KR100899949B1

KR100899949B1 - 변형된 인자 Ⅷ ｃＤＮＡ 및 인자 Ⅷ의 생성을 위한 이의용도

Info

Publication number: KR100899949B1
Application number: KR1020020007000A
Authority: KR
Inventors: 끌라우드 네그리에르; 장-뤽 쁠랑띠에르; 마리 헬렌 로드리그
Original assignee: 체에스엘 베링 게엠베하
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2009-05-28
Also published as: ATE431363T1; AU785354B2; CA2371447A1; DE60232282D1; AU1555502A; US6780614B2; KR20020066385A; US20020182684A1; EP1233064A1; JP2002291472A

Abstract

야생형 인자 cDNA의 B-도메인이 결실되고, 절두된 인자 IX 인트론 1이 인자 VIII cDNA의 2개의 위치에 삽입되고, 조혈 세포주와 특히 혈소판에서의 발현에 적합한 cDNA가 프로모터로서 사용되는, 변형된 인자 VIII cDNA가 기술되어 있다.

인자 VIII cDNA, 조혈 세포, 혈소판, 인자 IX 인트론 1, B-도메인

Description

변형된 인자 Ⅷ ｃＤＮＡ 및 인자 Ⅷ의 생성을 위한 이의 용도{Modified factor VIII cDNA and its use for the production of factor VIII}

도 1은 형질감염된 HEL 세포에 의해 생성된 면역침전된 FVIII의 면역블롯 분석을 보여준다. pcDNA3- 및 CMV-FVIII I1+13 HEL 세포를 사람 vWF 및 PMA와 함께 4일간 항온배양하였다. 상청액을 농축시킨 후, vWF 면역침전을 수행하였다. FVIII 면역블롯 분석을, 항-사람 FVIII 항체를 사용하여 수행하고, 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)를 검출하였다.

도 2는 pTracer/GPIIb 벡터의 수득과정을 보여준다. pTracer-EF C 및 pcDNA3-GPIIb 벡터를 NruI 및 SpeI으로 분해하였다. 이어서, 개방된 pTracer 및 NruI-SpeI-GPIIb 프로모터를 연결하여, pTracer/GPIIb 플라스미드를 수득하였다. 기호의 설명: PEF-1α, 사람 연장 인자 1α 프로모터; 6His, 폴리히스티딘 영역; BGH pA, 폴리아데닐화 영역.

도 3은 pTracer/GPIIb-FVIII 벡터의 수득과정을 보여준다. pTracer/GPIIb 벡터를 NotI 및 BclI으로 분해하였다. FVIII cDNA를 NotI과 XhoI사이에 클로닝하였다. pcDNA3-FVIII를 NotI, BclI 및 PvuI으로 분해하였다. 개방된 pTracer/GPIIb 및 2개의 FVIII 단편을 연결시켜, pTracer/GPIIb-FVIII 플라스미드 를 수득하였다.

도 4는 형질감염된 Dami 세포에 의해 생성된 면역침전된 FVIII의 면역블롯 분석을 보여준다. pTracer/GPIIb- 및 GPIIb-FVIII I1+13 Dami 세포를 사람 vWF 및 PMA와 함께 4일간 항온배양하였다. 상청액을 농축시킨 후, vWF 면연침전을 수행하였다. 면역침전 전에, 용해물을 사람 vWF와 함께 항온배양하였다. FVIII 면역블롯 분석을, 항-사람 FVIII 항체를 사용하여 수행하고, 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)를 검출하였다. ReFacto^R(5ng)을 대조군으로서 사용하였다.

본 발명은 변형된 인자 Ⅷ cDNA 및 인자 Ⅷ 생성의 향상을 위한 이의 용도에 관한 것이다.

