CN101351229A - 血液凝固异常的治疗方法 - Google Patents

Abstract

提供一种治疗血液凝固异常的治疗剂。该治疗剂以慢病毒载体作为有效成分。所述的慢病毒载体包含功能性地结合于诱导血小板特异性表达的启动子的凝血因子基因。使用编码因子VIII，或因子IX基因，提供治疗血友病A或B的治疗剂。本发明的治疗剂感染到造血干细胞，通过基因治疗可以达到治疗血液凝固异常的效果。

Description

血液凝固异常的治疗方法

技术领域

本发明涉及一种血液凝固异常的治疗方法。

背景技术

血管受损伤会引起出血。而血液自身备有止血机制。止血主要是通过血小板聚集于血管壁受损伤部位(初期止血；primary hemostasis)和纤维蛋白填充到血小板间隙中(二期止血；Secondary Hemostasis)的步骤来完成。止血的这些步骤被称为血液凝固(blood coagulation)。血液凝固是多种物质复合参与的复杂的生理反应。初期止血是填塞损伤部位的过程。受到损伤的内皮细胞下暴露的结缔组织中，含有胶原等。血小板通过von Willebrand因子(VWF，血管性血友病因子)介导结合在该结缔组织后，血小板形成凝集块。

后者是以纤维蛋白的形成和蓄积为主的止血步骤，被称为二期止血(Secondary Hemostasis)。纤维蛋白是血液中的前体蛋白(纤维蛋白原)被凝血酶等蛋白酶的活性激活后形成的纤维状蛋白质。初期止血形成的血小板的集合构造是纤维蛋白形成的凝血块的附着处，同时，纤维蛋白也强化了该构造本身。在二期止血中起主要作用的与纤维蛋白形成相关的因子，已知有从第I因子(Factor I)到第XIII因子(Factor XIII)的12种(缺乏第VI因子)物质。这些因子通过例如调节其他因子的活性或使纤维蛋白稳定等作用参与一系列的凝血反应。

参与凝血的众多因子，通常在血液中其活性被巧妙地调节。所以，正常情况下血管中流动的血液不会凝固。然而一旦出血，立即启动初期止血，进而负责二期止血的众多因子也逐个被激活。正常情况下，这一系列的步骤是在数秒之内进行的一种快速的生理反应。

当与凝血有关的因子群的量及活性出现异常时，会引起凝血机制的异常。例如，凝血中的某一因子的表达及活性降低时，正常的止血机制就会停止运作。这种状态称做血液凝固异常。已知很多原因可以导致血液凝固异常。血友病是血液凝固异常的代表性疾病。

血友病按照病因可分为血友病A和血友病B。血友病A是第VIII因子的量或质出现异常而导致的。而血友病B则是因为第IX因子缺陷。首先，第VIII因子是被凝血酶激活的凝血因子。活化了的第VIII因子(第VIIIa因子)与活化了的第IX因子(第IXa因子)结合后激活第X因子。被活化了的第X因子(第Xa因子)，通过激活凝血酶参与纤维蛋白的形成。此外，第IX因子通过活化了的第XI因子(第XIa因子)被激活、与同样被激活的第VIIIa因子一起形成第X因子的活化因子。第VIII因子和第IX因子都是二期止血的最终阶段中使凝血酶活化的重要因子。因此，由于这些因子的不足所导致的血友病，根据其程度有时可引起严重的血液凝固缺陷。

血友病一般为遗传性疾病。目前，修复作为发病原因的遗传病因是十分困难的。因此，血友病多是通过补充缺陷的凝血因子来进行治疗(补充疗法)。补充疗法使用人血纯化的第VIII因子及第IX因子。然而，给药以人血为原料的血液制剂时出现了感染人免疫缺陷病毒及肝炎病毒等的传染病问题。为防止传染病，人们在努力排除感染血液及通过建立病原性病毒的灭活技术来减低感染的可能性。并且，随着使用基因工程方法制备这些因子的纯化蛋白制剂的实用，由于凝血因子给药引发的感染风险几乎不存在了。

然而，即使感染风险降低了，但是目前的补充疗法还是会制约患者的日常生活。一般来说，补充疗法的凝血因子的给药剂量及给药日程，要视患者的凝血因子缺陷程度而定。凝血因子一般可维持给药时的药效半天左右，之后随着时间的推移药效逐渐下降。因此，凝血因子须隔6-24小时给药一次。而蛋白制剂的凝血因子要通过静脉给药，如此频繁的静脉注射会制约患者的正常生活。

更应指出的是血友病的补充疗法会导致自身抗体的产生。从接受补充疗法的血友病患者中，有时会检测出对被给药的凝血因子产生的中和抗体(抑制剂)。患者产生的抗体中和被给药的凝血因子并使其失活。其结果，产生自身抗体的患者按正常剂量给药不能收到良好的治疗效果。

针对血友病的补充疗法，有报告显示正在尝试一种作为不需要通过静脉注射给药凝血因子的给药方法——基因治疗方法。例如，在导入了编码第VIII因子基因的转基因小鼠的血小板中观察到了第VIII因子的表达，表明了基因治疗可以治疗血友病(Blood 2003，；102：4006-4013)的可能性。然而，在实际应用到人体治疗时，有必要采用转基因动物以外的方法，诱导外源性第VIII因子基因的表达。

除了转基因动物，还进行了由病毒载体诱导第VIII因子基因表达的尝试。如果是病毒载体，可临床应用于人体。即将组合有编码第VIII因子的DNA的慢病毒载体导入骨髓细胞等，并将该骨髓细胞移植到了血液凝固异常的小鼠模型(敲除了第VIII因子的小鼠)体内(Mol Ther.2003，May；7(5 Pt1)：623-631)。然而，此报告中虽然在体外观察到了第VIII因子的很强的表达，但是未能在接受移植的小鼠的末梢血中检测出足够的第VIII因子活性。我们估计，在小鼠体内诱导出了对第VIII因子的中和抗体，而该抗体是造成体内第VIII因子活性下降的原因。

本发明者们将整合了第VIII因子的猴免疫缺陷病毒载体导入到了人脐带血CD34阳性细胞。并将该细胞移植到NOD/SCID小鼠体内。然后观察了小鼠血中第VIII因子的表达。结果，确认到了导入的第VIII因子至少可以持续表达60天以上(J Gene Med.2004 Oct.；6(10)：1049-1060)。但是用于试验的NOD/SCID小鼠处于严重的免疫缺陷状态，无法对其自身抗体的影响进行评价。同时，在Glanzmann血小板机能不全症(Glanzmann ThrombastheniaGT)小鼠模型中，通过GPIIb启动子使血小板的黏附因子即整联蛋白得以表达，从而增强了血小板的活性(Fang J.et al.Blood.2005 Oct 15；106(8)：2671-9.Epub 2005 Jun 21.)。

【非专利文献1】Yarovoi HV.et al.，Blood 2003；102：4006-4013

【非专利文献2】Kootstra NA.et al.，Mol Ther.2003，May；7(5 Pt1)：623-631

【非专利文献3】Kikuchi J.et al.J Gene Med.2004 Oct.；6(10)：1049-1060

【非专利文献4】Fang J.et al.Blood.2005 Oct 15；106(8)：2671-9.Epub2005 Jun 21.

发明的公开

本发明要解决的课题

本发明以提供一种治疗血液凝固异常疾病的基因治疗技术为课题。具体为，本发明的课题为不依赖转基因动物等技术，实现编码凝血因子的基因在活体内的表达，提供一种通过基因治疗攻克血液凝固异常疾病的治疗技术。

解决课题的方法

本发明者们考虑为解决上述课题，如果能在血小板中特异性诱导编码凝血因子基因的表达或许有效。将血小板中表达的凝血因子保留在血小板内，以防与机体免疫系统发生接触。所以，我们认为诱导中和抗体的可能性很低。这正是以往技术存在的难题。此外，出血时，血小板迅速集合到血管的受伤部位，同时，出血部位被激活的血小板将各种止血因子释放到细胞外。这时，我们期待细胞内蓄积的凝血因子能释放到细胞外。

本发明者们考虑血小板特异性凝血因子的诱导表达在血液凝固异常的基因治疗中是理想的基因表达系统。基于这一考虑，本发明者们尝试构建了血小板特异性凝血因子的表达系统，使用可进行血小板特异性基因表达的启动子，成功地实现了血小板内凝血因子的表达。

为达到治疗血液凝固异常的目的，就需要不断地供给凝血因子，于是进一步探讨了慢病毒载体的应用。即构建了一种血液凝固异常基因治疗用慢病毒载体。该载体携带了在血小板特异性启动子控制下表达的凝血因子基因。并且在导入了该基因治疗用载体的细胞所移植了的动物模型体内确认到血液凝固功能得到改善后完成了本发明。即本发明提供了以下血液凝固异常的治疗剂、治疗方法以及治疗用试剂盒。

(1)一种血液凝固异常的治疗剂，该治疗剂以慢病毒载体为有效成分。所述的慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子。该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子。

(2)(1)的治疗剂，其中所述启动子是GPIb启动子或其变体。

(3)(2)的治疗剂，其中所述编码凝血因子的多核苷酸由5′UTR介导结合于上述启动子。

(4)(1)的治疗剂，其中所述血液凝固异常为血友病A，凝血因子为第VIII因子或是其突变体。

(5)(1)的治疗剂，其中所述血液凝固异常为血友病B，凝血因子为第IX因子或其突变体。

(6)(1)的治疗剂，其中所述血液凝固异常为血友病A或者血友病B，凝血因子为第VII因子或其突变体

(7)(1)的治疗剂，其中所述慢病毒载体为猴免疫缺陷病毒载体。

(8)(1)的治疗剂，其中所述慢病毒载体是选自马传染性贫血病毒载体，人免疫缺陷病毒1载体，人免疫缺陷病毒2载体，猫免疫缺陷病毒载体，牛发热性疾病病毒载体以及山羊关节炎/脑炎病毒载体中的载体之一。

(9)一种感染了慢病毒载体的造血干细胞。其中所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸，以及对于巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子。该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子。

(10)是一种感染了慢病毒载体的巨核细胞和/或其衍生产物的血小板。其中所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及巨核细胞和/或其衍生产物血小板特异性启动子。该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子。

(11)提供了蓄积了凝血因子的巨核细胞和/或血小板的制备方法，该方法包括下述步骤：将慢病毒载体感染到造血干细胞的感染步骤，其中所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子；和培养感染了慢病毒载体的造血干细胞直至其分化成包含巨核细胞和/或其衍生的血小板的细胞群的步骤。

(12)血液凝固异常的治疗方法，包含以下步骤：

(a)将慢病毒载体感染到造血干细胞的步骤。其中所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸，以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子。该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子。

(b)将步骤(a)的造血干细胞给药到血液凝固异常患者的步骤。

(13)(12)的方法，其中所述造血干细胞包含采集自患者的造血干细胞。

(14)(13)的方法，其中所述造血干细胞是包含骨髓干细胞和末梢血干细胞的其中之一或以上两种的细胞。

(15)(12)的方法，将步骤(a)的造血干细胞培养后给药到人体。

(16)治疗血液凝固异常的试剂盒，包含以下组分：

a：包含一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子；以及

b：采集造血干细胞的试剂。

(17)(16)的治疗血液凝固异常试剂盒，还包含以下c组分。

c：诱导造血干细胞分化成巨核细胞所用的培养基。

(18)(17)的血液凝固异常治疗试剂盒，其中所述用以诱导造血干细胞分化成巨核细胞的培养基至少包含以下成分：

转铁蛋白；

胰岛素；

干细胞因子(stem cell factor)；

血小板生成素；

白细胞介素-6；

Flt-3配体；及

可溶性白细胞介素-6受体。

(19)慢病毒载体用于制备血液凝固异常治疗剂的用途，该慢病毒载体包含有编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子。该编码凝血因子的多核苷酸功能性的结合于该启动子。

本发明涉及慢病毒载体在制造血液凝固异常治疗剂中的的用途。该慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸，以及巨核细胞和/或其衍生产物血小板中的特异性启动子。该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子。本发明还提供血液凝固异常治疗用医药包装，其包括：包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子的慢病毒载体，其中该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子；以及关于血液凝固异常治疗的说明书。

发明的效果

基于本发明开发了血液凝固异常的新疗法。使用本发明的血液凝固异常治疗剂，可以使凝血因子在血小板中长期表达，维持对血液凝固功能的改善效果。有望实现少次数，长疗效的理想的治疗效果。具体为，治疗血友病等慢性血液凝固异常，根据本发明，例如数月治疗(给药)一次，也可以稳定维持血液凝固功能。

在对血友病患者给药治疗用凝血因子时，经常可以观察到会产生中和抗体，从而降低治疗效果。所以使防止中和抗体产生的治疗方法实用化，在血友病的治疗方法中尤为重要。本发明正是使在血小板中表达的凝血因子在细胞内部中能够被保存，从而大大限制了患者的免疫系统与外来凝血因子的接触机会。即本发明可以防止对为治疗而给药的凝血因子产生中和抗体。

即使对已有中和抗体的血友病患者，本发明的血液凝固异常治疗也会有效。一般而言，对已产生中和抗体的患者，通过血液给药的凝血因子与体内的中和抗体结合后会减低其活性。而本发明的血小板内表达的凝血因子只要保持在血小板内部存在，就不会与血液中的中和抗体发生接触，所以其活性不被中和而仍得以维持。并且，在出血部位被激活的血小板释放出的凝血因子，可以在出血部位帮助血液凝固。本发明的从血液中和抗体的保护和出血部位凝血因子的释放如图8所示。

本发明的防止对凝血因子产生中和抗体的效果，在正常情况下，对血液中分泌的凝血因子尤其有利。这些体液因子通常将凝血因子封存在血液中以达到治疗效果。因此，在治疗中不可避免地会使给药的蛋白质与患者的免疫系统发生接触。也就是说，防止产生中和抗体是极为困难的。而由于本发明能够使必要的凝血因子保持在血小板中，所以即使是体液因子也可达到理想的治疗效果。进而，还可以避免保持在血小板中的凝血因子与免疫系统发生接触。即本发明提供了在给药体液凝血因子的情况下治疗效果和防止中和抗体这两大难题的解决方法。

附图说明

[图1]血小板特异性启动子活性的比较示意图。(A)实验中使用的血小板特异性启动子的图解。将各种构建体与无启动子的载体(基本)以及对照载体(SV40/增强子)共同转染到了UT-7/TPO(B)、CD34⁺来源的巨核细胞(C)、及HUVEC(D)中。转染48小时后测定了萤光素酶活性，与被SV40启动子(SV40/增强子)促进产生的活性做了比较。各实验用相同的样品重复试验了5次。柱形及误差棒表示平均±SD。

[图2]携带由CMV或GPIbα启动子促进的eGFP基因的SIV载体转导的UT-7/TPO细胞以及CD34⁺由来巨核细胞中的eGFP表达示意图。(A)为本研究中使用的SIV构建体概略示意图。用SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIbα-eGFP以指定的MOI数感染UT-7/TPO(B)及CD34⁺由来巨核细胞(C)。采用流式细胞术分析了细胞内的eGFP表达。柱形及误差棒表示平均±SD(n＝3)。(D)采用流式细胞术调查了当天、第5天、第7天、第12天、以及第15天的人CD34⁺细胞的巨核细胞分化期间的GPIIb及GPIb的细胞表面表达情况。柱形及误差棒表示平均±SD(n＝3)。(E)将分化开始后的当天、第3天、第7天、以及第14天的CD34⁺由来巨核细胞，用SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIbα-eGFP，以MOI 30进行了转导。柱形及误差棒表示平均±SD(n＝3)。

【图3】由SIV-CMV-eGFP对KSL细胞进行转导的示意图。培养KSL细胞，以递增的SIV-pCMV-eGFP浓度转染24小时(A)、或以固定浓度(MOI＝30)转染经过不同的温育时间(B)。用流式细胞术分析了指定的温育后的KSL细胞内的eGFP的表达。图为表达eGFP的转导细胞的百分比。柱形及误差棒表示平均±SD(n＝3)。

【图4a】活体内血液细胞中eGFP表达启动子的不同效果的表示图。培养KSL细胞，并在MOI30下由SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIbα-eGFP进行转导。将100,000个转导细胞与5×105个的未分级全骨髓细胞一起给药到放射线照射了的小鼠体内。(A)CD45⁺淋巴细胞中eGFP阳性细胞及末梢血中的粒细胞、红细胞(RBCs)以及血小板的具有代表性的流式细胞术分析。

【图4b】(B)移植后第14天、第30天以及第60天的CD45⁺淋巴细胞(左)及血小板(右)中的eGFP阳性细胞百分比。柱形及误差棒表示平均±SD(每组n＝5)。

【图4c】(C)移植后第60天、为检测B淋巴细胞(B220)、T淋巴细胞(CD3)、粒细胞(Gr1)、巨噬细胞(CD11b)及成红血细胞(TER119)，使用抗体对骨髓细胞进行了染色。用流式细胞术分析测定了各系细胞中的GFP阳性细胞。数据为3个实验的代表值。

【图5】从接受了hFVIII转导的KSL细胞移植的小鼠采取的器官中的hFVIII表达示意图和照片。(A)将未被转导的KSL细胞(对照)，或用SIV-pCMV-hFVIII或SIV-pGPIbα-hFVIII转导的KSL细胞，如“材料及方法”中所述，注射到受到致命性放射线照射的CL57/B6小鼠体内。图示为所示器官中有关hFVIII基因由来的复制的RT-PCR分析。作为对照，同时就小鼠GAPDH的RNA做了RT-PCR。数据为4个实验的代表值。(B)SIV载体由来的mRNA表达，如“材料及方法”所述，用实时定量RT-PCR进行定量。柱形及均值相关区间图为平均±SD(每组n＝4)。

