CN1630666A - 因子ⅷc2结构域变体 - Google Patents

因子ⅷc2结构域变体 Download PDF

Info

Publication number
CN1630666A
CN1630666A CNA028238451A CN02823845A CN1630666A CN 1630666 A CN1630666 A CN 1630666A CN A028238451 A CNA028238451 A CN A028238451A CN 02823845 A CN02823845 A CN 02823845A CN 1630666 A CN1630666 A CN 1630666A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
leu
glu
ala
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA028238451A
Other languages
English (en)
Inventor
J·S·劳拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AMORY UNIV
Emory University
Original Assignee
AMORY UNIV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AMORY UNIV filed Critical AMORY UNIV
Publication of CN1630666A publication Critical patent/CN1630666A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

血友病患者用因子VIII治疗后，人因子VIII的特定氨基酸座位与患者的抑制抗体相互作用。揭示的修饰因子VIII中的氨基酸序列通过在一个或多个特定氨基酸座位取代来改变。修饰因子VIII对血友病患者有效，它以避免或防止抑制抗体的作用。

Description

因子VIII C2结构域变体
                       参照相关专利申请
本申请要求提交于2001年11月30日的美国临时专利申请No.60/334,569的优先权。
                       联邦研究支持的说明
本发明，至少部分，是用国立卫生院的基金(合同号FO1-HL46215)完成的。因此，美国政府对本发明具有一定权利。
                          发明领域
本发明一般涉及包含氨基酸取代的修饰的哺乳动物因子VIII，与获得它们的蛋白质或其它因子VIII制品，如人因子VIII相比，所述氨基酸取代降低了其免疫原性和/或抗原性。
                          发明背景
当血小板附于损伤位置的受损血管切口时，血液凝固开始。随后，在酶调节的级联反应中，可溶纤维蛋白原分子被凝血酶转化成纤维蛋白的不溶链，使血小板在血栓中保持一起。在级联反应各步，蛋白质前体转化成蛋白酶，裂解此系列中的下一个蛋白质。大部分步骤需要辅因子。
因子VIII作为血液中失活前体循环，紧密且非共价结合冯维勒因子。因子VIII由凝血酶或因子Xa蛋白分解活化，使它与冯维勒因子分离并活化它在级联中的促凝血功能。活性形式的蛋白因子VIII是一种辅因子，使因子IXa对因子X活化的催化效率增加几个数量级。
因子VIII或抗因子VIII抗体有缺陷的人不用因子VIII治疗不能控制内出血，内出血会引起多种严重症状，从关节炎症反应到早期死亡。美国约有10,000个严重血友病患者，他们可通过灌输人因子VIII来治疗，如果以足够频率和浓度施用人因子VIII能恢复血液正常的凝固能力。因子VIII的经典定义是正常血浆中存在的物质，修正血友病A个体血浆中的凝固缺陷。
抑制因子VIII活性的抗体(“抑制剂”或“抑制抗体”)的发展是治疗血友病患者中的一个严重并发症。约20％血友病A患者中自身抗体应答因子VIII的治疗灌输而发生。在前面发展抗体的未治疗血友病A患者中，抑制剂通常在治疗一年内发生。此外，使因子VIII失活的自身抗体偶尔在前面具正常因子VIII水平的个体中发展。因子VIII(fVIII)的抑制抗体(抑制剂)可在接受因子VIII灌输的血友病A患者中作为同种抗体发展，或在非血友病患者中作为自身抗体发展[Hoyer，L.W.和D.Scandella(1994)Semin.Hematol.31：1-5]。A1-A2-B-ap-A3-C1-C2 fVIII分子中的A2、ap-A3和C2结构域抗原表位的抗体在大部分抑制剂血浆中产生抗凝血作用[Prescott，R.等，(1997)Blood 89：3633-3671；Barrow，R.T.等，(2000)Blood 95：557-561]。18-kDa C2结构域定义为单链人因子VIII中的丝氨酸2173-酪氨酸2332残基，包含因子VIII正常促凝血功能必需的磷脂膜结合位点。特异于C2结构域的人抗因子VIII抗体抑制此相互作用[Arai，M.等，(1989)J.Clin.Invest.83：1978-1984]。与此一致的是，磷脂保护因子VIII不被因子VIII抑制剂失活[Arai，M.等，同上；Barrowcliffe，T.W.等，(1983)J.Lab.Clin.Med.101：34-43]。C2结构域也包含部分冯维勒因子(vWf)结合位点[Saenko，E.L.等，(1994)J.Biol.Chem.269：11601-11605；Saenko，E.L.和Scandella，D.(1997)J.Biol.Chem.272：18007-18014]。一些抑制剂可通过干扰此相互作用来见效[Shima，M.等，(1995)Br.J.Haematol.91：714-721；Saenko，E.L.等，(1994)J.Biol.Chem.271：27424-27431；Gilles，J.G.等，(1999)Thromb.Haemost.82：40-45]。
倘若抑制剂效价足够低，治疗血友病A患者可通过增加因子VIII的剂量。然而，通常抑制剂效价高到不能通过施用因子VIII克服。另一种策略是绕过正常止血中对因子VIII的需要，使用因子IX复合制品(例如KONYNE，Proplex)或重组人因子VIIIa。此外，由于猪因子VIII与抑制剂的反应性通常显著低于人因子VIII，使用部分纯化的猪因子VIII制品(HYATE：C)。许多发展人因子VIII抑制抗体的病人成功地用猪因子VIII治疗且长时间耐受这种治疗。然而，施用猪因子VIII还不是完善的方法，因为一次或多次灌输后抑制剂可对猪因子VIII发展。
一些获自人血浆的因子VIII不同纯度制品可商业购买用于治疗血友病A。这些包括获自许多供体收集血液的部分纯化因子VIII，用热和去垢剂处理病毒但含显著水平的抗原性蛋白质；单克隆抗体-纯化因子VIII，具较低水平的抗原性杂质和病毒感染；以及正在进行临床试验的重组人因子VIII。不幸的是，人因子VIII在生理浓度和pH不稳定，在血液中存在浓度非常低(0.2μg/ml血浆)，特异凝固活性低。
血友病患者需要每天更新因子VIII以防止出血和导致变形性血友病关节病。然而，供给不足和治疗使用中出现的问题是由于分离和纯化中的困难、免疫原性和被病毒(如HIV、肝炎病毒等)感染的风险造成的。使用重组人因子VIII或部分纯化的猪因子VIII不能解决所有问题。
与普遍使用、商业购买、获自血浆的因子VIII相关的问题引起发展更好因子VIII产品的巨大兴趣。需要具更特异活性的因子VIII分子从而适当凝固活性可以较小剂量传送；在所选pH和生理浓度稳定的因子VIII分子；免疫原性较小的因子VIII分子；在已发展出人因子VIII抗体的病人中不被抑制的因子VIII分子。
Lollar的美国专利6,180,371描述了人因子VIII A2结构域中的氨基酸取代，取代改变所得因子VIII分子的抗原性。Lollar的美国专利5,859,204揭示了人因子VIII 484-509区域中的氨基酸位点特异取代。更具体的是，所述’204专利教授了修饰因子VIII相对人蛋白质在位置485、487、488、489、492、501或508发生氨基酸取代。Lollar等的美国专利5,888,974揭示了杂合促凝血因子VIII，通过分离和重组人与其它非人因子VIII亚基或结构域来产生。Lollar等的美国专利5,663,060描述了杂合因子VIII，具有非人和人的重及轻链亚基的组合。美国专利5,583,209描述了编码’060专利中杂合因子VIII分子的核酸。美国专利5,364,771描述了纯化的杂合因子VIII，由人和猪的重及轻链亚基组合形成。同样揭示了人因子VIII，其中猪A2结构域取代人A2结构域。
美国专利6,180,371；5,888,974；5,859,204；5,744,446；5,663,060；5,583,209和5,364,771(所有纳入本文供参考)没有揭示因子VIII C2结构域中的取代或提出特异氨基酸取代，取代会导致抗原性或免疫原性低于野生型因子VIII或相应重组因子VIII。
因此，本发明的一个目的是提供修正患者血友病的修饰因子VIII，患者缺乏因子VIII或具有因子VIII C2结构域的抑制抗体。
本发明的进一步目的是提供治疗血友病的方法。
本发明的另一个目的是提供在所选pH和生理浓度稳定的因子VIII。
本发明的又一个目的是提供凝血活性高于人因子VIII的因子VIII。
                         发明概述
本发明一般涉及重组修饰因子VIII。本发明的组合物提供分离、纯化的重组修饰因子VIII分子，分子具凝血活性，其中重组因子VIII在C2结构域有氨基酸取代使抗原性低于正常人因子VIII或其它具正常人因子VIII C2结构域的因子VIII。以提供编码本发明的组合物的DNA序列以及产生修饰因子VIII的方法。治疗需要因子VIII处理的病人的方法也在本发明范围内。
发明的第一个实施方案提供的组合物含C2结构域有氨基酸取代的哺乳动物因子VIII。修饰重组因子VIII C2结构域中的氨基酸取代使抑制抗体抗凝血活性低于正常人因子VIII或其它具正常人因子VIII C2结构域的因子VIII。此实施方案的组合物有凝血活性且减少与定向抗C2结构域的抑制抗体的结合。
在此实施方案的一个方面，组合物涉及C2结构域有至少一个氨基酸取代的重组哺乳动物因子VIII，取代位置对应于人因子VIII的R2215、W2313、R2220、R2320、Y2195、F2196和F2290。此实施方案的组合物可以是单突变、双突变、三突变或其它多突变。发明的氨基酸取代例子包括但不限于R2215A、R2215K、W2313A、W2313F、R2220A、R2220K、R2320A、R2320K、Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、F2290S和F2290A，它们都涉及人因子VIII编号系统，其中氨基酸1号是成熟因子VIII的氨基末端丙氨酸。优选重组猪或人因子VIII中的取代。优选的氨基酸取代包括降低免疫反应性的取代。优选在位置2220、2196和2215取代。
发明的第二个实施方案提供新的杂合因子VIII组合物，含C2结构域有氨基酸取代的重组因子VIII。此实施方案的新组合物通过制备C2结构域有氨基酸取代的杂合因子VIII来构建。因子VIII的其它结构域可获自多种哺乳动物如人、小鼠、猪、大鼠和犬等。此实施方案的新组合物有凝血活性且减少与抑制抗体的结合。发明的氨基酸取代例子包括但不限于R2215A、R2215K、W2313A、W2313F、R2220A、R2220K、R2320A、R2320K、Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、F2290S和F2290A，它们都涉及人因子VIII编号系统，其中氨基酸1号是成熟因子VIII的氨基末端丙氨酸。优选重组猪或人因子VIII中的取代。优选的氨基酸取代包括降低免疫反应性的取代。优选在位置2220、2196和2215取代。
发明的另一个实施方案提供DNA序列，包括本发明新组合物的编码序列。发明的又一个实施方案提供产生发明新组合物的方法。
发明也提供降低因子VIII分子免疫原性的方法以及通过此方法生成的免疫原性减少的重组因子VIII。具体的是，描述了修饰重组因子VIII分子和产生这些免疫原性减少的分子的方法，免疫原性减少的分子在C2结构域有取代。
还提供了了治疗因子VIII缺陷病人的药物组合物和方法，包括施用重组修饰因子VIII和其杂合物。
                             附图简述
图1A-1H一起提供了人、猪和小鼠因子VIII氨基酸序列的序列比对。
                             发明详述
本发明一般涉及重组修饰因子VIII。本发明的组合物提供了具有凝血活性的分离、纯化的重组修饰因子VIII分子。发现因子VIII C2结构域中的突变使突变体抑制抗体的结合低于正常人因子VIII或具有正常人因子VIII C2结构域的因子VIII，突变已用最近获得的x-射线结构鉴定。因此，本发明的组合物提供了在C2结构域有氨基酸取代的重组因子VIII，这种取代使其抗原性低于正常人因子VIII或具正常人因子VIII C2结构域的因子VIII。此外，本发明还提供了在C2结构域有氨基酸取代的重组因子VIII，这种取代使其抗原性低于其它可获得的因子VIII制品。本发明还提供了在C2结构域有降低免疫原性的氨基酸取代的重组因子VIII。发明的相关实施方案提供了治疗需要因子VIII处理的病人的方法、制造本发明的新重组因子VIII组合物的方法、编码新重组因子VIII蛋白质的DNA序列、以及包含新因子VIII蛋白质的药物组合物。
本发明进一步提供活性重组杂合因子VIII分子或其片断、编码这些杂合物的核酸序列、制备和分离它们的方法以及确定它们特征的方法。这些杂合物可以是人/动物、动物/动物、猪/人或其它这类杂合因子VIII分子，且进一步具有至少一个C2结构域的特异氨基酸序列，包括一类因子VIII的一个或多个独特氨基酸用于取代其它类因子VIII的对应氨基酸序列(或氨基酸)；或具有至少一种C2结构域的序列，包括与因子VIII没有已知序列同一性的一个或多个氨基酸，因子VIII取代人、动物、猪或杂合因子VIII中的特异氨基酸序列。所得重组杂合因子VIII与获得该因子的蛋白质相比，对因子VIII抑制抗体的免疫反应性降低或消失。
如本文所用，“对应的”核酸或氨基酸或两者的序列存在于因子VIII分子或其片断的位点中，结构和/或功能与其它种类因子VIII分子的位点相同，尽管核酸或氨基酸数量可能不同。“对应于”另一种类因子VIII序列的DNA序列完全对应此序列并在严紧条件下与指定的SEQ ID NO.序列杂合。“对应于”另一种因子VIII序列的DNA序列也包括一种序列，此序列使VIII或其片断表达，且如果不是因为遗传密码的简并性会与指定的SEQ ID NO.序列杂合。
“独特”氨基酸残基或序列在这里指一个种类因子VIII分子中的氨基酸序列或残基，它与另一种类因子VIII序列分子中的同源残基或序列不同。
“特异活性”在这里是指会修正人因子VIII缺乏血浆的凝固缺陷的活性。特异活性在标准测定中以凝固活性单位每毫克总因子VIII蛋白质测量，其中人因子VIII缺乏血浆的凝固时间与正常人血浆相比较。一个单位的因子VIII活性是一毫升正常人血浆中存在的活性。在测定中，凝固形成时间越短，所测因子VIII活性活性越高。猪因子VIII在人因子VIII测定中具有凝固活性。
“表达”指使用遗传信息生成产物时发生的一系列过程。编码猪因子VIII氨基酸序列的DNA可在哺乳动物宿主细胞中“表达”以产生猪因子VIII蛋白质。物质、遗传结构、宿主细胞和可表达特定DNA序列的条件在本领域熟知且可操作用于影响表达的时间和量以及表达蛋白质的胞内或胞外位置。例如，通过在编码猪因子VIII的DNA 5’末端(5’末端习惯指编码蛋白质NH2末端的终端)包含编码信号肽的DNA，表达蛋白质从宿主细胞内部运输到培养基中。信号肽编码DNA结合猪因子VIII编码DNA具有优势，因为表达因子VIII输出到培养基中使纯化过程简化。优选信号肽是哺乳动物因子VIII信号肽。
因子VIII作为约300kDa的单链肽合成，内部序列同源定义“结构域”序列NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。如本文所用，因子VIII分子中的“结构域”是连续氨基酸序列，由内部氨基酸序列同一性和凝血酶蛋白裂解位点定义。除非另有说明，当序列与人氨基酸残基序列排列时，因子VIII结构域包括下列氨基酸残基序列：A1，残基Ala1-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；B，残基Ser741-Arg1648；A3，残基Ser1690-Ile2032；C1，残基Arg2033-Asn2172；C2，残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括残基Ser1690-Tyr2332。剩余部分是残基谷氨酸1649-精氨酸1689，通常称为因子VIII轻链活化肽。因子VIII被凝血酶或因子Xa蛋白裂解活化，使它与冯维勒因子分离并形成具促凝血功能的因子VIIIa。因子VIIIa的生物功能是使因子IXa对因子X活化的催化效率增加几个数量级。凝血酶活化的因子VIIIa是160kDa A1/A2/A3-C1-C2异三聚物，在血小板或单核细胞表面与因子IXa和因子X形成复合体。如本文所用，“部分结构域”是形成部分结构域的连续氨基酸序列。
