KR20030014623A - 인자 Ⅷ 및 이의 유도체의 높은 발현 수준을 위한 변형된ｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

본원에서는 야생형 인자 Ⅷ cDNA의 인트론 1 및/또는 13에, 하나 이상의 스플라이싱 가능한 뉴클레오타이드 서열 또는 핵으로부터 프리-mRNA의 방출 과정 동안 스플라이싱 될 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 기술한다. 추가로, 생물학적으로 활성인 재조합 사람 인자 Ⅷ 또는 이의 유도체의 제조 방법이 기재되어 있고, 이는 상기의 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 함유하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 동물 세포주를 배양하여 수행된다. 그리고, 상기의 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 포함하는, 사람 유전자 치료법에서 사용하기 위한 전달 벡터가 기재된다.

Description

인자 Ⅷ 및 이의 유도체의 높은 발현 수준을 위한 변형된 ｃＤＮＡ{Modified cDNA for high expression levels of factor Ⅷ and its derivatives}

본 발명은 생물학적으로 활성인 재조합 사람 인자 Ⅷ 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 DNA 서열, 이러한 DNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 재조합 사람 인자 Ⅷ 및 이의 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 변형된 DNA 서열을 포함하는 사람 유전자 치료에 사용하기 위한 전달 벡터를 포함한다.

통상의 혈우병 또는 혈우병 A는 가장 흔한 선천성 출혈성 질환이다. 이는 염색체 X와 연계된 혈액응고 인자 Ⅷ의 결여로 야기되고, 10,000명 중 1명 내지 2명의 빈도로 거의 남성에게만 영향을 미친다. X-염색체 결함은 본인은 혈우병이 아닌 여성 운반자에 의해서 유전된다. 혈우병 A의 임상적 징후는 비정상적 출혈 경향이고, 인자 Ⅷ 농축물을 사용한 치료법이 도입되기 전에는, 중증 혈우병인 사람의 평균 수명은 20년 이하였다. 혈장으로부터의 인자 Ⅷ 농축물의 사용은 혈우병 환자에 대한 상태를 상당히 호전시켰다. 평균 수명이 크게 증가하였고, 그들 대부분에게 다소 정상적인 삶을 살 수 있는 가능성을 주었다. 그러나, 혈장에서 유도된 농축물 및 이들의 사용에는 몇가지 문제가 있었고, 가장 심각한 것은 바이러스의 감염이었다. 지금까지, AIDS, B형 간염 및 비-A형, 비-B형 간염을 야기시키는 바이러스가 일반인에게 심각하게 감염되었다. 최근에, 상이한 바이러스 비활성 방법 및 고도로 정제된 신규한 인자 Ⅷ 농축물이 개발되었으나, 바이러스 오염의 부재에 대한 어떠한 보장도 할 수 없다. 또한 인자 Ⅷ 농축물은 사람 혈장의 원료 물질의 한정된 공급으로 상당히 비싸다.

재조합 물질로부터 유도된 인자 Ⅷ 생성물은 혈우병 A의 치료용으로 혈장에서 유도된 인자 Ⅷ 농축물의 사용과 관련된 광범위한 문제점들을 해결할 수 있을것 같다. 그러나, 재조합 인자 Ⅷ의 개발은 몇가지 곤란성, 예를 들면, 특히 전체 길이의 분자와 관련하여 충분하게 고수율의 제조 수준을 달성하는 문제점이 생겼다.

프로테아제 억제제의 존재하에 제조된 신선 혈장에서, 인자 Ⅷ는 280kDa의 분자량을 갖고, 각각 200kDa 및 80kDa인 2개의 폴리펩타이드 쇄로 구성된 것으로 나타났다[참고문헌: Andersson, L.-O., et al. (1986) Proc. Natl. Aca. Sci. USA 83, 2979-2983]. 이들 쇄는 금속 이온 브릿지로 결합된다. 다소 단백질 가수분해로 분해된 형태의 인자 Ⅷ 분자는 시판되는 농축물로부터 정제된 인자 Ⅷ 물질 내에서 활성 단편으로서 발견될 수 있다[참고문헌: Andersson, L.-O., et al. ibid.; Andersson, L.-O., et al. (1985) EP 0 197 901]. 260kDa 내지 170kDa의 분자량을 갖는 단편화된 형태의 인자 Ⅷ은 180kDa 내지 90kDa 범위의 분자량인 1개의 중쇄로 이루어지고, 여기서 모든 변이체는 1개의 80kDa 경쇄와 결합된, 동일한 아미노 말단을 갖는다. 중쇄의 아미노 말단 부위는 인자 Ⅷ cDNA의 뉴클레오타이드 서열 정보로부터 추론될 수 있는 단쇄 인자 Ⅷ 폴리펩타이드의 부위와 동일하다[참고문헌: Wood, W.I., et al. (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G.A., et al. (1984) Nature 312, 337-342].

