WO2007049749A1 - 血液凝固異常の治療方法 - Google Patents

Abstract

　血小板特異的な発現を誘導するプロモーターに機能的に結合された血液凝固因子遺伝子を含むレンチウイルスベクターを有効成分とする血液凝固異常の治療剤が提供された。第VIII因子、あるいは第IX因子をコードする遺伝子を応用することによって、血友病ＡあるいはＢの治療剤が提供される。本発明の治療剤を造血幹細胞などに感染させることによって、血液凝固異常を遺伝子治療によって治療することができる。

Description

明 細 書

血液凝固異常の治療方法

技術分野

[0001] 本発明は、血液凝固異常の治療に関する。

背景技術

[0002] 血液は、出血を止める（止血）ためのメカニズムを備えて!/、る。血管の損傷によって 出血が起こる。止血は、主に、血管の損傷部位に血小板が集まる工程（一次止血; pr imary hemostasis)と、血小板の間をフイブリンで充填する工程（二次止血; Secondary Hemostasis)によって達成される。止血のための一連の工程は、血液凝固 (blood coag ulation)と呼ばれる。血液凝固は、数多くの物質が複合的に関与する、複雑な生理反 応である。一次止血は、損傷部位をふさぐ過程である。障害された内皮細胞下に露 出した結合組織は、コラーゲンなどを含んでいる。この結合組織に血小板力フォン' ヴイレブランド因子を介して結合後に、血小板が凝集塊を形成していく。

[0003] 一方、後者のフイブリンの形成と蓄積を中心とする工程は、二次止血 (Secondary He mostasis)と呼ばれている。フイブリンは、血液中の前駆体（フイブリノ一ゲン）カ^ロンビ ンなどのプロテアーゼ活性によって活性ィ匕されて形成される繊維状の蛋白質である。 一次止血で形成された血小板の集合構造は、フイブリンの凝集塊を形成するための 足場となるとともに、フイブリンによって構造自体が強化される。二次止血の中心とな るフイブリン形成に関与する因子として、現在までに第 I因子 (Factor I)から第 XIII因子 (Factor XIII)の 12種類の物質が同定されている（第 VI因子は欠番）。これらの物質は 、たとえば他の因子の活'性の調節によって、あるいはフイブリンの安定ィ匕等を通じて 血液凝固のための一連の反応に関与している。

[0004] 血液凝固に関与する多くの因子は、正常な状態では、血液中でその活性を巧妙に 制御されている。そのため、血管内を流れている血液は、正常な状態では凝固しな い。し力しいつたん出血が起きると、直ちに一次止血が開始される。更に二次止血を 構成する複数の因子の活性ィ匕が次々と起こる。正常な状態であれば、一連の工程は 秒単位で進行する迅速な生理反応である。 [0005] 血液凝固に関与する因子群の量や活性に異常が生じると、血液凝固メカニズムの 異常が起きる。たとえば、血液凝固を支えるいずれかの因子の発現や活性の低下が 起きると、正常な止血システムが動作しなくなる。このような状態を血液凝固異常とい う。種々の原因に起因する血液凝固異常が知られている。血友病 (hemophillia)は血 液凝固異常をともなう代表的な疾患である。

[0006] 血友病は、その原因によって、血友病 Aと血友病 Bに分類される。血友病 Aは、第 V III因子の量的、あるいは質的異常が原因である。一方、血友病 Bは第 IX因子の欠乏 を原因とする。まず第 vm因子は、トロンビンによって活性化される血液凝固因子であ る。活性化された第 Vin因子 (第 Villa因子）は、活性化した第 IX因子 (第 IXa因子)と結 合して第 X因子を活性ィ匕する。活性化された第 X因子 (第 Xa因子）は、トロンビンを活 性ィ匕してフイブリン形成につながる。一方第 IX因子は活性化された第 XI因子 (第 XIa 因子）によって活性化され、同じく活性化された Villa因子とともに第 X因子の活性ィ匕 因子となる。第 vm因子と第 IX因子は、いずれも、二次止血の最終段階に必要なトロ ンビンの活性化を支える重要な因子である。したがって、これらの因子の不足に起因 する血友病は、その程度によっては、重篤な血液凝固不全をともなう。

[0007] 血友病は、一般に、遺伝性の疾患である。したがって、現在のところ、疾患の原因 である遺伝的な原因を修復することは困難である。そのため血友病は、不足する因 子の補充によって治療されている (補充療法)。補充療法には、ヒト血液から精製され た第 vm因子や第 IX因子が利用された。しかしヒト血液を原料とする血液製剤の投与 によって、ヒト免疫不全ウィルスや肝炎ウィルスなどの感染症の被害が生じた。これら の感染症は、感染血液の排除や、病原ウィルスの不活性ィヒ技術の確立などにより、 その可能性を低くするための努力が続けられている。更に、これらの因子を遺伝子ェ 学的に製造した精製蛋白質製剤の実用化によって、血液凝固因子の投与に起因す る感染性疾患のリスクはほぼなくなつたと考えられている。

[0008] 感染の危険性が低下したとしても、現在の補充療法は、患者の日常生活を制約す る可能性がある。一般に、補充療法における血液凝固因子の投与量と投与スケジュ ールは、血液凝固因子の不足の程度に応じて設定される。通常、血液凝固因子は、 投与後、半日間程度は投与時の効果を維持し、その後、時間の経過とともに効果が 低下する。したがって血液凝固因子は、 6〜24時間おきに投与される。蛋白製剤で ある血液凝固因子は、静脈注射によって投与される。このような頻繁な静脈注射は、 患者の日常生活における制約となりかねない。

[0009] 更に、血友病の補充療法には、自己抗体の産生という問題も指摘されている。補充 療法を受けた血友病患者にお 、て、投与された血液凝固因子に対する中和抗体 (ィ ンヒビター）が検出されることがある。患者が産生する抗体は、投与した血液凝固因子 を中和し、その活性を奪ってしまう。その結果、自己抗体を有する患者においては、 通常の投与量では十分な治療効果を得られな 、。

[0010] 血友病の補充療法に対して、静脈注射を必要としない血液凝固因子の投与方法と して、遺伝子治療の試みが報告されている。たとえば、第 VIII因子をコードする遺伝 子を導入されたトランスジヱニックマウスの血小板で第 VIII因子の発現が観察され、遺 伝子治療による血友病の治療の可能性が示された (Blood 2003,; 102: 4006-4013)。 し力 実際にヒトの治療に応用するには、トランスジエニック動物以外の方法で、外来 性の第 VIII因子遺伝子の発現を誘導する必要がある。

[0011] トランスジエニック動物ではなぐウィルスベクターによる第 VIII因子遺伝子の発現の 誘導が試みられた。ウィルスベクターであれば、ヒトへの臨床応用の可能性がある。 すなわち、第 VIII因子をコードする DNAを組み込んだレンチウィルスベクターが骨髄 細胞などに導入された。そしてこの骨髄細胞が、血液凝固異常モデルマウス (第 VIII 因子ノックアウトマウス)に移植された (Mol Ther. 2003, May;7( 5 Pt 1):623- 631)。しか しこの報告においては、 in vitroでは第 VIII因子の強い発現が見られたものの、移植 マウスの末梢血においては十分な第 VIII因子活性を検出できな力つた。マウスにお いて、第 VIII因子に対する中和抗体が誘導されたこと力 in vivoにおける第 VIII因子 活性の低下の原因として予測された。

[0012] 本発明者らは、第 VIII因子を組み込んだサル免疫不全ウィルスベクターをヒト臍帯 血の CD34陽性細胞に導入した。そしてこの細胞を NOD/SCIDマウスに移植して血中 における第 VIII因子の発現を観察した。その結果、少なくとも 60日間にわたり、導入さ れた第 VIII因子の発現が継続することを確認した (J Gene Med. 2004 Oct.;6(10):1049 -1060)。し力し実験に用いた NOD/SCIDマウスは、重度の免疫不全状態にあるため、 自己抗体の影響については評価されていない。あるいは、グランツマン血小板無力 症 (Glanzmann thrombasthenia;GT)モデルマウスにおいて、血小板における接着因 子であるインテグリンを GPIIbプロモーターで発現させることによって、血小板の活性 が増強された (Fang J. et al. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2671- 9. Epub 2005 Jun 21.) 非特許文献 l :Yarovoi HV. et al., Blood 2003; 102: 4006-4013

非特許文献 2 : Kootstra NA. et al.,Mol Ther. 2003, May;7( 5 Pt 1):623- 631 非特許文献 3 : Kikuchi J. et al. J Gene Med. 2004 Oct. ;6(10): 1049- 1060

非特許文献 4 : Fang J. et al. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2671- 9. Epub 2005 Jun 21. 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 本発明は、遺伝子治療による血液凝固異常の治療技術の提供を課題とする。より 具体的には、本発明の課題は、トランスジエニック動物などの技術に頼らず、血液凝 固因子をコードする遺伝子の生体中での発現を実現し、遺伝子治療による血液凝固 異常の治療技術を提供することである。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明者らは、前記課題を解決するために、血液凝固因子をコードする遺伝子の 発現を、血小板特異的に誘導することができれば有効であろうと考えた。血小板にお いて発現した血液凝固因子は、血小板内部に保持され、生体の免疫システムとの接 触が絶たれる。そのため、従来技術において問題とされた中和抗体を誘導する可能 性が低いと考えられた。他方、血小板は、出血時には速やかに血管の損傷部位に集 合する。そして出血部位において活性ィ匕された血小板は、止血に必要なさまざまな 因子を細胞外に放出する。このとき、細胞内に蓄積された血液凝固因子の細胞外へ の放出が期待できる。

[0015] 本発明者らは、血小板特異的な血液凝固因子の発現誘導は、血液凝固異常の遺 伝子治療においては、理想的な遺伝子発現系であろうと考えた。このような考え方に 基づいて、本発明者らは、血小板特異的な血液凝固因子の発現のためのシステムの 構築を試みた。そして、血小板特異的な遺伝子発現を可能とするプロモーターの利 用によって、血小板における血液凝固因子の発現に成功した。

[0016] 更に、継続的な血液凝固因子の供給が必要な血液凝固異常の治療を目的として、 レンチウィルスベクターの応用について検討した。つまりレンチウィルスベクターに血 小板特異的なプロモーターの制御下に発現する血液凝固因子遺伝子を搭載した血 液凝固異常の遺伝子治療用ベクターを構築した。そして、この遺伝子治療用べクタ 一を導入した細胞を移植したモデル動物において実際に血液凝固能が改善される ことを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、次の血液凝固異常の治療剤 、治療方法、並びに治療用キットを提供する。

[0017] 〔1〕巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、お よび当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオ チドを含むレンチウィルスベクターを有効成分として含有する、血液凝固異常の治療 剤。

〔2〕プロモーターが、 GPIbプロモーターまたはそのバリアントである〔1〕に記載の治 療剤。

〔3〕血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド力 5'UTRを介して前記プロモータ 一に結合している〔2〕に記載の治療剤。

〔4〕血液凝固異常が血友病 Aであり、血液凝固因子が第 VIII因子またはその変異 体である〔1〕に記載の治療剤。

〔5〕血液凝固異常が血友病 Bであり、血液凝固因子が第 IX因子またはその変異体 である〔1〕に記載の治療剤。

〔6〕血液凝固異常が血友病 A、あるいは血友病 Bのいずれかの疾患であり、血液凝 固因子が第 VII因子またはその変異体である〔1〕に記載の治療剤。

〔7〕レンチウィルスベクターがサル免疫不全ウィルスベクターである〔1〕に記載の治 療剤。

〔8〕レンチウィルスベクター力 ゥマ伝染性貧血ウィルスベクター、ヒト免疫不全ウイ ルス 1ベクター、ヒト免疫不全ウィルス 2ベクター、ネコ免疫不全ウィルスベクター、ゥ シ熱性疾患ウィルスベクター、およびャギ関節炎 ·脳炎ウィルスベクターからなる群か ら選択されるいずれかのベクターである〔1〕に記載の治療剤。 〔9〕巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、お よび当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオ チドを含むレンチウィルスベクターを感染させた造血幹細胞。

〔io〕巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、 および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレ ォチドを含むレンチウィルスベクターを感染させた巨核球、及び Z又はその派生産 物である血小板。

〔11〕巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、 および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレ ォチドを含むレンチウィルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程と、レンチウイ ルスベクターを感染させた造血幹細胞を巨核球およびその派生産物である血小板の いずれか、または両方を含む細胞群に分ィ匕するまで培養する工程を含む、血液凝固 因子を蓄積した巨核球および血小板の!、ずれか、または両方の製造方法。

〔12〕次の工程を含む、血液凝固異常の治療方法；

(1)巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、およ び当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチ ドを含むレンチウィルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程、および

(2)工程 (1)の造血幹細胞を血液凝固異常を有する患者に投与する工程。

〔13〕造血幹細胞が、患者から採取された造血幹細胞を含む〔12〕に記載の方法。

〔14〕造血幹細胞が骨髄幹細胞、および末梢血造血幹細胞のいずれか、または両 方を含む細胞である〔13〕に記載の方法。

〔15〕工程 (1)の造血幹細胞を培養した後に患者に投与する〔12〕に記載の方法。

〔16〕次の要素を含む、血液凝固異常の治療用キット；

a:巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および 当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド を含むレンチウィルスベクター、および

b:造血幹細胞の採集試薬。

〔17〕下記の要素 cを付加的に含む、〔16〕に記載の血液凝固異常の治療用キット； c:造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地。

〔18〕造血幹細胞を巨核球に分ィ匕誘導するための培地が、少なくとも次の成分を含 む〔17〕に記載の血液凝固異常の治療用キット；

トランスフェリン；

インスリン；

幹細胞因子（stem cell factor)；

トロンボポェチン；

インターロイキン 6 ;

Fit- 3リガンド；および

可溶性インターロイキン 6受容体。

〔19〕血液凝固異常の治療剤の製造のためのレンチウィルスベクターの使用であつ て、該レンチウィルスベクターが巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に 特異的なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因 子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクターである、使用。

[0018] あるいは本発明は、巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプ 口モーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコード するポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクターの、血液凝固異常の治療剤の製 造における使用に関する。また本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プ 口モーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含む レンチウィルスベクターと、血液凝固異常の治療に用いるためのものであることを表 示した指示書を含む、血液凝固異常の治療用医薬パッケージを提供する。

発明の効果

[0019] 本発明に基づ 、て、血液凝固異常の新たな治療方法が実現した。本発明の血液 凝固異常の治療剤を用いれば、血液凝固因子が長期間にわたって血小板において 発現され、血液凝固能の改善効果が継続する。長期間にわたって治療効果が期待 できるので、少ない治療回数で十分な治療が実現できる。具体的には、血友病など の慢性の血液凝固異常においても、本発明によれば、たとえば数ケ月に一度の治療 (投与）によって、血液凝固能を安定に維持できる可能性がある。 [0020] 血友病患者には、しばしば治療目的で投与された血液凝固因子に対する中和抗 体が誘導され、その治療効果を制限する現象が観察される。中和抗体の誘導を防ぐ ことができる治療方法が実用化されれば、血友病の治療方法として有用である。本発 明においては、血小板で発現した血液凝固因子は、細胞内部に保持される。その結 果、患者の免疫システムが外来性の血液凝固因子と接触する機会が著しく制限され る。つまり本発明によれば、治療のために投与された血液凝固因子に対する中和抗 体の誘導が防止される。

[0021] 更に、既に中和抗体を有している血友病患者の治療においても、本発明による血 液凝固異常治療は有用である。中和抗体を有する患者においては、血中に投与さ れた血液凝固因子は、中和抗体と結合してその活性が低下してしまう。一方、本発明 においては、血小板内で発現した血液凝固因子は、血小板内部に保持される限り、 血流中の中和抗体と接触しないので、その活性が中和されることなく維持される。そ して出血部位において活性ィ匕した血症板力 放出された血液凝固因子力 出血部 位において血液凝固を助けるのである。本発明における、血流中の中和抗体からの 保護と、出血部位における血液凝固因子の放出の様子を図 8に示した。

[0022] 本発明による血液凝固因子に対する中和抗体の誘導の防止効果は、正常な状態 で、血液中に分泌されている血液凝固因子において、特に有利である。これらの液 性因子は、通常、血液凝固因子を血中に存在させることで、治療効果が達成される。 したがって、治療に当たり、投与された蛋白質と患者の免疫システムとの接触は避け れられない。すなわち中和抗体の誘導を防ぐことは、きわめて難しい課題であった。 一方本発明にお 、ては、血小板中に必要な血液凝固因子を保持させることによって 、液性因子であっても、十分な治療効果を達成することができる。更に、血小板に保 持された血液凝固因子は、免疫システムとの接触を避けることができる。すなわち本 発明は、液性の血液凝固因子の投与において、治療効果と、中和抗体の誘導防止 の、 2つの困難な課題のいずれをも解決することができる方法を提供した。

図面の簡単な説明

[0023] [図 1]血小板特異的プロモーター活性の比較を示す図である。（A)実験で使った血 小板特異的プロモーターの図解プレゼンテーションが示される。プロモーターなしの ベクター（基本）およびコントロールベクター（SV40/Enhancer)と共に、各構築物を UT -7/TPO (B)、 CD34+由来巨核球（C)、および HUVEC (D)にトランスフエタトした。ルシ フェラーゼ活性をトランスフエクシヨンの 48時間後に測定し、 SV40プロモーター（SV40 /Enhancer)に促進された活性と比較して示される。各実験は、重複サンプルで 5回実 行された。コラムおよびエラーバーは、平均士 SDを表す。