如本文所用，人或动物因子VIII的“亚基”是蛋白质的重和轻链。因子VIII的重链包含三个结构域A1、A2和B。因子VIII的轻链也包含三个结构域A3、C1和C2。
术语“抗原表位”、“抗原位置”和“抗原决定簇”在这里可同义使用，并定义为被抗体特异识别的人或动物因子VIII部分或其片断。它可由任意数量氨基酸残基组成，它可取决于蛋白质一级、二级或三级结构。
术语“免疫原性位置”在这里定义为人或动物因子VIII区域或其片断，特异引起人或动物中因子VIII或片断的生成，通过常规操作测量例如免疫测定，如本文所述的ELISA或Bethesda测定。它可由任意数量氨基酸残基组成，它可取决于蛋白质一级、二级或三级结构。在一些实施方案中，杂合或杂合等价的因子VIII或其片断在动物或人中没有免疫原性或免疫原性低于人或猪因子VIII。
如本文所用，“因子VIII缺乏”包括凝固活性缺乏，由缺陷因子VIII生成、不适当或没有生成因子VIII、抑制剂部分或完全抑制因子VIII来引起。血友病A是因子VIII缺乏类型，来自X-相连基因缺陷和其编码的因子VIII蛋白质缺失或不足。
“诊断测定”在这里包括以一些方式使用抗原-抗体相互作用来检测和/或定量测试样品中存在的具体分子量以选择医学治疗。本领域技术人员已知许多这类的测定。如本文所用，人、猪或修饰猪因子VIII DNA或其片断和其表达蛋白质可全部或部分取代其它已知测定中的相应试剂，其中修饰测定可用于检测和/或定量因子VIII抗体。使用这些试剂即因子VIII DNA或其片断和其表达蛋白质可修改已知测定用于检测人或动物因子VIII的抗体。这些测定包括但不限于ELISA、免疫扩散测定和免疫印迹。本领域技术人员已知使用这些测定的适当方法。如本文所用，包括至少一个蛋白质抗原表位的因子VIII或其片断可用作诊断试剂。其它可使用人、猪或修饰猪因子VIII或其片断的测定例子包括Bethesda测定和抗凝血测定。
术语“编码蛋白质如猪因子VIII的DNA”指一种聚脱氧核糖核酸，其核苷序列包含宿主细胞编码信息，根据已知遗传密码关系用于蛋白质氨基酸如猪因子VIII。
编码人或动物因子VIII或修饰因子VIII的DNA的“表达产物”获自适当宿主细胞中参考蛋白质的表达，包含特征如参考DNA编码蛋白质的翻译前或后修饰，包括但不限于糖基化、蛋白裂解等。在本领域中已知这些修饰可发生且取决于宿主细胞类型和其它因素而有所不同，可产生保持促凝血活性的产物分子同工型。参见例如Lind，P.等，Eur.J.Biochem，232：1927(1995)，纳入本文供参考。
“表达载体”是一种DNA元件，通常为环状结构，能在所需宿主细胞中自动复制或整合到宿主细胞基因组，且也具有一些熟知的特征可表达在适当位点和以适当方向插入载体序列的编码DNA。这些特征可包括但不限于一个或多个启动子序列，用于指导编码DNA和其它DNA元件的转录起始，如增强子、多腺苷酸位点等，所有这些在本领域熟知。因此，例如缺乏启动子的载体可通过插入结合编码DNA的启动子成为表达载体。
“免疫原性降低”在本文定义为促进抗体-抗原对结合能量的氨基酸。已知免疫原性降低的一些氨基酸非限制性例子包括丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、丝氨酸和甘氨酸。要理解的是通过特定抗体-抗原对中特定取代获得的免疫原性降低也可由除了上述所列之外的氨基酸取代产生，只要它们影响蛋白质构象、抗原表位可达性等。
减少抑制抗体结合的因子VIII突变的发现
因子VIII C2结构域由氨基酸残基2173-2332组成，包含血友病A或获得性血友病患者中主要的抗原位点或用于大部分抑制抗体的位点。这些抗体的抑制作用主要由于对因子VIII结合促凝血磷脂膜的抑制。人因子VIII C2结构域的X-射线结构显示一个假定的疏水性磷脂膜-结合位点，由含M2199/F2200和L2251/L2252的环组成[Barrow，R.T.等，(2000)Blood 97：169-174]。当这些环被同源猪、鼠或犬残基取代时观察到抗原性降低，由此判断它们参与结合抑制性抗C2抗体。鉴定另外的抗原残基是通过突变膜结合位点周围的7个表面暴露位点来产生下列构建：Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、R2215K、R2215A、R2220K、R2220A、F2290S、F2290A、W2313F、W2313A、R2320K和R2320A。突变体在幼仓鼠肾细胞中表达。W2313A和R2320K产生低水平表达且没有进一步评估。为促进筛选这些突变体，用重组人/猪因子VIII分子HP20测试44种患者抑制剂血浆的C2特异性，HP20包含取代相应人结构域的猪C2结构域。11种血浆对HP20的交叉反应性与或几乎与无重组B结构域的猪因子VIII一样低，说明它们是C2-特异的。这些血浆中的8种关于C2突变体评估，使用Bethesda测定。对于2种抑制剂血浆(DR和JF)，R2215、R2220和F2196的突变产生的抗原性低于野生型因子VIII，但W2313、R2320、F2290或Y2195不是。剩余6种抑制剂血浆没有证明Bethesda滴读对任何突变体降低，表明它们不识别氨基酸R2215、R2220、F2196、W2313、R2320、F2290或Y2195。
总之，残基R2215、R2220和F2196有助于因子VIII结合抑制抗体。数据证明膜结合环外的氨基酸残基可促进抗体结合。本文所示数据说明通过特异于因子VIII C2结构域的抑制抗体，在这些残基中的免疫原性降低氨基酸取代可减少抑制。膜结合环外的免疫原性降低氨基酸取代如位置2199、2220、2251和2252可预期进一步减少抑制一些与C2结构域反应的抑制抗体，膜结合环中具有类似的取代。
通过上述剪接-重叠延伸突变[Lubin，I.M.，等(1997)J.Bio.chem.272：30191-30195]突变在名为HSQ的人因子VIII无B结构域形式中进行[Lind，P.K.等(1995)，Eur.J.Biochem，232：19-27]。进行下列具对应核苷变化的突变：
R2215A                AGG到GCC
R2215K                AGG到AAG
W2313A                TGG到GCC
W2313F                TGG到TTC
R2220A                AGA到GCC
R2220K                AGA到AAG
R2320A                AGG到GCC
R2320K                AGG到AAG
Y2195H                TAC到CAC
Y2195A                TAC到GCC
F2196L                TTT到CTG
F2196A                TTT到GCC
F2290S                TTC到TCT
F2290A                TTC到GCT
                          方法的概述
美国专利5,364,771描述了发现具凝血活性的杂合人/猪因子VIII分子，其中人或猪的因子VIII分子元件取代其它种类因子VIII分子的相应元件。美国专利5,663,060描述了促凝血杂合人/动物和杂合等价因子VIII分子，其中一个种类的因子VIII分子元件取代其它种类因子VIII分子的相应元件。
尽管目前的信息表明B结构域没有抑制抗原表位且对因子VIII功能没有已知效果，在一些实施方案中，B结构域在活性杂合或杂合等价因子VIII分子或其片断(“B(-)因子VIII”)中全部或部分缺失，VIII分子或其片段用本文所述的任何方法制备。
人因子VIII基因在哺乳动物细胞中分离和表达，如报导于Toole，J.J.等，(1984)Nature 312：342-347(Genetics Institute)；Gischier，J.等，(1984)Nature312：326-330(Genetech)；Wood，W.I.等，(1984)Nature 312：330-337(Genetech)；Vehar，G.A.等，(1984)Nature 312：337-342(Genetech)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；美国专利号4,757,006，氨基酸序列推断自cDNA。Capon等的美国专利号4,965,199揭示了重组DNA方法，用于在哺乳动物细胞中生成因子VIII并纯化人因子VIII。报导了CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHKC(幼仓鼠肾细胞)中表达的人因子VIII。人因子VIII被修饰以缺失部分或所有B结构域(美国专利号4,868,112)，并尝试用人因子V的B结构域取代人因子VIII的B结构域(美国专利号5,004,803)。
猪因子VIII从血浆中分离[Fass，D.N.等，(1982)Blood 59：594]。Church等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6934描述了猪因子VIII的部分氨基酸序列对应于N-末端轻链序列部分，此序列与血浆铜蓝蛋白和凝固因子V同源。Toole，J.J.等(1984)Nature 312：342-347描述了4个猪因子VIII氨基酸片断的N-末端部分测序，但没有确定片断在因子VIII分子中位置的特征。猪因子VIII的B和部分A2结构域氨基酸序列报导于Ioole，J.J.等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5939-5942。1994年11月15日出版的名为“杂合人/猪因子VIII”的美国专利5,364,771和1993年10月14日出版的WO 93/20093中所述cDNA序列编码猪因子VIII完整A2结构域和预测的氨基酸序列和杂合人/猪因子VIII，杂合人/猪因子VIII具有全部结构域、全部亚基和特异氨基酸序列的取代。编码猪因子VIII A2结构域的cDNA序列对应于成熟人因子VIII的残基373-740。更近的是，1994年5月26日出版的WO 94/11503报导了猪因子VIII部分A1结构域和A2结构域的核苷和对应氨基酸序列，A1结构域缺乏前198个氨基酸。编码猪因子VIII的完整核苷序列包括完整A1结构域、活化肽、A3、C1和C2结构域，以及编码的氨基酸序列最终由Lollar获得，如1999年1月12日出版的美国专利5,859,204和1997年12月31日出版的WO 97/49725所示，两者都纳入本文供参考。
猪和人因子VIII作为两个亚基蛋白质从血浆中分离。称为重链和轻链的亚基通过非共价键结合一起，需要钙或其它二价金属离子。因子VIII的重链包含三个共价连接的结构域A1、A2和B。因子VIII的轻链也包含三个结构域，名为A3、C1和C2。B结构域没有已知的生物功能，可通过蛋白裂解或重组DNA技术方法从分子中去除或部分去除，因子VIII任何可测量参数没有显著改变。人重组因子VIII的结构和功能类似来自血浆的因子VIII，尽管它没有糖基化，除非在哺乳动物中表达。
由于A1和A2结构域间的重链裂解，人和猪的活化因子VIII(“因子VIIIa”)具有三个亚基。此结构称为A1/A2/A3-C1-C2。人因子VIIIa在稳定猪因子VIIIa的条件下不稳定，大概是因为人因子VIIIa A2亚基的弱结合。人和猪因子VIIIa的A2亚基分离与因子VIIIa分子的活性损失相关。Yakhyaev，A.等(1982)Blood90：增补本1，摘要#126报导了通过低密度脂蛋白受体-相关蛋白来结合A2结构域，表明这种结合调节的A2细胞吸收用于下调因子VIII活性。
“无B结构域因子VIII”的表达通过包含B结构域部分来增加。包含名为“SQ”[lind，P.等(1995)]的B结构域部分被报导产生良好表达。“SQ”构建缺乏所有人B结构域，除了B结构域N-末端的5个氨基酸和B结构域C-末端的9个氨基酸。POL1212构建指编码猪因子VIII的cDNA，此猪因子VIII缺乏大部分B结构域但含编码A2和ap结构域间24个氨基酸接头的DNA序列，如2000年3月10日提交的USSN 09/523,656所示，它全部纳入本文供参考。
纯化的修饰因子VIII或其片断可通过标准分析测定免疫反应性和凝固活性，包括例如无血浆的因子VIII测定、一阶段的凝固测定、使用纯化重组人因子VIII作为标准的酶联免疫吸收测定。
其它载体包括质粒和真核病毒载体，可用于在真核细胞中表达重组基因构建，这取决于技术人员的偏向和判断[参见例如，《分子克隆》(Molecular Cloning)第16章，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，NY，NY]。其它载体和表达系统包括细菌、酵母和昆虫细胞系统，由于糖基化不同或缺乏，可使用但不优选。
重组因子VIII蛋白质可在多种细胞中表达，这些细胞常用于培养和重组哺乳动物蛋白质的表达。具体的是，发现一些啮齿动物细胞系是表达大蛋白的特别有用宿主。优选细胞系来自美国模式培养物保藏所，Rockville，MD，包括幼仓鼠肾细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，它们用常规过程和培养基培养。
更高的猪因子VIII凝固活性基础是人A2亚基与人因子VIIIa的自发分离快于猪A2亚基与猪因子VIIIa的分离。A2亚基解离导致活性损失[Lollar，P.等(1990)J.Bio.Chem. 265：1688-1692；Lollar，P.等(1992)J.Bio.Chem. 267：23652-23657；Fay，P.J.等(1992)J.Bio.Chem. 267：13246-13250]。
免疫反应性降低的因子VIII分子
与抑制因子VIII凝固活性的抗体(“抑制剂”或“抑制抗体”)免疫反应的抗原表位在因子VIII的已知结构-功能关系基础上确定特征。推测抑制剂作用可通过破坏与因子VIII结构域结构相关的任何大分子相互作用或它与冯维勒因子、凝血酶、因子Xa、因子Ixa或因子X的联合。然而，大部分人因子VIII的抑制抗体作用是通过结合位于因子VIII的40kDa A2结构域或20kDa C2结构域中的抗原表位、破坏与这些结构域相关的特异功能，描述于Fulcher等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7728-7732和Scandella等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6152-6156。根据Scandella等(1993)Blood 82：1767-1775，除了A2和C2结构域，可能在因子VIII轻链的A3或C1结构域中有第三个抗原表位。此推定的第三个抗原表位意义未知，但它似乎说明了一小部分因子VIII的抗原表位反应性。
抗A2抗体阻碍因子X活化，如Lollar等(1994)J.Clin.Invest.93：2497-2504所示。前面Ware等(1992)Blood Coagul.Fibrinolysis 3：703-716描述通过缺失突变进行图谱研究，将A2抗原表位定位于40kDa A2结构域N-末端的20 kDa区域。竞争免疫辐射度测定表明A2抑制剂识别普通的抗原表位或精细成簇的抗原表位，描述于Scandella等(1992)Throm.Haemostas.67：665-671并证明于美国专利5,859,204。
可测试修饰因子VIII分子在人中的抗原性降低和/或临床试验中的免疫原性。一类设计用于确定因子VIII是否与抑制抗体免疫反应的试验中，施用因子VIII给约25个因子VIII缺乏的病人，优选通过静脉内灌输，病人的抗体抑制治疗性人因子VIII的凝固活性。动物或修饰动物因子VIII的剂量范围在每千克体重5-50单位之间，优选每千克体重10-50单位，最优选每千克体重40单位。各施用后约1小时，从血液样品中回收的因子VIII在一阶段凝固测定中测量。灌输后约5小时再次取样品，测量回收。来自样品的因子VIII总回收和消失速度预测抗体效价和抑制活性。如果抗体效价高，通常不能测量因子VIII回收。回收结果与其他病人的回收结果相比较，这些病人用获自血浆的人因子VIII、重组人因子VIII、获自血浆的猪因子VIII、其它普遍使用的因子VIII或因子VIII替代物治疗形式治疗。
鉴定临床重要的抗原表位后，可表达重组因子VIII分子，当体外测试抗广泛抑制血浆时，重组因子VIII分子的交叉反应性低于获自血浆的猪因子VIII或相当。可进行另外的抗原表位区域突变以降低交叉反应性。减少的交叉反应性尽管需要，但对于生成优于现存血浆-获得猪因子VIII浓缩物的产物不是必需的，由于感染的猪蛋白质或感染传染剂如病毒或朊病毒，此浓缩物可能产生副作用。重组朊病毒或修饰猪因子VIII分子不包含外源猪蛋白质。
诊断测定