1개의 90kDa 및 1개의 80kDa 쇄로 이루어진, 170kDa 분자량의 인자 Ⅷ의 최소 활성 형은 보다 큰 분자량 형과 동일한 정도로 트롬빈을 사용하여 활성화될 수 있고, 따라서 비활성화된 형을 나타낸다. 또한, 혈우병인 개에서 시험된 바와 같이, 생체내에서 완전한 생물학적 활성을 갖는 것으로 나타났다[참고문헌:Brinkhous, K.M., et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 82, 8752-8756]. 따라서, 170kDa 형의 지혈 효과는 인자 Ⅷ의 고분자량 형과 동일하다.

아미노산 Arg-740번 및 Glu-1649번 사이에 존재하는 인자 Ⅷ 폴리펩타이드 쇄 중간의 과도하게 글리코실화된 부위가 완전한 생물학적 활성을 위해 필수적인 것 같지는 않다는 사실로 인해, 몇몇 연구가들은 이 부위가 결여된 재조합 인자 Ⅷ의 유도체를 제조하고자 했다. 이는 인자 Ⅷ 중간의 과도하게 글리코실화된 부위를 암호화하는 cDNA의 부분을 전체적으로 또는 부분적으로 결실시키는 것으로 달성되었다.

예를 들면, 각각 아미노산 982번 내지 1562번 및 760번 내지 1639번이 결여된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현은 문헌[참고문헌: J.J. Toole, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA (1986) 83, 5939-5942]에 보고되었다. 아미노산 797번 내지 1562번이 결여된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현은 문헌[참고문헌: D.L. Eaton, et al., Blochemistry (1986) 25, 8343-8347]에 보고되었다. 아미노산 741번 내지 1646번이 결여된 인자 Ⅷ의 발현은 문헌[참고문헌: R.J. Kaufman, PCT application No. WO 87/04187]에 기재되었다. 아미노산 747번 내지 1560번이 결여된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현은 문헌[참고문헌: N. Sarver, et al., DNA (1987) 6, 553-564]에 보고되었다. 각각 아미노산 745번 내지 1562번 및 아미노산 741번 내지 1648번이 결여된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현은 문헌[참고문헌: M. Pasek, PCT application No. WO 88/00831]에 보고되었다. 각각 아미노산 816번 내지 1598번 및 아미노산 741번 내지 1689번이 결여된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현은 문헌[참고문헌: K.-D. Langner,Behring Inst. Mitt., (1988) No. 82, 16-25, EP 295 597]에 보고되었다. 각각 아미노산 868번 내지 1562번 및 아미노산 771번 내지 1666번이 결여된 인자 Ⅷ의 작제 및 발현은 문헌[참고문헌: P. Meulien, et al., Protein Engineering (1988) 2(4), 301-306, EP 0 303 540 A1]에 보고되었다. 포유동물 세포내에서 인자 Ⅷ cDNA의 상기 결실된 형을 발현시키는 경우, 생성 수준은 전체 길이의 인자 Ⅷ와 비교하여 통상적으로 10배 더 높다.

추가로, 동일한 세포내에서 2개의 상이한 cDNA 유도체로부터 90kDa 및 80kDa 쇄를 개별적으로 발현시키고자 하였다[참고문헌: Burke, R.L., et al. (1986), J. Biol. Chem. 261, 12574-12578, Pavirani, A., et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm., 145, 234-240]. 그러나, 이러한 계에서 생체내 재구성은 회수된 인자 Ⅷ; C 활성의 측면에서, 효율이 제한되는 것으로 간주된다.