[図 2]CMVまたは GPIb aプロモーターで促進された eGFP遺伝子を有する SIVベクタ 一で形質導入された UT-7/TPO細胞および CD34+由来巨核球における eGFP発現を 示す図である。 （A)本研究で使った SIV構築物の概略図が示される。 UT-7/TPO (B) および CD34+由来巨核球（C)を指定された MOIにお!/、て SIV-pCMV-eGFPまたは SIV -pGPIb a - eGFPで感染させる。細胞内の eGFPの発現は、フローサイトメトリーによつ て分析した。コラムおよびエラーバーは、平均士 SDを表す (n=3)。（D)ヒト CD34+細 胞の巨核球分ィ匕の間の GPIIbおよび GPIbの細胞表面発現は、フローサイトメトリーに よって 0日目、 5日目、 7日目、 12日目、および 15日目に調べた。コラムおよびエラーノ 一は、平均士 SDを表す (n=3)。（E)分ィ匕の開始後の 0日目、 3日目、 7日目、および 1 4日目における CD34+由来巨核球を、 30の MOIにおいて SIV- pCMV- eGFPまたは SIV -pGPIb a -eGFPで形質導入した。コラムおよびエラーバーは、平均士 SDを表す (n = 3)。

[図 3]SIV-CMV-eGFPによる KSL細胞の形質導入を示す図である。培養 KSL細胞を、 24時間の間増加された濃度の SIV-pCMV-eGFPで (A)、または種々のインキュベー シヨン時間での固定濃度 (MOI = 30)においてトランスフエタトした (B)。指定されたィ ンキュベーシヨンの後、 KSL細胞内での eGFPの発現をフローサイトメトリーによって分 祈した。 eGFPを発現している形質導入細胞のパーセンテージを示す。コラムおよび エラーバーは、平均士 SDを表す（n = 3)。

[図 4a]インビボでの血液細胞における eGFP発現に対するプロモーターの相違の効 果を示す図である。培養 KSL細胞を、 SIV- pCMV- eGFPまたは SIV- pGPIb a - eGFPで 30の MOIにおいて形質導入した。放射線照射された各マウスは、 5 X 10⁵個の非分割 の全体骨髄細胞と共に 100, 000個の形質導入細胞を受容した。（A) CD45+リンパ球 における eGFP陽性細胞ならびに末梢血の中の顆粒球、赤血球（RBCs)および血小 板の代表的なフローサイトメトリー分析が示される。

[図 4b] (B)移植後の 14日目、 30日目および 60日目の CD45+リンパ球 (左）および血小 板 (右）における eGFP陽性細胞のパーセンテージが示される。コラムおよびエラーバ 一は、平均士 SDを表す（グループにっき n=5)。

[図 4c] (C)移植後 60日に、 Bリンパ球（B220)、 Tリンパ球（CD3)、顆粒球（Grl)、マク 口ファージ（CD1 lb)、および赤芽球 (TER119)を検出するために、抗体を使って骨髄 細胞を染色した。各系統細胞の中の GFP陽性細胞をフローサイトメトリーによって測 定した。データは 3つの実験の代表値である。

[図 5]hFVin形質導入 KSL細胞で移植されたマウスカゝら得られた器官における hFVin の発現を示す図および写真である。 (A)形質導入されて!/ヽな!ヽ KSL細胞 (コントロー ル）または SIV-pCMV-hFVIIIもしくは SIV-pGP¾ a -hFVIIIで形質導入された KSL細 胞を、「材料および方法」の項で記述されるように、致命的な放射線照射を受けた CL 57/B6マウスに注射した。示された器官における hFVIII遺伝子由来の複製について の RT- PCR分析が示される。コントロールのために、 RNAのマウス GAPDHについての RT-PCRを同時に行った。データは 4つの実験の代表値である。（B) SIVベクター由来 の mRNA発現を、「材料および方法」の項で記述されるようにリアルタイム定量 RT-PC Rによって定量化した。コラムおよびエラーバーは、平均士 SDを表す（グループにつ き n=4)。

[図 6]移植マウスにおける骨髄および脾臓での hFVIIIの発現を示す写真である。 (A) S IV-pCMV-hFVIIIまたは SIV-pGPIb a -hFVIIIで形質導入された KSL細胞を移植され たマウス由来の単離骨髄細胞を、マウス GPIb a (左）および hFVIII (中央）について免 疫染色した。 2つのイメージは右のコラムで重ね合わせられており、 SIV-pGPIb a -hF VIIIで形質導入された骨髄細胞において、 GPIb aおよび FVIII発現の重複する部位 が存在することを示して ヽる。（B)各移植マウス（陽性染色:灰色）の脾臓での hFVIII についての免疫組織化学。コントロールのために、ベクター感染なしの KSL細胞を移 植されたマウス力も得られた脾臓の切片を抗 FVIII抗体で同時に処理した。オリジナ ル倍率 X 400。

[図 7]血小板標的遺伝子送達による血友病 Aマウスの表現型修正を示す図である。 ( A) SIV-pGPIb a -hFVIIIで形質導入されたかまたは形質導入されて!/、な!/、KSL細胞 を移植された FVIII欠損マウス由来の血液を、 50 μ g/mlのコラーゲンおよび 1 μ Μの Ρ ΜΑで 15分間刺激する力または刺激しない。遠心分離の後に、血小板が欠乏した血 漿を得て、そして hFVIII抗原レベルを ELISAによって測定した。コラムおよびエラーバ 一は、平均士 SDを表す（グループにっき n=4)。 （B)コントロールの KSL細胞または SI V-pGPIb a -hFVIIIで形質導入された KSL細胞（コントロールで n= 10、 GPIb aで n=8 )を移植されたマウスの尾切断の後の 24時間以内の死亡率。死亡率は統計学的に力 ィ二乗検定によって評価した。

[図 8]血流中での、血小板内による導入遺伝子産物（血液凝固因子）の中和抗体から の保護と、出血部位における、活性化された血小板からの導入遺伝子産物 (血液凝 固因子)の放出の様子を模式的に示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0024] 本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結さ れた血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクターを有効 成分として含有する、血液凝固異常の治療剤に関する。本発明者らは、血小板特異 プロモーターによって、血小板において目的とする血液凝固因子の発現を誘導でき ることを確認した。更に当該遺伝子をレンチウィルスベクターで造血幹細胞に導入す ることによって、血液凝固因子が長期にわたって安定に発現され、実際に血液凝固 能を改善できることを確認した。

[0025] 本発明において、血液凝固因子とは、血液凝固に関与するタンパク質である。たと えば第頭子〜第 XIII因子 (第 V頭子は欠番）、ならびにその活性ィ匕型は、本発明に おける血液凝固因子に含まれる。 VWFなどの一次止血に関与する蛋白質もまた、本 発明における血液凝固因子に含まれる。本発明における血液凝固因子は、治療を すべき患者の動物種に由来するものであることが望ましい。したがって、ヒトを治療の 対象とするときには、ヒト由来の血液凝固因子を用いるのが好ましい。

[0026] 本発明において、血液凝固因子は、人工の蛋白質を含む。具体的には、次の蛋白 質は本発明における血液凝固因子に含まれる。

(1)天然の血液凝固因子と同等の活性を有する変異体 たとえば、ヒト第 vm因子は、その N末端を構成する Bドメインを欠損しても血液凝固 因子としての活性が維持されることが知られている (Blood Vol.81, No.ll, 1993: pp 29 25-2935, Blood Vol.84, No.12, 1994: pp 4214-4225, Eur J Biochem 1995 Aug.; 232 (1): ppl9-27)₀したがって、 Bドメインを欠損する第 VIII因子の変異体は、本発明の血 液凝固因子に含まれる。 Bドメインを欠損したヒト第 VIII因子のアミノ酸配列を配列番 号： 10に、そしてそれをコードする cDNAのコード領域の塩基配列を配列番号： 9に示 した。

そのほかの血液凝固因子についても、アミノ酸配列の付加、欠失、置換、および揷 入のいずれか、もしくは複数を含み、天然の血液凝固因子と同等の活性を維持した 変異体は、いずれも本発明における血液凝固因子に含まれる。

[0027] 第 VIII因子は 2332個のアミノ酸力もなる巨大な蛋白質である。第 VIII因子をコード する DNAは約 7kbに及ぶ。公知のベクターでは、このような大きな蛋白質を十分に発 現できな 、ものもあり、少しでも発現産物を小さくするために Bドメインを欠 、た変異 体（1457アミノ酸残基）が利用されることもあった。しかし本発明において血液凝固 因子遺伝子を搭載するレンチウィルスベクターは、大きな外来性遺伝子を搭載できる という特徴を持つ。したがって、 Bドメインを欠いた変異体のみならず、たとえば第 VIII 因子の全長をコードする DNAを搭載し、安定な発現を維持することもできる。

一方、本発明における血液凝固因子は、蛋白質に翻訳された後、分泌されることな く血小板内部に保持されるのが好ましい。血液凝固因子が血流中に分泌されると、 中和抗体の誘導、あるいはインヒビターによる中和の原因となる。したがって、本発明 における血液凝固因子には、リーダー配列を持たない構造とするのが好ましい。

[0028] (2)天然の血液凝固因子よりも強い活性を有する変異体

天然の血液凝固因子と同等な活性を有する蛋白質のみならず、天然の血液凝固 因子よりも強い活性、あるいは改変された性質を有する蛋白質も、本発明における血 液凝固因子として利用することができる。血液凝固因子としての活性、あるいは生体 中における安定性、あるいは生体に対する免疫原性などを改変した血液凝固因子を 取得することができる。これらの、天然の血液凝固因子に対して変異を含み、治療上 、望ましい形質を付加された変異体は、本発明における血液凝固因子として利用す ることがでさる。

たとえば、第 VIII因子の改変体 (EXPERIMENTAL and MOLECULAR MEDICINE, Vol. 34, No. 3, 233-238, July 2002)、あるいは第 VII因子の改変体 (Biochem. J. (200 4) 379 (497-503))等が報告されている。これらの改変体は、本発明における血液凝 固因子に含まれる。

[0029] 本発明において、たとえば以下に示すような血液凝固因子は、それぞれ次に示す ような血液凝固異常を伴う疾患の治療に有用である。各血液凝固因子に対して、上 記（1)あるいは（2)で述べたような変異体を本発明における血液凝固因子として利用 することちでさる。

血友病 A (第 VIII因子、第 Vila因子）

血友病 B (第 IX因子）

フォン ·ヴィルブランド病（フォン'ヴィルブランド因子）

第 I因子欠乏症、無フイブリノゲン血症、低フイブリノゲン血症 (第 I因子） 第 II因子欠乏症 (プロトロンビン）

第 V因子欠乏症、パラ血友病 (第 V因子）

第 VII因子欠乏症 (第 VII因子）

第 X因子欠乏症 (第 X因子）

第 XI因子欠乏症 (第 XI因子）

第 ΧΙΠ因子欠乏症 (第 XIII因子）

[0030] これらの疾患のうち、特に患者数の多い、血友病 A、血友病 B、およびフォン'ヴィル ブランド病は、社会的に重要な疾患である。したがってそれぞれの疾患の治療に有 用な、第 VIII因子、第 Vila因子、第 IX因子、およびフォン'ヴィルブランド因子、並びに これらの各因子と同等な活性を有する変異体は、本発明における好適な血液凝固因 子である。

[0031] 当業者は、本発明における血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを調製する ことができる。たとえば、ヒト由来の VWFや第 I因子〜第 XIII因子のアミノ酸配列、ある いは cDNAの塩基配列は公知である。したがって、 cDNAの塩基配列の一部または全 部をプローブとして、肝臓の cDNAライブラリーから、目的とするポリヌクレオチドを調 製することができる。あるいは、既知の塩基配列の一部をプライマーとして、肝などの 適当な組織の mRNAを铸型として、公知の核酸増幅法によって目的とするポリヌクレ ォチドを合成することもできる。

[0032] 本発明にお 、て、血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドは、血小板特異的な プロモーターと機能的に結合される。本発明において、機能的な結合とは、血小板 特異的なプロモーターの活性に応じて血液凝固因子をコードする遺伝子の転写が 起こるように、該プロモーターの下流に血液凝固因子をコードする遺伝子を連結する ことを言う。あるいは、プロモーターと遺伝子の機能的な結合は、血小板特異的なプ 口モーターの制御下に血液凝固因子をコードする遺伝子が発現することを意味する

[0033] 一方、本発明において、血小板特異的なプロモーターとは、任意の宿主細胞に導 入されたときに、血小板細胞においてプロモーター活性を発現する DNAを言う。より 具体的には、血小板特異的プロモーターは、たとえば造血幹細胞に導入されたとき に、血小板あるいはその前駆細胞である巨核球細胞にぉ 、てプロモーター活性を検 出することができる。本発明における好ましいプロモーターは、巨核球の分化の後期 における転写活性が高いプロモーターである。一方、血小板に対する特異性の無い プロモーターは、血小板や巨核球細胞以外の細胞にお 、てプロモーター活性が検 出される。

[0034] プロモーターの各細胞における活性は、レポーターアツセィの原理に基づいて評 価することができる。すなわち、活性を評価すべきプロモーターにレポーター遺伝子 を機能的に結合したコンストラクトを調製し、種々の細胞に導入する。当該コンストラタ トを導入された細胞においてレポーター遺伝子に起因するシグナルが検出されれば 、プロモーター活性が検出される。レポーター遺伝子としては、蛍光活性や酵素活性 などの各種のシグナルを生成する遺伝子が公知である。より具体的には、 GFP (蛍光 活性）、 LacZある 、は Luc (酵素活性)などをレポーター遺伝子として利用することが できる。

[0035] 本発明にお 、て、血小板特異的なプロモーター活性とは、当該プロモーターが導 入される細胞群の中で、血小板に対する特異性を有していれば良い。たとえば造血 幹細胞や骨髄細胞に導入する場合、導入された細胞群の中で、最終的に、血小板 特異的なプロモーター活性が確認されるプロモーターは、本発明における血小板特 異的なプロモーターに含まれる。本発明において、血小板特異的なプロモーターの 種類は限定されない。必要な活性を有する限り、由来する動物種も任意である。ある いは人為的に改変されたプロモーターを利用することもできる。

[0036] たとえば、血小板特異的膜糖タンパク質 GPIb a 'プロモーターは、血液凝固因子遺 伝子の血小板ある!/、は巨核球特異的な発現に好適なプロモーターである。具体的 には、 GPIb αのプロモーター活性は、特に巨核球の分ィ匕の後期で強化される。すな わち、血小板への分ィ匕の進行に応じて活性が強まる。したがって、血小板における 特異性の高いプロモーターである。更に、同じく血小板特異プロモーターとされてい る GPIIbよりもプロモーター活性が強!、。

[0037] 本発明にお!/、て利用することができる GHb aプロモーターの塩基配列を、配列番 号：7に示す。更に、配列番号： 7に記載の塩基配列を含むプロモーターは、その制 御下に発現する遺伝子のコード領域との間に非翻訳領域 (5'UTR)を配置することによ つて、転写活性が向上する。したがって、たとえば第 VIII因子遺伝子を当該プロモー ターと機能的に結合する場合には、第 VIII因子遺伝子の 5'UTRを GPIb aと第 VIII因 子遺伝子との間に介在させることができる。 GPIb α (配列番号： 7)の下流に第 VIII因 子遺伝子の 5'UTRを付加した塩基配列を配列番号： 8に示した。

[0038] 本発明において、 GPIb αプロモーターには、当該プロモーターと機能的に同等な プロモーターが含まれる。機能的に同等なプロモーターは、たとえば配列番号： 7に 記載の塩基配列 (ヒト)を基に、ホモロジ一検索等により探し出すことができる（例えば BLAST; Altschul, S. F. et al.， 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)。あるいは、配列番 号： 7に記載の塩基配列を基に設計したプライマーを用いたジエノミック PCRにより得 ることもできる。あるいはヒト以外の動物種のゲノムライブラリーを、配列番号： 7に記載 の塩基配列を有するプローブを使って、ストリンジェントな条件におけるハイブリダィ ゼーシヨンにより、ヒト以外の種に由来する相同なプロモーターを得ることもできる。具 体的には、 GPIb αプロモーターを含む核酸、またはハイブリダィズの対象とする核酸 のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にノ、イブリダィズすることを検出 することにより、 目的とするプロモーターを同定することができる。

[0039] ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨンの条件は、例えば 5 X SSC (1 X SSCは 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む)、 7%(W/V) SDS、 100 μ g/ml変性サケ精子 DNA、 5 Xデンハルト液（1 Xデンハルト溶液は 0.2%ポリビニールピロリドン、 0.2%牛血 清アルブミン、および 0.2%フイコールを含む）を含む溶液中、 48°C、好ましくは 50°C、 より好ましくは 52°Cでハイブリダィゼーシヨンを行 、、その後ハイブリダィゼーシヨンと 同じ温度、より好ましくは 60°C、さらにこの好ましくは 65°C、最も好ましくは 68°Cで 2 X S SC中、好ましくは 1 X SSC中、より好ましくは 0.5 X SSC中、より好ましくは 0.1 X SSC中で 、振蘯しながら 2時間洗浄する条件である。

[0040] このようにして取得されるプロモーターは、 GPIb aプロモーターと高!、ホモロジ一を 有する配列を含んでいる。高いホモロジ一とは、 70%以上、好ましくは 75%以上、より 好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、より好ましく は 95%以上の同一性を有する配列である。配列の同一性は、例えば BLASTプロダラ ムにより決定することができる (Altschul, S. F. et al.， 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-41 0)。具体的には、塩基配列の同一性を決定するには blastnプログラム、アミノ酸配列 の同一性を決定するには blastpプログラムを用い、例えば NCBI (National Center for Biothchnology Information)の BLASTのウェブページにおいて" Low complexity"など のフィルターの設定は全て OFFにして、デフォルトのパラメータを用いて計算を行う（ Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266—272; Madden, T.L. et al. (1996) M eth. Enzymol. 266: 131—141 ; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 -3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649—656)。パラメータには 、たとえば次のような数値を用いることができる。

open gapのコストはヌクレオチドは 5、

extend gapのコストはヌクレオチドは 2、

nucleotide mismatchのべナノレアィ ~~は- 3、

nucleotide matchの報酬は 1、

expect valueは 10、

wordsizeはヌクレオチドは 11、 Dropoff (X) for blast extensions in bitsi^blastnで ίま 20、

final X dropoff value for gapped alignment (in bits)i¾blastnで ίま 50

2つの配列の比較を行う blast2sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)により、 2配列のァライメントを作成し、配列の同一性を 決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、 GPIb aプロモーター全体 (例えば配列番号: 7の全長）に対する同一性の値を計算する。

