HU225993B1

HU225993B1 - Modified vitamin k-dependent polypeptides

Info

Publication number: HU225993B1
Application number: HU0102257A
Authority: HU
Inventors: Gary L Nelsestuen
Original assignee: Univ Minnesota
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2008-02-28
Also published as: BR9814611A; HUP0102257A3; PT1090128E; EA200000449A1; KR20010031370A; US6017882A; EP1676919A1; NO20002025L; EP1090128B1; CA2307175C; ATE390486T1; DK1090128T3; NO20002025D0; AP2000001811A0; CA2307175A1; DE69839313D1; SG105547A1; IL135603A0; JP4276379B2; HUP0102257A2

Description

A K-vitamin-dependens proteinek 45 N-terminális aminosavuk között 9-13 gamma-karboxi-glutaminsavat (Gla) tartalmaznak. A gamma-karboxi-glutaminsavakat a máj olyan enzimei termelik, amelyek a proteinprekurzorokban lévő glutaminsavak oldalláncainak karboxilezésére K-vitamint használnak. A K-vitamin-dependens proteinek számos biológiai folyamatban szerepet játszanak, melyek közül a legismertebb a véralvadás [áttekintést lásd Fürié és Fürié: Cell 53, 505 (1988)]. A K-vitamin-dependens proteinek közé tartozik a protein-Z, protein-S, protrombin, X. faktor, IX. faktor, protein-C, VII. faktor és Gas6-protein, mely utóbbi a sejtszaporodás szabályozásában játszik szerepet [Matsubara és munkatársai: Dev. Bioi. 180, 499 (1996)]. Agamma-karboxi-glutaminsavakra e proteinek megfelelő kalciumkötése és membránkölcsönhatása miatt van szükség. A X. faktor membránkötő helye feltételezhetően az 1. és 37. aminosavai között helyezkedik el [Evans és Nelsestuen: Protein Science 5 (pótkötet), 163 (1996)]. Bár a plazmaproteinek Gla-tartalmú régiói nagymértékű szekvenciahomológiát mutatnak, membránaffinitásuk legalább 1000-szeres tartományon belül változhat [McDonald és munkatársai: Biochemistry 36, 5120 (1997)].

A VII. faktor a véralvadás kezdeti stádiumában fejti ki hatását, s valószínűleg a vérrögök kialakulásának egyik kulcsfontosságú eleme. Az inaktív prekurzor (vagy zimogén) enzimaktivitása kicsi, de ez - a Vlla faktort eredményező enzimatikus hasítás következtében - nagymértékben fokozódik. Ezt az aktiválást a Xa faktor, valamint a Vlla szöveti faktor (amely számos sejttípusban megtalálható, integráns membránprotein) katalizálja [Fiore és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 143 (1994)]. A Vlla szöveti faktor által bekövetkező aktiválást autoaktiválásnak nevezzük; ez a Vlla faktor VII. faktorból történő kialakítását eredményező aktiválásban, illetve a Vlla faktor későbbi aktivitásában egyaránt szerepet játszik. Az aktiválás legfontosabb in vivő reakcióútja nem ismeretes. A Vlla faktor a IX. és X. véralvadási faktorokat aktiválja.

A szöveti faktor bizonyos tumorsejtek felületén nagy mennyiségben termelődik. Lehetséges, hogy a szöveti faktor és a Vlla faktor szerepet játszik a tumorfejlődésben és a tumor szövetekre történő átterjedésében (Vrana és munkatársai: Cancer Rés. 56, 5063). A szöveti faktor sejtben történő termelődése és működése az endotoxikus sokkra adott toxikus reakciónak is lényeges faktora lehet [Dackiw és munkatársai: Arch. Surg. 131, 1273 (1996)].

A protein-C-t - az endotélsejtek integráns membránproteinjét képezi trombomodulin jelenlétében - a trombin aktiválja [Esmon és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 859 (1982)]. Az aktivált protein-C (APC) kofaktorával, a protein-S-sel együtt - az Va és Villa faktort bontja le. Az APC-vel szembeni rezisztencia az örökölt trombózisos betegség egyik leggyakoribb formája [Dahlback: Blood 85, 607 (1995)]. A K-vitamin-inhibitorokat általánosan alkalmazzák a trombózisos betegségek profilaxisára.

A K-vitamin-dependens proteinek a hemofília bizonyos típusainak kezelésére alkalmazhatók. Az A típusú hemofíliára (hemofília-A) az aktív Vili. faktor és a Villa faktor hiánya, illetve a Vili. faktor inhibitorainak jelenléte jellemző. A hemofília-B-re az aktív IX. faktor és IXa faktor hiánya jellemző. A VII. faktor hiánya - bár ritka a VII. faktor adagolásával jól kezelhető [Bauer: Haemostasis 26, (1. pótkötet) 155 (1996)]. A Vili. faktor helyettesítésével végzett terápia - a nagy titerű Vili. faktor-inhibitor antitestek bizonyos pácienseknél megfigyelhető kialakulása miatt - csak korlátozottan alkalmazható. A Vlla faktor alkalmazható a hemofília-A és -B kezelésére is. A IXa faktor és a Villa faktor a X. faktort aktiválja. A Vlla faktor jelenléte - azáltal, hogy közvetlenül aktiválja a X. faktort - kiküszöböli a IX. és Vili. faktor szükségességét, s ezáltal (csekély immunológiai következménnyel) megoldhatók a IX. és Vili. faktor hiányával kapcsolatos problémák [Hedner és munkatársai Transfus. Medi. Rév. 7 78 (1993); Nicolaisen és munkatársai: Thromb. Haemost. 76, 200 (1996)]. A Vlla faktor adagolásának hatásos dózisa gyakran igen nagy (45-90 pg/testtömegkilogramm), és az adagolást néhány óránként kell ismételni [Shulmav és munkatársai: Thromb. Haemost. 75, 432 (1996)].