몇몇 연구는 상이한 세포계에서 낮은 FⅧ 생성 수준을 강조하였다: FⅧ의 생합성은 3개 이상의 상이한 수준으로 조절되는 것으로 나타났다. 첫째, FⅧ cDNA 서열 중 A2 암호화 도메인에 편재된 2개의 뉴클레오타이드 신장이 전사 사일런서(silencer)로서 작용하는 것으로 입증되었다[참고문헌: Fallaux et al., 1996; Hoeben et al., 1995; Koeberl et al., 1995; Lynch et al., 1993]: 둘째, FⅧ 단백질 합성은 몇몇 소포체 샤페론(BIP; 칼레티쿨린(Calreticulin); 칼넥신(Calnexin); ERGIC-53)에 의해 엄격하게 조절된다. 다수의 이들 상호작용은 세포내에서 FⅧ를 보유하고, 이를 세포 분해 기작을 통하여 지시한다[참고문헌: Dorner et al., 1987; Nochols et al., 1998; Pipe et al., 1998]. 셋째, 일단 분비된 FⅧ는 프로테아제 분해에 민감하므로, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 의해 보호되어야 한다[참고문헌: Kaufman et al., 1989].

따라서, 보다 고수율로 FⅧ를 생산하기 위한 개선된 공정을 개발하는 것이 문제이다. 본 발명은 변형된 FⅧ cDNA로 이 문제에 대한 해결책을 제공한다.

본 발명은 분자량 및 기타 생화학적 특성의 측면에서, 시판되는 농축물내에 다량으로 존재하는 선행 기술분야에서 유도된 혈장 인자 Ⅷ 형[참고문헌: Andersson, L.-O. et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Scl. USA 83, 2979-2983]에 상응하는 재조합 인자 Ⅷ 유도체를 암호화하는 결실된 인자 Ⅷ cDNA 분자를 기재한다. 이들 신규한 인자 Ⅷ cDNA 유도체는 재조합 인자 Ⅷ 또는 이의 유도체의 약제학적 제조를 위한 산업적 공정에서 사용되는 재조합 인자 Ⅷ 단백질을 충분히 고수율로 제공한다.

도 1은 FⅧ cDNA 내 FIX 인트론 1의 삽입을 도시한 것이다.

도 2는 APOAⅠ 인트론 단편 및 BGLOBⅠ 인트론 단편을 도시한 것이다.

도 3은 pCR2.1-ABC 및 pCR2.1-ABC13 플라스미드를 도시한 것이다.

도 4는 APOAI 인트론을 NsiⅠ 분해를 사용하여, pCR2.1 ABC내로 삽입하는 것을 도시한 것이다.

도 5는 클로닝 단계후 수득된 플라스미드를 도시한 것이다.

도 6은 전체길이 FⅧ - ΔB cDNA 내 인트론의 PCR2.1 삽입을 도시한 것이다.

도 7은 pcDNA3-FⅧ A1 + 13 및 pcDNA3-FⅧ B1 + 13 플라스미드를 도시한 것이다.

본 발명은 인자 Ⅷ의 cDNA내에 야생형 인자 Ⅷ 게놈 DNA의 인트론 1 및/또는 13의 결여가 인자 Ⅷ의 높은 수준의 발현을 억제하므로, cDNA가 변형되어야한다는 관찰을 근거로 한다. 이는 유럽 특허원 제1 048 726호에 기재된 바와 같이, 인트론 1 및/또는 13의 위치에 절단된 FIX 인트론의 삽입에 의해 효과적으로 수행될 수 있다. 그러나, 놀랍게도 절단된 FIX 인트론으로 제한되는 것이 아니라, 야생형 인자 Ⅷ 게놈 DNA의 인트론 1 및/또는 13의 위치내로, 하나 이상의 스플라이싱 가능한 뉴클레오타이드 서열 또는 핵으로부터 프리-mRNA의 방출 과정 동안 스플라이싱 될 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열의 도입으로 수행될 수 있음이 발견되었다. 인자 Ⅷ의 발현 수준은 상당히 증가된다. 본 발명의 바람직한 양태는, 야생형 인자 Ⅷ 게놈 DNA의 인트론 1 및/또는 13의 위치에, 하나 이상의 완전하거나 절단된 인트론 또는 스플라이싱 될 능력을 보유한 하나 이상의 합성 인트론이 삽입된 변형된 인자 Ⅷ cDNA로 이루어진다. 야생형 인자 Ⅷ 게놈 DNA의 인트론 1 및/또는 13의 위치에, 제1의 완전하거나 절단된 아포지단백질 A1 인트론 또는 제1의 완전하거나 절단된 β-글로빈 인트론의 삽입에 의해 우수한 결과가 수득되었다.