因子VIII cDNA和/或其表达蛋白质可全部或部分用作测定的诊断试剂以检测底物中人或动物因子VIII或修饰动物因子VIII的抑制抗体，包括例如血清样品和因子VIII缺乏的人类患者的体液。这些抗体测定包括如ELISA测定、免疫印迹、放射性免疫测定、免疫扩散测定和因子VIII生物活性测定(如通过凝固测定)。制备这些试剂的技术和其使用方法对于本领域技术人员是已知的。例如，检测病人血清样品中抑制抗体的免疫测定可包括使测试样品与足够量因子VIII反应，从而在样品中与抑制抗体形成可检测复合体。
核酸和氨基酸探针可在修饰因子VIII cDNA或蛋白质分子或其片断基础上制备。在一些实施方案中，标记这些可用染料或酶、荧光、化学发光或可商业购买的放射性标记。氨基酸探针可用于例如筛选血清或其它体液，其中怀疑存在人、动物或杂合人/动物因子VIII的抑制剂。可定量病人的抑制剂水平并与健康对照相比，例如可用于确定因子VIII缺乏的病人是否能用动物或修饰动物因子VIII治疗。cDNA可用于例如筛选DNA文库的研究目的。
制备重组因子VIII
重组因子VIII可通过使用真核蛋白质表达系统来产生。通常，缺乏所需基因的真核细胞系用载体转化，该载体含有其缺乏的基因和希望表达的重组DNA。转化可通过电穿孔或病毒传递等技术来完成。所选生成蛋白质的细胞系与感兴趣蛋白质相容，能连续表达感兴趣蛋白质，能在培养基上生长，该培养基可促进感兴趣蛋白质以及精通此领域的技术人员已知的其它因子的纯化。这些技术的例子描述于欧洲专利申请0 302 968 A2和美国专利号5,149,637，全部纳入本文供参考。
测试重组因子VIII公子
可测试重组因子VIII分子在人中的抗原性降低和/或至少两类临床试验中的免疫原性。一类设计用于确定重组或重组杂合因子VIII是否与抑制抗体免疫反应的试验中，施用重组或重组杂合因子VIII给约25个因子VIII缺乏的病人，优选通过静脉内灌输，病人的抗体抑制治疗性人或猪因子VIII的凝固活性。重组或重组杂合因子VIII的剂量范围在5和50单位/kg体重间，优选10-50单位/kg体重，最优选40单位/kg体重。各施用后约1小时，从血液样品中回收的因子VIII在一阶段凝固测定中测量。灌输后约5小时再次取样品，测量回收。来自样品的因子VIII总回收和消失速度预测抗体效价和抑制活性。如果抗体效价高，通常不能测量因子VIII回收。回收结果与其他病人的回收结果相比较，这些病人用获自血浆的人因子VIII、重组人因子VIII、猪因子VIII、其它普遍使用的因子VIII或因子VIII替代物治疗形式治疗。
第二类临床试验设计用于确定重组或重组杂合因子VIII是否是免疫原性即病人是否发展抗体，其中重组或重组杂合因子VIII如前面段落所述施用给约100个以前未治疗的血友病患者，他们没有发展出因子VIII抗体。在6个月到1年的时间段中，大约每2周进行治疗。在此阶段中，以1到3个月间隔取血液样品并进行Bethesda测定或其它抗体测定以确定抑制抗体的存在。也可如上所述在各灌输后进行回收测定。结果与其他血友病患者比较，这些血友病患者用获自血浆的人因子VIII、重组人因子VIII、猪因子VIII、或其它普遍使用的因子VIII或因子VIII替代物治疗形式治疗。
药物组合物
药物组合物包括重组或重组杂合(或修饰)因子VIII，单独或结合适当药物稳定化合物、传递载体和/或运载体(carrier vehicle)，组合物根据已知方法制备，如E.W.Martin的《Remington药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)中所述的方法。
在一个优选的实施方案中，用于静脉内灌输的优选携带或传递载体是生理盐水或磷酸缓冲盐水。
在另一个优选的实施方案中，适当的稳定化合物、传递载体和运载体包括但不限于其它人或动物蛋白质如清蛋白。
磷脂泡或脂质体悬浮液也优选作为药学上可接受的携带或传递载体。这些可根据本领域技术人员已知方法制备，可包含例如磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱或其它磷脂或去垢剂组合物，它们赋予表面负电荷，因为因子VIII结合带负电的磷脂膜。制备脂质体可通过在无机溶液中溶解适当脂类(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱(arachidoyl phosphatidyl choline)和胆固醇)，随后蒸发无机溶液，在容器表面留下干燥脂类的薄膜。然后将杂合因子VIII的水溶液导入容器。接着容器用手旋转以使脂类物质从容器侧面游离且分散脂类聚集物，从而形成脂质体悬浮液。
重组或重组杂合(修饰)因子VIII可结合适当药物稳定化合物、传递载体和/或运载体，包括依赖维生素K的凝固因子、组织因子、冯维勒因子(vWf)或含因子VIII结合位点的vWf片断、多糖如蔗糖。
重组或重组杂合(修饰)因子VIII也可通过基因治疗传递，与传递人因子VIII的方式相同，使用传递载体如逆转录病毒载体。此方法包括将因子VIII cDNA纳入人细胞中，人细胞直接移植到因子VIII缺乏的病人中或置于因子VIII能渗透但细胞不能渗透的可移植装置中，随后移植装置。优选方法是逆转录病毒-调节的基因转移。在此方法中，外源基因(如因子VIII cDNA)克隆到修饰逆转录病毒的基因组中。基因通过病毒机制插入宿主细胞基因组，在其中它被细胞表达。修饰逆转录病毒载体使它不产生病毒，防治病毒感染宿主。此类治疗的一般原则对本领域技术人员已知且在文献中综述[如Kohn，D.B.等，(1989)Transfusion 29：812-820]。
重组或重组杂合(修饰)因子VIII可结合vWf保存以提高杂合分子的半衰期和自身寿命。另外，vWf存在时冻干因子VIII能改进活性分子产量。目前商业供应商用于保存人和动物因子VIII的方法可用于保存杂合或修饰因子VIII。这些方法包括：(1)冻干部分纯化状态的因子VIII(作为没有进一步纯化灌输的因子VIII的“浓缩物”)；(2)通过Zimmerman方法免疫亲和纯化因子VIII且在清蛋白存在时冻干，清蛋白稳定因子VIII；(3)在清蛋白存在时冻干重组因子VIII。
此外，杂合因子VIII在4℃的0.6M NaCl、20mM MES、5mM CaCl2，pH6.0中不一定稳定，它也可在这些缓冲液中冷冻保存并以最小活性损失来解冻。
治疗方法
重组或重组杂合(修饰)因子VIII用于治疗因子VIII缺乏引起的不受控出血(如关节内、头盖内或胃肠出血)，用于有和没有抑制抗体的血友病患者以及由于抑制抗体发展产生获得性因子VIII缺乏的病人。活性物质优选静脉内施用。
另外，如上所述，施用重组或重组杂合(修饰)因子VIII可通过移植遗传改造产生杂合物的细胞或移植含这些细胞的装置。
在一个优选的实施方案中，重组或重组杂合(修饰)因子VIII的药物组合物单独或结合稳定剂、传递载体和/或运载体，根据人或动物因子VIII灌输所用相同过程静脉灌输给病人。
必须施用给需要这些治疗的病人的重组或重组杂合(修饰)因子VIII组合物治疗剂量取决于因子VIII缺乏的严重性而变化。一般，调节剂量水平的频率、持续时间和单位与各病人出血事件的严重性和持续时间一致。因此，杂合因子VIII以足够量包括在药学上可接受运载体、传递载体或稳定剂中，用于将治疗有效量的杂合物传递给病人以停止出血，这通过标准凝固测定来测量。
因子VIII的经典定义是正常血浆中存在的物质，它修正来自血友病A个体血浆中的凝固缺陷。纯化或部分纯化形式的因子VIII的体外凝固活性用于计算灌输人类患者的因子VIII剂量且可靠指示回收自患者血浆的活性和体内出血缺陷的修正。根据Lusher，J.M.等，328 New Engl.J.Med.328：453-459；Pittman，D.D.等，(1992)Blood 79：389-397；Brinkhous等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：8752-8755，新因子VIII分子的体外标准测定和它们在狗灌输模型或人类患者中的特性间没有报导差异。
通常，所需血浆因子VIII水平在正常的30-100％范围中，此水平通过施用重组或重组杂合因子VIII在病人中获得。在施用重组或重组杂合因子VIII的一个优选模式中，静脉内给予的组合物优选剂量范围是每千克体重约5-50单位，更优选每千克体重10-50单位，最优选每千克体重20-40单位；间隔频率范围从约8到24小时(在一些严重受影响的血友病患者中)；治疗持续时间的天数范围从1到10天或直到解决短暂出血。参见例如Roberts，H.R.和M.R.Jones《血友病和相关症状-先天性凝血素缺陷(因子II、因子V和因子VII-XII)(Hemophilia andRelated Conditions-Congenital Deficiencies of Prothrommbin(FactorII，Factor V，and Factors VII to XII))，第153章，1453-1474，1460，《血液学》(Hematology)，Williams，W.J.等编(1990)。有抑制剂的病人可能需要更多重组或重组杂合因子VIII，或由于其特异活性高于人因子VIII或者抗体反应性或免疫原性减少，病人可能需要更少的重组或重组杂合因子VIII。用人或猪因子VIII治疗，灌输的重组或重组杂合因子VIII的量通过一阶段因子VIII凝固测定确定，在一些选择情况中，体内回收通过测量灌输后病人血浆中的因子VIII来确定。要理解的是对于任何具体试验者，特异剂量方案应随着时间调节，调节是根据个体需要和施用或监控组合物施用的人的专业判断，本文所列浓度范围仅作为范例，不想限制权利要求的组合物的范围或实践。
根据需要，治疗可采用形式是单次静脉内施用组合物或定期或连续施用一段延长的时间。另外，重组或重组杂合因子VIII可皮下或用脂质体在不同时间间隔以一个或几个剂量施用。
因子VIII也可用于治疗血友病患者中因子VIII缺乏引起的不受控出血。在此情况中，高于单独人或动物因子VIII的凝固活性不是必需的。如果活性不被患者血浆中的抗体中和，低于人因子VIII的凝固活性(即小于3,000单位/mg)有用。
上面综述的重组或重组杂合(或修饰)因子VIII分子和其分离、特征确定、产生和使用方法通过参考下列非限制例子可进一步理解。
                              实施例
材料一柠檬酸化的血友病A血浆和正常收集的人血浆(FACT)购自George KingBiomedical公司(Overland Park，KS)。肝素-琼脂糖购自Sigma Chemical公司(St.Louis，MO)。胎牛血清、遗传霉素、青霉素、链霉素、DMEM/F12培养基和AIM-V培养基购自Life Technologies公司(Gaithersburg，MD)。HP20如上所述制备[Healey，J.F.，(1998)同上]，它是无B结构域的杂合人/猪因子VIII分子，含人A1、A2、ap-A3、C1结构域和猪C2结构域。
质粒DNA用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒纯化(Qiagen公司，Valencia，CA)。PCR反应用Hybrid OmniGene热循环仪进行，使用pfu DNA聚合酶。PCR产物用胶纯化，乙醇沉淀并用T4 DNA连接酶连入质粒DNA(DNA快速连接试剂盒(Rapid DNALigation kit)，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。含插入的质粒用于转化大肠杆菌Epicurean XL1-Blue细胞。所有PCR产生的新因子VIII DNA序列通过双脱氧测序用Applied Biosystems(Foster City，CA)的373a自动DNA测序仪和PRISM终止子染色试剂盒(PRISM dye terminator kit)来确定。
实施例1：因子VIII突变cDNA的构建
转染细胞系维持于Dulbecco改进的Eagle培养基-F12，其中含有10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。胎牛血清使用前在56℃热失活1小时。ReNeo中的突变cDNA稳定转染到BHK细胞中，选择遗传霉素抗性，转入无血清的AIM V培养基用于表达，通过上述肝素-琼脂糖层析部分纯化[Healey，J.F.等，(1998)同上]。
实施例2：因子VIII和因子VIII抑制剂测定
重组因子VIII蛋白质的活性通过一阶段(one-stage)凝固测定来测量[Bowie，E.J.W.和Owen，C.A.(1984)，《止血紊乱》(Disorders of Hemostasis)，O.D.Ratnoff和C.D.Forbes编，Grune&Stratton公司，Orlando，FL 43-72]。1单位的因子VIII定义为1ml正常柠檬酸化人血浆中的活性。因子VIII抑制剂效价通过改进的Bethesda测定来测量[Kasper，C.K.等，(1975)Thromb.Diath.Haemorrh.34：869-872]。重组因子VIII加入血友病A血浆至最终浓度为每毫升0.8-1.2单位，并用不同浓度的抑制剂在37℃孵育2小时。为确定定义Bethesda单位的50％抑制点，稀释抑制剂以产生横跨至少35％-65％范围的剩余活性。在一些情况中，进行反复稀释，使用平均值。平均稀释10次以确定各Bethesda效价。数据通过非线性回归用Marquardt算法(SigmaPlot 5.0，SPSS公司)产生等式
                  剩余活性％＝m(logx-logx50)+50
其中拟合参数(fitted parameter)x50是产生50％抑制的对应稀释，合适参数m是半-log线斜率且独立变量x是抑制剂样品的对应稀释。
Bethesda效价相当于x50 -1。Bethesda效价的标准误差(SD)估计通过Bethesda效价乘以变量x50的系数来计算。因子VIII分子的Bethesda效价用Student t检验来比较。部分纯化制品中的因子VIII质量浓度通过三明治ELISA确定，如上所述使用ESH4作为捕捉抗体和生物素化的ESH8作为检测抗体[Lubin，I.M.等，(1994)269：8639-8641]。样品测定四次。
实施例3：抗C2突变体的C2特异性血浆的Bethesda效价
因子VIII抑制剂血浆称为DR、EE、EEE、JF、LK、NF、JM和WC，它们抗C2突变体Y2195H、Y2195A、F2196L、F2196A、R2215K、R2215A、R2220K、R2220A、F2290S、F2290A、W2313F、W2313A、R2320K和R2320A。测试并与HSQ相比较，参见表1。DR和JF血浆中发现抗原性降低，但其它6种血浆中没有发现。DR强烈识别R2215、R2220和F2196，而JF强烈识别R2215。
                              表1
患者C2特异血浆抗人无B结构域的fVIII C2突变体的Bethesda效价(HSQ效价％)
          DR      EE       EEE     JF       LK      NF      JM      WC
HSQ       100     100      100     100      100     100     100     100
R2215A    8       140      62      7        70      81      91      68
R2215K    91      152      68      102      68      95      85      112
R2220A    4       119      58      41       85      129     123     121
R2220K    4       130      54      107      79      75      113     78
W2313F    41      138      99      133      50      80      93      89
R2320A    87      117      80      90       89      185     139     118
F2290S    74      130      129     70       118     162     123     159
F2290A    64      131      103     73       57      97      99      119
Y2195H    69      93       60      63       65      71      86      105
Y2195A    37      131      116     112      74      113     125     92
F2196L    14      74       99      72       89      155     89      99
F2196A    8       143      84      172      68      99      122     69
序列表
<110>J.S.劳拉(LOLLAR，John，S.)