인자 Ⅷ(FVIII)는 혈액응고 연쇄증폭반응과 관련된 X-링크된 유전자 생성물이다. 인자 Ⅷ는, 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2를 가지며 19개의 아미노산 단일 펩티드를 포함하는, 2351개 아미노산 일본쇄 폴리펩티드로서 합성된다[참조 문헌: Gitschier J. et al., 1984; Toole, J.J. et al., 1984; Vehar, G.A. et al., 1984]. 혈장 FVIII는 다양한 크기의 아미노-말단 중쇄(200 내지 90kDa; Andersson et al., 1986)와 금속-이온에 의해 연결된 카복시-말단 유래된 경쇄(80kDa)로 이루어진 이종이량체이다. FVIII의 부재 또는 결핍은 A형 혈우병이라 불리는 심각한 출혈 장애를 유발한다.

인자 Ⅷ 생성 수준은, 다른 유전자에 비해 세포 형질감염 후에 저수준으로 유지된다. 지금까지 세가지 이유가 확인되었다: (1) 인자 Ⅷ mRNA가 비효율적으로 생성되고, (2) 소포체로 부터 골지체로의 인자 Ⅷ의 이동이 저조하며, (3) 인자 Ⅷ는 단백질분해에 민감하다. 따라서, FVIII 전이유전자(transgene)의 개선은 A형 혈우병 유전자 치료에 있어 중요한 과제이다.

유럽 특허원 제99 104 050.2호에는, 야생형 cDNA의 B-도메인을 결실시키고 인자 Ⅷ cDNA의 상이한 위치에 절두된(truncated) FIX 인트론 1을 삽입시켜 FVIII cDNA를 변형시키는 방법이 이미 제안되었었다. 이러한 변형된 인자 Ⅷ cDNA는 시험관내에서 뿐만 아니라 유전자 치료용 형질전환 벡터속에서 FVIII를 고수율로 제조하는데 사용될 수 있다. 인트론 1과 인트론 13 위치 모두에서 FIX 절두된 인트론 1을 지닌 cDNA가, CHO 및 HepG2 세포주의 형질감염 후, 가장 고수준의 FVIII 제조를 유도하였다. 이러한 재조합 FVIII는 생물학적으로 활성인 단백질이다.

인자 Ⅷ의 유전공학적 제조에서 수율을 추가로 향상시키기 위하여, 본 발명은 당단백질 IIb(GPIIb)의 조직-특이적 프로모터를 사용한, 조혈 세포와 특히 혈소판에서의 인자 Ⅷ의 발현에 관한 것이다.

이러한 시도의 실현가능성은 조혈 세포주 HEL을 사용함으로써 첫번째로 입증되었다. 사람 적백혈구병 세포주가 적혈구성 표현형[참조 문헌: Martin et al., 1982] 뿐만 아니라 몇몇 거대핵세포 마커, 예를 들면 혈소판 막 당단백질[참조 문헌 Tabilio et al., 1984]을 발현하는 것으로 알려졌다. 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)에 의한 유도시, HEL 세포주는 증가된 양의 거대핵세포 단백질, 예를 들면 당단백질 IIb/IIIa, 혈소판 인자 4, 또는 폰빌레브란트(vWF)를 발현한다[참조 문헌: Long and coll., 1990].

거대핵모세포 백혈병에 걸린 환자의 혈액으로 부터 확립된 또 다른 조혈 세포주 Dami는 거대핵세포-유사 세포의 순수한 집단인 것으로 여겨진다[참조 문헌: Greenberg et al., 1988]. 배양된 Dami 세포는 혈소판 당단백질 GPIb 및 GPIIb/IIIa를 발현한다. PMA 자극 후, 이들 두개의 혈소판 당단백질의 표면 발현, 및 vWF 합성이 증가하였다. 이러한 변화는 자극된 Dami 세포의 증식의 감소와 관련이 있었다[참조 문헌: Greenberg et al., 1988., Ballen et al., 1996; von der Vuurst et al., 1998]. 혈소판 α-과립중에 vWF와 공동편재되어 있는 다량체성 분자는, 과립 분포를 나타내는 PMA-자극된 Dami 세포에서 합성된다는 것이 밝혀졌다[참조 문헌: Hayward et al., 1993]. 동일한 결과가 플라스미노겐 활성인자 제I형 및 vWF를 사용함으로써 수득되었다[참조 문헌: Hill et al., 1996]. Dami 세포를 사용하여, GPIIb 프로모터 조절하에 FVIII의 거대핵세포-특이적 발현을 연구하였다.