[0041] また、 GPIb aプロモーターには多型およびバリアントが存在する可能性もある。また 、一般に、塩基配列の部分的な置換や欠失、あるいは挿入によっても、プロモーター 活性が維持されることは多い。このような、 GPIbひプロモーターのノ リアントを本発明 に使用することができる。 GPIb αプロモーターのバリアントは、一般に配列番号： 7の 塩基配列において 1または複数の塩基が置換、欠失、および/または挿入された配 列を含み得る。配列番号： 7に記載の塩基配列との違いは、通常 30塩基以内、好まし くは 20塩基以内、好ましくは 10塩基以内、より好ましくは 5塩基以内、より好ましくは 3 塩基以内、より好ましくは 2塩基以内である。ノ リアントのプロモーター活性は、たとえ ば先に述べたレポーターアツセィなどの方法によって確認することができる。その結 果、 GPIb αプロモーターと同等、あるいはそれ以上の活性を有することが確認された プロモーターは、本発明における GPIb aプロモーターとして好ましい。

[0042] 本発明の血液凝固異常の治療剤において、血小板特異的なプロモーターに機能 的に結合された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドは、レンチウィルスベクタ 一に組み込まれる。以下、本発明に利用することができるレンチウィルスベクターに ついて説明する。

[0043] ウィルスの生活環は大きく感染と増殖の段階に分けられる。一般にウィルスベクタ 一は、ウィルスの感染システムを利用して、遺伝子を効率よく宿主の細胞内に導入出 来ることが特徴である。多くのウィルスベクターは、安全性確保のため、増殖システム を排除して自己複製能を欠如させ、導入された細胞内での増殖を防止する措置がと られている。

[0044] ベクター粒子の構造を簡単に説明する。まずベクター粒子には、力プシドと呼ばれ る蛋白質の外殻がある。力プシドは gag遺伝子産物の構造蛋白質力も構成されている 。その力プシドの外側にエンベロープと呼ばれる膜構造がある。エンベロープは、感 染する細胞の種類を決定する機能を有する。力プシドの中には、 2コピーのベクター ゲノム RNA、 pol遺伝子産物である逆転写酵素が存在している。ウィルスベクターは宿 主細胞に感染すると、ベクターゲノム RNAは自らの上記逆転写酵素により逆転写され た後、宿主染色体に組み込まれてプロウィルス DNAとなり、感染を成立させる。

[0045] 一般にウィルスベクターは、パッケージングベクターとジーントランスファーベクター によって調製することができる。ノ ッケージングベクターは、パッケージングシグナル が除去されたウィルス DNAを搭載している。ウィルス DNAには、ウィルスタンパク質配 列が含まれている。ノ ッケージングベクターが導入された宿主細胞は、特にパッケ一 ジング細胞と呼ばれる。ノ ケージングベクターを宿主に導入すると、宿主細胞では 、ノ ッケージングシグナルがないために、空のウィルス粒子が作られる。

[0046] 一方のジーントランスファーベクターは、宿主染色体 DNAに組み込まれるために必 要なウィルス由来の遺伝子配列と、導入する外来遺伝子を搭載している。本発明に おいては、血小板特異的なプロモーターと血液凝固因子をコードするポリヌクレオチ ドを連結したコンストラクトが、ジーントランスファーベクターに外来遺伝子として搭載 される。このジーントランスファーベクターをパッケージング細胞に導入すると、ジーン トランスファーベクター力 供給されるベクターゲノム DNAが宿主染色体に組み込ま れた後、転写によってベクターゲノム RNAが作られる。このベクターゲノム RNA力 ノ ッケージング細胞によって作られるウィルス粒子に取り込まれ、宿主内に核酸分子を 導入する能力を有するウィルス粒子が生成される。

[0047] 一般に、自己複製能を欠如し、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウィル ス粒子を「ウィルスベクター」と呼ぶ。特に遺伝子組み換え技術により構築されたウイ ルスベクターは、「組み換え」ウィルスベクターと呼ばれる。ウィルスゲノムをコードする DNAとパッケージング細胞を用いて構築したウィルスベクターは、組み換えウィルス ベクターに含まれる。本発明におけるレンチウィルスベクターは、レンチウィルスに由 来するウィルスゲノムを含み、自己複製能を欠如し、宿主内に核酸分子を導入する 能力を有するウィルス粒子である。

レンチウィルスとは、レンチウィルス亜科（Lentivirus)に属するレトロウイルスを指す 。たとえば次のようなウィルス力 レンチウィルスに含まれる。

ヒト免 ヽ全ゥ ノレス (human immunodeficiency virus; HIV)；

(例えば HIV1または HIV2)、

サル免役不全ウィルス (simian immunodeficiency virus; biV)、

ネコ免疫不全ウィルス (FIV)、

マエディ ·ビスナウィルス、

ゥマ伝染性貧血ウィルス (EIAV)、

ャギ関節炎脳炎ウィルス (CAEV)

[0048] 本発明においては、任意の株およびサブタイプに由来するレンチウィルスベクター を利用することができる。例えば HIV-1としては、全てのメジャー（M)サブタイプ (Aか ら Jを含む）、 Nおよび outlier (0)が含まれる（Hu, D. J. et al.， JAMA 1996; 275: 210- 216; Zhu, T. et al, Nature 1998, 5; 391(6667): 594—7; Simon, F. et al, Nat. Med. 1 998, 4(9): 1032-7) o SIV単離株としては、 SIVagm、 SIVcpz、 SIVmac、 SIVmnd、 SIVsm 、 SIVsnm、 SIVsyk等が例示できる。これらのレンチウィルスベクターの中でも、サル免 疫不全ウィルス (SIV)ベクターは特に好まし 、ウィルスベクターである。

本発明における SIVベクターとして利用することができる SIVのゲノムの塩基配列を 配列番号： 14に示した。あるいは公知の SIVゲノムの塩基配列を利用することもできる (Fukasawa et al. Nature Vol. 333, p457— 461, 1988; GenBank Accession No. X078 05)。

[0049] 本発明にお 、て「サル免疫不全ウィルス (SIV)ベクター」とは、ウィルス粒子中の核 酸分子のうち、ウィルスベクターとしての機能に必須な配列が SIVゲノムに基づく配列 であるベクターを指す。本発明にお 、て「ウィルスベクターとしての機能に必須な配 列」とは、 5'側から順に、下記の領域を示すことができる。

5'LTRの R領域；

U5領域；

パッケージングシグナル（ φ )、 RRE;

3'LTRのプロモーター領域以外の U3領域； R領域；

[0050] 本発明における SIVベクターを構成する各領域の塩基配列として、たとえば次の塩 基配列を示すことができる。

配列番号： 1Z5'LTR領域力 パッケージングシグナルまでの塩基配列

配列番号： 2ZRRE配列

配列番号： 3Z3'LTRのプロモーター領域を欠如した U3領域から R領域までの塩基 配列

これらの塩基配列はその一例であって、同等の機能を有する塩基配列であれば、 本発明に利用できることはいうまでも無い。すなわち上述の定義に当てはまる限り、 本発明における SIVベクターは、改変を含むことができる。例えば、「ウィルスベクター としての機能に必須な配列」が SIV由来である限り、他に SIV由来の配列または SIV以 外の由来の配列を含んでいてもよい。好適に含まれ得る配列として、例えば、後述す る cPPT (central polypurine tract)、内部プロモーター（CMV) WPRE (woodchuck h epatitis virus posttranscnptional regulatory element) 挙けること; 0でさる。

[0051] サル免疫不全ウィルス (Simian Immunodeficiency Virus, SIV)はサルにおける HIV 類似ウィルスとして発見され、 HIVとともに Primates Lentivirusグループを形成してい る（井戸栄治，速水正憲，サル免疫不全ウィルスの遺伝子と感染，病原性.蛋白質核 酸酵素： Vol..39, No.8. 1994) oこのグループはさらに大きく次の 4つのグループに分 類される。

1)ヒトにお ヽて後天'性免投不全症候群 acquired immune deficiency syndrome, AID S)の原因となる HIV-1とチンパンジーより分離された SIVcpzを含む HIV-1グループ

2)スーティーマンガべィ Cercocebus atysより分離された SIVsmmとァカゲザル Mac aca mulattaより分離された SIVmac、ヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示す HIV-2 (Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retroviral" 16(5), 327-32, 1997)よりなる HIV- 2グループ、

3)アフリカミドリザル Cercopithecus aethiops力も分離された SIVagmに代表される SI Vagmグノレープ、

4)マンドリル Papio sphinxから分離された SIVmndに代表される SIVmndグループ [0052] このうち、 SIVagmおよび SIVmndには自然宿主における病原性の報告はな ヽ（Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115—22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol ., 18(3-4), 255-9, 1989;速水正憲， 日本臨床， 47, 1, 1989)。特に本実施例で用い た SIVagmの一種である TYO-1株は、自然宿主でも、力-クイザル Macaca facicularis 、ァカゲザル Macaca mulattaに対する実験感染でも病原性を示さないことが報告さ れている（Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6), :367—84, 1994; Honjo, S. et al" J. Med. Primatol, 19(1), 9—20, 1990)。

[0053] SIVagmのヒトに対する感染、発症については報告がなぐヒトに対する病原性は知 られていない。一般に霊長類におけるレンチウィルスは種特異性が高ぐ自然宿主か ら他種に感染、発症した例は少ない。あるいは感染した場合にも、その発症頻度が 低い、あるいは発症後の進行が遅いという傾向がある（Novembre, F. J. et al., J. Viro 1., 71(5), 4086-91, 1997)。従って、 SIVagm、特に SIVagm TYO- 1株をベースとして作 製したウィルスベクターは、 HIV-1や他のレンチウィルスをベースとしたベクターと比 ベて安全性が高いと考えられる。つまり SIVagm TYO-1株をベースとして作製したレン チウィルスベクターは、本発明における好ましいベクターである。 SIVagm TYO-1株の ゲノム塩基配列を配列番号： 14に示す。

[0054] 本発明におけるサル免疫不全ウィルスベクターは、他のレトロウイルスのゲノム RNA 配列の一部を含むことができる。例えば、次に示すような、 SIV以外のレンチウィルス のゲノム配列の一部を SIVのゲノムの一部と置換したキメラ配列を有するベクターも、 本発明における SIVベクターに含まれる。

ヒト免投不全ウィルス (Human Immunodeficiency Virus; HIV)；

ネコ免疫不全ウィルス Feline Immunodeficiency Virus (FIV) (Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4(3), 354—7, 1998)；

ャギ関節炎脳炎ウィルス Caprine Arthritis Encephalitis Virus (CAEV) (Mselli- Lakh al, L. et al., Arch. Virol, 143(4), 681—95, 1998)

[0055] 本発明におけるレンチウィルスベクターは、血小板特異的なプロモーターに機能的 に結合された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを搭載している組換え SIVベ クタ一を含む。本発明において、血液凝固因子として第 vm因子を利用する場合、第 VIII因子をコードするポリヌクレオチドを搭載した SIVベクターを、 SIV-FVIIIベクターと 記載する。本発明における SIV-FVIIIベクターは、上述の定義に該当する限り、種類 や構造を制限されない。本発明における好ましい siv-Fvmベクターは、第 vm因子を コードするポリヌクレオチドが挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクタ 一を用いて製造される SIVベクターを挙げることができる。

[0056] 本発明の SIV- FVinベクターは、 VSV- Gシユードタイプ化されて!/、てもよ!/、。 VSV- G シユードタイプ化とは、ベクターのエンベロープに水疱性口内炎ウィルス（Vesicular s tomatitis virus; VSV)の表面糖蛋白質である VSV-G蛋白質を含ませることを言う。 VS V-G蛋白質は、任意の VSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株 (J. Virology 39: 519-528 (1981))由来の VSV-G蛋白を用いることができるが、これに 限定されない。また、 VSV-G蛋白質は、天然由来の蛋白質から 1または複数のァミノ 酸の置換、欠失、および/または付加などにより改変されていてもよい。 VSV-Gシユー ドタイプィ匕ベクターは、ウィルスの産生時に VSV-G蛋白質を共存させることにより製造 することができる。

[0057] 例えば、 VSV-G発現ベクターのトランスフエクシヨンや、宿主染色体 DNAに組み込 んだ VSV-G遺伝子からの発現誘導により、ノ ッケージング細胞内で VSV-Gを発現さ せることにより、この細胞力 産生されるウィルス粒子が VSV-Gでシユードタイプィ匕さ れる。 VSV-G蛋白質は 1種類の糖蛋白が安定な 3量体を形成して膜上に存在するた め、精製過程でのベクター粒子の破壊が起こりにくい。また VSV-Gでシユードタイプ 化されたウィルス粒子は、遠心分離によって高濃度に濃縮することができる (Yang, Y. et al, Hum Gene Ther: Sep, 6(9), 1203-13. 1995)。

[0058] 本発明における SIV-FVIIIベクターは、付カ卩的に他のウィルス由来のエンベロープ 蛋白質を含むことができる。 SIV-FVIIIベクターに付加できるエンベロープ蛋白質とし て、例えば、ヒト細胞に感染するウィルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適であ る。エンベロープ蛋白質は、特に制限されない。たとえば、レトロウイルスのアンフォト 口ピックエンベロープ蛋白質などを、 SIV-FVIIIベクターに付カ卩することができる。

具体的には、レトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ蛋白質としては、例え ばマウス白血病ウィルス (MuLV) 4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用いることが できる。また、 MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えば pCL-lOAl(Imgenex) (Naviaux, R. K. et al" J. Virol. 70: 5701-5705 (1996))。その他 、ヘルぺスウィルス科の蛋白質としては、例えば単純へルぺスウィルスの gB、 gD、 gH 、 gp85蛋白質、 EBウィルスの gp350、 gp220蛋白質などが挙げられる。へパドナウィル ス科の蛋白質としては、 B型肝炎ウィルスの S蛋白質などが挙げられる。

[0059] 本発明における組換えサル免疫不全ウィルスベクターは、 LTR (long terminal repea t)に改変をカ卩えることもできる。 LTRはレトロウイルスに特徴的な配列であり、ウィルス ゲノムの両端に存在している。 5'LTRはプロモーターとして働き、プロウィルスからの m RNAの転写を促す。したがって、ウィルス粒子内にパッケージングされるウィルス RNA ゲノムをコードするジーントランスファーベクターの 5'LTRのプロモーター活性をもつ 部分を別の強力なプロモーターと置換すれば、ジーントランスファーベクターの mRN A転写量が増大し、ノ ッケージング効率、並びにベクター力価を上昇させることがで きる。

[0060] さらに、例えばレンチウィルスの場合、 5'LTRはウィルス蛋白質 tatによる転写活性の 増強を受けることが知られている。したがって 5'LTRを tat蛋白質に依存しないプロモ 一ターに置換することで、ノ ッケージングベクターから tatを削除することができる。

[0061] さて、細胞に感染し細胞内に侵入したウィルス RNAは逆転写された後、両端の LTR を結合させた環状構造となる。次 、で LTR間の結合部位とウィルスのインテグラーゼ が共役して細胞の染色体内にウィルスゲノム力 Sインテグレートされる。

プロウィルスから転写される mRNAは 5'LTR内の転写開始点より下流、 3'LTRの poly A配列までである。 5'LTRのプロモーター部分はウィルス内にパッケージングされない 。したがって、プロモーターを置換したとしても標的細胞の染色体に挿入される部分 には変化が無い。以上のことから、 5'LTRのプロモーターの置換は、より高力価で安 全性の高いベクターを作製することにつながると考えられる。従って、ジーントランス ファーベクターの 5'側プロモーターを置換して、パッケージングされるベクターの力価 を上昇させることができる。

[0062] また、 3'LTRの配列を部分的に削除し、標的細胞力も全長のベクター mRNAが転写 されることを防止する自己不活性化型ベクター (Self Inactivating Vector： SINベクター )の作製により、安全性を高めることもできる。標的細胞の染色体に侵入したレンチウ ィルスのプロウィルスは、 3'LTRの U3部分を 5'端に結合した形となる。したがってジ ーントランスファーベクターの転写産物は、逆転写後、標的細胞の染色体に組み込 まれた状態では 5'端に U3が配置され、そこ力もジーントランスファーベクター力もの 転写産物と同様の構造を持つ RNAが転写されることになる。

[0063] 仮に、標的細胞内にレンチウィルスあるいはその類似の蛋白質が存在した場合、 転写された RNAが再びパッケージングされ、他の細胞に再感染する可能性がある。 また 3'LTRのプロモーターにより、ウィルスゲノムの 3'側に位置する宿主由来の遺伝 子が発現されてしまう可能性がある（Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retoroviral Pathog enesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997)。この現 象はレトロウイルスベクターにおいてすでに問題とされ、回避の方法として SINベクタ 一が開発された (Yu, S. F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 83(10), 3194—8, 1986 )。