     埃默里大学(Emory University)
<120>因子VIII C2结构域变体
<130>130-01 WO
<140>待定
<141>2002-11-27
<150>US 60/334,569
<151>2001-11-30
<160>7
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>9009
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
cagtgggtaa gttccttaaa tgctctgcaa agaaattggg acttttcatt aaatcagaaa 60
ttttactttt ttcccctcct gggagctaaa gatattttag agaagaatta accttttgct 120
tctccagttg aacatttgta gcaataagtc atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt 180
ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc accagaagat actacctggg tgcagtggaa 240
ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct 300
cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt 360
gtagaattca cggttcacct tttcaacatc gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg 420
ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat gatacagtgg tcattacact taagaacatg 480
gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga 540
gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg gagaaagaag atgataaagt cttccctggt 600
ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca 660
ctgtgcctta cctactcata tctttctcat gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc 720
ctcattggag ccctactagt atgtagagaa gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc 780
ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa 840
acaaagaact ccttgatgca ggatagggat gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg 900
cacacagtca atggttatgt aaacaggtct ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa 960
tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc accactcctg aagtgcactc aatattcctc 1020
gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata 1080
actttcctta ctgctcaaac actcttgatg gaccttggac agtttctact gttttgtcat 1140
atctcttccc accaacatga tggcatggaa gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag 1200
gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa gaagcggaag actatgatga tgatcttact 1260
gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt 1320
cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag 1380
gactgggact atgctccctt agtcctcgcc cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat 1440
ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac 1500
acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct attcagcatg aatcaggaat cttgggacct 1560
ttactttatg gggaagttgg agacacactg ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga 1620
ccatataaca tctaccctca cggaatcact gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta 1680
ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt ccaattctgc caggagaaat attcaaatat 1740
aaatggacag tgactgtaga agatgggcca actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc 1800
tattactcta gtttcgttaa tatggagaga gatctagctt caggactcat tggccctctc 1860
ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa agaggaaacc agataatgtc agacaagagg 1920
aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag aaccgaagct ggtacctcac agagaatata 1980
caacgctttc tccccaatcc agctggagtg cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc 2040
aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg 2100
catgaggtgg catactggta cattctaagc attggagcac agactgactt cctttctgtc 2160
ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa atggtctatg aagacacact caccctattc 2220
ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg atggaaaacc caggtctatg gattctgggg 2280
tgccacaact cagactttcg gaacagaggc atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt 2340
gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac agttatgaag atatttcagc atacttgctg 2400
agtaaaaaca atgccattga accaagaagc ttctcccaga attcaagaca ccctagcact 2460
aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct 2520
tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg 2580
atgctcttgc gacagagtcc tactccacat gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc 2640
aaatatgaga ctttttctga tgatccatca cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg 2700
tctgaaatga cacacttcag gccacagctc catcacagtg gggacatggt atttacccct 2760
gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag aaactgggga caactgcagc aacagagttg 2820
aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca tcaaataatc tgatttcaac aattccatca 2880
gacaatttgg cagcaggtac tgataataca agttccttag gacccccaag tatgccagtt 2940
cattatgata gtcaattaga taccactcta tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag 3000
tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt 3060
ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg 3120
ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct gctttgttga ctaaagataa tgccttattc 3180
aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac aaaacttcca ataattcagc aactaataga 3240
aagactcaca ttgatggccc atcattatta attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat 3300
atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt 3360
atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta aatcatatgt caaataaaac tacttcatca 3420
aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat 3480
ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg 3540
actcatggaa agaactctct gaactctggg caaggcccca gtccaaagca attagtatcc 3600
ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta 3660
gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc 3720
agaaacctat ttcttactaa cttggataat ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa 3780
aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg 3840
cctcagatac atacagtgac tggcactaag aatttcatga agaacctttt cttactgagc 3900
actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgag ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt 3960
aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa 4020
ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat 4080
gcatgcacca caaggatatc tcctaataca agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt 4140
aagagagctt tgaaacaatt cagactccca ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata 4200
attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc 4260
ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca 4320
gattgcctta cgaggagtca tagcatccct caagcaaata gatctccatt acccattgca 4380
aaggtatcat catttccatc tattagacct atatatctga ccagggtcct attccaagac 4440
aactcttctc atcttccagc agcatcttat agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc 4500
agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat aacctttctt tagccattct aaccttggag 4560
atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca 4620
tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa 4680
gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat cagaaggacc tattccctac ggaaactagc 4740
aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga 4800
gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca 4860
gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta ttggatcctc ttgcttggga taaccactat 4920
ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct 4980
tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca 5040
gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg 5100
actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact 5160
cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa attgactatg atgataccat atcagttgaa 5220
atgaagaagg aagattttga catttatgat gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt 5280
caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg 5340
agtagctccc cacatgttct aagaaacagg gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag 5400
aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc tcctttactc agcccttata ccgtggagaa 5460
ctaaatgaac atttgggact cctggggcca tatataagag cagaagttga agataatatc 5520
atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt ccctattcct tctattctag ccttatttct 5580
tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa 5640
accaaaactt acttttggaa agtgcaacat catatggcac ccactaaaga tgagtttgac 5700
tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg 5760
attggacccc ttctggtctg ccacactaac acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg 5820
acagtacagg aatttgctct gtttttcacc atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc 5880
actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct ccctgcaata tccagatgga agatcccact 5940
tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc aatggctaca taatggatac actacctggc 6000
ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa 6060
aacatccatt ctattcattt cagtggacat gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat 6120
aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc 6180
aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt attggcgagc atctacatgc tgggatgagc 6240
acactttttc tggtgtacag caataagtgt cagactcccc tgggaatggc ttctggacac 6300
attagagatt ttcagattac agcttcagga caatatggac agtgggcccc aaagctggcc 6360
agacttcatt attccggatc aatcaatgcc tggagcacca aggagccctt ttcttggatc 6420
aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag 6480
aagttctcca gcctctacat ctctcagttt atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag 6540
tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga accttaatgg tcttctttgg caatgtggat 6600
tcatctggga taaaacacaa tatttttaac cctccaatta ttgctcgata catccgtttg 6660
cacccaactc attatagcat tcgcagcact cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta 6720
aatagttgca gcatgccatt gggaatggag agtaaagcaa tatcagatgc acagattact 6780
gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac 6840
ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa 6900
gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg 6960
cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg 7020
actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca 7080
cctgtggtga actctctaga cccaccgtta ctgactcgct accttcgaat tcacccccag 7140
agttgggtgc accagattgc cctgaggatg gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc 7200
tactgagggt ggccactgca gcacctgcca ctgccgtcac ctctccctcc tcagctccag 7260
ggcagtgtcc ctccctggct tgccttctac ctttgtgcta aatcctagca gacactgcct 7320
tgaagcctcc tgaattaact atcatcagtc ctgcatttct ttggtggggg gccaggaggg 7380
tgcatccaat ttaacttaac tcttacctat tttctgcagc tgctcccaga ttactccttc 7440
cttccaatat aactaggcaa aaagaagtga ggagaaacct gcatgaaagc attcttccct 7500
gaaaagttag gcctctcaga gtcaccactt cctctgttgt agaaaaacta tgtgatgaaa 7560
ctttgaaaaa gatatttatg atgttaacat ttcaggttaa gcctcatacg tttaaaataa 7620
aactctcagt tgtttattat cctgatcaag catggaacaa agcatgtttc aggatcagat 7680
caatacaatc ttggagtcaa aaggcaaatc atttggacaa tctgcaaaat ggagagaata 7740
caataactac tacagtaaag tctgtttctg cttccttaca catagatata attatgttat 7800
ttagtcatta tgaggggcac attcttatct ccaaaactag cattcttaaa ctgagaatta 7860
tagatggggt tcaagaatcc ctaagtcccc tgaaattata taaggcattc tgtataaatg 7920
caaatgtgca tttttctgac gagtgtccat agatataaag ccattggtct taattctgac 7980
caataaaaaa ataagtcagg aggatgcaat tgttgaaagc tttgaaataa aataacatgt 8040
cttcttgaaa tttgtgatgg ccaagaaaga aaatgatgat gacattaggc ttctaaagga 8100
catacattta atatttctgt ggaaatatga ggaaaatcca tggttatctg agataggaga 8160
tacaaacttt gtaattctaa taatgcactc agtttactct ctccctctac taatttcctg 8220
ctgaaaataa cacaacaaaa atgtaacagg ggaaattata taccgtgact gaaaactaga 8280
gtcctactta catagttgaa atatcaagga ggtcagaaga aaattggact ggtgaaaaca 8340
gaaaaaacac tccagtctgc catatcacca cacaatagga tcccccttct tgccctccac 8400
ccccataaga ttgtgaaggg tttactgctc cttccatctg cctgcacccc ttcactatga 8460
ctacacagaa ctctcctgat agtaaagggg gctggaggca aggataagtt atagagcagt 8520
tggaggaagc atccaaagac tgcaacccag ggcaaatgga aaacaggaga tcctaatatg 8580
aaagaaaaat ggatcccaat ctgagaaaag gcaaaagaat ggctactttt ttctatgctg 8640
gagtattttc taataatcct gcttgaccct tatctgacct ctttggaaac tataacatag 8700
ctgtcacagt atagtcacaa tccacaaatg atgcaggtgc aaatggttta tagccctgtg 8760
aagttcttaa agtttagagg ctaacttaca gaaatgaata agttgttttg ttttatagcc 8820
cggtagagga gttaacccca aaggtgatat ggttttattt cctgttatgt ttaacttgat 8880
aatcttattt tggcattctt ttcccattga ctatatacat ctctatttct caaatgttca 8940
tggaactagc tcttttattt tcctgctggt ttcttcagta atgagttaaa taaaacattg 9000
acacataca                                                         9009
<210>2
<211>2351
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
  1               5                  10                  15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
             20                  25                  30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
         35                  40                  45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
     50                  55                  60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile
 65                  70                  75                  80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
                 85                  90                  95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
            100                 105                 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
        115                 120                 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
    130                 135                 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145                 150                 155                 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
                165                 170                 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
            180                 185                 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
        195                 200                 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
    210                 215                 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
                245                 250                 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
            260                 265                 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
        275                 280                 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
    290                 295                 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305                 310                 315                 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
                325                 330                 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
            340                 345                 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
        355                 360                 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
    370                 375                 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385                 390                 395                 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
                405                 410                 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
            420                 425                 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
        435                 440                 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
    450                 455                 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
                485                 490                 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
            500                 505                 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
        515                 520                 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
    530                 535                 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545                 550                 555                 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
                565                 570                 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
            580                 585                 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
        595                 600                 605
Asn Ile GlnArg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
    610                615                 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625                 630                 635                 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
                645                 650                 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
            660                 665                 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
        675                 680                 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
    690                 695                 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705                 710                 715                 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
                725                 730                 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
            740                 745                 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro
        755                 760                 765
Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp
    770                 775                 780
Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys
785                 790                 795                 800
Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser
                805                 810                 815
Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr
            820                 825                 830
Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn
        835                 840                 845
Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly
    850                 855                 860
Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu
865                 870                 875                 880
Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys
                885                 890                 895
Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn
            900                 905                 910
Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met
        915                 920                 925
Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys
    930                 935                 940
Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu
945                 950                 955                 960
Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu
                965                 970                 975
Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe
            980                 985                 990
Lys Gly Lys Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala
        995                1000                1005
Leu Phe Lys Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn
   1010                1015                1020
Asn Ser Ala Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu
1025               1030                1035                1040
Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr
               1045                1050                1055
Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
           1060                1065                1070
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr Thr
       1075                1080                1085
Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly Pro Ile
   1090                1095                1100
Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys Met Leu Phe
1105               1110                1115                1120
Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His Gly Lys Asn Ser
               1125                1130                1135
Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys G1n Leu Val Ser Leu Gly
           1140                1145                1150
Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser Glu Lys Asn Lys
       1155                1160                1165
Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu
   1170                1175                1180
Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn
1185               1190                1195                1200
Leu His Glu Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu
               1205                1210                1215
Ile Glu Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln
           1220                1225                1230
Ile His Thr Val Thr Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu
       1235                1240                1245
Leu Ser Thr Arg Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Ala Tyr Ala
   1250                1255                1260
Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr
1265               1270                1275                1280
Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu
               1285                1290                1295
Glu Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
           1300                1305                1310
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr Gln
       1315                1320                1325
Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu Glu Thr
   1330                1335                1340
Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser
1345               1350                1355                1360
Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr
               1365                1370                1375
Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys
           1380                1385                1390
Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala Asn Arg Ser Pro Leu Pro
