CN1246462C - 修饰的维生素k依赖性多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有增强膜结合亲和力的维生素K依赖性多肽。这些多肽可用来调节哺乳动物的血凝块形成。本发明还描述了调节哺乳动物血凝块形成的方法。根据IX因子编号氨基酸位置，所述多肽含修饰GLA区，该修饰区增强所述多肽的膜结合亲和力，使之高于对应的天然维生素K依赖性多肽，所述修饰GLA区在残基11，12，29或34处具有至少一处氨基酸取代。

Description

修饰的维生素K依赖性多肽
                          发明背景
维生素K依赖性蛋白氨基末端的45个残基中含9至13个γ-羧基谷氨酸残基(Gla)。Gla残基是在肝内由酶用维生素K羧化蛋白质前体内谷氨酸残基的侧链而产生的。维生素K依赖性蛋白参与许多生物过程，其中描述得最清楚的是凝血过程(参见Furie，B.和Furie，B.C.，1988，Cell，53：505-518)。维生素K依赖性蛋白包括Z蛋白，S蛋白，凝血酶原，X因子，IX因子，C蛋白，VII因子和Gas6。蛋白Gsa6的功能在于调节细胞生长。Matsubara等，1996，Dev.Biol.，180：499-510。Gla残基为这些蛋白正确地结合钙和发生膜相互作用所必需。X因子的膜接触位点被认为在氨基酸残基1-37内。Evans和Nelsestuen，1996，Protein Science 5：增刊1，163Abs。虽然血浆蛋白的含Gla区具有很高的序列同源性，可它们的膜亲和力相差至少1000倍。McDonald，J.F.等，1997，Biochemistry，36：5120-5137。
VII因子参与凝血早期阶段，可能是形成血凝块的重要因素。无活性前体即酶原的酶活性很低，经蛋白酶剪切形成VIIa因子后，活性大大提高。该活化作用可由Xa因子和VIIa-组织因子催化，后者是存在于多种细胞内的一种膜内在蛋白。Fiore，M.M.等，1994，J.Biol.Chem.，269：143-149。被VIIa-组织因子活化又称自身活化。它既与活化(由VII因子形成VIIa因子)有关，又与所得VIIa因子活性有关。迄今，还不知道最重要的体内活化途径。VIIa因子能活化凝血因子IX和X。
组织因子在某些肿瘤细胞表面高水平表达。组织因子和VIIa可能参与肿瘤的发展和组织入侵。Vrana，J.A.等，Cancer Res.，56：5063-5070。组织因子的细胞表达和作用还是内毒素休克毒性应答中的主要因素。Dackiw，A.A.等，1996，Arch.Surg.，131：1273-1278。
C蛋白在内皮细胞膜内在蛋白，凝血调节蛋白存在下，由凝血酶活化。Esmon，N.L.等，1982，J.Biol.Chem.，257：859-864。活性C蛋白(APC)与其辅因子S蛋白一起降解Va因子和VIIIa因子。耐APC是遗传性血凝疾病最常见的形式。Dahlback，B.1995，Blood，85：607-614。常用给予维生素K抑制剂来预防血凝块形成。
维生素K依赖性蛋白常用于治疗某些类型的血友病。血友病A的特征是缺乏VIII因子，VIIIa因子，或存在VIII因子的抑制剂。血友病B的特征是缺乏活性IX因子，IXa因子。VII因子缺乏症，虽然少见，但对给予VII因子反应良好。Bauer，K.A.，1996，Haemostasis，26：155-158，增刊1。VIII因子取代疗法因为在某些患者中产生高效价的抑制性VIII因子而受到限制。或者，可用VIIa因子治疗血友病A和B。IXa因子和VIIIa因子活化X因子。因为VIIa因子直接活化X因子，所以不再需要因子IX和VIII，能够克服因子IX和VIII缺乏问题而几乎没有免疫学后果。Hender等，1993，Transfus，Medi.Rev.，7：78-83；Nicolaisen，E.M.等，1996，Thromb.Haemost.，76：200-204。给予VIIa因子的有效量一般很高(45-90μg/kg体重)，而且需要每隔数小时反复给予。Shulmav，S.等，1996，Thromb.Haemost.，75：432-436。
目前发现，不含膜接触区的可溶形式组织因子(可溶性组织因子即sTF)在与VIIa因子联合给予时可有效治疗血友病。U.S.专利5,504,064。在狗中显示，sTF减少治疗血友病所需VIIa因子量。sTF-VIIa的膜结合作用完全依靠VII因子的膜接触位点。这与通过组织因子和VIIa因子一起与膜结合的正常组织-VHa因子复合物不同。
                        发明概述
已发现，维生素K依赖性多肽的γ-羧基谷氨酸残基(GLA)区内的修饰增强其膜结合亲和力。如此修饰后的维生素K依赖性多肽活性增强，可用作抗凝血药，促凝血药或利用维生素K依赖性蛋白的其他功能。例如，改进的VII因子分子可提供多个优点：降低VIIa所需量及相对给予频率和/或提供质量改进使治疗缺乏症更有效。
本发明以维生素K依赖性多肽为特征，所述多肽具有修饰GLA区，相对于天然维生素K依赖性多肽，该修饰区增强所述多肽的膜结合亲和力。修饰GLA区位于氨基酸1至氨基酸45，并包括至少1处氨基酸取代。例如，所述氨基酸取代可以在氨基酸11，12，29，33或34。以氨基酸11，33或34处的取代为佳。修饰GLA区可包括这样一段氨基酸序列：它在钙饱和状态下形成的三级结构为负电荷云包围一个阳离子核心。
维生素K依赖性多肽可以是例如C蛋白，活性C蛋白，IX因子，IXa因子，VII因子，VIIIa因子或活性位点被修饰的VIIa因子。蛋白C或活性蛋白C的修饰GLA区可有氨基酸33处的谷氨酸残基，氨基酸34处的天冬氨酸残基(SEQ IDNO：19)。蛋白C或活性蛋白C的修饰GLA区还可能在氨基酸11处具有一个谷胺酰胺残基或谷氨酸残基(分别为SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21)。此外，C蛋白或活性C蛋白(SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：35)GLA区内氨基酸12可能被甘氨酸取代。VII因子，VIIa因子和活性位点被修饰的VIIa因子的修饰GLA区可能在氨基酸11和33处被取代。例如，可以谷胺酰胺残基取代氨基酸11，谷氨酸残基取代氨基酸33(SEQ ID NO：30)。本发明提供这样的C蛋白或活性C蛋白多肽，含修饰GLA区，该修饰区增强所述多肽的膜结合亲和力，使之高于对应的天然C蛋白或活性C蛋白多肽，所述修饰GLA区具有至少一处氨基酸取代，所述氨基酸取代的位置选自残基10、11、28或33处，非修饰的所述GLA区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供这样的C蛋白或活性C蛋白多肽，含修饰GLA区，该修饰区增强所述多肽的膜结合亲和力，使之高于对应的天然C蛋白或活性C蛋白多肽，所述修饰GLA区含有三处氨基酸取代，所述取代的位置选自残基10、11、28、32和33，非修饰的所述GLA区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的另一特征是一种编码维生素K依赖性多肽的分离的核酸。“分离的核酸”在此指对应于编码维生素K依赖性多肽基因一部分或全部的序列，但不是哺乳动物基因组中该基因一侧或两侧的游离序列。维生素K依赖性多肽含修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。该修饰GLA区还包括至少一处氨基酸取代。
本发明的另一特征是一种哺乳动物宿主细胞。该细胞包含编码维生素K依赖性多肽的核酸载体。该维生素K依赖性多肽含修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。该修饰GLA区还包括至少一处氨基酸取代，例如氨基酸11，12，29，33或34处的取代。该维生素K依赖性多肽可以是例如VII因子，VIIa因子，并包含氨基酸11和氨基酸33处的氨基酸取代。例如，这种氨基酸取代可以包括氨基酸11处的谷氨酰胺残基和氨基酸33处的谷氨酸残基(SEQ ID NO：30)。
本发明还涉及一种药物组合物，它包含药学上认可的载体和有效量的维生素K依赖性多肽，以抑制哺乳动物中血凝块的形成。该维生素K依赖性多肽含修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。该修饰GLA区还包括至少一处氨基酸取代。该维生素K依赖性多肽可以是例如C蛋白，活化C蛋白，或活性位点被修饰的VIIa因子。C蛋白或活性C蛋白可包括，例如，氨基酸33处的谷氨酸残基和氨基酸34处的天冬氨酸残基(SEQID NO：19)。C蛋白或活性C蛋白还可包括，例如，氨基酸11处的谷氨酰胺(SEQID NO：20)或谷氨酸(SEQ ID NO：21)。氨基酸取代还可包括氨基酸12处的甘氨酸(SEQ ID NO：24或35)。活性位点被修饰的VIIa因子可包括，例如，氨基酸11处为谷氨酰胺和氨基酸33处为谷氨酸残基(SEQ ID NO：30)。
本发明的又一特征是一种药物组合物，含药学上认可的载体和有效量的维生素K依赖性多肽，以增加哺乳动物血凝块形成。所述维生素K依赖性多肽具有修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。所述修饰GLA区具有至少一处氨基酸取代。所述维生素K依赖性多肽可以是例如VII因子，VIIa因子，IX因子或IXa因子。所述药物组合物还可包含可溶性组织因子。VII因子或VIIa因子可具有氨基酸11和氨基酸33处的氨基酸取代。例如，可以谷胺酰胺残基取代氨基酸11，谷氨酸残基取代氨基酸33(SEQ IDNO：30)。