본 발명은 활성 FVIII 분자를 생성할 수 있는 조혈 세포주의 능력을 기술한다. GPIIb 작제물로 형질감염된 Dami 세포가 FVIII를 합성할 수 있으며, FIX 인트론 1 서열이 인자 Ⅷ의 생성을 급격히 증가시킨다는 것이 입증될 수 있었다.

야생형 인자 cDNA의 B-도메인이 결실되고, 절두된 인자 IX 인트론이 조혈 세포주와 특히 혈소판에서의 발현에 적합한 cDNA를 프로모터로서 함유하는 인자Ⅷ cDNA의 2개 위치에 삽입된, 변형된 인자 Ⅷ cDNA가 발견되었다. 사람 혈소판 당단백질(GPIIb)를 암호화하는 cDNA가 프로모터로서 적합하다. 본 발명의 변형된 인자 Ⅷ cDNA는 인자 Ⅷ 인트론 1 및 13중에 절두된 인자 IX 인트론 1을 함유한다.

본 발명의 또 다른 목적은 위에서 언급한 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 사용하여, 세포주 HEL 또는 Dami속에서 인자 Ⅷ를 생성하는 방법을 제공하는 것이다. 인자 Ⅷ의 생성이 유도인자에 의해 자극되는 것이 바람직하다. 가장 우수한 결과는, 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)가 사용되었을 때 수득되었다.

재료 및 방법

벡터: pcDNA3-FVIII 및 pcDNA3-FVIII I1 + 13은 유럽 특허 출원 제 99 104 050.2호에 기재된 것과 동일한 벡터이다. -643/+33 GPIIb 프로모터를 지닌 pBLCAT3-벡터를 G. Uzan으로 부터 구입하였다[참조 문헌: Uzan et al., 1991]. HindIII-BamHI 분해(Promega, Charbonnieres, France) 후, pBLCAT3-GPIIb 벡터로 부터 상기 프로모터를 골라내고, 동일한 효소에 의해 개방된 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)내에 도입하였다. 이어서, 이러한 작제물을 MlulClal 분해로 CMV 프로모터를 결실시키고, 수득된 작제물을 소위 pcDNA3-GPIIb라 칭하였다. pTracer^TM-EF C 벡터를 Invitrogen(Groningen, The Netherlands)로 부터 구입하였다. 이러한 벡터는 Zeozine^TM 내성 유전자를 함유한다.

세포 배양: HEL92.1.7을 ECACC(Sophia Antipolis, France)로 부터 구입하였다. 당해 세포를 5% CO₂를 함유하는 RPMI/10% FCS 배지에서 유지시켰다. pcDNA3 작제물을 이용한 안정한 형질감염을 위하여, HEL 세포(1 x 10⁶개 세포)를 6㎕ FUGENE^TM6(Roche Diagnostics, Meylan, France)을 사용하여 5시간 동안 Pvul 선형화된 플라스미드 2㎍으로 형질감염시켰다. 항온처리 후, 당해 세포를 수거하여, 0.6mg/ml 게네티신(Gibco BRL, Cergy Pontoise, France)이 보충된 신선한 배지중에 넣었다.

Dami 세포를 5% CO₂를 함유하는 RPMI/10% FCS 배지에서 유지시켰다. pTracer 작제물을 이용한 안정한 형질감염을 위하여, Dami 세포(1 x 10⁶개 세포)를 6㎕ FUGENE^TM을 사용하여 5시간 동안 Pvul 선형화된 플라스미드 2㎍으로 형질감염시켰다. 이어서, 당해 세포를 수거하여, 신선한 배지중에 넣었다. 이어서, Zeocin^TM(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)를 최종 농도 300㎍/ml이 되도록 가하였다.