       1395                1400                1405
Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr
   1410                1415                1420
Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr
1425               1430                1435                1440
Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly
               1445                1450                1455
Ala Lys Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr
           1460                1465                1470
Gly Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser
       1475                1480                1485
Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu
   1490                1495                1500
Pro Lys Thr Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr
1505               1510                1515                1520
Gln Lys Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His
               1525                1530                1535
Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
           1540                1545                1550
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg Val
       1555                1560                1565
Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp Pro Leu
   1570                1575                1580
Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys
1585               1590                1595                1600
Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr
               1605                1610                1615
Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile
           1620                1625                1630
Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu Val Thr Trp Ala Lys Gln
       1635                1640                1645
Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg
   1650                1655                1660
His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu
1665               1670                1675                1680
Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe
               1685                1690                1695
Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys
           1700                1705                1710
Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr
       1715                1720                1725
Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly
   1730                1735                1740
Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly
1745               1750                1755                1760
Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly
               1765                1770                1775
Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
           1780                1785                1790
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu
       1795                1800                1805
Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn
   1810                1815                1820
Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His
1825               1830                1835                1840
His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr
               1845                1850                1855
Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
           1860                1865                1870
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg
       1875                1880                1885
Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu
   1890                1895                1900
Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala
1905               1910                1915                1920
Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg
               1925                1930                1935
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val
           1940                1945                1950
Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser
       1955                1960                1965
Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val
   1970                1975                1980
Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly
1985               1990                1995                2000
Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg
               2005                2010                2015
Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
           2020                2025                2030
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser
       2035                2040                2045
Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln
   2050                2055                2060
Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
2065               2070                2075                2080
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala
               2085                2090                2095
Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
           2100                2105                2110
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly
       2115                2120                2125
Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val
   2130                2135                2140
Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn
2145               2150                2155                2160
Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser
               2165                2170                2175
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser
           2180                2185                2190
Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln
       2195                2200                2205
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro
   2210                2215                2220
Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro
2225               2230                2235                2240
Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr
               2245                2250                2255
Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
           2260                2265                2270
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His
       2275                2280                2285
Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly
   2290                2295                2300
Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
2305               2310                2315                2320
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile
               2325                2330                2335
Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
           2340                2345                2350
<210>3
<211>6402
<212>DNA
<213>猪
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(6399)
<400>3
atg cag cta gag ctc tcc acc tgt gtc ttt ctg tgt ctc ttg cca ctc    48
Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu
  1               5                  10                  15
ggc ttt agt gcc atc agg aga tac tac ctg ggc gca gtg gaa ctg tcc    96
Gly Phe Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
             20                  25                  30
tgg gac tac cgg caa agt gaa ctc ctc cgt gag ctg cac gtg gac acc    144
Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr
         35                  40                  45
aga ttt cct gct aca gcg cca gga gct ctt ccg ttg ggc ccg tca gtc    192
Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val
     50                  55                  60
ctg tac aaa aag act gtg ttc gta gag ttc acg gat caa ctt ttc agc    240
Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser
 65                  70                  75                  80
gtt gcc agg ccc agg cca cca tgg atg ggt ctg ctg ggt cct acc atc    288
Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile
                 85                  90                  95
cag gct gag gtt tac gac acg gtg gtc gtt acc ctg aag aac atg gct    336
Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala
            100                 105                 110
tct cat ccc gtt agt ctt cac gct gtc ggc gtc tcc ttc tgg aaa tct    384
Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser
        115                 120                 125
tcc gaa ggc gct gaa tat gag gat cac acc agc caa agg gag aag gaa    432
Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu
    130                 135                 140
gac gat aaa gtc ctt ccc ggt aaa agc caa acc tac gtc tgg cag gtc    480
Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val
145                 150                 155                 160
ctg aaa gaa aat ggt cca aca gcc tct gac cca cca tgt ctc acc tac    528
Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr
                165                 170                 175
tca tac ctg tct cac gtg gac ctg gtg aaa gac ctg aat tcg ggc ctc    576
Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu
            180                 185                 190
att gga gcc ctg ctg gtt tgt aga gaa ggg agt ctg acc aga gaa agg    624
Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg
        195                 200                 205
acc cag aac ctg cac gaa ttt gta cta ctt ttt gct gtc ttt gat gaa    672
Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu
    210                 215                 220
ggg aaa agt tgg cac tca gca aga aat gac tcc tgg aca cgg gcc atg    720
Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met
225                 230                 235                 240
gat ccc gca cct gcc agg gcc cag cct gca atg cac aca gtc aat ggc    768
Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly
                245                 250                 255
tat gtc aac agg tct ctg cca ggt ctg atc gga tgt cat aag aaa tca    816
Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser
            260                 265                 270
gtc tac tgg cac gtg att gga atg ggc acc agc ccg gaa gtg cac tcc    864
Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser
        275                 280                 285
att ttt ctt gaa ggc cac acg ttt ctc gtg agg cac cat cgc cag gct    912
Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ala
    290                 295                 300
tcc ttg gag atc tcg cca cta act ttc ctc act gct cag aca ttc ctg    960
Ser Leu Glu Ile Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu
305                 310                 315                 320
atg gac ctt ggc cag ttc cta ctg ttt tgt cat atc tct tcc cac cac    1008
Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His His
                325                 330                 335
cat ggt ggc atg gag gct cac gtc aga gta gaa agc tgc gcc gag gag    1056
His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu
            340                 345                 350
ccc cag ctg cgg agg aaa gct gat gaa gag gaa gat tat gat gac aat    1104
Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn
        355                 360                 365
ttg tac gac tcg gac atg gac gtg gtc cgg ctc gat ggt gac gac gtg    1152
Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val
    370                 375                 380
tct ccc ttt atc caa atc cgc tcg gtt gcc aag aag cat ccc aaa acc    1200
Ser Pro Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385                 390                 395                 400
tgg gtg cac tac atc tct gca gag gag gag gac tgg gac tac gcc ccc    1248
Trp Val His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
                405                 410                 415
gcg gtc ccc agc ccc agt gac aga agt tat aaa agt ctc tac ttg aac    1296
Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn
            420                 425                 430
agt ggt cct cag cga att ggt agg aaa tac aaa aaa gct cga ttc gtc    1344
Ser Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val
        435                 440                 445
gct tac acg gat gta aca ttt aag act cgt aaa gct att ccg tat gaa    1392
Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu
    450                 455                 460
tca gga atc ctg gga cct tta ctt tat gga gaa gtt gga gac aca ctt    1440
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
ttg att ata ttt aag aat aaa gcg agc cga cca tat aac atc tac cct    1488
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
                485                 490                 495
cat gga atc act gat gtc agc gct ttg cac cca ggg aga ctt cta aaa    1536
His Gly Ile Thr Asp Val Ser Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys
            500                 505                 510
ggt tgg aaa cat ttg aaa gac atg cca att ctg cca gga gag act ttc    1584
Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro Ile Leu Pro Gly Glu Thr Phe
        515                 520                 525
aag tat aaa tgg aca gtg act gtg gaa gat ggg cca acc aag tcc gat    1632
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
    530                 535                 540
cct cgg tgc ctg acc cgc tac tac tcg agc tcc att aat cta gag aaa    1680
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys
545                 550                 555                 560
gat ctg gct tcg gga ctc att ggc cct ctc ctc atc tgc tac aaa gaa    1728
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
                565                 570                 575
tct gta gac caa aga gga aac cag atg atg tca gac aag aga aac gtc    1776
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
            580                 585                 590
atc ctg ttt tct gta ttc gat gag aat caa agc tgg tac ctc gca gag    1824
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu
        595                 600                 605
aat att cag cgc ttc ctc ccc aat ccg gat gga tta cag ccc cag gat    1872
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp
    610                 615                 620
cca gag ttc caa gct tct aac atc atg cac agc atc aat ggc tat gtt    1920
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625                 630                 635                 640
ttt gat agc ttg cag ctg tcg gtt tgt ttg cac gag gtg gca tac tgg    1968
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
                645                 650                 655
tac att cta agt gtt gga gca cag acg gac ttc ctc tcc gtc ttc ttc    2016
Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
            660                 665                 670
tct ggc tac acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa gac aca ctc acc    2064
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
        675                 680                 685
ctg ttc ccc ttc tca gga gaa acg gtc ttc atg tca atg gaa aac cca    2112
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
    690                 695                 700
ggt ctc tgg gtc cta ggg tgc cac aac tca gac ttg cgg aac aga ggg    2160
Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly
705                 710                 715                 720
atg aca gcc tta ctg aag gtg tat agt tgt gac agg gac att ggt gat    2208
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp Ile Gly Asp
                725                 730                 735
tat tat gac aac act tat gaa gat att cca ggc ttc ttg ctg agt gga    2256
Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly
            740                 745                 750
aag aat gtc att gaa ccc aga agc ttt gcc cag aat tca aga ccc cct    2304
Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro
        755                 760                 765
agt gcg agc caa aag caa ttc caa acc atc aca agt cca gaa gat gac    2352
Ser Ala Ser Gln Lys Gln Phe Gln Thr Ile Thr Ser Pro Glu Asp Asp
    770                 775                 780
gtg gag ctt gac ccg cag tct gga gag aga acc caa gca ctg gaa gaa    2400
Val Glu Leu Asp Pro Gln Ser Gly Glu Arg Thr Gln Ala Leu Glu Glu
785                 790                 795                 800
cta agt gtc ccc tct ggt gat ggg tcg atg ctc ttg gga cag aat cct    2448
Leu Ser Val Pro Ser Gly Asp Gly Ser Met Leu Leu Gly Gln Asn Pro
                805                 810                 815
gct cca cat ggc tca tcc tca tct gat ctt caa gaa gcc agg aat gag    2496
Ala Pro His Gly Ser Ser Ser Ser Asp Leu Gln Glu Ala Arg Asn Glu
            820                 825                 830
gct gat gat tat tta cct gga gca aga gaa aga aac acg gcc cca tcc    2544
Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gly Ala Arg Glu Arg Asn Thr Ala Pro Ser
        835                 840                 845
gca gcg gca cgt ctc aga cca gag ctg cat cac agt gcc gaa aga gta    2592
Ala Ala Ala Arg Leu Arg Pro Glu Leu His His Ser Ala Glu Arg Val
    850                 855                 860
ctt act cct gag cca gag aaa gag ttg aag aaa ctt gat tca aaa atg    2640
Leu Thr Pro Glu Pro Glu Lys Glu Leu Lys Lys Leu Asp Ser Lys Met
865                 870                 875                 880
tct agt tca tca gac ctt cta aag act tcg cca aca att cca tca gac    2688
Ser Ser Ser Ser Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Thr Ile Pro Ser Asp
                885                 890                 895
acg ttg tca gcg gag act gaa agg aca cat tcc tta ggc ccc cca cac    2736
Thr Leu Ser Ala Glu Thr Glu Arg Thr His Ser Leu Gly Pro Pro His
            900                 905                 910
ccg cag gtt aat ttc agg agt caa tta ggt gcc att gta ctt ggc aaa    2784
Pro Gln Val Asn Phe Arg Ser Gln Leu Gly Ala Ile Val Leu Gly Lys
        915                 920                 925
aat tca tct cac ttt att ggg gct ggt gtc cct ttg ggc tcg act gag    2832
Asn Ser Ser His Phe Ile Gly Ala Gly Val Pro Leu Gly Ser Thr Glu
    930                 935                 940
gag gat cat gaa agc tcc ctg gga gaa aat gta tca cca gtg gag agt    2880
Glu Asp His Glu Ser Ser Leu Gly Glu Asn Val Ser Pro Val Glu Ser
945                 950                 955                 960
gac ggg ata ttt gaa aag gaa aga gct cat gga cct gct tca ctg acc    2928
Asp Gly Ile Phe Glu Lys Glu Arg Ala His Gly Pro Ala Ser Leu Thr
                965                 970                 975
aaa gac gat gtt tta ttt aaa gtt aat atc tct ttg gta aag aca aac    2976
Lys Asp Asp Val Leu Phe Lys Val Asn Ile Ser Leu Val Lys Thr Asn
            980                 985                 990
aag gca cga gtt tac tta aaa act aat aga aag att cac att gat gac    3024
Lys Ala Arg Val Tyr Leu Lys Thr Asn Arg Lys Ile His Ile Asp Asp
        995                1000                1005
gca gct tta tta act gag aat agg gca tct gca acg ttt atg gac aaa    3072
Ala Ala Leu Leu Thr Glu Asn Arg Ala Ser Ala Thr Phe Met Asp Lys
   1010                1015                1020
aat act aca gct tcg gga tta aat cat gtg tca aat tgg ata aaa ggg    3120
Asn Thr Thr Ala Ser Gly Leu Asn His Val Ser Asn Trp Ile Lys Gly
1025               1030                1035                1040
ccc ctt ggc aag aac ccc cta agc tcg gag cga ggc ccc agt cca gag    3168
Pro Leu Gly Lys Asn Pro Leu Ser Ser Glu Arg Gly Pro Ser Pro Glu
               1045                1050                1055
ctt ctg aca tct tca gga tca gga aaa tct gtg aaa ggt cag agt tct    3216
Leu Leu Thr Ser Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val Lys Gly Gln Ser Ser
           1060                1065                1070
ggg cag ggg aga ata cgg gtg gca gtg gaa gag gaa gaa ctg agc aaa    3264
Gly Gln Gly Arg Ile Arg Val Ala Val Glu Glu Glu Glu Leu Ser Lys
       1075                1080                1085
ggc aaa gag atg atg ctt ccc aac agc gag ctc acc ttt ctc act aac    3312
Gly Lys Glu Met Met Leu Pro Asn Ser Glu Leu Thr Phe Leu Thr Asn
   1090                1095                1100
tcg gct gat gtc caa gga aac gat aca cac agt caa gga aaa aag tct    3360
Ser Ala Asp Val Gln Gly Asn Asp Thr His Ser Gln Gly Lys Lys Ser
1105               1110                1115                1120
cgg gaa gag atg gaa agg aga gaa aaa tta gtc caa gaa aaa gtc gac    3408
Arg Glu Glu Met Glu Arg Arg Glu Lys Leu Val Gln Glu Lys Val Asp
               1125                1130                1135
ttg cct cag gtg tat aca gcg act gga act aag aat ttc ctg aga aac    3456
Leu Pro Gln Val Tyr Thr Ala Thr Gly Thr Lys Asn Phe Leu Arg Asn
           1140                1145                1150
att ttt cac caa agc act gag ccc agt gta gaa ggg ttt gat ggg ggg    3504
Ile Phe His Gln Ser Thr Glu Pro Ser Val Glu Gly Phe Asp Gly Gly
       1155                1160                1165
tca cat gcg ccg gtg cct caa gac agc agg tca tta aat gat tcg gca    3552
Ser His Ala Pro Val Pro Gln Asp Ser Arg Ser Leu Asn Asp Ser Ala
   1170                1175                1180
gag aga gca gag act cac ata gcc cat ttc tca gca att agg gaa gag    3600
Glu Arg Ala Glu Thr His Ile Ala His Phe Ser Ala Ile Arg Glu Glu
1185               1190                1195                1200
gca ccc ttg gaa gcc ccg gga aat cga aca ggt cca ggt ccg agg agt    3648
Ala Pro Leu Glu Ala Pro Gly Asn Arg Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser
               1205                1210                1215
gcg gtt ccc cgc cgc gtt aag cag agc ttg aaa cag atc aga ctc ccg    3696
Ala Val Pro Arg Arg Val Lys Gln Ser Leu Lys Gln Ile Arg Leu Pro
           1220                1225                1230
cta gaa gaa ata aag cct gaa agg ggg gtg gtt ctg aat gcc acc tca    3744