Felismerték, hogy a szöveti faktor oldható - membránkapcsolódási régiót nem tartalmazó - alakja (oldható szöveti faktor vagy sTF) a Vlla faktorral együtt adagolva hatásos a hemofília kezelésére (5 504 064 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Kimutatták, hogy kutyák esetében az oldható szöveti faktor csökkenti a Vlla faktor mennyiségét (ami a hemofília kezelésére szempontjából előnyös). Az sTF/Vlla komplex membránhoz történő kötődése teljes mértékben a VII. faktor membránkapcsolódási helyétől függ. Ez ellentétes a normálszöveti faktor/Vlla faktor komplex membránkötődésével, ami a szöveti faktoron és a Vlla faktoron keresztül valósul meg.

Felismertük, hogy a K-vitamin-dependens polipeptidek γ-karboxi-glutaminsav (GLA) doménjén belüli módosításai fokozzák membránkötődési affinitásukat. Az így módosított K-vitamin-dependens polipeptidek fokozott aktivitásúak, és véralvadásgátlóként, prokoagulánsként, illetve egyéb, a K-vitamin-dependens proteinekkel kapcsolatos funkciók betöltésére alkalmazhatók. Például egy javított VII. faktor-molekula számos előnyös tulajdonsággal bír, például alkalmas a Vlla faktor szükséges dózisának csökkentésére; a beadás gyakoriságának csökkentésére; és/vagy a deficiens állapotok hatásos kezelését lehetővé tevő minőségi változások biztosítására.

A találmány tárgyát módosított GLA-domént tartalmazó K-vitamin-dependens polipeptidek képezik, amelyekben a módosított GLA-domén a protein membránkötődési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli.

A módosított GLA-domén a polipeptid kb. 1. aminosavától a kb. 45. aminosaváig teljed, és legalább egy helyen aminosavszubsztitúciót tartalmaz. A szubsztitúció, például a 11., 12., 29., 33. vagy 34. pozícióban, előnyösen a 11., 33. vagy 34. pozícióban fordul elő. A módosított GLA-domén olyan aminosavszekvenciát tartalmazhat, amely - kalciumtelítettségi állapotban 2

HU 225 993 Β1 olyan harmadlagos szerkezetet mutat, amely negatív töltésű burokkal körülvett kationos magot tartalmaz. A számozás alapját minden esetben az 1. azonosító számú szekvencia képezi.

A K-vitamin-dependens polipeptid, például protein-C, aktivált protein-C, IX. faktor, IXa faktor, VII. faktor, Vlla faktor vagy aktív helyén módosított VIla faktor lehet. A protein-C vagy az aktivált protein-C módosított GLA-doménje a 33. pozícióban glutaminsavat, a 34. pozícióban pedig aszparaginsavat tartalmazhat (19. azonosító számú szekvencia). A protein-C vagy az aktivált protein-C módosított GLA-doménje a 11. pozícióban tartalmazhat glutamint, illetve glutaminsavat is (20., illetve 21. azonosító számú szekvencia). Ezen túlmenően, a protein-C vagy az aktivált protein-C GLAdoménjének 12. aminosava glicinnel lehet helyettesítve (24., illetve 35. azonosító számú szekvencia). A VII. faktor, a Vlla faktor és az aktív helyén módosított Vlla faktor a 11. és 33. pozícióban hordozhat szubsztitúciót. Például a 11. aminosav glutaminnal, a 33. aminosav pedig glutaminsawal lehet helyettesítve (30. azonosító számú szekvencia).

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti K-vitamin-dependens polipeptideket kódoló izolált nukleinsavak. Ahogy itt használjuk, az „izolált („tisztított) kifejezés olyan szekvenciára vonatkozik, amely részben vagy egészben megfelel egy K-vitamindependens polipeptidet kódoló génnek, de mentes azoktól a szekvenciáktól, amelyek egy emlős genomjában a gén két végét normális esetben szegélyezik. A K-vitamin-dependens polipeptid módosított GLA-domént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez viszonyítva - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy emlőseredetű gazdasejt, amely K-vitamin-dependens polipeptidet kódoló nukleinsawektort tartalmaz, mely K-vitamindependens polipeptid módosított GLA-domént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez viszonyítva - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz (például a 11., 12., 29., 33. vagy 34. pozícióban). A K-vitamin-dependens polipeptid például VII. faktor vagy Vlla faktor lehet, és a 11. és 33. pozícióban hordoz szubsztitúciót (például a 11. pozícióban glutamint, a 33. pozícióban glutaminsavat; lásd 30. azonosító számú szekvencia).