【图6】移植小鼠的骨髓及脾脏的hFVIII表达照片。(A)由SIV-pCMV-hFVIII或SIV-pGPIbα-hFVIII转导的KSL细胞所移植的小鼠由来的分离骨髓细胞，对小鼠GPIbα(左)及hFVIII(中央)进行了免疫染色。将2个图像用右侧的柱图重叠比较。在用SIV-pGPIbα-hFVIII转导的骨髓细胞中，观察到了存在表达GPIbα及FVIII的重复部位。(B)各移植小鼠(阳性染色：灰色)的脾脏中的hFVIII的免疫组织化学。作为对照，同时将移植了未被载体感染的KSL细胞的小鼠脾脏切片，做了抗FVIII抗体处理。原始放大倍率×400。

【图7】血小板靶向性基因投递的血友病A小鼠的表现型改善示意图。(A)将用SIV-pGPIbα-hFVIII转导或未转导的KSL细胞移植的FVIII缺损小鼠由来的血液，在50μg/ml的胶原蛋白及1μM的PMA中刺激15分钟或不刺激。离心分离后，获取除去血小板的血浆，并用ELISA法测定了hFVIII抗原水平。柱形及误差棒表示平均±SD(每组n＝4)。(B)将作为对照的KSL细胞或用SIV-pGPIbα-hFVIII转导的KSL细胞(对照为n＝10、GPIbα为n＝8)移植后的小鼠断尾后24小时以内的死亡率。死亡率用统计学的x²检验法进行了评价。

【图8】血流中血小板内的导入基因产物(凝血因子)被保护免遭中和抗体的作用，和出血部位导入基因产物(凝血因子)从被激活的血小板释放的模式图。

本发明的最佳实施方式

本发明涉及一种以慢病毒载体为有效成分的血液凝固异常的治疗剂。所述的慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸，以及血小板特异性启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于该启动子。本发明者们确认了通过血小板特异性启动子可在血小板中诱导目的凝血因子的表达。进一步确认了慢病毒载体将该基因导入到造血干细胞后，可以长期稳定地表达凝血因子，使血液凝固功能得到实际改善。

本发明中的所谓“凝血因子”是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。例如，第I因子～第XIII因子(无第VI因子)，及其活化型都包含在本发明所述的凝血因子范畴内。VWF等参与初期止血的蛋白质也包含在本发明所述的凝血因子范畴内。本发明的凝血因子优选来源于应接受治疗患者的动物种。由此，以人为治疗对象时优选使用人体由来的凝血因子。

本发明的凝血因子包含人工蛋白质。具体来说，以下蛋白质包含在本发明的凝血因子范畴内。

(1)与天然凝血因子具有同等活性的突变体

例如，众所周知人第VIII因子，即使缺损构成N末端的B区域，只要保持有活性也可作为凝血因子(Blood Vol.81，No.11，1993：pp 2925-2935，Blood Vol.84，No.12，1994：pp 4214-4225，Eur J Biochem 1995 Aug.；232(1)：pp19-27)。因此，缺损B区域的第VIII因子的突变体也包含在本发明的凝血因子内。将缺损B区域的第VIII因子的氨基酸序列编为序列号：10，编码它的cDNA的编码域的碱基序列编为序列号：9。

其它的凝血因子，包括氨基酸序列的一个或多个附加、缺失、置换、及插入并与天然凝血因子保持有同等活性的突变体，均包含在本发明的凝血因子内。

第VIII因子，是由2332个氨基酸组成的巨大蛋白质。编码第VIII因子的DNA约7kb。由于已知的载体有的不能表达如此巨大的蛋白质，为解决这个问题，有时利用缺损B区域的突变体(1457氨基酸残基)，以便尽量减小表达产物。然而，本发明中携带了凝血因子基因的慢病毒载体具有可以携带较大外源性基因的特征。因此，它们不仅可以携带缺损有B区域的突变体，还例如可以携带编码第VIII因子全长的DNA，并保持其稳定的表达。

另外，本发明的凝血因子优选在蛋白质被翻译后，不被分泌而保存在血小板内。凝血因子一被分泌到血流中后，会导致中和抗体的诱导或抑制剂的中和。因此，本发明的凝血因子优选具有无前导序列的构造。

(2)比天然凝血因子更具活性的突变体

本发明的凝血因子，不仅可以利用与天然凝血因子具有同等活性的蛋白质，还可以利用比天然凝血因子具有更强活性或其性质被改变的蛋白质。可以获得作为凝血因子的活性或在活体内的稳定性或者对活体的免疫原性等改变了的凝血因子。这些含有相对于天然凝血因子而言产生突变，附加了治疗上可取的性状的突变体也可作为本发明的凝血因子使用。

例如，第VIII因子的变体(EXPERIMENTAL and MOLECULARMEDICINE，Vol.34，No.3，233-238，July 2002)，或第VII因子的变体(Biochem.J.(2004)379(497-503))等已有报道，这些变体均包含在本发明的凝血因子中。

本发明，例如以下所示凝血因子可用于如下所示伴有血液凝固异常疾病的治疗。对于各种凝血因子，上述(1)或(2)中所述突变体也可作为本发明的凝血因子使用。

血友病A(第VIII因子、第VIIa因子)

血友病B(第IX因子)

血管性血友病(Von Willebrand’s disease)(血管性血友病因子(vonWillebrand factor))

第I因子缺乏症、无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症(第I因子)

第II因子缺乏症(凝血酶原)

第V因子缺乏症、副血友病(第V因子)

第VII因子缺乏症(第VII因子)

第X因子缺乏症(第X因子)

第XI因子缺乏症(第XI因子)

第XIII因子缺乏症(第XIII因子)

在这些疾病中，患者人数居多的血友病A、血友病B、及血管性血友病为重要的社会性疾病。因此，针对各种疾病的治疗有用的因子，即第VIII因子、第VIIa因子、第IX因子、及血管性血友病因子、以及与这些因子具有同等活性的突变体，是本发明中优选的凝血因子。

本领域技术人员可制备编码本发明凝血因子的多核苷酸。例如，已知人源VWF及第I因子～第XIII因子的氨基酸序列，或cDNA的碱基序列。可以cDNA的碱基序列的一部分或全部作为探针，从肝脏的cDNA库制备目的多核苷酸。或者，将已知的碱基序列的一部分作为引物，以肝脏等适当组织的mRNA作为模板，根据已知的核酸扩增法合成为所需的多核苷酸。

本发明中编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于血小板特异性启动子。本发明中的所谓功能性的结合，指的是根据血小板特异性启动子的活性，编码凝血因子的基因进行转录，即在该启动子的下游连接有编码凝血因子的基因。或者启动子与基因功能性的结合，意指在血小板特异性启动子的调控下编码凝血因子的基因得以表达。

本发明中所谓血小板特异性启动子，指的是在导入任意的宿主细胞时，在血小板细胞中表现启动子活性的DNA。更具体地说，血小板特异性启动子是指导入造血干细胞时，可以在血小板或其前体细胞即巨核细胞中检测出启动子活性。本发明优选的启动子为巨核细胞分化后期的转录活性较高的启动子。而对血小板无特异性的启动子，在血小板及巨核细胞以外的细胞中可检测出启动子的活性。

启动子在每种细胞中的活性可根据报告基因检测的原理进行评价。即制备报告基因功能性地结合于应评价其活性的启动子功能性地结合的构建物，然后将其导入到各种细胞中。在导入了该构建物的细胞中如能检测出报告基因的信号，就可检测出启动子的活性。作为报告基因，已知可具有生成荧光活性及酶活性等的各种信号的基因。更具体为，GFP(荧光活性)、LacZ或Luc(酶活性)等可以作为报告基因使用。

本发明的所谓血小板特异性启动子活性，是指在该启动子所导入的细胞群中，只要对血小板具有特异性即可。例如导入造血干细胞及骨髓细胞时，在所导入的细胞群中最终在血小板中确认到启动子活性的血小板特异性启动子，包含在本发明的血小板特异性启动子中。本发明的血小板特异性启动子的种类不限。只要具备活性，可以来源于任意动物。或被人为改变的启动子也可使用。

例如，血小板特异性膜糖蛋白质GPIbα的启动子，就是适合于凝血因子基因在血小板或巨核细胞中进行特异性表达的启动子。具体地，GPIbα启动子的活性，尤其可以在巨核细胞分化的后期被强化。即随着向血小板的分化进程其活性也逐渐增强。所以，该启动子是在血小板中特异性较高的启动子。并且，与同样作为血小板特异性启动子的GPIIb相比，其启动子活性要更强。

将本发明可利用的GPIbα启动子的碱基序列标为序列号：7。进而，在包含有序列号7的碱基序列的启动子与其所调控下表达的基因编码区域之间配置非翻译区域(5′UTR)，以此提高转录活性。所以，例如将第VIII因子基因功能性地结合于该启动子时，可以使第VIII因子基因的5′UTR介入在GPIbα和第VIII因子基因之间。在GPIbα(序列号：7)的下游附加有第VIII因子基因5′UTR的碱基序列的序列号为：8。

本发明的GPIbα启动子，包含与该启动子具有同等功能的启动子。所谓同等功能的启动子，例如序列号7的碱基序列(人)为基础，可根据同源性检索等检出(例如BLAST；Altschul，S.F.et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。或通过以序列号7的碱基序列为基础设计的引物，由基因组PCR获得的序列。或使用人以外的动物来源的基因组库，使用含有序列号7的碱基序列的探针，在严格条件下进行杂交，以获得的人以外动物来源的同源的启动子。具体为，从包含GPIbα启动子的核酸、或者作为被杂交对象的核酸中之一来制备探针，通过由该探针检出的与其杂交的核酸来鉴定目的启动子。

严格的杂交条件为，例如含5×SSC(1×SSC包含150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA、5×denhardt’s溶液(1×denhardt’s溶液含0.2％聚维酮、0.2％牛血清白蛋白、及0.2％聚蔗糖)的溶液中，在48℃，优选50℃，更优选52℃下进行杂交，之后与杂交同样的温度，优选60℃，更优选65℃，进而更优选68℃下在2×SSC中，优选1×SSC中，更优选0.5×SSC中，更优选0.1×SSC中震荡清洗2小时。

如此获得的启动子，包含与GPIbα启动子具有较高同源性的序列。所谓较高同源性，具有为70％或以上，优选75％或以上，更优选80％或以上，更优选85％或以上，更优选90％或以上，更优选95％或以上的同一性的序列。序列的同源性可以根据，例如BLAST程序来决定(Altschul，S.F.et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。具体为，决定碱基序列同源性时使用blastn程序，决定氨基酸序列同源性时使用blastp程序。例如NCBI(National Centerfor Biothchnology Information)的BLAST网页中的″Low complexity″等的过滤的设定全部为OFF，用缺省的参数进行计算(Altschul，S.F.et al.(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.et al.(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)Genome Res.7：649-656)。参数可使用如下数值。

缺口形成分值(open gap cost)是核苷酸为5、

缺口延伸分值(extend gap cost)的是核苷酸为2、

核苷酸错配(nucleotide mismatch)的处罚为-3、

核苷酸错配的报酬为1、

期望值(expect value)为10、

字长(wordsize)是核苷酸为11、

blastn中blast延伸的减少(Dropoff，X)以比特数计为20、

在blastn中带缺口比对的最终X减少值(以比特数计)是50

比较2个序列时，使用blast2sequences程序(Tatiana A et al.(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，作成2序列比对，以决定序列的同源性。缺口与错配同样处理，计算GPIbα启动子全体(例如序列号7的全长)序列的同源性的值。

另外，GPIbα启动子中有可能存在多态及变体。而且，一般来说对部分碱基序列的置换及缺失或插入，大多可以维持有启动子的活性。如此，GPIbα启动子的变体可以用于本发明中。GPIbα启动子的变体，包含序列号7的碱基序列中的1个或多个碱基的置换、缺失、和/或插入的序列。与碱基序列号7的不同通常在30个碱基以内、优选20个碱基以内、优选10个碱基以内、更优选5个碱基以内、更优选3个碱基以内、更优选2个碱基以内。变体启动子的活性，例如可以根据如上所述的报告基因测试等方法确认。其结果，确认到与GPIbα启动子具有相同或其以上活性的启动子，为本发明优选的GPIbα启动子。

本发明的血液凝固异常治疗剂中，编码凝血因子的多核苷酸整合在慢病毒载体中，且该编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于血小板特异性启动子。以下，对可在本发明中使用的慢病毒载体进行阐述。

病毒的生命周期大体可分为感染和增殖两个阶段。一般来说，病毒载体是以利用病毒的感染系统，将基因有效地导入到宿主细胞内为特征。为确保安全，很多病毒载体须排除增殖系统以使其缺失自我复制能力，以防止导入细胞后增殖。

简要说明载体粒子的构造。首先，载体粒子中有一种被称为衣壳的蛋白质外壳。衣壳由gag基因产物的结构蛋白质构成。在衣壳的外侧有一层叫做包膜的膜结构。包膜具有决定感染细胞种类的功能。衣壳中存在着2个拷贝的载体基因组RNA、pol基因产物的逆转录酶。病毒载体一旦感染宿主细胞，载体基因组RNA便通过上述自身的逆转录酶被逆转录后、整合到宿主染色体，成为前病毒DNA，以完成感染。

通常，病毒载体可以通过包装载体和转基因载体制备。包装载体携带有敲除了包装信号的病毒DNA。病毒DNA中包含病毒蛋白质序列。导入了包装载体的宿主细胞叫做包装细胞。包装载体导入宿主后，由于宿主细胞中没有包装信号，便形成空的病毒粒子。

转基因载体携带有整合进宿主染色体DNA所必要的病毒来源的基因序列和需导入的外源性基因。本发明中血小板特异性启动子和编码凝血因子的多核苷酸连接形成的构建体作为外源性基因被搭载在转基因载体中。将该转基因载体导入包装细胞时，由转基因载体所供给的载体基因组DNA整合到宿主染色体后，可通过转录来制备载体基因组RNA。该载体基因组RNA被包含到包装细胞制作的病毒粒子中，形成具有将核酸分子导入进宿主内能力的病毒粒子。

一般来讲，将缺失自我复制功能，具有将核酸分子导入到宿主内能力的病毒粒子称为病毒载体。尤其是，通过基因重组技术构建的病毒载体称为“重组”病毒载体。使用编码病毒基因组的DNA和包装细胞构建的病毒载体包含在重组病毒载体内。本发明中的慢病毒载体，是包含慢病毒来源的病毒基因组，缺失自我复制能力，具有将核酸分子导入到宿主内能力的病毒粒子。

所谓的慢病毒指的是慢病毒亚科(Lentivirus)的逆转录病毒。例如，以下病毒包含在慢病毒中。

人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus；HIV)；

(例如HIV1或HIV2)、

猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus；SIV)、

猫免疫缺陷病毒(FIV)、

梅迪-维斯纳病毒(maedi-visna virus)、

马传染性贫血病毒(EIAV)、

山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)

本发明可以利用任意的病毒株以及亚型来源的慢病毒。例如，HIV-1包括所有的主要(M)亚型(包含A到J)、N以及outlier(O)(Hu，D.J.etal.，JAMA 1996；275：210-216；Zhu，T.et al.，Nature 1998，5；391(6667)：594-7；Simon，F.et al.，Nat.Med.1998，4(9)：1032-7)。SIV分离株可以例举出，SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm、SIVsyk等。这些慢病毒中猴免疫缺陷病毒(SIV)载体为特别优选的病毒载体。

作为本发明的SIV载体，可以利用序列号14的SIV基因组的碱基序列。或可利用已知的SIV基因组的碱基序列(Fukasawa et al.Nature Vol.333，p457-461，1988；GenBank Accession No.X07805)。

本发明中的所谓″猴免疫缺陷病毒(SIV)载体″，指的是病毒粒子里核酸分子中的病毒载体功能所必须的序列是基于SIV基因组序列的载体。本发明中所谓″病毒载体功能所必须的序列″，可以表示成从5’侧逐次为以下区域。

5′LTR的R区域；

U5区域；

包装信号

RRE；

3′LTR的启动子区域以外的U3区域；

R区域；

作为构成本发明中的SIV载体的各区域的碱基序列，例如可以表示如下。

序列号：1/从5′LTR区域到包装信号的碱基序列

序列号：2/RRE序列

序列号：3/从缺失有3′LTR启动子区域的U3区域到R区域的碱基序列

以上碱基序列只是例举的其中例子，如果是具有同样功能的碱基序列，都可以在本发明中使用。即只要符合上述定义，本发明的SIV载体还可以包含其突变体。例如，″病毒载体功能所必须的序列″，只要是SIV来源，就可以包含其他SIV来源的序列或SIV以外来源的序列。可包含的优选序列，例如可以例举后述的cPPT(central polypurine tract)、内部启动子(CMV)、WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。

猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)是在猴子中表达的类似于HIV的病毒，与HIV一起称为灵长类慢病毒(Primates Lentivirus)类群(井户荣治，速水正宪，猴免疫缺陷病毒的基因和感染·病原性.蛋白核酸 酵素：Vol..39，No.8.1994)。进而，该群大致还可以分为4个组。

1)包含导致获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiencysyndrome，AIDS)原因的HIV-1和从黑猩猩分离出的SIVcpz在内的HIV-1组

2)由从白顶白眉猴Cercocebus atys分离的SIVsmm和从猕猴Macacamulatta分离的SIVmac，对人有较低致病性的HIV-2(Jaffar，S.et al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.，16(5)，327-32，1997)组成的HIV-2组

3)从非洲绿猴Cercopithecus aethiops分离的以SIVagm为代表的SIVagm组

4)从山魈Papio sphinx分离的以SIVmnd为代表的SIVmnd组。

其中，没有SIVagm及SIVmnd对其自然宿主具有病原性的报告(Ohta，Y.et al.，Int.J.Cancer，15，41(1)，115-22，1988；Miura，T.et al.，J.Med.Primatol.，18(3-4)，255-9，1989；速水正宪，日本临床，47，1，1989)。有报告说，尤其是本实施例中使用的SIVagm中一种的TYO-1株，即使对其自然宿主食蟹猴(Macaca facicularis)、猕猴(Macaca mulatta)进行的感染实验中也不显示病原性(Ali，M.et al，Gene Therapy，1(6)，：367-84，1994；Honjo，S.et al.，J.Med.Primatol.，19(1)，9-20，1990)。