[0064] ジーントランスファーベクター上の 3'LTRの U3部分を欠失させることにより、標的細 胞内では 5'LTRや 3'LTRのプロモーターが無くなるため、全長の RNAや宿主遺伝子 の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行 われることになり、安全性が高ぐ高発現のベクターとなることが期待される。このよう なベクターは、本発明において好適である。 SINベクターの構築は、公知の方法また は本発明者らによる特許出願：国際公開番号 WO2002/101057の実施例 1 4に記 載の方法などに従えばよい。

[0065] レトロウイルスベクターなど、ゲノムに LTR配列を含むウィルスベクターを用いた遺伝 子治療の問題点の一つに、導入遺伝子の発現が次第に低下することがある。これら のベクターは宿主ゲノムに組み込まれると、宿主側の機序によりその LTRがメチル化 され、導入遺伝子の発現が抑制されてしまうことが原因の一つと考えられて 、る (Chal lita, P. M. and Kohn, D. B" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994)。 自己不活 性ィ匕 (SIN)型ベクターでは、宿主ゲノムに組み込まれると LTR配列の大部分を失うた め、 LTRのメチルイ匕による遺伝子発現の減弱を受けにくい利点がある。

[0066] 本発明者らによって、ジーントランスファーベクターの 3'LTRの U3領域を他のプロモ 一ター配列に置換して製造した自己不活性ィ匕型ベクターは、霊長類 ES細胞に導入 後、 2力月以上にわたって安定した発現を維持することが判明している (WO2002/101 057) oこのように、 LTR U3領域の改変により自己不活性化するように設計された SIN ベクターは、本発明において特に好適である。

具体的には、 3'LTRの U3領域の 1または複数の塩基が置換、欠失、および/または 付カロにより改変されたベクターは、本発明に含まれる。この U3領域は、単に欠失させ てもよいし、あるいはこの領域に他のプロモーターを挿入してもよい。このようなプロモ 一ターとしては、例えば CMVプロモーター、 EF1プロモーター、または CAGプロモー ターなどを挙げることができる。

[0067] また、本発明においてレンチウィルスベクターに搭載される血液凝固因子遺伝子は 、血小板特異的なプロモーターにより転写されるように設計される。例えば、上記のよ うに LTR U3領域を非 LTRプロモーターである血小板特異プロモーターと置換した場 合には、この改変 LTRにより血液凝固因子遺伝子を駆動することができる。あるいは 、実施例において示されるように、 LTR領域の間に血小板特異プロモーターを配置し 、その下流に血液凝固因子遺伝子を連結することにより、 LTRに依存せずに血液凝 固因子遺伝子の発現を誘導することができる。

[0068] HIVベクターをはじめとするレンチウィルスベクターは、宿主ゲノムが HIVプロウィル スをすでに保持して 、る場合、外来ベクターと内因性プロウィルスの間で組み換えが 生じ、複製可能ウィルスが発生しないかという危惧が指摘されている。これは、将来 実際に HIV感染患者に HIVベクターを用いる時には確かに大きな問題になろう。しか し SIVベクターは、 HIVとの相同配列はほとんどない。その上 SIVベクターは、ウィルス 由来の配列を 80%以上取り除 、た複製不能ウィルスなので、複製可能なウィルスが 構成される危険性は極めて小さい。つまり、他のレンチウィルスベクターに比べて SIV ベクターは安全 ¾が高い。

[0069] 本発明における SIVベクターは、上述の「ウィルスベクターとしての機能に必須な配 列」以外の SIVゲノム配列が一定以上除去されたベクターである。本発明にお 、て、 好ましい SIVベクターは、このベクターが由来する SIVのゲノム配列の 40%以上、通常 50%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上、更に好ましくは 80%以上が 取り除かれた複製不能ウィルスである。

[0070] レトロウイルスの産生には、宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジーントラ ンスファーベクター DNAを転写させ、 gag、 pol蛋白質およびエンベロープ蛋白質の存 在下でウィルス粒子を形成させる。ノ ッケージング細胞内の gag、 pol蛋白質はパッケ 一ジングベクターを用いて供給することができる。エンベロープ蛋白質は、パッケージ ングベクターによって供給することもできるし、あるいは別のベクターによって供給さ れてもよ 、。例えば VSV-G発現ベクターによって供給することもできる。

[0071] 本発明のジーントランスファーベクターは、少なくとも次の要素を含む。

5'LTR、

パッケージングシグナル配列、 血小板特異的プロモーター、

血液凝固因子遺伝子、および

3'LTR酉己歹 IJ

LTR配列は、 SIVベクターの改変として上述したように改変することができる。また、 上述の cPPT配列、 CMV配列、あるいは RRE配列等を組み込むことができる。ジーント ランスファーベクター DNAにコードされるパッケージングシグナル配列は、この配列に より形成される構造を保持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい。

[0072] 一方で、該ベクター DNA上のパッケージングシグナルと、 gag、 pol蛋白質を供給す るパッケージングベクターとの間で起こる組み換えによる野生型ウィルスの出現頻度 を抑制するためには、これらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。従 つて、ジーントランスファーベクター DNAの構築においては、パッケージング効率およ び安全性の両者を満足させるために、ノ ッケージングに必要な配列を含むできる限り 短 、配列を用いることが好ま 、。

[0073] 例えば、パッケージングベクターを SIVagm由来のものにした場合は、 HIV由来のジ ーントランスファーベクターはパッケージングされない。そのため、ジーントランスファ 一ベクター DNAに用いられるパッケージングシグナルは、 SIV由来に制限されると考 えられる。ただし、 HIV由来のパッケージングベクターを用いた場合、 SIV由来のジー ントランスファーベクターもパッケージングされる。したがって組換えウィルスの出現頻 度を低下させるために、異なるレンチウィルス由来のジーントランスファーベクターと ノ ッケージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成させることも可能である

。このようにして製造された SIVベクターも、本発明のベクターに含まれる。この場合、 霊長類のレンチウィルスの間の組み合わせ（例えば、 HIVと SIV)であることが好まし!/ヽ

[0074] ジーントランスファーベクター DNAでは、 gag蛋白質が発現しないように改変されて いることが好ましい。ウィルス gag蛋白質は、生体にとって異物として認識され、抗原 性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。 gag蛋白 質を発現しな!、ようにするためには、 gagの開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等 によりフレームシフトするように改変することができる。また、 gag蛋白質のコード領域 の一部を欠失させることが好まし 、。

[0075] 一般にウィルスのパッケージングには、 gag蛋白質のコード領域の 5'側が必要である とされている。従って、ジーントランスファーベクターにおいては、 gag蛋白質の C末側 のコード領域を欠失して 、ることが好ま 、。 ノ ッケージング効率に大きな影響を与 えない範囲でできるだけ広い gagコード領域を欠失させることが好ましい。また、 gag蛋 白質の開始コドン (ATG)を ATG以外のコドンに置換することも好ましい。置換するコド ンは、ノ ッケージング効率に対する影響が少ないものを適宜選択する。これにより構 築されたパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクター DNAを、適当 なノ^ケ一ジング細胞に導入することにより、ウィルスベクターを生産させることができ る。生産させたウィルスベクターは、例えばパッケージング細胞の培養上清から回収 することができる。

[0076] さらに、血液凝固因子遺伝子の導入効率および発現効率を高めるために、ジーント ランスファーベクター DNAを改変することができる。たとえば、導入効率を上昇させる ために、 cPPT配列を導入することができる。 cPPTは、もともと SIVゲノムに存在する配 列である。 HIVウィルスにおいてはかなり以前から報告がある（P.Charneau et al.： J.V irol 65: 2415-2431, 1991)。 HIVベクターにおいては cPPTを導入するとベクターゲノ ムの核への移行が良くなり、遺伝子導入効率が上昇することが報告されている (A.Sirv en et al.： Blood 96:4103—4110, 2000)。 [0077] 本実施例で使用した cPPTの塩基配列を配列番号: 4に示す。また発現効率を高め る改変の例としては、 WPRE配列の導入を挙げることができる。 WPREは遺伝子発現 効率を高める機能を有する因子である（US Patent 6284469： RNA export element an d methods of use)。他のレンチウィルスベクターでは CPPTと WPREの 2つの因子の同 時導入は個々の効果を更に高める結果が報告されている (SC.Barry et al.： Hum. Ge ne Ther. 12: 1103-1108, 2001)。本実施例で使用した WPREの塩基配列を配列番号 : 5に示す。

[0078] 本発明の SIV-FVIIIベクターにおいて、 cPPTは、一般的なレンチウィルスベクターに おける配置と同様の配置とすることができる。例えば、 cPPTをプロモーターと外部遺 伝子との間に配置してもよぐまたは RRE配列の上流に配置することもできる力 好ま しくは、血液凝固因子の転写を駆動する上述の血小板特異プロモーターの上流に配 置する（図 2A)。一方 WPREは、血液凝固因子遺伝子の下流に配置することができる

[0079] 本発明にお ヽて、ノ ッケージングベクターは、血液凝固因子遺伝子導入に必要で ない配列を取り除くことができる。必要でない配列として、修飾遺伝子と呼ばれる vif、 および vpr、並びに制御遺伝子の tat、および revを例示することができる。修飾遺伝子 産物はベクターにおいて必要でないことが報告されており (V.Kim et al.: J.Virol 72:8 11-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが 使用されている。また、 tatも削除され、 revは別のプラスミドに移すことにより更に安全 性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されている。ノ^ケ一ジングべ クタ一力も revを除いた場合は、別に、 rev発現ベクターを構築し、該 rev発現ベクター を本発明の SIV- FVIIIベクターの製造において使用することができる。 SIVagm TYO- 1株の revの塩基配列を配列番号： 6に示す。

[0080] 上記のようにして構築されたパッケージングベクターは、例えば、プロモーター配列 、ウィルスコアタンパク質配列（gag)、逆転写酵素配列 (pol)、 polyA配列を含む構成 とすることができ、実施例に示すように上記構成にさらに RRE配列を含むことができる 。また rev発現ベクターは、 rev配列の上流に該配列を制御するためのプロモーター、 rev配列の下流に polyA配列を配置した構成とすることができる。 [0081] ノ¾ /ケージング細胞に使われる細胞としては、一般的にウィルスの産生に使用され る細胞株であれば制限はない。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞の 由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。ノ ッケージング細胞として使 用されうるヒト細胞株としては、例えば 293細胞、 293T細胞、 293EBNA細胞、 SW480細 胞、 U87MG細胞、 HOS細胞、 C8166細胞、 MT- 4細胞、 Molt- 4細胞、 HeLa細胞、 HT1 080細胞、 TE671細胞などが挙げられる。サル由来細胞株としては、例えば、 COS1細 胞、 COS7細胞、 CV-1細胞、 BMT10細胞などが挙げられる。

[0082] 本発明の SIV-FVIIIベクターは、実質的に純粋になるよう精製することができる。具 体的には、フィルター濾過、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製 ·分離 方法によりベクターを精製することができる。例えば、ベクター溶液を 0.45 mのフィ ルターにて濾過後、 42500 X g、 90分、 4°Cで遠心を行うことで、ベクターを沈殿'濃縮 することができる。

[0083] 本発明の血液凝固異常の治療剤は、血液凝固異常を伴う疾患の治療および予防 に使用することができる。具体的には血友病の治療および予防に用いることができる 。たとえば、血液凝固因子として第 Vin因子あるいは第 Vila因子 (活性ィ匕型第 VII因子 )を用いた場合には血友病 Aの治療剤とすることができる。あるいは第 IX因子を血液 凝固因子として応用することにより、血友病 Bの治療剤とすることができる。上述した 血小板特異的プロモーターに機能的に結合した血液凝固因子遺伝子を搭載した SI V-ベクターは、必要に応じて薬学的に許容される所望の担体または媒体と適宜組み 合わせて上記疾患用の治療剤とすることができる。

「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクタ 一による遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、 生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)などと適宜組み合わせる ことができる。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。

[0084] 上記の血液凝固異常の治療剤を血小板前駆細胞に感染させ、血小板前駆細胞移 植組成物を製造することができる。ある 、は当該細胞を巨核球あるいは血小板に分 ィ匕させることによって、血液凝固異常の治療用の巨核球ある 、は血小板を製造する こともできる。すなわち本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモータ 一に機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウ ィルスベクターを感染させた血小板前駆細胞に関する。

本発明において、血小板前駆細胞とは、血小板への分化能を有する任意の細胞 が含まれる。たとえば、造血幹細胞は、血小板への分ィ匕能を有する細胞である。ある いは造血幹細胞力も分ィ匕した巨核球は、更に分ィ匕を経て血小板となる細胞である。 したがって、巨核球も血小板前駆細胞である。

[0085] 血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝 固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクターを血小板前駆細胞 に感染させる工程と、レンチウィルスベクターを感染させた血小板前駆細胞を巨核球 および血小板の!/ヽずれか、または両方を含む細胞群に分ィ匕するまで培養する工程 を含む、血液凝固因子を蓄積した巨核球および血小板のいずれか、または両方の 製造方法に関する。

[0086] たとえば造血幹細胞は、適当なサイト力イン類などの存在下で培養することによって 、巨核球細胞への分化が誘導される。培養を継続すれば、血小板前駆細胞である巨 核球は、血小板への分化が進む。造血幹細胞の、巨核球や血小板への分化は、各 細胞に特異的なマーカーの消滅あるいは出現を確認することによって検出すること ができる。あるいは、細胞の形態の変化を観察して、巨核球や血小板への分化を確 認することもできる。巨核球や血小板は、特徴的な形状を持つ細胞なので、形態の 変化を捉えることは容易である。

[0087] 本発明において、造血幹細胞 (hematopoietic stem-cell; HSC)とは、巨核球または 血小板の少なくともいずれかの血液細胞に分化し得る細胞を言う。言い換えれば、血 小板に分化するあらゆる血小板前駆細胞は、本発明における造血幹細胞に含まれる 。本発明では、造血幹細胞として、当該細胞を含む細胞群を利用することもできる。 具体的には、たとえば、骨髄や臍帯血を、造血幹細胞を含む細胞群として利用する ことができる。あるいは、末梢血幹細胞を造血幹細胞に利用することもできる。

[0088] 各血液細胞は、その形態や染色の特異性から同定することができる。染色法として は、ギムザ染色、ライト染色、メイ ギムザ染色、メイ—ダリユンワルド ギムザ染色、 ペルォキシダーゼ染色、エラスターゼ染色、 PAS染色等を用いることができる（新生化 学実験講座 8,血液 (上)， 1987, 8-15ページ参照)。

[0089] 造血幹細胞は、骨髄のみならず末梢血および臍帯血中にも存在する。これらの細 胞に本発明におけるレンチウィルスベクターを感染させ、患者に投与することによつ て本発明に基づく血液凝固異常の治療が実施される。本発明にお ヽて造血幹細胞 の投与とは、造血幹細胞を含む細胞組成物を患者に投与することを言う。具体的に は、骨髄移植 (BMT)、末梢血幹細胞移植 (PBSCT)、および臍帯血幹細胞移植 (CB SCT)などが含まれる。すなわち本発明は、骨髄細胞移植のみならず、末梢血造血幹 細胞移植および臍帯血移植においても適用することができる。 HSCは、顆粒球、単球 の前駆細胞をコロニーアツセィ法で算定したり、 HSCに特徴的と考えられる CD34 (抗 原）陽性細胞をフローサイトメーターで測定することにより同定することができる。

[0090] 具体的には、造血細胞としては、マウスであれば c-kit+、

lin―、 Sca-1+ (Os awa M, Hanada K, Hamada H, Nakauchi H. Science. 1996; 273: 242-245.)、ヒ卜では CD34+、 Thy+、 Lin―、 c-kit^low(Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94:5320-5325)の表現型を有する細胞が挙げられる。 lin" (lineage negative)の表現型は、適宜市販のキット等を用いて同定および選択するこ と力 Sできる力 ί列えば GPA、 CD3、 CD2、 CD56、 CD24、 CD19、 CD14、 CD16、および CD99bが全て negativeのものである。

[0091] ヒト造血幹細胞の分離方法は、以下の文献でも参照することができる。

Leary AG, Blood 69: 953, 1987;

Sutherland HJ, Blood 74: 1563, 1989;

Andrews RG, J Exp Med 169: 1721. 1989;

Terstappen LWMM, Blood 77: 1218, 1991;

Lansdorp PM, J Exp Med 175: 1501, 1992;

Briddell RA, Blood 79: 3159, 1992;

Gunji Y, Blood 80: 429, 1992;

Craig W, J Exp Med 177: 1331, 1993;

Gunji Y, Blood 82: 3283, 1993;

Traycoff CN, Exp Hematol 22: 215, 1994; Huang S, Blood 83: 1515, 1994;

DiGinsto D, Blood 84: 421, 1994;

Murray L, Blood 85: 368, 1995;

Hao Qし, Blood 86: 3745, 1995;

Laver JH, Exp Hematol 23: 1515, 1995;

Berardi AC, Science 267: 104, 1995;

Kawashima I, Blood 87: 4136, 1996;

Leemhuis T, Exp Hematol 24: 1215, 1996;

Civin CI, Blood 88: 4102, 1996;

Larochelle A, Nature Med 2: 1329, 1996;

Tajima S, J Exp Med 184: 1357, 1996;

Sakabe H, Stem Cells 15: 73, 1997;

Sakabe H, Leukemia 12: 728, 1998;および

原田実根他編，新しい造血幹細胞移植，南江堂， 1998, 9-23ページ

[0092] 例えばマウスの骨髄細胞は、大腿骨、及び頸骨より骨髄細胞をフラッシュにて採取 し、 Lysing buffer (0.38% NH CI in Tris- HC1, pH7.65)にて赤血球除去後、抗 Thyl.2