본 발명의 추가의 목적은 야생형 인자 Ⅷ cDNA의 B-도메인이 단축되거나 완전하게 제거된 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 사용하여, 인자 Ⅷ 및 이의 유도체의 발현 수준을 향상시키는 것이다.

사람 인자 Ⅷ의 아미노산 1 내지 740번을 암호화하는 제1의 DNA 절편 및 사람 인자 Ⅷ의 아미노산 1649 내지 2332번을 암호화하는 제2의 DNA 절편을 포함하는 변형된 인자 Ⅷ cDNA가 바람직하게 사용된다. 이들 두개의 절편은 국제 특허원 제WO 92/16557호에 기재된 바와 같이, 바람직하게 라이신 또는 아르기닌으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산의 링커 펩타이드를 암호화하는 링커 DNA 단편에 의해 상호 연결될 수 있다.

본 발명에 따라 이러한 B-도메인이 결실된 인자 Ⅷ cDNA는 인자 Ⅷ의 야생형 게놈 DNA의 인트론 1 및/또는 13의 위치에서, 하나 이상의 스플라이싱 가능한 뉴클레오타이드 서열 또는 핵으로부터 프리-mRNA의 방출 과정 동안 스플라이싱 될 뉴클레오타이드 서열이 삽입되어 추가로 변형될 수 있다.

특히, 인자 Ⅷ의 야생형 게놈 DNA의 인트론 1 및/또는 13의 위치에서, 하나 이상의 완전하거나 절단된 인트론 또는 스플라이싱 될 능력을 보유한 하나 이상의 합성 인트론이 삽입되는 경우, 인자 Ⅷ의 발현 수준은 상당히 증가된다. 인자 Ⅷ의 야생형 게놈 DNA의 인트론 1 및/또는 13의 위치내로의 삽입을 위한 적합한 인트론의 예로는 제1의 완전하거나 절단된 아포지단백질 AI 인트론 또는 제1의 완전하거나 절단된 β-글로빈 인트론이 있다.

적절한 숙주 세포에서, 높은 수준의 인자 Ⅷ 단백질의 생성은 상기 언급된 변형된 인자 Ⅷ DNA를 재조합 발현 벡터내의 적절한 조절 인자와 함께, 효과적인 전사 단위로 어셈블리시켜야하고, 이는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라, 이. 콜라이 내에서 증식될 수 있다. 효과적인 전사의 조절 인자는 동물 세포를 천연 숙주로서 갖는 바이러스 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스 또는 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체로부터 유도된 프로모터-인핸서 조합, 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같은 동물 세포내에서 강하게 구조적으로 전사된 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합이 사용될 수 있다. 인자 Ⅷ DNA로부터 전사된 mRNA를 안정적인 높은 수준으로 달성하기 위해서, 전사의 단위는 3'-근접 부분에 전사의 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야 한다. 바람직하게는, 이 서열은 시미안 바이러스 40의 초기전사 영역, 래빗 베타-글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성제 유전자로부터 유도된다.

이와같이 효과적인 재조합 발현 벡터로 어셈블리된 인자 Ⅷ cDNA는 이어서 인자 Ⅷ 단백질의 발현을 위해, 적절한 숙주 세포주 내로 도입된다. 바람직하게는, 이 세포주는 정확한 폴딩, 이황화물 결합 형성, 아스파라긴-결합된 글리코실화 및 기타 해독후 변형 뿐만 아니라 배양 배지내로의 분비를 확실하게 하기 위해서, 척추동물 기원의 동물 세포주이어야한다. 기타 해독후 변형에 대한 예로는, 티로신 O-황산화 및 초기 폴리펩타이드쇄의 단백질 가수분해 과정이 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예로는, 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아의 신장 293 세포이고, 바람직하게는 CHO-세포이다.