Leu Glu Glu Ile Lys Pro Glu Arg Gly Val Val Leu Asn Ala Thr Ser
       1235                1240                1245
acc cgg tgg tct gaa agc agt cct atc tta caa gga gcc aaa aga aat    3792
Thr Arg Trp Ser Glu Ser Ser Pro Ile Leu Gln Gly Ala Lys Arg Asn
   1250                1255                1260
aac ctt tct tta cct ttc ctg acc ttg gaa atg gcc gga ggt caa gga    3840
Asn Leu Ser Leu Pro Phe Leu Thr Leu Glu Met Ala Gly Gly Gln Gly
1265               1270                1275                1280
aag atc agc gcc ctg ggg aaa agt gcc gca ggc ccg ctg gcg tcc ggg    3888
Lys Ile Ser Ala Leu Gly Lys Ser Ala Ala Gly Pro Leu Ala Ser Gly
               1285                1290                1295
aag ctg gag aag gct gtt ctc tct tca gca ggc ttg tct gaa gca tct    3936
Lys Leu Glu Lys Ala Val Leu Ser Ser Ala Gly Leu Ser Glu Ala Ser
           1300                1305                1310
ggc aaa gct gag ttt ctt cct aaa gtt cga gtt cat cgg gaa gac ctg    3984
Gly Lys Ala Glu Phe Leu Pro Lys Val Arg Val His Arg Glu Asp Leu
       1315                1320                1325
ttg cct caa aaa acc agc aat gtt tct tgc gca cac ggg gat ctc ggc    4032
Leu Pro Gln Lys Thr Ser Asn Val Ser Cys Ala His Gly Asp Leu Gly
   1330                1335                1340
cag gag atc ttc ctg cag aaa aca cgg gga cct gtt aac ctg aac aaa    4080
Gln Glu Ile Phe Leu Gln Lys Thr Arg Gly Pro Val Asn Leu Asn Lys
1345               1350                1355                1360
gta aat aga cct gga agg act ccc tcc aag ctt ctg ggt ccc ccg atg    4128
Val Asn Arg Pro Gly Arg Thr Pro Ser Lys Leu Leu Gly Pro Pro Met
               1365                1370                1375
ccc aaa gag tgg gaa tcc cta gag aag tca cca aaa agc aca gct ctc    4176
Pro Lys Glu Trp Glu Ser Leu Glu Lys Ser Pro Lys Ser Thr Ala Leu
           1380                1385                1390
agg acg aaa gac atc atc agt tta ccc ctg gac cgt cac gaa agc aat    4224
Arg Thr Lys Asp Ile Ile Ser Leu Pro Leu Asp Arg His Glu Ser Asn
       1395                1400                1405
cat tca ata gca gca aaa aat gaa gga caa gcc gag acc caa aga gaa    4272
His Ser Ile Ala Ala Lys Asn Glu Gly Gln Ala Glu Thr Gln Arg Glu
   1410                1415                1420
gcc gcc tgg acg aag cag gga ggg cct gga agg ctg tgc gct cca aag    4320
Ala Ala Trp Thr Lys Gln Gly Gly Pro Gly Arg Leu Cys Ala Pro Lys
1425               1430                1435                1440
cct ccg gtc ctg cga cgg cat cag agg gac ata agc ctt cct act ttt    4368
Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp Ile Ser Leu Pro Thr Phe
               1445                1450                1455
cag ccg gag gaa gac aaa atg gac tat gat gat atc ttc tca act gaa    4416
Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile Phe Ser Thr Glu
           1460                1465                1470
acg aag gga gaa gat ttt gac att tac ggt gag gat gaa aat cag gac    4464
Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Gly Glu Asp Glu Asn Gln Asp
       1475                1480                1485
cct cgc agc ttt cag aag aga acc cga cac tat ttc att gct gcg gtg    4512
Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
   1490                1495                1500
gag cag ctc tgg gat tac ggg atg agc gaa tcc ccc cgg gcg cta aga    4560
Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu Ser Pro Arg Ala Leu Arg
1505               1510                1515                1520
aac agg gct cag aac gga gag gtg cct cgg ttc aag aag gtg gtc ttc    4608
Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg Phe Lys Lys Val Val Phe
               1525                1530                1535
cgg gaa ttt gct gac ggc tcc ttc acg cag ccg tcg tac cgc ggg gaa    4656
Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Gly Glu
           1540                1545                1550
ctc aac aaa cac ttg ggg ctc ttg gga ccc tac atc aga gcg gaa gtt    4704
Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val
       1555                1560                1565
gaa gac aac atc atg gta act ttc aaa aac cag gcg tct cgt ccc tat    4752
Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr
   1570                1575                1580
tcc ttc tac tcg agc ctt att tct tat ccg gat gat cag gag caa ggg    4800
Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Pro Asp Asp Gln Glu Gln Gly
1585               1590                1595                1600
gca gaa cct cga cac aac ttc gtc cag cca aat gaa acc aga act tac    4848
Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro Asn Glu Thr Arg Thr Tyr
               1605                1610                1615
ttt tgg aaa gtg cag cat cac atg gca ccc aca gaa gac gag ttt gac    4896
Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp
           1620                1625                1630
tgc aaa gcc tgg gcc tac ttt tct gat gtt gac ctg gaa aaa gat gtg    4944
Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val
       1635                1640                1645
cac tca ggc ttg atc ggc ccc ctt ctg atc tgc cgc gcc aac acc ctg    4992
His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Arg Ala Asn Thr Leu
   1650                1655                1660
aac gct gct cac ggt aga caa gtg acc gtg caa gaa ttt gct ctg ttt    5040
Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe
1665               1670                1675                1680
ttc act att ttt gat gag aca aag agc tgg tac ttc act gaa aat gtg    5088
Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val
               1685                1690                1695
gaa agg aac tgc cgg gcc ccc tgc cac ctg cag atg gag gac ccc act    5136
Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu Gln Met Glu Asp Pro Thr
           1700                1705                1710
ctg aaa gaa aac tat cgc ttc cat gca atc aat ggc tat gtg atg gat    5184
Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Val Met Asp
       1715                1720                1725
aca ctc cct ggc tta gta atg gct cag aat caa agg atc cga tgg tat    5232
Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asn Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
   1730                1735                1740
ctg ctc agc atg ggc agc aat gaa aat atc cat tcg att cat ttt agc    5280
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser
1745               1750            1755                    1760
gga cac gtg ttc agt gta cgg aaa aag gag gag tat aaa atg gcc gtg    5328
Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val
               1765                1770                1775
tac aat ctc tat ccg ggt gtc ttt gag aca gtg gaa atg cta ccg tcc    5376
Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
           1780                1785                1790
aaa gtt gga att tgg cga ata gaa tgc ctg att ggc gag cac ctg caa    5424
Lys Val Gly Ile Trp Arg Ile Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu Gln
       1795                1800                1805
gct ggg atg agc acg act ttc ctg gtg tac agc aag gag tgt cag gct    5472
Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr Ser Lys Glu Cys Gln Ala
   1810                1815                1820
cca ctg gga atg gct tct gga cgc att aga gat ttt cag atc aca gct    5520
Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1825               1830                1835                1840
tca gga cag tat gga cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt cat tat    5568
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr
               1845                1850                1855
tcc gga tca atc aat gcc tgg agc acc aag gat ccc cac tcc tgg atc    5616
Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Asp Pro His Ser Trp Ile
           1860                1865                1870
aag gtg gat ctg ttg gca cca atg atc att cac ggc atc atg acc cag    5664
Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Met Thr Gln
       1875                1880                1885
ggt gcc cgt cag aag ttt tcc agc ctc tac atc tcc cag ttt atc atc    5712
Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
   1890                1895                1900
atg tac agt ctt gac ggg agg aac tgg cag agt tac cga ggg aat tcc    5760
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln Ser Tyr Arg Gly Asn Ser
1905               1910                1915                1920
acg ggc acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat gtg gac gca tct ggg att    5808
Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ala Ser Gly Ile
               1925                1930                1935
aaa cac aat att ttt aac cct ccg att gtg gct cgg tac atc cgt ttg    5856
Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Val Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
           1940                1945                1950
cac cca aca cat tac agc atc cgc agc act ctt cgc atg gag ttg atg    5904
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met
       1955                1960                1965
ggc tgt gat tta aac agt tgc agc atg ccc ctg gga atg cag aat aaa    5952
Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Gln Asn Lys
   1970                1975                1980
gcg ata tca gac tca cag atc acg gcc tcc tcc cac cta agc aat ata    6000
Ala Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ala Ser Ser His Leu Ser Asn Ile
1985               1990                1995                2000
ttt gcc acc tgg tct cct tca caa gcc cga ctt cac ctc cag ggg cgg    6048
Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg
               2005                2010                2015
acg aat gcc tgg cga ccc cgg gtg agc agc gca gag gag tgg ctg cag    6096
Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser Ala Glu Glu Trp Leu Gln
           2020                2025                2030
gtg gac ctg cag aag acg gtg aag gtc aca ggc atc acc acc cag ggc    6144
Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Thr Thr Gln Gly
       2035                2040                2045
gtg aag tcc ctg ctc agc agc atg tat gtg aag gag ttc ctc gtg tcc    6192
Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Val Ser
   2050                2055                2060
agt agt cag gac ggc cgc cgc tgg acc ctg ttt ctt cag gac ggc cac    6240
Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu Phe Leu Gln Asp Gly His
2065               2070                2075                2080
acg aag gtt ttt cag ggc aat cag gac tcc tcc acc ccc gtg gtg aac    6288
Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Ser Thr Pro Val Val Asn
               2085                2090                2095
gct ctg gac ccc ccg ctg ttc acg cgc tac ctg agg atc cac ccc acg    6336
Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Thr
           2100                2105                2110
agc tgg gcg cag cac atc gcc ctg agg ctc gag gtt cta gga tgt gag    6384
Ser Trp Ala Gln His Ile Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Glu
       2115                2120                2125
gca cag gat ctc tac tga                                            6402
Ala Gln Asp Leu Tyr
   2130
<210>4
<211>2133
<212>PRT
<213>猪
<400>4
Met Gln Leu Glu Leu Ser Thr Cys Val Phe Leu Cys Leu Leu Pro Leu
  1               5                  10                  15
Gly Phe Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
             20                  25                  30
Trp Asp Tyr Arg Gln Ser Glu Leu Leu Arg Glu Leu His Val Asp Thr
         35                  40                  45
Arg Phe Pro Ala Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Leu Gly Pro Ser Val
     50                  55                  60
Leu Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp Gln Leu Phe Ser
 65                  70                  75                  80
Val Ala Arg Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile
                 85                  90                  95
Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Val Thr Leu Lys Asn Met Ala
            100                 105                 110
Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Phe Trp Lys Ser
        115                 120                 125
Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Glu Asp His Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu
    130                 135                 140
Asp Asp Lys Val Leu Pro Gly Lys Ser Gln Thr Tyr Val Trp Gln Val
145                 150                 155                 160
Leu Lys Glu Asn Gly Pro Thr Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr
                165                 170                 175
Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu
            180                 185                 190
Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Thr Arg Glu Arg
        195                 200                 205
Thr Gln Asn Leu His Glu Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu
    210                 215                 220
Gly Lys Ser Trp His Ser Ala Arg Asn Asp Ser Trp Thr Arg Ala Met
225                 230                 235                 240
Asp Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Pro Ala Met His Thr Val Asn Gly
                245                 250                 255
Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser
            260                 265                 270
Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Val His Ser
        275                 280                 285
Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg His His Arg Gln Ala
    290                 295                 300
Ser Leu Glu Ile Ser Pro Leu Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu
305                 310                 315                 320
Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His His
                325                 330                 335
His Gly Gly Met Glu Ala His Val Arg Val Glu Ser Cys Ala Glu Glu
            340                 345                 350
Pro Gln Leu Arg Arg Lys Ala Asp Glu Glu Glu Asp Tyr Asp Asp Asn
        355                 360                 365
Leu Tyr Asp Ser Asp Met Asp Val Val Arg Leu Asp Gly Asp Asp Val
    370                 375                 380
Ser Pro Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385                 390                 395                 400
Trp Val His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
                405                 410                 415
Ala Val Pro Ser Pro Ser Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Leu Tyr Leu Asn
            420                 425                 430
Ser Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Ala Arg Phe Val
        435                 440                 445
Ala Tyr Thr Asp Val Thr Phe Lys Thr Arg Lys Ala Ile Pro Tyr Glu
    450                 455                 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Lys Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
                485                 490                 495
His Gly Ile Thr Asp Val Ser Ala Leu His Pro Gly Arg Leu Leu Lys
            500                 505                 510
Gly Trp Lys His Leu Lys Asp Met Pro Ile Leu Pro Gly Glu Thr Phe
        515                 520                 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
    530                 535                 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Ile Asn Leu Glu Lys
545                 550                 555                 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
                565                 570                 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
            580                 585                 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Leu Ala Glu
        595                 600                 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Asp Gly Leu Gln Pro Gln Asp
    610                 615                 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625                 630                 635                 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
                645                 650                 655
Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
            660                 665                 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
        675                 680                 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
    690                 695                 700
Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Leu Arg Asn Arg Gly
705                 710                 715                 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Tyr Ser Cys Asp Arg Asp Ile Gly Asp
                725                 730                 735
Tyr Tyr Asp Asn Thr Tyr Glu Asp Ile Pro Gly Phe Leu Leu Ser Gly
            740                 745                 750
Lys Asn Val Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro
        755                 760                 765
Ser Ala Ser Gln Lys Gln Phe Gln Thr Ile Thr Ser Pro Glu Asp Asp
    770                 775                 780
Val Glu Leu Asp Pro Gln Ser Gly Glu Arg Thr Gln Ala Leu Glu Glu
785                 790                 795                 800
Leu Ser Val Pro Ser Gly Asp Gly Ser Met Leu Leu Gly Gln Asn Pro
                805                 810                 815
Ala Pro His Gly Ser Ser Ser Ser Asp Leu Gln Glu Ala Arg Asn Glu
            820                 825                 830
Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gly Ala Arg Glu Arg Asn Thr Ala Pro Ser
        835                 840                 845
Ala Ala Ala Arg Leu Arg Pro Glu Leu His His Ser Ala Glu Arg Val
    850                 855                 860
Leu Thr Pro Glu Pro Glu Lys Glu Leu Lys Lys Leu Asp Ser Lys Met
865                 870                 875                 880
Ser Ser Ser Ser Asp Leu Leu Lys Thr Ser Pro Thr Ile Pro Ser Asp
                885                 890                 895
Thr Leu Ser Ala Glu Thr Glu Arg Thr His Ser Leu Gly Pro Pro His
            900                 905                 910
Pro Gln Val Asn Phe Arg Ser Gln Leu Gly Ala Ile Val Leu Gly Lys
        915                 920                 925
Asn Ser Ser His Phe Ile Gly Ala Gly Val Pro Leu Gly Ser Thr Glu
    930                 935                 940
Glu Asp His Glu Ser Ser Leu Gly Glu Asn Val Ser Pro Val Glu Ser
945                 950                 955                 960
Asp Gly Ile Phe Glu Lys Glu Arg Ala His Gly Pro Ala Ser Leu Thr
                965                 970                 975
Lys Asp Asp Val Leu Phe Lys Val Asn Ile Ser Leu Val Lys Thr Asn
            980                 985                 990
Lys Ala Arg Val Tyr Leu Lys Thr Asn Arg Lys Ile His Ile Asp Asp
        995                1000                1005
Ala Ala Leu Leu Thr Glu Asn Arg Ala Ser Ala Thr Phe Met Asp Lys
   1010                1015                1020
Asn Thr Thr Ala Ser Gly Leu Asn His Val Ser Asn Trp Ile Lys Gly
1025               1030                1035                1040
Pro Leu Gly Lys Asn Pro Leu Ser Ser Glu Arg Gly Pro Ser Pro Glu
               1045                1050                1055
Leu Leu Thr Ser Ser Gly Ser Gly Lys Ser Val Lys Gly Gln Ser Ser
           1060                1065                1070
Gly Gln Gly Arg Ile Arg Val Ala Val Glu Glu Glu Glu Leu Ser Lys
       1075                1080                1085
Gly Lys Glu Met Met Leu Pro Asn Ser Glu Leu Thr Phe Leu Thr Asn
   1090                1095                1100
Ser Ala Asp Val Gln Gly Asn Asp Thr His Ser Gln Gly Lys Lys Ser
1105              1110                 1115                1120
Arg Glu Glu Met Glu Arg Arg Glu Lys Leu Val Gln Glu Lys Val Asp
               1125                1130                1135
Leu Pro Gln Val Tyr Thr Ala Thr Gly Thr Lys Asn Phe Leu Arg Asn
           1140                1145                1150
Ile Phe His Gln Ser Thr Glu Pro Ser Val Glu Gly Phe Asp Gly Gly
       1155                1160                1165
Ser His Ala Pro Val Pro Gln Asp Ser Arg Ser Leu Asn Asp Ser Ala
   1170                1175                1180
Glu Arg Ala Glu Thr His Ile Ala His Phe Ser Ala Ile Arg Glu Glu
1185               1190                1195                1200
Ala Pro Leu Glu Ala Pro Gly Asn Arg Thr Gly Pro Gly Pro Arg Ser
               1205                1210                1215
Ala Val Pro Arg Arg Val Lys Gln Ser Leu Lys Gln Ile Arg Leu Pro
           1220                1225                1230
Leu Glu Glu Ile Lys Pro Glu Arg Gly Val Val Leu Asn Ala Thr Ser
       1235                1240                1245
Thr Arg Trp Ser Glu Ser Ser Pro Ile Leu Gln Gly Ala Lys Arg Asn
   1250                1255                1260
Asn Leu Ser Leu Pro Phe Leu Thr Leu Glu Met Ala Gly Gly Gln Gly
1265               1270                1275                1280
Lys Ile Ser Ala Leu Gly Lys Ser Ala Ala Gly Pro Leu Ala Ser Gly
               1285                1290                1295
Lys Leu Glu Lys Ala Val Leu Ser Ser Ala Gly Leu Ser Glu Ala Ser
           1300                1305                1310
Gly Lys Ala Glu Phe Leu Pro Lys Val Arg Val His Arg Glu Asp Leu
       1315                1320                1325
Leu Pro Gln Lys Thr Ser Asn Val Ser Cys Ala His Gly Asp Leu Gly
   1330                1335                1340
Gln Glu Ile Phe Leu Gln Lys Thr Arg Gly Pro Val Asn Leu Asn Lys
1345               1350                1355                1360