세포 유도: FVIII 생성을 비교하기 위하여, 내성 세포(2.5 x 10⁵ 세포/ml)를 사람 vWF ± PMA 1nM을 함유한 RPMI/1% BSA중에 넣었다. 4일간의 배양 후, 당해 세포를 계수하고 상청액을 수거하였다. 상청액을, 컷-오프가 30kd인 Microsep^TM 미세농축기(Pall Gelman Sciences, France)를 사용하여 농축하였다. 당해 세포를 Hepes 20mM, KCl 0.1M, MgCl₂ 2mM, Triton X 100 0.5%중에서 용해시켰다. 단백질 농도를 Bio-Rad D_c 단백질 분석(Bio-Rad, Ivry sur Seine, France)을 사용하여 측정하였다. FVIII 생성을 FVIII ELISA 키트(Asserachrom FVIII, Stago Asnieres, France)를 사용하여 측정하였다. 농축된 배양 배지를, 색원성 FVIII 분석(Coamatic FVIII, Biogenic, France)을 사용하여 응고 활성에 대하여 시험하였다.

RT-PCR 및 PCR: 역전사효소(RT) 반응을, Superscript^TMII RnaseH 역전사효소(Gibco BRL, Cergy Pontoise, France) 및 올리고(dT)¹⁵ 프라이머(Promega, Charbonnieres, France)를 사용하여 2㎍ mRNA[Rneasy Mini 키트(QIAGEN S.A., Frnace)를 사용하여 추출함]으로 실현하였다. PCR의 경우, Expand^TM 장쇄 주형 PCR 시스템(Roche Diagnostics, Meylan, France)을 각각의 RT 생성물 4㎕ 또는 각각의 대조군 플라스미드 10ng를 함께 사용하였다. 인트론 스플라이싱을, 인트론 1 위치 에 특이적인 프라이머 세트 및 인트론 13을 위한 또 다른 세트를 사용하여 연구하였다. 첫번째 PCR를 통해, 인트론 서열을 갖지 않은 1701 bp 단편 및 FIX 인트론 1 서열을 갖는 2014bp 단편을 수득하였다. 2개의 다른 프라이머를 사용하는 경우, PCR의 크기는 인트론 13의 부재 또는 존재에 따라 각각 623bp 및 935bp 이였다. RT-PCR 및 PCR 단편을 0.8% 아가로즈 겔상에서 전개하고 1kb 래더(ladder)(Gibco BRL, Cergy Pontoise, France)와 비교하였다.

면역침전 및 FVIII 면역블롯팅 분석: 면역침전 전에, 용해물을 사람 vWF(40ng FVIII에 대한 2,000ng vWF; Diagnostica Stago, Asnieres, France)와 함께 10분간 실온에서 항온처리하였다. 50㎕의 항-사람 vWF 항체 비드[제조원: Aventis Behring (USA)]를 샘플에 가하고, 밤새 4℃에서 항온배양하였다. 이어서, 당해 비드를 원심분리(2500rpm에서 2분간) 후 수집하고, 평형 완충제(Hepes 10mM, KCl 100mM, MgCl₂ 2mM, Trition x 100 0.1%)로 3회 세척하고, Laemmli 완충제(Laemmli, 1970)으로 희석시켰다. 이어서, 샘플을 SDS-PAGE/7% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하고, Hybond^TM C Pure 막(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, France)상에 반-건조 블롯팅하였다. 면역블롯을 TBS-T(Tris-HCl 10mM pH 7.5, NaCl 0.15M, Tween 0.1%)로 1시간 동안 실온에서 차단한 후, 양(sheep) 항-사람 FVIII 항체(Cedarlane, Ontario, Canada)의 1:3,000 희석액과 함께 항온처리하였다. 이어서, 막을 TBS-T에서 3회 세척하고, 퍼옥시다제-표지된 항-양 항체(Dako S.A. Trappes, France)의 1:10.000 희석액과 함께 30분간 항온처 리하였다. 3회 세척 후, 화학발광 시그날을 ECL 시스템(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, France)을 사용하여 자가방사선술로 검출하였다.