目前，还没有关于SIVagm对人的感染和发病报告，对人是否有病原性尚属未知。一般，对灵长类的慢病毒种属特异性较高，很少有从其自然宿主感染其他种类并发病的例子。即使感染其发病率也很低，或者具有即使发病其发病进程也很缓慢的倾向(Novembre，F.J.et al.，J.Virol.，71(5)，4086-91，1997)。所以，SIVagm，尤其是以SIVagm TYO-1株为骨架制备的病毒载体，与以HIV-1及其他慢病毒为骨架的载体相比，其安全性较高。也就是说，以SIVagm TYO-1株为骨架制备的慢病毒载体是本发明的优选载体。SIVagm TYO-1株的基因组碱基序列表示为序列号：14。

本发明的猴免疫缺陷病毒载体，可包含其他的逆转录病毒基因组RNA序列的一部分。例如，如下所示含有利用SIV以外的慢病毒基因组序列的一部分置换SIV基因组的一部分的嵌合序列的载体，也包含在本发明的SIV载体中。

人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus；HIV)；

猫免疫缺陷病毒Feline Immunodeficiency Virus(FIV)(Poeschla，E.M.etal.，Nature Medicine，4(3)，354-7，1998)；

山羊关节炎脑炎病毒Caprine Arthritis Encephalitis Virus(CAEV)(Mselli-Lakhal，L.et al.，Arch.Virol.，143(4)，681-95，1998)

本发明的慢病毒载体包含携带有编码凝血因子的多核苷酸的重组SIV载体。其中所述编码凝血因子的多核苷酸功能性地结合于血小板特异性启动子。在本发明中，作为凝血因子使用第VIII因子时，将携带有编码第VIII因子的多核苷酸的SIV载体表述为SIV-FVIII载体。本发明的SIV-FVIII载体，只要符合上述定义，对其种类及构造没有特别限制。本发明优选的SIV-FVIII载体，可举例出用转基因载体制备的SIV载体。该载体包含有插入了编码第VIII因子的多核苷酸的碱基序列。

本发明的SIV-FVIII载体也可以是VSV-G假型化载体。所谓VSV-G假型化是指，载体的包膜中包含有水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的表面糖蛋白——VSV-G蛋白。VSV-G蛋白可以来源于任意的VSV病毒株。例如可以使用印地安纳(Indiana)血清型株(J.Virology 39：519-528(1981))来源的VSV-G蛋白，但不限于此。VSV-G蛋白也可以是从天然来源的蛋白质中通过置换、缺失、和/或附加等方法改变1个或多个氨基酸来获取。VSV-G假型化载体，可以在生产病毒时通过将其与VSV-G蛋白质共存来制备。

例如，通过VSV-G表达载体的转染剂及整合到宿主染色体DNA中的VSV-G基因的表达诱导、通过在包装细胞内表达VSV-G，从该细胞产生的病毒粒子可以用VSV-G假型化。由于VSV-G蛋白质是1种糖蛋白形成稳定的3聚体存在于膜上，所以在纯化过程中很难破坏载体粒子。同时用VSV-G假型化的病毒粒子可以离心分离高浓度浓缩(Yang，Y.et al.，Hum Gene Ther：Sep，6(9)，1203-13.1995)。

本发明的SIV-FVIII载体可包含附加的其他病毒来源的包膜蛋白质。可以附加在SIV-FVIII载体的包膜蛋白质，例如，适合来源于感染人细胞的病毒的包膜蛋白质。包膜蛋白质尤其不受此限制。例如，逆转录病毒的包膜蛋白质等可附加在SIV-FVIII中。

具体为，逆转录病毒的双嗜性包膜蛋白质可使用例如，小鼠白血病病毒(MuLV)4070A株由来的包膜蛋白质。也可用MuMLV 10A1由来的包膜蛋白质(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux，R.K.et al.，J.Virol.70：5701-5705(1996))。其他疱疹病毒科的蛋白质，可例举单纯疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白质、EB病毒的gp350、gp220蛋白质等。肝炎病毒科的蛋白质，还可例举乙型肝炎病毒的S蛋白质等。

可以对本发明的重组猴免疫缺陷病毒载体的LTR(长末端重复longterminal repeat)进行改变。LTR是逆转录病毒特异性的序列，存在于病毒基因组的两端。5′LTR作为启动子促进原病毒的mRNA转录。所以、将包被在病毒粒子内的编码病毒RNA基因组的转基因载体5′LTR的启动子活性部分与其他强力启动子置换的话，可增大转基因载体的mRNA转录量，提高包装效率及载体效价。

进而，例如慢病毒，已知5′LTR的转录活性因病毒蛋白tat的作用而增强。所以通过将5′LTR置换为不依赖tat蛋白的启动子，可以从包装载体中去除tat。

侵入到感染细胞内的病毒RNA被逆转录后，形成两端的LTR相结合的环状构造。接着LTR间的结合部位和病毒整合酶(Integrase)共同作用，将病毒基因组整合进细胞染色体内。

原病毒转录的mRNA为从5′LTR内转录起始点下游到3′LTR的polyA序列。5′LTR启动子部分在病毒内不被包装。所以，即使置换启动子，插入到靶细胞染色体的部分不会发生变化。综上可知，置换5′LTR启动子，有利于制作较高效价和安全性的载体。所以、置换转基因载体的5′侧启动子，可提高被包装载体的效价。

另外、可以去除3′LTR的部分序列，制作自我失活型载体(SelfInactivating Vector：SIN载体)以防全长的载体mRNA从靶细胞被转录，提高安全性。侵入靶细胞染色体的慢病毒的原病毒形成将3′LTR的U3部分结合到5′端的形状。所以转基因载体的转录产物被逆转录后，在整合到靶细胞染色体的状态下，U3配置在5′端，由此和转基因载体转录产物的构造相同的RNA被转录。

假如靶细胞内存在慢病毒或与其类似的蛋白，被转录的RNA再次被包装，有可能再次感染其它细胞。而且位于病毒基因组3′侧的宿主由来基因有可能通过3′LTR的启动子被表达(Rosenberg，N.，Jolicoeur，P.，RetoroviralPathogenesis.Retroviruses.Cold Spling Harbor Laboratory Press，475-585，1997)。这一现象已被视为逆转录病毒载体的难题，作为回避的方法而开发出了SIN载体(Yu，S.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，83(10)，3194-8，1986)。

通过去除转基因载体3′LTR的U3部分，使得靶细胞内失去了5′LTR及3′LTR的启动子，所以不会引起全长RNA及宿主基因的转录。并且，从内部启动子只转录目的基因，可望成为安全性高、表达水平高的载体。这种载体正适合本发明。SIN载体的构建可参照公开的方法或本发明者们的专利申请：国际公开号WO2002/101057的实施例1-4中所述方法。

使用逆转录病毒载体等基因组内包含LTR序列的病毒载体进行基因治疗的问题之一就是导入基因的表达水平逐渐降低。原因之一是，这些载体整合到宿主基因组后，由于宿主方的生理活动，使LTR甲基化，造成导入基因的表达受到抑制(Challita，P.M.and Kohn，D.B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2567，1994)。自我失活型载体(SIN)的长处是，一旦整合到宿主基因组中，LTR序列的大部分会失去，因此不会受LTR甲基化的影响降低基因表达水平。

本发明者将转基因载体3′LTR的U3区域与其它启动子序列置换而制作出的自我失活型载体导入灵长类ES细胞后，发现可维持2个月以上稳定的表达(WO2002/101057)。如此，通过改变LTR U3区域使得自我失活而设计出的SIN载体尤其适合于本发明。

具体为，通过置换、缺失及/或附加3′LTR的U3区域的一个或多个碱基而改变的载体包含在本发明中。这个U3区域可以只是缺失，也可以在这个区域插入其它的启动子。这样的启动子可以列举如CMV启动子、EF1启动子、或CAG启动子等。

此外，本发明中携带于慢病毒载体的凝血因子基因被设计为由血小板特异性启动子进行转录。例如，如上将LTR U3区域与非LTR启动子的血小板特异性启动子置换的时候，可以通过这个改变了的LTR来驱动凝血因子基因。或如实施例所示，在LTR区域配置血小板特异性启动子，通过在其下游连结凝血因子基因，可以在不依存LTR的情况下诱导凝血因子基因的表达。

有资料指出，以HIV载体为首的慢病毒载体在宿主基因组持有原病毒HIV的情况下，外来载体和内源性原病毒之间发生重组，有可能产生具有复制能力的病毒。这的确是HIV感染患者实施HIV载体给药的大问题。不过，SIV载体几乎没有与HIV同源的序列。加上载体SIV是一种去除80％以上病毒由来序列的不可复制型病毒，所以，形成可复制病毒的危险性极小。即，与其它慢病毒载体相比，SIV载体具有很高的安全性。

本发明的SIV载体是一种很大程度上去除了上述“作为病毒载体的机能所必需的序列”以外的SIV基因组序列的载体。本发明优选的SIV载体是原载体由来的SIV基因组序列的40％以上、通常50％以上、优选60％以上、更优选70％以上、更优选80％以上被去除的不可复制型病毒。

逆转录病毒的产生，是在宿主细胞转录具有包装信号的转基因载体DNA，在gag、pol蛋白以及包膜蛋白质的存在下形成病毒粒子。包装细胞内的gag、pol蛋白可用包装载体供给。包膜蛋白既可由包装载体供给，也可由其它载体供给。例如可由VSV-G表达载体供给。

本发明的转基因载体至少含有以下组分。

5′LTR、

包装信号序列、

血小板特异性启动子、

凝血因子基因、及

3′LTR序列

LTR序列可以作为SIV载体的改型如上进行改变。同时，还可以整合上述cPPT序列、CMV序列、或RRE序列。转基因载体DNA编码的包装信号序列优选尽可能长，以保持由此序列形成的构造。

同时，为了抑制该载体DNA上的包装信号和供给gag、pol蛋白质的包装载体之间由重组导致产生的野生型病毒的出现频率，有必要将这些载体间序列的重复控制在最小限度内。所以，构建转基因载体DNA，要兼顾到包装效率及安全性这两方面，优选使用包装所必要的尽可能短的序列。

例如，包装载体为SIVagm由来时，HIV由来的转基因载体则不被包装。因此，转基因载体DNA所用包装信号被认为限于SIV由来。只是，在使用HIV由来的包装载体时，SIV由来的转基因载体也被包装。所以，要减低重组病毒的出现频率，也可以将不同的慢病毒由来的转基因载体和包装载体进行组合，使其形成载体粒子。这样制造的SIV载体也包含在本发明的载体中。这时，优选在灵长类慢病毒之间的组合(例如、HIV和SIV)。

优选对转基因载体DNA加以改变，以使gag蛋白不进行表达。病毒gag蛋白对活体来说被当成异物加以识别，有可能表现出抗原性。同时也有可能给细胞机能带来影响。为了不表达gag蛋白，可以在gag的起始编码子的下游附加或缺失碱基，导致随后的编码区框码漂移。而且，优选缺失gag蛋白编码区域中的一部分。

一般来说病毒的包装，需要gag蛋白的编码区域的5′侧。所以，转基因载体优选去除gag蛋白C末端的编码区域。在不严重影响包装效率的范围内优选尽可能广地去除gag编码区域。同时，也优选将gag蛋白的起始密码子(ATG)置换成ATG以外的密码子。置换的密码子可选择不太影响包装效率的为好。将如此构建的带有包装信号的转基因载体DNA导入到适当的包装细胞中，可使其生产病毒载体。生产的病毒载体例如可从包装细胞的培养上清中回收。

为进一步提高凝血因子基因的导入效率及表达效率，可以改变转基因载体DNA。例如，为提高导入效率可导入cPPT序列。cPPT本来就是存在于SIV基因组中的序列。很早以前有关于HIV病毒的报告(P.Charneau et al.：J.Virol 65：2415-2431，1991)。cPPT一旦导入到HIV载体中会使载体基因组容易进入细胞核，从而提高基因导入效率(A.Sirven et al.：Blood96：4103-4110，2000)。

本实施例使用的cPPT的碱基序列如序列号4所示。提高表达效率的改变可具体举例为导入WPRE序列。WPRE是具有提高基因表达效率的因子(US Patent 6284469：RNA export element and methods of use)。有报告指出，其它的慢病毒载体中同时导入CPPT和WPRE这2个因子，可使其各自的效果有进一步的提高(SC.Barry et al.：Hum.Gene Ther.12：1103-1108，2001)。本实施例使用的WPRE的碱基序列如序列号5所示。

本发明的SIV-FVIII载体中，cPPT可以与一般的慢病毒载体中的位置相同。例如，可以将cPPT配置在启动子和外部基因之间，或配置于RRE序列的上游。优选配置于驱动凝血因子转录的上述血小板特异性启动子的上游(图2A)。另一方面，WPRE可以配置在凝血因子基因的下游。

本发明的包装载体可去除那些在凝血因子基因导入时所不必要的序列。作为不必要的序列，可列举如称为附加基因的vif、及vpr、以及调控基因tat、及rev等。有报告说附加基因产物在载体中并非必要(V.Kim et al.：J.Virol 72：811-816，1998)。近年为提高安全性，一般使用去除了附加基因的载体。另外，tat也被去除，rev转移到其它质粒使得安全性更加得到提高的被称为第三世代的载体正在开发中。从包装载体去除rev时，可以另外构建rev表达载体，并将该rev表达载体用在本发明的SIV-FVIII载体制备中。SIVagm TYO-1株的rev的碱基序列如序列号6所示。

如上构建的包装载体，可以包含例如，启动子序列、病毒核蛋白质序列(gag)、逆转录酶序列(pol)、polyA序列，按实施例所示上述构成还可以包含RRE序列。另外rev表达载体，可以由在rev序列上游配置调控该序列的启动子，在rev序列下游配置polyA序列来构成。

用于包装细胞的细胞只要是一般病毒制备所使用的细胞株则没有限制。考虑到用于人体基因治疗，最好使用来源于人或猴的细胞。包装细胞可使用的人细胞株可以列举如293细胞、293T细胞、293EBNA细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。猴由来细胞株可以列举如、COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。

本发明的SIV-FVIII载体可以纯化至基本纯。具体可用过滤器过滤、离心分离、及分离柱提纯等公知的纯化·分离方法纯化载体。例如将载体溶液在0.45μm的过滤器中过滤后，经42500×g、90分、4℃条件下的离心，可将载体沉淀、浓缩。

本发明的血液凝固异常治疗剂可以用于伴有血液凝固异常的疾病的治疗及预防。具体可用于血友病的治疗及预防。例如，作为凝血因子的第VIII因子或第VIIa因子(活化型第VII因子)可用作血友病A的治疗剂。或将第IX因子作为凝血因子应用，可用作血友病B的治疗剂。上述携带了与血小板特异性启动子功能性结合的凝血因子基因的SIV-载体可以根据需要与可药用载体或赋形剂适当混合成为上述疾病用治疗剂。

“可药用载体”是指可以与本发明载体一起给药，是一种不明显抑制该载体的基因导入的材料。例如，该载体可以用灭菌水、生理盐水、培养液、血清、磷酸盐缓冲液(PBS)等适当混合。进一步地，还可以含有其他稳定剂和杀菌剂等。

将上述血液凝固异常治疗剂感染血小板前体细胞，可制造血小板前体细胞移植组合物。也可使该细胞分化成巨核细胞或血小板，制造血液凝固异常治疗用的巨核细胞或血小板。即本发明涉及一种感染慢病毒载体的血小板前体细胞。该慢病毒载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性地结合的编码凝血因子的多核苷酸。

本发明的所谓血小板前体细胞包含具有分化出血小板机能的任意细胞。例如造血干细胞就是能分化出血小板的细胞。或从造血干细胞中分化出来的经过进一步分化能形成血小板的巨核细胞。所以、巨核细胞也是血小板前体细胞。

本发明还涉及储存了凝血因子的巨核细胞及/或血小板的制造方法，其包括下述步骤：一是将慢病毒载体感染到血小板前体细胞的步骤，该慢病毒载体包含血小板特异性启动子，以及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸；一是将慢病毒载体感染的血小板前体细胞培养至分化成包含巨核细胞及血小板的任意之一或两者在内的细胞群的步骤。

例如，造血干细胞在适当的细胞因子类等存在的条件下进行培养，可诱导分化成巨核细胞。继续培养的话，血小板前体细胞的巨核细胞进而分化成血小板。造血干细胞分化成巨核细胞及血小板，可以通过各细胞特异性标记的出现和消失进行检测。或观察细胞形态的变化，也可确认向巨核细胞及血小板的分化。巨核细胞及血小板的形状比较特殊，很容易发觉其形态的变化。

本发明的所谓造血干细胞(hematopoietic stem-cell；HSC)指的是可以分化成巨核细胞或血小板至少其中之一的血液细胞的细胞。换言之，分化成血小板的所有血小板前体细胞包含在本发明的造血干细胞中。本发明的造血干细胞可以使用包含该细胞在内的细胞群。具体例如，可以将骨髓及脐带血作为含有造血干细胞的细胞群使用。或将末梢血干细胞用于造血干细胞。

各血液细胞可以根据形态及染色的特异性鉴定。染色法可使用姬姆萨染料染色、瑞氏染色、梅-姬复合染色、梅格吉染色、过氧化物酶染色、弹性蛋白酶染色、PAS染色等方法(参照新生化学实验讲座8，血液(上)，1987，8-15页)。

造血干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于末梢血管及脐带血中。这些细胞被本发明的慢病毒载体所感染，给药到患者，可以进行本发明的血液凝固异常的治疗。本发明所谓给药造血干细胞指的是将含有造血干细胞的细胞组合物给药到患者。具体包含骨髓移植(BMT)、末梢血干细胞移植(PBSCT)及脐带血干细胞移植(CBSCT)等。即本发明不仅不限于骨髓细胞移植，还适用于末梢血造血干细胞移植及脐带血移植。HSC可通过用集落试验法算定粒细胞、单核细胞的前体细胞，或用流式细胞仪测定HSC特异性CD34(抗原)阳性细胞来鉴定。