Val Asn Arg Pro Gly Arg Thr Pro Ser Lys Leu Leu Gly Pro Pro Met
               1365                1370                1375
Pro Lys Glu Trp Glu Ser Leu Glu Lys Ser Pro Lys Ser Thr Ala Leu
           1380                1385                1390
Arg Thr Lys Asp Ile Ile Ser Leu Pro Leu Asp Arg His Glu Ser Asn
       1395                1400                1405
His Ser Ile Ala Ala Lys Asn Glu Gly Gln Ala Glu Thr Gln Arg Glu
   1410                1415                1420
Ala Ala Trp Thr Lys Gln Gly Gly Pro Gly Arg Leu Cys Ala Pro Lys
1425               1430                1435                1440
Pro Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg Asp Ile Ser Leu Pro Thr Phe
               1445                1450                1455
Gln Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile Phe Ser Thr Glu
           1460                1465                1470
Thr Lys Gly Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Gly Glu Asp Glu Asn Gln Asp
       1475                1480                1485
Pro Arg Ser Phe Gln Lys Arg Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
   1490                1495                1500
Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Glu Ser Pro Arg Ala Leu Arg
1505               1510                1515                1520
Asn Arg Ala Gln Asn Gly Glu Val Pro Arg Phe Lys Lys Val Val Phe
               1525                1530                1535
Arg Glu Phe Ala Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Gly Glu
           1540                1545                1550
Leu Asn Lys His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val
       1555                1560                1565
Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr
   1570                1575                1580
Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Pro Asp Asp Gln Glu Gln Gly
1585               1590                1595                1600
Ala Glu Pro Arg His Asn Phe Val Gln Pro Asn Glu Thr Arg Thr Tyr
               1605                1610                1615
Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp
           1620                1625                1630
Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val
       1635                1640                1645
His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Arg Ala Asn Thr Leu
   1650                1655                1660
Asn Ala Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe
1665               1670                1675                1680
Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val
               1685                1690                1695
Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys His Leu Gln Met Glu Asp Pro Thr
           1700                1705                1710
Leu Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Val Met Asp
       1715                1720                1725
Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asn Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
   1730                1735                1740
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser
1745               1750                1755                1760
Gly His Val Phe Ser Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val
               1765                1770                1775
Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
           1780                1785                1790
Lys Val Gly Ile Trp Arg Ile Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu Gln
       1795                1800                1805
Ala Gly Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Tyr Ser Lys Glu Cys Gln Ala
   1810                1815                1820
Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly Arg Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
1825               1830                1835                1840
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr
               1845                1850                1855
Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Asp Pro His Ser Trp Ile
           1860                1865                1870
Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Met Thr Gln
       1875                1880                1885
Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
   1890                1895                1900
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Arg Asn Trp Gln Ser Tyr Arg Gly Asn Ser
1905               1910                1915                1920
Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ala Ser Gly Ile
               1925                1930                1935
Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Val Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
           1940                1945                1950
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met
       1955                1960                1965
Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Gln Asn Lys
   1970                1975                1980
Ala Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ala Ser Ser His Leu Ser Asn Ile
1985               1990                1995                2000
Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg
               2005                2010                2015
Thr Asn Ala Trp Arg Pro Arg Val Ser Ser Ala Glu Glu Trp Leu Gln
           2020                2025                2030
Val Asp Leu Gln Lys Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Thr Thr Gln Gly
       2035                2040                2045
Val Lys Ser Leu Leu Ser Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Val Ser
   2050                2055                2060
Ser Ser Gln Asp Gly Arg Arg Trp Thr Leu Phe Leu Gln Asp Gly His
2065               2070                2075                2080
Thr Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Ser Thr Pro Val Val Asn
               2085                2090                2095
Ala Leu Asp Pro Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Thr
           2100                2105                2110
Ser Trp Ala Gln His Ile Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Glu
       2115                2120                2125
Ala Gln Asp Leu Tyr
   2130
<210>5
<211>7493
<212>DNA
<213>小鼠
<400>5
tctagagttt ctttgctaca ggtaccaagg aacagtcttt tagaataggc taggaattta 60
aatacacctg aacgcccctc ctcagtattc tgttcctttt cttaaggatt caaacttgtt 120
aggatgcacc cagcaggaaa tgggttaagc cttagctcag ccactcttcc tattccagtt 180
ttcctgtgcc tgcttcctac tacccaaaag gaagtaatcc ttcagatctg ttttgtgcta 240
atgctacttt cactcacagt agataaactt ccagaaaatc ctctgcaaaa tatttaggac 300
tttttactaa atcattacat ttctttttgt tcttaaaagc taaagttatt ttagagaaga 360
gttaaatttt catttcttta gttgaacatt ttctagtaat aaaagccatg caaatagcac 420
tcttcgcttg cttctttctg agccttttca atttctgctc tagtgccatc agaagatact 480
accttggtgc agtggaattg tcctggaact atattcagag tgatctgctc agtgtgctgc 540
atacagactc aagatttctt cctagaatgt caacatcttt tccattcaac acctccatca 600
tgtataaaaa gactgtgttt gtagagtaca aggaccagct tttcaacatt gccaagccca 660
ggccaccctg gatgggtttg ctaggtccta ccatttggac tgaggttcat gacacagtgg 720
tcattacact taaaaacatg gcttctcatc ctgtcagtct tcatgctgtt ggtgtgtcct 780
actggaaagc ttctgaggga gatgaatatg aagatcagac aagccaaatg gagaaggaag 840
atgataaagt tttccctggt gaaagtcata cttatgtttg gcaagtcctg aaagagaatg 900
gtccaatggc ctctgaccct ccatgtctca cttactcata tatgtctcat gtggatctgg 960
tgaaagattt gaattcaggc ctcattggag ctctgctagt atgtaaagaa ggcagtctct 1020
ccaaagaaag aacacagatg ttgtaccaat ttgtactgct ttttgctgta tttgatgaag 1080
ggaagagctg gcactcagaa acaaacgact cttatacaca gtctatggat tctgcatctg 1140
ctagagactg gcctaaaatg cacacagtca atggctatgt aaacaggtct cttccaggtc 1200
tgattggatg ccataggaaa tcagtctact ggcacgtgat tggaatgggc accactcctg 1260
aaatacactc aatattcctc gaaggtcaca cattttttgt gaggaaccac cgtcaagctt 1320
cattggagat atcaccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgata gatcttgggc 1380
agttcctact attttgtcat atctcttccc ataaacatga tggcatggaa gcttatgtca 1440
aagtagatag ctgccctgag gaatcccaat ggcaaaagaa aaataataat gaggaaatgg 1500
aagattatga tgatgatctt tattcagaaa tggatatgtt cacattggat tatgacagct 1560
ctccttttat ccaaattcgc tcggttgcta aaaagtaccc taaaacttgg atacattata 1620
tttctgctga ggaggaagac tgggactatg caccttcagt tcctacctcg gataatggaa 1680
gttataaaag ccagtatctg agcaatggtc ctcatcggat tggtaggaaa tataaaaaag 1740
tcagatttat agcatacaca gatgaaacct ttaagactcg tgaaactatt cagcatgaat 1800
caggactctt gggaccttta ctttatggag aagttggaga cacactgttg attattttta 1860
agaatcaagc aagccgacca tataacattt accctcatgg aatcactgat gtcagtcctc 1920
tacatgcaag gagattgcca agaggtataa agcacgtgaa ggatttgcca attcatccag 1980
gagagatatt caagtacaag tggacagtta cagtagaaga tggaccaact aaatcagatc 2040
cacggtgcct gacccgctat tattcaagtt tcattaaccc tgagagagat ctagcttcag 2100
gactgattgg ccctcttctc atctgctaca aagaatctgt agatcaaagg ggaaaccaga 2160
tgatgtcaga caaaagaaat gtcatcctgt tttctatatt tgatgagaac caaagctggt 2220
acatcacaga gaacatgcaa cgcttcctcc ccaatgcagc taaaacacag ccccaggacc 2280
ctgggttcca ggcctccaac atcatgcaca gcatcaatgg ctatgttttt gatagcttgg 2340
agttgacagt ttgtttgcat gaggtggcat actggcacat tctcagtgtt ggagcacaga 2400
cagacttctt atctatcttc ttctctggat atactttcaa acacaaaatg gtctatgaag 2460
atacacttac cctgttccca ttctcaggag aaactgtctt tatgtcgatg gaaaacccag 2520
gtctatgggt cttggggtgt cataattcag actttcggaa gagaggtatg acagcattgc 2580
tgaaagtttc tagttgtgac aagagcacta gtgattatta tgaagaaata tatgaagata 2640
ttccaacaca gttggtgaat gagaacaatg tcattgatcc cagaagcttc ttccagaata 2700
caaatcatcc taatactagg aaaaagaaat tcaaagattc cacaattcca aaaaatgata 2760
tggagaagat tgagcctcag tttgaagaga tagcagagat gcttaaagta cagagtgtct 2820
cagttagtga catgttgatg ctcttgggac agagtcatcc tactccacat ggcttatttt 2880
tatcagatgg ccaagaagcc atctatgagg ctattcatga tgatcattca ccaaatgcaa 2940
tagacagcaa tgaaggccca tctaaagtga cccaactcag gccagaatcc catcacagtg 3000
agaaaatagt atttactcct cagcccggcc tccagttaag atccaataaa agtttggaga 3060
caactataga agtaaagtgg aagaaacttg gtttgcaagt ttctagtttg ccaagtaatc 3120
taatgactac aacaattctg tcagacaatt tgaaagcaac ttttgaaaag acagattctt 3180
caggatttcc agatatgcca gttcactcta gtagtaaatt aagtactact gcatttggta 3240
agaaagcata ttcccttgtt gggtctcatg tacctttaaa cgcgagtgaa gaaaatagtg 3300
attccaacat attggattca actttaatgt atagtcaaga aagtttacca agagataata 3360
tattatcaat agagaatgat agattactca gagagaagag gtttcatgga attgctttat 3420
tgaccaaaga taatacttta ttcaaagaca atgtctcctt aatgaaaaca aacaaaacat 3480
ataatcattc aacaactaat gaaaaactac acactgagag cccaacatca attgagaata 3540
gtacaacaga cttgcaagat gccatattaa aggtcaatag tgagattcaa gaagtaacag 3600
ctttgattca tgatggaaca cttttaggca aaaattctac atatttgaga ctaaaccata 3660
tgctaaatag aactacctca acaaaaaata aagacatatt tcatagaaaa gatgaagatc 3720
ctattccaca agatgaagag aatacaatca tgccattttc caagatgttg ttcttgtcag 3780
aatcttcaaa ttggtttaaa aagaccaatg gaaataattc cttgaactct gagcaagaac 3840
atagtccaaa gcaattagta tatttaatgt ttaaaaaata tgtaaaaaat caaagtttct 3900
tgtcagagaa aaataaagtc acagtagaac aggatggatt tacaaagaac ataggactta 3960
aagacatggc ttttccacat aatatgagca tatttcttac cactttgtct aacgtacatg 4020
aaaatggtag gcacaatcaa gaaaaaaata ttcaggaaga gatagagaag gaagcactaa 4080
ttgaagagaa agtagttttg ccccaggtgc acgaagcaac tggctctaag aatttcttga 4140
aagacatatt gatactaggc actaggcaaa atataagttt atatgaagta catgtaccag 4200
tacttcaaaa catcacatca ataaacaatt caacaaatac agtacagatt cacatggagc 4260
atttctttaa aagaaggaag gacaaggaaa caaattcaga aggcttggta aataaaacca 4320
gagaaatggt aaaaaactat ccaagccaga agaatattac tactcaacgt agtaaacggg 4380
ctttgggaca attcagactg tcaactcaat ggcttaaaac cataaactgt tcaacacagt 4440
gtatcattaa acagatagac cacagcaagg aaatgaaaaa gttcattact aaatcttcct 4500
tatcagattc ttctgtgatt aaaagcacca ctcagacaaa tagttctgac tcacacattg 4560
taaaaacatc agcatttcca ccaatagatc tcaaaaggag tccattccaa aacaaatttt 4620
ctcatgttca agcatcatcc tacatttatg actttaagac aaaaagttca agaattcaag 4680
aaagcaataa tttcttaaaa gaaaccaaaa taaataaccc ttctttagcc attctaccat 4740
ggaatatgtt catagatcaa ggaaaattta cctccccagg gaaaagtaac acaaactcag 4800
tcacatataa gaaacgtgag aacattattt tcttgaaacc aactttgcct gaagaatctg 4860
gcaaaattga attgcttcct caagtttcca ttcaagagga agaaatttta cctacagaaa 4920
ctagccatgg atctcctgga cacttgaatc tcatgaaaga ggtctttctt cagaaaatac 4980
aggggcctac taaatggaat aaagcaaaga ggcatggaga aagtataaaa ggtaaaacag 5040
agagctctaa aaatactcgc tcaaaactgc taaatcatca tgcttgggat tatcattatg 5100
ctgcacagat accaaaagat atgtggaaat ccaaagagaa gtcaccagaa attatatcca 5160
ttaagcaaga ggacaccatt ttgtctctga ggcctcatgg aaacagtcat tcaatagggg 5220
caaatgagaa acaaaattgg cctcaaagag aaaccacttg ggtaaagcaa ggccaaactc 5280
aaaggacatg ctctcaaatc ccaccagtgt tgaaacgaca tcaaagggaa cttagtgctt 5340
ttcaatcaga acaagaagca actgactatg atgatgccat caccattgaa acaatcgagg 5400
attttgacat ttacagtgag gacataaagc aaggtccccg cagctttcaa cagaaaacaa 5460
ggcactattt tattgcagct gtggaacgac tctgggacta tgggatgagt acatctcatg 5520
ttctacgaaa taggtatcaa agtgacaatg tacctcagtt caagaaagta gttttccagg 5580
aatttactga tggctccttt agtcagccct tatatcgtgg agaattaaat gaacacctgg 5640
ggttgttggg cccatatata agagcagaag ttgaagacaa cattatggta actttcaaaa 5700
accaggcctc ccgtccctac tccttctatt ctagcctcat ttcttataaa gaagatcaga 5760
gaggagaaga acctagaaga aactttgtca agcctaatga aaccaaaatt tatttttgga 5820
aagtacaaca tcatatggca cccacagaag atgagtttga ctgcaaggcc tgggcttatt 5880
tctctgatgt tgatcttgaa agagatatgc actcgggatt aattggaccc cttctgattt 5940
gccacgcgaa cacactgaat cctgctcatg ggagacaagt gtcagtacag gaatttgctc 6000
tgcttttcac tatctttgat gagaccaaga gctggtactt cactgaaaac gtgaaaagga 6060
actgcaagac accctgcaat ttccagatgg aagaccccac tttgaaagag aattatcgct 6120
tccatgcaat caatggttat gtaatggata ccctaccagg cttagtaatg gctcaagatc 6180
aaaggattcg atggtatctt ctcagcatgg gcaacaatga gaacatccaa tctattcatt 6240
tcagtggaca tgttttcact gtacggaaaa aagaggagta taaaatggca gtgtacaacc 6300
tctacccagg tgtttttgag actctggaaa tgataccatc cagagctgga atatggcgag 6360
tagaatgcct tattggcgag cacttacagg ctgggatgag cactcttttt ctggtgtaca 6420
gcaagcagtg tcagattcct cttggaatgg cttctggaag catccgtgat ttccagatta 6480
cagcttcagg acattatgga cagtgggccc caaacctggc aagacttcat tattccggat 6540
caatcaatgc ctggagtacc aaggagccct tttcttggat caaggtagat ctgttggcac 6600
caatgattgt tcatggcatc aagactcagg gtgctcgtca gaaattttcc agcctttata 6660
tctctcaatt tatcatcatg tatagcctgg atgggaagaa gtggctgagt tatcaaggaa 6720
attccactgg aaccttaatg gttttctttg gcaatgtgga ctcatctggg attaagcata 6780
atagttttaa tcctccaatt attgctcgat atatccgttt gcaccccact cattctagca 6840
tccgtagtac tcttcgcatg gagttgatgg gctgtgattt aaacagttgc agcataccat 6900
tgggaatgga aagtaaagta atatcagata cacaaatcac tgcctcatcc tacttcacca 6960
acatgtttgc tacttggtct ccttcacaag ctcgacttca cctccaggga aggactaatg 7020
cctggcgacc tcaggtgaat gatccaaaac aatggttgca agtggactta caaaagacaa 7080
tgaaagtcac tggaataata acccagggag tgaaatctct ctttaccagc atgtttgtga 7140
aagagttcct tatttccagc agtcaagatg gccatcactg gactcaaatt ttatacaatg 7200
gcaaggtaaa ggtttttcag gggaatcagg actcatccac acctatgatg aattctctag 7260
acccaccatt actcactcgc tatcttcgaa ttcaccccca gatctgggag caccaaattg 7320
ctctgaggct tgagattcta ggatgtgagg cccagcagca atactgaggt agcctctgca 7380
tcacctgctt attccccttc ctcagctcaa agattgtctt aatgttttat tgctgtgaag 7440
agacactatg accatggcaa ctctttataa aataaagcat ttaatcaggg ctt        7493
<210>6
<211>2319
<212>PRT
<213>小鼠
<400>6
Met Gln Ile Ala Leu Phe Ala Cys Phe Phe Leu Ser Leu Phe Asn Phe
  1               5                  10                  15
Cys Ser Ser Ala Ile Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
             20                  25                  30
Trp Asn Tyr Ile Gln Ser Asp Leu Leu Ser Val Leu His Thr Asp Ser
         35                  40                  45
Arg Phe Leu Pro Arg Met Ser Thr Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Ile
     50                  55                  60
Met Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Tyr Lys Asp Gln Leu Phe Asn
 65                  70                  75                  80
Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile
                 85                  90                  95
Trp Thr Glu Val His Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala
            100                 105                 110
Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala
        115                 120                 125
Ser Glu Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Gln Thr Ser Gln Met Glu Lys Glu
    130                 135                 140
Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Glu Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val
145                 150                 155                 160
Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Pro Cys Leu Thr Tyr
                165                 170                 175
Ser Tyr Met Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu
            180                 185                 190
Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Lys Glu Gly Ser Leu Ser Lys Glu Arg
        195                 200                 205
Thr Gln Met Leu Tyr Gln Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu
    210                 215                 220
Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Asn Asp Ser Tyr Thr Gln Ser Met
225                 230                 235                 240
Asp Ser Ala Ser Ala Arg Asp Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly
                245                 250                 255
Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser
            260                 265                 270
Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Ile His Ser
        275                 280                 285
Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Phe Val Arg Asn His Arg Gln Ala
    290                 295                 300
Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu
305                 310                 315                 320
Ile Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Lys
                325                 330                 335
His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu
            340                 345                 350
Ser Gln Trp Gln Lys Lys Asn Asn Asn Glu Glu Met Glu Asp Tyr Asp
        355                 360                 365
Asp Asp Leu Tyr Ser Glu Met Asp Met Phe Thr Leu Asp Tyr Asp Ser
    370                 375                 380
Ser Pro Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys Tyr Pro Lys Thr
385                 390                 395                 400
Trp Ile His Tyr Ile Ser Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
                405                 410                 415
Ser Val Pro Thr Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Ser
            420                 425                 430
Asn Gly Pro His Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Ile
        435                 440                 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Thr Ile Gln His Glu
    450                 455                 460
Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465                 470                 475                 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
                485                 490                 495
His Gly Ile Thr Asp Val Ser Pro Leu His Ala Arg Arg Leu Pro Arg
            500                 505                 510
Gly Ile Lys His Val Lys Asp Leu Pro Ile His Pro Gly Glu Ile Phe
        515                 520                 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
    530                 535                 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Ile Asn Pro Glu Arg
545                 550                 555                 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
                565                 570                 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Met Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
            580                 585                 590
Ile Leu Phe Ser Ile Phe Asp Glu Asn Gln Ser Trp Tyr Ile Thr Glu
        595                 600                 605
Asn Met Gln Arg Phe Leu Pro Asn Ala Ala Lys Thr Gln Pro Gln Asp
    610                 615                 620
Pro Gly Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625                 630                 635                 640
Phe Asp Ser Leu Glu Leu Thr Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
                645                 650                 655
His Ile Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Ile Phe Phe
            660                 665                 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
        675                 680                 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
    690                 695                 700
Gly Leu Trp Val Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Lys Arg Gly
705                 710                 715                 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Ser Thr Ser Asp
                725                 730                 735
Tyr Tyr Glu Glu Ile Tyr Glu Asp Ile Pro Thr Gln Leu Val Asn Glu
            740                 745                 750
Asn Asn Val Ile Asp Pro Arg Ser Phe Phe Gln Asn Thr Asn His Pro
        755                 760                 765
Asn Thr Arg Lys Lys Lys Phe Lys Asp Ser Thr Ile Pro Lys Asn Asp
    770                 775                 780
Met Glu Lys Ile Glu Pro Gln Phe Glu Glu Ile Ala Glu Met Leu Lys