4

抗体およびゥサギ補体を用いた抗体補体反応による成熟 τ細胞の除去後に得られる

(Tomita Y, Mayumi H, Eto M, Nomoto K. J Immunol. 1990; 144: 463-473.)。または 、採取骨髄細胞を抗 B220 (B細胞)抗体、抗 CD3 (T細胞)抗体、抗 Gr-1 (顆粒球)抗 体、抗 Mac- 1 (マクロファージ）抗体、抗 DX-5 (NK細胞）抗体等の抗体でビーズあるい は遠心法にて lineageを除去して得られる（Sato T, Laver JH, Ogawa M. Blood. 1999; 94: 2548-2554.) o

[0093] ヒト造血細胞を骨髄より採取する場合は、全身麻酔下、腹臥位で、腸骨の左右それ ぞれ 3〜5ケ所から、 1回に数 mL程度の骨髄液を採取する（末梢血混入を避けるため )。採取量は同種移植の場合では細胞数は 3 (2〜5) X 10 kg (患者体重あたり）、自 家移植の場合で 1〜3 X 10Vkgを目標として骨髄採取する。骨組織などの混入がある ためメッシュを通した後、ノ ッグにつめる。骨髄移植の際には粗いフィルターを通して 投与される。本発明においては、こうして採取された骨髄液そのもの、骨髄液から単 離された造血幹細胞を含む細胞群、あるいは単離された造血幹細胞に、レンチウイ ルスベクターを導入することができる。

[0094] 同種移植の場合は、ヒト白血球抗原（human lymphocyte antigen； HLA)適合ドナー を選択することが好ましい。但し、 GVHD予防法の確立、新しい免疫抑制剤の開発、 および CD34陽性細胞の純ィヒ技術などにより、 HLA不一致のドナーでも移植は可能 になってきている。ドナーとしては、 HLA- A、 - B、および- DRの 3組 6抗原のうち、 4種 類以上、より好ましくは 5種類以上、より好ましくは全てがレシピエントと一致することが 好ましい。 ABOmajor不適合移植の場合、遠心分離により赤血球を除去したものを用 いる。 ABOminor不適合の場合、遠心分離にて血漿を除去したものを用いる。（森下 ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第 2版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東京、 (1 9"年） p²⁶0-²⁷⁷、参照）。

[0095] 末梢血より末梢血幹細胞を採取する場合は、 G-CSF 1 日 400 g/m (又は 10 μ g/k g)を 1回、または 2回に分割し、 5 日間または採取終了時まで連日皮下注射し、投与 開始 4日目カゝら 6日目までの期間に 1から 3回、末梢血 (静脈)から血球分離装置を用 Vヽて造血幹細胞を採取することができる（日本造血細胞移植学会のウェブページに おける造血幹細胞移植に関するガイドラインの説明資料を (2003年 4月 21日改訂第 3 版）を参照）。末梢血幹細胞（PBSC)の動員については、 Harada M et al., J. Hematot her 5: 63-71 , 1996、 Waller CF et al., Bone Marrow Transplant 18: 279-283, 1996、 Anderlini P et al., Blood 90: 903-908, 1997、原田実根他編，新しい造血幹細胞移 植，南江堂， 1998, 67-72ページ、名古屋 BMTグループ編，造血細胞移植マニュアル 改訂三版， 2004, 237-240ページも参照のこと。

[0096] 動員に用いる G-CSFとしては、野生型蛋白質の他、 N末端を改変した誘導体 (narto grastinなど）、糖鎖が付加された修飾蛋白質 (lenograstinなど）を用いることができる。 また G-CSFと他の造血因子を併用してもよい。例えば、 GM- CSF、 IL-3、または SCF などを併用することができる（Huhn RD et al., Exp Hematol 24: 839-847, 1996; Begle y CG et al. , Blood 90: 3378—3389, 1997; Lane TA et al. , Blood 85: 275-282, 1995) 。 G-CSF投与中は、腰痛、骨痛および発熱などの全身症状の軽減のため、 aspirinを 投与することができる。 [0097] ヒト末梢血造血幹細胞 (CD34+細胞）を得るには、上記で得られた末梢血幹細胞か ら CD34陽性細胞を CD34抗体磁気ビーズでの濃縮法 Isolex system (Baxter社など）、 CliniMACS (AmCell社）、アビジンカラムを通しての濃縮法（CEPRATE、 Cellpro社）、 CD34抗体をフラスコに固定ィ匕し、反応する細胞をフラスコに吸着させ、残りを洗い流 す (CELLECTOR、 AIS社)等の方法で CD34陽性細胞を分離採取することで得られる (森下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第 2版、小寺、斎藤監修、日本医学館、東 京、（1"⁹年） p²⁶0-²⁷⁷、参照）。

[0098] ヒト臍帯血細胞移植では、採取した臍帯血に、赤血球沈降剤血球を加え、重量によ つて各血液画分に分け、移植時には不要となる血漿画分、赤血球画分を除き、必要 な造血幹細胞を得る。更に CD34陽性細胞を Isolex system (Baxter社）、 CliniMACS ( AmCell社）、アビジンカラムを通しての濃縮法（CEPRATE、 Cellpro社）、 CD34抗体を フラスコに固定ィ匕し、反応する細胞をフラスコに吸着させ、残りを洗い流す (CELLEC TOR, AIS社)等の方法によって純化することで臍帯血 CD34陽性造血幹細胞を得る ことができる (森下ら編、『造血幹細胞移植マニュアル』第 2版、小寺、斎藤監修、日 本医学館、東京、（1999年）、 p661-680、参照；)。

[0099] 単離した造血幹細胞は、例えばメチルセルロース法により、 SCF、 IL-3、 GM- CSF、 G- CSF、 Epoを添カ卩した培地で培養することができる（Sonoda Y. et al.， Blood 84: 40 99-4106, 1994; Kimura T. et al.， Blood 90: 4767-4778, 1997)。造血細胞は 1 X 10² 力 1 X 10⁴/ml程度で添カ卩し、例えば 37°C、 5% CO、 5% 0 下で培養する。但し、培

2 2

養条件は適宜調整してよい。

[0100] 自家移植にぉ 、ては、簡便性の点力 末梢血幹細胞移植が選択されることが多!ヽ 力 自家骨髄移植も適用される。その場合、通常は、化学療法の影響のない造血回 復期に、骨髄の正常造血を確認後、全身麻酔下に腸骨および胸骨から採取する。 目標細胞数は、骨髄有核細胞 3 X 10⁸から 5 X 10⁸/kg程度である。連続式血液成分分 離装置で得られた細胞浮遊液は、顆粒球や赤血球の混入が非常に少ないため、単 核球分離操作を省略することができる。顆粒球や赤血球が多く含まれる場合には、 Fi coll比重遠心法により単核球を分離することができる。骨髄液の場合は、顆粒球や赤 血球の除去と濃縮のため、 Ficoll処理または血液分離装置による単核球分離を行うこ とがでさる。

[0101] 採取した細胞を凍結保存する場合は、 10%自己血清、 10%DMSOを含む RPMI164 0培地に浮遊させて凍結させ、 programmed freezerで凍結、液体窒素中で保存する。 細胞濃度は 2 X 10⁷から 6 X 10ソ mlとすることができる。比較的短期間の細胞保存のた めには、細胞浮遊液（1 X 10⁸/ml以下の濃度）に終濃度 6% Hydrodyethyl Starch (HE S)、 5% DMSO、 4% albuminとなるように、氷冷した等量の保存液を混合し、 - 80°Cの de ep freezerで凍結保存することができる（Knudsen LM et al., J. Hematother. 5: 399-4 06, 1996)。

[0102] 安全な自家移植に必要な CD34陽性細胞数は、およそ 2 X 10⁶/kgである（Schots R e t al., Bone Marrow Transplant. 17: 509—515, 199b; Zimmerman TM et al., Bone Mar row Transplant. 15: 439-444, 1995)。 CD34陽性細胞数は、通常の 2 color flowcytom etryで計測することができる。具体的には、骨髄細胞や末梢血ァフェレ一シス細胞を 溶血処理により赤血球を除去した後、 forward scatterと抗 CD45抗体で展開し、 gateを 決めて赤血球および血小板を除く。次に、この gateを side scatterと抗 CD34抗体で展 開し、好中球などの非特異反応部分を除 、た分画中の細胞数の全細胞数に対する 割合で算定する。この値と、予め血球計測機で測定した血球数から、全 CD34陽性細 胞数が算出できる。

凍結保存した細胞に含まれる viableな幹細胞の数は、コロニー形成法により CFU-G Mを数える方法で知ることができる。移植に必要な CFU-GMの基準は、一般的には 1 X 10⁵〜2 X 10⁵/kgである。

[0103] 上記のように調整した造血幹細胞、あるいは造血幹細胞を含む細胞群を本発明の 血液凝固異常治療剤と接触させることにより、血液凝固因子遺伝子を搭載したレンチ ウィルスベクターを造血幹細胞に導入することができる。レンチウィルスベクターと造 血幹細胞は、体内（in vivo)または体外 (in vitroまたは ex vivo)で接触させることがで きる。例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶 液中で両者を接触させて、レンチウィルスベクターを細胞中に導入することができる。 このとき、ポリプレンやレトロネクチンなどの存在下で両者を接触させることにより、レン チウィルスベクターの感染効率を高めることができる。 [0104] ベクターと造血幹細胞との接触においては、 MOI (多重感染度； 1細胞あたりの感染 ウィルス数）を 1〜500の間で調節することができる。 MOIは、通常 2〜300、たとえば 3 〜200、好ましくは 5〜100、さらに好ましくは？〜 70である。このような条件において、レ ンチウィルスベクターは、ごく短時間で造血幹細胞に導入される。具体的には、両者 の接触時間を、 1分以上、通常 3分以上、たとえば 5分以上、好ましくは 10分以上、あ るいは 20分以上とすることができる。例えば 1〜60分程度、より具体的には 5分〜 30分 程度、両者を接触させることができる。もちろん、それ以上の時間接触させてもよぐ 例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。

[0105] ベクターを導入した造血幹細胞は、薬理学的に許容される所望の担体または媒体 と組み合わせて造血幹細胞移植組成物とすることができる。「薬学的に許容される担 体または媒体」とは、生細胞を懸濁できる溶液であれば制限はない。例えばリン酸緩 衝生理食塩水（PBS)、塩ィ匕ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が挙げられる。

[0106] また造血幹細胞移植組成物は、ベクターを導入して 、な 、造血細胞が含まれて!/ヽ てもよい。ベクターを導入した造血細胞と、ベクターを導入していない造血細胞を混 合することにより、造血細胞の生着効率は上昇し得る。混合比率は、それに限定され な 、が、例えばベクター導入造血細胞：非導入造血細胞を 1： 10〜10： 1の間で適宜 調整してよい。

[0107] また本発明は、前記レンチウィルスベクターが導入された造血細胞から巨核球ある いは血小板を分化誘導する方法に関する。この方法は、（a)血小板特異的プロモー ターと機能的に結合された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを搭載したレ ンチウィルスベクターを造血幹細胞に接触させる工程、および (b)工程 (a)の造血幹 細胞を動物に注入する工程、を含む。

[0108] あるいは本発明は、次の工程を含む、血液凝固異常の治療方法に関する。

(1)血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液 凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクターを造血幹細胞に 感染させる工程、および

(2)工程 (1)の造血幹細胞を血液凝固異常を有する患者に投与する工程

本発明において、血液凝固異常の治療に用いられる造血幹細胞の由来は限定さ れない。治療対象である、患者力 採取された造血幹細胞であれば、生着が容易で GVHDなどの危険性も無い。しかし免疫抑制剤などを利用すれば、異なる個体の造 血幹細胞を本発明に応用することもできる。本発明による治療方法において、造血 幹細胞は、血小板に分ィ匕しうる細胞であれば、その由来は限定されない。具体的に は、骨髄幹細胞、および末梢血造血幹細胞のいずれか、または両方を含む細胞など を用いることができる。たとえば骨髄細胞は、本発明の治療方法における、好ましい 造血幹細胞である。

[0109] 本発明にお 、て、レンチウィルスベクターを感染させた後の造血幹細胞は、適宜培 養した後に患者に投与することもできる。たとえば、前記レンチウィルスベクターを感 染させた造血幹細胞を、分化誘導用培地で培養して、巨核球への分化を誘導するこ とで、本発明による血液凝固異常の治療効率を高めることができる。通常、造血幹細 胞は、巨核球 (血小板前駆細胞)のみならず、赤血球や白血球への分化能も有して いる。そのため、単に造血幹細胞を生体に戻すだけでは、レンチウィルスベクター感 染細胞は、巨核球のみならず、赤血球や白血球へも分ィ匕する可能性がある。

[0110] しかし本発明においては、血液凝固因子を血小板特異プロモーターの制御下に発 現させるため、これらの血小板以外の血液細胞では、血液凝固因子が発現できない 可能性がある。したがって、レンチウィルスベクターを感染させた造血幹細胞に占め る巨核球に分ィ匕する細胞の割合を高めることが、本発明の治療効果の向上につなが る。巨核球への分ィ匕を誘導することができる培養条件は公知である。

[0111] たとえば患者力 採取された骨髄力 下記の組成の IMDMで 24時間程度培養され る。培養後、レンチウィルスベクターを接触させ、更に 10時間〜 24時間経過後に細 胞は洗浄され、患者に投与される。培養にはレトロネクチンは必須ではない。

IMDM 1%血清ァノレブミン

200 micro— g/mL of transferrin (トランスフェリン）

10 micro- g/mL of insulin、インスリン)

100 ng/mL of SCF (幹細胞因子； stem cell factor)

10 ng/mL〜100 ng/mL of TPO (トロンボポェチン）

100 ng/mL of IL- 6 (インターロイキン 6) 100 ng/mL of Fit- 3L (Fit- 3リガンド）

400 ng/ml of sIL- 6R (可溶性 IL- 6受容体）

上記組成中、血清アルブミンには、たとえば、脂肪酸除去ゥシ血清アルブミン (fatty acid-free BSA)、あるいはウィルスフリーのヒト血清アルブミン製剤等を利用することが できる。また TPOの添カ卩量としては、具体的には、たとえば 100 ng/mLをカ卩えることが できる (Mostoslavsky et al.Mol. Ther. 11, 932—940, 2005)。

[0112] 本発明による血液凝固異常の治療方法に利用する要素を予め組み合わせて、治 療用キットとして供給することもできる。すなわち本発明は、次の要素を含む、血液凝 固異常の治療用キットに関する。

a:血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液 凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクター、および b:造血幹細胞の採集試薬。

[0113] 本発明の治療用キットにおいて、前記レンチウィルスベクターは、治療に必要な量 を個別にパッケージすることができる。たとえば臍帯血移植の場合には、一般に生着 に必要な造血幹細胞は 2-3 X 10⁷ cell/kgとされている。したがって、 50 kgの体重の 方を予測すると、計算上、 1-1.5 X 10⁹個の細胞が必要である。 MOI 10、 Functional Titerが 1 X 10^1Q/mlと仮定すると、ウィルス液量は 1-1.5 mlとなる。もしも MOI 30であ れば、液量は単純にその 3倍である。

[0114] あるいは公知の重症複合型免疫不全症の患者に対して、骨髄細胞から CD34陽性 細胞を分離して、 14-38 X 10⁶/kgの細胞が投与されている（N Engl J Med. 2002 Apr 18;346(16): 1185-93)。なおこの報告の条件では、投与された細胞中、遺伝子導入さ れた細胞は 5-20 X 10⁶/kgである。同様の条件で本発明を実施する場合、おそよ 2 X 10ソ kgの細胞の全てにレンチウィルスベクターを感染させてを 50 kgのヒトに投与 するとして、 1 X 10⁹の細胞が必要となる。この処理に必要なウィルス液量は、 MOI 1 0で 1 mlである。したがって、本発明の治療用キットにおいて、レンチウィルスベクター は、 MOI 10として、たとえば 0.05〜50 mL、通常 0.5〜20 mL、具体的には 0.8〜10 mL 、ある!/、は 0.8〜2 mLの液量とすることができる。

[0115] 更に本発明者らの知見によれば、本発明においては、レンチウィルスベクターは、 投与される全ての細胞ではなぐ半分程度の細胞に感染させることで、十分な治療効 果を期待できる。したがって、レンチウィルスベクターの使用量は、更に少量とするこ ともできる。具体的には、 MOIを 15程度として、同量のウィルス液量でキットを構成す ることができる。あるいは、感染させる細胞の数を、上記条件のたとえば半分程度とし ても、治療効果は期待できる。

[0116] 一方、同じく本発明の治療用キットを構成する造血幹細胞の採集試薬とは、前記レ ンチウィルスベクターを感染させるべき、造血幹細胞を得るための試薬である。ヒトの 造血幹細胞を単離するための方法は公知である。具体的には、たとえば、造血幹細 胞を単離するための細胞マーカーに結合する抗体は、造血幹細胞を得るための試 薬に含まれる。

[0117] 本発明の治療キットは、付加的に造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地 を含むことができる。既に述べたように、レンチウィルスベクターを感染させた造血幹 細胞は、巨核球に分ィ匕する割合を高めることによって、本発明の治療効率を高めるこ とができる。造血幹細胞を巨核球に誘導しうる培地は公知である。たとえば、以下の サイト力イン類などを含む培地は、骨髄細胞の分ィ匕誘導ための培養に有用である。 トランスフェリン；

インスリン；

幹細胞因子（stem cell factor)；

トロンボポェチン；

インターロイキン 6 ;

Fit- 3リガンド；および

可溶性インターロイキン 6受容体

[0118] あるいは、由来が異なる造血幹細胞（ドナー）の患者 (レシピエント)への移植によつ て本発明に基づく治療方法を実施することもできる。すなわち、ドナーから採取され た造血幹細胞に、レンチウィルスベクターを感染させる。そして得られた造血幹細胞 力 必要に応じて培養した後に、血液凝固異常を有する患者に投与される。通常の 条件では、造血幹細胞は、患者の免疫応答によって排除される可能性が高い。しか し、予めレシピエントを免疫抑制処置することによって、ある程度の造血幹細胞は生 着することが明らかにされている。このように、骨髄組織の完全な破壊を伴わない移 植方法は、ミニ移植などと呼ばれる。したがって、ドナーの造血幹細胞を用いても、本 発明に基づ 、て血液凝固異常の治療方法を実施することができる。