A találmány tárgyát képezi továbbá egy gyógyászati készítmény, amely gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, valamint egy K-vitamin-dependens polipeptid olyan mennyiségét hordozza, amely emlősben hatásos a véralvadás gátlására. A szóban forgó K-vitamin-dependens polipeptid módosított GLA-domént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz. A K-vitamin-dependens polipeptid, például protein-C, aktivált protein-C vagy aktív helyén módosított Vlla faktor lehet. A protein-C vagy az aktivált protein-C módosított GLA-doménje a 33. pozícióban glutaminsavat, a 34. pozícióban pedig aszparaginsavat tartalmazhat (19. azonosító számú szekvencia). A protein-C vagy az aktivált protein-C módosított GLA-doménje a 11. pozícióban tartalmazhat glutamint, illetve glutaminsavat is (20., illetve 21. azonosító számú szekvencia). Ezen túlmenően, a protein-C vagy az aktivált protein-C GLA-doménjének 12. aminosava glicinnel lehet helyettesítve (24., illetve 35. azonosító számú szekvencia). Az aktív helyén módosított Vlla faktorban, például a 11. aminosav glutaminnal, 33. aminosav pedig glutaminsawal lehet helyettesítve (30. azonosító számú szekvencia).

Szintén a találmány tárgyát képezi egy gyógyászati készítmény, amely gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, valamint egy K-vitamin-dependens polipeptid olyan mennyiségét tartalmazza, amely hatásos egy emlősben a véralvadás fokozására. A szóban forgó K-vitamin-dependens polipeptid módosított GLA-domént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz. A találmány e megvalósítási módja értelmében hasznos K-vitamin-dependens polipeptid, például VII. faktor, Vlla faktor, IX. faktor vagy IXa faktor lehet. A találmány szerinti gyógyászati készítmény oldható szöveti faktort is tartalmazhat. A VII. faktor és a Vlla faktor a 11. és 33. pozícióban hordozhat szubsztitúciót (például a 11. pozícióban glutamint, a 33. pozícióban glutaminsavat; lásd 30. azonosító számú szekvencia).

A találmány tárgyát képezi továbbá egy K-vitamindependens polipeptid véralvadási rendellenesség kezelésére történő alkalmazása, mely K-vitamin-dependens polipeptid módosított GLA-domént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz. A találmány e megvalósítási módja értelmében hasznos K-vitamin-dependens polipeptidek közé tartozik, például a protein-C, aktivált protein-C, IX. faktor, IXa faktor, VII. faktor, Vlla faktor és az aktív helyén módosított Vlla faktor.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy K-vitamindependens polipeptid alkalmazása véralvadási rendellenesség kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására, mely K-vitamin-dependens polipeptid módosított GLAdomént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz. A találmány e megvalósítási módja értelmében hasznos K-vitamin-dependens polipeptidek közé tartozik, például a protein-C, aktivált protein-C, IX. faktor, IXa faktor, VII. faktor, Vlla faktor és az aktív helyén módosított Vlla faktor.

HU 225 993 Β1

Szintén a találmány tárgyához tartozik egy eljárás véralvadás csökkentésére egy emlősben, melynek során az emlősnek egy K-vitamin-dependens polipeptid véralvadás csökkentésére hatásos - mennyiségét adagoljuk. A K-vitamin-dependens polipeptid módosított GLA-domént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz. A találmány e megvalósítási módja értelmében hasznos K-vitamin-dependens polipeptidek közé tartozik, például a protein-C, az aktivált protein-C és az aktív helyén módosított VIla faktor. A protein-C vagy az aktivált protein-C módosított GLA-doménje a 33. pozícióban glutaminsavat, a 34. pozícióban pedig aszparaginsavat tartalmazhat (19. azonosító számú szekvencia). A protein-C vagy az aktivált protein-C módosított GLA-doménje a 11. pozícióban tartalmazhat glutamint, illetve glutaminsavat is (20., illetve 21. azonosító számú szekvencia). Ezen túlmenően, a protein-C vagy az aktivált protein-C GLA-doménjének 12. aminosava glicinnel lehet helyettesítve (24., illetve 35. azonosító számú szekvencia). Az aktív helyén módosított VIla faktorban, például a 11. aminosav glutaminnal, a 33. aminosav pedig glutaminsawal lehet helyettesítve (30. azonosító számú szekvencia).

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás véralvadás fokozására egy emlősben, melynek során az emlősnek egy K-vitamin-dependens polipeptid - véralvadás fokozására hatásos - mennyiségét adagoljuk. A K-vitamin-dependens polipeptid módosított GLA-domént tartalmaz, amely e polipeptid membránkötési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót hordoz. A találmány e megvalósítási módja értelmében hasznos K-vitamin-dependens polipeptidek közé tartozik, például a VII. faktor, VIla faktor, IX. faktor vagy IXa faktor. A VII. faktorban vagy a VIla faktorban, például a 11. aminosav glutaminnal, a 33. aminosav pedig glutaminsawal lehet helyettesítve (30. azonosító számú szekvencia).

Hacsak másképpen nem jelezzük, a technikai és tudományos kifejezéseket általános jelentésükben alkalmazzuk. Bár a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésére az itt leírtakhoz hasonló vagy azokkal egyenértékű eljárások és anyagok is alkalmazhatók, a következőkben az alkalmas eljárások és anyagok leírását ismertetjük. A találmány leírásában említett valamennyi szabadalmi bejelentést, szabadalmi leírást és egyéb hivatkozást teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintjük. Vitás esetekben a találmány leírása az irányadó. A leírásban említett anyagokat, eljárásokat és példákat csak szemléltetési célból mutatjuk be, s nem tekinthetők a találmány oltalmi körének korlátozásának.

A találmány szerinti megoldás egyéb jellemzői és előnyei a következő részletes leírás és a szabadalmi igénypontok alapján lesznek nyilvánvalóak.