아래의 결과가 수득되었다:

1. CMV 프로모터 조절하의 FVIII 발현

1.1 HEL 세포중의 FVIII 생성

동일한 CMV 프로모터를 사용한 FVIII 생성을 비교하기 위하여, HEL 세포를 pcDNA3-FVIII 및 pcDNA3-FVIII I1+13으로 안정하게 형질감염시켰다. pcDNA3.1 벡터(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)를 네가티브 대조군으로서 사용하였다. 이 후, G418-내성 세포를 비교하였다.

pcDNA3.1 대조군 세포의 용해물의 상청액중에서 FVIII가 검출되지 않았다. PMA 자극이 제공되지 않는 경우, FVIII는 HEL 세포의 상청액 또는 용해물 어느 곳에서도 검출되지 않았다. 1nM PMA를 세포 배양물에 가한 경우, FVIII가 CMV-FVIII- 및 CMV-FVIII I1+13- 발현 세포에서 검출되었다(표 1). 상청액에서, FVIII 생성은 CMV-FVIII 발현 세포에 비해 CMV-FVIII I1+13 형질감염된 세포에서 13배 더 많았다. 세포내 FVIII의 양 또한 CMV-FVIII I1+13 세포에서 더 많았다(2.5배 증가).

PMV-자극된 HEL 세포에 의한 FVIII 생성

	pcDNA3	CMV-FVIII	CMV-FVIII I1+13
상청액(ng/ml)	0±0	0.22±0.05	2.97±0.26 **
용해물(ng/mg 단백질)	0±0	1.38±0.22	3.77±0.26 **

5 x 10⁵개 G418 내성 세포를 2ml RPMI/1% BSA/1 nM PMA중에 4일간 두었다. 이후, 상청액을 수거하고, 당해 세포를 용해 완충제 250㎕중에 현탁시켰다. FVIII를 FVIII ELISA 키트를 사용하여 정량하였다. 결과는 4회의 각각의 실험의 평균값±SEM으로서 표현된다. pcDNA3을 통계를 위한 기준으로서 사용하였다(**는 p<0.01을 나타낸다).

1.2 FVIII 응고 활성

CMV-FVIII 1+13 HEL 세포를 1nM PMA를 사용하는 유도 상태하에 두었다. 4일 후, 조절된 배지를 수거하여 농축한 후, FVIII 항원 및 FVIII 응고 활성을 정량화하였다. 당해 결과에 의해, HEL-생성된 FVIII가 활성 분자임이 입증되었다(표 2). 평균 비활성은 4,858.9±798.8 U/mg이었으며, 이는 혈장 FVIII의 비활성과 매우 유사하였다.

PMA 자극된 CMV-FVIII I1+13 HEL 세포의 상청액중 FVIII 응고 활성

	FVIII 항원(ng/ml)	응고 활성(mU/mL)	비활성(U/mg)
실험 1	6.24±0.70	33.58±8.15	5,335.0±882.7
실험 2	12.04±0.62	52.85±6.64	4,382.9±369.2 4,858.9±798.8

CMV-FVIII I1+13 HEL 세포를 4일간 유도 상태하에 두었다. 이어서, FVIII 항원 및 FVIII 응고 활성을 농축된 상청액에서 정량화하였다. 두 개의 독립적인 실험이 제시되었다. 결과는 평균값±SEM(n=3)으로 표현된다.

1.3 FIX 인트론 1의 스플라이싱

형질감염된 HEL 세포를 RPMI-1% BSA-1 nM PMA 배지에서 3일간 배양하였다. RNA를 추출하여 RT-PCR 반응에 사용하였다. pcDNA3-형질감염된 HEL 세포에서, 2 세트의 프라이머를 갖는 단편이 수득되지 않았다. 1701bp 및 623bp 단편이, CMV-FVIII I1+13 형질감염된 세포로 부터 수득한 mRNA로 실행된 RT-PCR에서 실질적으로 검출되었으며, 이로써 인트론 서열이 정확하게 스플라이싱되었음이 입증되었다. 대조적으로, 대조군 플라스미드 pcDNA3-FVIII I1+13은, 인트론 1 및 13의 검출에 상응하는 2014bp 및 935bp 단편을 나타내었다.