[0119] ドナーの造血幹細胞を利用して本発明の治療方法を実施する場合、レンチウィル スベクターを感染させた造血幹細胞を血液凝固異常の治療剤として供給することも できる。すなわち本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機 能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルス ベクターを感染させた造血幹細胞に関する。

あるいは本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的 に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクタ 一を感染させた造血幹細胞を有効成分として含有する、血液凝固異常の治療剤を 提供する。更に本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機 能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルス ベクターを感染させた造血幹細胞の、血液凝固異常の治療剤の製造における使用 に関する。

[0120] 更に、本発明においては、レンチウィルスベクターを感染させた造血幹細胞力も分 化した巨核球あるいは血小板を血液凝固異常の治療剤として供給することもできる。 すなわち本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に 連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクター を感染させた造血幹細胞から分化した、巨核球および血小板のいずれか、または両 方を提供する。本発明において、これらの巨核球および血小板を、血液凝固因子導 入細胞と記載する。

あるいは本発明は、前記血液凝固因子導入細胞を有効成分として含有する、血液 凝固異常の治療剤を提供する。更に本発明は、前記血液凝固因子導入細胞の、血 液凝固異常の治療剤の製造における使用に関する。

[0121] 加えて本発明は、血小板特異プロモーター、および当該プロモーターに機能的に 連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクター を感染させた造血幹細胞と、当該造血幹細胞が血液凝固異常の治療に用いられる ことを記載した指示書を含む、血液凝固異常の治療用医薬パッケージに関する。同 様に本発明は、前記血液凝固因子導入細胞と、当該血液凝固因子導入細胞が血液 凝固異常の治療に用いられることを記載した指示書を含む、血液凝固異常の治療用 医薬パッケージを提供する。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。

実施例

[0122] <材料および方法 >

(1)マウス

FVIII遺伝子のェクソン 16の標的破壊のある血友病 Aマウスは、 H.H.Kazazian Jr. ( ペンシルバニア大学、フィラデルフィア、 PA、米国）から提供された（Bi, L., Lawler, A .M., Antonarakis, S.E., High, K.A., Gearhart, J.D., and Kazazian, H.H.Jr. (1995) T argeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nat. Genet. 10, 119-121)。 C57BL/6 (B6- Ly5.2)マウスは、日本 SLC (静岡、 日本） から購入した。 Ly5遺伝子座 (B6- Ly5.1)に遺伝子を導入した C57BL/6マウスは、 San kyo-Labサービス (筑波、日本)から購入した。動物管理は、自治医科大学における 規格ィ匕された動物管理および関連委員会のガイドラインに従った (Madoiwa, S., Yam auchi, T., Hakamata, Υ·, Kobayashi, Ε·, Arai, Μ., Sugo, Τ·, imuro, J., and ba ata, Y. (2004) Induction of immune tolerance by neonatal intravenous injection of human factor VIII in murine hemophilia A. J. Thromb. Haemost. 2, 754-762)。

[0123] (2)サイト力インおよび抗体

組換えヒトトロンボポイエチン (TPO)および組換えヒト幹細胞因子 (SCF)は、キリンビ ール社 (群馬、 日本)から提供された。以下の材料は示された供給元から入手した。 組換えヒ HL- 6 (IL-6)、組換えヒト可溶性 IL- 6受容体 (sIL- 6R)および組換えヒト Flt3 -リガンド（Flt3- L) (PeproTech EC、ロンドン、英国）；

組換えヒト IL- 3 (IL-3) (TECHNE社、ミネアポリス、 MN)；

抗マウス C-キットモノクローナル抗体（MoAb) (クローン 2B8)、抗マウス Sea- 1 MoAb ( クローン D7)、抗マウス Ly5 (CD45) MoAb (クローン 30- F11)および抗マウス Ly5.1 (CD 45.1) MoAb (クローン A20) (BD Pharmingen社、 CA)；

抗マウス GPIb a MoAb (クローン Xia.G5) (Emfret Analytics GmbH社、 Wurzbergゝド イツ）；抗ヒト GPIIb/IIIa MoAb (クローン 5B12)、抗ヒト GHb a MoAb (クローン AN51)お よび抗ヒト CD34 MoAb (クローン BIRMA—K3) (DakoCytomation、 Glostrup、デンマー ク)。

[0124] (3)細朐焙着

ヒト巨核芽球細胞株 UT- 7/TPOは、 Norio Komatsu博士（山梨大学、山梨、 日本)か ら提供された（Komatsu, N" Kunitama, M., Yamada, M., Hagiwara, T" Kato, T" Miy azaki, H., Egucni, M., Yamamoto, M., and Miura, Y. (1996) Establishment and chara cterization of the thrombopoietin- dependent megakaryocytic cell line, UT- 7/TPO. Blood 87, 4552-4560) oその細胞を、 10%ゥシ胎児血清（FBS)および lOng/mLの TP 0を補った Iscove's modified Dulvecco培地（IMDM)で培養した。

ヒト臍静脈内皮細胞 (HUVEC)を入手し、前述されるように維持した (Hisano, N., Ya tomi, Y., Satoh, Κ., Akimoto, S., Mitsumata, M., Fujino, M.A., and Ozaki, Y. (1999 ) Induction and suppression of endothelial cell apoptosis by sphingolipids: a possible in vitro model for cell— cell interactions between platelets and endothelial cells. Bloo d 93, 4293-4299)。

[0125] (4) 核球分化

臍帯血由来のヒト CD34+細胞を、 AutoMACS磁気細胞分類システム（Miltenyi Biote 、 Auburn, CA)を製造業者の指示に従って用いることにより単離した。単離された C D34+細胞の純度は、 90%を越えていた（データは示していない）。 CD34+細胞を、 50η g/mlの ΤΡΟおよび 10ng/mlの IL- 3を補った、 1%の脱脂肪酸 BSA、 200 g/mlのヒト鉄 飽和トランスフェリンおよび 10 μ g/mlのヒト組換えインシュリンを含む IMDMで増殖させ て巨核球に分化させた（Majka, M., Rozmyslowicz, T.， Lee, B.， Murphy, SI., Pietrz kowski, Z., Gaulton, G.N., Silberstein, L., and Ratajczak, M.Z. (1999) Bone marrow CD34 cells and megakaryoblasts secrete — chemokines that block infection of hema topoietic cells by M— tropic R5 HIV. J. Clin. Invest. 104, 1739—1749)。 14日間の培 養の後に、細胞の 75〜90%が GPIIb/IIIに対して陽性であった（図 2C)。 [0126] (5)ルシフェラーゼリポータープラスミド、一渦性トランスフエクシヨンおよびルシフェラ ーゼアツセィの構築

最大のプロモーター活性を有するとされる以下の DNAフラグメントを、ヒトゲノム DNA をテンプレートとして用いた PCRによって増幅した。

GPIIbプロモーター：— 554〜+ 28 (Prandini, M.H., Uzan, G.， Martin, F.， Thevenon, D., and Marguerie, G. (1992) Characterization of a specific erythromegakaryocytic enhancer within the glycoprotein lib promoter. J. Biol. Chem. 267, 10370-10374)；

GPIb αプロモーター：— 254〜 + 330 (Hashimoto, Y.， and Ware, J. (1995) Identificat ion of essential GATA and Ets binding motifs within the promoter of the platelet gly coprotein lb gene. J. Biol. Chem. 270, 24532-24539)；および

GPVIプロモーター：- 320〜 + 28 (Holmes, ML., Bartle, N.， Eisbacher, M., and Ch ong, B.H. (2002) Cloning and analysis of the thrombopoietin- induced megakaryocyt e— specific glycoprotein VI promoter and its regulation by GATA— 1, Fli-1, and Spl. J. Biol. Chem. 277, 48333-48341)

[0127] PCR- Blunt- TOPO (Invitrogen社、 Carlsbad、 CA)にサブクローユングした後、フラグ メントを pGL3-塩基性、プロモーターのないルシフェラーゼプラスミド（Promega社、マ ディソン、 CA)に引き続いてクローンした。 50万個の細胞（UT- 7/TPOおよび CD34+由 来巨核球） 6ゥヱルプレートの各ゥヱルにある IMDM (FBSまたは成長要因なし）の中に 置き、 DMRIE- C試薬（Invitrogen社）を用いた 4 μ gのプラスミド DNAでトランスフエタト した。 4時間後、 2 X成長因子を補った等量の IMDMを各ゥエルに添加した。細胞を 37 °Cで 48時間インキュベートし、そしてルシフェラーゼ活性を製造会社の指示 (ルシフ エラーゼアツセィシステム、 Promega社）に従ってアツセィした。

[0128] (6) SIVベクターの構築および生成

複製不能の自己不活性ィ匕された SIVベクターを、前述のように構築した (Nakajima, T" Nakamaru, K., Ido, E" Terao, K., Hayami, M., and Hasegawa, M. (2000) Develo pment of novel simian immunodeficiency virus vectors carrying a dual gene expressio n system. Hum. Gene. Ther. 11, 1863—1874)。全長のヒト FVIII (hFVIII) cDNAは、 J.A .van Mourik博士（血液凝固作用、 Sanquin、アムステルダム、オランダ）から提供され た。そして、 human B domain-deleted (BDD) FVIII (hBDD- FVIII) cDNAを前述される ように PCRベースの突然変異誘発により作成した（Lind, P., Larsson, K., Spira, J., Sy dow-Backman, M., Almstedt, A., Gray, E., and Sandberg, H. (1995) Novel forms of B— domain— deleted recombinant factor VIII molecules. Construction and biochemical characterization. Eur. J. Biochem.232, 19-27)。

[0129] サイトメガロウィルス (CMV)プロモーターで駆動される eGFP遺伝子（または hFVIII 遺伝子）を SIV由来ベクターの LTR含有エレメント（U3、 R、 U5)の間に挿入して SIV-p CMV-eGFP/hFVIIIとした。同様に、 GPIb αプロモーターで駆動される eGFP遺伝子（ または hFVIII遺伝子）を SIV由来ベクターの LTR含有エレメント（U3、 R、 U5)の間に揷 入して SIV- pGHb a - eGFP/hFVIIIとした（図 2A)。

[0130] 遺伝子導入プラスミドを、リボフヱクトァミンプラス試薬（Invitrogen社）を使って 293T 細胞に、 3つのパッケージプラスミド（gag- pol、 rev、および VSV- G envをコード）と共に トランスフエタトした。 12時間後に、ウィルス粒子を回収するために培養培地を取り換 えた。培養培地を 48時間で回収し、ウィルス粒子を遠心分離により濃縮した。 eGFPを 有する SIVベクターの形質導入ユニットを 293個の細胞の感染によって測定し、次 ヽ で FACS分析によって eGFP発現を測定した。 SIV-CMV eGFPベクターの平均的な感 染性は、 2〜5 X 10⁸TU/mlの範囲にあった。様々なプロモーターまたは標的遺伝子の 間のウィルスの感染性を比較するために、ウィルス粒子力価をリアルタイム定量 RT-P CRによって同時に測定した。 QIAampウィルス RNAミニキット（QIAGEN社、バレンシア 、 CA)を使って、ウィルス RNAを単離し、その単離した RNAを Superscript II (Invitrogen 社)を使って逆転写させた。

[0131] ウッドチャック肝炎ウィルス (WPRE)配列由来のベクター特異的転写後調節因子の 複製物を QuantiTectプローブ PCRシステム（Qiagen社）を用いたリアルタイム定量 PC Rによって測定して、ベクター粒子を定量化した。 WPREの配列を WPREフォワードプ ライマーである 5し GCTTTCATTTTCTCCTCCTT— 3' (配列番号： 11)および WPREリ バースプライマーである 5'- GGCCACAACTCCTCATAA- 3' (配列番号： 12)により増 幅した。 FAM標識プローブ配列は、 5'-ATCCTGGTTGCTGTCTC-3' (配列番号： 13 )であった。 [0132] PCRは、 95°Cで 15分間の最初のインキュベーションステップで開始した。熱サイクル は、 94°Cで 15秒間、 56°Cで 30秒間、そして 76°Cで 30秒間の 45サイクルとした。 PCRの アニーリング段階の間に、特異プローブからのリポーター螢光シグナルを ABI PRISM 7700シーケンスデテクターシステム（PE Applied Biosystems、 Foster City, CA)で検 出した。 SIVベースベクターの平均ウィルス粒子力価は、 l〜2 X 10^1QTU/mlの範囲に あった。 SIVベクターの感染性 (感染多重度： MOI)は、粒子力価の SIV- CMV- eGFP に対する比率力 算定した。

[0133] SIVベクターによる UT- 7/TPOおよび CD34+由来巨核球の形質導入のために、 1 X 1 0⁵個の細胞を 8 μ g/mlのポリブレンを含む 100 μ Lの培養培地に再懸濁させた。 24時 間のテストで示された種々の ΜΟΙの SIVベクターで細胞を形質導入した。次いで、 0.5 % BSAおよび 2mMの EDTAを含む 300 1の PBSの中で、細胞を再懸濁させ、そして e GFP陽性細胞を FACS分析によって分析した。

[0134] (7)；告 rfn. 糸田 よびウィルス 人

マウス大腿骨およびマウス脛骨力 得られた骨髄細胞から、系統細胞除去キット (M iltenyi Biotec)を使った磁気分離によって系統細胞マーカー（B220、 CD5、 CDllb、 Gr- 1および Ter- 119)を発現する細胞を除去した。次いで、 Sea- 1+および c- kit+細胞（ KSL)を FACS (FACSAria cell sorterゝ Becton Dickinson)で単離した。

[0135] 新たに単離した KSL細胞を SIVベクターで直接感染させた場合、形質導入の後に PI 陽性細胞 (死んで ヽる細胞）が増え、形質導入の効率は減少した (データは示して!/ヽ ない)。そこで、 SIV形質導入および細胞生存能力を改善する KSL細胞の培養条件を 調べた。単離した KSL細胞を IL-3、 IL-6および SCFと共に培養した場合、 KSL細胞の 中での eGFP遺伝子の SIV形質導入は、より低!、形質導入効率（25〜35%： 30の MOI) および PI陽性細胞のかなりの増加（20〜30%)をもたらした (データは示して 、な 、)。 一方、 SCF、 IL-6, sIL- 6R、 Fit- 3Lおよび TPOと一緒に KSL細胞を 3〜7日間培養す ることによって、 eGFPの高いレベルの発現が得られた（図 3参照）。そして eGFP形質 導入の後の PI陽性細胞が際立って減少した (8〜12%)。そのため、 KSL細胞は、ウイ ルス導入の前に以下の成分を補った IMDM 1%の脱脂肪酸 BSA、 200 g/mlのトラン スフエリン、および 10 μ g/mlのインスリンでプレ培養した。 100ng/mlの SCF、

lOng/mlの TPO、

lOOng/mlの IL- 6、

lOOng/mlの Flt-3L、および

400ng/mlの sIL- 6R

[0136] 50 μ g/mlの RetroNectin (TakaraBio社、東京、 日本）で覆われたプレート中で細胞 に SIVを感染させた。培養された KSL細胞（1 X 10⁵個の細胞または 1 X 10⁶個の細胞） を、 10% FBSを含む 100 ほたは lmlの IMDMに再懸濁させた。前述の同じサイトカイ ンの組み合わせの存在下での 12時間の場合の種々の MOIで、細胞に SIVベクターを 導入し、そして 37°Cにおいてインキュベートした。ポリプレン (最高 4 g/ml)の使用は 、マウス KSLおよびヒト CD34+細胞 (データは示して 、な 、）の形質導入効率を際立つ て改善しな力つたので、幹細胞形質導入においては、ポリプレンなしで行われた。次 Vヽで、幹細胞移植のために 1%ゥシ血清アルブミン（BSA)を含む 100 μ 1の PBSで細胞 を再懸濁するか、あるいは細胞を FACS分析のために結果に示した日数の間インキュ ペートした。

[0137] (8 田 槭

ドナー細胞とレシピエント細胞とを区別することを可能にするために、 B6-Ly5.1から 骨髄細胞を得た。レシピエントマウス（生後 8〜12週間 B6-Ly5.2)に 9.5 Gyの単一の 致死量の放射線照射を行なった（⁶°Co、 Gamma Cell;Nortion International, ON、力 ナダ)。 SIV形質導入なしまたは SIV形質導入ありの B6-Ly5.1由来の 10万個の培養 KS L細胞を、競合細胞として 5 X 10⁵個の新たに単離した Ly5.2非分画骨髄細胞とともに 注射した。骨髄の再構成を評価するために、へノ リンコートのマイクロピペットで眼窩 静脈叢 (retro- orbital sinus)力 末梢血を取り出し、 Ly5.1 (ドナー由来）リンパ細胞お よび骨髄細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。本発明者ら の移植手順では、 Ly5.1細胞による移植は、移植後 4力月でのリンパ細胞および骨髄 細胞にぉ 、て 40〜55%であった。