具体的造血细胞可举例为，小鼠c-kit⁺、Thy1.1^low、lin^-、Sca-1⁺(OsawaM，Hanada K，Hamada H，Nakauchi H.Science.1996；273：242-245.)、人CD34⁺、Thy⁺、Lin^-、c-kit^low(Bhatia M，Wang JC，Kapp U，Bonnet D，Dick JE.Proc Natl Acad Sci U S A.1997；94：5320-5325)等具有表现型的细胞。lin^-(谱系阴性)的表现型可用市场出售的试剂盒等鉴定及选择。例如GPA、CD3、CD2、CD56、CD24、CD19、CD14、CD16、及CD99b都是阴性。

人造血干细胞的分离方法可参照以下文献。

Leary AG，Blood 69：953，1987；

Sutherland HJ，Blood 74：1563，1989；

Andrews RG，J Exp Med 169：1721.1989；

Terstappen LWMM，Blood 77：1218，1991；

Lansdorp PM，J Exp Med 175：1501，1992；

Briddell RA，Blood 79：3159，1992；

Gunji Y，Blood 80：429，1992；

Craig W，J Exp Med 177：1331，1993；

Gunji Y，Blood 82：3283，1993；

Traycoff CN，Exp Hematol 22：215，1994；

Huang S，Blood 83：1515，1994；

DiGinsto D，Blood 84：421，1994；

Murray L，Blood 85：368，1995；

Hao QL，Blood 86：3745，1995；

Laver JH，Exp Hematol 23：1515，1995；

Berardi AC，Science 267：104，1995；

Kawashima I，Blood 87：4136，1996；

Leemhuis T，Exp Hematol 24：1215，1996；

Civin CI，Blood 88：4102，1996；

Larochelle A，Nature Med 2：1329，1996；

Tajima S，J Exp Med 184：1357，1996；

Sakabe H，Stem Cells 15：73，1997；

Sakabe H，Leukemia 12：728，1998；及

原田实根等编，新造血干细胞移植，南江堂，1998，9-23页

例如小鼠的骨髓细胞可用灌流从大腿骨、颈骨提取，用裂解缓冲液(0.38％NH₄Cl溶于Tris-HCl，pH7.65)去除红血球后，去除用抗Thy1.2抗体及用兔补体的抗体补体反应产生的成熟T细胞后取得(Tomita Y，MayumiH，Eto M，Nomoto K.J Immunol.1990；144：463-473.)。此外，将提取骨髓细胞用抗B220(B细胞)抗体、抗CD3(T细胞)抗体、抗Gr-1(粒细胞)抗体、抗Mac-1(巨噬细胞)抗体、抗DX-5(NK细胞)抗体等抗体，通过磁珠法或离心法去除谱系后取得(Sato T，Laver JH，Ogawa M.Blood.1999；94：2548-2554.)。

从骨髓提取人的造血细胞时可在全身麻醉下进行。卧位，从肠骨两侧，各3～5处，1次取骨髓液数mL左右(防止混入末梢血)。提取量在同种移植时细胞数为3(2～5)×10⁸/kg(患者体重)、同种移植时取1～3×10⁸/kg为宜。混入骨组织时可网筛后装入袋内。骨髓移植的时候通过粗过滤膜给药。本发明可以将慢病毒载体导入到提取的骨髓液本身、或从骨髓液分离的造血干细胞的细胞群、或分离出的造血干细胞中。

同种移植时优选人白细胞抗原(human lymphocyte antigen；HLA)适合的供体。不过，通过GVHD预防法的确立、新免疫抑制剂的开发及CD34阳性细胞的纯化技术等，HLA不一致的供体也可移植。供体的HLA-A、-B、及DR的3组6抗原中4种以上、优选5种以上、更优选全部与接受移植者相同。A B O major不适合移植时，离心分离去除红血球后使用。A B Ominor不适合时、离心分离去除血浆后使用。(森下等编、『造血干细胞移植手册』第2版、小寺、齐藤监修、日本医学馆、东京、(1999年)p260-277、参照)。

从末梢血管提取末梢血干细胞时，每日一次400μg/m²(或10μg/kg)，或分2次，5天内或到提取结束时连日皮下注射G-CSF，从给药开始第4天到第6天期间1到3次、可用血球分离装置从末梢血(静脉)提取造血干细胞[可参照日本造血细胞移植学会的网页中有关造血干细胞移植的说明资料(2003年4月21日改订第3版)]。关于末梢血干细胞(PBSC)的募集可参照Harada M et al.，J.Hematother 5：63-71，1996、Waller CF et al.，BoneMarrow Transplant 18：279-283，1996、Anderlini P et al.，Blood 90：903-908，1997、原田实根等编，新造血干细胞移植，南江堂，1998，67-72页、名古屋BMT组编，造血细胞移植手册改订三版，2004，237-240页。

用于募集的G-CSF，除可使用野生型蛋白质外，还可用其它改变了N末端的衍生物(nartograstin等)、附加了糖链的修饰蛋白质(lenograstin等)。另外，G-CSF也可与其它的造血因子并用。例如、可与GM-CSF、IL-3、或SCF等并用(Huhn RD et al.，Exp Hematol 24：839-847，1996；Begley CG et al.，Blood 90：3378-3389，1997；Lane TA et al.，Blood 85：275-282，1995)。G-CSF给药时如出现腰痛、骨痛及发热等全身症状，可给药阿司匹林，减轻症状。

要提取人末梢血造血干细胞(CD34⁺细胞)，可从上述提取的末梢血干细胞中得到的CD34阳性细胞用CD34抗体磁珠的浓缩法Isolex system(Baxter公司等)、CliniMACS(AmCell公司)，抗生物素蛋白柱浓缩法(CEPRATE、Cellpro公司)、将CD34抗体固定在烧瓶中，将反应细胞吸附于烧瓶，剩余洗净(CELLECTOR、AIS公司)等方法将CD34阳性细胞分离而得(森下等编、『造血干细胞移植手册』第2版、小寺、齐藤监修、日本医学馆、东京、(1999年)p260-277、参照)。

人脐带血细胞移植，在提取的脐带血中加入红细胞沉降剂血球，按重量分为各血液组分，去除移植时不要的血浆组分、红细胞组分，得到必要的造血干细胞。然后将CD34阳性细胞用Isolex system(Baxter公司)、CliniMACS(AmCell公司)、抗生物素蛋白柱浓缩法(CEPRATE、Cellpro公司)、将CD34抗体固定于烧瓶，将反应细胞吸附于烧瓶，剩余洗净(CELLECTOR、AIS公司)等方法纯化可得脐带血CD34阳性造血干细胞(参照森下等编『造血干细胞移植手册』第2版、小寺、齐藤监修、日本医学馆、东京、(1999年)p260-277)。

分离的造血干细胞可根据例如甲基纤维素法，可在添加了SCF、IL-3、GM-CSF、G-CSF、Epo的培养基内培养(Sonoda Y.et al.，Blood 84：4099-4106，1994；Kimura T.et al.，Blood 90：4767-4778，1997)。造血细胞可添加1×10²到1×10⁴/ml左右，例如在37℃、5％ CO₂、5％ O₂条件下培养。但培养条件可适度调整。

同种移植多选择简便性的末梢血干细胞移植，也适用于同种骨髓移植。这时通常在不受化学疗法影响的造血恢复期确认骨髓的正常造血后，在全身麻醉下从髂骨及胸骨提取。按需要提取的细胞数为有核骨髓细胞3×10⁸～5×10⁸个/kg左右为宜。用连续式血液成分分离装置所得细胞浮悬液很少混入粒细胞及红细胞，可以省去单核细胞分离操作。大量混入粒细胞及红细胞，可用Ficoll比重离心法分离单核细胞。为了去除和浓缩颗粒球及红血球，骨髓液可根据Ficoll处理或血液分离装置进行单核细胞分离。

冻存提取的细胞时，在含有10％自身血清、10％DMSO的RPMI1640培养基中浮悬后冻存，用程控冰箱冻存，在液氮中保存。细胞浓度以2×10⁷到6×10⁷/ml为宜。短期细胞保存时，为使细胞悬浮液(1×10⁸/ml以下的浓度)中的终浓度为6％羟乙基淀粉(HES)、5％DMSO、4％白蛋白可加入等量冰镇保存液，可在-80℃的低温冰箱中冻存(Knudsen LM et al.，J.Hematother.5：399-406，1996)。

安全的同种移植所必要的CD34阳性细胞数大约为2×10⁶/kg(Schots Ret al.，Bone Marrow Transplant.17：509-515，1996；Zimmerman TM et al.，BoneMarrow Transplant.15：439-444，1995)。CD34阳性细胞数可用通常的2色流式细胞术测算。具体为，将血细胞分离仪分离的骨髓细胞及末梢血细胞通过溶血处理去除红细胞后，用前散射和抗CD45抗体展开，设门，去除红细胞及血小板。接着，将这个门用侧散射和抗CD34抗体展开，对去除中性粒细胞等非特异反应部分的组分中的全部细胞数按比例计算。可以从所得值和事先用血细胞计数器测定的血细胞数中，计算出整个CD34阳性细胞数。

冻存细胞所含的成活干细胞数可通过集落形成法查数CFU-GM的方法得知。移植必要的CFU-GM标准一般是1×10⁵～2×10⁵/kg。

如上制备的造血干细胞或含有造血干细胞的细胞群通过与本发明的血液凝固异常治疗剂相接触，可以将携带凝血因子基因的慢病毒载体导入到造血干细胞中。慢病毒载体和造血干细胞可以在体内(in vivo)或体外(invitro或ex vivo)接触。例如可以在培养液、生理盐水、血液、血浆、血清、体液等适宜的生理性水溶液中接触，将慢病毒载体导入到细胞中。这时，聚凝胺(polybrene)及retronectin等存在下使两者接触，可提高慢病毒载体的感染效率。

载体和造血干细胞相接触中可将MOI(感染复数；每1个细胞所感染的病毒数)在1～500之间调整。MOI通常2～300、例如，3～200、优选5～100、更优选7～70。在这个条件下，慢病毒载体在极短时间内被导入造血干细胞。具体地说，两者的接触时间可以调整为1分钟以上、通常3分钟以上、例如，5分钟以上、优选10钟分以上、或20分钟以上。例如1～60分钟左右、更具体为5分钟～30分钟左右。当然，接触时间还可以更长，如几天以上。

导入载体的造血干细胞可与可药用载体或赋形剂适当混合成为造血干细胞移植组合物。“可药用载体或赋形剂”如果是可以悬浮活细胞的溶液则不受限制。例如，可列举磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水、林格氏液、培养液等。

造血干细胞移植组合物也可包含未导入载体的造血细胞。导入载体的造血细胞和未导入载体的造血细胞相混合可提高造血细胞的成活率。混合比率不受限制，例如导入载体的造血细胞：非导入造血细胞的比例可在1∶10～10∶1之间适当调整。

本发明涉及从导入了上述慢病毒载体的造血细胞中诱导分化巨核细胞或血小板的方法。这一方法包含(a)将慢病毒载体接触到造血干细胞的步骤。该载体携带与血小板特异性启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸；及(b)将方法(a)的造血干细胞注射入动物的步骤。

或本发明还涉及一种包含以下步骤的血液凝固异常的治疗方法。

(1)将慢病毒载体感染到造血干细胞的步骤。该载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸；及(2)将步骤(1)的造血干细胞给药血液凝固异常患者的步骤。

本发明用于血液凝固异常治疗的造血干细胞的由来不受限制。如果是患者自身提取的造血干细胞的话，容易成活，没有GVHD等危险。不过如果使用免疫抑制剂的话，异体造血干细胞也可应用于本发明。本发明的治疗方法中的造血干细胞如果只要是可分化成血小板的细胞，其由来不受限制。具体为，可使用骨髓干细胞及末梢血造血干细胞之一或包含两者的细胞等。例如，骨髓细胞是本发明治疗方法的优选造血干细胞。

本发明的慢病毒载体感染后的造血干细胞可适当培养后给药到患者。例如，上述慢病毒载体感染的造血干细胞在分化诱导用培养基中培养，诱导分化成巨核细胞，从而提高本发明的血液凝固异常的疗效。通常、造血干细胞不仅具有分化成巨核细胞(血小板前体细胞)的功能，也具有分化成红细胞及白细胞的功能。为此，只将造血干细胞返回活体的话，慢病毒载体感染细胞不仅可能分化成巨核细胞，还有可能分化成红细胞及白细胞。

然而本发明使凝血因子在血小板特异启动子的调控下得以表达，在这些的血小板以外的血液细胞中凝血因子有可能不能表达。所以，提高慢病毒载体感染的造血干细胞中分化成巨核细胞的细胞比例，直接关系到提高本发明的治疗效果。能够诱导分化成巨核细胞的培养条件已为公知。

例如，由患者提取的骨髓在以下组成的IMDM中进行24小时左右培养。培养后，与慢病毒载体接触，进而10到24小时后将细胞洗净给药到患者。培养时不需要retronectin。

IMDM 1％血清白蛋白

200micro-g/mL of transferrin(转铁蛋白)

10micro-g/mL of insulin(胰岛素)

100ng/mL of SCF(干细胞因子；stem cell factor)

10ng/mL～100ng/mL of TPO(血小板生成素)

100ng/mL of IL-6(白细胞介素-6)

100ng/mL of Flt-3L(Flt-3配体)

400ng/ml of sIL-6R(可溶性IL-6受体)

上述组成，血清白蛋白中可使用例如，去除脂肪酸的牛血清白蛋白(fattyacid-free BSA)、或无病毒的人血清白蛋白制剂等。或作为TPO的添加量，具体例如，可添加100ng/mL(Mostoslavsky et al.Mol.Ther.11，932-940，2005)。

用于本发明血液凝固异常治疗法的组分可事先组合，提供为治疗用试剂盒。即本发明涉及包含以下组分的血液凝固异常治疗用试剂盒。

a：包含慢病毒载体。该载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸；及

b：造血干细胞的采集试剂。

本发明的治疗用试剂盒中所述的慢病毒载体可根据治疗情况分量包装。例如，脐带血移植时，一般成活所必要的造血干细胞为2-3×10⁷个细胞/kg。所以，按50kg体重者计算的话需要1-1.5×10⁹个细胞。MOI 10、功能效价(Functional Titer)假定为1×10¹⁰/ml的话，病毒液量为1-1.5ml。如果是MOI 30的话，液量为3倍。

或对公知的重症复合型免疫缺陷症患者，从骨髓细胞中分离CD34阳性细胞，给药14-38×10⁶/kg细胞(N Engl J Med.2002 Apr18；346(16)：1185-93)。在这个条件下，给药的细胞中的基因导入细胞为5-20×10⁶/kg。同样条件实施本发明时，大约2×10⁷/kg的细胞的全部感染慢病毒载体后给药到体重50kg的患者体内，需要1×10⁹细胞。这个处理所需的病毒液量在MOI 10的感染条件时为1ml。所以本发明的治疗用试剂盒中的慢病毒载体在MOI 10感染条件时，例如，可以是0.05～50mL、通常0.5～20mL、具体为0.8～10mL、或0.8～2mL液量。

根据本发明者们的经验，本发明的慢病毒载体所给药目标不是所有细胞，感染一半左右的细胞就会得到充分的疗效。所以，慢病毒载体的使用量可以尽量减少。具体为MOI，15左右，用同量的病毒液量做成试剂盒。在上述条件下，或感染的细胞数为一半左右，既可得到预期的治疗效果。

同样，本发明中构成治疗用试剂盒的造血干细胞的提取试剂应为感染上述慢病毒载体，获得造血干细胞所需的试剂。分离人的造血干细胞的方法为公认。具体例如，为分离造血干细胞而与细胞标记结合的抗体包含在提取造血干细胞的试剂中。

本发明的治疗试剂盒可以附加诱导造血干细胞分化成巨核细胞的培养基。如上所述，感染慢病毒载体的造血干细胞通过加大巨核细胞的分化比例，提高本发明的治疗效率。将造血干细胞诱导为巨核细胞的培养基为公知的。例如，包含以下细胞因子类等的培养基，可用于骨髓细胞的分化诱导的培养。

转铁蛋白；

胰岛素；

干细胞因子(stem cell factor)；

血小板生成素；

白细胞介素-6；

Flt-3配体；及

可溶性白细胞介素-6受体

或不同由来的造血干细胞(供体)的患者(移植受体)的移植，可实施本发明的治疗方法。即使供体采集的造血干细胞感染慢病毒载体。将所得造血干细胞酌情培养后给药。通常情况，造血干细胞由于患者的免疫应答被排除的可能性很大。然而，事先移植受体经免疫抑制处理后，某种程度上造血干细胞成活很明显。这样，将不完全破坏骨髓组织的移植方法称为“迷你”移植等。所以，用供体的造血干细胞也可适用本发明血液凝固异常的治疗方法。

利用供体的造血干细胞实施本发明的治疗方法时，感染了慢病毒载体的造血干细胞可作为血液凝固异常的治疗剂。即本发明涉及一种感染了慢病毒载体的造血干细胞。该慢病毒载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸。

或本发明提供一种血液凝固异常的治疗剂。该治疗剂的主要成分含有感染了慢病毒载体的造血干细胞。该慢病毒载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸。本发明进一步涉及感染了慢病毒载体的造血干细胞在血液凝固异常治疗剂的制造方面的应用。该慢病毒载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸。

进而，本发明也可将慢病毒载体感染的造血干细胞分化出的巨核细胞或血小板作为血液凝固异常治疗剂来提供。即本发明提供慢病毒载体感染的造血干细胞分化的巨核细胞及血小板之一或者是两者。该慢病毒载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸。本发明将这些巨核细胞及血小板表述为凝血因子导入细胞。

或本发明提供以上述凝血因子导入细胞为有效成分的血液凝固异常的治疗剂。进而本发明涉及上述凝血因子导入细胞在血液凝固异常治疗剂的制造方面的应用。

更进一步讲，本发明涉及血液凝固异常治疗用医药包装。该包装包含感染了慢病毒载体的造血干细胞及记载有该造血干细胞能够用于血液凝固异常治疗的使用说明书。该慢病毒载体包含血小板特异性启动子及与该启动子功能性结合的编码凝血因子的多核苷酸。同样，本发明提供血液凝固异常治疗用医药包装。该包装包含上述凝血因子导入细胞和记载有该凝血因子导入细胞能够用于血液凝固异常治疗的使用说明书。

且本说明书中引用的所有现有技术文献作为参考被编入本说明书。

实施例

<材料及方法>

(1)小鼠

FVIII基因的第16外显子被靶向破坏的血友病A模型小鼠由H.H.Kazazian Jr.(宾夕法尼亚大学、费城、PA、美国)提供(Bi，L.，Lawler，A.M.，Antonarakis，S.E.，High，K.A.，Gearhart，J.D.，and Kazazian，H.H.Jr.(1995)Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model ofhaemophilia A.Nat.Genet.10，119-121)。C57BL/6(B6-Ly5.2)小鼠购于日本SLC(静冈、日本)。在Ly5基因座位(B6-Ly5.1)中导入了基因的C57BL/6小鼠购于Sankyo-Lab服务(筑波、日本)。动物管理遵照自治医科大学的规范化动物管理及有关机构的规定(Madoiwa，S.，Yamauchi，T.，Hakamata，Y.，Kobayashi，E.，Arai，M.，Sugo，T.，Mimuro，J.，and Sakata，Y.(2004)Induction ofimmune tolerance by neonatal intravenous injection of human factor VIII inmurine hemophilia A.J.Thromb.Haemost.2，754-762)。

(2)细胞因子及抗体

重组人血小板生成素(TPO)及重组人干细胞因子(SCF)由麒麟啤酒公司(群马、日本)提供。以下材料由所示供应源提供。

重组人IL-6(IL-6)、重组人可溶性IL-6受体(sIL-6R)及重组人Flt3-配体(Flt3-L)(PeproTech EC、伦敦、英国)；

重组人IL-3(IL-3)(TECHNE公司、明尼阿波利斯、MN)；

抗小鼠c-kit单克隆抗体(MoAb)(克隆2B8)、抗小鼠Sca-1 MoAb(克隆D7)、抗小鼠Ly5(CD45)MoAb(克隆30-F11)及抗小鼠Ly5.1(CD45.1)MoAb(克隆A20)(BD Pharmingen公司、CA)；

抗小鼠GPIbα MoAb(克隆Xia.G5)(Emfret Analytics GmbH公司、Wurzberg、德国)；抗人GPIIb/IIIa MoAb(克隆5B12)、抗人GPIbαMoAb(克隆AN51)及抗人CD34 MoAb(克隆BIRMA-K3)(DakoCytomation、Glostrup、丹麦)。

(3)细胞培养

人原巨核细胞株UT-7/TPO由Norio Komatsu博士(山梨大学、山梨、日本)提供(Komatsu，N.，Kunitama，M.，Yamada，M.，Hagiwara，T.，Kato，T.，Miyazaki，H.，Eguchi，M.，Yamamoto，M.，and Miura，Y.(1996)Establishmentand characterization of the thrombopoietin-dependent megakaryocytic cell line，UT-7/TPO.Blood 87，4552-4560)。将其细胞在补充了10％牛胎儿血清(FBS)及10ng/mL的TPO的Iscove′s modified Dulvecco培养基(IMDM)中培养。

得到人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后如前述维持(Hisano，N.，Yatomi，Y.，Satoh，K.，Akimoto，S.，Mitsumata，M.，Fujino，M.A.，and Ozaki，Y.(1999)Induction and suppression of endothelial cell apoptosis by sphingolipids：apossible in vitro model for cell-cell interactions between platelets andendothelial cells.Blood 93，4293-4299)。

(4)巨核细胞的分化

将脐带血由来的人CD34⁺细胞用AutoMACS磁细胞分类系统(MiltenyiBiotec.、Auburn、CA)按照制造商的指示进行分离。单离的CD34⁺细胞的纯度超过90％(未标明具体数据)。将CD34⁺细胞在补充了50ng/ml的TPO及10ng/ml的IL-3的含有1％脱脂肪酸BSA、200μg/ml铁饱和人转铁蛋白及10μg/ml人重组胰岛素的IMDM中增殖分化成巨核细胞(Majka，M.，Rozmyslowicz，T.，Lee，B.，Murphy，S.L.，Pietrzkowski，Z.，Gaulton，G.N.，Silberstein，L.，and Ratajczak，M.Z.(1999)Bone marrow CD34⁺ cells andmegakaryoblasts secrete -chemokines that block infection of hematopoieticcells by M-tropic R5 HIV.J.Clin.Invest.104，1739-1749)。培养14天后，细胞的75～90％对GPIIb/III呈阳性(图2C)。

(5)萤光素酶标记质粒、瞬时性转染及萤光素酶测定的构建

将认为具有最大启动子活性的以下DNA片段通过以人基因组DNA为模板，用PCR进行扩增。

GPIIb启动子：-554～+28(Prandini，M.H.，Uzan，G.，Martin，F.，Thevenon，D.，and Marguerie，G.(1992)Characterization of a specificerythromegakaryocytic enhancer within the glycoprotein IIb promoter.J.Biol.Chem.267，10370-10374)；

GPIbα启动子：-254～+330(Hashimoto，Y.，and Ware，J.(1995)Identification of essential GATA and Ets binding motifs within the promoter ofthe platelet glycoprotein Ib gene.J.Biol.Chem.270，24532-24539)；及

GPVI启动子：-320～+28(Holmes，M.L.，Bartle，N.，Eisbacher，M.，andChong，B.H.(2002)Cloning and analysis of the thrombopoietin-inducedmegakaryocyte-specific glycoprotein VI promoter and its regulation by GATA-1，Fli-1，and Sp1.J.Biol.Chem.277，48333-48341)

亚克隆到PCR-Blunt-TOPO(Invitrogen公司、Carlsbad、CA)后，接着将断片克隆进pGL3-碱基性、无启动子的萤光素酶质粒(Promega公司、麦迪逊、CA)。将50万个细胞(UT-7/TPO及CD34⁺由来巨核细胞)置于6孔培养板各孔中的IMDM(无FBS或生长因子)培养基中，使用DMRIE-C试剂(Invitrogen公司)用4μg的质粒DNA进行转染。4小时后，每孔添加了补充有2×生长因子的等量IMDM。将细胞在37℃条件下培养48小时，然后按照制造商的说明(萤光素酶检测系统，Promega公司)对萤光素酶活性进行了检测。

(6)SIV载体的构建及制备

如上构建了无复制能力的自我失活型SIV载体(Nakajima，T.，Nakamaru，K.，Ido，E.，Terao，K.，Hayami，M.，and Hasegawa，M.(2000)Development ofnovel simian immunodeficiency virus vectors carrying a dual gene expressionsystem.Hum.Gene.Ther.11，1863-1874)。全长的人FVIII(hFVIII)cDNA由J.A.van Mourik博士(血液凝固作用、Sanquin、阿姆斯特丹、荷兰)提供。且如上通过PCR技术为基础的突变诱导制作出人B域-删除(human Bdomain-deleted，BDD)的FVIII(hBDD-FVIII)cDNA(Lind，P.，Larsson，K.，Spira，J.，Sydow-Backman，M.，Almstedt，A.，Gray，E.，and Sandberg，H.(1995)Novel forms of B-domain-deleted recombinant factor VIII molecules.Construction and biochemical characterization.Eur.J.Biochem.232，19-27)。

将巨细胞病毒(CMV)启动子所驱动的eGFP基因(或hFVIII基因)插入到SIV由来载体的含有LTR的(U3、R、U5)元件之间，组成了SIV-pCMV-eGFP/hFVIII。同样将GPIbα启动子所驱动的eGFP基因(或hFVIII基因)插入到SIV由来载体的含有LTR的(U3、R、U5)元件之间，组成了SIV-pGPIbα-eGFP/hFVIII(图2A)。

用Lipofectamine Plus试剂(Invitrogen公司)将基因导入质粒与3个包装质粒(编码gag-pol、rev、及VSV-G env)一起转染进293T细胞。12小时后，为回收病毒粒子，更换了培养基。在48小时回收培养基，将病毒粒子离心分离进行了浓缩。通过293个细胞的感染测定了具有eGFP的SIV载体的转染单元，接着通过FACS分析测定了eGFP的表达。SIV-CMV eGFP载体的平均感染性在2～5×10⁸TU/ml范围内。为比较各种启动子或靶基因之间的病毒感染性，将病毒粒子效价用实时定量RT-PCR同时进行了测定。用QIAamp病毒RNA小量提取试剂盒(QIAGEN公司、巴林西阿、CA)，分离病毒RNA，其分离的RNA用SuperScript II(Invitrogen公司)进行了逆转录。

通过使用了QuantiTect探针PCR系统(Qiagen公司)的实时定量PCR，测定了土拨鼠肝炎病毒(WPRE)序列由来的载体特异转录后调节因子的复制产物，并做了载体粒子的定量化。将WPRE序列通过WPRE正向引物的5′-GCTTTCATTTTCTCCTCCTT-3′(序列号：11)及WPRE反向引物的5′-GGCCACAACTCCTCATAA-3′(序列号：12)扩增。FAM标记探针序列是5′-ATCCTGGTTGCTGTCTC-3′(序列号：13)。

PCR是在95℃下15分钟的最初保温步骤开始的。热循环是94℃下15秒、56℃下30秒、76℃下30秒，这样的45次循环。PCR的退火阶段，用ABI PRISM 7700序列检测系统(PE Applied Biosystems、Foster City、CA)检出了来自特异探针的报告荧光信号。SIV载体的平均病毒粒子效价在1～2×10¹⁰TU/ml范围。SIV载体的感染性(感染复数：MOI)由粒子效价对SIV-CMV-eGFP的比率来算定。

为将SIV载体转染进UT-7/TPO及CD34⁺由来的巨核细胞，将1×10⁵个细胞在含有8μg/ml的聚凝胺的100μL培养基里再悬浮。用24小时的测试中显示各种MOI的SIV载体对细胞进行了转染。接着，在含有0.5％BSA及2mM的EDTA的300μl的PBS中，使细胞再悬浮，并用FACS分析，分析了eGFP阳性细胞。

(7)造血干细胞分离及病毒转染

从小鼠大腿骨及小鼠胫骨所得的骨髓细胞，通过使用谱系细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec)的磁分离去除了表达谱系细胞标记(B220、CD5、CD11b、Gr-1及Ter-119)的细胞。然后，用FACS(FACSAria cell sorter、Becton Dickinson)分离了Sca-1⁺及c-kit⁺细胞(KSL)。

将新分离的细胞KSL用SIV载体直接感染时，转染后PI阳性细胞(死细胞)增加，降低了转染效率(未提示具体数据)。于是，进一步调查了改善SIV转染及细胞生存能力的KSL细胞的培养条件。将分离的KSL细胞与IL-3、IL-6及SCF一起培养时，导致KSL细胞中的eGFP基因的SIV转染效率降低(25～35％：MOI 30)及PI阳性细胞的大量增加(20～30％)(数据未提示)。

与SCF、IL-6、sIL-6R、Flt-3L及TPO一起将KSL细胞进行3～7天的培养，可获得eGFP的高水平表达(图3参照)。并且eGFP转染后的PI阳性细胞有明显减少(8～12％)。为此在病毒感染前，将KSL细胞在补充了以下成分的含1％的脱脂肪酸BSA、200μg/ml的转铁蛋白、及10μg/ml的胰岛素的IMDM中预培养。

100ng/ml的SCF、

10ng/ml的TPO、

100ng/ml的IL-6、

100ng/ml的Flt-3L、及

400ng/ml的sIL-6R

用50μg/ml的RetroNectin(TakaraBio公司、东京、日本)包被的培养皿中将SIV感染到细胞。将所培养的KSL细胞(1×10⁵个细胞或1×10⁶个细胞)在含有10％ FBS的100μl或1ml的IMDM中再悬浮。在培养的第12个小时，在与上述相同的细胞因子组合存在下，以各种MOI将SIV载体导入细胞，并在37℃条件下进行了培养。使用聚凝胺(最高4μg/ml)并未明显改善小鼠KSL及人CD34⁺细胞(未提示具体数据)的转染效率，所以，干细胞转染时未使用聚凝胺。然后，为了干细胞移植在含有1％牛血清蛋白(BSA)的100μl的PBS中再悬浮细胞，或为了FACS分析，将细胞按照结果所示的天数进行了培养。

(8)干细胞移植

为了便于区分供体细胞和受体细胞，从B6-Ly5.1得到了骨髓细胞。对受体小鼠(生后8～12周B6-Ly5.2)进行了9.5Gy的单一致死量的放射线照射(⁶⁰Co、Gamma Cell；Nortion International、ON、加拿大)。将无SIV转染或有SIV转染的B6-Ly5.1由来的10万个培养KSL细胞与作为竞争细胞(competitor cell)的5×10⁵个新分离Ly5.2非分级骨髓细胞同时注射。为了评价骨髓重建，用涂有肝素的微型吸管从眼窝静脉(retro-orbital sinus)抽取末梢血，Ly5.1(供体由来)淋巴细胞及骨髓细胞的百分比通过流式细胞仪进行了分析。按本发明者们的移植程序，Ly5.1细胞的移植在移植后4个月为淋巴细胞及骨髓细胞中的40～55％。

(9)hFVIII转基因转录的检出

用RT-PCR检测出hFVIII转基因的转录(Kikuchi，J.，Mimuro，J.，Ogata，K.，Tabata，T.，Ueda，Y.，Ishiwata，A.，Kimura，K.，Takano，K.，Madoiwa，S.，Mizukami，H.，Hanazono，Y.，Kume，A.，Hasegawa，M.，Ozawa，K.，and Sakata，Y.(2004)Sustained transgene expression by human cord blood derived CD34⁺ cellstransduced with simian immunodeficiency virus agmTYO1-based vectorscarrying the human coagulation factor VIII gene in NOD/SCID mice.J.Gene.Med.6，1049-1060)。用RNA分离试剂盒(RNeasy Protect试剂盒；QIAGEN公司)从小鼠器官分离RNA。用RT-PCR分析了RNA样品，所述RT-PCR使用了一对用于hFVIII(17)的引物及RT-PCR试剂盒(SuperScriptOne-StepRT-PCR系统、Invitrogen公司)。对照RT-PCR实验中使用了用于小鼠GAPDH mRNA(R&D系统公司、明尼亚波里斯、MN)的一对引物。

通过使用QuantiTect探针RT-PCR系统(Qiagen公司)的实时定量RT-PCR，定量了SIV载体由来的mRNA表达。使用小鼠GAPDH(mGAPDH)参照试剂(Qiagen公司)估算出所分析RNA的量。通过分析SIV基因转移载体的连续稀释系列，确立了标准曲线。将从组织提取的50ng纯化RNA作为模板使用。对各样品估算与标准参照曲线相比较的WPRE序列的量，并且通过用mGAPDH序列的拷贝数除WPRE序列的拷贝数，来确定WPRE序列的量。

(10)免疫组织化学

使用Cytospin3(Shandon、ThermoShandon公司、PA)将切片上附着的骨髓细胞固定在含3％多聚甲醛的PBS中，然后在0.2％的Triton X-100中使其通透(permeabilized)。用1％BSA封闭后，将样品与结合了生物素的多克隆抗FVIII抗体一起在4℃下培育2小时。培育后、用PBS洗净样品，然后与链霉亲和素偶联的Alexa 594(Molecular Probes、Eugene、OR)、及FITC标记抗小鼠GPIbα单克隆抗体一起培育。观察免疫荧光染色，用装有照相机的荧光显微镜进行了拍照。

为了对小鼠组织中的hFVIII分子进行免疫组织化学检测，在含有4％的多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，4℃下2小时固定脾脏，用含有蔗糖(10～30％)的PBS一起培育，然后在含有OCT化合物的干冰/酒精中冷冻。将-25℃冻存的组织制成切片，附着在涂有聚赖氨酸的玻璃片上。为了检出hFVIII，在含有1％兔血清和Triton-X100(0.1％)的PBS中封闭组织切片，与绵羊多克隆抗人FVIII抗体(Cedarlane试验所、Homby、安大略、加拿大)一起在4℃下16小时培育。PBS洗净后，接着与结合生物素的兔抗绵羊IgG抗体一起培育切片，再与ABC试剂(Vectastain ABC Elitekit；Vector、Burlingame、CA)及DAB试剂盒(Vector)一起培育切片。

(11)hFVIII抗原、中和抗体及表现型改变的测定

用抗hFVIII特异性ELISA试剂盒(Affinity Biological、Hamilton、ON、加拿大)测定hFVIII抗原，并与人标准血浆中的测定值做了比较。为抑制血小板活性，使用含有30μl的柠檬酸钠及1μM的PGI2的注射器，在麻醉下从小鼠的上腔静脉抽取270ml的全血后拔出。在结果所示时间内将1μM的卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)及50μg/ml的胶原蛋白添加到该血液，使血小板活化。离心分离后，进行FVIII抗原分析之前，去除了血小板的血浆一直在-80℃条件下冷冻。对小鼠中诱导的hFVIII的中和抗体，通过使用去除了FVIII的血浆及通常的全血浆的Bethesda法进行了分析(Madoiwa，S.，Yamauchi，T.，Hakamata，Y.，Kobayashi，E.，Arai，M.，Sugo，T.，Mimuro，J.，andSakata，Y.(2004)Induction of immune tolerance by neonatal intravenousinjection of human factor VIII in murine hemophilia A.J.Thromb.Haemost.2，754-762)。将几只移植小鼠在二乙醚麻醉下，切掉小鼠尾1.5cm，做了表现型矫正试验。24小时后观察小鼠的生存状况。

用于实验的血友病A模型小鼠的表现型为血液凝固功能欠损。所以，不矫正这个表现型的话，断尾的小鼠不久就会失血死亡。如果生存率得到改善，可确认通过转染的血小板第VIII因子使得血液凝固功能得到补充完善。即表现型的矫正通过断尾的血友病A模型小鼠的生存得到确认。

<结果>

[实施例1]血小板特异性启动子促进萤光素酶表达的比较

为达成靶基因在血小板的有效表达，本发明者们对最初巨核细胞内的3个血小板特异性基因GPIIb、GPIbα及GPVI的启动子活性进行了比较。图1A表示了本研究中使用的血小板特异性启动子的模式图和其固有调节因子。使用萤光素酶报告基因，比较了各启动子之间的启动子活性。本发明者们使用了在以往研究中最具有活性的启动子中的核苷酸区域(Prandini，M.H.，Uzan，G.，Martin，F.，Thevenon，D.，and Marguerie，G.(1992)Characterization of a specific erythromegakaryocytic enhancer within theglycoprotein IIb promoter.J.Biol.Chem.267，10370-10374；Hashimoto，Y.，andWare，J.(1995)Identification of essential GATA and Ets binding motifs withinthe promoter of the platelet glycoprotein Ib gene.J.Biol.Chem.270，24532-24539；Holmes，M.L.，Bartle，N.，Eisbacher，M.，and Chong，B.H.(2002)Cloning and analysis of the thrombopoietin-induced megakaryocyte-specificglycoprotein VI promoter and its regulation by GATA-1，Fli-1，and Sp1.J.Biol.Chem.277，48333-48341).