A vad típusú Vlla faktor és a VIIQ11E33 faktor GLAdoménjének aminosavszekvenciáját a 3., illetve 30.

azonosító számú szekvenciaként mutatjuk be. A szarvasmarha-eredetű X. faktor GLA-doménjének aminosavszekvenciáját 18. azonosító számú szekvenciaként; a szarvasmarha-eredetű protein-C GLA-doménjének aminosavszekvenciáját 2. azonosító számú szekvenciaként; a humán protein-C GLA-doménjének aminosavszekvenciáját 1. azonosító számú szekvenciaként; és a szarvasmarha-eredetű protein-C-H11 GLA-doménjének aminosavszekvenciáját 23. azonosító számú szekvenciaként mutatjuk be. A protein-C VQ33E, N34D GLA-doménjének aminosavszekvenciáját 19. azonosító számú szekvenciaként mutatjuk be.

Az 1. ábrán a vad típusú Vlla faktor (üres körök), a VIIQ11E33 faktor (fekete körök) és a szarvasmarha-eredetű X. faktor (fekete háromszögek) membránkötődési eredményeit mutatjuk be (a szórás feltüntetésével).

A 2. ábrán a VIIQ11E33 faktor autoaktiválási eredményeit mutatjuk be. A szaggatott vonal a foszfolipid hiányában mért aktivitást mutatja·

A 3. ábrán a vad típusú Vlla faktor (üres körök), illetve a VllaQ11E33 faktor (sötét körök) X. faktort aktiváló hatását mutatjuk be. A kísérletekben a vad típusú Vlla faktort, illetve a VllaQ11E33-at (sötét körök) 0,06 nM koncentrációban alkalmaztuk.

A 4. ábrán a vad típusú Vlla faktor (üres körök), illetve a VllaQ11E33 faktor (sötét körök) humán vérplazma alvadását - oldható szöveti faktor jelenlétében - fokozó hatását mutatjuk be.

Az 5. ábrán a VII. faktor zimogének humán vérplazma alvadását - normálszöveti faktor jelenlétében - fokozó hatását mutatjuk be.

A 6. ábrán az aktív helyén módosított VllaQI1E33 faktor (DEGR-VllaQ11E33) véralvadást csökkentő hatását mutatjuk be.

A 7. ábrán a VIIQ11E33 faktor patkányokban mért keringési idejét mutatjuk be.

A 8. ábrán normál- és módosított proteinek membránkölcsönhatását mutatjuk be. A 8A. ábrán a vad típusú, szarvasmarha-eredetű protein-C (üres körök) és a szarvasmarha-eredetű protein-C-H11 (fekete körök) vezikulákkal mutatott interakcióját, míg a 8B. ábrán a vad típusú humán protein-C (üres körök) és a humán protein-C-P11 (fekete körök) membránkölcsönhatását mutatjuk be. A szaggatott vonal mindkét ábrán azt az eredményt jelzi, amelyet akkor kapnánk, ha valamennyi protein a membránhoz kötődne.

A 9. ábrán az aktivált protein-C véralvadási időre gyakorolt hatását mutatjuk be. A 9A. ábrán a vad típusú, szarvasmarha-eredetű APC (üres körök) és a szarvasmarha-eredetű APC-H11 (fekete körök) szarvasmarha-vérplazma véralvadási idejére gyakorolt hatása látható. Az eredményeket három kísérlet átlaga ±szórás értékekként adtuk meg.

HU 225 993 Β1

A 9B. ábrán a vad típusú humán APC (üres körök) és a humán APC-P11 (fekete körök) humán vérplazma alvadási idejére gyakorolt hatását mutatjuk be. Az eredményeket ebben az esetben is három kísérlet átlaga ±szórás értékekként adtuk meg.

A 10. ábrán a szarvasmarha-eredetű és humán APC Va faktort inaktiváló hatását mutatjuk be. A 10A. ábrán a vad típusú, szarvasmarha-eredetű APC (üres körök) és a szarvasmarha-eredetű APC-H11 (fekete körök) Va faktort gátló hatását, míg a 10B. ábrán a vad típusú humán APC (üres körök), illetve a humán APC-H11 (fekete körök) humán Va faktorra - protein-S-hiányos vérplazmában - gyakorolt gátlóhatását mutatjuk be.

A 11. ábrán a protein-Z töltéseloszlását mutatjuk be. A függőleges vonalak a pozitív töltésű régiókat, míg a vízszintes vonalak a negatív töltésű régiókat jelzik.

A 12. ábrán különböző protein-C-k membránkötődését és aktivitását mutatjuk be. A 12A. ábrán a vad típusú protein-C (üres körök), a protein-C P11H-mutánsa (fekete négyzetek), s Q33E, N34D-mutáns (fekete körök), illetve a szarvasmarha-eredetű protrombin (üres négyzetek) membránkötődési eredményeit mutatjuk be. A 12B. ábrán e mutánsok véralvadást gátló hatását, míg a 12C. ábrán a mutánsok Va faktort inaktiváló hatását mutatjuk be.

A 13. ábrán humán protein-C-mutánsok membránkötődési és aktivitási eredményeit mutatjuk be. A 13A. ábrán a vad típusú protein-C (üres körök), az E33-mutáns (üres háromszögek) és az E33D34-mutáns (fekete körök) eredményeit hasonlítjuk össze. A 13B, ábrán a vad típusú protein-C (üres háromszögek), az E33-mutáns (üres körök) és az E33D34-mutáns (fekete körök) véralvadási időre gyakorolt hatása látható.

A 14. ábrán a vad típusú, szarvasmarha-eredetű protein-C (üres négyzetek), a H11-mutáns (fekete körök), az E33D34-mutáns (üres háromszögek) és a háromszoros H11E33D34mutáns (üres körök) sejtmembránhoz történő kötődését (14A. ábra), illetve véralvadást gátló hatását (14B. ábra) hasonlítjuk össze.