[0138] (9) hFVinトランス遣伝子の転写の検出

hFVIIIトランス遺伝子の転写を RT-PCRによって検出した（Kikuchi, J., Mimuro, J., Ogata, K., Tabata, T., Ueda, Y., Ishiwata, A., Kimura, K., Takano, K., Madoiwa, S. , Mizukami, H., Hanazono, Y., Kume, A., Hasegawa, M., Ozawa, K., and Sakata, Y. (2004) Sustained trans gene expression by human cord blood derived CD34 cells tr ansduced with simian immunodeficiency virus agmTYOl— based vectors carrying the human coagulation factor VIII gene in NOD/SCID mice. J. Gene. Med. 6, 1049-106 0)。 RNA単離キット（RNeasy Protectキット； QIAGEN社）を使ってマウス器官から RNA を単離した。 hFVIII (17)のための 1対のプライマーを使った RT- PCRおよび RT- PCRキ ット（スーパースクリプトワンステップ RT-PCRシステム、 Invitrogen社）に RNAサンプル を供した。マウス GAPDH mRNA (R&Dシステム社、ミネアポリス、 MN)のためのプライ マー対をコントロール RT- PCR実験で使用した。

[0139] SIVベクター由来の mRNA発現を、 QuantiTectプローブ RT-PCRシステム（Qiagen社 )を使ったリアルタイム定量 RT-PCRによって定量した。マウス GAPDH (mGAPDH)コ ントロール試薬（Qiagen社）を使って、分析された RNAの量を見積もった。 SIV遺伝子 転移ベクターの連続希薄系列を分析することによって、標準曲線を確立した。組織か ら抽出した 50ナノグラムの精製 RNAをテンプレートとして使用した。各サンプルに対し て、標準コントロール曲線と比較した WPRE配列の量を見積もり、そして mGAPDH配 列のコピー数で WPRE配列のコピー数を割ることによって、 WPRE配列の量を決定し た。

[0140] Π 0)免痔組織化学

Cytospin3 (Shandon, ThermoShandon社、 PA)を使ってガラススライドに付着してい る骨髄細胞を、 3%のパラホルムアルデヒドを含む PBS中で固定し、次いで、 0.2%の T riton X- 100で浸透（permeabilized)させた。 1%BSAでブロックした後に、試料をピオ チンでコンジュゲートしたポリクローナル抗 FVIII抗体と共に 4°Cで 2時間インキュベー トした。インキュベート後、試料を PBSで洗浄し、次いでストレプトアビジンでコンジュゲ ートした Alexa 594 (Molecular Probes,ユージーン、 OR)、および FITC標識抗マウス G PIb aモノクローナル抗体と共にインキュベートした。免疫蛍光染色を観察し、付属力 メラ付きの蛍光顕微鏡を使って写真を撮った。

[0141] マウス組織における hFVIII分子の免疫組織ィ匕学的な検出のために、 4%のパラホル ムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩水（PBS)中で 4°Cにおいて 2時間脾臓を固定し、 シュクロース（10〜30%)を含んだ PBSと共にインキュベートし、次いでドライアイス/ェ タノール中の OCT化合物の存在下で凍結した。 -25°Cに凍結された組織から切片を 調製し、ポリリシンコートのガラススライドに付着させた。 hFVIIIの検出のために、 1%ゥ サギ血清と Triton-XlOO (0.1%)を含む PBS中で組織切片をブロックし、ヒッジポリクロ ーナル抗ヒト FVIII抗体（Cedarlane試験所、 Homby、オンタリオ、カナダ）と共に 4°Cに おいて 16時間インキュベートした。 PBSで洗浄した後、ピオチンコンジユゲートゥサギ 抗ヒッジ IgG抗体に続いて ABC試薬（Vectastain ABC Elite kit ;ベクター、 Burlingame 、 CA)および DABキット（ベクター）と共に切片をインキュベートした。

( 1 D hFVTTT^ .巾禾 D^T ：: よび ¾ί己 の沏 I定

抗 hFVIII特異的 ELISAキット（Affinity Biological, Hamilton, ON、カナダ）によって hF VIII抗原を測定し、そしてヒト標準プール血漿中の測定値と比較した。血小板の活性 を阻害するために 30 μ 1のクェン酸ナトリウムおよび 1 μ Μの PGIを含んだシリンジを使

2

つて、 270mlの全血を麻酔されたマウスの上大静脈力 抜き出した。結果に示す時間 に 1 μ Μのホルボールミリスチン酸アセテート（ΡΜΑ)および 50 μ g/mlのコラーゲンをそ の血液に添加し、血小板を活性化させた。遠心分離の後、 FVIII抗原の分析まで血 小板欠乏血漿を- 80°Cで凍結させた。マウスの中で誘導された hFVIIIに対する中和 抗体を、 FVIII欠乏血漿および通常のプール血漿を用いる Bethesda法によって分析し 7こ (Madoiwa, S., Yamaucni, T., Hakamata, Y., Kobayashi, E., Aral, M., Sugo, T., Mi muro, J., and Sakata, Y. (2004) Induction of immune tolerance by neonatal intraveno us injection of human factor VIII in murine hemophilia A. J. Thromb. Haemost. 2, 75 4-762) o何匹かの移植マウスにおいて、ジェチルエーテルでマウスに麻酔をかけ、そ れらの尾 1.5cmを切ること〖こよって、表現型矯正を試験した。 24時間後にマウスの生 存を観察した。

実験に用いた血友病 Aマウスの表現型は、血液凝固機能の欠損である。したがって 、この表現型が矯正されなければ、尾を切断された個体はやがて失血によって死亡 する。もしも生存率が改善されれば、形質導入された血小板の第 VIII因子によって、 血液凝固機能が補完されたことが確認できる。すなわち表現型の矯正が、尾を切断 した血友病 Aマウスの生存によって確認できる。

[0143] <結果>

[実施例 1]血小板特異的プロモーターによって促進されたルシフェラーゼリポーター 発現の比較

血小板において標的とされた遺伝子の効率的な発現を達成するために、本発明者 らは最初に巨核球細胞内の 3つの血小板特異的遺伝子、 GPIIb、 GPIbひおよび GPVI のプロモーター活性を比較した。図 1Aは、本研究で使われた血小板特異的プロモ 一ターの模式図をそれら固有の調節因子と共に示す。ルシフェラーゼレポーター遺 伝子を使って、種々のプロモーターの間でのプロモーター活性を比較した。本発明 者らは、以前の研究で最も高い活性を持っていたプロモーターにおけるヌクレオチド 領域 使った (Prandini, M.H., Uzan, u., Martin, F., Thevenon, D., and Marguene, . (1992) Characterization of a specific erythromegakaryocytic enhancer within the glycoprotein lib promoter. J. Biol. し hem. 2b /', 10370—10374; Hashimoto, Y., and W are, J. (1995) Identification of essential GATA and Ets binding motifs within the pro moter of the platelet glycoprotein lb gene. J. Biol. Chem. 270, 24532-24539; Holm es, M.L., Bartle, N., Eisbacher, M., and Chong, B.H. (2002) Cloning and analysis of the thrombopoietin— induced megakaryocyte— specific glycoprotein VI promoter and i ts regulation by GATA- 1, Fli— 1, and Spl. J. Biol. Chem. 277, 48333—48341)。

[0144] GPIb aプロモーターは、 UT- 7/TPO細胞、巨核芽球細胞株におけるルシフェラー ゼの最も強力な発現を導く（図 1B)。 GPIb _αプロモーターの相体効率は、 CD34+由来 巨核球においてさらに著しくなる（図 1C)。報告されるところによれば、 GPIbおよび GP VIは内皮細胞内で発現されるので（Konkle, B.A., Shapiro, S.S., Asch, A.S., and Na chman, R.L. (1990) Cytokine- enhanced expression of glycoprotein lb in human end othelium. J. Biol. Chem. 265, 19833—19838、 Sun, B., Tao,し.，し in, S., Calingasan, N .Y., Li, J., Tandon, N.N., Yoshitake, M., and Kambayashi, J. (2003) Expression of gl ycoprotein VI in vascular endothelial cells. Platelets 14, 225-232)、本発明者らは、 これらの血小板特異的プロモーター活性が内皮細胞で刺激されていたかどうかを調 ベた。 [0145] PAト 1プロモーター (Mimuro, J., Muramatsu, S., Hakamada, Y., Mori, K., Kikuchi, J., Urabe, M., Madoiwa, S., Ozawa, K., and Sakata, Y. (2001) Recombinant adeno- a ssociated virus vector-transduced vascular endothelial cells express the thrombomo dulin trans gene under the regulation of enhanced plasminogen activator inhibitor— 1 promoter. Gene Ther. 8, 1690-1697)が効率的にルシフェラーゼ発現を導く条件下 で、 GPIIb、 GPIb a、および GPVIプロモーターは、 HUVECにおいてルシフェラーゼ発 現を導かな力つた（図 1D)。したがって、本発明者らは GPIbひを使うことに決め、本研 究において標的遺伝子の直接の血小板特異的発現を方向付けた。

[0146] [実施例 2] SIVベースベクターによる巨核球細胞の効率的な変換

本発明者らは、 CMVプロモーター（SIV- pCMV- eGFP)または GPIb aプロモーター（ SIV-pGPIb a -eGFP)の!、ずれかの制御の下で、 eGFP遺伝子を含む 2つの SIVベー スのレンチウィルスベクターを構築した。 CMVプロモーター（pCMV)または GPIb aプ 口モーター（_pGPIb _a )の下流に位置して!/、るトランス遺伝子を SIV由来ベクターの LT Rを含む因子 (U3、 R、 U5) (図 2A)の間に挿入した（図 2A)。形質導入細胞内で遺伝 子発現を増やすために、ウッドチャック肝炎ウィルス (WPRE)由来の転写後制御因子 を発現した遺伝子の下流に挿入した。

[0147] 巨核球の eGFP遺伝子形質導入を調べるために、 UT-7/TPOまたは CD34+由来の 巨核球を、種々の濃度の SIV- pCMV- eGFPまたは SIV- pGPIb a -eGFPの存在下で 24 時間インキュベートした。両方の構築物は、 UT-7/TPOまたは CD34+由来の巨核球（ 図 2B)の中に効率的に eGFP遺伝子を形質導入した。それぞれ約 1および 3の MOIに お!、て SIV- pCMV- eGFPおよび SIV- pGPIbで細胞をインキュベートしたとき、 eGFPの 最大半量の発現を達成した。一方、リポフエクシヨンを使った形質導入は、 eGFP遺伝 子を 8〜12%のみの UT- 7/TPOまたは CD34+由来の巨核球の中に導入した（データ は示していない）。

[0148] 次に、本発明者らは、エタスビボでの巨核球分化が遺伝子発現に影響を与えるか どうか調べた。臍帯血由来の CD34+細胞が IL-3および TPOによって巨核球に分ィ匕さ れる条件の下で、細胞上での GPI¾および GPIbの表面発現をフローサイトメトリーによ り調べた。 GPIbは 0日目には発見されなかったのに対して、細胞の約 18%が GPIIb ( 図 2D)に対して陽'性であった。さらに、前述（Lepage, A., Leboeuf, M., Cazenave, J. P., de la Salle, C, Lanza, F.， and Uzan, G. (2000) The lib 3 integrin and GPIb— V— I X complex identify distinct stages in the maturation of CD34 cord blood cells to me gakaryocytes. Blood 96, 4169-4177)されるように、 GPIb発現は、巨核球分化過程の 後期に発現するように思われた（図 2D)。 CMVプロモーターによって促進された eGF P発現は、巨核球分ィ匕によって影響を受けな力つた（図 2E)。一方、 pGPIb aプロモ 一ターの制御の下で、 eGFP発現は、 CD34+細胞（図 2D)の巨核球分化の間に促進 された。

[0149] [実施例 3] SIVベクターを有する KSL細胞の効率的な形質導入の確立

CMVプロモーターによって促進された eGFP遺伝子を含む SIVベクターを使うことに よって、本発明者らは次に KSL細胞の形質導入プロトコルを最適化した。培養 KSL細 胞での eGFPの形質導入効率は、 60〜80%に達した（図 3A)。形質導入のプラトー値 は、 10〜30の MOIで観察した。ウィルスベクターとのインキュベーションの後の 1日（24 時間）で、形質導入遺伝子の高い発現を達成するのに十分であった。 eGFP発現は、 それから次第に低下した（図 3B)。 eGFP発現の減少は、細胞生存能力の減少のため である可能性もある。なぜなら、 PI陽性細胞 (死んでいる細胞）は、時間と共に増加し た力 である（データは示していない）。したがって、本発明者らは、 30の MOIにおい て KSLを 24時間培養し、そして次の実験にお!、てレシピエントマウスの中にその細胞 を移植した。

[0150] [実施例 4]インビボでの GPIb aプロモーターを潜在的に有する SIVベクターを使った 血小板での優先的な eGFP発現

CMVおよび GP¾ aプロモーターの強度および特異性を比較するために、そしてィ ンビボでの SIVベクターによる eGFP形質導入を評価するために、 SIV-pCMV-eGFPま たは SIV- pGPIb- eGFPで形質導入した KSL細胞をレシピエントマウス（Ly5.2)に移植 した。 SIV-pCMV- eGFPまたは SIV-pGPIb a -eGFP (30の MOI)で形質導入した 10万 個の培養 KSL細胞 (Ly5.1)を 5 X 10⁵個の競合細胞 (Ly5.2)と一緒に移植した。

[0151] SIV-pCMV-eGFPで形質導入した KSL細胞を移植した場合、 eGFP発現が、末梢血 中で CD45+細胞の 35〜45%および血小板の 7〜11%で観察された（図 4A、 4B)。興 味深いことに、 GPIb aプロモーターを潜在的に有する SIVベクターの形質導入は、血 小板（16〜27%)に効率的な遺伝子マーキングをもたらした力 CD45+細胞ではそう ではなかった（図 4A、 4B)。本発明者らは、次にマクロファージ、顆粒球、 Bリンパ球 、 Tリンパ球および赤芽球を識別するための特定のマーカーを使って、移植マウス由 来の骨髄細胞を分析した。 SIV-pCMV-eGFPで形質導入した KSL細胞を受容したマ ウスのこれらの系統細胞において eGFPを発現させたのに対して、 GPIb aプロモータ 一は、これらの系統細胞において eGFP発現を促進せず、巨核球および血小板での 活性の特異性を確かめた（図 4C)。

[0152] [実施例 5] SIV-pGPIb a -hFVIIIで形質導入された KSL細胞を移植された血友病 Aマ ウスにおける hFVIIIの発現および表現型修正

血小板依存性遺伝子療法が FVIIIの持続的な発現を可能にするかどうか決定する ために、本発明者らは、 CMV (SIV-pCMV- hFVIII)または GPIb αプロモーター（SIV-p GPIb a -hFVIII)の制御の下で hBDD- FVIII cDNAを含む 2つの SIVベクターを構築し た。本発明者らは、 I X 10⁵個の形質導入 KSL細胞をマウスに移植し、次いで致命的 な γ照射を行なった。最初に本発明者らは、移植の 3力月後において移植受容体の 器官中の hFVIII遺伝子転写体の存在量を分析した。 CMVプロモーターによって促進 させられた hFvm転写の分析により、 hFvm遺伝子が骨髄で主に発現し、より小さい 程度で脾臓で発現したことを明らかにした（図 5A、パネル中）。興味深いことに、 hFVI II mRNAは、 SIV-pGPIb a -hFVIIIで形質導入された KSL細胞の受容体において骨髄 と共に大部分は脾臓で見!、だされた (図 5A、パネル下)。

[0153] 各器官での mRNA発現レベルを定量化するために、ベクター特異的 WPRE発現をリ アルタイム定量 RT- PCRにより測定した。 RT-PCRからの結果に基づ 、て予期された ように、骨髄および脾臓は、 SIVベクターで形質導入された KSL細胞を移植されたマ ウスの主要な部位である（図 5B)。 hFVIII転写についてのデータに従って、 hFVIII分 子が、両方のタイプの形質導入マウスで骨髄と脾臓において免疫組織ィ匕学的に検 出された（図 6)。注目すべきは、 GPIb aを発現して!/、る細胞は、 SIV-pGP¾ a -hFVII Iを形質導入されたマウス力も得られた骨髄で同時に hFVIIIを発現して 、た（図 6A)。

[0154] 最終的に、本発明者らは、 SIV-pGPIb a -hFVIIIを使った血小板特異的遺伝子形質 導入が Fvm欠損血友病 Aマウスの表現型を矯正するかどうかを評価した。血小板活 性があるまたは血小板活性がない血漿 Fvm抗原レベルを、移植後 30日または 60日 の移植 Fvm欠損マウスで測定した。本発明者らは、移植マウスにおいて Fvm活性を 検出し、そこでは SIV-pGPIb α -hFVIIIで形質導入された KSL細胞を移植されたマウ スの血漿に 1〜2%の矯正が注目された（図 7A)。血小板がコラーゲンおよび PMAで 刺激された場合、血漿 FVIIIレベルは 2〜3.5%に高められる（図 7A)。尾切断の後の 死亡率は形質導入マウスで際立って改善された（図 7B)。さらに、異所的に発現した hFVIIIレベルは弱められなかった。また、移植後 60日の SIV-pGPIb a -hFVIIIで形質 導入された KSL細胞を移植されたマウスにお!、て、 hFVIIIに対するインヒビターは検 出されなかった (データは示して!/ヽな ヽ）。

[0155] 本発明にお!/、て、インビボでの血小板特異的プロモーターを含む SIVレンチウィル スベクターを使って、血小板および巨核球への遺伝子形質導入を試みた。トランス遺 伝子生成物の生産に血小板を用いることについては、トランスジエニックマウスでの 試みがある（Kufrin, D., Eslin, D.E., Bdeir, K., Murciano, J.C., Kuo, A., Kowalska, M.A., Degen, J丄.， Sachais, B.S., Cines, D.B., and Poncz, M. (2003) Antithrombotic thrombocytes: ectopic expression of urokinase— type plasminogen activator in platel ets. Blood 102, 926—933; Yarovoi, H.V., Kufrin, D.， Eslin, D.E., Thornton, M.A., H aberichter, S.L., Shi, Q., Zhu, H., Camire, R., Fakharzadeh, S.S., Kowalska, M. A.,