인자 Ⅷ cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 몇몇 다른 방법으로 동물 세포주내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 상이한 동물 바이러스를 기초로 한 벡터로부터 생성될 수 있고, 이들의 예로는, 바쿨로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는, 소 파필로마 바이러스계 벡터이다.

또한, 인자 Ⅷ DNA를 암호화하는 전사 단위는, 재조합 DNA가 이의 게놈내로 통합된 특정 세포 클론의 분리를 용이하게 하기 위해서, 이들 세포내에서 우세한 선택성 마커로서 기능할 수 있는 또다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포내로 도입될 수 있다. 이러한 타입의 우세한 선택성 마커 유전자의 예로는, 제네티신(G418)에 대한 내성을 부여하는 Tn5 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에대한 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제가 있다. 이러한 선택성 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인자 Ⅷ cDNA를 암호화하는 것과 동일한 벡터상에 존재할 수 있거나, 숙주 세포의 게놈에 동시에 도입되어 통합되는 별개의 벡터상에 암호화될 수 있고, 종종 상이한 전사 단위사이에 단단한 물리적 결합을 가져온다.

인자 Ⅷ DNA와 함께 사용될 수 있는 선택성 마커 유전자의 다른 타입은 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)을 암호화하는 다양한 전사 단위를 기초로 한다. 내인성 dhfr-활성이 결여된 세포, 바람직하게는 CHO-세포(DUKX-B11, DG-44) 내로 이러한 타입의 유전자를 도입한 후, 뉴클레오사이드가 결여된 배지에서 이들이 성장되도록 할 수 있을 것이다. 이러한 배지의 예로는, 하이포크산틴, 티미딘 및 글리신이 없는 햄(Ham) F12가 있다. 이들 dhfr-유전자는 인자 Ⅷ cDNA 전사 단위와 함께, 동일한 벡터 또는 상이한 벡터상에 결합된 상기 타입의 CHO-세포 내로 도입될 수 있고, 이로써 재조합 인자 Ⅷ 단백질을 생성하는 dhfr-양성 세포주를 생성한다.

상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에 성장하는 경우, 메토트렉세이트에 대해 내성인 신규한 세포주가 나타날 것이다. 이들 세포주는 결합된 dhfr 및 인자 Ⅷ 전사 단위의 증폭된 수로 인해 증가된 비율로 재조합 인자 Ⅷ 단백질을 생성할 수 있다. 이들 세포주를 증가된 농도(1-10000nM)의 메토트렉세이트 중에서 증식시킨 경우, 매우 높은 비율로 인자 Ⅷ 단백질을 생성하는 신규한 세포주를 수득할 수 있다.

인자 Ⅷ 단백질을 생성하는 상기 세포주는 현탁 배양물 중에 또는 다양한 고형 지지체상에서 대량으로 성장시킬 수 있다. 이러한 지지체의 예로는, 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스를 기초로 한 미세담체 또는 중공섬유 또는 다양한 세라믹 물질 형태의 고형 지지체가 있다. 현탁 배양물 중에 또는 미세담체 상에서 성장시킨 경우, 상기 세포주의 배양은 연장된 기간에 걸쳐 컨디셔닝된 배지를 연속적으로 생성시키면서 욕 배양 또는 관류 배양으로서 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 상기 세포주는 사람 혈장으로부터 분리될 수 있는 재조합 인자 Ⅷ의 생성을 위한 산업적 공정의 개발에 매우 적절하다.

상기 타입의 CHO-세포의 배지내에 축적된 재조합 인자 Ⅷ 단백질은 재조합 인자 Ⅷ 단백질과 세포 배양 배지내의 기타 물질 사이의 크기, 전하, 소수성, 용해성, 특이적 친화성등의 차이를 이용한 방법을 포함하는 다양한 생화학적 방법으로 농축 및 정제될 수 있다.

이러한 정제의 예로는, 고형 지지체상에 고정된 모노클로날의 항체에 재조합 인자 Ⅷ 단백질의 흡착이 있다. 탈착후, 인자 Ⅷ 단백질은 상기 특징을 근거로 하는 다양한 크로마토그래피 기술로 추가 정제될 수 있다.