A 15. ábrán különböző K-vitamin-dependens proteinek membránkölcsönhatási tulajdonságait mutatjuk be. A 15A. ábrán a humán X. faktor (fekete körök) és a szarvasmarha-eredetű X. faktor (üres körök) membránkölcsönhatási eredményeit hasonlítjuk össze. A 15B. ábrán a szarvasmarha-eredetű normálprotrombin

1. fragmense (üres körök), a TNBS-sel módosított 1. fragmens (kalcium hiányában; fekete körök) és a TNBS-sel módosított 1. fragmens (25 mM kalcium jelenlétében; fekete négyzetek) membránkölcsönhatását hasonlítjuk össze. A 15C. ábrán a protein-Z vezikulákhoz történő kötődésének 9-es pH-n (fekete körök), illetve 7,5-es pH-η (üres körök) mért sebességét hasonlítjuk össze.

A találmány egyik szempontja értelmében feltárunk egy K-vitamin-dependens polipeptidet, amely olyan módosított GLA-domént tartalmaz, mely a polipeptid membránkötődési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest növeli. A K-vitamin-dependens polipeptid olyan proteinek csoportjába tartozik, amelyek bioszintézises reakcióútjukban a proteinprekurzorokban lévő glutaminsavak oldalláncainak karboxilezéséhez K-vitamint használnak. A GLA-domén a polipeptid N-terminális régiójában - rendszerint az 1. aminosavtól a kb. 45. aminosavig terjedő régióban - 9-13 γ-karboxi-glutaminsavat tartalmaz, a K-vitamin-dependens polipeptidek példáiként említhető a protein-Z, protein-S, X. faktor, II. faktor (protrombin), IX. faktor, protein-C, VII. faktor és Gas6. A találmány szerinti polipeptidek aminosavainak számozását az 1. azonosító számú szekvenciának megfelelően adjuk meg. A protein-S, protein-C, X. faktor és humán protrombin egyaránt tartalmazhatnak kevesebb aminosavat (például a 4. aminosav hiányzik), ez esetben aminosavszámozásukat ennek megfelelően kell módosítani. Például a szarvasmarha-eredetű protein-C 10. pozíciójában prolin található, de ezt a találmány leírásában - a többi K-vitamin-dependens polipeptiddel történő összehasonlítás elősegítése érdekében - 11. aminosavként említjük. Ahogy a leírásban használjuk, a „polipeptid” kifejezésen aminosavláncot értünk, függetlenül annak hosszúságától és poszttranszlációs módosításaitól. Az aminosavakat szokványos egy- vagy hárombetűs rövidítéseikkel jelöljük.

A GLA-domén módosításai legalább egy aminosavszubsztitúcióra terjednek ki. A szubsztitúciók lehetnek konzervatívak vagy nem konzervatívak. A konzervatív aminosavszubsztitúció során egy aminosav azonos osztályba tartozó aminosawal van helyettesítve, míg a nem konzervatív szubsztitúció eltérő osztályba tartozó aminosawal történő helyettesítést jelent. A nem konzervatív aminosavszubsztitúciók a polipeptid hidrofóbitásának vagy az aminosavoldallánc méretének jelentős mértékű változását idézhetik elő. Ezenfelül, a nem konzervatív szubsztitúciók megváltoztathatják a polipeptid töltését (például a pozitív töltés csökkentésével vagy a negatív töltés bevitelével). A nem konzervatív szubsztitúciók példái közé tartozik, például egy apoláris aminosav bázikus aminosawal történő helyettesítése, vagy egy savas aminosav poláris aminosawal történő helyettesítése. A szubsztitúciók a 11., 12., 29., 33. vagy 34., előnyösen a 11., 33. vagy 34. aminosavpozíciókban fordulhatnak elő. A módosított GLA-domén olyan aminosavszekvenciát tartalmazhat, amely - kalciumtelítettségi állapotban - negatív töltésű burokkal körülvett kationos magot tartalmazó harmadlagos szerkezetet kialakulását teszi lehetővé. Anélkül, hogy egy adott elmélethez ragaszkodnánk, a fokozott membránaffinitás olyan elektrosztatikus mintázat eredménye lehet,

HU 225 993 Β1 amely egy negatív felülettel teljesen körülvett pozitív magból áll.

Számos K-vitamin-dependens polipeptid membránkötött enzim szubsztrátjaként funkcionál. Mivel egy K-vitamin-dependens polipeptid sem mutatja a GLAdomén maximális lehetséges membránkötődési affinitását, e polipeptideknek olyan aminosavakat kell tartalmazniuk, amelyek célja a kötődési affinitás csökkentése. Ennek megfelelően, sok K-vitamin-dependens polipeptid tartalmaz olyan aminosavakat, amelyek a maximális affinitás szempontjából nem optimálisak. Ezek az aminosavak hatékonyan rombolják a kötőhelyeket ahhoz, hogy egy enzimatikus reakcióhoz gyorsabb turnover-t biztosítanak.