1.4 FVIII 면역블롯 분석

HEL 상청액중의 FVIII 재조합 단백질을 추가로 분석하기 위하여, FVIII를 항-사람 vWF 항체와 커플링된 비드(제조원: Aventis Behring)를 사용하여 정제하였다. pcDNA3 및 pcDNA3-FVIII I1+13 형질감염된 HEL 세포를, hu vWF(150ng/mL)가 보충된 RPMI-1% BSA 1nM PMA 배지에서 항온배양하였다. 이어서, 상청액을 컷-오프가 30Kd인 Microsep^TM 미세농축기상에서 농축하였다. 이어서, 면역침전된 단백질을 전기영동하고, FVIII 면역블롯팅 분석을 수행하였다. ReFacto^R, 즉 치료적 재조합체 B-도메인이 결실된 FVIII(Wyeth Genetics Institute)를 대조군 FVIII로서 사용하였다. 당해 결과는 도 1에 제시되어 있다. 면역블롯 분석으로 FVIII 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 검출하였으며, CMV-FVIII I1+13 HEL 세포에 의해 생성된 재조합 FVIII가 ReFacto^R과 동일한 단백질 프로파일을 제공한다는 것이 입증되었다.

2. GPIIb 프로모터 조절하의 FVIII 발현

2.1 pTracer-GPIIb 작제물의 수득

조혈 세포주 Dami에서 FVIII 전이유전자를 발현시키기 위하여, 계통-특이적 프로모터 GPIIb를 선택하였다. -643/+33 GPIIb 프로모터를 함유하는 pBLCAT 벡터를 G.Uzan(Uzan, 1991 #44)으로 부터 구입하였다. HindIII-BamHI 분해(Promega, Charbonnieres, France) 후, pBLCA3-GPIIb 벡터로 부터 상기 프로모터를 골라내었다. 이것을 동일한 효소에 의해 개방된 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen, Leek, The Netherlands)내에 도입하였다. 이어서, 이러한 작제물을 Mlul-Clal 분해로 CMV 프로모터를 결실시키고, 이를 pcDNA3-GPIIb라 칭하였다. -597/+33 GPIIb 프로모터를 함유하는 GPIIb 벡터는 이미 유럽 특허 출원 제99 107 397.4호에 기술되어있다.

pTracer^TM-EF C를 Nrul-Spel 분해로 개방시켰다. 이러한 효소 분해에 의해 초기 벡터로 부터 EF-1α 프로모터가 결실되었다. 동일한 분해를 사용하여 pcDNA-GPIIb-FVIII 플라스미드로 부터 GPIIb 프로모터를 추출하였다. 이어서, 2개의 단 편을 연결시켜, 생성된 발현 플라스미드를 pTracer/GPIIb라고 칭하였다.

pTracer/GPIIb-FVIII를 수득하기 위하여, pTracer/GPIIb를 Notl 및 BclI으로 분해하였다(도 3). 이러한 분해에 의해, V5 에피토프 및 초기 pTracer-EF C 벡터(도 2)의 폴리히스티딘 영역이 제거되었다. pcDNA3-FVIII를 NotI, BclI 및 PvuI으로 처리하였다. 2개의 생성된 FVIII 단편(446bp 및 3973bp)를 아가로즈 겔로 부터 추출하고, pTracer/GPIIb-FVIII를 삼중-연결로 수득하였다. 동일한 방법을 pTracer/GPIIb-FVIII I1+13에 대해 사용하였다.

2.2 Dami 세포에서의 FVIII 생성

Dami 세포를 Zeocin 선별을 사용하여 안정하게 형질감염시켰다. pTracer/GPIIb를 네가티브 벡터 대조군으로서 사용하였다. 각각의 GPIIb 작제물에 대해 3개의 수집물(pool)을 수득하였다. 당해 세포를 유도 상태에 두고, FVIII를 상청액 및 세포 용해물 모두에서 정량화하였다.