본 발명에 기재된 인자 Ⅷ 활성을 갖는 재조합 단백질은 치료의 용도를 위해 약제학적 제제로 제형될 수 있다. 정제된 인자 Ⅷ 단백질은 임의로 약제학적 제제를 제공하기 위한 약제학적 보조제가 첨가될 수 있는 통상적인 생리학적으로 양립할 수 있는 수성 완충 용액에 용해될 수 있다.

또한, 당해 발명의 변형된 인자 Ⅷ DNA는 사람 유전자 치료에 사용하기 위해전달 벡터내로 통합될 수 있다.

본 발명은 하기의 이의 실시예에서 보다 상세히 추가로 기재될 것이다. 본 발명의 구체적 양태는 첨부된 도와 함께 기술될 것이다.

FⅧ A1 + 13 및 FⅧ B1 + 13 작제물의 제조

인트론의 클로닝

FIX 인트론 1 대신에, 아포지단백질 A1(A) 및 β-글로빈(B) 유전자의 제1의 인트론을 클론하기 위해서, 2세트의 프라이머를 설계하였다. FIX 인트론 1의 스플라이스 공여체(SD) 및 스플라이스 수용체(SA) 사이에 삽입된 신규한 인트론의 서열을 도 1에 나타낸다. 2세트의 올리고뉴클레오타이드는 각각의 SD 및 SA 부위가 결실된 인트론을 증폭시켰다(5' 클로닝 부위, Nsil 및 3' 클로닝 부위, Mlul). 하기의 프라이머가 사용되었다:

명칭	인트론 표적	서열
APOAII-S	아포지단백질 AI(센스)	CATGCATTGCTGCCTGCCCCGGTCACTC(= 서열번호 1)
APOAII-AS	아포지단백질 AI(안티센스)	TACGCGTCCTGGCTGAGTGGGGTGCCTT(= 서열번호 2)
BGLOBI-S	β-글로빈 (센스)	CATGCATCAAGGTTACAAGACAGGTTT(= 서열번호 3)
BGLOBI-AS	β-글로빈 (안티센스)	TACGCGTGACCAATAGGCAGAGAGAGT(= 서열번호 4)

PCR 반응을 게놈 DNA를 사용하여 수행하였다. 아포지단백질 AI 인트론 I(APOAI 인트론)은 186 염기쌍(bp) 길이 단편을 가져왔고, β-글로빈 인트론 I(BGLOBI 인트론)은 119 bp 길이 단편을 가져왔다(도 2). OCR 단편은 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 클로닝되었다(pCR II 벡터: Invitrogen, Leek, the Netherlands).

FⅧ cDNA내의 위치 1 또는 13에 각각의 인트론 삽입

FⅧ cDNA내 인트론을 삽입하기 위해서, FIX 인트론 1의 초기 클로닝 동안 수득되었던 2개의 플라스미드가 사용되었다(도 3). pCR2.1 ABC는 위치 1에 FIX 인트론을 갖는 FⅧ ATG 단편(Ncol-Spel)을 포함한다. pCR2.1 ABC13은 위치 13에 FIX 인트론을 갖는 FⅧ cDNA의 BglⅡ-SalⅠ 단편을 함유한다.

APOAI 인트론은 NsiⅠ 분해를 사용하여, pCR2.1 ABC내로 삽입되었다(도 4). pCR2.1 ABC의 MluⅠ-XhoⅠ 단편은 이후에 수득된 벡터내로 재도입되었다. 최종 플라스미드는 위치 1에서 APOAI 인트론을 갖는 FⅧ의 ATG 단편을 포함하는 pCR2.1 ABC.A였다. 동일한 전략이 위치 1에서 BGLOB 인트론을 클로닝하는데 사용되었다. 또한 동일한 NsiⅠ 연결후, MluⅠ-XhoⅠ 단편의 재도입이 위치 13에서 사용되었다. 수득된 벡터를 도 5에 나타냈다.