A csökkentett membránaffinitás több célból előnyös lehet. A nagy affinitás lassú kicserélődéssel jár, ami korlátozza a reakciósebességet. Például ha a protrombinázenzim a membránokon nagy affinitással kötődik szubsztrátjához, a membránból történő proteincsere és nem az enzimkatalízis - a sebességkorlátozó tényező [Lu és Nelsestuen: Biochemístry 35, 8201 (1996)]. Más módon, a membránaffinitás nem optimális aminosavakkal végzett szubsztitúcióval történő szabályozása kiegyenlítheti a prokoaguláció (X., IX., VII. faktor és protrombin) és az antikoaguláció (protein-C, protein-S) egymással kompeticióban lévő folyamatát. Bár a természetes proteinek membránaffinitása a normális állapotokhoz megfelelő lehet, a membránaffinitás növelésével olyan proteinek hozhatók létre, amelyek in vitro vizsgálatokra alkalmazhatók, illetve javított gyógyszerekként használhatók a véralvadás in vivő (kóros állapotokban történő) szabályozására.

A következőkben a módosított GLA-domént tartalmazó K-vitamin-dependens polipeptidek különböző példáit ismertetjük.

A K-vitamin-dependens lehet polipeptid protein-C vagy aktivált protein-C (APC). A vad típusú humán protein-C (hC) és a vad típusú, szarvasmarha-eredetű protein-C (bC) GLA-doménjét az 1. táblázatban mutatjuk be, ahol „X” jelentése Gla vagy Glu. Általában elmondható, hogy a 11., 33. és 34. pozíciókban semleges aminosavakat (például Q) vagy anionos aminosavakat (például D vagy E) tartalmazó proteinek nagyobb membránaffinitásúak.

1. táblázat hC: ANS-FLXXLRH₁₁SSLXRXCIXX₂₁ICDFXXAKXI₃₁FQNVDDTLAF₄₁WSKH (1. azonosító számú szekvencia);

bC: ANS-FLXXLRP-i·,GNVXRXCSXX₂₁VCXFXXARXI₃₁FQNTXDTMAF₄₁WSFY (2. azonosító számú szekvencia).

A protein-C vagy az aktivált protein-C (APC) módosított GLA-doménje, például a 33. pozícióban glutaminsavat, a 34. pozícióban aszparaginsavat tartalmazhat (19. azonosító számú szekvencia). A 33. pozícióban lévő glutaminsav in vivő γ-karboxi-glutaminsawá módosítható tovább. A módosított GLA-domén az optimális aktivitás céljából, a 11. pozícióban további aminosavszubsztitúciót hordozhat; például a 11. pozícióban glutamint (20. azonosító számú szekvencia), vagy más módon, glutaminsavat vagy aszparaginsavat (21., illetve 22. azonosító számú szekvencia) tartalmazhat. A szarvasmarha-eredetű protein-C a 11. pozícióban szubsztituálva hisztidint tartalmazhat (23. azonosító számú szekvencia). További módosításként a 12. szerin helyett glicint tartalmazhat (24. és 35. azonosító számú szekvencia). A protrombin 29. aminosavának fenil-alaninnal történő helyettesítése egy további hasznos módosítás (25. azonosító számú szekvencia). A fokozott membránkötődési affinitású, módosított protein-C egyéb injektálható véralvadásgátlók (mint például a heparin) alkalmazható. A legtöbb sebészeti beavatkozásnál a heparint alkalmazzák, de ennek hátránya, hogy alacsony a hatékonyság/toxicitás hányadosa. Ezenfelül, a fokozott membránkötődési affinitású, módosított protein-C perorális adagolású véralvadásgátlók (mint például a kumarincsaládba tartozó warfarin) helyett is alkalmazható.

A szóban forgó módosítások az aktív helyén módosított, aktivált protein-C (APC) esetében is alkalmazhatók. Az APC aktív helyét kémiailag, például N-danzilglutamil-glicil-arginil-(klór-metil)-keton (DEGR) alkalmazásával, vagy helyspecifikus mutagenezissel módosíthatjuk [Sorensen és munkatársai: J. Bioi. Chem. 272, 11 863 (1997)]. Az aktív helyén módosított APC a protrombinázkomplex inhibitoraként funkcionál. Az aktív helyén módosított APC fokozott membránaffinitása gyógyászati szempontból hatásosabb polipeptidet eredményez.

A találmány szerinti, K-vitamin-dependens polipeptid VII. faktor vagy aktív VII. faktor (Vlla faktor) is lehet. A természetes VII. faktor membránaffinitása kicsi. A vad típusú humán VII. faktor (hVII) és a szarvasmarha-eredetű, vad típusú VII. faktor (bVII) GLA-doménjének aminosavszekvenciáját a 2. táblázatban mutatjuk be.

2. táblázat hVII: ANA-FLXXLRP₁₁GSLXRXCKXX₂₁QCSFXXARXI₃₁FKDAXRTKLF₄₁WISY (3. azonosító számú szekvencia);

bVII: ANG-FLXXLRPiGSLXRXCRXX₂₁LCSFXXAHXI₃₁FRNXXRTRQP₄₁WVSY (4. azonosító számú szekvencia).

A VII. faktor vagy Vlla faktor módosított GLA-doménje, például a 11. pozícióban glutaminsavat vagy aszparaginsavat (26., illetve 27. azonosító számú szekvencia), a 29. pozícióban fenil-alanint (28. azonosító számú szekvencia), illetve a 33. pozícióban glutaminsavat (30. azonosító számú szekvencia) tartalmazhat. A VII. faktor vagy Vlla faktor GLA-doménje a 11. pozícióban előnyösen glutamint, míg a 33. pozícióban glutaminsavat tartalmaz (30. azonosító számú szekvencia). Az így módosított K-vitamin-dependens polipeptid sokkal nagyobb affinitással kötődik a sejtmembránokhoz, mint a megfelelő, természetes vagy vad tí6