모든 용해물에서, pTracer/GPIIb로 형질감염된 Dami 세포에서 FVIII가 생성되지 않았다. 대조적으로, FVIII가 GPIIb-FVIII 및 GPIIb-FVIII I1+13 Dami 세포의 용해물에서 검출되었다(표 3). PMA 자극이 제공되지 않는 경우, GPIIb-FVIII I1+13-발현 세포가 GPIIb-FVIII-발현 Dami 세포 보다 약 25배 더 많은 FVIII를 생성하였다. 당해 세포를 PMA와 함께 항온배양하는 경우, FVIII 생성이 증가하였다(GPIIb-FVIII-형질감염된 세포의 경우 6배 증가하고, GPIIb-FVIII I1+13 발현 세포의 경우 4배 증가하였다). FVIII와 FVIII I1+13-형질감염된 Dami 세포간 의 FVIII 생성의 차이는 통계학적으로 유의적이었다(PMA 부재시 p<0.05 및 PMA 존재시 p<0.01).

상청액에서, FVIII가 pTracer/GPIIb로 형질감염된 Dami 세포에서 전혀 검출되지 않았다. PMA 부재시, GPIIb-FVIII I1+13-발현 세포는 GPIIb-FVIII-발현 세포 보다 약 7.5배 더 많은 FVIII를 생성하였다. FVIII 생성의 현저한 증가가, PMA 자극 후 상청액중에서 측정되었다. 그러나, GPIIb-FVIII I1+13-발현 세포는 GPIIb-FVIII Dami 세포 보다 항상 더 많은 FVIII를 생성하였다.

이들 결과로 부터, GPIIb-FVIII I1+13으로 형질감염된 Dami 세포가 GPIIb-FVIII-발현 세포 보다 유의적으로 더 많은 FVIII를 생성한다는 것이 입증되었다.

Dami 세포 용해물에서 FVIII 생성(ng FVIII/mg 단백질)

	pTracer/GPIIb	GPIIb-FVIII	GPIIb-FVIII I1+13
PMA 부재시	0±0	0.62±0.37	15.81±11.06 **
1nM PMA 존재시	0±0	3.66±2.19	62.92±28.27 **

5 x 10⁵개 Zeocin-내성 Dami 세포를 2ml RPMI/1% BSA ± 1nM PMA중에 4일간 두었다. 이 후, 상청액을 수거하고 당해 세포를 용해 완충제 250㎕중에 현탁시켰다. FVIII를 FVIII ELISA 키트를 사용하여 정량화하였다. 결과는 3회의 각각의 실험의 평균값±SEM으로서 표현된다. pTracer/GPIIb를 통계를 위한 기준으로서 사용하였다(**는 p<0.01을 나타낸다).

2.3 FVIII 응고 활성

FVIII 응고 활성을 색원 시험을 사용하여 농축된 상청액에서 측정하였다. 당해 결과는 표 4에 제시되었다. GPIIb로 형질감염된 Dami 세포로 부터 수득한 상청액에서 응고 활성이 전혀 검출되지 않았다. 대조적으로, FVIII 응고 활성이 GPIIb-FVIII I1+13-발현 Dami 세포의 상청액에서 발견되었으며, 비활성이 4,622.3±1,061.4 U/mg으로 계산되었다. FVIII 항원과 FVIII 응고 활성간의 상관관계로 부터, Dami 세포에서 생성된 재조합 FVIII가 생물학적 활성 FVIII이라는 것이 입증되었다.

PMA-자극된 GPIIb-FVIII I1+13 Dami 세포의 상청액중의 FVIII 응고 활성

	FVIII 항원(ng/ml)	응고 활성(mU/ml)	비활성(U/mg)
농축된 상청액	29.96±5.28	142.53±53.12	4,622.3±1,061.4

GPIIb-FVIII I1+13 Dami 세포를 4일간 유도 상태하에 두었다. 이어서, FVIII 항원 및 FVIII 응고 활성을 농축된 상청액에서 정량화하였다. 당해 결과는 평균값±SEM(n=5)으로 표현된다.