FⅧ A1 + 13 및 FⅧ B1 + 13 작제물의 작제

pKS-FⅧ는 B 도메인-결실된 FⅧ cDNA를 함유한다. 플라스미드를 NcoⅠ 및 SpeⅠ 효소(도 6) 뿐만 아니라 pCR2.1 ABC.A를 사용하여 개방하였다. pCR2.1 ABC.A로부터 기원하는 삽입물은 NcoⅠ 및 SpeⅠ에 의해 개방된 pKS-FⅧ내로 삽입되었다. 연결후, pKS-FⅧ A1이 수득되었다. 본 벡터는 위치 1에서 APOAI 인트론을포함했고, 이어서 위치 13에 인트론을 도입하기 위해서 BglⅡ-SalⅠ 분해로 분해되었다. 최종 플라스미드는 2개의 인트론 서열을 나타내는 pKS-FⅧ A1 + 13이었다. 동일한 전략이 pKS-FⅧ B1 + 13을 수득하는데 사용되었다. 이들 2개의 플라스미드는 이어서 NotⅠ 및 XhoⅠ로 분해되었고, 삽입물은 동일한 효소로 개방된 pcDNA3 벡터(Invitrogen, Leek, the Netherlands)로 연결되었다. 최종 발현 플라스미드를 pcDNA3 FⅧ A1 + 13 및 pcDNA3 FⅧ B1 + 13으로 칭했다(도 7).

참고문헌:

Gallo-Penn AM., Shirley PS, Andrews JL, Kayda DB, Pinkstaff AM, Kaloss M, Tinlin S, Cameron C, Notley C, Hough C, Lilicrop D, Kaleko M, Conelly S(1999). In vivo evaluation of an adenoviral vector encoding canine factor Ⅷ: high-level, sustained expression in hemophiliac mice. Hum. Gene Ther., 10(11), 1791-1802.

생물학적으로 활성인 재조합 사람 인자 VⅢ 및 이의 유도체를 제조하여, 선행 기술분야에서 사용되었던 혈장에서 유도된 인자 VⅢ 농축물의 여러가지 문제점들을 해결하면서, 혈우병 A를 치료하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

Claims (11)

1. 야생형 인자 Ⅷ cDNA의 인트론 1 및/또는 13에, 하나 이상의 스플라이싱 가능한 뉴클레오타이드 서열 또는 핵으로부터 프리-mRNA의 방출 과정 동안 스플라이싱 될 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ cDNA.
2. 제1항에 있어서, 야생형 인자 Ⅷ cDNA의 인트론 1 및/또는 13에, 하나 이상의 완전하거나 절단된 인트론이 삽입된 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ cDNA.
3. 제1항에 있어서, 야생형 인자 Ⅷ cDNA의 인트론 1 및/또는 13에, 스플라이싱 될 능력을 보유한 하나 이상의 합성 인트론이 삽입된 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ cDNA.
4. 제1항에 있어서, 야생형 인자 Ⅷ cDNA의 인트론 1 및/또는 13에, 제1의 완전하거나 절단된 아포지단백질 AI 인트론 또는 제1의 완전하거나 절단된 β-글로불린 인트론이 삽입된 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ cDNA.
5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 사람 인자 Ⅷ의 아미노산 1 내지 740번을 암호화하는 제1의 DNA 절편 및 사람 인자 Ⅷ의 아미노산 1649 내지 2332번을 암호화하는 제2의 DNA 절편을 포함하고, 당해 절편들이 라이신 및 아르기닌으로부터 선택된2개 이상의 아미노산의 링커 펩타이드를 암호화하는 링커 DNA 절편에 의해 상호 연결되는 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ cDNA.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따르는 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 포함하는 전사 단위, 전사 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터.
7. 제6항에 따르는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 동물 기원의 숙주 세포주.
8. 제7항에 따르는 동물 세포주를 영양 배지에서 배양하고, 사람 인자 Ⅷ 또는 이의 유도체를 발현 및 분리시킨 후, 배양 배지로부터 당해 발현 생성물을 회수함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 생물학적으로 활성인 재조합 사람 인자 Ⅷ 또는 이의 유도체의 제조 방법.
9. 제8항에 따르는 방법으로 제조된 사람 인자 Ⅷ 또는 이의 유도체.
10. 제9항에 기재된 FⅧ를 함유하는 약제학적 조성물.
11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따르는 변형된 인자 Ⅷ cDNA를 포함하는 것을 특징으로 하는, 사람 유전자 치료에 사용하기 위한 전달 벡터.