HU 225 993 Β1 pusú polipeptid, továbbá az autoaktiválásban, a Xa faktor létrehozásában és számos más véralvadási vizsgálatban is sokkal nagyobb aktivitást mutat. Aktivitása különösen fokozott mértékű a szélsőséges koagulációs feltételek mellett, például kis szövetifaktor-koncentrációnál és/vagy kis foszfolipidkoncentrációnál. Például optimális tromboplasztinkoncentrációnál a módosított VII. faktor kb. négyszer hatásosabb a vad típusnál, míg az optimális tromboplasztinkoncentráció 1%-ánál az aktivitáskülönbség 20-szoros. In vivő feltehetőleg a szélsőséges prokoagulációs szignálok a legfontosabbak. Az egészséges, illetve hemofíliás páciensek vérplazmája közötti véralvadásiidő-különbségek a jelenleg rendelkezésre álló - optimális tromboplasztinkoncentrációval végzett - véralvadási tesztekkel nem mutathatók ki. Az ilyen minták véralvadási idejének különbségei csak akkor detektálhatok, ha a tesztekben nem optimális tromboplasztinkoncentrációt, illetve hígított tromboplasztint alkalmazunk.

A K-vitamin-dependens polipeptidek további példája az aktív helyén módosított Vlla faktor. A Vlla faktor aktív helye kémiailag (például DEGR alkalmazásával) vagy helyspecifikus mutagenezissel módosítható. A DEGR-rel módosított VII. faktor - különféle adagolási módokon - hatásos véralvadásgátlóként alkalmazható [Arnljots és munkatársai: J. Vasc. Surg. 25, 341 (1997)]. A GLA-domén módosításaival olyan - aktív helyén módosított - Vlla faktort kaphatunk, amely nagyobb membránaffinitásának köszönhetően nagyobb hatékonyságú. Az aktív helyén módosított Vlla faktor módosított GLA-doménje, például a 11. pozícióban glutamint, a 33. pozícióban pedig glutaminsavat tartalmazhat (30. azonosító számú szekvencia).

A K-vitamin-dependens polipeptidek következő példái a IX. faktor és a IX. faktor aktív alakja (IXa faktor). Hasonlóan az aktív helyén módosított Vlla faktorhoz, az aktív helyén módosított IXa és Xa faktor véralvadásgátlóként funkcionálhat. A vad típusú humán IX. faktor (hlX) és a vad típusú, szarvasmarha-eredetű IX. faktor (blX) GLA-doménjének aminosavszekvenciáját a 3. táblázatban mutatjuk be. Például a 11. aminosav aszparaginsawal vagy glutaminsawal lehet helyettesítve (31., illetve 32. azonosító számú szekvencia), a 29. aminosav fenil-alaninnal (33. azonosító számú szekvencia), és a 34. aminosav aszparaginsavval lehet szubsztituálva (34. azonosító számú szekvencia).

3. táblázat hlX: YNSGKLXXFVQnGNLXRXCMXXz^CSFXXARXV₃₁FXNTXRTTXF₄₁WKQY (5. azonosító számú szekvencia);

blX: YNSGKLXXFVQ₁₁GNLXRXCMXX₂₁KCSFXXARXV₃₁FXNTXKRTTXF₄₁WKQY (6. azonosító számú szekvencia).

A találmány egy további szempontja értelmében emlőseredetű gazdasejtet tárunk fel, amely módosított GLA-domént tartalmazó K-vitamin-dependens polipeptidet hordoz, melynek GLA-doménje a polipeptid membránkötődési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest növeli. Ahogy fentebb említettük, a módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót tartalmaz. A találmány szerinti, emlőseredetű gazdasejt, például módosított VII. faktort vagy módosított Vlla faktort hordozhat. A módosított VII. faktor vagy Vlla faktor GLAdoménje a 11. és 33. pozícióban tartalmazhat aminosavszubsztitúciót: a 11. aminosav helyett előnyösen glutamint, a 33. aminosav helyett pedig előnyösen glutaminsavat (30. azonosító számú szekvencia).

A találmány szerinti megoldás céljaira alkalmas, emlőseredetű gazdasejtek a K-vitamin-dependens polipeptid glutaminsavait γ-karboxi-glutaminsawá képesek módosítani. A veséből és májból származó emlőseredetű sejtek különösen alkalmasak gazdasejtként.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy gyógyászati készítmény, amely gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, valamint egy K-vitamin-dependens polipeptid véralvadásgátlásra emlősben hatásos mennyiségét tartalmazza. A K-vitamin-dependens polipeptid olyan módosított GLA-domént tartalmaz, amelyben legalább egy aminosavszubsztitúció található, ami a polipeptid membránkötődési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A találmány szerinti gyógyászati készítményben történő felhasználásra alkalmas, módosított K-vitamin-dependens polipeptidek közé tartozik, többek között, a protein-C, APC, aktív helyén módosított APC, aktív helyén módosított Vlla faktor, aktív helyén módosított IXa faktor és az aktív helyén módosított Xa faktor.

A K-vitamin-dependens polipeptid véralvadás gátlására emlősökben hatásos koncentrációja számos tényezőtől függ, így például az adagolni kívánt vegyület előnyös dózisától, kémiai tulajdonságaitól, az adott gyógyszerkészítményben lévő segédanyagoktól, illetve az adagolás módjától. A találmány szerinti gyógyászati készítmény optimális dózisa az adott páciens általános egészségi állapotától, illetve a kiválasztott vegyület relatív biológiai hatékonyságától is függ. A találmány szerinti gyógyászati készítmények a véralvadás in vivő szabályozására alkalmazhatók. Például a készítmények trombózis kezelésére alkalmazhatók. A K-vitamin-dependens polipeptid csupán néhány aminosavának - fentiek szerint történő - módosítása általában nem változtatja meg jelentősen a mutáns polipeptidek antigénsajátságát.