Wilcox, D.A., Sachais, B. S" Montgomery, R.R., and Poncz, M. (2003) Factor VIII ectopically expressed in platelets: efficacy in hemophilia A treatment. Blood 102, 40 06-4013)。し力しながら、トランスジエニック動物の手法を治療に応用することはでき ない。本発明者らのシステムにおいて、 SIVレンチウィルスベクターを有する造血幹細 胞の形質導入は、血小板の約 20%にトランス遺伝子の発現をもたらして、そして血友 病 Aマウスの表現型も矯正することができた。血小板への血液凝固因子遺伝子の形 質導入によって、出血性障害の表現型を矯正できることが本発明によって初めて明 らかにされた。

[0156] 巨核球は、約 10日から 21日の有限の寿命を有する（Wilcox, D.A., and White II, G. し. (2003) Gene therapy for platelet disorders: studies with Glanzmann s thrombasth enia. J. Thromb. Haemost. 1, 2300-2311)。そのため、血小板内で標的タンパク質の 長期の発現を確立するために、造血幹細胞は、遺伝子導入にとって巨核球よりいつ そう実用的な標的である。レンチウィルスは、ある特定のタイプの静止細胞に感染す ることができるので、造血性細胞の形質導入へのレンチウィルス由来ベクターの応用 に対しての大きな興味があった。

そして、実際にレンチウィルスベクターが効率的に造血幹細胞に形質導入すること ができることが示された（Woods, N.B., Ooka, A., and Karlsson, S. (2002) Developme nt of gene therapy for hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Leukemia lb , 563-569)。本発明者らは、その潜在的な安全性から効率的な血小板標的遺伝子 形質導入のために SIVレンチウィルスシステムを使った。 SIVレンチウィルスシステム は、 SIVagmTYOlに由来し、そしてその自然の宿主および実験的に感染されたアジ ァのマカクザルに対して非病原性である（Nakajima, T., Nakamaru, K., Ido, E.， Tera o, K., Hayami, M., and Hasegawa, M. (2000) Development of novel simian immunod eficiency virus vectors carrying a dual gene expression system. Hum. Gene. Ther. 1 1, 1863-1874) o複製能力のあるウィルス粒子は、ベクターに感染した細胞において 検出されない。 HIVキャリア患者において複製能力のあるレンチウィルス粒子の出現 は、 HIVベースのベクターより際立って低い。したがって、 SIVベクターは、安全性問 題および遺伝子治療の臨床的応用に関して有利な点を有して 、る。

大方の報告された研究は、巨核球特異的遺伝子形質導入および血小板特異的遺 伝子形質導入のために GPIIbプロモーターを使っていた。本発明者らは、この研究に おいて血小板特異的プロモーターとして GPIb αプロモーターを使った。なぜなら、 G PIb aのプロモーター活性は、 UT- 7/TPOおよび CD34+由来の巨核球のプロモータ 一活性よりいっそう能力が高いからである。本発明者らがこの血小板特異的プロモー ターを選択したもう 1つの理由は、巨核球増生の遅い段階に働くということである。 GPI lb遺伝子は血小板および巨核球において発現する力 巨核球増生については早い 段階の遺伝子である（Lepage, A., Leboeuf, M., Cazenave, J.P., de la Salle, C, Lanz a, F., and Uzan, G. (2000) The lib 3 integrin and GPIb- V- IX complex identify disti net stages in the maturation of CD34 cord blood cells to megakaryocytes . Blood 96 , 4169-4177)。

[0158] チミジンキナーゼ遺伝子が GPI¾プロモーターによって促進される条件付きのノック アウトマウスにぉ 、て、ガンシクロビルの投与は血小板総数の劇的な減少を導 、た (T ropel, P., Roullot, V., Vernet, M., Poujol, C, Pointu, H., Nurden, P., M arguerie, G. , and Tronik- Le Roux, D. (1997) A 2.7-kb portion of the 5' flanking region of the m urine glycoprotein lib gene is transcriptionally active in primitive hematopoietic pro genitor cells. Blood 90, 2995-3004)。骨髄において、赤芽球前駆細胞および骨髄始 原細胞もまた影響を受けていた。そして、そのことは、前駆細胞での GPI¾の存在を示 していた（Tropel, P., Roullot, V., Vernet, M., Poujol, C, Pointu, H.， Nurden, P., M arguerie, G., and Tronik- Le Roux, D. (1997) A 2.7-kb portion of the 5' flanking regi on of the murine glycoprotein lib gene is transcriptionally active in primitive hemat opoietic progenitor cells. Blood 90, 2995-3004)。

[0159] 実際のところ、ヒト CD34+造血性幹細胞の 18%はすでに GPIIbを発現しており、 GPIb の出現は、 GPIIbの出現と比較して著しく遅れている。そのことは、 GPIbが巨核球成熟 のより遅いマーカーであることを示している。したがって、 GPIb αプロモーターを使つ た血小板は、 GPIIbプロモーターを使った場合より、特異的で制限された遺伝子生成 物の発現を可能とすることが見込まれた。

[0160] ここでのもう 1つの重要な実験結果は、 CMVプロモーターによって促進される eGFP 遺伝子が、インビボで CD45+細胞の形質導入効率が高いにもかかわらず、血小板で 発現が際立って減少したことを示した。一般に、短縮されたタンパク質半減期によつ て起こされたトランス遺伝子の発現の減少は、最終分ィ匕した血液細胞にぉ 、て 、つ てつ顕 であつ 7こ (Wahlers, A., Schwieger, M., Li, Z., Meier— Tackmann, D., Lindem ann, C, Eckert, H.G., von Laer, D., and Baum, C. (2001) Influence of multiplicity o f infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in he matopoietic cells. Gene Ther. 8, 477-486)。それは、分化の間にトランス遺伝子のダ ゥンレギュレーションによって仲介され得る。コードィ匕されたタンパク質の安定性は、 分化細胞にぉ 、て RNAプロセシングに影響を与えて!/、るプロモーターまたはシス要 素の選択と少なくとも同じぐら 、トランス遺伝子の発現にっ 、て関係して 、る (Wahler s, A., Schwieger, M., Li, Z., Meier— Tackmann, D., Lindemann, C, Eckert, H.G., vo n Laer, D., and Baum, C. (2001) Influence of multiplicity of infection and protein sta bility on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Th er. 8, 477-486) oこの状況において、後期の巨核球分化を促進する GP¾ αプロモー ターの使用は、最終分化した無核血小板の遺伝子形質導入にとって重要であり得る

[0161] 血小板依存性遺伝子形質導入の本発明者らの戦略は、遺伝性血小板障害 (Glanz mann血小板無力症（thromboasthemia)および Bernard- Sourlier症候群）だけではなく 、他の出血性障害に対しても可能性を持っている。血友病 Aは、 FVIII遺伝子の欠陥 によって起こされる X染色体に関係する出血性障害であり、 1 : 5000の割合の男性が 罹患している（Hoyer, L. W. (1994) Hemophilia A. N. Engl. J. Med. 330, 38-47)。血 友病は、遺伝子治療に適していると考えられている。なぜなら、その疾患は 1つの遺 伝子異常によって起こされ、そして治療の凝固因子レベルが広い範囲（5%〜100%) にわたつて変化し得るからである（Hoyer, L. W. (1994) Hemophilia A. N. Engl. J. Me d. 330, 38-47)。

[0162] FVIIIの持続的な治療的な発現は、さまざまな組織を標的とした広 、範囲の遺伝子 転送技術を使ったプレ臨床研究で達成された (Lozier, J. (2004) Gene therapy of the hemophilias. Semin. Hematol. 41, 287-296)。しかし、中和抗体の発生は臨床的応 用 しばしば帘 IJ限し (High, K. (2005) Gene transfer for hemophilia: can therapeutic e fficacy in large animals be safely translated to patients? J. Thromb. Haemost. 3, 168 2-1691)、造血幹細胞の標的化も例外ではない。造血幹細胞へのレンチウィルス FVI II遺伝子形質導入によって、治療のレベルの FVIIIを生産することができる（Kikuchi, J ., Mimuro, J" Ogata, K., Tabata, T" Ueda, Y" Ishiwata, A" Kimura, K., Takano, K ., Madoiwa, S., Mizukami, H., Hanazono, Y., Kume, A., Hasegawa, M., Ozawa, K., and Sakata, Y. (2004) Sustained trans gene expression by human cord blood derived CD34 cells transduced with simian immunodeficiency virus agmTYOl— based vector s carrying the human coagulation factor VIII gene in NOD/SCID mice. J. Gene. Med • 6, 1049-1060, Kootstra, N.A., Matsumura, R" and Verma, l.M. (2003) Efficient pr oduction of human FVIII in hemophilic mice using lentiviral vectors. Mol. Ther. 7, 6 23-631) oしかしこれまでの方法では、 FVIIIに対する中和抗体が誘導され、 FVIII活 性レベルの減少の原因となっていた（Kootstra, N.A., Matsumura, R.， and Verma, I. M. (2003) Efficient production of human FVIII in hemophilic mice using lentiviral vec tors. Mol. Ther. 7, 623-631)。

[0163] 血小板を利用した血友病 Aのための遺伝子治療は、臨床応用における優位性を持 つ。なぜなら、抗原提示細胞における FVIIIの発現を妨げることによって、血小板特異 的システムの使用がインヒビター（中和抗体)の誘導を防止できるからである。さらに、 血友病 A患者の 10〜30%は、血液凝固因子の投与に起因するインヒビターを持って いる。そのため、凝固作用が低下し大出血に結びつく恐れがある。このようなインヒビ ターを有する患者の治療にぉ 、ても、血友病 Aの血小板依存性遺伝子治療は有用 である。なぜなら、血小板に保持された血液凝固因子は、血流中でインヒビターから 保護される。そして、血栓形成部位においてそれらを放出し、血液凝固を活性化する ことができる。

[0164] GPI¾プロモーターの制御の下で GPIIIa cDNAを含む HIVレンチウィルスベクターを 使うことによって、 GPIIIa欠損マウスにおける GPIIb/IIIaの治療の発現が報告された (F ang, J., Hodivala- Dilke, K., Johnson, B.D., Du, L.M., Hynes, R.O., White II, G.C., Wilcox, D.A. (2005) Therapeutic expression of the platelet-specific integrin, lib 3, i n a murine model for Glanzmann thrombasthenia. Blood (in press))。その研究【ま、幹 細胞移植および遺伝子形質導入のためのソースとして骨髄細胞の不均一集団を使 つていた。

[0165] 本発明者らは、 GPIb aプロモーターを有する SIVベクターによって KSLマウスの造血 性細胞の効率的な形質導入および血友病 Aマウスの表現型矯正を実証した。初期の KSL細胞は、ほとんど均一な集団であり、そして単一の KSL細胞は、しばしば致命的 な放射線照射されたマウスの長期の多系統 (multilineage)移植を与えることができる（ Nakauchi, H., Sudo, K., and Ema, H. (2001) Quantitative assessment of tne stem ce 11 self-renewal capacity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 938, 18-24)。初期の造血幹細胞を標 的化することは、より安全なアプローチであると思われる。なぜなら、再構成のために 必要とした形質導入細胞の数は、不均一の骨髄集団を使うときに必要とされる数より ずっと低いからである。

[0166] レトロウイルスベクター形質導入された骨髄細胞を移植された、複合型免疫不全症 を持っている 2人の子供における白血病の進行は、染色体 DNAの中にプロウィルス 配列を組み込むリスクについて新たな懸念を生じさせた（Hacein-Bey-Abina, S., von Kalle, C" Schmidt, M., Le Deist, F" Wulflraat, N" Mclntyre, E" Radford, I., Villev al, J.L., Fraser, C.C., Cavazzana— Calvo, M., and Fischer, A. (2003) A serious adve rse event after successlul gene therapy for X— linked severe combined immunodeficie ncy. N. Engl. J. Med. 348, 255-256)。挿入突然変異のリスクを減らす 1つの理論的 な方法は、遺伝的に改変された細胞の合計の数を最小にする導入プロトコルを採用 することであろう (Mostoslavsky, G" Kotton, D.N., Fabian, A.J., Gray, J.T., Lee, J.S. , and Mulligan, R.C. (2005) Efficiency of transduction of hignly purified murine hema topoietic stem cells by lentiviral and oncoretroviral vectors under conditions of mini mal in vitro manipulation. Mol. Ther. 11, 932-940)。この点に関して、 SIVレンチウイ ルスシステムで形質導入された KSL細胞を使った本発明者らの手順は、臨床的応用 にお 、て血小板特異的遺伝子改変のための実用的なアプローチである。

産業上の利用可能性

[0167] 本発明は、血液凝固因子の量的な、あるいは活性の異常に起因する血液凝固異 常の治療に有用である。より具体的には、本発明に基づいて、血液凝固因子の発現 レベルや活性の低下を原因とする血液凝固異常を治療することができる。本発明に よって治療が可能な疾患として次のような血液凝固異常性疾患を示すことができる。 カツコ内に各疾患の治療に有用な血液凝固因子の名称を記載した。すなわち、下記 のような血液凝固因子をコードする遺伝子を本発明に応用することによって、それぞ れ次のような血液凝固異常疾患を治療することができる。

[0168] 血友病 A (第 Vin因子、第 Vila因子）

血友病 B (第 IX因子）

フォン ·ヴィルブランド病（フォン'ヴィルブランド因子）

第 I因子欠乏症、無フイブリノゲン血症、低フイブリノゲン血症 (第 I因子） 第 II因子欠乏症 (プロトロンビン）

第 V因子欠乏症、パラ血友病 (第 V因子）

第 VII因子欠乏症 (第 VII因子）

第 X因子欠乏症 (第 X因子）

第 XI因子欠乏症 (第 XI因子）

第 ΧΙΠ因子欠乏症 (第 XIII因子）

これらの血液凝固異常性疾患のうち、特に血友病 Aや血友病 Bは、強い出血傾向 を伴う場合があり、患者数も多い重要な疾患である。血友病に本発明を応用すること によって、少ない治療回数で高い治療効果を達成することができる。すなわち、血友 病患者の日常生活に対して制約の少ない治療方法を実現できる。

Claims

請求の範囲

[I] 巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当 該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを 含むレンチウィルスベクターを有効成分として含有する、血液凝固異常の治療剤。

[2] プロモーターが、 GPIbプロモーターまたはそのバリアントである請求項 1に記載の治 療剤。

[3] 血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド力 5'UTRを介して前記プロモーターに結 合して 、る請求項 2に記載の治療剤。

[4] 血液凝固異常が血友病 Aであり、血液凝固因子が第 VIII因子またはその変異体であ る請求項 1に記載の治療剤。

[5] 血液凝固異常が血友病 Bであり、血液凝固因子が第 IX因子またはその変異体である 請求項 1に記載の治療剤。

[6] 血液凝固異常が血友病 A、あるいは血友病 Bのいずれかの疾患であり、血液凝固因 子が第 VII因子またはその変異体である請求項 1に記載の治療剤。

[7] レンチウィルスベクターがサル免疫不全ウィルスベクターである請求項 1に記載の治 療剤。

[8] レンチウィルスベクター力 ゥマ伝染性貧血ウィルスベクター、ヒト免疫不全ウィルス 1 ベクター、ヒト免疫不全ウィルス 2ベクター、ネコ免疫不全ウィルスベクター、ゥシ熱性 疾患ウィルスベクター、およびャギ関節炎 ·脳炎ウィルスベクターからなる群力 選択 される 、ずれかのベクターである請求項 1に記載の治療剤。

[9] 巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当 該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを 含むレンチウィルスベクターを感染させた造血幹細胞。

[10] 巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当 該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを 含むレンチウィルスベクターを感染させた巨核球、及び Z又はその派生産物である 血小板。

[II] 巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および当 該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを 含むレンチウィルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程と、レンチウィルスベクタ 一を感染させた造血幹細胞を巨核球およびその派生産物である血小板のいずれか 、または両方を含む細胞群に分ィ匕するまで培養する工程を含む、血液凝固因子を蓄 積した巨核球および血小板の!/、ずれか、または両方の製造方法。

[12] 次の工程を含む、血液凝固異常の治療方法；

(1)巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、およ び当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチ ドを含むレンチウィルスベクターを造血幹細胞に感染させる工程、および

(2)工程 (1)の造血幹細胞を血液凝固異常を有する患者に投与する工程。

[13] 造血幹細胞が、患者から採取された造血幹細胞を含む請求項 12に記載の方法。

[14] 造血幹細胞が骨髄幹細胞、および末梢血造血幹細胞の!/、ずれか、または両方を含 む細胞である請求項 13に記載の方法。

[15] 工程 (1)の造血幹細胞を培養した後に患者に投与する請求項 12に記載の方法。

[16] 次の要素を含む、血液凝固異常の治療用キット；

a:巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的なプロモーター、および 当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド を含むレンチウィルスベクター、および

b:造血幹細胞の採集試薬。

[17] 下記の要素 cを付加的に含む、請求項 16に記載の血液凝固異常の治療用キット； c:造血幹細胞を巨核球に分化誘導するための培地。

[18] 造血幹細胞を巨核球に分ィ匕誘導するための培地が、少なくとも次の成分を含む請求 項 17に記載の血液凝固異常の治療用キット；

トランスフェリン；

インスリン；

幹細胞因子（stem cell factor)；

トロンボポェチン；

インターロイキン 6 ; Fit- 3リガンド；および

可溶性インターロイキン 6受容体。

血液凝固異常の治療剤の製造のためのレンチウィルスベクターの使用であって、該 レンチウィルスベクターが巨核球、及び Z又はその派生産物である血小板に特異的 なプロモーター、および当該プロモーターに機能的に連結された血液凝固因子をコ ードするポリヌクレオチドを含むレンチウィルスベクターである、使用。