GPIbα启动子在UT-7/TPO细胞、成巨核细胞株中诱导萤光素酶的最强力表达(图1B)。GPIbα启动子的相对效率在CD34⁺由来巨核细胞中更为显著(图1C)。因为有报告指出，GPIb及GPVI在内皮细胞内表达(Konkle，B.A.，Shapiro，S.S.，Asch，A.S.，and Nachman，R.L.(1990)Cytokine-enhancedexpression of glycoprotein Ib in human endothelium.J.Biol.Chem.265，19833-19838、Sun，B.，Tao，L.，Lin，S.，Calingasan，N.Y.，Li，J.，Tandon，N.N.，Yoshitake，M.，and Kambayashi，J.(2003)Expression of glycoprotein VI invascular endothelial cells.Platelets 14，225-232)，故本发明者们调查了这些血小板特异性启动子活性在内皮细胞是否受到刺激。

在PAI-1启动子(Mimuro，J.，Muramatsu，S.，Hakamada，Y.，Mori，K.，Kikuchi，J.，Urabe，M.，Madoiwa，S.，Ozawa，K.，and Sakata，Y.(2001)Recombinant adeno-associated virus vector-transduced vascular endothelial cellsexpress the thrombomodulin transgene under the regulation of enhancedplasminogen activator inhibitor-1 promoter.Gene Ther.8，1690-1697)能有效地引导萤光素酶表达的条件下，GPIIb、GPIbα、及GPVI启动子在HUVEC中却未能引导萤光素酶的表达(图1D)。所以、本发明者们决定使用GPIbα，本研究中将靶基因直接在血小板特异性表达作为方向确定了下来。

[实施例2]SIV载体引起的巨核细胞的有效转化

本发明者们构建了包含在CMV启动子(SIV-pCMV-eGFP)或GPIbα启动子(SIV-pGPIbα-eGFP)之一的调控下的eGFP基因的2个SIV慢病毒载体。将CMV启动子(pCMV)或GPIbα启动子(pGPIbα)下游位置的转基因插入到SIV由来载体的含有LTR的元件(U3、R、U5)(图2A)之间(图2A)。为在转染细胞内增加基因表达，将土拨鼠肝炎病毒(WPRE)由来的转录后调控因子插入表达基因的下游。

为研究巨核细胞的eGFP基因转染，将UT-7/TPO或CD34⁺由来的巨核细胞在不同浓度的SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIbα-eGFP存在下培育了24小时。两个构建物都向UT-7/TPO或CD34⁺由来的巨核细胞(图2B)中有效地转染了eGFP基因。分别在约1或3的MOI下用SIV-pCMV-eGFP及SIV-pGPIb培育细胞时，完成了eGFP的半最大量表达。另一方面、使用Lipofection基因导入试剂仅将eGFP基因导入到8～12％的UT-7/TPO或CD34⁺由来的巨核细胞中(未提示具体数据)。

接着，本发明者们调查了回体方式下的巨核细胞分化是否对基因表达产生影响。在脐带血由来的CD34⁺细胞通过IL-3及TPO向巨核细胞分化的条件下，用流式细胞仪检测了细胞表面上GPIIb及GPIb的表达。当天没有发现GPIb，而约18％细胞呈GPIIb(图2D)阳性。如上所述(Lepage，A.，Leboeuf，M.，Cazenave，J.P.，de la Salle，C.，Lanza，F.，and Uzan，G.(2000)TheIIb 3 integrin and GPIb-V-IX complex identify distinct stages in the maturationof CD34⁺ cord blood cells to megakaryocytes.Blood 96，4169-4177)，GPIb被认为是在巨核细胞分化过程后期进行表达的(图2D)。CMV启动子促进的eGFP表达未受巨核细胞分化的影响(图2E)。另一方面，在pGPIbα启动子的调控下，eGFP表达在CD34⁺细胞(图2D)的巨核细胞分化中得到促进。

[实施例3]携有SIV载体的KSL细胞的有效转染的确立

发明者们使用包含CMV启动子促进的eGFP基因的SIV载体，将KSL细胞的转染方案优化。培养KSL细胞的eGFP转染效率达到60～80％(图3A)。在10～30的MOI条件下观察到了转染平台(plateau)值。与病毒载体培育后第1天(24小时)已充分实现转染基因的高表达。eGFP表达在其后日渐降低(图3B)。eGFP表达之所以减少有可能是因为细胞生存能力的减少。因为，PI阳性细胞(死亡细胞)随着时间不断增加(未提示具体数据)。所以、本发明者们在MOI为30的条件下培养KSL 24小时后，将细胞移植到了后续实验的受体小鼠中。

[实施例4]在活体内、使用携带固有GPIbα启动子的SIV载体使eGFP在血小板内优先表达

为比较CMV及GPIbα启动子的强度及特异性，并评价活体条件下SIV载体的eGFP转染，将用SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIb-eGFP转染了的KSL细胞移植到受体小鼠(Ly5.2)。将用SIV-pCMV-eGFP或SIV-pGPIbα-eGFP(MOI为30)转染的10万个培养KSL细胞(Ly5.1)与5×10⁵个竞争细胞(Ly5.2)同时植入。

移植用SIV-pCMV-eGFP转染了的KSL细胞时，在末梢血中观察到有35～45％的CD45⁺细胞及7～11％的血小板表达eGFP(图4A、4B)。更有趣的是，具有固有GPIbα启动子的SIV载体的转染给血小板(16～27％)带来了有效的基因标记，而对于CD45⁺细胞则不是这样(图4A、4B)。接着，本发明者们使用了识别巨噬细胞、粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞及成红血细胞的特定的标记分析了移植小鼠由来的骨髓细胞。在接受了SIV-pCMV-eGFP转染的KSL细胞的小鼠的这些细胞谱系中eGFP进行了表达，相反，GPIbα启动子在这些细胞谱系中不促进eGFP表达，从而确认了巨核细胞及血小板中的活性的特异性(图4C)。

[实施例5]接受移植SIV-pGPIbα-hFVIII转染的KSL细胞的血友病A模型小鼠的hFVIII的表达及表现型修正

为确定血小板依赖性基因疗法是否能够持续表达FVIII，本发明者们构建了含有在CMV(SIV-pCMV-hFVIII)或GPIbα启动子(SIV-pGPIbα-hFVIII)的调控下的hBDD-FVIII cDNA的2个SIV载体。本发明者们将1×10⁵个转染KSL细胞移植到小鼠后进行了致命性的γ照射。本发明者们首次分析了移植3个月后的移植受体器官中的hFVIII基因转录体的存在量。对CMV启动子促进的hFVIII转录的分析表明，hFVIII基因主要在骨髓表达，较少在脾脏表达(图5A、中图)。更为有趣的是，在用SIV-pGPIbα-hFVIII转染的KSL细胞的受体内，在脾脏和骨髓内发现了大部分量的hFVIII mRNA(图5A、下图)。

为了将各器官mRNA表达水平定量化，将载体特异性的WPRE表达用实时定量RT-PCR进行了测定。依RT-PCR的测定结果如期所望，骨髓及脾脏为移植了用SIV载体转染的KSL细胞的小鼠的主要部位(图5B)。有关hFVIII转录，如数据所示，两种类型的转染小鼠体内的骨髓和脾脏中均检出了hFVIII分子(图6)。值得注意的是，在从SIV-pGPIbα-hFVIII转染后的小鼠体内得到的骨髓中，表达GPIbα的细胞同时表达了hFVIII(图6A)。

最后，本发明者们评价了使用SIV-pGPIbα-hFVIII的血小板特异性的基因转染是否能矫正FVIII缺乏型血友病A模型小鼠的表现型。将有血小板活性或无血小板活性的血浆FVIII抗原水平在移植后30天或60天的移植FVIII缺乏小鼠体内进行了测定。本发明者们检出移植小鼠中的FVIII活性，并注意到在移植了SIV-pGPIbα-hFVIII转染的KSL细胞的小鼠的血浆中1～2％得到了矫正(图7A)。血小板被胶原蛋白及PMA刺激后，血浆FVIII水平可提高到2～3.5％(图7A)。断尾后的死亡率在转染小鼠中明显得到了改善(图7B)。进而，异位表达的hFVIII水平并未减弱。而且移植后60天，在接受SIV-pGPIbα-hFVIII转染的KSL细胞移植的小鼠体内未检测出对hFVIII的抑制剂(未提示具体数据)。

本发明在活体中，用含有血小板特异性启动子的SIV慢病毒载体进行了将基因导入血小板及巨核细胞的尝试。关于在转基因产物的生产中使用血小板，用转基因小鼠进行了试验(Kufrin，D.，Eslin，D.E.，Bdeir，K.，Murciano，J.C.，Kuo，A.，Kowalska，M.A.，Degen，J.L.，Sachais，B.S.，Cines，D.B.，andPoncz，M.(2003)Antithrombotic thrombocytes：ectopic expression ofurokinase-type plasminogen activator in platelets.Blood 102，926-933；Yarovoi，H.V.，Kufrin，D.，Eslin，D.E.，Thornton，M.A.，Haberichter，S.L.，Shi，Q.，Zhu，H.，Camire，R.，Fakharzadeh，S.S.，Kowalska，M.A.，Wilcox，D.A.，Sachais，B.S.，Montgomery，R.R.，and Poncz，M.(2003)Factor VIII ectopically expressed inplatelets：efficacy in hemophilia A treatment.Blood 102，4006-4013)。然而，转基因动物的方法不可用于治疗。本发明者们的系统中，具有SIV慢病毒载体的造血干细胞的转染在约20％的血小板中产生了转基因的表达，且还可以矫正血友病A模型小鼠的表现型。通过凝血因子基因的转染到血小板，可以矫正出血性障碍的表现型，这就是通过本发明初次证实的。

巨核细胞的寿命为大约10天到21天(Wilcox，D.A.，and White II，G.C.(2003)Gene therapy for platelet disorders：studies with Glanzmann′sthrombasthenia.J.Thromb.Haemost.1，2300-2311)。因此，为确立在血小板内靶蛋白质的长期表达，造血干细胞对基因导入来说比巨核细胞更为实用。因为慢病毒可以感染到某特定类型的静止细胞中，所以对造血性细胞转染方面的慢病毒由来载体的应用具有极大的兴趣。

而且，已表明实际上慢病毒载体可以有效地转染到造血干细胞(Woods，N.B.，Ooka，A.，and Karlsson，S.(2002)Development of gene therapy forhematopoietic stem cells using lentiviral vectors.Leukemia 16，563-569)。本发明者们为了安全有效地进行血小板靶基因转染，使用了SIV慢病毒系统。SIV慢病毒系统为SIVagmTYO1由来，且对自然宿主及实验性被感染的亚洲猕猴是非病原性(Nakajima，T.，Nakamaru，K.，Ido，E.，Terao，K.，Hayami，M.，and Hasegawa，M.(2000)Development of novel simian immunodeficiency virusvectors carrying a dual gene expression system.Hum.Gene.Ther.11，1863-1874)。在感染了载体的细胞中未检测出有复制能力的病毒粒子。HIV携带患者中有复制能力的慢病毒粒子的出现比HIV载体明显减低。所以SIV载体具有安全性问题及基因治疗的临床应用方面的优势。

大量的已报导研究为了巨核细胞特异的基因导入及血小板特异的基因导入，使用了GPIIb启动子。本发明者们在这一研究中使用了血小板特异的启动子——GPIbα启动子。因为，GPIbα的启动子活性比UT-7/TPO及CD34⁺由来的巨核细胞的启动子活性的能力更高。本发明者们选择这一血小板特异性启动子的另一个理由是在巨核细胞增生的晚期阶段发挥作用。GPIIb基因在血小板及巨核细胞中表达，但属于巨核细胞增生的早期阶段的基因(Lepage，A.，Leboeuf，M.，Cazenave，J.P.，de la Salle，C.，Lanza，F.，and Uzan，G.(2000)The IIb 3 integrin and GPIb-V-IX complex identify distinct stages in thematuration of CD34⁺ cord blood cells to megakaryocytes.Blood 96，4169-4177)。

在胸苷激酶(TK)基因通过GPIIb启动子而被促进的敲除小鼠中，给药更昔洛韦后使血小板总数急剧减少(Tropel，P.，Roullot，V.，Vernet，M.，Poujol，C.，Pointu，H.，Nurden，P.，Marguerie，G.，and Tronik-Le Roux，D.(1997)A2.7-kb portion of the 5′flanking region of the murine glycoprotein IIb gene istranscriptionally active in primitive hematopoietic progenitor cells.Blood 90，2995-3004)。骨髓中，成血红细胞前体细胞及骨髓祖细胞也未受影响。而且，这一事实表明在前体细胞内存在GPIIb(Tropel，P.，Roullot，V.，Vernet，M.，Poujol，C.，Pointu，H.，Nurden，P.，Marguerie，G.，and Tronik-Le Roux，D.(1997)A 2.7-kb portion of the 5′flanking region of the murine glycoprotein IIb geneis transcriptionally active in primitive hematopoietic progenitor cells.Blood 90，2995-3004)。

实际上，人CD34⁺造血性干细胞的18％已经表达了GPIIb。GPIb的出现与GPIIb的出现相比较明显迟缓。这一事实表示GPIb是比巨核细胞成熟晚的标记。所以，使用GPIbα启动子的血小板比使用GPIIb启动子可能会表达被特异性限制的基因产物。

在这里还有一个重要的实验结果表明CMV启动子促进的eGFP基因尽管在活体内的CD45⁺细胞导入效率高，但在血小板的表达明显减少。一般来说，缩短的蛋白质半衰期引起的转基因表达的减少在最终分化的血液细胞中更明显(Wahlers，A.，Schwieger，M.，Li，Z.，Meier-Tackmann，D.，Lindemann，C.，Eckert，H.G.，von Laer，D.，and Baum，C.(2001)Influence ofmultiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated geneexpression in hematopoietic cells.Gene Ther.8，477-486)。这可以在分化期间通过转基因的下调来介导。在分化细胞中，被编码的蛋白质的稳定性与转基因表达的关联性至少与能够影响RNA加工的启动子或顺式元件的选择相同(Wahlers，A.，Schwieger，M.，Li，Z.，Meier-Tackmann，D.，Lindemann，C.，Eckert，H.G.，von Laer，D.，and Baum，C.(2001)Influence of multiplicity ofinfection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression inhematopoietic cells.Gene Ther.8，477-486)。在这个状态下，促进后期巨核细胞分化的GPIbα启动子的使用对于最终分化的无核血小板的基因导入来说尤为重要。

血小板依赖性基因导入的本发明者们的战略不仅仅对症遗传性血小板障碍(Glanzmann血小板无力症(thromboasthemia)及Bernard-Sourlier症候群)，对其他出血性障碍疾病也具有治疗效果。血友病A是缺少FVIII基因导致的与X染色体有关系的出血性障碍，男性患病率为1∶5000(Hoyer，L.W.(1994)Hemophilia A.N.Engl.J.Med.330，38-47)。基因治疗比较适合血友病。因为，该病由1个基因的异常引起，并且治疗的凝固因子水平可以在大范围(5％～100％)发生变化(Hoyer，L.W.(1994)Hemophilia A.N.Engl.J.Med.330，38-47)。

FVIII的持续治疗表达在使用以各种组织为目标的广范围的基因转送技术的临床前研究中完成了(Lozier，J.(2004)Gene therapy of the hemophilias.Semin.Hematol.41，287-296)。然而，中和抗体的发生时常影响临床应用(High，K.(2005)Gene transfer for hemophilia：can therapeutic efficacy in largeanimals be safely translated to patients？J.Thromb.Haemost.3，1682-1691)、造血干细胞的靶向化也不例外。通过慢病毒转染FVIII基因到造血干细胞，可生产具有高治疗水平的FVIII(Kikuchi，J.，Mimuro，J.，Ogata，K.，Tabata，T.，Ueda，Y.，Ishiwata，A.，Kimura，K.，Takano，K.，Madoiwa，S.，Mizukami，H.，Hanazono，Y.，Kume，A.，Hasegawa，M.，Ozawa，K.，and Sakata，Y.(2004)Sustained transgene expression by human cord blood derived CD34⁺ cellstransduced with simian immunodeficiency virus agmTYO1-based vectorscarrying the human coagulation factor VIII gene in NOD/SCID mice.J.Gene.Med.6，1049-1060，Kootstra，N.A.，Matsumura，R.，and Verma，I.M.(2003)Efficient production of human FVIII in hemophilic mice using lentiviral vectors.Mol.Ther.7，623-631)。然而，以往的方法诱导产生出FVIII的中和抗体，是FVIII活性水平的减少的原因(Kootstra，N.A.，Matsumura，R.，and Verma，I.M.(2003)Efficient production of human FVIII in hemophilic mice usinglentiviral vectors.Mol.Ther.7，623-631)。

用血小板基因治疗血友病A，具有临床应用的优越性。因为在抗原呈递细胞中防止FVIII的表达，血小板特异系统的使用可以防止产生抑制剂(中和抗体)。加之，血友病A患者的10～30％具有凝血因子的给药引起的抑制剂。所以，有凝固作用低下，导致大出血的危险。对这种具有抑制剂的患者的治疗，可以使用血友病A的血小板依赖性基因治疗。因为，在血流中血小板中的凝血因子被保护而不受到抑制剂的作用。在血栓形成部位得以释放，可以使血液凝固活化。

有报告表明使用含有GPIIb启动子调控下的GPIIIa cDNA的HIV慢病毒载体，在缺乏GPIIIa的小鼠中进行了GPIIb/IIIa的治疗表达(Fang，J.，Hodivala-Dilke，K.，Johnson，B.D.，Du，L.M.，Hynes，R.O.，White II，G.C.，Wilcox，D.A.(2005)Therapeutic expression of the platelet-specific integrin，IIb 3，in a murine model for Glanzmann thrombasthenia.Blood(in press))。这一研究使用了骨髓细胞的异质群体作为干细胞移植及基因导入源。

本发明者们证实了通过GPIbα启动子SIV载体进行了KSL小鼠的造血性细胞的有效转染及血友病A模型小鼠的表现型矫正。初期的KSL细胞几乎是均一的群体，且单一的KSL细胞可带来频繁接受致命放射线照射的小鼠的长期的多系(multilineage)移植(Nakauchi，H.，Sudo，K.，and Ema，H.(2001)Quantitative assessment of the stem cell self-renewal capacity.Ann.N.Y.Acad.Sci.938，18-24)。将初期的造血干细胞靶向化是较为安全的方法。因为，重建所必须的导入细胞数在使用不均一的骨髓群体时比所需要的数少得多。

在移植了逆转录病毒载体转染的骨髓细胞的两个复合型免疫缺陷症儿童的白血病的进行期，产生了染色体DNA中整合出原病毒序列的危险(Hacein-Bey-Abina，S.，von Kalle，C.，Schmidt，M.，Le Deist，F.，Wulffraat，N.，McIntyre，E.，Radford，I.，Villeval，J.L.，Fraser，C.C.，Cavazzana-Calvo，M.，andFischer，A.(2003)A serious adverse event after successful gene therapy forX-linked severe combined immunodeficiency.N.Engl.J.Med.348，255-256)。减少插入突然变异风险的一个理论方法是采用遗传性地被改变的细胞总数最小的导入方案(Mostoslavsky，G.，Kotton，D.N.，Fabian，A.J.，Gray，J.T.，Lee，J.S.，and Mulligan，R.C.(2005)Efficiency of transduction of highly purifiedmurine hematopoietic stem cells by lentiviral and oncoretroviral vectors underconditions of minimal in vitro manipulation.Mol.Ther.11，932-940)。关于这点，使用SIV慢病毒系统转染的KSL细胞的本发明者们的步骤是临床应用中改变血小板特异性基因的实用的方法。

产业上的利用可能性

本发明可用于凝血因子的量或活性的异常引起的血液凝固异常的治疗。具体为根据本发明可以治疗凝血因子的表达水平及活性的低下为原因的血液凝固异常。作为使用本发明可治疗的疾病，可列举以下血液凝固异常性疾病。括号内为可用于各疾病治疗的凝血因子的名称。即、以下编码凝血因子的基因应用于本发明，可治疗以下各种血液凝固异常疾患。

血友病A(第VIII因子、第VIIa因子)

血友病B(第IX因子)

血管性血友病(Von Willebrand’s disease)(血管性血友病因子(vonWillebrand factor))

第I因子缺乏症、无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症(第I因子)

第II因子缺乏症(凝血酶原)

第V因子缺乏症、副血友病(第V因子)

第VII因子缺乏症(第VII因子)

第X因子缺乏症(第X因子)

第XI因子缺乏症(第XI因子)

第XIII因子缺乏症(第XIII因子)

这些血液凝固异常性疾病中，特别是血友病A及血友病B，会伴有较强出血倾向，患者数也多，是重要疾病。本发明应用到血友病，可以达到治疗次数少、治疗效果高的效果。即、可实现对血友病患者的日常生活制约少的治疗方法。

序列表

<110>生物载体株式会社(DNAVEC CORPORATION)

<120>血液凝固异常的治疗方法

<130>D4-A0506P

<150>JP 2005-315447

<151>2005-10-28

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>982

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>1

cagtctctta ctaggagacc agcttgagcc tgggtgttcg ctggttagcc taacctggtt     60

ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc    120

ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc tcactctctt gaacgggaat cttccttact    180

gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg    240

agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc    300

gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag    360

cctagttaga ggactaggag aggccgtagc cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg    420

gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag cactaaatag gagacaatta gaccaatttg    480

agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg    540

caggcaagga gatggagcgc ttcggcctcc atgagaggtt gttggagaca gaggaggggt    600

gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa   660

gtctgttcaa tcttgtgtgc gtgctatatt gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca   720

cagaggaagc agtagcaaca gtaagacaac actgccatct agtggaaaaa gaaaaaagtg   780

caacagagac atctagtgga caaaagaaaa atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg   840

gcagtcagaa ttttccagcg caacaacaag gaaatgcctg ggtacatgta cccttgtcac   900

cgcgcacctt aaatgcgtgg gtaaaagcag tagaggagaa aaaatttgga gcagaaatag   960

tacccatgtt tcaagcccta tc                                            982

<210>2

<211>614

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>2

cccgtttgtg ctagggttct taggcttctt gggggctgct ggaactgcaa tgggagcagc    60

ggcgacagcc ctgacggtcc agtctcagca tttgcttgct gggatactgc agcagcagaa   120

gaatctgctg gcggctgtgg aggctcaaca gcagatgttg aagctgacca tttggggtgt   180

taaaaacctc aatgcccgcg tcacagccct tgagaagtac ctagaggatc aggcacgact   240

aaactcctgg gggtgcgcat ggaaacaagt atgtcatacc acagtggagt ggccctggac   300

aaatcggact ccggattggc aaaatatgac ttggttggag tgggaaagac aaatagctga   360

tttggaaagc aacattacga gacaattagt gaaggctaga gaacaagagg aaaagaatct   420

agatgcctat cagaagttaa ctagttggtc agatttctgg tcttggttcg atttctcaaa   480

atggcttaac attttaaaaa tgggattttt agtaatagta ggaataatag ggttaagatt    540

actttacaca gtatatggat gtatagtgag ggttaggcag ggatatgttc ctctatctcc    600

acagatccat atcc                                                      614

<210>3

<211>185

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>3

gcacttttta aaagaaaagg gaggactgga tgggatttat tactccgata ggacgctggc     60

ttgtaactca gtctcttact aggagaccag cttgagcctg ggtgttcgct ggttagccta    120

acctggttgg ccaccagggg taaggactcc ttggcttaga aagctaataa acttgcctgc    180

attag                                                                185

<210>4

<211>125

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>4

caattttaaa agaaagggag gaataggggg acagacttca gcagagagac taattaatat     60

aataacaaca caattagaaa tacaacattt acaaaccaaa attcaaaaaa ttttaaattt    120

tagag                                                                125

<210>5

<211>591

<212>DNA

<213>土拨鼠肝炎病毒

<400>5

ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg      60

ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc     120

gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt     180

tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca     240

ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc     300

ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc     360

tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc     420

tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc     480

tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc     540

ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg c              591

<210>6

<211>255

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>6

atgcccctag gaccagaaga aagaagattc gttcgcttaa tttggctcct ttacagcacc     60

aatccatatc caccaagtgg ggaagggacg gccagacaac gccgacgagc caggagaagg    120

tggagacaac agcaggatca aattagagtc ttggtagaaa gactccaaga gcaggtgtat    180

gcagttgacc gcctggctga cgaggctcaa cacttggcta tacaacagtt gcctgaccct    240

cctcattcag cttag                                                     255

<210>7

<211>447

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>7

gttctgggat tacaggcatg agccacgcgc ccggccctgg agaggttttt aaaagatggc     60

agaaggctgt ttggaggagt ccacccccat ctcccctgtg taaaaggaaa gcggaagaga    120

gaaccacaaa gagggcctgg gggaaagccg tggagtgagg cgataagggc ttgtgtccag    180

gggattcccg gtcactggaa tccctatcag gcctgcattt cctcctcacc cccatcccct    240

tccttgccac tggcttagtc ctccatgggg ctagaagaga gaaggacgga gtcgagtggc    300

accctagaag acgctctgtg ccttcggagg tctttctgcc tgcctgtaag ccggggttgg    360

tgctggggca ggagaggggt ctgagggagg ggaaagagcc aaggacctgg agctagtagt    420

tttaagttct gcaggcaagg gtgggag                                        447

<210>8

<211>584

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>包含hFVIII之GPIba和5’UTR的人工启动子

<400>8

gttctgggat tacaggcatg agccacgcgc ccggccctgg agaggttttt aaaagatggc     60

agaaggctgt ttggaggagt ccacccccat ctcccctgtg taaaaggaaa gcggaagaga    120

gaaccacaaa gagggcctgg gggaaagccg tggagtgagg cgataagggc ttgtgtccag    180

gggattcccg gtcactggaa tccctatcag gcctgcattt cctcctcacc cccatcccct    240

tccttgccac tggcttagtc ctccatgggg ctagaagaga gaaggacgga gtcgagtggc    300

accctagaag acgctctgtg ccttcggagg tctttctgcc tgcctgtaag ccggggttgg    360

tgctggggca ggagaggggt ctgagggagg ggaaagagcc aaggacctgg agctagtagt    420

tttaagttct gcaggcaagg gtgggagatg ggagtaggga ggacaggagg tgtggatgct    480

gtttctggaa gcgaagctgc agggggaagg gggctggggc ctggggggat gcttccaggg    540

gatgcagggg gatccactca aggctccctt gcccacaggt cctc                     584

<210>9

<211>4374

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>9

atggaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc     60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc    120

ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac    180

acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc    240

gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat    300

gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt    360

ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg    420

gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg    480

aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat    540

gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa    600

gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta    660

tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat    720

gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct    780

ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc    840

accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat    900

cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg    960

gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa   1020

gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa   1080

gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat   1140

gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact   1200

tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc   1260

cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg   1320

aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct    1380

attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg    1440

ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact    1500

gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt    1560

ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca    1620

actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga    1680

gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa    1740

agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag    1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg    1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt    1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc    1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa    2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg    2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc    2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac    2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc    2280

ttctcccaga atccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt    2340

cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa    2400

gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca    2460

cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca    2520

catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc    2580

caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat    2640

ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc    2700

agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat    2760

cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac    2820

ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg    2880

gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt    2940

ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa    3000

tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg    3060

gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat    3120

tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct    3180

caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct    3240

attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg    3300

tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt    3360

tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg    3420

gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt    3480

cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat    3540

tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg    3600

ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc    3660

ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat    3720

cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata    3780

aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat    3840

tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc    3900

atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac    3960

tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg    4020

agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag    4080

aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg    4140

tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt    4200

cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac    4260

tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac    4320

cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta ctga          4374

<210>10

<211>1457

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>10

Met Glu Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1               5                   10                  15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

            20                  25                  30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

        35                  40                  45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

    50                  55                  60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65                  70                  75                  80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

                85                  90                  95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

            100                 105                 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

        115                 120                 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

    130                 135                 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145                 150                 155                 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

                165                 170                 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

            180                 185                 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

        195                 200                 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

    210                 215                 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225                 230                 235                 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

                245                 250                 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

            260                 265                 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

        275                 280                 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

    290                 295                 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305                 310                 315                 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

                325                 330                 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

            340                 345                 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

        355                 360                 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

    370                 375                 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385                 390                 395                 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

                405                 410                 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

            420                 425                 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

        435                 440                 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

    450                 455                 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465                 470                 475                 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

                485                 490                 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

            500                 505                 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

        515                 520                 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

    530                 535                 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545                 550                 555                 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

                565                 570                 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

            580                 585                 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

        595                 600                 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

    610                 615                 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625                 630                 635                 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

                645                 650                 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

            660                 665                 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

        675                 680                 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

    690                 695                 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705                 710                 715                 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

            725                 730                 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

            740                 745                 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

        755                 760                 765

Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln

    770                 775                 780

Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu

785                 790                 795                 800

Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe

                805                 810                 815

Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp

            820                 825                 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln

        835                 840                 845

Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

    850                 855                 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

865                 870                 875                 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile

                885                 890                 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

            900                 905                 910

Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

        915                 920                 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val

    930                 935                 940

Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp

945                 950                 955                 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu

                965                 970                 975

Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His

            980                 985                 990

Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe

        995                 1000                1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn

    1010                1015                1020

Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys

    1025                1030                1035

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr

    1040                1045                1050

Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr

    1055                1060                1065

Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe

    1070                1075                1080

Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met

    1085                1090                1095

Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met

    1100                1105                1110

Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly

    1115                1120                1125

Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser

    1130                1135                1140

Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg

    1145                1150                1155

Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro

    1160                1165                1170

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser

    1175                1180                1185

Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

    1190                1195                1200

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe

    1205                1210                1215

Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp

    1220                1225                1230

Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu

    1235                1240                1245

Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn

    1250                1255                1260

Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro

    1265                1270                1275

Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly

    1280                1285                1290

Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys

    1295                1300                1305

Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn

    1310                1315                1320

Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln

    1325                1330                1335

Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu

    1340                1345                1350

Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val

    1355                1360                1365

Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys

    1370                1375                1380

Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu

    1385                1390                1395

Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp

    1400                1405                1410

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr

    1415                1420                1425

Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

    1430                1435                1440

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

    1445                1450                1455

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>11

gctttcattt tctcctcctt                                              20

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>12

ggccacaact cctcataa                                                18

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工合成的探针序列

<400>13

atcctggttg ctgtctc                                                 17

<210>14

<211>10763

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>14

atacgactca ctatagggcg aattggagct ccaccgcggt ggcggccgct ctagatgcct     60

atcagaagtt aactagttgg tcagatttct ggtcttggtt cgatttctca aaatggctta    120

acattttaaa aatgggattt ttagtaatag taggaataat agggttaaga ttactttaca    180

cagtatatgg atgtatagtg agggttaggc agggatatgt tcctctatct ccacagatcc    240

atatccacca agtggggaag ggacggccag acaacgccga cgagccagga gaaggtggag    300

acaacagcag gatcaaatta gagtcttggt agaaagactc caagagcagg tgtatgcagt    360

tgaccgcctg gctgacgagg ctcaacactt ggctatacaa cagttgcctg accctcctca    420

ttcagcttag gaaagctttt caatacctgc aatatgggct cgcagaactc aaaaccggcg    480

cacaagaaat actccaaact ctggcaggcg ttgcacaaaa cgcatgtcac cagatatggc    540

ttgcttgcag atccgcttat aggaacatcg tcaacagtcc aagaagagtg cgacaaggcc    600

ttgaggaaat ccttaattag gaaacaaaat ggcaacatga cggaagaggg aaggaggctt    660

caagaaggag acacctggga agagtggtcg gatgatgagg aagaagtggg atttccagtg    720

agaccaagag tacccttaag gcaaatgact tataaacttg cagtggattt ttcgcacttt    780

ttaaaagaaa agggaggact ggatgggatt tattactccg ataggagaaa taagatcctg    840

aatctgtatg ctcttaatga atgggggata attgatgatt ggaatgcctg gtcgaaggga    900

ccaggaataa gattccctaa atgctttggg ttctgcttta agctagtgcc agtggactta    960

catgaggaag cacaaacatg tgaaagacat tgcctagtcc atccagcgca gatgggagaa   1020

gatccagatg gtatcagcca tggagagatc ttggtgtgga agtttgatcc tatgttggca   1080

atacagtacg accccaatcg ggagtacttt actgacatgc atgggctggt gaagaggaag    1140

tagccagacc gcaagcctgc ggttagaaca tcaccatgga gatgacatta aaaactgctg    1200

acgggacttt ccagcgaagg gactttccaa ggcgggacat gggcggtccg gggagtggct    1260

ttaccctcag aactgcataa aagcagatgc tcgctggctt gtaactcagt ctcttactag    1320

gagaccagct tgagcctggg tgttcgctgg ttagcctaac ctggttggcc accaggggta    1380

aggactcctt ggcttagaaa gctaataaac ttgcctgcat tagagcttat ctgagtcaag    1440

tgtcctcatt gacgcctcac tctcttgaac gggaatcttc cttactgggt tctctctctg    1500

acccaggcga gagaaactcc agcagtggcg cccgaacagg gacttgagtg agagtgtagg    1560

cacgtacagc tgagaaggcg tcggacgcga aggaagcgcg gggtgcgacg cgaccaagaa    1620

ggagacttgg tgagtaggct tctcgagtgc cgggaaaaag ctcgagccta gttagaggac    1680

taggagaggc cgtagccgta actactctgg gcaagtaggg caggcggtgg gtacgcaatg    1740

ggggcggcta cctcagcact aaataggaga caattagacc aatttgagaa aatacgactt    1800

cgcccgaacg gaaagaaaaa gtaccaaatt aaacatttaa tatgggcagg caaggagatg    1860

gagcgcttcg gcctccatga gaggttgttg gagacagagg aggggtgtaa aagaatcata    1920

gaagtcctct accccctaga accaacagga tcggagggct taaaaagtct gttcaatctt    1980

gtgtgcgtac tatattgctt gcacaaggaa cagaaagtga aagacacaga ggaagcagta    2040

gcaacagtaa gacaacactg ccatctagtg gaaaaagaaa aaagtgcaac agagacatct    2100

agtggacaaa agaaaaatga caagggaata gcagcgccac ctggtggcag tcagaatttt    2160

ccagcgcaac aacaaggaaa tgcctgggta catgtaccct tgtcaccgcg caccttaaat    2220

gcgtgggtaa aagcagtaga ggagaaaaaa tttggagcag aaatagtacc catgtttcaa    2280

gccctatcag aaggctgcac accctatgac attaatcaga tgcttaatgt gctaggagat    2340

catcaagggg cattacaaat agtgaaagag atcattaatg aagaagcagc ccagtgggat    2400

gtaacacacc cactacccgc aggaccccta ccagcaggac agctcaggga ccctcgcggc    2460

tcagatatag cagggaccac cagctcagta caagaacagt tagaatggat ctatactgct    2520

aacccccggg tagatgtagg tgccatctac cggagatgga ttattctagg acttcaaaag    2580

tgtgtcaaaa tgtacaaccc agtatcagtc ctagacatta ggcagggacc taaagagccc    2640

ttcaaggatt atgtggacag attttacaag gcaattagag cagaacaagc ctcaggggaa    2700

gtgaaacaat ggatgacaga atcattactc attcaaaatg ctaatccaga ttgtaaggtc    2760

atcctgaagg gcctaggaat gcaccccacc cttgaagaaa tgttaacggc ttgtcagggg    2820

gtaggaggcc caagctacaa agcaaaagta atggcagaaa tgatgcagac catgcaaaat    2880

caaaacatgg tgcagcaggg aggtccaaaa agacaaagac ccccactaag atgttataat    2940

tgtggaaaat ttggccatat gcaaagacaa tgtccggaac caaggaaaac aaaatgtcta    3000

aagtgtggaa aattgggaca cctagcaaaa gactgcaggg gacaggtgaa ttttttaggg    3060

tatggacggt ggatgggggc aaaaccgaga aattttcccg ccgctactct tggagcggaa    3120

ccgagtgcgc ctcctccacc gagcggcacc accccatacg acccagcaaa gaagctcctg    3180

cagcaatatg cagagaaagg gaaacaactg agggagcaaa agaggaatcc accggcaatg    3240

aatccggatt ggaccgaggg atattctttg aactccctct ttggagaaga ccaataaaga    3300

cagtgtatat agaaggggtc cccattaagg cactgctaga cacaggggca gatgacacca    3360

taattaaaga aaatgattta caattatcag gtccatggag acccaaaatt atagggggca    3420

taggaggagg ccttaatgta aaagaatata acgacaggga agtaaaaata gaagataaaa    3480

ttttgagagg aacaatattg ttaggagcaa ctcccattaa tataataggt agaaatttgc    3540

tggccccggc aggtgcccgg ttagtaatgg gacaattatc agaaaaaatt cctgtcacac    3600

ctgtcaaatt gaaggaaggg gctcggggac cctgtgtaag acaatggcct ctctctaaag    3660

agaagattga agctttacag gaaatatgtt cccaattaga gcaggaagga aaaatcagta    3720

gagtaggagg agaaaatgca tacaataccc caatattttg cataaagaag aaggacaaat    3780

cccagtggag gatgctagta gactttagag agttaaataa ggcaacccaa gatttctttg    3840

aagtgcaatt agggataccc cacccagcag gattaagaaa gatgagacag ataacagttt    3900

tagatgtagg agacgcctat tattccatac cattggatcc aaattttagg aaatatactg    3960

cttttactat tcccacagtg aataatcagg gacccgggat taggtatcaa ttcaactgtc    4020

tcccgcaagg gtggaaagga tctcctacaa tcttccaaaa tacagcagca tccattttgg    4080

aggagataaa aagaaacttg ccagcactaa ccattgtaca atacatggat gatttatggg    4140

taggttctca agaaaatgaa cacacccatg acaaattagt agaacagtta agaacaaaat    4200

tacaagcctg gggcttagaa accccagaaa agaaggtgca aaaagaacca ccttatgagt    4260

ggatgggata caaactttgg cctcacaaat gggaactaag cagaatacaa ctggaggaaa    4320

aagatgaatg gactgtcaat gacatccaga agttagttgg gaaactaaat tgggcagcac    4380

aattgtatcc aggtcttagg accaagaata tatgcaagtt aattagagga aagaaaaatc    4440

tgttagagct agtgacttgg acacctgagg cagaagctga atatgcagaa aatgcagaga    4500

ttcttaaaac agaacaggaa ggaacctatt acaaaccagg aatacctatt agggcagcag    4560

tacagaaatt ggaaggagga cagtggagtt accaattcaa acaagaagga caagtcttga    4620

aagtaggaaa atacaccaag caaaagaaca cccatacaaa tgaacttcgc acattagctg    4680

gtttagtgca gaagatttgc aaagaagctc tagttatttg ggggatatta ccagttctag    4740

aactcccgat agaaagagag gtatgggaac aatggtgggc ggattactgg caggtaagct    4800

ggattcccga atgggatttt gtcagcaccc cacctttgct caaactatgg tacacattaa    4860

caaaagaacc catacccaag gaggacgttt actatgtaga tggagcatgc aacagaaatt    4920

caaaagaagg aaaagcagga tacatctcac aatacggaaa acagagagta gaaacattag    4980

aaaacactac caatcagcaa gcagaattaa cagctataaa aatggctttg gaagacagtg    5040

ggcctaatgt gaacatagta acagactctc aatatgcaat gggaattttg acagcacaac    5100

ccacacaaag tgattcacca ttagtagagc aaattatagc cttaatgata caaaagcaac    5160

aaatatattt gcagtgggta ccagcacata aaggaatagg aggaaatgag gagatagata    5220

aattagtgag taaaggcatt agaagagttt tattcttaga aaaaatagaa gaagctcaag    5280

aagagcatga aagatatcat aataattgga aaaacctagc agatacatat gggcttccac    5340

aaatagtagc aaaagagata gtggccatgt gtccaaaatg tcagataaag ggagaaccag    5400

tgcatggaca agtggatgcc tcacctggaa catggcagat ggattgtact catctagaag    5460

gaaaagtagt catagttgcg gtccatgtag ccagtggatt catagaagca gaagtcatac    5520

ctagggaaac aggaaaagaa acggcaaagt ttctattaaa aatactgagt agatggccta    5580

taacacagtt acacacagac aatgggccta actttacctc ccaagaagtg gcagcaatat    5640

gttggtgggg aaaaattgaa catacaacag gtataccata taacccccaa tctcaaggat    5700

caatagaaag catgaacaaa caattaaaag agataattgg gaaaataaga gatgattgcc    5760

aatatacaga gacagcagta ctgatggctt gccatattca caattttaaa agaaagggag    5820

gaataggggg acagacttca gcagagagac taattaatat aataacaaca caattagaaa    5880

tacaacattt acaaaccaaa attcaaaaaa ttttaaattt tagagtctac tacagagaag    5940

ggagagaccc tgtgtggaaa ggaccagcac aattaatctg gaaaggggaa ggagcagtgg    6000

tcctcaagga cggaagtgac ctaaaggttg taccaagaag gaaagctaaa attattaagg    6060

attatgaacc caaacaaaga gtgggtaatg agggtgacgt ggaaggtacc aggggatctg    6120

ataactaaat ggcagggaat agtcagatat tggatgagac aaagaaattt gaaatggaac    6180

tattatatgc attaccaaat tacatgggct tggtacacca tgagtagata tgtaatacca    6240

ataggaaaac atggggaaat atgtgtagac ctatattggc atttaacacc agagcaagga    6300

tggctatcca catatgcagt aggtatacaa tatgtaagca atttagaatc taaatataga    6360

acagaattag accctgctac agcagatagt ataatacatg gtcactattt taattgtttt    6420

aaagaaagag ccatccaaca agctctgagg ggccacagat ttgtcttctg tcagtttcca    6480

gaagggcata aaagcacagg acaggtacca tctttgcagt acctagctct gctcgcacat    6540

caaaatggcc tcagggagag atccaagaga ggcaagacca ggagaagtag aaatttggga    6600

tctaagcagg gagccgtggg acgaatggct aagagatatg ttacaagatc tcaaccagga    6660

ggcgaggctg cattttggga gagaactcct gttccaagta tggaactact gtcaggagga    6720

aggagaaaga catggtactc ccatgatgga aagggcctac aaatattata ggctagtaca    6780

aaaggctctc tttgtgcatt ttcgatgtgg gtgcaggaga aggcagccct ttgaaccata    6840

cgaggagagg agagatggac aagggggagg cagagcaaat cgtgtcccac caggacttga    6900

gtgaagacta tcagaagcct ctgcagactt gtaaaaataa atgtttttgc aaaaaatgtt    6960

gttaccactg tcagctttgc tttctgcaaa aaggcctagg tgttacctat catgccccta    7020

ggaccagaag aaagaagatt gcttcgcttg atttggctcc tttacagcac cagtaagtat    7080

gaggtataca ataataacct taggaataat agtgatagga atagggatag tgttaagtaa    7140

gcaatggata acagtctttt atggaatacc agtatggaaa aacagctcgg tgcaggcttt    7200

ctgcatgact cccaccacaa gcttatgggc tactactaat tgcataccag atgatcatga    7260

ctatacagaa gtacctctaa atatcactga accatttgag gcatggggtg atagaaaccc    7320

attaatagca caagcagcca gtaacatcca tttactcttt gagcaaacta tgaaaccttg    7380

tgtgaagtta tcaccactat gcatcaagat gaattgtgta gagttaaatt ccacaagaga    7440

aagggcgaca acacctacaa cgacgccgaa atctaccggc ctaccctgtg taggcccgac    7500

gtcaggtgaa aatctacagt cctgtaatgc aagcattata gaaagggaga tggaggatga    7560

gcccgcctct aattgtacat tcgcaatggc tggctatgta agagatcaga agaaaaatta    7620

ttctgtggtg tggaatgatg cagaaatcta ttgcaaaaat aagactaata gcactagcaa    7680

agagtgttac atgattcatt gtaatgactc agttataaaa gaagcatgtg acaaaacata    7740

ttgggatcag ttgaggttaa ggtattgtgc tccagcaggt tatgctttgc taaaatgtaa    7800

tgatgaagat tataatgggt ataaacaaaa ttgctcaaat gtatcagtag tgcattgtac    7860

aggcttaatg aatacaacag tgacaacagg gttgttgctg aatggaagct atcatgagaa    7920

tcgaacccag atatggcaga aacatagggt aaataataac acagtattga tcttgttcaa    7980

caagcactat aatctatcag tcacctgtag gagaccagga aacaagacag tcctaccggt    8040

aacgataatg gcgggactgg ttttccactc tcaaaaatac aacatgaagc ttagacaggc    8100

ttggtgtcac ttcgaaggca attggagagg tgcctggcgg gaagtaaaac aaaaaatagt    8160

agagttacca aaagacaggt ataaaggaac caataataca gaacacatat acctgcaaag    8220

acaatgggga gacccagaag catccaactt gtggtttaat tgtcaaggag aattctttta    8280

ttgtaagatg gattggtttt taaattactt aaataataaa acatgggatg cagaccataa    8340

tttttgtagc agcaaaaaga aaggacacgc accaggacca tgtgtacaaa ggacgtatgt    8400

tgcttgccat atcaggtctg taataaatga ttggtatacc ctatcaaaga aaacttatgc    8460

tccgccaaga gaaggacatt tgcaatgcag gtccacagtc actgggatga cagttgagct    8520

taattataat agtaaaaaca gaaccaacgt gacactaagt ccccagatag aatctatctg    8580

ggcggctgaa ttgggcagat acaaattagt ggaaatcaca ccaattggct ttgcacccac    8640

agaagtaagg cgttatacgg gaggacatga gaggcaaaag agagtcccgt ttgtgctagg    8700

gttcttaggc ttcttggggg ctgctggaac tgcaatggga gcagcggcga cagccctgac    8760

ggtccagtct cagcatttgc ttgctgggat actgcagcag cagaagaatc tgctggcggc    8820

tgtggaggct caacagcaga tgttgaagct gaccatttgg ggtgttaaaa acctcaatgc    8880

ccgcgtcaca gcccttgaga agtacctaga ggatcaggca cgactaaact cctgggggtg    8940

cgcatggaaa caagtatgtc ataccacagt ggagtggccc tggacaaatc ggactccgga    9000

ttggcaaaat atgacttggt tggagtggga aagacaaata gctgatttgg aaagcaacat    9060

tacgagacaa ttagtgaagg ctagagaaca agaggaaaag aatctagatg cctatcagaa    9120

gttaactagt tggtcagatt tctggtcttg gttcgatttc tcaaaatggc ttaacatttt    9180

aaaaatggga tttttagtaa tagtaggaat aatagggtta agattacttt acacagtata    9240

tggatgtata gtgagggtta ggcagggata tgttcctcta tctccacaga tccatatcca    9300

ccaagtgggg aagggacggc cagacaacgc cgacgagcca ggagaaggtg gagacaacag    9360

caggatcaaa ttagagtctt ggtagaaaga ctccaagagc aggtgtatgc agttgaccgc    9420

ctggctgacg aggctcaaca cttggctata caacagttgc ctgaccctcc tcattcagct    9480

taggaaagct tttcaatacc tgcaatatgg gctcgcagaa ctcaaaaccg gcgcacaaga    9540

aatactccaa actctggcag gcgttgcaca aaacgcatgt caccagatat ggcttgcttg    9600

cagatccgct tataggaaca tcgtcaacag tccaagaaga gtgcgacaag gccttgagga    9660

aatccttaat taggaaacaa aatggcaaca tgacggaaga gggaaggagg cttcaagaag    9720

gagacacctg ggaagagtgg tcggatgatg aggaagaagt gggatttcca gtgagaccaa     9780

gagtaccctt aaggcaaatg acttataaac ttgcagtgga tttttcgcac tttttaaaag     9840

aaaagggagg actggatggg atttattact ccgataggag aaataagatc ctgaatctgt     9900

atgctcttaa tgaatggggg ataattgatg attggaatgc ctggtcgaag ggaccaggaa     9960

taagattccc taaatgcttt gggttctgct ttaagctagt gccagtggac ttacatgagg    10020

aagcacaaac atgtgaaaga cattgcctag tccatccagc gcagatggga gaagatccag    10080

atggtatcag ccatggagag atcttggtgt ggaagtttga tcctatgttg gcaatacagt    10140

acgaccccaa tcgggagtac tttactgaca tgcatgggct ggtgaagagg aagtagccag    10200

accgcaagcc tgcggttaga acatcaccat ggagatgaca ttaaaaactg ctgacgggac    10260

tttccagcga agggactttc caaggcggga catgggcggt ccggggagtg gctttaccct    10320

cagaactgca taaaagcaga tgctcgctgg cttgtaactc agtctcttac taggagacca    10380

gcttgagcct gggtgttcgc tggttagcct aacctggttg gccaccaggg gtaaggactc    10440

cttggcttag aaagctaata aacttgcctg cattagagct tatctgagtc aagtgtcctc    10500

attgacgcct cactctcttg aacgggaatc ttccttactg ggttctctct ctgacccagg    10560

cgagagaaac tccagcagtg gcgcccgaac agggacttga gtgagagtgt aggcacgtac    10620

agctgagaag gcgtcggacg cgaaggaagc gcggggtgcg acgcgaccaa gaaggagact    10680

tggtgagtag gcttctcgac ctcgaggggg ggcccggtac cagcttttgt tccctttagt    10740

gagggttaat ttcgagcttg gcg                                            10763

Claims (19)

1.一种以慢病毒载体为有效成分的血液凝固异常治疗剂，所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性的结合于该启动子。

2.权利要求1的治疗剂，其中所述启动子是GPIb启动子或其变体。

3.权利要求2的治疗剂，其中所述编码凝血因子的多核苷酸由5′UTR介导结合于上述启动子。

4.权利要求1的治疗剂，其中所述血液凝固异常为血友病A，凝血因子为第VIII因子或其突变体。

5.权利要求1的治疗剂，其中所述血液凝固异常为血友病B，凝血因子为第IX因子或其突变体。

6.权利要求1的治疗剂，其中所述血液凝固异常为血友病A或血友病B中之一的疾病，凝血因子为第VII因子或其突变体。

7.权利要求1的治疗剂，其中所述慢病毒载体为猴免疫缺陷病毒载体。

8.权利要求1的治疗剂，其中所述慢病毒载体是选自马传染性贫血病毒载体，人免疫缺陷病毒1型载体，人免疫缺陷病毒2型载体，猫免疫缺陷病毒载体，牛发热性疾病病毒载体以及山羊关节炎/脑炎病毒载体中的载体之一。

9.一种感染了慢病毒载体的造血干细胞，其中所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该凝血因子功能性的结合于该启动子。

10.感染了慢病毒载体的巨核细胞和/或其衍生的血小板，其中所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性的结合于该启动子。

11.蓄积了凝血因子的巨核细胞和/或血小板的制备方法，该方法包括下述步骤：将慢病毒载体感染到造血干细胞的感染步骤，所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性的结合于该启动子；和培养感染了慢病毒载体的造血干细胞直至其分化成含有巨核细胞和/或其衍生的血小板的细胞群的步骤。

12.血液凝固异常的治疗方法，其包括以下步骤：

(a)将慢病毒载体感染到造血干细胞的步骤，其中所述慢病毒载体包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性的结合于该启动子；

(b)将(a)的造血干细胞给药到血液凝固异常患者的步骤。

13.权利要求12的方法，其中所述造血干细胞包含采集自患者的造血干细胞。

14.权利要求13的方法，其中所述造血干细胞是包含骨髓干细胞和末梢血造血干细胞中的一种或两种在内的细胞。

15.权利要求12的方法，其中将步骤(a)的造血干细胞培养后给药到患者。

16.一种包含如下组分的血液凝固异常治疗试剂盒：

a：包含编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子的慢病毒载体，该编码凝血因子的多核苷酸功能性的结合于该启动子；

b：采集造血干细胞的试剂。

17.权利要求16的血液凝固异常治疗试剂盒，还包含如下组分c：用于诱导造血干细胞分化成巨核细胞的培养基。

18.权利要求17的血液凝固异常治疗试剂盒，其中所述用以诱导造血干细胞分化成巨核细胞的培养基至少包含以下成分：

转铁蛋白；

胰岛素；

干细胞因子；

血小板生成素；

白细胞介素-6；

Flt-3配体；及可溶性白细胞介素-6受体。

19.慢病毒载体用于制备血液凝固异常治疗剂的用途，该慢病毒载体包含有编码凝血因子的多核苷酸以及对巨核细胞和/或其衍生的血小板特异性的启动子，该编码凝血因子的多核苷酸功能性的结合于该启动子。

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