785                 790                 795                 800
Val Gln Ser Val Ser Val Ser Asp Met Leu Met Leu Leu Gly Gln Ser
                805                 810                 815
His Pro Thr Pro His Gly Leu Phe Leu Ser Asp Gly Gln Glu Ala Ile
            820                 825                 830
Tyr Glu Ala Ile His Asp Asp His Ser Pro Asn Ala Ile Asp Ser Asn
        835                 840                 845
Glu Gly Pro Ser Lys Val Thr Gln Leu Arg Pro Glu Ser His His Ser
    850                 855                 860
Glu Lys Ile Val Phe Thr Pro Gln Pro Gly Leu Gln Leu Arg Ser Asn
865                 870                 875                 880
Lys Ser Leu Glu Thr Thr Ile Glu Val Lys Trp Lys Lys Leu Gly Leu
                885                 890                 895
Gln Val Ser Ser Leu Pro Ser Asn Leu Met Thr Thr Thr Ile Leu Ser
            900                 905                 9l0
Asp Asn Leu Lys Ala Thr Phe Glu Lys Thr Asp Ser Ser Gly Phe Pro
        915                 920                 925
Asp Met Pro Val His Ser Ser Ser Lys Leu Ser Thr Thr Ala Phe Gly
    930                 935                 940
Lys Lys Ala Tyr Ser Leu Val Gly Ser His Val Pro Leu Asn Ala Ser
945                 950                 955                 960
Glu Glu Asn Ser Asp Ser Asn Ile Leu Asp Ser Thr Leu Met Tyr Ser
                965                 970                 975
Gln Glu Ser Leu Pro Arg Asp Asn Ile Leu Ser Ile Glu Asn Asp Arg
            980                 985                 990
Leu Leu Arg Glu Lys Arg Phe His Gly Ile Ala Leu Leu Thr Lys Asp
        995                1000                1005
Asn Thr Leu Phe Lys Asp Asn Val Ser Leu Met Lys Thr Asn Lys Thr
   1010                1015                1020
Tyr Asn His Ser Thr Thr Asn Glu Lys Leu His Thr Glu Ser Pro Thr
1025               1030                1035                1040
Ser Ile Glu Asn Ser Thr Thr Asp Leu Gln Asp Ala Ile Leu Lys Val
               1045                1050                1055
Asn Ser Glu Ile Gln Glu Val Thr Ala Leu Ile His Asp Gly Thr Leu
           1060                1065                1070
Leu Gly Lys Asn Ser Thr Tyr Leu Arg Leu Asn His Met Leu Asn Arg
       1075                1080                1085
Thr Thr Ser Thr Lys Asn Lys Asp Ile Phe His Arg Lys Asp Glu Asp
   1090                1095                1100
Pro Ile Pro Gln Asp Glu Glu Asn Thr Ile Met Pro Phe Ser Lys Met
1105               1110                1115                1120
Leu Phe Leu Ser Glu Ser Ser Asn Trp Phe Lys Lys Thr Asn Gly Asn
               1125                1130                1135
Asn Ser Leu Asn Ser Glu Gln Glu His Ser Pro Lys Gln Leu Val Tyr
           1140                1145                1150
Leu Met Phe Lys Lys Tyr Val Lys Asn Gln Ser Phe Leu Ser Glu Lys
       1155                1160                1165
Asn Lys Val Thr Val Glu Gln Asp Gly Phe Thr Lys Asn Ile Gly Leu
   1170                1175                1180
Lys Asp Met Ala Phe Pro His Asn Met Ser Ile Phe Leu Thr Thr Leu
1185               1190                1195                1200
Ser Asn Val His Glu Asn Gly Arg His Asn Gln Glu Lys Asn Ile Gln
               1205                1210                1215
Glu Glu Ile Glu Lys Glu Ala Leu Ile Glu Glu Lys Val Val Leu Pro
           1220                1225                1230
Gln Val His Glu Ala Thr Gly Ser Lys Asn Phe Leu Lys Asp Ile Leu
       1235                1240                1245
Ile Leu Gly Thr Arg Gln Asn Ile Ser Leu Tyr Glu Val His Val Pro
   1250                1255                1260
Val Leu Gln Asn Ile Thr Ser Ile Asn Asn Ser Thr Asn Thr Val Gln
1265               1270                1275                1280
Ile His Met Glu His Phe Phe Lys Arg Arg Lys Asp Lys Glu Thr Asn
               1285                1290                1295
Ser Glu Gly Leu Val Asn Lys Thr Arg Glu Met Val Lys Asn Tyr Pro
           1300                1305                1310
Ser Gln Lys Asn Ile Thr Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Gly Gln
       1315                1320                1325
Phe Arg Leu Ser Thr Gln Trp Leu Lys Thr Ile Asn Cys Ser Thr Gln
   1330                1335                1340
Cys Ile Ile Lys Gln Ile Asp His Ser Lys Glu Met Lys Lys Phe Ile
1345               1350                1355                1360
Thr Lys Ser Ser Leu Ser Asp Ser Ser Val Ile Lys Ser Thr Thr Gln
               1365                1370                1375
Thr Asn Ser Ser Asp Ser His Ile Val Lys Thr Ser Ala Phe Pro Pro
           1380                1385                1390
Ile Asp Leu Lys Arg Ser Pro Phe Gln Asn Lys Phe Ser His Val Gln
       1395                1400                1405
Ala Ser Ser Tyr Ile Tyr Asp Phe Lys Thr Lys Ser Ser Arg Ile Gln
   1410                1415                1420
Glu Ser Asn Asn Phe Leu Lys Glu Thr Lys Ile Asn Asn Pro Ser Leu
1425               1430                1435                1440
Ala Ile Leu Pro Trp Asn Met Phe Ile Asp Gln Gly Lys Phe Thr Ser
               1445                1450                1455
Pro Gly Lys Ser Asn Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys Lys Arg Glu Asn
           1460                1465                1470
Ile Ile Phe Leu Lys Pro Thr Leu Pro Glu Glu Ser Gly Lys Ile Glu
       1475                1480                1485
Leu Leu Pro Gln Val Ser Ile Gln Glu Glu Glu Ile Leu Pro Thr Glu
   1490                1495                1500
Thr Ser His Gly Ser Pro Gly His Leu Asn Leu Met Lys Glu Val Phe
1505               1510                1515                1520
Leu Gln Lys Ile Gln Gly Pro Thr Lys Trp Asn Lys Ala Lys Arg His
               1525                1530                1535
Gly Glu Ser Ile Lys Gly Lys Thr Glu Ser Ser Lys Asn Thr Arg Ser
           1540                1545                1550
Lys Leu Leu Asn His His Ala Trp Asp Tyr His Tyr Ala Ala Gln Ile
       1555                1560                1565
Pro Lys Asp Met Trp Lys Ser Lys Glu Lys Ser Pro Glu Ile Ile Ser
   1570                1575                1580
Ile Lys Gln Glu Asp Thr Ile Leu Ser Leu Arg Pro His Gly Asn Ser
1585               1590                1595                1600
His Ser Ile Gly Ala Asn Glu Lys Gln Asn Trp Pro Gln Arg Glu Thr
               1605                1610                1615
Thr Trp Val Lys Gln Gly Gln Thr Gln Arg Thr Cys Ser Gln Ile Pro
           1620                1625                1630
Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Leu Ser Ala Phe Gln Ser Glu
       1635                1640                1645
Gln Glu Ala Thr Asp Tyr Asp Asp Ala Ile Thr Ile Glu Thr Ile Glu
   1650                1655                1660
Asp Phe Asp Ile Tyr Ser Glu Asp Ile Lys Gln Gly Pro Arg Ser Phe
1665               1670                1675                1680
Gln Gln Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
               1685                1690                1695
Asp Tyr Gly Met Ser Thr Ser His Val Leu Arg Asn Arg Tyr Gln Ser
           1700                1705                1710
Asp Asn Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp
       1715                1720                1725
Gly Ser Phe Ser Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu
   1730                1735                1740
Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met
1745               1750                1755                1760
Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
               1765                1770                1775
Leu Ile Ser Tyr Lys Glu Asp Gln Arg Gly Glu Glu Pro Arg Arg Asn
           1780                1785                1790
Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Ile Tyr Phe Trp Lys Val Gln His
       1795                1800                1805
His Met Ala Pro Thr Glu Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr
   1810                1815                1820
Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Arg Asp Met His Ser Gly Leu Ile Gly
1825               1830                1835                1840
Pro Leu Leu Ile Cys His Ala Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg
               1845                1850                1855
Gln Val Ser Val Gln Glu Phe Ala Leu Leu Phe Thr Ile Phe Asp Glu
           1860                1865                1870
Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Val Lys Arg Asn Cys Lys Thr
       1875                1880                1885
Pro Cys Asn Phe Gln Met Glu Asp Pro Thr Leu Lys Glu Asn Tyr Arg
   1890                1895                1900
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Val Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val
1905               1910                1915                1920
Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Asn
               1925                1930                1935
Asn Glu Asn Ile Gln Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val
           1940                1945                1950
Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly
       1955                1960                1965
Val Phe Glu Thr Leu Glu Met Ile Pro Ser Arg Ala Gly Ile Trp Arg
   1970                1975                1980
Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu Gln Ala Gly Met Ser Thr Leu
1985               1990                1995                2000
Phe Leu Val Tyr Ser Lys Gln Cys Gln Ile Pro Leu Gly Met Ala Ser
               2005                2010                2015
Gly Ser Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly His Tyr Gly Gln
           2020                2025                2030
Trp Ala Pro Asn Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
       2035                2040                2045
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala
   2050                2055                2060
Pro Met Ile Val His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
2065               2070                2075                2080
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly
               2085                2090                2095
Lys Lys Trp Leu Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val
           2100                2105                2110
Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ser Phe Asn
       2115                2120                2125
Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Ser Ser
   2130                2135                2140
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser
2145               2150                2155                2160
Cys Ser Ile Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Val Ile Ser Asp Thr Gln
               2165                2170                2175
Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro
           2180                2185                2190
Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Thr Asn Ala Trp Arg Pro
       2195                2200                2205
Gln Val Asn Asp Pro Lys Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu Gln Lys Thr
   2210                2215                2220
Met Lys Val Thr Gly Ile Ile Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Phe Thr
2225               2230                2235                2240
Ser Met Phe Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His
               2245                2250                2255
His Trp Thr Gln Ile Leu Tyr Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly
           2260                2265                2270
Asn Gln Asp Ser Ser Thr Pro Met Met Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
       2275                2280                2285
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ile Trp Glu His Gln Ile
   2290                2295                2300
Ala Leu Arg Leu Glu Ile Leu Gly Cys Glu Ala Gln Gln Gln Tyr
2305               2310                2315

Claims (67)

1.一种修饰因子VIII，其特征在于，所述因子包括对应于人因子VIII的C2结构域中一个或多个位置的氨基酸取代，所述位置选自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
2.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，所述因子缺乏B结构域。
3.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或赖氨酸取代精氨酸2215。
4.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或赖氨酸取代精氨酸2220。
5.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，包括苯丙氨酸取代色氨酸2313。
6.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸取代精氨酸2320。
7.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或丝氨酸取代苯丙氨酸2290。
8.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，包括组氨酸或丙氨酸取代酪氨酸2195。
9.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，包括亮氨酸或丙氨酸取代苯丙氨酸2196。
10.一种修饰人因子VIII，其特征在于，所述因子包括C2结构域中对应于一个或多个位置的氨基酸取代，所述位置选自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
11.如权利要求10所述的修饰人因子VIII，其特征在于，所述因子缺乏B结构域。
12.如权利要求10或11所述的修饰人因子VIII，其特征在于，氨基酸取代在位置2215。
13.如权利要求10或11所述的修饰人因子VIII，其特征在于，氨基酸取代在位置2220。
14.如权利要求10或11所述的修饰人因子VIII，其特征在于，氨基酸取代在位置2196。
15.如权利要求12所述的修饰人因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或赖氨酸取代精氨酸2215。
16.如权利要求13所述的修饰人因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或赖氨酸取代精氨酸2220。
17.如权利要求14所述的修饰人因子VIII，其特征在于，包括丙氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸2196。
18.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，与相应的人蛋白质相比抗原性降低。
19.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，与相应的人蛋白质相比免疫原性降低。
20.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，与相应的人蛋白质相比免疫原性和抗原性降低。
21.如权利要求1所述的修饰因子VIII，其特征在于，特异活性大于每毫克约2,000单位。
22.如权利要求21所述的修饰因子VIII，其特征在于，特异活性大于每毫克约3,000单位。
23.如权利要求22所述的修饰因子VIII，其特征在于，特异活性大于每毫克约5,000单位。
24.如权利要求23所述的修饰因子VIII，其特征在于，特异活性大于每毫克约10,000单位。
25.如权利要求1或10所述的修饰因子VIII，其特征在于，它是单突变体。
26.如权利要求1或10所述的修饰因子VIII，其特征在于，它是双突变体。
27.如权利要求1或10所述的修饰因子VIII，其特征在于，它是三突变体。
28.如权利要求1或10所述的修饰因子VIII，其特征在于，它是四突变体。
29.如权利要求1或10所述的修饰因子VIII，其特征在于，与相应的人因子VIII相比，它对至少一种C2特异性抑制抗体的抗原性降低。
30.如权利要求1或10所述的修饰因子VIII，其特征在于，与相应的人因子VIII或重组人因子VIII相比，对至少一种抑制抗体制品的Bethesda效价增加或减少。
31.一种修饰因子VIII，其特征在于，所述因子包括至少一个非人因子VIII氨基酸取代相应的人因子VIII氨基酸。
32.如权利要求31所述的修饰因子VIII，其特征在于，至少一个非人因子VIII氨基酸取代来自非人的哺乳动物。
33.如权利要求32所述的修饰因子VIII，其特征在于，所述非人的哺乳动物是猪、犬或鼠。
34.如权利要求32所述的修饰因子VIII，其特征在于，与获得所述修饰因子的因子VIII分子或其它因子VIII制品相比，所述修饰因子VIII具有凝固活性且抗原性降低。
35.如权利要求32所述的修饰因子VIII，其特征在于，所述氨基酸取代不是丙氨酸。
36.如权利要求32所述的修饰因子VIII，其特征在于，与获得所述修饰因子的因子VIII分子或其它因子VIII分子相比，修饰因子VIII免疫原性降低。
37.一种修饰因子VIII，以使对抑制抗体的反应性降低并保持促凝血活性的方法，其特征在于，所述方法包括用免疫反应性降低的氨基酸在一个或多个位置取代对应于人因子VIII的C2结构域中天然产生的氨基酸，所述位置选自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2215。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2313。
40.如权利要求37所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2220。
41.如权利要求37所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2320。
42.如权利要求37所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2195。
43.如权利要求37所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2196。
44.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是单突变体。
45.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是双突变体。
46.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是三突变体。
47.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是四突变体。
48.一种修饰因子VIII，以使抗原性降低并保持促凝血活性的方法，其特征在于，所述方法包括用免疫反应性降低的氨基酸在一个或多个位置取代对应于人因子VIII的C2结构域中天然产生的氨基酸，所述位置选自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2215。
50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2313。
51.如权利要求48所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2220。
52.如权利要求48所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2320。
53.如权利要求48所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2195。
54.如权利要求48所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2196。
55.如权利要求48所述的方法，其特征在于，取代发生在氨基酸位置2290。
56.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是单突变体。
57.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是双突变体。
58.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是三突变体。
59.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述修饰因子VIII是四突变体。
60.一种编码修饰因子VIII的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含对应于人因子VIII的C2结构域中一个或多个位置的氨基酸取代，所述位置选自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
61.一种编码修饰人因子VIII的分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含C2结构域中对应于一个或多个位置的氨基酸取代，所述位置选自2215、2313、2220、2320、2195、2196和2290。
62.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求60或61所述的核酸分子。
63.如权利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII缺乏B结构域。
64.如权利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII包含位置2220的氨基酸取代。
65.如权利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII包含位置2215的氨基酸取代。
66.如权利要求60或61所述的核酸分子，其特征在于，所述因子VIII包含位置2196的氨基酸取代。
67.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞被权利要求62所述的表达载体转染。
CNA028238451A 2001-11-30 2002-11-27 因子ⅷc2结构域变体 Pending CN1630666A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33456901P 2001-11-30 2001-11-30
US60/334,569 2001-11-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1630666A true CN1630666A (zh) 2005-06-22

Family

ID=23307813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA028238451A Pending CN1630666A (zh) 2001-11-30 2002-11-27 因子ⅷc2结构域变体

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20040249134A1 (zh)
EP (1) EP1456235A4 (zh)
JP (1) JP2005511038A (zh)
CN (1) CN1630666A (zh)
AU (1) AU2002364509A1 (zh)
CA (1) CA2462966A1 (zh)
MX (1) MXPA04005079A (zh)
WO (1) WO2003047507A2 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6458563B1 (en) * 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
US7560107B2 (en) * 1996-06-26 2009-07-14 Emory University Modified factor VIII
US7485291B2 (en) 2003-06-03 2009-02-03 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for generating multiple polypeptides from a single vector using a virus derived peptide cleavage site, and uses thereof
WO2005017149A1 (en) 2003-06-03 2005-02-24 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of recombinant polypeptides from a single vector using a peptide cleavage site
US20050123997A1 (en) * 2003-10-30 2005-06-09 Lollar John S. Modified fVIII having reduced immunogenicity through mutagenesis of A2 and C2 epitopes
ES2449044T3 (es) * 2004-05-03 2014-03-18 Emory University Procedimiento de administración de fVIII sin dominio B porcino
MY185597A (en) * 2005-09-20 2021-05-24 Avantor Performance Mat Inc Vegetarian protein a preparation and methods thereof
FR2913020B1 (fr) 2007-02-23 2012-11-23 Biomethodes Nouveaux facteurs viii pour le traitement des hemophiles de type a
IT1394522B1 (it) 2009-01-09 2012-07-05 Invatec Technology Ct Gmbh Dispositivo medicale con rilascio di farmaco
US20130116182A1 (en) * 2009-11-13 2013-05-09 Kathleen Pratt Factor VIII B Cell Epitope Variants Having Reduced Immunogenicity
US8759293B2 (en) 2009-11-13 2014-06-24 Grifols Therapeutics Inc. von Willebrand factor (vWF)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto
JP6042335B2 (ja) 2010-09-15 2016-12-14 ノヴォ ノルディスク アー／エス 細胞取込みが低下した第ｖｉｉｉ因子変異体
SG190136A1 (en) 2010-11-05 2013-07-31 Baxter Int A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity
EP3107561A4 (en) * 2014-02-19 2017-12-20 Bloodworks Factor viii b cell epitope variants having reduced immunogenicity
EP3114138B1 (en) 2014-03-05 2021-11-17 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757006A (en) * 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4965199A (en) * 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4868112A (en) * 1985-04-12 1989-09-19 Genetics Institute, Inc. Novel procoagulant proteins
US5004803A (en) * 1988-11-14 1991-04-02 Genetics Institute, Inc. Production of procoagulant proteins
US5859204A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5888974A (en) * 1992-04-07 1999-03-30 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5663060A (en) * 1992-04-07 1997-09-02 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US6376463B1 (en) * 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US6180371B1 (en) * 1996-06-26 2001-01-30 Emory University Modified factor VIII
US5744446A (en) * 1992-04-07 1998-04-28 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5364771A (en) * 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US6458563B1 (en) * 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
HUP0301179A3 (en) * 2000-09-19 2006-11-28 Univ Emory Modified factor viii

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003047507A2 (en) 2003-06-12
EP1456235A2 (en) 2004-09-15
WO2003047507A3 (en) 2003-07-17
MXPA04005079A (es) 2004-08-19
JP2005511038A (ja) 2005-04-28
EP1456235A4 (en) 2005-08-17
US20040249134A1 (en) 2004-12-09
AU2002364509A1 (en) 2003-06-17
CA2462966A1 (en) 2003-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1224627C (zh) 修饰的凝血因子ⅷ
CN1191360C (zh) 修饰的凝血因子ⅷ
CN1205221C (zh) 修饰的凝血因子ⅷ
CN1630666A (zh) 因子ⅷc2结构域变体
CN1246462C (zh) 修饰的维生素k依赖性多肽
AU2007269233B2 (en) Method of producing Factor VIII proteins by recombinant methods
AU693837B2 (en) Hybrid human/animal factor VIII
CN1034080C (zh) 胰岛素类似物的制备方法
CA2374675C (en) Modified factor viii
JP5506664B2 (ja) 細胞培養における第ｖｉｉｉ因子ポリペプチドタイターの改善
CN1745100A (zh) 因子ⅷ多肽
JP2013533748A (ja) 細胞培養による組換え型高分子量ｖＷＦ産生方法
AU3643397A (en) Modified factor viii
CN1262688A (zh) 整合蛋白结合肽及其应用
CN1671423A (zh) 新型嵌合cd154
WO2012170289A1 (en) Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
CN1039441A (zh) 毒蛇毒液多肽及基因表达
CN1518558A (zh) 肽和/或蛋白质及其用于制备治疗性和/或预防性药物组合物的用途
CN1088986A (zh) 抗免疫球蛋白等模式标本的重整形单克隆抗体
US20140357565A1 (en) Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
CN1179976C (zh) 产生凝血因子ⅷ的生产方法和宿主细胞
CN1107159A (zh) 线性粘附抑制剂
US20090203077A1 (en) Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
CN1040203A (zh) 抗聚集肽
CN1036582A (zh) 多肽衍生物的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned
C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned