ES2226029T3 - Vector y linea celular de mamifero con productividad mejorada. - Google Patents

Vector y linea celular de mamifero con productividad mejorada.

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Abstract

SE DESCRIBE UN VECTOR MEJORADO PARA INTRODUCIR UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA HETEROLOGA, EN UNA LINEA CELULAR DE MAMIFERO PARA AUMENTAR LA EXPRESION DE LA PROTEINA. EL VECTOR INCLUYE UNA SECUENCIA DE ADNC QUE CODIFICA LA PROTEINA, UN PRIMER PROMOTOR Y UN INTRON DONANTE CADENA ABAJO, ESTANDO EL PRIMER PROMOTOR Y EL INTRON DONANTE CADENA ABAJO COLOCADOS ENTRE UN SEGUNDO PROMOTOR Y UN ACEPTOR DE INTRON DONANTE. EN UN EJEMPLO ILUSTRATIVO, LA SECUENCIA CODIFICA PARA EL FACTOR VIII, Y SE ASEGURA LA ELEVADA PRODUCTIVIDAD DE UNA LINEA CELULAR TRANSFECTADA MEDIANTE EL ESTABLECIMIENTO DE UN INDICE DE AMPLIFICACION MINIMO, QUE AL CONTRARIO QUE EN LA PRACTICA ACTUAL, SE ENFOCA EN LA UTILIZACION DE LINEAS CELULARES QUE PRESENTAN UNA PRODUCTIVIDAD RELATIVAMENTE BAJA ANTES DE LA AMPLIFICACION.

Description

Vector y línea celular de mamíferos con productividad mejorada.
Antecedentes de la invención
Campo: Esta invención se refiere generalmente a la producción de proteínas biológicamente activas a partir de líneas celulares de mamíferos modificadas por ingeniería genética. Específicamente, la invención se refiere a un vector novedoso y un procedimiento de selección de células que potencia la productividad de las líneas celulares. La invención es especialmente útil para la producción aumentada del factor VIII recombinante.
Técnica anterior: la amplificación génica es una estrategia que se ha aplicado ampliamente para aumentar la producción de proteínas en células de mamíferos. Una unidad de transcripción (cDNA) que codifica una proteína de interés se une normalmente de manera covalente a un marcador que se puede amplificar. La unidad de transcripción y el marcador se cotransfieren después en una célula apropiada, seguido de selección y coamplificación.
La estrategia de transfección y amplificación génica más ampliamente usada implica el uso de vectores de expresión de la dihidrofolatorreductasa (DHFR) junto con células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en DHFR (Kellems, Curr. Op. Biotech. 2: 723 - 729, 1991). Se han producido numerosas proteínas valiosas comercialmente que incluyen activador de plasminogenes tisulares, eritropoyetina, y factor VIII mediante esta estrategia (véase el documento de Estados Unidos 4.740.461 de Kaufman y Kaufman, y col., Mol. Cell. Biol. 5 (7): 1750 - 1759, 1985). Debido a la presencia del gen endógeno de DHFR, generalmente esta estrategia no se ha extendido a los huéspedes de células que no son deficientes en DHFR. Sin embargo, se ha descrito un éxito limitado cuando los huéspedes de células DHFR* se usaron para expresar proteínas terapéuticas. La patente de Estados Unidos 4.965.199 (Wood y col., 1990) describe un procedimiento para producir el factor VIII en células de riñón de hámsteres infantiles (BHK - 21) de DHFR*. Este procedimiento implica (i) la cotransfección de células huésped con una secuencia de DNA que codifica el factor VIII unida a una segunda secuencia de DNA que codifica DHFR, y un marcador seleccionable que confiere resistencia a neomicina, (ii) selección de transfectantes en un medio selectivo que contiene G418, y (iii) amplificación de células resistentes al G418 en medios que contienen cantidades crecientes de metotrexato (MTX).
Wall y col., (Gene, 81: 139 - 149, 1989) han informado sobre el uso de la estrategia de de coamplificación de DHFR/MTX que expresa la proteína C funcional en células 293 humanas. Okamoto y col., (Biotechnol., 8: 550 - 553, 1990) han descrito la amplificación y expresión del factor de estimulación de colonias de granulocitos (abreviadamente en inglés GM - CSF) en células linfoides humanas.
A pesar de los recientes avances en las técnicas de DNA recombinante, ha continuado siendo difícil la derivación de clones de células recombinantes con alta productividad para el factor VIII. La solicitud de patente europea Nº 0260148 (Gorman, publicada el 17 de septiembre de 1987) e incorporada en esta memoria descriptiva como referencia describe la construcción de un vector de expresión (pCIS - F8) que tiene una secuencia estabilizadora hacia abajo de un promotor y hacia arriba del DNA que codifica el factor VII. El vector se construyó con un citomegalovirus o promotor de CMV y potenciador, un cDNA que codifica el factor VIII y una secuencia de terminación en 3'. En la ausencia de esta secuencia estabilizadora, no se observó la expresión del factor VIII en cualquier tipo de células ensayado.
Mediante la cotransfección de células 293S humanas con pCIS - F8 y un vector de expresión del plásmido que confiere resistencia a neomicina, se obtuvieron líneas celulares recombinantes con productividad moderada (0,1 - 0,2 uU/c(d) para el factor VIII. Sin embargo, sorprendentemente fallaron numerosos intentos para amplificar un gran número de poblaciones y clones a partir de diversos experimentos de transfección para generar clones de alta producción después de la amplificación extensiva en metotrexato (hasta 1 -2 uM). La amplificación se hizo como se describe en las patentes de Estados Unidos 4.740.461 (Kaufman) y 4.965.199. (Wood y col.).
Se ha encontrado que el nivel de expresión de una proteína tal como el factor VIII se puede aumentar significativamente modificando un vector usado para transfectar una célula de mamífero. Los detalles de la modificación y su uso se describen más adelante.
Sumario de la invención
El vector de esta descripción comprende una proteína que codifica una secuencia, un primer promotor y un intrón donante hacia abajo, el primer promotor e intrón donante hacia abajo que esta localizado entre un segundo promotor y un aceptor de intrón donante. En una realización preferida la secuencia codifica el factor VIII (también conocido como FVIIIC o FVIII: C) y el vector es pCAIS - F8. La secuencia codificadora también puede ser para derivados del factor VIII, variantes o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.045.455). El vector se usa para introducir el DNA apropiado que codifica una secuencia para una proteína heteróloga en células de mamíferos para incrementar la expresión de proteínas mediante las células.
Esta descripción también describe un procedimiento mejorado para seleccionar poblaciones de células que se pueden amplificar para una proteína deseada de manera que se puede llevar a cabo la producción continua de la proteína y con alta productividad.
Un marcador que se puede amplificar preferido es DHFR aunque se pueden sustituir otros marcadores tales como la glutamina sintetasa (abreviadamente GS) y resistencia a multifármacos (MDR). El huésped de las células a transfectar puede ser cualquier célula de mamífero y no necesita ser deficiente en DHFR. Son mejores las líneas celulares que se sabe que integran genes de selección en su DNA cromosómico; por ejemplo, líneas de riñón embrionario humano (2935), de ovario de hámster chino (abreviadamente en inglés CHO), de riñón de hámster infantil (BHK - 21), de mieloma, y de hepatoma tales como las células HepG2, y similares.
La productividad de una línea celular de mamífero se puede potenciar estableciendo un índice mínimo de amplificabilidad que, contrario a la práctica actual, se focaliza sobre el uso de líneas celulares que tienen relativamente baja productividad después de una selección inicial y miniclonación, pero antes de la amplificación. Según la descripción, las células seleccionadas deben tener un índice de amplificabilidad (\Delta E = Y/X) > 3 donde X = producción de la células antes de la primera amplificación e Y = producción de la células después de la primera amplificación.
Breve descripción de las figuras
La figura 1a muestra el vector de la técnica anterior pCIS - F8.
La figura 1b muestra el vector pCAIS - F8 de la descripción.
La figura 2a muestra un mapa lineal del donante_{2} - intrón_{2} - aceptor (D2I2A) del promotor del CMV de la figura 1a.
La figura 2b muestra un mapa lineal de la localización del promotor de AML y donante^{1} - intrón^{1} en relación con el promotor de CMV y donante^{2}- intrón^{2} - aceptor de la figura 1b.
La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos del promotor tardío principal de adeno y su intrón.
La figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra el procedimiento de selección global de esta descripción y el cálculo de \DeltaE.
La figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra el esquema de construcción del vector pCAIS - F8.
Realizaciones específicas Ejemplo 1 Construcción de los vectores de expresión
Los vectores de expresión pCIS - F8 y pSV_{2} - neoBa16 se construyeron como se describe en la solicitud de patente europea Nº 0260148. El vector de expresión mejorado (designado pCAIS- F8) se construyó insertando el promotor tardío principal de adeno que incluye la secuencia de intrón en 3' inmediata (+1 a +132 con respecto al sitio CAP, Figura 2) en el sitio SacII del vector conocido pCIS - F8 usando la técnica recombinante habitual (Maniatis, 1990). Este fragmento SacII de 382 pares de bases se aisló a partir de pAML3p.8cl como se describe en la patente de Estados Unidos 4.965.199 de Wood y col.
En resumen, un fragmento de 382 pares de bases se purificó sobre gel después de la digestión de 50 ug de pAML3p.8cl con SacII. Después este fragmento se ligó a pCIS - F8 que se ha linealizado con SacII. Después de 4 horas de ligación a 20ºC, se usaron 50 ng de mezcla de ligación para transformar DH5\alpha de E. coli. La clonación con éxito del promotor de AML y las secuencias intrónicas se confirmó mediante secuenciación (figura 2). El esquema de construcción del vector se muestra en la figura 5.
Ejemplo 2 Derivación de los clones de células estables con alta productividad
La producción de líneas celulares se estableció mediante cotransfección de 5 x 10^{5} células con 10 ug de pCIS - F8 o pCAIS - F8 y 10 ug de pSV_{2} - neoBa16 usando el procedimiento de lipofección según las instrucciones del fabricante. Un experimento de transfección típico implica 2,5 x 10^{6} células (GIBCO). Las transfecciones múltiples se realizan normalmente simultáneamente. Dos días después de la transfección, las células se tripsinizaron, se sembraron en una placa de 48 pocillos (CoStar, área de crecimiento = 100 mm^{2}), y se desarrollaron en un medio selectivo (DMEM/F12, relación de peso = 1:1) que contenía G148 (400 ug/ml). La productividad del factor VIII de las células resistentes al G418 se ensayaron hasta aproximadamente 50% de confluencia (aproximadamente 3 semanas después del comienzo de la selección) mediante un procedimiento de sustrato cromogénico según las instrucciones del fabricante (Coatest, Kabi). Después las células se dejaron crecer hasta confluencia en un medio (DMEM/F12, 1:1, deficiente en glicina, hipoxantina, y timidina) que contenía metotrexato 50 nM. Esta etapa de amplificación inicial lleva aproximadamente 3 semanas. Después las células resistentes a metotrexato se ensayaron para la productividad del factor VIII.
Procedimiento de selección de líneas célulares
Después se determino un "índice delta E (\DeltaE)" de cada población. Un índice \DeltaE se define como \DeltaE = Y/X donde X = productividad antes de la selección con metotrexato 50 nM e Y = productividad después de la selección por metotrexato 50 nM. Una transfección típica implicaría la selección de 220 - 440 poblaciones de células transfectadas. Las poblaciones celulares con un \DeltaE > 3 se subclonaron y se amplificaron posteriormente en el siguiente nivel más alto de metotrexato (100 nM).
Hay que destacar que las poblaciones con productividad alta (que según la técnica previa se deberían haber recogido después de la amplificación) fallan para amplificarse para una productividad mayor. Todas estas poblaciones tienen un valor del índice \DeltaE menor que 3. Las poblaciones de células con productividad moderada pero con un alto índice \DeltaE (> 3) se amplificaron para una productividad mayor.
Una selección típica implica el subcultivo de 1 población (aproximadamente 1 x 10^{5}) de células en 96 subpoblaciones (placa de 96 pocillos, área de crecimiento = 32 mm^{2}). Las células se desarrollaron hasta confluencia en metotrexato 100 nM y se ensayaron para la productividad del factor VIII. Después la población con la mayor productividad se sometió al mismo régimen de enriquecimiento clonal bajo amplificación en el siguiente nivel más alto de metotrexato (200 nM). Se repitió el mismo régimen de selección hasta que se alcanzó un nivel alto constante de productividad del factor VIII. La productividad máxima de células 293S se logra típicamente a un nivel de metotrexato 1 uM. La amplificación posterior en un nivel más alto de metotrexato no incrementó la productividad del factor VIII. Después los clones de células individuales se obtuvieron limitando la clonación en dilución en presencia de metotrexato 50 nM.
Como se muestra en la tabla 1, los clones con productividad alta se obtuvieron a partir de tanto pCIS - F8 (0,7 - 1,0 uC/c/d) como pCAIS - F8 1,3 - 1,5 uU/c/d). Los clones generados por pCAIS - F8 mostraron un 40 - 50% significativo de productividad sobre los generados por pCIS - F8. Estos clones son estables y adecuados para la producción continua del factor VIII en condiciones exentas de suero.
TABLA I Productividad del factor VIII de clones amplificados de células 293S transfectadas con diversos factores de expresión
Vectores Método de selección Productividad de clones**
(1 uM) (uU/c/d)
pCIS – F8 Tradicional* 0,1 - 0,25
pCIS – F8 \DeltaE 0,7 - 1,0
pCIS – F8 Tradicional* 0,15 - 0,3
pCIS – F8 \DeltaE 1,3 - 1,5
* Células que muestran una producción más alta después de la selección de G418 se eligieron para amplificación
posterior en metotrexato.
**Se evaluó un total de 10 - 12 clones mediante la productividad después de alcanzar resistencia a metotrexato
1 uM.
Como se muestra en esta descripción, el índice \DeltaE es un indicador útil para identificar las poblaciones potenciales de células de alta producción que se pueden amplificar posteriormente.
Ejemplo 3 Producción continua del factor VIII
Uno de los clones de alta producción se desarrolló hasta una densidad de células de 5 - 7 x 10^{5} células/ml en una centrífuga de 250 ml en medio esencial mínimo de Joklik (GIDCO) suplementado con suero bovino fetal dializado al 10%. El cultivo se agitó a una velocidad de 100 r. p. m. y se mantuvo en un incubador a 37ºC. Después las células se lavaron con solución salina tamponada de Hank (GIBCO), se volvieron a sembrar en un matraz de centrífuga de 250 ml a una densidad de 5 x 10^{5} células/ml en un medio de producción exento de suero (MEM de Joklik suplementado con insulina, 5ug/ml, transferrina 25 ug/ml, albúmina sérica humana, 1 mg/ml, y MgCl_{2} 15 mM), y se mantuvo a 37ºC. Después de 24 horas, el fluido del cultivo se recogió y se ensayó para la producción del factor VIII mediante el procedimiento cromogénico de Coatest (Kabi). Las células se centrifugaron, se volvieron a suspende en medio de producción exento de suero, y se incubaron a 37ºC durante otras 24 horas después de lo cual se repite el mimo procedimiento a intervalos de 24 horas durante 21 días. Durante todo este período de producción la productividad de las células se mantuvo en el intervalo de 1,2 - 1,5 uU/c/d.
Considerada la descripción anterior, se producirán variaciones para los expertos en este campo. Por ejemplo, la disposición de la secuencia aumentadora y los vectores de esta descripción se podrían usar como vectores propuestos para la terapia génica en seres humanos. En el caso del factor VIII, el vector se podría integrar en células hepáticas humanas. De acuerdo con lo anterior, se intenta que los ejemplos anteriores se deben construir como ilustrativos y que el alcance de la invención descrita se debe limitar solamente por las siguientes reivindicaciones.

Claims (5)

1. Un vector que comprende en secuencia lineal una segunda secuencia promotor - primer promotor - donante _{1} de ayuste - intrón _{1} - donante _{2} de ayuste - intrón _{2}- aceptor unida operativamente a una secuencia que codifica una proteína como se muestra en la figura 1B.
2. El vector pCAIS - F8 como se muestra en la figura 1B integrado comosómicamente en una célula de mamífero.
3. El vector de la reivindicación 1 que comprende una secuencia codificadora para el factor VIII localizada corriente abajo del aceptor.
4. Una línea celular de mamífero que comprende el vector de la reivindicación 1 como un elemento cromosómico integrado.
5. Una línea celular de mamífero que comprende el vector de la reivindicación 4 como un elemento cromosómico integrado.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214578B1 (en) * 1996-06-12 2001-04-10 Japan Tobacco Inc. Method for the expressing foreign genes and vectors therefor
US5854021A (en) * 1997-02-28 1998-12-29 Bayer Corporation Enhance protein production method
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US6051401A (en) * 1998-07-28 2000-04-18 Bayer Corporation Methods and constructs for protein expression
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6358703B1 (en) 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
US20040235715A1 (en) * 1999-11-12 2004-11-25 Bayer Corporation Method of producing glycosylated bikunin
EP2108694A1 (en) 2000-06-27 2009-10-14 Basf Se Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation
US7723102B2 (en) 2000-09-28 2010-05-25 Bayer Corporation Enhanced transfection system
AU2004278684B2 (en) 2003-09-30 2011-05-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses therefor
JP4804356B2 (ja) * 2003-10-16 2011-11-02 クラウド ネグリエー 第ＶＩＩＩ因子及びその誘導体の高発現レベルのための改変されたｃＤＮＡ
CN112029737A (zh) 2005-04-07 2020-12-04 宾夕法尼亚大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
US20070214041A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-13 Cisco Technologies, Inc. System and method for location-based mapping of soft-keys on a mobile communication device
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
CN102869779A (zh) 2010-03-29 2013-01-09 宾夕法尼亚大学托管会 药理学诱导的转基因消融系统
WO2012112832A1 (en) 2011-02-17 2012-08-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for altering tissue specificity and improving aav9-mediated gene transfer
WO2015012924A2 (en) 2013-04-29 2015-01-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof
US10058624B2 (en) 2015-04-16 2018-08-28 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
WO2022032140A2 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Amicus Therapeutics, Inc. Vesicle targeting proteins and uses of same

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5079159A (en) * 1983-12-27 1992-01-07 Genetics Institute, Inc. Method for making tissue plasminogen activator
US4740461A (en) * 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4965199A (en) * 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
NZ221790A (en) * 1986-09-12 1990-07-26 Genentech Inc Method for the continuous production of a heterologous protein in a eukaryotic host cell

Also Published As

Publication number Publication date
CA2125449C (en) 2010-02-23
JPH06343476A (ja) 1994-12-20
EP0874057A2 (en) 1998-10-28
EP0874057B1 (en) 2004-07-28
EP0874057A3 (en) 1999-01-07
EP0629700A3 (en) 1995-02-15
DE69433925D1 (de) 2004-09-02
CA2125449A1 (en) 1994-12-11
ATE272122T1 (de) 2004-08-15
EP0629700A2 (en) 1994-12-21
DE69433925T2 (de) 2005-07-28
US5612213A (en) 1997-03-18
DK0874057T3 (da) 2004-11-22

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