本发明还描述了维生素K依赖性多肽治疗血凝疾病的用途。所述维生素K依赖性多肽具有修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。所述修饰GLA区具有至少一处氨基酸取代。有用的修饰维生素K依赖性多肽包括例如前文所述的C蛋白，活性C蛋白，VII因子，VIIa因子，活性位点被修饰的VIIa因子，IX因子和IXa因子。
本发明的特征还在于维生素K依赖性多肽在制造治疗血凝块病的药物中的用途。所述维生素K依赖性多肽具有修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。所述修饰GLA区具有至少一处氨基酸取代。有用的修饰维生素K依赖性多肽包括例如前文所述的C蛋白，活性C蛋白，VII因子，VIIa因子，活性位点被修饰的VIIa因子，IX因子和IXa因子。
本发明还描述了在哺乳动物内减少血栓形成的方法。所述方法包括给予有效量的维生素K依赖性多肽以减少哺乳动物血栓形成。所述维生素K依赖性多肽具有修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。所述修饰GLA区具有至少一处氨基酸取代。所述维生素K依赖性多肽是例如C蛋白，活性C蛋白或活性位点被修饰的VIIa因子。C蛋白或活性C蛋白可具有氨基酸33处的谷氨酸残基和氨基酸34处的天冬氨酸残基(SEQ IDNO：19)。在C蛋白或活性C蛋白内可以还有一个谷胺酰胺或谷氨酸取代(SEQ IDNO：20或SEQ ID NO：21)。可以进一步以甘氨酸取代氨基酸12(SEQ ID NO：24或35)。活性位点被修饰的VIIa因子可具有氨基酸11处的一个谷胺酰胺残基和氨基酸33处的一个谷氨酸残基(SEQ ID NO：30)。
本发明的还包括在哺乳动物内增加血凝块形成的方法。该方法包括给予有效量的维生素K依赖性多肽以增加哺乳动物血凝块形成。该维生素K依赖性多肽具有修饰GLA区，该修饰区增强其膜结合亲和力，使之高于对应天然维生素K依赖性多肽。所述修饰GLA区具有至少一处氨基酸取代。该维生素K依赖性多肽可以是例如VII因子，VIIa因子，IX因子或IXa因子。VII因子或VIIa因子可具有位于氨基酸11和氨基酸33处的氨基酸取代。例如，所述氨基酸取代可以是氨基酸11处的谷胺酰胺残基和氨基酸33处的谷氨酸残基(SEQ ID NO：30)。
除非另作说明，本文所用科技术语的意义与本领域一般技术人员所理解的相同。虽然可以用与本文所述类似或相当的方法和材料来实施本发明，以下还是描述了合适的方法和材料。本文给出了提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的完整出处。如有冲突，以本发明的说明，包括定义，为准。此外，本文中的材料，方法和实施例只是说明性的，不是限定性的。
以下详细描述和权利要求将显示本发明的其他特征和优点。
                        附图简述
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：30内分别是野生型VIIa和VIIQ11E33的GLA区氨基酸序列。SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：23内分别是牛X因子，牛C蛋白，人C蛋白和牛C-H11蛋白的GLA区氨基酸序列。SEQ ID NO：19是C VQ33E，N34D的GLA区序列。
图1显示野生型VIIa(空心圆)，VIIQ11E33(实心圆)和牛X因子(实心三角)与膜的结合，包括标准偏差。
图2显示VIIQ11E33的自身活化。虚线显示的是无磷脂存在下的活性。
图3所示为X因子被VIIa因子活化。给出的是浓度为0.06nM的野生型VIIa因子(空心圆)和VIIaQ11E33(实心圆)的结果。
图4显示VIIa和VIIaQ11E33与可溶性组织因子引起的人血浆凝固。
图5显示VII因子酶原和普通组织因子引起的血浆凝固。
图6显示活性位点被修饰的VIIaQ11E33因子(DEGR-VIIaQ11E33)抑制血凝块形成。
图7显示VIIaQ11E33因子在大鼠体内的循环时间。
图8显示普通蛋白和修饰蛋白与膜的相互作用。分图A显示野生型牛C蛋白(空心圆)和牛C-H11(实心圆)与囊泡的相互作用。分图B显示野生型人C蛋白(空心圆)和人C-P11(实心圆)与膜的相互作用。两图中，虚线所示都是假设所加蛋白全部与膜结合的结果。
图9显示活性C蛋白对凝血时间的影响。分图A中，显示的是野生型牛APC(空心圆)和bAPC-H11(实心圆)3次人血浆凝固测定的平均值和标准偏差。分图B中，显示的是野生型人APC(空心圆)和人APC-P11(实心圆)3次人血浆凝固测定的平均值和标准偏差。
图10显示Va因子被牛和人的APC灭活。分图A显示Va因子被野生型牛APC(空心圆)和牛APC-H11(实心圆)灭活。分图B显示在缺乏S蛋白的血浆中人Va因子被野生型人APC(空心圆)或人APC-H11(实心圆)灭活。
图11显示Z蛋白的静电分布。垂直线表示正电区，水平线表示负电区。
图12显示多种C蛋白与膜的结合和活性。分图A显示野生型C蛋白(空心圆)，P11H突变C蛋白(实心方块)，Q33E，N34D突变蛋白(实心圆)和牛凝血酶原(空心方块)与膜的结合。分图B显示上述突变蛋白的凝血抑制。分图C显示Va因子的灭活。
图13比较突变人C蛋白与膜的结合和活性。分图A比较野生型(空心圆)，E33(空心三角)和E33D34(实心圆)与膜的结合。分图B比较野生型(空心三角)，E33(空心圆)和E33D34(实心圆)的凝血时间。
图14比较牛C蛋白的野生型(空心方块)，H11(实心圆)，E33D34(空心三角)和H11E33D34三联突变蛋白(空心圆)与膜的结合(分图A)和凝血抑制(分图B)。
图15显示不同维生素K依赖性蛋白与膜相互作用的特性。分图A比较人X因子(实心圆)和牛X因子(空心圆)与膜的相互作用。分图B显示普通牛凝血酶原片段1(空心圆)，无钙时TNBS修饰的片段1(实心圆)和25mM钙存在下TNBS修饰的片段1(实心方块)与膜的相互作用。分图C显示pH9(实心圆)和pH7.5(空心圆)时Z蛋白与囊泡结合的速度。
                         详细描述
本发明内容之一是具有修饰GLA区的维生素K依赖性多肽，该多肽的膜结合亲和力增强，高于对应的天然维生素K依赖性多肽。维生素K依赖性多肽是在生物合成路径中用维生素K羧化蛋白质前体内谷氨酸残基上侧链的一组蛋白质。GLA区在多肽N末端区，含9-13个γ羧基谷氨酸残基，通常是氨基酸1至45。维生素K依赖性多肽的例子有Z蛋白，S蛋白，X因子，II因子(凝血酶原)，IX因子，C蛋白，VII因子和Gas6。本文中多肽的氨基酸位置根据IX因子编号。S蛋白，C蛋白，X因子，VII因子和人凝血酶原都少一个氨基酸(第4位)，所以必需进行调整。例如，牛C蛋白的10位其实是脯氨酸，但为了便于比较，在此都编为氨基酸11。本文中，“多肽”是各种氨基酸链，不考虑长度或翻译后修饰。氨基酸在此用标准三字母或单字母缩写表示。
GLA区的修饰包括至少一处氨基酸取代。所述取代可以是保守性或非保守性的。保守性氨基酸取代以同类氨基酸进行取代，非保守性氨基酸取代则以不同类的氨基酸进行取代。非保守性取代可能造成多肽疏水性或残基侧链大小的本质性改变。此外，非保守性取代可能本质性改变多肽的电荷，例如减少正电荷或引入负电荷。非保守性取代的实例包括碱性氨基酸取代非极性氨基酸，或极性氨基酸取代酸性氨基酸。氨基酸取代可发生在第11，12，29，33或34位氨基酸。较好的是，氨基酸取代位于氨基酸11，33或34处。修饰GLA区可具有这样一段氨基酸序列，在钙饱和状态下，促进形成被负电荷云包围的阳离子核心的三级结构。除特定理论之外，与膜亲和力的增强可能缘于正电核心被负电表面完全包围而成的特殊静电形式。
许多维生素K依赖性多肽是膜结合酶的底物。既然维生素K依赖性多肽都没有表现出GLA区的最大潜在膜结合亲和力，则一定都具有旨在降低结合亲和力的氨基酸。所以，许多维生素K依赖性多肽含有就最大亲和力而言并非最适的氨基酸。这些残基干扰结合位点，使酶反应更快转换。
降低膜亲和力可能具有几个目的。高亲和力伴随着低交换率，这将限制反应速度。例如，在膜上合成与底物具有高亲和力的凝血酶原酶时，限速性的是从膜上交换出蛋白，而不是酶催化。Lu，Y.和Nelsestuen，G.L.，1996，Biochemistry，35：8201-8209。或者，用非最适氨基酸取代调整膜亲和力能平衡促凝血(X、IX、VII和凝血酶原)与抗凝血(C蛋白，S蛋白)的竞争。虽然天然蛋白的膜亲和力就常态来说是最合适的，膜亲和力的增强可能产生可用于体外研究的蛋白质，和在体内病理情况下调节凝血的改良药物。
以下描述了多种GLA区被修饰的维生素K依赖性多肽的实例。
维生素K依赖性多肽可能是C蛋白或活性C蛋白(APC)。表1显示了野生型人C蛋白(hC)和牛C蛋白(bC)GLA区的氨基酸序列。X是Gla或Glu残基。通常，第11，33和34位是中性(例如Q)或阳离子残基(例如D，E)的蛋白具有较高的膜亲和力。
                        表1
hC：ANS-FLXXLRH11SSLXRXCIXX21ICDFXXAKXI31FQNVDDTLAF41WSKH(SEQ ID NO：1)
bC：ANS-FLXXLRP11GNVXRXCSXX21VCXFXXARXI31FQNTXDTMAF41WSFY(SEQ ID NO：2)
例如，C蛋白或APC的修饰GLA区可具有氨基酸33处的谷氨酸残基和氨基酸34处的天冬氨酸残基(SEQ ID NO：19)。在体内，第33位的谷氨酸还可以进一步修饰成γ-羧基谷氨酸。为了获得最大活性，修饰GLA区可另外包括氨基酸11处的取代。例如，可在氨基酸11处取代以谷胺酰胺残基(SEQ ID NO：20)或谷氨酸残基或天冬氨酸残基(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)。可用组氨酸残基取代牛C蛋白内的氨基酸11(SEQ ID NO：23)。进一步修饰可包括在氨基酸12处以甘氨酸取代丝氨酸(SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：35)。在凝血酶原中以苯丙氨酸取代氨基酸29是另一种有用的修饰(SEQ ID NO：25)。增强了膜亲和力的修饰C蛋白可用来代替诸如肝素等其他可注射抗凝血药。大多数手术中都用到肝素，但它的缺点在于效果/毒性比低。此外，增强了膜亲和力的修饰C蛋白可用来代替香豆素家族口服抗凝血药，例如丙酮苄羟香豆素。
还可以对活性位点被修饰的APC进行上述修饰。可以化学灭活APC的活性位点，例如用N-丹酰基-谷氨酰甘氨酰精氨酰氯甲基丙酮(DEGR)或进行活性位点的定点诱变。Sorensen，B.B.等，1997，J.Biol.Chem.，272：11863-11868。活性位点修饰APC是凝血酶原酶复合物的抑制剂。活性位点修饰APC的膜亲和力增强，使之成为疗效更强的多肽。
维生素K依赖性多肽可以是VII因子或VII因子的活性形式VIIa因子。天然VII因子多肽的膜亲和力较低。表2显示野生型人VII因子(hVII)和牛VII因子(bVII)的GLA区氨基酸序列。
                               表2
hVII：ANA-FLXXLRP11GSLXRXCKXX21QCSFXXARXI31FKDAXRTKLF41WISY(SEQ ID NO：3)
bVII：ANG-FLXXLRP11GSLXRXCRXX21LCSFXXAHXI31FRNXXRTRQF41WVSY(SEQ ID NO：4)
VII因子或VIIa因子的修饰GLA区可含有例如氨基酸11处的谷氨酸或天冬氨酸(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)，氨基酸29处的苯丙氨酸(SEQ ID NO：28)，或氨基酸33处的天冬氨酸(SEQ ID NO：29)。较好的是，VII因子或VIIa因子的修饰GLA区含有氨基酸11处的谷胺酰胺残基和氨基酸33处的谷氨酸残基(SEQ IDNO：30)。这样修饰的维生素K依赖性多肽具有比天然或野生型多肽高得多的膜亲和力。在Xa因子产生和几个凝血试验中，其自身活化的活性也高得多。尤其是例如低水平组织因子和/或磷脂等临界血凝条件下的活性增强了。例如，在最适组织促凝血酶原激酶水平，修饰VII因子的活性是天然VIIa因子的4倍，在1％最适组织促凝血酶原激酶水平则是约20倍。在体内，临界促凝血信号可能是最主要的。目前使用最适组织促凝血酶原激酶水平的凝血试验无法测出正常血浆和血友病患者血浆之间的凝血时间差异。只有在凝血试验中采用非最适组织促凝血酶原激酶水平或稀释组织促凝血酶原激酶才能测出上述样品之间的凝血差异。
维生素K依赖性多肽的另一个例子是活性位点修饰VIIa因子。可对VIIa因子的活性位点进行化学修饰，例如用DEGR或活性位点定点诱变。DEGR修饰的VII因子通过数种途径给予是有效的凝血抑制剂。Arnljots，B.等，1997，J.Vasc.Surq.，25：341-346。GLA区修饰会使活性位点修饰的VIIa因子因为膜亲和力增强而更有效。活性位点修饰VIIa因子的修饰GLA区可含有氨基酸11处的谷胺酰胺残基和氨基酸33处的谷氨酸残基(SEQ ID NO：30)。
维生素K依赖性多肽还可以是IX因子或IX因子的活性形式IXa因子。和活性位点修饰的VIIa因子一样，活性位点修饰的IXa因子和Xa因子也是凝血抑制剂。表3显示野生型人IX因子(hIX)和牛IX因子(bIX)的GLA区氨基酸序列。例如，可以天冬氨酸或谷氨酸取代氨基酸11(SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32)，苯丙氨酸取代氨基酸29(SEQ ID NO：33)，或天冬氨酸取代氨基酸34(SEQ IDNO：34)。
                          表3
hIX：YNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXRTTXF41WKQY(SEQ ID NO：5)
bIX：YNSGKLXXFVQ11GNLXRXCMXX21KCSFXXARXV31FXNTXKRTTXF41WKQY(SEQ ID NO：6)
本发明还包括一种哺乳动物宿主细胞，其中含GLA区被修饰的维生素K依赖性多肽，所述修饰区增强多肽的膜结合亲和力，使之高于对应的天然维生素K依赖性多肽。该修饰GLA区具有至少一处上述氨基酸取代。例如，哺乳动物宿主细胞含有修饰VII因子或修饰VIIa因子。修饰VII因子或修饰VIIa因子的修饰GLA区含氨基酸11和33处的氨基酸取代。较好的是，氨基酸取代包括氨基酸11处的谷胺酰胺残基和氨基酸33处的谷氨酸残基(SEQ ID NO：30)。
合适的哺乳动物宿主细胞能够将维生素K依赖性多肽的谷氨酯残基修饰成γ羧基谷氨酸酯。特别有用的宿主细胞是来自肾和肝的哺乳动物细胞。
本发明还包括药物组合物，其中含药学上认可的载体和抑制哺乳动物凝血有效量的维生素K依赖性多肽。维生素K依赖性多肽具有至少含一处氨基酸取代的修饰GLA区，它增强多肽的膜亲和力，使之高于对应的天然维生素K依赖性多肽。药物组合物中所用修饰维生素K依赖性多肽包括但不限于上述C蛋白或APC，活性位点修饰的APC，活性位点修饰的VIIa因子，活性位点修饰的IXa因子和活性位点修饰的Xa因子。
在哺乳动物中，有效抑制凝血的维生素K依赖性多肽浓度取决于许多因素，包括化合物优选给予剂量，所用化合物的化学性质，化合物的赋形剂配方和给药途径。药物组合物的最佳给予剂量还取决于患者总体健康状况和所选化合物相对生物效力等变数。所述药物组合物可用于调节体内凝血。例如，组合物可用于治疗血凝块形成。如上所述仅改变一个氨基酸残基一般不显著影响突变多肽的抗原性。
可将具有修饰GLA区的维生素K依赖性多肽与药学上认可的无毒赋形剂或载体混合，配制成药物组合物。可将上述化合物和组合物用于胃肠外给药，具体是以水性生理缓冲液配制的溶液或悬浮液形式；或用于口服，具体是以片剂或胶囊的形式；或用于鼻给药，具体是以粉剂、滴鼻液或气雾剂的形式。其他给予途径的组合物可如本发明所述用标准方法来制备。
胃肠外给予的方剂含常用赋形剂：无菌水或盐溶液，聚乙二醇等聚烷基二醇，植物油，氢化萘等。特别是，例如生物相容性、可生物降解的交酯聚合物，交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是用于本发明化合物体内控释的赋形剂。其他合适的胃肠外传递系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入浸润系统和脂质体。吸服制剂如果需要可含乳糖之类赋形剂。吸服剂可以是以滴鼻液形式给予的含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液或油溶液。根据需要，可将化合物配制成鼻内使用的凝胶。胃肠外给予的制剂还包括用于颊给药的甘胆酸盐。
在另一实施例中，本发明还包括含药学上认可的载体和在哺乳动物内促进凝血有效量的维生素K依赖性多肽的药物组合物。该维生素K依赖性多肽具有至少含一处氨基酸取代的修饰GLA区，该修饰区增强多肽的膜结合亲和力，使之高于对应的天然维生素K依赖性多肽。所述药物组合物可用于治疗血友病A、血友病B等凝血疾病和肝病。
在该实施例中，药物组合物中所用维生素K依赖性多肽包括但不限于VII因子或VII因子的活性形式VIIa因子。VII因子或VIIa因子的修饰GLA区含氨基酸11和33处的氨基酸取代，例如氨基酸11处的谷胺酰胺和氨基酸33处的谷氨酸(SEQ ID NO：30)。该药物组合物还可以包含可溶性组织因子。VII因子对于凝血尤其重要，因为它处于凝血级联的引发阶段，并能够活化IX和X因子两种蛋白。直接由VIIa因子活化X因子对于能够治疗主要的A型和B型血友病是很重要的，因为这完全绕过了所涉及的IX和VIII因子步骤。已发现，给予患者VII因子能有效治疗几种形式的血友病。通过修饰GLA区提高VII因子或VIIa因子的膜亲和力提供了使多肽对许多凝血条件反应性更强的可能性，降低了VII/VIIa的所需剂量，延长了给予VII/VIIa因子的间隔时间，并提供使治疗更有效的其他质量改变。总之，改善VII因子的膜接触位点既能提高其活化速度，又能提高VIIa因子对X或IX因子的活化。上述步骤可能对所有体内凝血速度产生多重效应，产生特别适合治疗多种凝血疾病的强效VIIa因子。
其他用于增强血凝块形成的维生素K依赖性多肽包括IX因子和IXa因子。
本发明还描述了减少哺乳动物内血凝形成的方法。该方法包括给予减少哺乳动物血凝块形成有效量的维生素K依赖性多肽。所述维生素K依赖性多肽具有增强多肽膜结合亲和力使之高于对应天然维生素K依赖性多肽的修饰GLA区。该修饰GLA区至少有一处氨基酸取代。该方法可使用修饰的C蛋白或APC，或修饰的活性位点被封闭的VIIa因子、IXa因子、Xa因子和APC。
本发明还包括增加哺乳动物内血凝形成的方法，该方法包括给予增加哺乳动物内血凝形成有效量的维生素K依赖性多肽。该维生素K依赖性多肽具有增强其膜结合亲和力使之高于对应天然维生素K依赖性多肽的修饰GLA区。该修饰GLA区至少有一处氨基酸取代。该方法可使用修饰的因子VII或VIIa，或修饰的IX或IXa因子。
以下将在实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限定本发明的范围，本发明范围仅由权利要求来限定。
                            实施例
实施例1-增强了膜亲和力和活性的VII因子
已发现，定点诱变能提高人凝血因子VII的膜结合亲和力。目前已经对P11Q，K33E突变体(本文称VIIQ11E33因子或突变VII因子(SEQ ID NO：30))进行了特征分析。其膜亲和力比野生型蛋白提高了约20倍。突变体的自身活化作用比野生型VII因子增强了至少100倍。VIIQ11E33的活性形式(即VIIaQ11E33)表现出强10倍的对X因子活性。VIIaQ11E33与可溶性组织因子一起在正常血浆中的凝血活性比野生型VIIa强约10倍。酶原即VIIQ11E33与正常组织因子(1∶100稀释的组织促凝血酶原激酶-HS)一起的凝血活性比野生型VII因子强20倍。活性增强的程度取决于条件，VIIQ11E33在低水平凝血刺激条件下特别活跃。
通常用Bradford试验测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准物。Bradford，M.M.，1976，Analyt.Biochem.248-254。根据VII因子的分子量为50,000，X因子的分子量为55,000计算摩尔浓度。除非另作说明，所有活性测定都在标准缓冲液(0.05M Tris，pH7.5，100mM NaCl)中进行。
突变VII因子的产生：突变VII因子是由野生型VII因子cDNA产生的(GenBank登录号：M13232，NID g182799)。Petersen等，1990，Biochemistry29：3451-3457。以Vallette等，1989，Nucleic Acid Res.17：723-733中所述聚合酶链反应将P11Q突变(将第11位的脯氨酸残基换成谷胺酰胺残基)和K33E突变(将第33位的赖氨酸残基换成谷氨酸残基)引入野生型VII因子。该过程中，消除了突变诊断性XmaII限制性酶位点。设计了4种PCR引物，用于引发M13232两种突变片段的合成，它们是从MluI至BglII即221-301位，和从BglII至SstII即302-787位。在标准PCR循环条件下(GENEAMP，Perkin Elmer)，以1ng野生型VII因子cDNA为模板，用上述引物引发片段的合成。对所得片段进行凝胶纯化，并用MluI和BglII，或BglII和SstII消化。然后将纯化后的两片段连接到表达载体Zem219b中的VIII因子cDNA内，载体事先已经去除了相应的野生型序列成为MluI-SstII片段。Petersen等，1990，同上。然后对突变片段完整测序以确认P11Q和K33E取代，同时消除PCR引入其他序列改变的可能性。
转染、挑选和纯化：将乳仓鼠肾(RHK)细胞培养于Dubeccos改讲的Eagles培养基中，其中补充了10％胎牛血清和青霉素-链霉素。按照制造商说明，用lipofectAMINE(Gibco BRL)以VII因子表达质粒转染半铺满时的细胞。转染后2天，以胰蛋白酶处理细胞，稀释在含1μM氨甲蝶呤(MTX)的选择培养基中。然后将稳定转染的BHK细胞培养在无血清Dubeccos改进的Eagles培养基中，其中补充了青霉素-链霉素，5μg/ml维生素K1和1μM MTX，收集条件培养基。对条件培养基进行两次免疫亲和柱层析，层析柱由钙依赖性单克隆抗体(CaFVII22)与Affi-Gel 10偶联而成。Nakagaki等，1991，Biochemistry，30：10819-10824。最后的纯化VIIQ11E33因子在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上走出单一条带，无证据表明制剂中有VIIa因子。纯VII突变体(P11Q，K33E)表现出1400-2800VII因子单位/mg。
VII因子的活化：牛Xa因子剪切VIIQ11E33形成活性因子VIIaQ11E33(重量比：1∶100，37℃培养1小时)。或者，通过含7μM VIIQ11E33，0.7μM sTF和磷脂(磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱(PS/PC)，25/75，0.1g/g蛋白)混合物中的自身活化获得VIIaQ11E33因子。
野生型VIIa因子是一种均质重组蛋白(NOVO Nordisk)。两种制剂分别是市售冷冻干燥产品和非冷冻干燥产品。后一种产品经FPLC mono-Q进一步纯化，以George King NPP标准物标定，表现出的特异性活性为80,000单位/mg。
以VIIQ11E33因子增强膜相互作用：按照Nelsestuen和Lin，1977，Biochemistry，30：10819-10824所述的方法进行磷脂制备、蛋白质-膜结合试验及测定。以现有方法制备大单室囊泡(LUV)和小单室囊泡(SUV)。Hope，M.J.等，Biochem.Biophys，Acta.，812：55-56；Huang，C.，1969，Biochemistry，8：344-352。将高纯度的磷脂酰丝氨酸(牛脑)和卵磷脂酰胆碱(Sigma Chemical Co.)混合在氯仿中。用氮气流驱除溶剂。将干燥的磷脂悬浮在缓冲液中。通过超声波处理和凝胶过滤制备成SVU，通过冻融和挤压制备成LUV。通过有机磷酸酯试验，假定磷∶磷脂重量比为25，测定磷脂浓度。
制备PS/PC(25/75)或PS/PC(10/90)的SUV。在磷脂中加入图1所示重量比的蛋白质。用Nelsestuen和lin，1977(同上)的方法，通过90。的光散射分析蛋白质-膜结合。简而言之，测定单独磷脂泡的光散射强度(I1)和加入蛋白质后的散射强度(I2)，并进行缓冲液背景和非结合蛋白校正。蛋白质-囊泡复合物分子量(M2)与单独囊泡分子量(M1)之比可根据方程1中的关系来估算，其中，δn/δc是物质各自的折射指数。
              I2/I1＝(M2/M1)2(δn/δc2/δn/δc1)2    (方程1)
如果知道磷脂和蛋白质的浓度，可以估算被结合蛋白(P*PL)和游离蛋白(P)的浓度。用所述值，以及囊泡的最大蛋白结合能力(P*PLmax)(假定对所有蛋白均为1.0g/g)可由方程2得出蛋白质-膜相互作用的平衡常数，其中，所有浓度都以蛋白或蛋白结合位点摩尔数表示。
         KD＝[P][P*PLma-P*PL]/[P*PL]    (方程2)
评价5mM钙时的结合情况，以M2/M1之比表示。
图1显示野生型VIIa(空心圆)和VIIQ11E33因子(实心圆)与PS/PC(25/75)膜，25μg/ml(分图A)或PS/PC(10/90)膜，25μg/ml(分图B)的结合。VIIQ11E33的亲和力比野生型蛋白高得多。与PS/PC(25/75)的结合是定量水平的，所以[蛋白质游离]基本为0。所以，无法从以上信息估算出Kd值。图1中以牛X因子的膜结合(实心三角)作为参照。牛X因子是该家族中亲和力最高的因子之一，2mM钙时，与PS/PC(20/80)的Kd为40nM。McDonald等，1997，Biochemistry，36：5120-5127。根据蛋白质/磷脂之比0.55时(图1)的结果所得牛X因子的Kd是0.025μM。
也测定了野生型和突变型VII因子与PS/PC(10/90)膜的结合(图1B)。VIIQ11E33的结合低于定量水平，这样，可由方程3估算结合常数：
     Kd＝[蛋白质游离][结合位点游离]/[蛋白质结合]    (方程3)
由方程4估算结合位点游离，假设最大M2/M1是1.0(即[结合位点总数总数][磷脂重量浓度/蛋白质分子量])。该家族内数种蛋白质的该值是相同的。参见McDonald等，1997，同上。
    [结合位点游离]＝[结合位点总数]-[蛋白质结合]    (方程4)
采用以上假设和蛋白质比磷脂0.37时的数据，牛X因子的Kd是0.7μM，野生型VII因子的是5.5μM，VIIQ11E33的是0.23μM。这样，显然，与野生型VII因子相比，VIIQ11E33因子的膜结合亲和力大大增强，为维生素K依赖性蛋白中的最高膜结合亲和力之一。
VIIQ11E33因子的增强活化：凝血的第一步涉及VII因子的活化。在含100nMsTF(得自Dr，Walter Kisiel的高度纯化的重组产品，Fiore等，1994，J.Bio1.Chem.，269：143-149)，36nM VIIQ11E33和PS/PC(25/75，22μg/ml)的溶液中进行VII自身活化。在不同时刻，加入0.15mg底物S-2288(Kabi)，通过405nm处的吸光度变化测定对硝基苯磷酸酯产物释放速度，估计VIIaQ11E33的活性。VIIQ11E33制剂的最初活性低于完全活化VIIaQ11E33活性的4％。
已发现，作为活化底物，VIIQ11E33比野生型VII因子好得多。图2显示VIIQ11E33因子的自身活化。用方程5中的关系分析数据(即Fiore等，1994，同上的方程7).
        ln[VIIa]t＝ln[VIIa]0+kcat*y*t    (方程5)
ln[VIIa]t是t时刻的VIIa因子浓度，kcat是VIIa因子作用于VII的催化速度常数，y是VIIa位点的饱和分数。就野生型VIIa而言，以上关系和1μM sTF得到的kcat是0.0045/s，kcat/Km之比是7×103M-1s-1。参见Fiore等，1994，同上)。就酶VIIQ11E33而言，自身活化很快(图2)，只能估计出kcat的下限。这是根据VIIa倍增时间25秒得出的(kcat＝(ln2)/t1/2)。根据所得值(kcatmin＝0.03/s)，该反应底物浓度(3.6×10-8M)，以及假设y＝1.0，得出kcat/[S]值＝8×105M-1s-1。这比VIIQ11E33的实际kcat/Km低得多，但比Fiore等，1994(同上)所估计的野生型VIIa因子/STF的kcat/Km高约100倍。因此，在凝血作用的活化步骤中，酶VIIaQ11E33与底物VIIQ11E33因子的组合优于野生型蛋白质组合。这提示：在最低凝血条件下，VIIQ11E33优于野生型酶。
增强的VIIaQ11E33活性：VIIa因子一旦生成就活化X因子或IX因子。VIIa因子活化牛X因子(0.1μM)是在25℃，50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5，含100mMNaCl，50mM钙，不同量磷脂(PS/PC，25/75)和1mg/ml牛血清白蛋白中进行的。在0时加入VIIa因子(0.06nM VIIaQIIE33或0.6nM野生型VIIa)，并在1，3和5分钟时测定Xa活性。将等份混合物(0.2m1)与含10mM EDTA和0.4mM S-2222(Kabi)(一种Xa因子的产色底物)缓冲液混合。在Beckman DV8分光光度计上测定405nm吸光度变化。由磷酸硝基苯反应产物的消光系数(1×104M-1cm-1)和该试验条件下纯化牛Xa因子水解底物的速度33/秒计算产生的Xa因子量。
图3比较了纯化系统中野生型VIIa因子(空心圆)和VIIaQ11E33(实心圆)活化X因子的能力。同样在此反应中，VIIaQ11E33远优于野生型VIIa因子。上述差异在低磷脂浓度下最大。在200μg/ml磷脂浓度下减少了两倍。这可从膜浓度高引起野生型VIIa因子更大部分结合于膜的事实中预计到。还有，在接触低磷脂条件下，VIIaQ11E33功能的增强最大。
VIIaQ11E33的超级血凝作用
用手动倾斜法在37℃进行凝血试验，检测血凝块形成。人血浆(0.1ml)在37℃平衡1分钟。在0.1ml缓冲液体积中加入各种试剂。在血浆中加入可溶性组织因子(50nM)和磷脂(PS/PC，10/90，75μg/ml)，加入图4所示浓度(0.1-32nM)的VIIa因子。最后，加入0.1ml 25mM CaCl2开始反应。测定血凝块形成时间。大多数情况下，记录重复样品的平均值和标准偏差。
图4显示野生型VIIa与VIIaQ11E33在正常人血浆中的凝血时间。由sTF和加入磷脂泡支持凝血。内源性野生型VII因子的浓度约为10nM，对凝血时间几乎没有影响。有或没有sTF时的背景凝血时间为120秒。在上述试验条件下，VIIaQ11E33的活性比野生型VIIa高约8倍。用缺乏VIII因子的血浆得出类似结果，说明该系统中的主要凝血途径与VIIa因子直接活化X因子有关。总之，在膜囊泡和可溶性组织因子支持的促凝血活性方面，VIIaQ11E33因子优于野生型VIIa。加或不加sTF的背景凝血时间都是2分钟，说明野生型酶原在上述条件下几乎没有活性。
与正常组织因子一起的促凝血活性：测定正常人血浆中VIIa和/或VIIQ11E33与sTF一起时的活性。该试验中，内源性VII因子对凝血时间似乎没有影响；有或没有可溶性组织因子血浆的背景凝血时间都是2分钟。在血浆中先加入可溶性组织因子(50nM最终浓度)和VIIa，然后加入钙溶液。测定含不同水平VIIa或VIIaQ11E33样品的凝血时间。检测了两种人血浆制剂，即正常血浆和缺乏VIII因子的血浆。
用标准兔脑含钙组织促凝血酶原激酶-HS(HS＝高灵敏度)(Sigma Chemical Co.)分析正常组织因子支持的凝血作用。混合物含磷脂和膜-结合组织因子。兔脑促凝血酶原激酶-HS以缓冲液1∶100稀释，用于VII(以正常人血浆形式加入，内含10nMVII因子)试验和VIIQ11E33(以纯蛋白形式加入)试验。将促凝血酶原激酶(0.2ml)加入血浆(0.1ml)开始反应，测定形成血凝块所需时间。如生产商所述，还用全长促凝血酶原激酶进行了试验。
在最适人促凝血酶原激酶水平，野生型VII表现出正常水平的活性，约1500单位/mg。这比野生型VIIa因子(80,000单位/mg)低约25倍。VIIQ11E33在标准试验条件下的活性约为1500-3000单位/mg，只比野生型VII高2倍。
当凝血条件亚最适时，野生型VII与VIIQ11E33之间的差异明显增大。图5显示含0.01倍正常促凝血酶原激酶水平的试验中的凝血时间和酶原浓度。在所述条件下，VIIQ11E33活性约为野生型VII因子的20倍。所以，在与许多体内情况相关的限制性凝血条件下，突变VIIQ11E33效力更高尤其明显。
DEGR-VIIaQ11E33的抗凝血活性：用正常血浆和以缓冲液1∶10稀释的人促凝血酶原激酶进行标准凝血试验。如Sorenson，B.B.等，1997(同上)所述，以DEGR修饰VIIaQ11E33因子的活性位点。图6显示在钙缓冲液中，在加入血浆前与促凝血酶原激酶一起培养了15秒的DEGR-VIIaQ11E33(0-4nm)的凝血时间。用手动倾斜法测定形式血凝块所需时间。1nm DEGR-VIIaQ11E33的凝血时间约为45秒。
实施例2-VIIQ11E33因子在大鼠体内的循环时间：
开始时，给2只巴比妥钠麻醉的Sprague Dawley大鼠(325-350g)注射36μgVIIQ11E33因子。通过事先插入了套管的颈静脉进行注射。在图7所示时刻，从事先手术插入了套管的颈动脉抽血。在缺乏VII因子的人血浆中加入1μl 1∶10稀释的大鼠血浆，根据该血浆的凝血时间估算循环血中的VIIQ11E33因子量。用的是兔脑促凝血酶原激酶-HS(Sigma Chemical Co.)1∶100稀释液。用实施例1所述的手动试管倾斜法评价凝血情况。测定VIIQ11E33注射前血浆内的VII因子活性水平，将其作为空白扣除。以log nM表示循环血中的VIIQ11E33因子浓度。在一个假设试验中，第三只鼠接受手术和套管，但不接受VIIQ11E33因子。在试验过程(100分钟)中，动物体内的VII因子活性水平没有变化。在试验最后，用过量戊巴比妥钠杀死大鼠。
在实验全程中，大鼠表现正常，没有凝血表现。所以，VIIQ11E33因子不引起普遍性凝血，即使是在手术后大鼠中。VIIQ11E33的循环寿命一般(图7)，约40％蛋白质在约60分钟内被清除，剩余蛋白的消失则更慢。这与牛凝血酶原从大鼠中清除的速度相似。Nelsestuen和Suttie，1971，Biochem.Biophys.Res.Commun.，45：198-203。这比野生型重组VIIa因子好，后者在功能试验中的循环半衰期是20-45分钟。Thomsen，M.K.等，1993，Thromb.Haemost.，70：458-464。这表明，VIIQ11E33因子没有被识别为异常蛋白，没有因凝血激活而迅速破坏。它在动物体内，好象正常蛋白，具有标准循环寿命。
实施例3-C蛋白膜位点和活性的增强：
虽然人C蛋白的膜亲和力高约10倍，牛和人C蛋白的GLA区(氨基末端的44个残基)氨基酸序列却具有高度同源性。牛C蛋白第11位是脯氨酸，人C蛋白第11位则是组氨酸。考察了以组氨酸取代牛C蛋白第11位脯氨酸和以脯氨酸取代人C蛋白第11位组氨酸的影响。两种蛋白中，第11位是脯氨酸的蛋白都表现出较低的膜亲和力，在牛C蛋白中低约10倍，在人C蛋白中低约5倍。根据所用试验，第11位是脯氨酸的活性人C蛋白(hAPC)活性比野生型hAPC低2.4-3.5倍。含组氨酸-11的牛APC活性比野生型APC高15倍。这表明突变能够改善膜接触和活性。
C蛋白突变：Dr.Johan Stenflo提供了全长人C蛋白的cDNA克隆(临床化学系，University Hospital，Malmo，Sweden)。Dr.Donald Foster(ZymoGenetics，Inc.，USA)提供了牛C蛋白的cDNA克隆。牛C蛋白核苷酸序列的GenBank的登录号是KO2435，NID g163486，人C蛋白的是K02059，NID g190322。
用PCR法进行定点诱变。为了将人C蛋白内第11位组氨酸诱变成脯氨酸，合成以下寡核苷酸：A，5’-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTT-3’(SEQ ID NO：7)(对应于载体pRc/CMV内的核苷酸860-895)，以在pRc/CMV和C蛋白之间产生一个Hind III位点；B，5’-GCACTCCCGCTCCAGGCTGCTGGGACGGAGCTCCTCCAGGAA-3’(SEQ IDNO：8)(对应于人C蛋白的氨基酸残疾4-17，该序列内第8位氨基酸由人C蛋白内的诱变成牛C蛋白内的，见下划线)。
为了将牛C蛋白内第11位脯氨酸诱变成组氨酸，合成以下寡核苷酸：A，(如上所述)；C，5’-ACGCTCCACGTTGCCGTGCCGCAGCTCCTCTAGGAA-3’(SEQ IDNO：9)(对应于牛C蛋白的氨基酸残基4-15，第6位的氨基酸由牛C蛋白内的诱变成人C蛋白内的，以下划线标记)；D，5’-TTCCTAGAGGAGCTGCGGCACGGCAACGTGGAGCGT-3’(SEQ ID NO：10)(对应于牛C蛋白的氨基酸残基4-15，第7位的氨基酸由牛C蛋白内的诱变成人C蛋白内的，以下划线标记)；E，5’-GCATTTAGGTGACACTATAGAATAGGGCCCTCTAGA-3’(SEQ ID NO：11)(对应于载体pRc/CMV中的核苷酸984-1019)，在pRc/CMV和C蛋白之间产生产生一个XbaI位点。
将人和牛C蛋白的cDNA克隆到表达载体pRc/CMV的Hind III位点和Xba I位点。用完整的人C蛋白cDNA和引物A和B，PCR扩增5’末端至氨基酸-17的人C蛋白cDNA。PCR反应的体积是100μ1，Tris-HCl缓冲液(10mM Tris，25mMKCl，5mM(NH4)2SO4和2mM MgSO4，pH8.85)中含0.25μg模板DNA，四种三磷酸脱氧核糖核苷各200μM，引物各0.5mM和2.5U Pwo-DNA聚合酶(BoehringerMannheim)。样品PCR循环30轮，每轮：94℃变性2分钟，55℃退火2分钟，72℃延长2分钟。扩增后，DNA在含1mM EDTA的40mM Tris-乙酸盐缓冲液中电泳通过0.8％琼脂糖凝胶。用JET质粒Miniprep-Kit(Saveen Biotech AB，Sweden)纯化PCR产物。含相应突变的人C蛋白cDNA用Hind III和Bsr BI剪切，然后克隆到经Hind III/Xba I剪切并含有人C蛋白内Bsr BI至3’末端片段的载体pRc/CMV中，产生带突变的人C蛋白全长cDNA。
用完整的人C蛋白cDNA和引物A和C，PCR扩增5’末端至氨基酸-11的牛C蛋白cDNA。用完整的人C蛋白cDNA和引物D和E扩增氨基酸-11至3，末端的牛C蛋白cDNA。用引物A和E，以上述两cDNA片段作为模板，扩增含突变氨基酸的全长牛C蛋白cDNA。PCR反应条件与用于hAPC的相同。含相应突变的牛C蛋白cDNA用Hind III和Bsu 36I剪切，将该Hind III/Bsu 36I片段克隆到含牛C蛋白内Bsu 36I至3’末端片段载体pRc/CMV中，产生含该突变的牛C蛋白全长cDNA。转染前，通过DNA测序确认所有突变。
细胞培养和表达：将腺病毒转染的人肾细胞系293培养存DMEM培养基中，其中补充了10％胎牛血清，2mM L-谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素和10μg/ml维生素K1。转染用脂质转染法进行。Felgner，P.L.等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417。将2μgDNA稀释在0.1ml含2mM L-谷胺酰胺培养基的DMEM中。在0.1ml含2mM L-谷胺酰胺培养基的DMEM中加入10μlLipofectin试剂(1mg/ml)。将DNA与Lipofectin混合，室温下放置10-15分钟。以含2mM L-谷胺酰胺培养基的DMEM洗涤细胞单层(5cm培养皿中的铺满率为25-50％)两次。将DNA/脂类混合物稀释在1.8ml含2mM L-谷胺酰胺培养基的DMEM中，加入细胞中，培养16小时。给予细胞2m含10％胎牛血清的完全培养基，恢复48-72小时，然后用胰蛋白酶处理，1∶5接种到含选择培养基(含10％血清和400μg/ml遗传霉素的DMEM)的10cm培养皿中。Yan，S.C.B.等，1990，Bio/Technology 655-661。3-5周的选择后，得到抗遗传霉素的克隆。从每种DNA转染中选取24个克隆，培养至铺满，用单克隆抗体HPC4(针对人C蛋白)和单克隆抗体BPC5(针对牛C蛋白)，以斑点印迹法检测C蛋白表达。分离出产生大量蛋白的克隆，在10μg/ml维生素K1存在下培养至铺满。
以目前的方法为基础，加以修改，纯化重组牛C蛋白及其突变体。Rezair，A.R.和Esmon，C.T.，1992，J.Biol.Chem.，267：26104-26109。稳定转化细胞的无血清条件培养基在4℃，5000rpm离心10分钟。用0.45μm的硝酸纤维素滤膜(MicroFiltration Systerms，Japan)过滤上清液。在293细胞的条件培养基中加入EDTA(最终浓度5mM)和PPACK(最终浓度0.2μM)，然后在室温下用Millipore Con SepLC100(Millipore，USA)通过Pharmacia FFQ阴离子交换柱。用CaCl2梯度(起始溶液：20mM Tris-HCl/150mM NaCl，pH7.4；限制溶液：20mM Tris-HCl/150mMNaCl/30mM CaCl2，pH7.4)洗脱蛋白质。用透析和Chelex100处理去除CaCl2后，蛋白质重新吸附于第二FFQ柱，然后用NaCl梯度(起始溶液：20mM Tris-HCl/150mM NaCl，pH7.4；限制溶液：20mM Tris-HCl/500mM NaCl，pH7.4)洗脱。纯化至此，根据SDS-PAGE测定，野生型和重组突变型牛C蛋白成为君质。
用于纯化野生型和重组突变性人C蛋白的第一柱与用于牛C蛋白的相同。采用Rezair和Esmon所述的层析法，对其进行了就S蛋白纯化法所述的修改。Rezair，A.R.和Esmon，C.T.，1992，同上；He，Z.等，1995，Eur.J.Biochem.，227：433-440。用斑点印迹法鉴定阴离子交换层析得到的含C蛋白组分。合并阳性组分，上样到含Ca2+-依赖性抗体HPC-4的亲和柱上。层析柱用20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4平衡，其中含5mM苄脒-HCl和2mM CaCl2。上样后，用含1M NaCl的上述缓冲液洗柱。然后用含5mM苄脒-HCl的20mM Tris-HCl，150mM NaCl和5mMEDTA，pH7.4洗脱C蛋白。纯化后，先SDS-PAGE后银染色估测所有人和牛重组C蛋白制剂的纯度。用YM10滤膜(Amicon)浓缩蛋白，然后用缓冲液(50mMTris-HCl，150mM NaCl，pH7.4透析12小时，保存于-70℃。以280nm吸光度测定蛋白质的浓度。
正常和突变C蛋白分子与膜的结合：以实施例1所述方法制备LUV和SUV。如前文就VII因子所述，用入射光的90°光散射进行蛋白质膜结合定量(25μg/mlPS/PC(25/75)，5mM钙(0.05Tris缓冲液-0.1M NaCl，pH7.5)。
第11位是组氨酸的牛C蛋白与膜的相互作用比野生型蛋白强约10倍。代入方程2，得C-H11蛋白的KD为930±80nM，野生型C蛋白的是9200±950nM(图8A)。亲和力差异对应于25℃时的约1.4kcal/mol。实际上，牛C-H11蛋白的膜亲和力与天然人C蛋白的(660nM，图8B)几乎相同。这说明，第11位的脯氨酸是人和牛蛋白膜结合位点之间差异的主要基础。
反向取代，即用脯氨酸取代人C蛋白的His-11，降低膜亲和力(图8B)。将以上数据代入方程2，得野生型人C蛋白的KD为660±90nM，人C-P11蛋白的为3350±110nM。引入脯氨酸的影响只略低于牛蛋白内的脯氨酸。
脯氨酸-11对活性C蛋白活性的影响：对野生型和突变型蛋白使用相同条件，通过凝血酶剪切产生活性C蛋白。约150μg的各种C蛋白制剂(1mg/ml)与牛凝血酶(3μg)混合，37℃培养5小时。将反应产物稀释在0.025M Tris缓冲液-0.05MNaCl中，上样到1ml SP-Sephadex C-50柱上。用1ml上述缓冲液洗柱，合并通过的洗液作为活性C蛋白。上样到柱上的蛋白约有65-80％被回收。25℃蛋白酶水解S2366(0.1mM)测定APC的活性。将以上制剂与大规模生产得到的标准制剂比较。标准人APV由Dr.Walter Kisiel提供。用于牛蛋白的标准制剂是大规模制备的凝血酶活化的APC制剂。正常和突变蛋白制剂的牛APC活性都相同(±5％)。用两种牛APC制剂进行比较。凝血酶产生的人APC的活性是标准物的55-60％。该研究中的浓度以对S2366的活性为基础，是标准物的相对值。
根据生产商的说明，标准APTT试验使用牛或人的血浆和标准APTT试剂(Sigma Chemical Co.)。或者，提供高度纯化磷脂形成的囊泡形式磷脂。该试验中，牛血浆(0.1ml)与高岭土(0.1ml配制于0.05M Tris缓冲液中，5mg/ml，pH7.5)或鞣花酸(0.1mM的缓冲液溶液)一起35℃培养5分钟。加入0.1ml含磷脂和所示量APC的缓冲液启动凝血作用，然后加入0.1ml 25mM氯化钙。所有试剂均配制在含0.05M Tris缓冲液，0.1M NaCl，pH7.5的标准缓冲液中。要获得与H11突变体相同的影响，需要平均高14倍的野生型bAPC浓度。10nM bAPC-H11的凝血时间超过120分钟。用此血浆，标准ATPP试剂(Sigma Chemical Co.)在35℃时的凝血时间是61秒。凝血时间是以手工技术记录的。将磷脂量设计成试验中的限制性成分，得到所示凝血时间。所用磷脂是SUV(最终试验中45μg/0.4ml，PS/PC，10/90)或LUV(最终试验中120μg/0.4ml，PS/PC，25/75)。
在多个试验中测定了活性C蛋白的抗凝血活性。图9显示对用限制性磷脂进行的APTT试验的影响。在该试验的条件下，凝血时间几乎线性地降低，与磷脂浓度成反比。要获得与牛APC-H11相同的效果，需要约多14倍的野生型牛APC。
对PS/PC(25/75，LUV)膜重复图9中的部分试验。同样，活性受磷脂限制，调节其浓度，得到360秒的对照凝血时间(120μg 0.25％PS/0.4ml试验)。要获得与H11突变体相同的效果，需要约多15倍的野生型酶。最后，使用标准ATPP试剂((Sigma Chemical Co.，凝血时间：50±2秒)。要使凝血时间倍增到102±5秒，需要约10.0±0.7nM野生型酶。2.2±0.1nM牛APC产生相同的效果。磷脂在标准试验中不是限速成分，所以可能对膜亲和力略有影响。
图8B显示了人蛋白的结果。要将凝血时间延长到野生型APC的水平需要约2.5倍含脯氨酸-11的人APC。引入脯氨酸-11的影响较小，反映人蛋白之间膜亲和力差异较小(图9B)。
Va因子的灭活：用Nicolaes等，1996，Thrombosis and Haemostasis，76：404-410所述方法分析Va因子的灭活。简而言之，牛蛋白时，用0.05M Tris，0.1M NaCl，1mg/ml牛血清白蛋白和5mM钙，pH7.5将牛血浆稀释1000倍。加入磷脂囊泡(5μg/0.24ml试验)和5μl190nM凝血酶以活化V因子。37℃培养10分钟后，加入APC继续培养6分钟。加入牛凝血酶原(至最终浓度10μM)和Xa因子(至最终浓度0.3nM)，37℃培养反应1分钟。将20μl该活化反应的样品加入含S2283底物(60μM)的0.38ml缓冲液(0.05M Tris，0.1M NaCl，5nM EDTA，pH7.5)中。根据405nm吸光度改变测定凝血酶量(ε＝1.0×104M-1S-1，凝血酶的kcat＝100/s)。人蛋白时，将缺乏S蛋白的人血浆(Biopool Canada Inc.)稀释100倍，加入人凝血酶活化Va因子，用研究牛蛋白所用试剂分析产生的Va因子。
牛APC-H11灭活Va因子的活性比野生型强9.2倍(图10A)。与膜结合(上文)一样，人蛋白中脯氨酸-11的影响较小，野生型和P-11突变体之间的平均差异为2.4倍(图10B)。用正常人血浆得到的结果与此相似。
实施例4-鉴定维生素K依赖性蛋白膜接触位点膜亲和力原型：
多种人和牛C蛋白突变体以及其他维生素K依赖性多肽之间的比较得出一个假设的膜接触位置原型。该静电原型为蛋白一侧表面上由结合钙离子形成的正电核心被蛋白氨基酸的负电荷云所包围。该蛋白质家族中成员越接近该静电模式，其与膜的亲和力就越高。
磷脂囊泡，野生型牛C蛋白，蛋白质-膜相互作用研究，C蛋白的活化和定量，以及活性测定如实施例3所述。
如下产生重组突变C蛋白。以PCR法进行定点诱变。合成以下寡核苷酸：A，见实施例3所述。F：5’-GCATTTAGGTGACACTATAGAATAGGGCCCTCTAGA-3’(SEQ ID NO：11)(对应于载体pRc/CMV中的氨基酸984-1019)，在pRc/CMV与C蛋白之间形成一个XbaI位点；G，5’-GAAGGCCATTGTGTCTTCCGTGTCTTCGAAAATCTCCCGAGC-3’(SEQ IDNO：12)(对应于牛C蛋白的氨基酸残基40-27)；H，5’-CAGTGTGTCATCCACATCTTCGAAAATTTCCTTGGC-3’(SEQ ID NO：13)(对应于人C蛋白的氨基酸残基38-27，该序列内的第6和第7氨基酸由QN突变成ED，见下划线)；I，5’-GCCAAGGAAATTTTCGAAGATGTGGATGACACACTG-3’(SEQID NO：14)(对应于人C蛋白的氨基酸残基27-38，该序列内的第6和第7氨基酸由QN突变成ED，见下划线)；J，5’-CAGTGTGTCATCCACATTTTCGAAAATTTCCTTGGC-3’(SEQ ID NO：15)(对应于人C蛋白的氨基酸残基38-27，该序列内的第7氨基酸由Q突变成E，见下划线)；K，5’-GCCAAGGAAATTTTCGAAAATGTGGATGACACACTG-3’(SEQ IDNO：16)(对应于人C蛋白的氨基酸残基27-38，该序列内的第6氨基酸由Q突变成E，见下划线)。
将牛和人C蛋白的全长eDNA克隆到载体pRc/CMV内HindIII和XbaI位置。为了获得牛突变C蛋白E33D34，如下进行靶DNA的PCR扩增。用完整牛C蛋白cDNA和引物A、C扩增含5’末端至氨基酸40的牛C蛋白eDNA。PCR反应条件与实施例3相同。对样品进行30轮PCR，每轮：94℃变性2分钟，55℃退火2分钟，72℃延长2分钟。扩增后，DNA在含1mM EDTA的40nM Tris-乙酸盐缓冲液中，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳。用Geneclean III试剂盒(BIO 101，Inc.USA)纯化PCR产物，用HindIII和BbsI消化含相应突变的牛C蛋白PCR片段。将HindIII/BbsI片段和人C蛋白片段(BbsI-3’末端)克隆到载体pRc/CMV的HindII与XbaI位点，产生带突变的全长牛C蛋白cDNA。以同样方法，但以牛突变C蛋白H11作为PCR模板，产生牛C蛋白突变体H11E33D34。
用完整人C蛋白cDNA和引物A，D，PCR扩增含5’末端至氨基酸38的人C蛋白cDNA。用完整人C蛋白cDNA和引物B，E，扩增含3’末端至氨基酸27的人C蛋白eDNA。以这两段人C蛋白cDNA片段为模板，用引物A，B扩增含突变(E33D34)的全长C蛋白cDNA。由以下步骤获得人C蛋白E33突变体：用完整人C蛋白cDNA和引物A、F扩增含5’末端至氨基酸38的人C蛋白cDNA。用完整人C蛋白cDNA和引物B、G，扩增含3’末端至氨基酸27的人C蛋白cDNA。以这两段cDNA片段为模板，用引物A、B扩增含突变(E33)的全长牛C蛋白cDNA。PCR混合物与程序如前文所述。用HindIII和SalI剪切含相应突变的人C蛋白PCR产物，然后将该片段(HindIII-SalI)与完整人C蛋白片段(SalI-3’末端)一起克隆到载体pRc/CMV的HindII与XbaI位点，产生带突变的全长人C蛋白cDNA。转染前用DNA测序确认所有突变。
如实施例3所述培养和转染腺病毒转染的人肾细胞系293。如实施例3所述纯化人和牛的重组C蛋白。
根据与标准膜的亲和力，将维生素K依赖性蛋白分成4类(表4)。以下给出部分相关蛋白的氨基末端残基作为参考，所述蛋白包括人C蛋白(hC)，牛C蛋白(bC)，牛凝血酶原(bPT)，牛X因子(bX)和人VII因子(hVID，其中的X是Gla(γ-羧基谷氨酸)或Glu。
bPT：ANKGFLXXVRK11GNLXRXCLXX21PCSRXXAFXA31LXSLSATDAF41WAKY
(SEQ ID NO：17)
bX：ANS-FLXXVKQ11GNLXRXCLXX21ACSLXXARXV31FXDAXQTDXF41WSKY
(SEQ ID NO：18)
hC：ANS-FLXXLRH11SSLXRXCIXX21ICDFXXAKXI31FQNVDDTLAF41WSKH
(SEQ ID NO：1)
bC：ANS-FLXXLRP11GNVXRXCSXX21VCXFXXARXI31FQNTXDTMAF41WSFY
(SEQ ID NO：2)
hVII：ANA-FLXXLRP11GSLXRXCKXX21QCSFXXARXI31FKDAXRTKLF41WISY
(SEQ ID NO：3)
                                               表4
                                           电荷和亲和力
                                残基
  11+   29+   33+   34+   ＝和   总电荷   KD(nM)
  I类
  bZ   -2   +   -2   -1   -4   -6   0.2a-32
  hZ   -2   +   -2   -3   -5   2.0a-170
  II类
  bPT-TNBS   -2   -2   -1   ＜10
  hVII-Q11E33   +   -2   -1   -2   -2   10
  hS   +   -2   -1   -2   -2   40
  bX   +   -2   -1   -2   -3   40
  bC-E33D34   P   +   -2   -1   -2   -4   125
  hX   +   +   -2   -1   -1   -2   160
  bPT   +   -2   -1   0   100
  hPT   +   +   -2   -1   -1   -
  bS   +   +   -2   0   0   120
  III类
  bIX   +   -2   -1   -1   1000
  hIX   +   -2   -1   -1   1000
  hC   +   +1   -2   660
  bC-H11   +   +1   -1   930
  IV类
  hC   P   +   +1   -2   330
  hVII   P   +   +   -1   +1   +1   4000
  bC   P   +   +1   -1   9200
  bVII   P   +   +   +1   0   15000
a：较高的亲和力值等于k解离/1×107M-1S-1；分母是其他蛋白的典型k结合。
表4中，突变的维生素K依赖性多肽以粗体表示。总电荷包括7个钙离子(+14)和氨基末端(+1)。
Z蛋白因为其解离速度常数比其他蛋白慢100至1000倍，所以归入I类。如果Z蛋白表现出一般结合速度常数(约107M-1S-1)，则KD将约为10-10M。Wei，G.J.等，1982，Biochemistry，21：1949-1959。后一亲和力值可能是维生素K蛋白的最大亲和力。IV类蛋白与III类蛋白的区别在于脯氨酸-11，该残基可能以非静电方式改变亲和力。
虽然膜亲和力与残基1-34的净负电荷之间没有密切关联，只考虑残基5、11、29、33和34时，则发现了密切的关联性(表4)。这几个氨基酸位于蛋白质的表面。通过氨基酸取代将许多蛋白质塑造成凝血酶原结构，并用DelPhi程序测定了它们的静电电势。图11显示牛Z蛋白静电电势草图。7，8，26，30，33，34和11位上的负电荷形成一个负电荷云，包围着由钙衬孔隙产生的阳离子核心(图11)。蛋白质结构越接近于该结构，则其与膜的亲和力越高。从野生型蛋白，突变蛋白和化学修饰蛋白都可以看到这一关联性。
通过检查在其他蛋白质中所没有的带电基团，可以得出其他结构图形。例如，牛凝血酶原的Lys-11和Arg-10在其附近形成高正电区；C蛋白和VII因子内的Gla-33缺乏降低这些蛋白区的负电性。所有情况中，最高亲和力所对应的结构是：正电核心完全被负电性蛋白表面所包围，如Z蛋白所示。以上方式的例外是具有Pro-11和Ser-12的蛋白质(人C蛋白)，Pro-11通过结构效应降低亲和力，Ser-12是独特的不带电残基。
为了进一步验证静电分布原型假设，通过定点诱变用Glu33Asp34取代牛C蛋白和人C蛋白的Gln33Asn34(SEQ ID NO：19)。Glu33应在蛋白合成过程中进一步修饰成Gla。上述改变将牛C蛋白的静电电势改变成了牛X因子的静电电势。估计该突变蛋白的膜亲和力将因为有脯氨酸-11而低于X因子。实际上，牛突变C蛋白的膜亲和力与牛凝血酶原的相似(图12A)，略低于牛X因子(表4)。
更有趣的是，突变APC的凝血抑制强于野生型酶(图12B，C)。结合实施例3牛C蛋白P11H突变体的结果显示，改变第11，33和34位的氨基酸取代可产生各具不同膜亲和力和活性的蛋白质家族。
含E33和E33D34的突变人C蛋白的膜结合亲和力略有升高(图13A)。这些突变体的活性略低于野生型(图13b)。牛C蛋白突变体的结果显示，人蛋白内E33D34突变的无效可能是因为该蛋白内的H11和/或其他独特氨基酸所致。图14A显示：牛C蛋白的H11突变体与膜结合的亲和力比野生型蛋白高约10倍，E33D34突变体的亲和力高约70倍，但三联突变体H11E33D34只略强于H11突变体。以上关系也反映在由这些突变蛋白形成的APC活性上(图14B)。以上结果说明，H11的存在降低E33D34对膜结合亲和力的影响。
以上结果显示，引入E33D34并非对所有蛋白都适合。所以，要产生采用E33D34且膜亲和力提高最大的人C蛋白，可能需要其他突变。牛蛋白所得结果显示，组氨酸11可能是这一现象的主要原因。所以，在人C蛋白内，与E33D34一起，可将H11换成谷胺酰胺或其他氨基酸。可能影响亲和力的另一氨基酸是第12位的丝氨酸，该氨基酸是人C蛋白独有的氨基酸。上述其他改变应能得到膜亲和力增强的蛋白质。
还通过比较人和牛的X因子检验了静电原型。人X因子内存在赖氨酸-11提示其亲和力应低于牛X因子。图15所示结果证实了这一预计。
早期研究显示，牛和人凝血酶原片段1的三硝基苯磺酸(TNBS)修饰对膜亲和力的影响较小(0-5倍)。Weber，D.J.等，1992，J.Biol.Chem.，267：4564-4569；Welsch，D.J.等，1988，Biochemistry，27：4933-4938。反应条件造成氨基末端衍生，这一改变与膜亲和力降低相关。Welsch，D.J.和Nelsestuen D.L.，1988，Biochemistry，27：4939-4945。保护氨基末端的钙存在下修饰蛋白质，使得TNBS修饰蛋白的膜亲和力大大高于天然片段1。
Z蛋白构成此原型这一提法的基础是其解离速度常数，以及，普通结合速度产生的KD＝10-10M。是否能达到该值不一定。可能，Z蛋白结合速度慢是因为不恰当的蛋白质折叠降低了膜结合构象浓度。如果能改变条件以改善蛋白质折叠，应该能提高Z蛋白的结合速度。实际上，改变pH提高Z蛋白的结合速度常数。这一现象的基础可能与凝血酶原结构的特殊性有关，该结构使氨基末端(pH7.5时为+1)靠近钙离子2和3。
图11中，是氨基酸末端的+1电荷形成了Ca-1正上方的弱正电区。Ca与氨基末端之间的电荷斥力使得蛋白折叠不稳定，可能对折叠稳定性低的蛋白构成严重问题。
表5提供了上述原型的其他支持。它显示了离子团距锶离子1和8(对应于钙离子1和凝血酶原Sr X光晶体结构中发现的另一个二价金属离子)距离之间的关系。该图式显示，离子团越靠近上述金属离子，它对膜亲和力的影响越大。Arg-16例外，它为正电核心提供电荷。较高的亲和力与所有其他位点上的负电荷相关。以上关联也适用于GLA残基。
                               表5
                   距Sr-1，8的距离和离子重要性
  距离()：影响/离子
位置   原子a   Sr-1   Sr-8   对KD(KM)的作用
(A.A-蛋白质)
3(K-PT)   ε-N   22.1   21.7   低或未知
5(K-IX)   对-C(F)   20.1   20.8   低或未知
19(K/R-VII)   C5(L)   20.2   17.8   低或未知
22(K-IX)   C4(P)   17.0   18.5   低或未知
10(R)   C6(R)   16.8   12.9   低或未知
25(R-PT)   C6(R)   11.2   13.8   低或未知
24(X/D-PC)   0(S)   8.1   12.0   低或未知
11(K-PT，hX，bS；Gla-PZ)   ε-C(K)   14.7   7.4   3-10倍b
33(Gla)   γ-C(E)   11.6   7.5   3-10倍b
34(D)   O(S)   15.3   12.1   3-10倍b
29(R)   对-C(F)   7.5   8.4   3-10倍b
16(R)   C6(R)   14.2   10.6   3-10倍c
Gla残基d
低重要性：
7   12.8   13.3   +2(＜2)
15   20   16   ＜2(＜2)
20   19.4   17.8   ＜2(＜2)
21   17.2   15   4(3)
33   11.6   7.5   ？e(＜2)
高重要性
8   8.7   10.9   ？e(20)
26   3.6   9.5   ？e(50)
  17   11.1   9.1   ＞200(100)
  27   8.4   10.6   ＞200(85)
  30   3.4   4.2   ＞200(25)
a：距离是从牛凝血酶原的该原子(括弧中是测定所用凝血酶原的残基)到Sr-凝血酶原片段1结构中的锶1和锶8。Seshadri等，1994，Biochemistry 33：1087-1092。b：除16-R之外，阳离子都降低亲和力，阴离子都增强亲和力。
c：Thariath等，1997，Biochem.J.322：309-315。d：Glu突变成Asp的影响，距离是γ-羧基-碳的平均值。KD(KM)来自Ratcliffe等，1993，J.Biol.Chem.268：24339-45。
e：结合能力低，或引起凝聚，使得比较不准确。
图15C的结果显示，pH9时Z蛋白的结合速度显著提高，此时的一个氨基末端应该不带电。以上数据得到的pH9时的速度常数比pH7.5时的高约12倍(图15C)。
                          其他实施例
应该理解，虽然详细描述了本发明，这些描述只是为了说明本发明而不是限定本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求界定。以下权利要求的范围还包括本发明的其他内容，优点和修改。
序列表
<110>Regents of the University of Minnesota
<120>修饰的维生素K依赖性多肽
<130>09531/O02WO1
<150>08/955,636
<151>1997-10-23
<160>35
<170>Windows 3.0版的FastSEQ
<210>1
<211>44
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MOD_RES
<222>(0)...(0)
<223>Xaa＝γ羧基谷氨酸或谷氨酸
<400>1
Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg His Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa
 1               5                  10                  15
Cys Ile Xaa Xaa Ile Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa Ile Phe Gln
            20                  25                  30
Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His
        35                  40
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Cys Ser Xaa Xaa Val Cys Xaa Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Gln
            20                  25                  30
Asn Thr Xaa Asp Thr Met Ala Phe Trp Ser Phe Tyr
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 l               5                  10                  15
Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys
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Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr
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Cys Arg Xaa Xaa Leu Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala His Xaa Ile Phe Arg
            20                  25                  30
Asn Xaa Xaa Arg Thr Arg Gln Phe Trp Val Ser Tyr
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Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe
            20                  25                  30
Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr
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Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe
            20                  25                  30
Xaa Asn Thr Xaa Lys Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr
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<213>人造序列
<220>
<223>Protein C mutagenic oligonucleotide
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<223>C蛋白的诱变寡核苷酸
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gcactcccgc tccaggctgc tgggacggag ctcctccagg aa                         42
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<223>C蛋白的诱变寡核苷酸
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<213>人造序列
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 1               5                  10                  15
Xaa Cys Leu Xaa Xaa Pro Cys Ser Arg Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu
            20                  25                  30
Xaa Ser Leu Ser Ala Thr Asp Ala Phe Trp Ala Lys Tyr
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Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Val Lys Gln Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa
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Cys Leu Xaa Xaa Ala Cys Ser Leu Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa
            20                  25                  30
Asp Ala Xaa Gln Thr Asp Xaa Phe Trp Ser Lys Tyr
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Cys Ile Xaa Xaa Ile Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa Ile Phe Glu
            20                  25                  30
Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His
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Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His
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<223>Xaa＝γ羧基谷氨酸或谷氨酸
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Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa
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Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ile Phe Lys
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Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr
        35                  40
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<212>PRT
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<223>Xaa＝γ羧基谷氨酸或谷氨酸
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Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa
 1               5                  10                  15
Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Asp
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Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr
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Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Glu
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Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr
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Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe
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Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr
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Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr
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Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Phe Xaa Val Phe
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Xaa Asn Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr
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<223>Xaa＝γ羧基谷氨酸或谷氨酸
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Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Xaa Xaa Phe Val Gln Gly Asn Leu Xaa Arg
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Xaa Cys Met Xaa Xaa Lys Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe
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Xaa Asp Thr Xaa Arg Thr Thr Xaa Phe Trp Lys Gln Tyr
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<223>Xaa＝γ羧基谷氨酸或谷氨酸
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Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Glu Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa
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Cys Ile Xaa Xaa Ile Cys Asp Phe Xaa Xaa Ala Lys Xaa Ile Phe Glu
            20                  25                  30
Asp Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His
         35                 40

Claims (26)

1.一种C蛋白或活性C蛋白多肽，含修饰GLA区，该修饰区增强所述多肽的膜结合亲和力，使之高于对应的天然C蛋白或活性C蛋白多肽，所述修饰GLA区具有至少一处氨基酸取代，所述氨基酸取代的位置选自残基10、11、28或33处，非修饰的所述GLA区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述C蛋白或活性C蛋白多肽，其中所述氨基酸取代位于残基10。
3.根据权利要求2所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述残基10为谷氨酸。
4.根据权利要求2所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述残基10为谷氨酰胺。
5.根据权利要求1所述C蛋白或活性C蛋白多肽，其中所述氨基酸取代位于残基11。
6.根据权利要求5所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述残基11为甘氨酸。
7.根据权利要求1所述C蛋白或活性C蛋白多肽，其中所述氨基酸取代位于残基28。
8.根据权利要求1所述C蛋白或活性C蛋白多肽，其中所述氨基酸取代位于残基33。
9.根据权利要求1所述C蛋白或活性C蛋白多肽，还包含位于残基32的氨基酸取代。
10.根据权利要求9所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述残基32为谷氨酸。
11.根据权利要求9所述C蛋白或活性C蛋白多肽，其氨基酸33为天冬氨酸。
12.根据权利要求9所述C蛋白或活性C蛋白多肽，其氨基酸32为谷氨酸且其氨基酸33为天冬氨酸。
13.一种C蛋白或活性C蛋白多肽，含修饰GLA区，该修饰区增强所述多肽的膜结合亲和力，使之高于对应的天然C蛋白或活性C蛋白多肽，所述修饰GLA区含有三处氨基酸取代，所述取代的位置选自残基10、11、28、32和33，非修饰的所述GLA区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
14.根据权利要求13所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述三处氨基酸取代位于残基11，32和33。
15.根据权利要求14所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述残基32为谷氨酸。
16.根据权利要求14所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述残基33为天冬氨酸。
17.根据权利要求14所述C蛋白或活性C蛋白多肽，所述残基32为谷氨酸且所述残基33为天冬氨酸。
18.根据权利要求17所述C蛋白或活性C蛋白多肽，其残基11为甘氨酸。
19.一种分离的核酸，其编码权利要求1-18中任一项所述的C蛋白或活性C蛋白多肽。
20.一种哺乳动物宿主细胞，其含有核酸载体，所述载体包含权利要求19所述的分离的核酸。
21.根据权利要求20所述的哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞是以腺病毒转染的人肾细胞系293。
22.一种药物组合物，包含权利要求1-18中任一项所述的C蛋白或活性C蛋白多肽和药学上认可的载体。
23.权利要求22所述药物组合物用于制造减少哺乳动物血凝块形成的药物的用途。
24.权利要求1-18中任一项所述的C蛋白或活性C蛋白多肽用于制造减少哺乳动物血凝块形成的药物的用途。
25.权利要求1-18中任一项所述的C蛋白或活性C蛋白多肽用于制造治疗哺乳动物血凝疾病的药物。
26.根据权利要求25所述的用途，所述疾病是血栓形成。
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