宿主細胞に送達される場合、カプシドタンパク質は、宿主細胞において選択されたカプシドタンパク質の発現を指示するために必要な配列を含有するプラスミドを介して送達され得る。最も望ましくは、トランスで宿主細胞に送達される場合、カプシドタンパク質を保有するプラスミドは、ｒＡＡＶをパッケージングするために必要な他の配列、例えばｒｅｐ配列、も保有する。
別の実施形態では、宿主細胞は、上記のものなど、適切なプロモーターの制御下でｒｅｐ配列を安定して含有する。最も望ましくは、この実施形態では、必須のｒｅｐタンパク質は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質はトランスで宿主細胞に供給される。トランスで宿主細胞に送達される場合、ｒｅｐタンパク質は、宿主細胞において選択されたｒｅｐタンパク質の発現を指示するために必要な配列を含有するプラスミドを介して送達され得る。最も望ましくは、トランスで宿主細胞に送達される場合、カプシドタンパク質を保有するプラスミドは、ｒＡＡＶをパッケージングするために必要な他の配列、例えばｒｅｐ配列、も保有する。
従って、一実施形態では、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、単一の核酸分子において宿主細胞に遺伝子移入され、エピソームとして細胞中に安定して存在し得る。別の実施形態では、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、細胞の染色体に安定して組み込まれる。別の実施形態は、宿主細胞において一過性に発現されるｒｅｐ及びｃａｐ配列を有する。例えば、このような遺伝子移入のための有用な核酸分子は、５’から３’で、プロモーター、そのプロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に挿入される任意選択的なスペーサー、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含む。
任意選択的に、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列は、宿主細胞に導入しようとする他のＤＮＡ配列を含有するベクター上で供給され得る。例えば、ベクターは、ミニ遺伝子を含むｒＡＡＶコンストラクトを含有し得る。ベクターは、ヘルパー機能、例えばアデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａ及びＥ４ ＯＲＦ６をコードする遺伝子の１つ以上及びＶＡＩ ＲＮＡに対する遺伝子を含み得る。
好ましくは、このコンストラクトにおいて使用されるプロモーターは、当業者にとって公知であるか又は上で論じられるような、構成的、誘導性又はネイティブプロモーターの何れかであり得る。一実施形態では、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列が使用される。これらの配列の何れかを提供するためのＡＡＶの選択は、本発明を限定しない。
別の好ましい実施形態では、ｒｅｐに対するプロモーターは、導入遺伝子制御エレメントとの関連において上で論じられるものなどの誘導性プロモーターである。ｒｅｐ発現に対する１つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーター及びｃａｐ遺伝子により調節されるｒｅｐ遺伝子を含むベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成的又は誘導的の何れかで発現する細胞に遺伝子移入されるか又は形質転換される。１９９８年３月１２日に公開された国際公開第９８／１００８８号パンフレットを参照。
スペーサーは、ベクターの設計における任意選択的なエレメントである。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子ＡＴＧ開始部位との間に挿入されるＤＮＡ配列である。スペーサーは、何れかの所望の設計を有し得；即ち、これは、ヌクレオチドのランダム配列であり得るか、又は或いはこれは、遺伝子産物、例えばマーカー遺伝子などをコードし得る。スペーサーは、一般的には開始／終結及びポリＡ部位を組み込む遺伝子を含有し得る。スペーサーは、原核生物又は真核生物由来の非コードＤＮＡ配列、反復非コード配列、転写制御がないコード配列又は転写制御があるコード配列であり得る。スペーサー配列の２つの代表的なソースは、とりわけ、ファージラダー配列又は酵母ラダー配列であり、これは、例えばＧｉｂｃｏ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０及びｃａｐ遺伝子産物がそのまま正常なレベルで発現され、ｒｅｐ７８及びｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を低下させるのに十分な何れかのサイズであり得る。従って、スペーサーの長さは、約１０ｂｐ～約１０．０ｋｂｐの範囲、好ましくは約１００ｂｐ～約８．０ｋｂｐの範囲であり得る。組み換えの可能性を低下させるために、スペーサーは、好ましくは２ｋｂｐ長未満であるが；本発明はそのように限定されない。
ｒｅｐ及びｃａｐを提供する分子が宿主細胞において一過性に存在し得るものの（即ち遺伝子移入を通じて）、例えば、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質の一方又は両方及びそれらの発現を制御するプロモーターが、エピソームとして又は宿主細胞の染色体への組み込みにより、宿主細胞において安定して発現されることが好ましい。本発明の実施形態を構築するために使用される方法は、上の参考文献に記載のものなど、従来の遺伝子操作又は組み換え操作技術である。この明細書が、本明細書中で提供される情報を使用して、特異的なコンストラクトの代表的な例を提供する一方で、当業者は、少なくとも１つの翻訳開始及び停止シグナル及び任意選択的なポリアデニル化部位の付加を含め、スペーサー、Ｐ５プロモーター及び他のエレメントの選択を使用して、他の適切なコンストラクトを選択し、設計し得る。
本発明の別の実施形態では、ｒｅｐ又はｃａｐタンパク質は、宿主細胞により安定して提供され得る。
ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞は、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするために、ヘルパー機能も必要とする。任意選択的に、これらの機能は、ヘルペスウイルスにより供給され得る。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は、上記のものなど、ヒト又は非ヒト霊長類アデノウイルス源からそれぞれ提供され、及び／又は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．（ＵＳ）を含む様々な供給元から入手可能である。１つの現在好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物及び／又はＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物とともに提供され及び／又はそれを含有する。宿主細胞は、ＶＡＩ ＲＮＡなどの他のアデノウイルス遺伝子を含有し得るが、これらの遺伝子は必要とされない。好ましい実施形態では、他のアデノウイルス遺伝子又は遺伝子機能は宿主細胞に存在しない。
「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」は、Ｅ１ａ又は何れかの機能的Ｅ１ａ部分をコードする何れかのアデノウイルス配列を意味する。Ｅ２ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ及びＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡは同様に定義される。アデノウイルス遺伝子又はその機能的部分のあらゆるアレル又は他の修飾も含まれる。このような修飾は、いくつかの方式でアデノウイルス機能を増強するための従来の遺伝子操作又は変異誘発技術並びに天然のそれらの対立遺伝子変異体を用いることよって、計画的に導入され得る。これらのアデノウイルス遺伝子機能を達成するためにＤＮＡを操作するためのこのような修飾及び方法は、当業者にとって公知である。
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ及び／又はＥ４ＯＲＦ６遺伝子産物並びに何れかの他の望ましいヘルパー機能は、細胞でのそれらの発現を可能にする何れかの手段を使用して提供され得る。これらの産物をコードする配列のそれぞれは、別個のベクター上にあり得るか、又は１つ以上の遺伝子が同じベクター上にあり得る。ベクターは、プラスミド、コスミド及びウイルスを含む、当技術分野で公知であるか又は上で開示される何れかのベクターであり得る。ベクターの宿主細胞への導入は、とりわけ、遺伝子移入、感染、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速度ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含む、当技術分野で公知であるか又は上で開示されるような何れかの手段により達成され得る。アデノウイルス遺伝子の１つ以上は、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれ得るか、エピソームとして安定して発現され得るか又は一過性に発現され得る。遺伝子産物は全て、エピソーム上で一過性に発現され得るか、又は安定して組み込まれ得るか又は、遺伝子産物のうちいくつかは、他が一過性に発現される一方で、安定して発現され得る。さらに、アデノウイルス遺伝子のそれぞれに対するプロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター又はネイティブアデノウイルスプロモーターから独立して選択され得る。プロモーターは、生物又は細胞の特異的な生理学的状態により（即ち、分化状態によるか、又は複製しているか又は無活動の細胞において）又は外因的に因子を添加することによって調節され得る。
宿主細胞及びパッケージング細胞株
宿主細胞それ自身、原核（例えば細菌）細胞及び、昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核細胞を含め、何れかの生物学的生物から選択され得る。特に、望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２及び、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを含む哺乳動物由来の、初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞などの細胞を含むが限定されないあらゆる哺乳動物種の中から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は、本発明の制約ではなく；哺乳動物細胞のタイプ、即ち、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども本発明の制約ではない。使用される細胞の要件は、Ｅ１、Ｅ２ａ及び／又はＥ４ ＯＲＦ６以外のアデノウイルス遺伝子を全く保有せず；結果としてｒＡＡＶの産生中に混入ウイルスの相同組み換えを生じさせ得る他のウイルス遺伝子を全く含有せず；ＤＮＡの感染又は遺伝子移入及び遺伝子移入されたＤＮＡの発現が可能であることである。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐが細胞に安定して遺伝子移入されるものである。
本発明で有用な１つの宿主細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐをコードする配列で安定して形質転換される宿主細胞であり、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ及びＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡ及び上記のようなミニ遺伝子を保有するコンストラクトを用いて遺伝子移入が行われる。安定なｒｅｐ及び／又はｃａｐ発現細胞株、例えばＢ－５０（国際公開第９９／１５６８５号パンフレット）など又は米国特許第５，６５８，７８５号明細書に記載のものも同様に使用され得る。別の望ましい宿主細胞は、Ｅ４ ＯＲＦ６を発現させるのに十分である最小アデノウイルスＤＮＡを含有する。また他の細胞株は、本発明の新規ＡＡＶ９キャップ配列を使用して構築され得る。
ｒＡＡＶを作製するための１つのプラットフォームは、２つ又は３つの何れかのプラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞に対して遺伝子移入を行うことを含み；１つは関心対象の遺伝子をコードし、１つはＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を保有し、別のものはアデノウイルス又はヘルペスウイルスの何れかにより提供されるヘルパー遺伝子を含有する。ローラーボトル又はセルスタックス（ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋｓ）の何れかにおいて接着細胞を用いて、多くのロバストな産生レベルが達成されてきた。さらに、懸濁適応ＨＥＫ２９３細胞において高産生レベルが達成され得る。産生は記載のものに限定されないが、当技術分野で公知である作製技術の改善を組み込み得る。
パッケージング宿主細胞への分子（プラスミド又はウイルスとして）の導入は、当業者にとって公知の技術を使用して、及び本明細書を通じて論じられるようにも完遂され得る。好ましい実施形態では、標準的な遺伝子移入技術が使用され、例えばＣａＰＯ４遺伝子移入又はエレクトロポレーション及び／又はヒト胚腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（トランス作用Ｅ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎臓細胞株）などの細胞株へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染である。
当業者は、ＡＡＶ配列がインビトロ、エクスビボ又はインビボでの遺伝子送達に容易に適応可能であり得ることを容易に理解する。同様に、当業者は、様々なｒＡＡＶ及び非ｒＡＡＶベクター系での使用のために、ＡＡＶゲノムの他の断片を容易に選択し得る。このようなベクター系は、とりわけ、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルス系を含み得る。これらのベクター系の選択は、本発明の制約ではない。
小胞に向けられるタンパク質の精製
発現及び分泌後、融合タンパク質を含有するエクソソーム及び細胞外小胞を単離し、標準的技術を用いて周囲の細胞培養培地から精製し得る。いくつかの実施形態では、エクソソーム及び細胞外小胞は、沈殿及び洗浄により精製され得る。いくつかの実施形態では，精製エクソソーム及び細胞外小胞は、その中から融合タンパク質を精製するためにさらに溶解され得る。
精製融合タンパク質の修飾
１つ以上の実施形態では、精製融合タンパク質を脂質複合化に供する。１つ以上の実施形態では、脂質複合化工程は、ミリストイル化を含む。１つ以上の実施形態では、脂質複合化工程は、パルミトイル化を含む。１つ以上の実施形態では、脂質複合化工程は、プレニル化を含む。１つ以上の実施形態では、脂質複合化工程は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質を含む。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質又は脂質に複合化された融合タンパク質は、脂質小胞へと再構成される。いくつかの実施形態では、脂質小胞は、エクソソーム又は合成小胞である。
融合タンパク質のクロスコレクション効率の決定
クロスコレクションと呼ばれる、ある細胞において産生されたタンパク質又は遺伝子産物が非形質導入細胞に入り、影響を及ぼすことによる機序の設計は、安全性及び有効性を改善するための実行可能なストラテジーである。特に、クロスコレクションは、形質導入されていない細胞に治療用巨大分子を送達することによって治療効果を最大化する。このように、組織全体において潜在的な効果を有するために形質導入されることを必要とするのは、細胞のうち少数のみである。ウイルスベクター投与量を減少させ得、それにより、有害事象に対するリスクが低下し、１回の投与当たりのコストが低下する。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質に対するクロスコレクション効率が測定され、ここでは、蛍光タンパク質タグとともに融合タンパク質をコードするベクターを用いて遺伝子移入が行われた細胞を非遺伝子移入細胞と同時培養し、蛍光顕微鏡下で可視化する。いくつかの実施形態では、細胞はＣＯＳ－７である。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質タグはｍＣｈｅｒｒｙタグである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の治療用タンパク質は、ＣＤＫＬ５を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の治療用タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡを含む。
１つ以上の実施形態では、融合タンパク質に対するクロスコレクション効率をインビボで測定する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＭｙｒＥＤ２７（配列番号５７）、ＭｙｒＥＤ７７（配列番号１０７）、ＭｙｒＥＤ８１（配列番号１１１）又はＭｙｒＥＤ８８（配列番号１１８）を含む。いくつかの実施形態では、インビボ試験は、マウス胚を使用することを含む。従って、いくつかの実施形態では、子宮内の胚の脳にプラスミドを直接注入し、及び／又はプラスミドが脳細胞に入ることを可能にするエレクトロポレーションを行う。いくつかの実施形態では、陽性対照は、相対的な形質導入効率を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、陽性対照コンストラクトは、ＢｉＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを含む。いくつかの実施形態では、これらのプラスミドは、遺伝子移入された細胞がＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙを発現するようなものであり、一方でクロスコレクションを受けた細胞はｍＣｈｅｒｒｙのみを含有する。クロスコレクションを受けた細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙを発現せず、それらは、形質導入された細胞から既に翻訳されたタンパク質を受け取る。いくつかの実施形態では、次に、胚をＥ１８．５で４日後に回収する。いくつかの実施形態では、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの存在について胚の脳切片を蛍光によりイメージングし、陽性対照と比較する。
膜結合型ＥＤ変異体を含有する融合タンパク質の相対発現の決定
いくつかの実施形態では、エクソソームにおいて膜結合型ＥＤ変異体を含有する融合タンパク質の相対発現は、ウエスタンブロット分析により決定され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＯＳ－７又はＥｘｐｉ２９３であり得る。１つ以上の実施形態では、蛍光タンパク質タグは、ｍＣｈｅｒｒｙタグであり得る。
融合タンパク質の患者への送達
本発明の別の態様は、融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む製剤処方物に関する。
本発明の別の態様は、疾患又は障害の処置を必要とする患者に製剤処方物を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法に関する。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ＣＤＫＬ５介在性神経障害を含み、治療用タンパク質はＣＤＫＬ５を含む。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ファブリー病を含み、治療用タンパク質は、アルファ－ガラクトシダーゼＡを含む。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ポンペ病を含み、治療用タンパク質は、アルファ－グルコシダーゼを含む。
１つ以上の実施形態では、本医薬組成物は、疾患又は障害を防ぐために予防として投与される。
１つ以上の実施形態では、製剤処方物は、くも膜下腔内に、頭蓋内に、大槽内に（ｉｎｔｒａ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａｌｌｙ）、静脈内に、大槽内に、脳室内に又は実質内に投与される。
遺伝子治療
本発明の別の態様は、遺伝子治療において適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子治療組成物は、遺伝子治療送達系及び改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子治療送達系は、ベクター、リポソーム、脂質－核酸ナノ粒子、エクソソーム及び遺伝子編集系の１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子治療送達系は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－９）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＺＮＦ（ジンクフィンガータンパク質）の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子治療送達系は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子治療送達系は、リーダーシグナルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子治療送達系は、ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターの１つ以上を含む。ウイルスベクターは、プロモーター（例えばハイブリッドＣＢＡプロモーター（ＣＢｈ）及びヒトシナプシン１プロモーター（ｈＳｙｎ１））、ポリアデニル化シグナル（例えばウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ））、安定化エレメント（例えばマーモット肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））及び／又はＳＶ４０イントロンなど、発現を上昇させ、及び／又はベクターを安定化するためのさらなるエレメントも含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されるウイルスポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。
１つ以上の実施形態では、遺伝子治療組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。薬学的に許容可能な担体としては、化合物がともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルが挙げられる。
本発明の様々な態様は、それを必要とする患者に遺伝子治療組成物を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法に関する。さらなる実施形態の１つでは（Ｉｎ ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）、遺伝子治療組成物は、くも膜下腔内に、頭蓋内に、大槽内に（ｉｎｔｒａ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａｌｌｙ）、静脈内に、大槽内に、脳室内に又は実質内に投与される。
組み換えウイルス及びそのための使用
本明細書中に記載の技術を使用して、当業者は、本明細書中で提供されるＡＡＶのカプシドを有し、所望の導入遺伝子を含むミニ遺伝子を受け入れているｒＡＡＶを作製し得る。一実施形態では、単一のＡＡＶからの全長カプシドが利用され得る。別の実施形態では、別の選択されたＡＡＶから又は同じＡＡＶの非相同（即ち非近接）部分からの配列とインフレームで融合される新規ＡＡＶカプシドの１つ以上の断片を含有する全長カプシドが作製され得る。或いは、ユニークなＡＡＶ配列は、他のウイルス又は非ウイルス配列を含有するコンストラクトにおいて使用され得る。
ウイルスの送達
投与の利用可能な多くの方法のうち１つによって、所望の導入遺伝子を含むミニ遺伝子を含有するｒＡＡＶは、インビボでエクソソームを生成させるために標的とされる細胞に直接投与され得る。例えば、投与は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、頬側投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、リンパ内、眼窩周囲、くも膜下腔内及び関節内又はそれらの組み合わせを含む、異なる多くの投与経路のうち１つによるものであり得る。獣医学の使用のために、通常の獣医学の実践に従い、適切に許容可能な処方物としてｒＡＡＶが投与され得る。獣医師は、特定の動物に対して最も適切である投与レジメン及び投与経路を容易に決定し得る。好ましくは、導入遺伝子を伴うミニ遺伝子を含有するｒＡＡＶベクターは、伝統的なシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃遺伝子銃」又は、エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「水力学的方法」又は超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
一実施形態では、本発明は、宿主への導入遺伝子の、ＡＡＶが介在する送達のための方法を提供する。この方法は、選択される宿主細胞に対して、その発現を指示する配列の制御下で選択される導入遺伝子及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有する組み換えウイルスベクターで遺伝子移入を行うか、又はそれを感染させることを含む。
任意選択的に、宿主からの試料は、選択されるＡＡＶソースに対する抗体（例えば血清型）の存在について最初にアッセイされ得る。中和抗体を検出するための様々なアッセイ方式は、当業者にとって周知である。このようなアッセイの選択は、本発明の制約ではない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，３（３）：３０６－３１２（Ｍａｒｃｈ １９９７）及びＷ Ｃ Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：４７７－４８５（Ｍａｒｃｈ １，１９９８）を参照。このアッセイの結果は、例えばカプシドソースに対する特異的な中和抗体がないことにより、特定のソースのカプシドタンパク質を含有するどのＡＡＶベクターが送達のために好ましいかを決定するために使用され得る。
この方法の一態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質を用いたベクターの送達は、異なるＡＡＶカプシドタンパク質を伴うベクターを介した遺伝子の送達に先行し得るか又はその後に続き得る。従って、ｒＡＡＶベクターを介した遺伝子送達は、選択される宿主細胞への反復遺伝子送達のために使用され得る。望ましくは、続いて投与されるｒＡＡＶベクターは、第１のｒＡＡＶベクターと同じ導入遺伝子を保有するが、続いて投与されるベクターは、第１のベクターとは異なるソース（及び好ましくは異なる血清型）のカプシドタンパク質を含有する。
任意選択的に、インビボでコンカタマー化して単一ベクターゲノムを形成するｒＡＡＶベクターの同時投与によって、大きな導入遺伝子又は複数の導入遺伝子を送達するために、複数のｒＡＡＶベクターが使用され得る。このような実施形態では、第１のＡＡＶは、単一導入遺伝子（又はそのサブユニット）を発現する発現カセットを保有し得、第２のＡＡＶは、宿主細胞における同時発現のための第２の導入遺伝子（又は異なるサブユニット）を発現する発現カセットを保有し得る。第１のＡＡＶは、ポリシストロニックなコンストラクト（例えばプロモーター及び導入遺伝子又はサブユニット）の第１片である発現カセットを保有し得、第２のＡＡＶは、ポリシストロニックなコンストラクト（例えば導入遺伝子又はサブユニット及びポリＡ配列）の第２片である発現カセットを保有し得る。ポリシストロニックなコンストラクトのこれらの２つの片は、インビボでコンカタマー化して、第１及び第２のＡＡＶにより送達される導入遺伝子を同時発現する単一のベクターゲノムを形成する。このような実施形態では、第１の発現カセットを保有するｒＡＡＶベクター及び第２の発現カセットを保有するｒＡＡＶベクターは、単一の医薬組成物において送達され得る。他の実施形態では、２つ以上のｒＡＡＶベクターは、実質的に同時に又は互いに少し前又は後に投与され得る別個の医薬組成物として送達される。
上記の組み換えベクターは、公開されている方法に従い、対象に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性の担体中で懸濁したｒＡＡＶをヒト又は非ヒト哺乳動物患者に投与し得る。適切な担体は、転移ウイルスが方向付けられる指示を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体は食塩水を含み、これは、様々な緩衝溶液（例えばリン酸緩衝食塩水）とともに処方され得る。他の代表的な担体としては、滅菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油及び水が挙げられる。担体の選択は本発明の制約ではない。
任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体などに加えて、他の従来からの医薬成分、例えば保存剤又は化学的な安定化剤を含有し得る。適切な代表的保存剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル，パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学的安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
ベクターは、細胞に遺伝子移入するため、及び不要な悪影響なく又は医学的に許容可能な生理学的影響で治療的な利益を提供するために十分なレベルの遺伝子転移及び発現をもたらすために十分な量で投与され、治療的な利益は、医学の技術分野の熟練者により判断され得る。慣習的及び薬学的に許容可能な投与経路としては、所望の臓器（例えば肝臓（任意選択的に肝臓動脈を介して）又は肺）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の非経口投与経路が挙げられるが限定されない。必要に応じて、投与経路が組み合わせられ得る。
ウイルスベクターの投与量は、処置されている状態、患者の年齢、体重及び健康などの因子に主に依存し、従って患者間で変動し得る。例えば、ウイルスベクターの治療的有効ヒト投与量は一般に、約１ｘ１０９～１ｘ１０１６のゲノムウイルスベクターの濃度を含有する約０．１ｍＬ～約１００ｍＬの溶液の範囲である。大きな臓器（例えば、肝臓、筋肉、心臓及び肺）への送達のための好ましいヒト投与量は、約１～１００ｍＬの体積で、１ｋｇあたりＡＡＶゲノム約５ｘ１０１０～５ｘ１０１３個であり得る。眼に送達するための好ましい投与量は、約０．１ｍＬ～１ｍＬの体積で約５ｘ１０９～５ｘ１０１２ゲノムコピーである。投与量は、何らかの副作用に対する治療的な利益の均衡をとるために調整され、このような投与量は、組み換えベクターが使用される治療適用に依存して変動し得る。導入遺伝子の発現のレベルは、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターを生じさせる投与量の頻度を決定するために監視され得る。任意選択的に、治療目的のために記載されたものと同様の投与レジメンは、本発明の組成物を使用して免疫付与のために利用され得る。
ＡＡＶ含有ベクターによる送達のための治療用製品及び免疫原性生成物の例を以下で提供する。これらのベクターは、本明細書中で記載のように、様々な治療又はワクチンレジメンのために使用され得る。さらに、これらのベクターは、所望の治療及び／又はワクチンレジメンにおいて、１つ以上の他のベクター又は活性成分と組み合わせて送達され得る。
インビボでのエクソソームが介在する遺伝子送達
エクソソームは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）及び殆どの細胞などの免疫細胞を含む多くの異なるタイプの細胞により生成される。エクソソームは、例えば神経膠腫細胞、血小板、網状赤血球、ニューロン、腸上皮細胞及び腫瘍細胞によっても生成される。このような細胞タイプ及びそれらが定める組織は、改変タンパク質をコードする遺伝子を用いて、エクソソーム産生のために標的化され得る。このような標的化は、改変タンパク質をコードする遺伝子を含む提供されるミニ遺伝子を含有するｒＡＡＶコンストラクトでの形質導入によって遂行される。
本発明の好ましい態様では、ＤＣ、好ましくは未成熟ＤＣ由来のエクソソームが標的化される。未成熟ＤＣから生成されるエクソソームは、ＭＨＣ－ＩＩ、ＭＨＣ－Ｉ又はＣＤ８６を発現しない。そうであるから、このようなエクソソームは、顕著な程度までナイーブＴ細胞を刺激せず、混合リンパ球反応において応答を誘導できない。従って、未成熟樹状細胞から生成されたエクソソームは、遺伝子治療など、遺伝物質の送達のためのビヒクルとして標的化するための理想的な候補である。
エクソソームへの組み込みのための核酸は、１本鎖又は２本鎖であり得る。１本鎖核酸は、ホスホジエステル、２’Ｏ－メチル、２’メトキシ－エチル、ホスホロアミダート、メチルホスホナート及び／又はホスホロチオエート骨格化学を伴うものを含む。一般的には、例えばプラスミドＤＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含め、２本鎖核酸が導入される。
エクソソームの標的化（クロスコレクションのため）
筋肉サテライト細胞、幹細胞又は疾患（線維症又は筋肉変性）細胞などの一部の細胞は形質導入が困難なので、本発明は、クロスコレクションを可能とするための所望の細胞タイプ又は組織へのエクソソームの標的化にも関する。この標的化は、クロスコレクションを必要とする細胞タイプの表面上で発現される細胞表面部分に結合する標的化部分をエクソソームの表面で発現させることによって達成される。一般的には、標的化部分は、一般的にエクソソームの表面上で発現される膜貫通タンパク質とともに改変タンパク質として発現されるペプチドである。
クロスコレクションのために細胞を標的化するための適切なペプチドは、標的としようとする細胞の細胞表面上で見出される受容体又はそれらのリガンドなど、細胞表面部分に結合するものである。適切な標的化部分の例は、エクソソームの表面上で標的化部分が発現され得、エクソソームへの膜タンパク質の挿入を妨害しない限り、短いペプチド、ｓｃＦｖ及び完全なタンパク質である。一般的には、標的化ペプチドは、膜貫通エクソソームタンパク質にとって異種である。ペプチド標的化部分は一般的に、１００アミノ酸長未満、例えば５０アミノ酸長未満、３０アミノ酸長未満から１０、５又は３アミノ酸の最短の長さまでであり得る。
標的化部分は、例えば筋肉、脳、肝臓、膵臓及び肺などの特定の組織タイプを標的とするために、例えば、又は腫瘍などの疾患組織を標的とするために、選択され得る。本発明の特に好ましい実施形態では、エクソソームは、脳組織に標的化される。
標的化する部分の具体例としては、骨格筋を標的とするためのファージディスプレイにより発見された筋肉特異的ペプチド、アセチルコリン受容体に結合する狂犬病ウイルス糖タンパク質の２９個のアミノ酸断片又は、ニューロンを標的とするためにその受容体を標的とする神経増殖因子の断片が挙げられ、セクレチン受容体に結合するセクレチンペプチドは、胆管及び膵臓上皮を標的とするために使用され得る。代替物として、ｓｃＦｖ抗体断片を含む免疫グロブリン及びそれらの誘導体も、特異的な抗原、例えば癌遺伝子治療のためのＶＥＧＦＲを標的とするために、改変タンパク質として発現され得る。代替物として、ＮＧＦＲに結合し、ニューロン特異的な標的化を与えるＮＧＦなど、特異性を与えるために、受容体に対する天然のリガンドを改変タンパク質として発現させ得る。
ペプチド標的化部分は、エクソソーム膜貫通タンパク質とともに改変タンパク質としてそれを発現させることにより、エクソソームの表面上で発現される。いくつかの実施形態では、エクソソーム膜貫通タンパク質は、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ－１、インテグリンアルファ４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１アルファ及びベータ、Ｖｔｉ－１Ａ及びＢ、ＣＤ３イプシロン及びゼータ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ構成成分、ＴＣＲベータ及びテトラスパニンの１つ以上であり得る。本発明の特に好ましい実施形態では、膜貫通タンパク質は、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３から選択される。
処置の方法
所望の導入遺伝子を含むミニ遺伝子を含有する１つ以上のｒＡＡＶベクターを投与することによって、それを必要とする対象において疾患を処置する、それに対して防御する及び／又は予防する方法が本明細書中で提供される。対象への導入遺伝子の投与は、エクソソーム送達経路を介して、対象に遺伝子治療を提供し得る。これは特に、遺伝子治療のために標的化された細胞が、それらが病的であるか、アクセス困難であるか（例えば脳細胞に対する血液脳関門）又は免疫応答に対する感受性が高いからの何れかであるために形質導入において困難がある場合に有益であり、従って、本明細書中に記載のようなエクソソームを介して送達するためにそれ自身役立つ。
遺伝子治療のために理想的である遺伝的欠損により引き起こされる疾患の例は、可能性のある遺伝子治療標的の中でもとりわけ、遺伝性網膜疾患（ボレチジーン・ネパルボベック（ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ）－ＲＰＥ６５を含む）、Ｘ－連鎖網膜分離症及び色覚異常、Ｘ－連鎖網膜色素変性症及び加齢性黄斑変性、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）欠損（ＬＰＬ遺伝子）、レーバー先天性黒内障（眼疾患）（ＲＰＥ特異的なタンパク質ＲＰＥ６５遺伝子）、全脈絡膜萎縮（眼疾患）（ＲＥＰ－１遺伝子）、色覚異常（失明）（ＣＮＧＡ３遺伝子）、レーバー遺伝子視神経症（眼疾患）（Ｇ１１７７８Ａミトコンドリアの遺伝子）、Ｘ－連鎖若年性網膜分離症（眼疾患）（ＸＬＲＳ遺伝子）、血友病Ａ（ＦＶＩＩＩ遺伝子）、血友病Ｂ（ＦＩＸ遺伝子）、アルファ－アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損（ＡＡＴ遺伝子）、脊髄筋萎縮症（ＳＭＮ遺伝子）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（マイクロＤＭＤ遺伝子）、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（アルファ－サルコグリカン遺伝子）、ベッカー型筋ジストロフィー孤発性封入体筋炎（フォリスタチン遺伝子）、ジスフェリン欠損（ジスフェリン遺伝子）、関節リウマチ（ＮＦ－ｋＢ及びＩＦＮ－ベータ遺伝子）、異染性白質ジストロフィー（ＡＲＳＡ遺伝子）、アルツハイマー病（ＮＧＦ遺伝子）、特発性パーキンソン病（ニュールツリン遺伝子）、ＡＡＤＣ欠損に対する遺伝子酵素補充療法（ＧＥＲＴ）（ＡＡＤＣ遺伝子）、ＬＩＮＣＬに対するＧＥＲＴ（バッテン病の形態）（ＴＰＰ１遺伝子）、ＭＰＳＩＩＩＡに対するＧＥＲＴ（サンフィリッポＡ症候群）（ＳＧＳＨ遺伝子）、血液アンモニア蓄積を補正するためのＧＥＲＴ（ＯＴＣ遺伝子）及び肝炎（Ｃ型肝炎ウイルス）である。
キット
本開示は、医薬組成物と、使用のための説明書と、を含むキットを提供する。本開示は、遺伝子治療組成物と、使用のための説明書と、を含むキットも提供する。
実施例－１
［Ａ］融合タンパク質をエクソソームへと標的化するための短縮されたＭＡＲＣＫＳ変異体の設計
ＭＡＲＣＫＳタンパク質の４つの短縮された変異体、ＭＡＲＣＫＳ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＤ（ＥＤまでのＭＡＲＣＫＳ）、ＭＡＲＣＫＳ ｎｏ ＥＤ（ＥＤなしのＭＡＲＣＫＳ）、ＭＡＲＣＫＳ ＥＤ ｏｎｌｙ（ＭＡＲＣＫＳ ＥＤのみ）及びＭｙｒＥＤ、は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質のどの部分が融合タンパク質をエクソソームへと標的化するために必須であるかを同定するために設計された。図１は、４つの短縮されたＭＡＲＣＫＳタンパク質変異体の模式図を示す。
ｍＣｈｅｒｒｙとともにプラスミドに４つの短縮されたＭＡＲＣＫＳタンパク質変異体のそれぞれをクローニングした。Ｃｏｓ－７細胞に対してプラスミドを用いて遺伝子移入を行った。ＣＤ６３タンパク質は、エクソソームに標的化される。図２は、ｍＣｈｅｒｒｙ（左）及びエクソソームタンパク質ＣＤ６３に対する抗ＣＤ６３抗体（右）に対する、免疫可視化された画像である。この図は、ＭＡＲＣＫＳ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＤ（ＥＤまでのＭＡＲＣＫＳ）、ＭＡＲＣＫＳ ＥＤ ｏｎｌｙ（ＭＡＲＣＫＳ ＥＤのみ）又はＭｙｒＥＤに融合される場合、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質がエクソソームタンパク質ＣＤ６３と共局在することを示す。
［Ｂ］融合タンパク質に対する短縮されたＭＡＲＣＫＳのクロスコレクション能力の決定。
ｍＣｈｅｒｒｙタグ付きの２つのコンストラクト、ｍＭＡＲＣＫＳ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＤ（ＥＤまでのｍＭＡＲＣＫＳ）及びＭｙｒＥＤを作製した。Ｃｏｓ－７細胞に対してコンストラクトを用いて遺伝子移入を行った。ＢｉＰａ、分泌性タンパク質及び陰性対照としてのｍＣｈｅｒｒｙも用いて、Ｃｏｓ－７細胞に対して遺伝子移入を行った。遺伝子移入された細胞を非遺伝子移入Ｃｏｓ－７細胞と同時培養した。確認された図３の蛍光画像は、両コンストラクトが隣接する非遺伝子移入細胞に入る能力を有することを示す。
ｍＣｈｅｒｒｙタグ付きの、両コンストラクト、ｍＭＡＲＣＫＳ ｔｈｒｏｕｇｈ ＥＤ（ＥＤまでのｍＭＡＲＣＫＳ）及びＭｙｒＥＤを使用して、Ｃｏｓ－７細胞に対して遺伝子移入を行った。分泌性の陽性対照について、Ｃｏｓ－７細胞に対して、ｍＣｈｅｒｒｙでタグ付加されたＢｉＰａを用いて遺伝子移入を行った。遺伝子移入されたＣｏｓ－７細胞を、遺伝子移入されたｍＣｈｅｒｒｙコンストラクト遺伝子移入２９３Ｔ細胞から作製された馴化培地中で処理された非遺伝子移入ＤＩＶ１５初代皮質ニューロン細胞と同時培養した。図４は、隣接する非遺伝子移入ニューロン細胞へ入る能力を有する蛍光画像コンストラクトを示す。
実施例２
［Ａ］エクソソームへと融合タンパク質を標的化するためのＭｙｒＥＤ変異体の設計。
融合タンパク質が小胞を標的とする能力を改善するために、ＭｙｒＥＤタンパク質の三十四（３４）個の変異体を設計した。図５は、本発明のために設計された様々なＭｙｒＥＤ配列のアライメントを示す。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対して、ｍＣｈｅｒｒｙに融合された、ＭｙｒＥＤタンパク質変異体、ＭｙｒＧａｇＯｎｌｙ（ＭｙｒＧａｇのみ）、ＭｙｒＥＤ６（配列番号３６）、ＭｙｒＥＤ７（配列番号３７）、ＭｙｒＥＤ８（配列番号３８）、ＭｙｒＥＤ９（配列番号３９）及びΔ４５－ＭＡＲＣＫＳ－ＥＤのそれぞれをコードするポリヌクレオチドを用いて遺伝子移入を行った。陰性対照のために、（１）モックｐ－シグナルで遺伝子移入されたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞及び（２）非遺伝子移入Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用した。Ｅｘｐｉ２９３発現培地中で細胞を増殖させた。馴化培地の蛍光強度は、図６Ａで示されるように、２４時間及び４８時間で測定した。ｍＣｈｅｒｒｙを含有するエクソソームを４８時間後に馴化培地から精製し、図６Ｂで示されるように、相対蛍光強度を測定した。図６Ｃは、この実験に対して試験した全てのＭｙｒＥＤ変異体においてｍＣｈｅｒｒｙがエクソソームへと標的化されたことを示すウエスタンブロット分析を示す。
同様に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対して、ｍＣｈｅｒｒｙと融合された、ＭｙｒＥＤタンパク質変異体、ＭｙｒＥＤ６（配列番号３６）、ＭｙｒＥＤ７（配列番号３７）、ＭｙｒＥＤ８（配列番号３８）、ＭｙｒＥＤ１０（配列番号４０）、ＭｙｒＥＤ１１（配列番号４１）、ＭｙｒＥＤ１２（配列番号４２）、ＭｙｒＥＤ１３（配列番号４３）、ＭｙｒＥＤ１４（配列番号４４）、ＭｙｒＥＤ１５（配列番号４５）、ＭｙｒＥＤ１６（配列番号４６）、ＭｙｒＥＤ１７（配列番号４７）、ＭｙｒＥＤ１８（配列番号４８）、ＭｙｒＥＤ１９（配列番号４９）、ＭｙｒＥＤ２０（配列番号５０）、ＭｙｒＥＤ２１（配列番号５１）、ＭｙｒＥＤ２２（配列番号５２）、ＭｙｒＥＤ２３（配列番号５３）、ＭｙｒＥＤ２４（配列番号５４）、ＭｙｒＥＤ２５（配列番号４４）及びＭｙｒＥＤ２６（配列番号５６）のそれぞれをコードするポリヌクレオチドを用いて遺伝子移入を行った。分泌型の陽性対照として、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に対してＢｉＰａ及びｍＣｈｅｒｒｙを用いて遺伝子移入を行った。陰性対照のために、（１）モックｐ－シグナルで遺伝子移入したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞及び（２）非遺伝子移入Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を使用した。細胞をＥｘｐｉ２９３発現培地中で増殖させた。図７Ａで示されるように、馴化培地の蛍光強度を４８時間及び９６時間で測定した。ｍＣｈｅｒｒｙを含有するエクソソームをＥｘｐｉ２９３発現培地から精製し、図７Ｂで示されるように相対蛍光強度を測定した。ｍＣｈｅｒｒｙを伴うＭｙｒＥＤ１３及びＭｙｒＥＤ１７をさらに使用して、Ｃｏｓ－７細胞に遺伝子移入した。図７Ｃは、ＭｙｒＥＤ１３及びＭｙｒＥＤ１７に対するＣＤ６３（右）と共局在するｍＣｈｅｒｒｙ（左）を示す。
実施例３
［Ａ］エクソソームを標的とするα－Ｄ－グルコピラノシドタンパク質の決定。
融合タンパク質、ＭｙｒＥＤ１３－ＧＡＡ－ＨＰＣ４をコードするコンストラクトを使用して、Ｃｏｓ－７細胞に対して遺伝子移入を行った。ＣＤ６３タンパク質は、エクソソームにおいて標的化される。図８Ａは、抗ＨＰＣ４に対する（右上）、及びエクソソームタンパク質ＣＤ６３に対する抗ＣＤ６３抗体（右下）に対する、免疫可視化された画像を示す。この図は、エクソソームタンパク質ＣＤ６３との融合タンパク質の共局在を示す。
細胞に対して、ＭｙｒＥＤ１３（配列番号４３）、ＭｙｒＥＤ１４（配列番号４４）及びＭｙｒＥＤ１７（配列番号４７）と融合されたＧＡＡタンパク質をコードするコンストラクトを用いて遺伝子移入を行った。細胞に対して分泌型の陽性対照としてＢｉＰ－ＧＡＡを用いて遺伝子移入を行った。陰性対照のために、（１）モックｐ－シグナルで遺伝子移入した細胞及び（２）非遺伝子移入細胞を使用した。細胞を発現培地中で増殖させた。融合タンパク質を含有するエクソソームを蛍光馴化培地から精製し、エスタン（ｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析を行った。図８Ｂは、融合タンパク質がエクソソームに標的化されたことを示す。
［Ｂ］エクソソームを標的とするＣＤＫＬ５タンパク質の決定。
ＭｙｒＥＤ１３（配列番号４３）、ＭｙｒＥＤ１４（配列番号４４）及びＭｙｒＥＤ１７（配列番号４７）とのＣＤＫＬ５タンパク質融合をコードするコンストラクトを用いて細胞に対して遺伝子移入を行った。分泌型の陽性対照として、Ｎ＿Ｔａｔｋ２８を用いて細胞に対して遺伝子移入を行った。陰性対照のために、（１）モックｐ－シグナルで遺伝子移入した細胞及び（２）非遺伝子移入細胞を使用した。細胞を発現培地中で増殖させた。融合タンパク質を含有するエクソソームを蛍光馴化培地から精製し、ウエスタンブロット分析を行った。図７Ｃは、融合タンパク質がエクソソームに標的化されたことを示す。
実施例４
［Ａ］インビボでのエクソソームの形質導入効率の決定。
融合タンパク質をコードする形質導入のためのコンストラクトを調製し、この融合タンパク質は、ＭｙｒＥＤ２７－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１６０）、ＭｙｒＥＤ７７－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１０７として示されるＭｙｒＥＤ７７）、ＭｙｒＥＤ８１－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１６１）又はＭｙｒＥＤ８８－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１６２）を含んだ。Ｂｉｐ－ｍＣｈｅｒｒｙを対照として使用した。さらに、各コンストラクトは、ＩＲＥＳ－ＧＦＰマーカーをさらに含んだ。マーカーは、形質導入された細胞を同定するために機能した。
各コンストラクトを使用して、マウス胚に形質導入した。具体的に、子宮内の胚の脳にプラスミドを直接注入し、及び／又はプラスミドが細胞に入ることを可能にするエレクトロポレーションを行った。次に、Ｅ１８．５に、４日後、胚を回収した。
ウエスタンブロットにおいてｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の有無について肝臓抽出物を分析した。図９は、肝臓におけるｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ発現のウエスタンブロット分析を示す。この分析は、潜在的な長距離のクロスコレクション及び血液脳関門からの回避を示唆する。
ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの存在について胚の脳切片に対して蛍光イメージングを行った。遺伝子移入された細胞のみがＧＦＰを発現し、一方でクロスコレクションを受けた細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙのみを発現した。図１０Ａ～１０Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙのＭｙｒＥＤ２７が介在する形質導入の画像分析を示す。図１０Ａは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１０Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１０Ｃは、そのマージ画像を示す。図９及び１０Ａ～１０Ｃの組み合わせた分析から、ＭｙｒＥＤ２７が軸索を標的とした及び膜結合性のコンストラクトであり、クロスコレクションのために使用され得ることが示唆される。しかし、１個又は２個の胚が肝臓においてｍＣｈｅｒｒｙの発現を示した。
図１１Ａ～１１Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙのＭｙｒＥＤ７７介在性形質導入の画像分析を示す。図１１Ａは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１１Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１１Ｃは、そのマージ画像を示す。図９及び１１Ａ～１１Ｃの組み合わせた分析から、ＭｙｒＥＤ７７が軸索に対する親和性を有し、このコンストラクトがクロスコレクションのために使用され得ることが示唆される。
図１２Ａ～１２Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙのＭｙｒＥＤ８１介在性形質導入の画像分析を示す。図１２Ａは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１２Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１２Ｃは、そのマージ画像を示す。図９及び１２Ａ～１２Ｃの組み合わせた分析から、ＭｙｒＥＤ８１がより低い発現を示したことが示唆される。しかし、このコンストラクトは、クロスコレクションのために使用され得る。
図１３Ａ～１３Ｃは、ｍＣｈｅｒｒｙのＭｙｒＥＤ８８介在性形質導入の画像分析を示す。図１３Ａは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１３Ｂは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１３Ｃは、そのマージ画像を示す。図９及び１３Ａ～１３Ｃの組み合わせた分析から、ＭｙｒＥＤ８８が設定において外れ値であることが示唆される。このコンストラクトはクロスコレクションのために使用され得るが、実質全体を通じて拡散シグナルがある。高倍率により、細胞外に分泌されるものと思われる、小さな赤い斑点が明らかになる。
図１４Ａ～１４Ｏは、陽性対照ＢｉＰ－ｍＣｈｅｒｒｙに対する、融合タンパク質、ＭｙｒＥＤ２７－ｍＣｈｅｒｒｙ、ＭｙｒＥＤ７７－ｍＣｈｅｒｒｙ、ＭｙｒＥＤ８１－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＭｒｙＥＤ８８－ｍＣｈｅｒｒｙの比較形質導入効率を示す。図１４Ａ、１４Ｄ、１４Ｇ、１４Ｊ及び１４Ｍは、ＧＦＰ遺伝子移入細胞を示し、図１４Ｂ、１４Ｅ、１４Ｈ、１４Ｋ及び１４Ｎは、ｍＣｈｅｒｒｙクロスコレクション細胞を示し、図１４Ｃ、１４Ｆ、１４Ｉ、１４Ｌ及び１４Ｏは、そのマージ画像を示す。画像分析からまた、クロスコレクションがＢｉＰ－ｍＣｈｅｒｒｙコンストラクトでは明らかではないことも示唆される。
結論として、ＭｙｒＥＤ２７コンストラクトは、軸索標的化及び膜結合性のコンストラクトである。緑／黄色細胞よりも赤い細胞が多く存在することから、ＭｙｒＥＤ２７介在性のクロスコレクションが示される。ウエスタンブロット分析によれば、１又は２個の胚が肝臓においてＭｙｒＥＤ２７介在性のｍＣｈｅｒｒｙ発現を示した。技術の特異性は顕著であり、他に影響を与えずに一方の脳半球に対して形質導入を行った。
実施例５
［Ａ］ＭｙｒＥＤを用いたＣＤＫＬ５標的化
ＭｙｒＥＤ２７（配列番号５７）及びＭｙｒＥＤ５３－６７（配列番号８３－９７）とのＣＤＫＬ５タンパク質融合をコードするコンストラクトを用いて細胞に対して遺伝子移入を行った。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において９μｌの馴化培地（ＣＭ）を遺伝子移入後７２時間で回収し、総タンパク質定量に基づいて正規化した５μｇのエクソソーム（ＥＸＯ）を個々のレーンに載せた。Ｑｉａｇｅｎ Ｅｘｏｅａｓｙ ｍａｘｉキットを使用して、５ｍｌの馴化培地からエクソソームを濃縮した。図１５Ｂは、融合タンパク質がエクソソームに標的化されたことを示すウエスタンブロットである。
実施例６
［Ａ］ＭｙｒＥＤでのＴＰＰ１標的化
細胞に対してＭｙｒＥＤ２７（配列番号５７）、ＭｙｒＥＤ５９（配列番号８９）、ＭｙｒＥＤ６０（配列番号９０）、ＭｙｒＥＤ６３（配列番号９３）、ＭｙｒＥＤ６４（配列番号９４）及びＭｙｒＥＤ６５（配列番号９５）と融合されたＴＰＰ１タンパク質をコードするコンストラクトを用いて遺伝子移入を行った。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において遺伝子移入の７２時間後に９μｌの馴化培地（ＣＭ）を回収し、総タンパク質定量に基づき正規化された４．５μｇのエクソソーム（ＥＸＯ）を個々のレーンに載せた。Ｑｉａｇｅｎ Ｅｘｏｅａｓｙ ｍａｘｉキットを使用して、５ｍｌの馴化培地からエクソソームを濃縮した。図１６は、融合タンパク質がエクソソームに標的化されたことを示すウエスタンブロットである。
実施例７
［Ａ］Ｃ末端のエクソソームを標的化するタグの試験
ＭｙｒＥＤ２７（配列番号５７）及びＭｙｒＥＤ８１～９４（配列番号１１１～１２４）と融合されたｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードするコンストラクトを用いて細胞に対して遺伝子移入を行い、これらの様々なＣ末端でタグ付加されたエクソソームに標的化される変異体を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光スクリーニングを行った。総タンパク質定量に基づいて正規化された１５μｇのエクソソームは、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉｄ５を使用して５７５Ｅｘ／６２０Ｅｍで読み取った。Ｑｉａｇｅｎ Ｅｘｏｅａｓｙ ｍａｘｉキットを使用して、５ｍｌの馴化培地からエクソソームを濃縮した。図１８は、融合タンパク質がエクソソームに標的化されたことを示す。
実施例８
［Ａ］ＭｙｒＥＤでのＧＡＡ標的化
細胞に対して、ＭｙｒＥＤ８１（配列番号１１１）、ＭｙｒＥＤ８８（配列番号１１８）、ＭｙｒＥＤ８９（配列番号１１９）及びＭｙｒＥＤ９３（配列番号１２３）と融合されたＧＡＡタンパク質をコードするコンストラクトを用いて遺伝子移入を行った。ＢｉＰタグ付加ＧＡＡコンストラクトを陰性対照とみなした。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における遺伝子移入から７２時間後に回収した５μｇの総細胞溶解物（ＬＹＳ）及び１２μｌの馴化培地（ＣＭ）を個々のレーンに載せた。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃエクソソーム単離キットパン、ヒト（ＭＡＣＳ）を使用して、２ｍｌの馴化培地からエクソソームを濃縮した。１００μｌの単離エクソソームを５０００ｇでスピンダウンし、１２μｌの上清（ＥＸＯ Ｓ／Ｎ）及び１２ｕｌのペレット化ビーズ（ＥＸＯビーズ）の両方を個々のレーンに載せた。図１９は、これらのＣ末端にタグ付加されたエクソソームに標的化される変異体におけるＧＡＡ（約１０５ｋＤａ）及びＣＤ９（約２０ｋＤａ）テトラスパニンマーカー発現を示すウエスタンブロットである。
実施例９
［Ａ］ＭｙｒＥＤでのＮＡＧＬＵ標的化
ＭｙｒＥＤ８１（配列番号１１１）、ＭｙｒＥＤ８８（配列番号１１８）、ＭｙｒＥＤ８９（配列番号１１９）及びＭｙｒＥＤ９３（配列番号１２３）に融合されたＮＡＧＬＵタンパク質をコードするコンストラクトを用いて細胞に対して遺伝子移入を行った。ＣＯＶ２ ＮＡＧＬＵ（Ｔ３４３Ｐ／Ａ１８１Ｌ）を陰性対照とみなした。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞での遺伝子移入から７２時間後に回収した５μｇの総細胞溶解物（ＬＹＳ）及び１２μｌの馴化培地（ＣＭ）を個々のレーンに載せた。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃエクソソーム単離キットパン、ヒト（ＭＡＣＳ）を使用して、２ｍｌの馴化培地からエクソソームを濃縮した。１００μｌの単離エクソソームを５０００ｇでスピンダウンし、１２μｌの上清（ＥＸＯ Ｓ／Ｎ）及び１２μｌのペレット化ビーズ（ＥＸＯビーズ）の両方を個々のレーンに載せた。図２０は、これらのＣ末端にタグ付加されたエクソソームに標的化された変異体におけるＮＡＧＬＵ（約８５ｋＤａ）及びＣＤ９（約２０ｋＤａ）テトラスパニンマーカー発現を示すウエスタンブロットである。
実施例１０
［Ａ］ＭｙｒＥＤでのＴＰＰ１標的化
細胞に対してＭｙｒＥＤ８１（配列番号１１１）、ＭｙｒＥＤ８９（配列番号１１９）及びＭｙｒＥＤ９３（配列番号１２３）と融合されたＴＰＰ１タンパク質をコードするコンストラクトを用いて遺伝子移入を行った。ＢｉＰ１タグ付加ＴＰＰ１コンストラクトを陰性対照とみなした。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞での遺伝子移入から７２時間後に回収した５μｇの総細胞溶解物（ＬＹＳ）及び１２μｌの馴化培地（ＣＭ）を個々のレーンに載せた。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃエクソソーム単離キットパン、ヒト（ＭＡＣＳ）を使用して、２ｍｌの馴化培地からエクソソームを濃縮した。１００μｌの単離されたエクソソームを５０００ｇでスピンダウンし、１２μｌの上清（ＥＸＯ Ｓ／Ｎ）及び１２μｌのペレット化ビーズ（ＥＸＯビーズ）の両方を個々のレーンに載せた。図２０は、これらのＣ末端にタグ付加されたエクソソームに標的化される変異体におけるＴＰＰ１（ＨＰＣ４ Ａｂ－約６５ｋＤａ）及びＣＤ９（約２０ｋＤａ）テトラスパニンマーカー発現を示すウエスタンブロットである。
配列リスト
配列番号１ ｖＭＳＰ＿００１
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧ
配列番号２ ｖＭＳＰ＿００２
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧ
配列番号３ ｖＭＳＰ＿００３
ＭＧＧＫＬＳ
配列番号４ ｖＭＳＰ＿００４
ＭＧＡＲＡＳＧＧ
配列番号５ ｖＭＳＰ＿００５
ＭＧＡＲＡＳ
配列番号６ ｖＭＳＰ＿００６
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳ
配列番号７ ｖＭＳＰ＿００７
ＭＧＳＫＬＴＣＣＬＧＧ
配列番号８ ｖＭＳＰ＿００８
ＭＧＮＩＬＴＣＣＩＮＳ
配列番号９ ｖＭＳＰ＿００９
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴ
配列番号１０ ｖＭＳＰ＿００１０
ＭＧＧＮＨＳＨＫＰＰ
配列番号１１ ｖＭＳＰ＿０１１
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳ
配列番号１２ ｖＭＳＰ＿０１２
ＭＧＡＲＡＳＧ
配列番号１３ ｖＥＤ＿００１
ＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬＳＧＦＳＦＫＫＮＫＫＡＳ
配列番号１４ ｖＥＤ＿００２
ＫＫＦＳＦＫＫＦＧ
配列番号１５ ｖＥＤ＿００３
ＫＫＦＳＦＫＫＮＫＫＧ
配列番号１６ ｖＥＤ＿００４
ＫＫＫＫＦＳＦＫＫＦＧ
配列番号１７ ｖＥＤ＿００５
ＫＫＫＫＦＡＦＫＫＦＧ
配列番号１８ ｖＥＤ＿００６
ＫＫＦＡＦＫＫＦＧ
配列番号１９ ｖＥＤ＿００７
ＫＫＫＫＫＲＦＡＦＫＫＡＦＫＬＡＧＦＡＦＫＫＮＫＫＡＧ
配列番号２０ ｖＥＤ＿００８
ＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳ
配列番号２１ ｖＥＤ＿００９
ＫＫＫＫＧ
配列番号２２ ｖＥＤ＿０１０
ＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬＡＧＦＳＦＫＫＮＫＫＡＳ
配列番号２３ ｖＥＤ＿０１１
ＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号２４ ｖＥＤ＿０１２
ＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳ
配列番号２５ ｖＥＤ＿０１３
ＫＫＫＫＫＦＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳ
配列番号２６ ｖＥＤ＿０１４
ＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧＧＧＧＧ
配列番号２７ ｖＥＤ＿０１５
ＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳ
配列番号２８ ｖＥＤ＿０１６
ＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳ
配列番号２９ ｖＥＤ＿０１７
ＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＡＳ
配列番号３０ ｖＥＤ＿０１８
ＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＧＬ
配列番号３１ ｖＭＹＲＥＤ＿００１
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＫＫＦＳＦＫＫＦＧ
配列番号３２ ｖＭＹＲＥＤ＿００２
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＫＫＦＳＦＫＫＮＫＫＧ
配列番号３３ ｖＭＹＲＥＤ＿００３
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＫＫＫＫＦＳＦＫＫＦＧ
配列番号３４ ｖＭＹＲＥＤ＿００４
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＫＫＫＫＦＡＦＫＫＦＧ
配列番号３５ ｖＭＹＲＥＤ＿００５
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＫＫＦＡＦＫＫＦＧ
配列番号３６ ｖＭＹＲＥＤ＿００６
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＲＦＡＦＫＫＡＦＫＬＡＧＦＡＦＫＫＮＫＫＡＧ
配列番号３７ ｖＭＹＲＥＤ＿００７
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号３８ ｖＭＹＲＥＤ＿００８
ＭＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧ
配列番号３９ ｖＭＹＲＥＤ＿００９
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬＡＧＦＳＦＫＫＮＫＫＡＳＧ
配列番号４０ ｖＭＹＲＥＤ＿０１０
ＭＧＡＲＡＳＧＧＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４１ ｖＭＹＲＥＤ＿０１１
ＭＧＡＲＡＳＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４２ ｖＭＹＲＥＤ＿０１２
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４３ ｖＭＹＲＥＤ＿０１３
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧ
配列番号４４ ｖＭＹＲＥＤ＿０１４
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４５ ｖＭＹＲＥＤ＿０１５
ＭＧＳＫＬＴＣＣＬＧＧＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４６ ｖＭＹＲＥＤ＿０１６
ＭＧＮＩＬＴＣＣＩＮＳＧＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４７ ｖＭＹＲＥＤ＿０１７
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４８ ｖＭＹＲＥＤ＿０１８
ＭＧＧＮＨＳＨＫＰＰＧＧＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号４９ ｖＭＹＲＥＤ＿０１９
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧ
配列番号５０ ｖＭＹＲＥＤ＿０２０
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧＧＧＧＧ
配列番号５１ ｖＭＹＲＥＤ＿０２１
ＭＧＡＲＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧＧＧＧＧ
配列番号５２ ｖＭＹＲＥＤ＿０２２
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧＧＧＧＧ
配列番号５３ ｖＭＹＲＥＤ＿０２３
ＭＧＡＲＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＰＦＫＬＳＧＬＳＦＫＲＮＲＫＡＳＧＧＧＧＧ
配列番号５４ ｖＭＹＲＥＤ＿０２４
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬＳＧＦＳＦＫＫＮＫＫＡＳＧ
配列番号５５ ｖＭＹＲＥＤ＿０２５
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＧＧＳＧＡＧＬＬＫＭＦＮＫＡＴＤＡＶＳＫＭＧＧＧＧＳＫＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬＳＧＦＳＦＫＫＮＫＫＡＳＧＧＧＧＧ
配列番号５６ ｖＭＹＲＥＤ＿０２６
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＧＧＳＧＡＧＬＬＫＭＦＮＫＡＴＤＡＶＳＫＭＧＧＧＧＳＧ
配列番号５７ ｖＭＹＲＥＤ＿０２７
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧ
配列番号５８ ｖＭＹＲＥＤ＿０２８
ＭＧＡＲＡＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧ
配列番号５９ ｖＭＹＲＥＤ＿０２９
ＭＧＡＲＡＳＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧ
配列番号６０ ｖＭＹＲＥＤ＿０３０
ＭＧＡＲＡＳＧＧＫＫＫＫＲＦＳＦＫＫＡＳＧ
配列番号６１ ｖＭＹＲＥＤ＿０３１
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＡＳＧ
配列番号６２ ｖＭＹＲＥＤ＿０３２
ＭＧＡＲＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧ
配列番号６３ ｖＭＹＲＥＤ＿０３３
ＭＧＡＲＡＳＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＧＬＬＫＭＦＮＫＡＴＤＡＶＳＫＭ
配列番号６４ ｖＭＹＲＥＤ＿０３４
ＭＧＡＲＡＳＧＧＧＧＳＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＧＬＬＫＭＦＮＫＡＴＤＡＶＳＫＭ
配列番号６５ ｖＭＹＲＥＤ＿０３５
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＫＳＧ
配列番号６６ ｖＭＹＲＥＤ＿０３６
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＰＲＲＡＲＳＶＫＳＧ
配列番号６７ ｖＭＹＲＥＤ＿０３７
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＳＲＲＫＲＥＶＫＳＧ
配列番号６８ ｖＭＹＲＥＤ＿０３８
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧ
配列番号６９ ｖＭＹＲＥＤ＿０３９
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＫＲＫＫＲＥＳＧ
配列番号７０ ｖＭＹＲＥＤ＿０４０
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＲＡＲＲＥＳＧ
配列番号７１ ｖＭＹＲＥＤ＿０４１
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＲＡＲＲＥＳＧ
配列番号７２ ｖＭＹＲＥＤ＿０４２
ＭＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＲＫＫＲＥＳＧ
配列番号７３ ｖＭＹＲＥＤ＿０４３
ＭＧＳＲＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＡＳＧ
配列番号７４ ｖＭＹＲＥＤ＿０４４
ＭＧＳＡＶＳＲＤＬＦＴＳＧ
配列番号７５ ｖＭＹＲＥＤ＿０４５
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬＫＳＧ
配列番号７６ ｖＭＹＲＥＤ＿０４６
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＰＲＲＡＲＳＶＫＳＧ
配列番号７７ ｖＭＹＲＥＤ＿０４７
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＳＲＲＫＲＥＶＫＳＧ
配列番号７８ ｖＭＹＲＥＤ＿０４８
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧ
配列番号７９ ｖＭＹＲＥＤ＿０４９
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＫＲＫＫＲＥＳＧ
配列番号８０ ｖＭＹＲＥＤ＿０５０
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＲＡＲＲＥＳＧ
配列番号８１ ｖＭＹＲＥＤ＿０５１
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＲＡＲＲＥＳＧ
配列番号８２ ｖＭＹＲＥＤ＿０５２
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＲＫＫＲＥＳＧ
配列番号８３ ｖＭＹＲＥＤ＿０５３
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＲＡＲＲＥＳＧ
配列番号８４ ｖＭＹＲＥＤ＿０５４
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号８５ ｖＭＹＲＥＤ＿０５５
ＭＧＳＲＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号８６ ｖＭＹＲＥＤ＿０５６
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＲＫＲＫＦＳＦＫＲＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号８７ ｖＭＹＲＥＤ＿０５７
ＭＧＧＬＦＳＲＷＲＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号８８ ｖＭＹＲＥＤ＿０５８
ＭＧＱＮＬＳＴＳＮＰＬＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号８９ ｖＭＹＲＥＤ＿０５９
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＡＡＲＡＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９０ ｖＭＹＲＥＤ＿０６０
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＡＡＲＡＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９１ ｖＭＹＲＥＤ＿０６１
ＭＧＬＱＡＣＬＬＧＬＦＡＬＩＬＳＧＫＣＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９２ ｖＭＹＲＥＤ＿０６２
ＭＧＶＲＨＰＬＣＳＲＲＬＬＡＶＣＡＬＶＳＬＡＴＡＡＬＬＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９３ ｖＭＹＲＥＤ＿０６３
ＭＧＫＳＥＳＱＭＤＩＴＤＩＮＴＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９４ ｖＭＹＲＥＤ＿０６４
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９５ ｖＭＹＲＥＤ＿０６５
ＭＧＱＱＰＡＫＳＭＤＶＲＲＩＥＧＧＥＬＬＬＮＱＬＡＧＲＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９６ ｖＭＹＲＥＤ＿０６６
ＭＧＱＩＶＴＦＦＱＥＶＰＨＶＩＥＥＶＭＮＩＶＬＩＡＬＳＶＬＡＶＬＫＧＬＹＮＦＡＴＣＧＬＶＧＬＶＴＦＬＬＬＣＧＲＳＣＴＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９７ ｖＭＹＲＥＤ＿０６７
ＭＧＱＬＩＳＦＦＱＥＩＰＶＦＬＱＥＡＬＮＩＡＬＶＡＶＳＬＩＡＶＩＫＧＩＩＮＬＹＫＳＧＬＦＱＦＩＦＦＬＬＬＡＧＲＳＣＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号９８ ｖＭＹＲＥＤ＿０６８
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＲＲＡＲＳＶＫＳＧ
配列番号９９ ｖＭＹＲＥＤ＿０６９
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＰＲＲＡＲＳＶＳＧ
配列番号１００ ｖＭＹＲＥＤ＿０７０
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＰＲＲＡＲＳＶＫＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１０１ ｖＭＹＲＥＤ＿０７１
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１０２ ｖＭＹＲＥＤ＿０７２
ＭＧＮＥＶＳＬＥＧＧＡＧＤＧＰＬＰＰＧＧＡＧＰＧＰＧＰＧＰＧＳＨＰＱＬＰＡＡＫＫＲＫＳＬＡＳＲＫＰＰＶＥＤＰＡＡＥＤＬＲＴＲ
配列番号１０３ ｖＭＹＲＥＤ＿０７３
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＰＲＲＡＲＳＶＫＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１０４ ｖＭＹＲＥＤ＿０７４
ＭＧＱＱＰＡＫＳＭＤＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１０５ ｖＭＹＲＥＤ＿０７５
ＭＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１０６ ｖＭＹＲＥＤ＿０７６
ＭＧＣＫＷＳＫＳＳＶＩＧＷＰＡＶＲＥＲＭＲＲＡＥＰＡＡＤＧＶＧＡＶＳＲＤＬＥＫＨＧＡＩＴＳＳＮＴＡＡＮＮＡＡＣＡＷＬＥＡＱＥＥＥＥＶＧＦＰＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１０７ ｖＭＹＲＥＤ＿０７７
ＭＧＣＫＷＳＫＳＳＶＩＧＷＰＡＶＲＥＲＭＲＲＡＥＰＡＡＤＧＶＧＡＶＳＲＤＬＥＫＨＧＡＩＴＳＳＮＴＡＡＮＮＡＡＣＡＷＬＥＡＱＥＥＥＥＶＧＦＰＧＧＧＳＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１０８ ｖＭＹＲＥＤ＿０７８
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫ
配列番号１０９ ｖＭＹＲＥＤ＿０７９
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＡＡＲＡＧＡＲＡＳＶＬＳＧＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１１０ ｖＭＹＲＥＤ＿０８０
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＡＡＲＡＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧ
配列番号１１１ ｖＭＹＲＥＤ＿０８１
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＡＩＴＣＬＳＦＩＴＦＹＶＡＡＦＭＶＬＬ
配列番号１１２ ｖＭＹＲＥＤ＿０８２
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＳＧＧＧＧＡＩＴＣＬＳＦＩＴＦＹＶＡＡＦＭＶＬＬ
配列番号１１３ ｖＭＹＲＥＤ＿０８３
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＡＲＩＫＦＳＴＧＳＨＣＨＧＳＦＳＬＩＦＬＳＬＷＡＶＩＦＶＬＹＱ
配列番号１１４ ｖＭＹＲＥＤ＿０８４
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＫＬＬＮＡＴＡＣＤＧＥＬＳＳＳＧＴＳＳＳＫＧＩＩＦＹＶＬＦＳＩＬＹＬＩＦ
配列番号１１５ ｖＭＹＲＥＤ＿０８５
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＲＲＮＶＡＲＹＧＲＴＶＶＶＳＧＳＨＡＡＡＶＡＰＧ
配列番号１１６ ｖＭＹＲＥＤ＿０８６
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＬＧＱＬＥＡＳＣＲＴＮＹＧＹＳＡＡＰＳＬＨＬＰＰＧＳＬＬＡＳＬＶＰＬＬＬＬＳＬＰ
配列番号１１７ ｖＭＹＲＥＤ＿０８７
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＲＴＮＹＧＹＳＡＡＰＳＬＨＬＰＰＧＳＬＬＡＳＬＶＰＬＬＬＬＳＬＰ
配列番号１１８ ｖＭＹＲＥＤ＿０８８
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号１１９ ｖＭＹＲＥＤ＿０８９
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号１２０ ｖＭＹＲＥＤ＿０９０
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号１２１ ｖＭＹＲＥＤ＿０９１
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＣＶＩＭ
配列番号１２２ ｖＭＹＲＥＤ＿０９２
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＲＣＶＩＭ
配列番号１２３ ｖＭＹＲＥＤ＿０９３
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＶＩＭ
配列番号１２４ ｖＭＹＲＥＤ＿０９４
ＡＳＧＧＧＧＳＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＳＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＣＬＬ
配列番号１２５ ｖＭＹＲＥＤ＿０９５
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧ
配列番号１２６ ｖＭＹＲＥＤ＿０９６
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧ
配列番号１２７ ｖＭＹＲＥＤ＿０９７
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧ
配列番号１２８ ｖＭＹＲＥＤ＿０９８
ＭＧＱＱＰＡＫＳＭＤＶＲＲＩＥＧＧＥＬＬＬＮＱＬＡＧＲＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧ
配列番号１２９ ｖＭＹＲＥＤ＿０９９
ＭＧＱＱＰＡＫＳＭＤＶＲＲＩＥＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧ
配列番号１３０ ｖＭＹＲＥＤ＿１００
ＭＧＱＱＰＡＫＳＭＤＶＲＲＩＥＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧ
配列番号１３１ ｖＭＹＲＥＤ＿１０１
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧ
配列番号１３２ ｖＭＹＲＥＤ＿２７ｂ
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＰＲＲＡＲＳＶＫＳＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＧ
配列番号１３３ ｖＭＹＲＥＤ＿２７ｃ
ＭＧＳＣＶＳＲＤＬＦＴＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＡ
配列番号１３４ ｖＭＹＲＥＤ＿６４ｂ
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＧＰＲＲＡＲＳＶＫＳＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＡ
配列番号１３５ ｖＭＹＲＥＤ＿６４ｃ
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＡ
配列番号１３６ ｖＭＹＲＥＤ＿６４ｄ
ＭＧＮＥＡＳＬＥＧＧＡＧＥＧＰＬＰＰＧＧＳＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＡ
配列番号１３７ ｖＭＹＲＥＤ＿６５ｃ
ＭＧＱＱＰＡＫＳＭＤＶＲＲＩＥＧＧＥＬＬＬＮＱＬＡＧＲＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＳＧＧＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫＡ
配列番号１３８ ｖＭＹＲＥＤ＿６５ｄ
ＭＧＱＱＰＡＫＳＭＤＶＲＲＩＥＧＧＥＬＬＬＮＱＬＡＧＲＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＡＳＧＧＧＫＳＲＲＥＶＥＡ
配列番号１３９ ｖＭＹＲＥＤ＿８１ｂ
ＡＳＧＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＲＰＲＡＶＰＴＱＳＧＧＧＳＧＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＡＩＴＣＬＳＦＩＴＦＹＶＡＡＦＭＶＬＬ
配列番号１４０ ｖＭＹＲＥＤ＿８８ｂ
ＡＳＧＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＲＰＲＡＶＰＴＱＳＧＧＧＳＧＧＧＧＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号１４１ ｖＭＹＲＥＤ＿８９ｂ
ＡＳＧＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＲＰＲＡＶＰＴＱＳＧＧＧＳＧＧＧＧＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ
配列番号１４２ ｖＭＹＲＥＤ＿９３ｂ
ＡＧＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＲＰＲＡＶＰＴＱＳＧＧＧＳＧＧＧＧＫＫＫＫＫＦＳＦＫＫＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＶＩＭ
配列番号１４３ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０１
Ｇ
配列番号１４４ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０２
ＳＧ
配列番号１４５ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０３
ＧＧ
配列番号１４６ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０４
ＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１４７ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０５
ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ
配列番号１４８ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０６
ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１４９ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０７
ＧＧＳＧＡＧＬＬＫＭＦＮＫＡＴＤＡＶＳＫＭＧＧＧＧＳ
配列番号１５０ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０８
ＧＧＳＧＡＧＬＬＫＭＦＮＫＡＴＤＡＶＳＫＭＧＧＧＧＳＧ
配列番号１５１ ｖＬＩＮＫＥＲ＿０９
ＳＳＧ
配列番号１５２ ｖＬＩＮＫＥＲ＿１０
ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ
配列番号１５３ ｖＬＩＮＫＥＲ＿１１
ＧＧＳＧ
配列番号１５４ ｖＳＮＸ１＿０１
ＬＬＫＭＦＮＫＡＴＤＡＶＳＫＭ
配列番号１５５ ｖＢＩＰ＿０１
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＡＡＲＡ
配列番号１５６ ＭＢＩＰ
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＡＡＲＡ
配列番号１５７ ＭＢＩＰ２
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＷＶＡＬＬＬＬＳＡＡＲＡ
配列番号１５８ ＭＢＩＰ３
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＳＬＶＡＬＬＬＬＳＡＡＲＡ
配列番号１５９ ＭＢＩＰ４
ＭＫＬＳＬＶＡＡＭＬＬＬＬＡＬＶＡＬＬＬＬＳＡＡＲＡ
配列番号１６０ ｖＭｙｒＥＤ２７－ｍＣｈｅｒｒｙ
Figure 2023537070000002
 配列番号１６１ ｖＭｙｒＥＤ８１－ｍＣｈｅｒｒｙ
Figure 2023537070000003
 配列番号１６２ ｖ ＭｙｒＥＤ８８－ｍＣｈｅｒｒｙ
Figure 2023537070000004
 配列番号１６３ ｖＭｙｒＥｄ６４－ｍＣｈｅｒｒｙ
Figure 2023537070000005
 配列番号１６４ ｖ ＭｙｒＥＤ８９－ｍｃｈｅｒｒｙ
Figure 2023537070000006
 配列番号１６５：ＫＲＡＳ４ｂ
ＣＶＩＭ

Claims (94)

  1. エフェクタードメイン（ＥＤ）ドメインに連結されるシグナルドメインを含む膜結合型ＥＤタンパク質であって、
    ａ． 前記シグナルドメインが前記エフェクタードメインに直接連結されるか；又は
    ｂ． 前記シグナルドメインが少なくとも第１のリンカーペプチドにより前記エフェクタードメインに連結され、前記第１のリンカーペプチドが、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有する、膜結合型ＥＤタンパク質。
  2. 前記シグナルドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  3. 前記シグナルドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも９０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  4. 前記シグナルドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  5. 前記ＥＤドメインが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  6. 前記ＥＤドメインが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも９０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  7. ＥＤドメインが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  8. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  9. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも９０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  10. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  11. 湾曲感知ドメインをさらに含む、請求項１～１０の何れか１項に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  12. 膜結合型ＥＤタンパク質のＮ末端がメチオニンを持たない、請求項１～１１の何れか１項に記載の膜結合型ＥＤタンパク質。
  13. 請求項１～１２の何れかに記載の膜結合型ＥＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  14. 小胞を標的とするタンパク質と、関心対象のタンパク質と、を含む融合タンパク質であって、前記小胞を標的とするタンパク質が、脂質複合ドメインと、エフェクタードメイン（ＥＤ）と、を含み；
    （ａ） 前記小胞を標的とするタンパク質が、前記エフェクタードメイン（ＥＤ）に直接連結される脂質複合ドメインを含むか；又は
    （ｂ） 前記小胞を標的とするタンパク質が、第２のリンカーペプチドにより前記エフェクタードメイン（ＥＤ）に連結される脂質複合ドメインを含み、前記第２のリンカーペプチドが、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２又は配列番号１５３に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
  15. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  16. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２に対する少なくとも９０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  17. 配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１又は配列番号１４２を含むアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  18. 前記脂質複合ドメインが、１つ以上のシグナルドメインを含み、前記シグナルドメインが、ミリストイル化シグナルドメイン、パルミトイル化シグナルドメイン、プレニル化シグナルドメイン、グリコシルホスファチジルインシトン（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｓｉｔｏｎ）アンカータンパク質及びＢｉＰ分泌シグナルドメインの１つ以上を含む、請求項１４に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  19. 前記脂質複合ドメインが前記ミリストイル化シグナルドメインである、請求項１８に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  20. 前記シグナルドメインのアミノ酸配列が、タンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１又はＢＡＳＰ１ファミリーのミリストイル化シグナルドメインに対する少なくとも７０％の類似性を有する、請求項１８又は１９に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  21. 前記シグナルドメインのアミノ酸配列が、タンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１又はＢＡＳＰ１ファミリーのミリストイル化シグナルドメインに対する少なくとも９０％の類似性を有する、請求項１８又は１９に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  22. シグナルドメインのアミノ酸配列が、タンパク質のＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１又はＢＡＳＰ１ファミリーのミリストイル化シグナルドメインに対する１００％の類似性を有する、請求項１８又は１９に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  23. 前記シグナルドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１９に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  24. 前記シグナルドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５に対する少なくとも９０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１９に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  25. 前記シグナルドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６５を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項２０に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  26. 前記ＥＤドメインが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも７０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１９～２５の何れか１項に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  27. 前記ＥＤドメインが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に対する少なくとも９０％の配列類似性を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１９～２５の何れか１項に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  28. 前記ＥＤドメインが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０を含むアミノ酸配列を有し、但し、前記膜結合型ＥＤタンパク質の得られるアミノ酸配列が配列番号３８ではない、請求項１９～２５の何れか１項に記載の小胞を標的とするタンパク質。
  29. 前記小胞を標的とするタンパク質が、Ｎｅｆタンパク質又はその変異体を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
  30. 前記小胞を標的とするタンパク質が、エクソソーム及び細胞外小胞の１つ以上を標的とする、請求項１４～２９の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  31. 前記関心対象のタンパク質が治療用タンパク質である、請求項１４～３０の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  32. 前記治療用タンパク質がリソソームタンパク質を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  33. 前記治療用タンパク質が、ＣＤＫＬ５、アルファ－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、イズロニダーゼ、アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、グリコサミノグリカンアルファ－Ｌ－イズロノヒドロラーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガングリオシドシアリダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、ベータ－Ｄ－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、バッテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ）、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ及び他のバッテン関連タンパク質又は酵素的に活性であるそれらの断片を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  34. セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質３、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質４、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質５、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質６、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質７、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質８、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１９、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１０、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１１、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１２、セロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１３及びセロイド－リポフスチン沈着症神経タンパク質１４を含む、請求項３１に記載のバッテン関連タンパク質。
  35. 前記治療用タンパク質が、ホルモン及び増殖及び分化因子を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  36. 前記ホルモン及び増殖及び分化因子が、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン増殖因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）、形質転換増殖因子、ヘレグリン増殖因子、ニューレグリン増殖因子、ＡＲＩＡ増殖因子、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３、ニューロトロフィンＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン、コラプシン、ネトリン－１、ネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ又はチロシンヒドロキシラーゼを含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。
  37. 前記形質転換増殖因子が、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－２）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－３）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－４）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－５）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－６）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－７）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－８）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－９）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１０）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１１）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１２）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１３）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１４）又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ－１５）を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
  38. 前記治療用タンパク質が、免疫系調節タンパク質を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  39. 前記免疫系調節タンパク質が、サイトカイン及びリンホカインを含み、サイトカイン及びリンホカインが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１６（ＩＬ－１６）、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－１９（ＩＬ－１９）、インターロイキン－２０（ＩＬ－２０）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）、インターロイキン－２３（ＩＬ－２３）、インターロイキン－２４（ＩＬ－２４）、インターロイキン－２５（ＩＬ－２５）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子又はｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドを含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。
  40. 前記治療用タンパク質が、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ ＭＨＣ分子、クラスＩＩ ＭＨＣ分子、改変免疫グロブリン又は改変ＭＨＣ分子を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  41. 前記治療用タンパク質が、補体調節タンパク質を含み、前記補体調節タンパク質が、メンブレンコファクタープロテイン（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２又はＣＤ５９を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  42. 前記治療用タンパク質が、前記ホルモン、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、調節タンパク質又は免疫系タンパク質に対する受容体を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  43. 前記治療用タンパク質が、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体又はスカベンジャー受容体を含むコレステロール調節及び／又は脂質調整のための受容体を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  44. 前記治療用タンパク質が、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体又は他の核内受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーを含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  45. 前記治療用タンパク質が、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニン、ＥＴＳ－ボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴ－ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ－結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡ－ボックス結合タンパク質又はウィングドヘリックスタンパク質のフォークヘッドファミリーを含む転写因子を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  46. 前記治療用タンパク質が、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）ベータ－シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラート、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列及びジストロフィン遺伝子産物を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  47. 前記治療用タンパク質が、血友病Ｂ及び血友病Ａを含む血友病の処置のために使用されるタンパク質を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  48. 前記治療用タンパク質が、挿入、欠失又はアミノ酸置換を含有する非天然のアミノ酸配列を有するキメラ又はハイブリッドポリペプチドなどの非天然ポリペプチドを含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  49. 前記治療用タンパク質が、単鎖改変免疫グロブリン、アンチセンス分子及び触媒的核酸を含む非天然ポリペプチドを含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  50. 前記治療用タンパク質が、細胞受容体及び「自己」に対する抗体を産生する細胞を含む自己免疫に関連する標的に対してブロードベースの（ｂｒｏａｄ ｂａｓｅｄ）防御的免疫応答を付与することにより自己免疫疾患及び障害に罹患している個体を処置するために有用なタンパク質を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。
  51. 前記細胞受容体がＴ細胞受容体を含む、請求項５０に記載の融合タンパク質。
  52. 前記自己免疫疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む、請求項５０又は５１に記載の融合タンパク質。
  53. 前記融合タンパク質が、１つ以上の湾曲感知ドメインを含む、請求項１４～５２の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  54. 第３のリンカーペプチドをさらに含み、前記第３のリンカーペプチドが、
    （ａ）前記小胞を標的とするタンパク質と関心対象のタンパク質との間；又は
    （ｂ）融合タンパク質の末端の間
    に位置する、請求項１４～５３の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  55. 前記第３のリンカーペプチドが、スペーサーペプチド、膜貫通ドメイン及び小胞外ドメインの１つ以上を含む、請求項５４に記載の融合タンパク質。
  56. 前記第３のリンカーペプチドが、親和性タグ、リンカーペプチド、プロテアーゼ切断部位、分泌シグナルペプチド、細胞標的化ドメイン、レポーター、酵素又はそれらの組み合わせの１つ以上を含む、請求項５４の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  57. 融合タンパク質のＮ末端がメチオニンを持たない、請求項１４～５６の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  58. 請求項１４～５７の何れか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
  59. 脂質と複合化される、請求項１４～５８の何れかに記載の融合タンパク質。
  60. ミリストイル化により複合化される、請求項５９に記載の融合タンパク質。
  61. パルミトイル化により複合化される、請求項５９に記載の融合タンパク質。
  62. プレニル化により複合化される、請求項５９に記載の融合タンパク質。
  63. グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質により複合化される、請求項５９に記載の融合タンパク質。
  64. 脂質小胞へと再構成される、請求項１４～６３の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  65. 請求項１４～６３の何れか１項に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、前記融合タンパク質を発現させ、エクソソームを単離し、前記融合タンパク質を精製することを含む、方法。
  66. 脂質複合化をさらに含む、請求項６５に記載の融合タンパク質を作製する方法。
  67. 脂質複合化がミリストイル化により行われる、請求項６６に記載の方法。
  68. 脂質複合化がパルミトイル化により行われる、請求項６６に記載の方法。
  69. 脂質複合化がプレニル化により行われる、請求項６６に記載の方法。
  70. 脂質複合化がグリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質により行われる、請求項６６に記載の方法。
  71. 前記融合タンパク質を脂質小胞へと再構成することをさらに含む、請求項６５～７０の何れか１項に記載の方法。
  72. 前記融合タンパク質が、間葉系幹細胞、多発性骨髄腫細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＯＳ７細胞、ＨＡＰ１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、マウス初代筋芽細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞又はそれらの変異体において発現される、請求項６４～７１の何れか１項に記載の方法。
  73. 請求項１４～６４の何れか１項に記載の融合タンパク質と、
    薬学的に許容可能な担体と、
    を含む製剤処方物。
  74. 疾患又は障害の処置を必要とする患者に請求項７３に記載の製剤処方物を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法。
  75. 対象に請求項７３に記載の製剤処方物を予防的に投与することを含む、疾患又は障害を予防する方法。
  76. 前記製剤処方物が、くも膜下腔内、頭蓋内、大槽内（ｉｎｔｒａ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａｌｌｙ）、静脈内、大槽内、脳室内又は実質内の１つ以上を介して投与される、請求項７４又は７５に記載の方法。
  77. 請求項７３～７６の何れか１項に記載の医薬組成物と、使用のための説明書と、を含むキット。
  78. 遺伝子治療送達系と；
    改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
    を含み、前記改変タンパク質が、小胞を標的とするタンパク質と、関心対象のタンパク質と、を含む、遺伝子治療組成物。
  79. 前記改変タンパク質が、請求項１４～５７の何れか１項に記載の融合タンパク質を含む、請求項７８に記載の遺伝子治療組成物。
  80. 前記遺伝子治療送達系が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－９）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はＺＮＦ（ジンクフィンガータンパク質）の１つ以上を含む、請求項７８又は７９に記載の遺伝子治療組成物。
  81. 前記遺伝子治療送達系が、ベクター、リポソーム、脂質核酸ナノ粒子、エクソソーム及び遺伝子編集系の１つ以上を含む、請求項７８又は７９に記載の遺伝子治療組成物。
  82. 前記遺伝子治療送達系が、ウイルスベクターを含む、請求項７８又は７９に記載の遺伝子治療組成物。
  83. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターの１つ以上を含む、請求項８２に記載の遺伝子治療組成物。
  84. 前記ウイルスベクターが、前記改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されるウイルスポリヌクレオチドを含む、請求項８２又は８３に記載の遺伝子治療組成物。
  85. 前記ウイルスベクターが、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む、請求項８２～８４の何れか１項に記載の遺伝子治療組成物。
  86. 前記ウイルスベクターが、ＳＶ４０イントロン、ポリアデニル化シグナル又は安定化エレメントの１つ以上を含む、請求項８２～８５の何れか１項に記載の遺伝子治療組成物。
  87. 前記遺伝子治療送達系がプロモーターを含む、請求項７８～８６の何れか１項に記載の遺伝子治療組成物。
  88. 前記遺伝子治療送達系が、リーダーシグナルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項７８～８７の何れか１項に記載の遺伝子治療組成物。
  89. 薬学的に許容可能な担体と、請求項７８～８８の何れか１項に記載の遺伝子治療組成物と、を含む、遺伝子治療組成物処方物。
  90. 疾患又は障害の処置を必要とする患者に請求項８９に記載の遺伝子治療組成物処方物を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法。
  91. 対象に請求項８９に記載の遺伝子治療組成物処方物を予防的に投与することを含む、疾患又は障害を予防する方法。
  92. 前記遺伝子治療組成物が、くも膜下腔内、静脈内、大槽内、脳室内又は実質内の１つ以上を介して投与される、請求項９０又は９１に記載の方法。
  93. 前記遺伝子治療組成物が、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、リンパ内、眼窩周囲、くも膜下腔内及び関節内又はそれらの組み合わせで投与される、請求項９０又は９１に記載の方法。
  94. 請求項７８～９３の何れか１項に記載の遺伝子治療組成物と、使用のための説明書と、を含む、キット。
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