2.4 FIX 인트론 1의 스플라이싱

2개의 FIX 인트론 1 서열의 정확한 스플라이싱을 확인하기 위하여, RT-PCR 분석을 실행하였다. mRNA를, 자극되지 않은 형질감염 세포 또는 3일간의 유도 후 PMA-자극된 형질감염 세포로 부터 추출하였다(Rneasy Mini Kit; Qiagen, Courtaboeuf, France). pTracer/GPIIb-FVIII 및 pTracer/GPIIb-FVIII I1+13을 사용한 PCR을 대조군으로서 사용하였다. RT-PCR 결과로 부터, FVIII mRNA가 필수적 으로 GPIIb-FVIII I1+13 Dami 세포에서 스플라이싱되었음이 입증되었다. 따라서, Dami 세포가 FVIII mRNA를 정확하게 프로세싱할 수 있었다.

2.5 FVIII 면역블롯 분석

FVIII 단백질 프로파일을 추가로 분석하기 위하여, 항-사람 vWF 모노클로날 항체와 커플링된 비드(제조원: Aventis Behring)를 사용하였다. 세포 유도를 상기 유도 배지에서 사람 vWF(400ng/ml)을 사용하여 수행하였다. 상청액을 농축하고 항-사람 vWF 모노클로날 항체를 함유하는 비드로 면역침전시켰다. 세포 용해물에 대해, 항-사람 vWF 항체로 면역침전시키기 직전에 사람 vWF를 당해 샘플에 가하였다(세포 용해 후 사람 vWF를 가하지 않는 경우, FVIII를 면역침전시킬 수 없었다). pTracer/GPIIb Dami 세포 용해물 또는 상청액에서, FVIII가 검출되지 않았다(도 4).

GPIIb-FVIII I1+13-형질감염된 Dami 세포에 의해 생성된 재조합 FVIII가 치료적 B-도메인-결실된 재조합체 FVIII(ReFacto^R, Wyeth Genetics Institute)과 매우 유사한 단백질 프로파일을 제공하였다.

2개의 세포주, HEL 및 Dami를 사용하여 본 발명의 결과를 수득하였다. 이들 조혈 세포주는 생물학적 활성 재조합체 FVIII를 생성할 수 있다. 이러한 시험관내-생성된 FVIII는 치료적 B-도메인-결실된 재조합체 FVIII(ReFacto^R, Wyeth Genetics Institute)과 실질적으로 유사한 정확한 단백질 프로파일을 제공한다. FVIII I1+13 작제물중에 2개의 인자 IX 절두된 인트론이 존재하는 것이 FVIII 생성의 급격한 증가의 원인이 되며, 이들 FIX 인트론 1 서열의 편재 효과를 확인시켜주었다. GPIIb 작제물-형질감염된 Dami 세포로 수득된 결과로 부터, GPIIb 프로모터가 Dami 세포에서 B 도메인 결실된 재조합 FVIII의 조직-특이적 생성을 효율적으로 향상시킬 수 있음이 입증되었다. 이들 결과로 부터, GPIIb 프로모터가 조혈 세포와 특히 거대핵세포 유래된 세포에서 응고 인자의 특이적 생성을 조절한다는 것이 확인되었다.

본 발명의 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 사용하여, 세포주 HEL 또는 Dami에서의 인자 Ⅷ의 생성을 향상시킬 수 있다.

참조문헌

Claims

당단백질 IIb(GPIIb)의 조직-특이적 프로모터를 프로모터로서 함유함을 특징으로 하는, 야생형 인자 VIII cDNA의 B-도메인이 결실되고, 절두된(truncated) 인자 IX 인트론 1이 인자 VIII 인트론 1+13중에 삽입된, 변형된 인자 VIII cDNA.
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제1항에 있어서, 당단백질 IIb(GPIIb)의 조직-특이적 프로모터가 사람 혈소판 당단백질 IIb(GPIIb)의 프로모터임을 특징으로 하는, 변형된 인자 VIII cDNA.
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제1항에 따른 변형된 인자 VIII cDNA를 사용하여 세포주 HEL 또는 Dami에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 인자 VIII의 생성 방법.
제7항에 있어서, 인자 VIII의 생성이 유도인자에 의해 자극되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 유도인자로서 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.