A módosított GLA-doméneket tartalmazó K-vitamin-dependens polipeptidek gyógyászati szempontból elfogadható, nem toxikus segédanyagokkal vagy hordozókkal összekeverve alakíthatók gyógyászati készítményekké. A parenterális adagolásra szánt készítményeket fiziológiailag puffereit vizes oldatokban készített folyékony oldatok vagy szuszpenziók alakjában; a perorális adagolású készítményeket elsősorban tabletták vagy kapszulák formájában; míg az intranazális adagolású készítményeket főként porok, orrcseppek vagy aeroszolok formájában állítjuk elő. Kívánt esetben - szokványos eljárások alkalmazásával - egyéb módokon adagolható készítmények is előállíthatók.

HU 225 993 Β1

A parenterális adagolásra alkalmas készítmények szokványos segédanyagként vizet vagy sóoldatot, polialkilénglikolokat, például polietilénglikolt, növényi olajokat, hidrogénezett naftalinokat és hasonlókat tartalmaznak. A találmány szerinti vegyületek in vivő felszabadulásának szabályozására alkalmas segédanyagok példáiként említhetők a biokompatibilis, biológiailag lebontható laktidpolimerek, laktid/glikolid kopolimerek vagy poli(oxi-etilén)/poli(oxi-propilén) kopolimerek. A parenterális adagolású készítmények egyéb hordozórendszerei közé tartoznak az etilén/vinil-acetát kopolimerszemcsék, az ozmotikus pumpák, a beültethető infúziós rendszerek és a liposzómák. Az inhalálásra alkalmas készítmények segédanyagként, kívánt esetben, laktózt tartalmazhatnak. Az inhalálókészítmények, például poli(oxi-etilén)-9-!auril-étert, glikokolátot és dezoxikolátot tartalmazó vizes oldatok vagy - orrcseppek formájában történő adagoláshoz olajos oldatok lehetnek. Kívánt esetben a vegyületek intranazálisan alkalmazható gélekbe foglalhatók. A parenterális adagolásra alkalmas készítmények - szájüregben történő alkalmazás esetén - glikokolátot is tartalmazhatnak.

A találmány egy másik megvalósítási módja értelmében olyan gyógyászati készítményt tárunk fel, amely gyógyászati szempontból elfogadható hordozót, valamint egy K-vitamin-dependens polipeptid véralvadás fokozására emlősökben alkalmas mennyiségét tartalmazza. A K-vitamin-dependens polipeptid olyan módosított GLA-domént tartalmaz, amelyben legalább egy aminosavszubsztitúció található, ami a polipeptid membránkötődési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest növeli. Az ilyen gyógyászati készítmények véralvadási rendellenességek (mint például a hemofília-A és -B), illetve májbetegségek kezelésére alkalmasak.

A találmány e megvalósítási módja szerinti gyógyászati készítmények K-vitamin-dependens polipeptidként, többek között, VII. faktort vagy a VII. faktor aktív alakját, Vlla faktort tartalmazhatnak. A módosított VII. faktor vagy Vlla faktor GLA-doménje a 11. és 33. pozícióban tartalmazhat aminosavszubsztitúciót: a 11. aminosav helyett előnyösen glutamint, a 33. aminosav helyett pedig előnyösen glutaminsavat (30. azonosító számú szekvencia). A szóban forgó gyógyászati készítmény oldható szöveti faktort is tartalmazhat. A VII. faktor a véralvadási kaszkád elején való elhelyezkedése és a IX. és X. faktort aktiváló képessége miatt kulcsfontosságú a véralvadás szempontjából. A X. faktor Vlla faktor általi, közvetlen aktiválása a hemofília legfőbb típusainak (A és B) kezelése szempontjából lényeges, mivel ezáltal a IX. és Vili. faktoron keresztül megvalósuló lépések teljesen kikerülhetők. A VII. faktor pácienseknek történő adagolásáról bebizonyosodott, hogy hatásos a hemofília bizonyos típusainak kezelésére. A VII. faktor vagy a Vlla faktor membránaffinitásának - GLA-domén módosításával megvalósított - javítása lehetőséget biztosít arra, hogy a polipeptid érzékenyebb legyen bizonyos véralvadási feltételekre; a VI I./VIla faktor szükséges dózisai csökkenthetők legyenek; a Vll./Vlla faktor beadási intervallumai hosszabbak legyenek; és további minőségi változásokat biztosít, melyek révén hatásosabb kezelés érhető el. A VII. faktor membránkötődési helyének javítása fokozza aktiválási sebességét, illetve javítja a Vlla faktor X. és IX. faktorra gyakorolt hatását. Ezek a lépések az in vivő véralvadási sebességet sokszorosára növelhetik, ami a Vlla faktort számos véralvadási rendellenesség kezelésére kiválóan alkalmas hatóanyaggá teszi.

A véralvadás fokozására alkalmas egyéb K-vitamin-dependens polipeptidek közé tartozik a IX. és IXa faktor.

A találmány egy következő szempontja értelmében eljárásokat tárunk fel véralvadás csökkentésére egy emlősben, melyek során az emlősnek egy K-vitamindependens polipeptid véralvadás csökkentésére hatásos mennyiségét adagoljuk. A K-vitamin-dependens polipeptid olyan módosított GLA-domént tartalmaz, amely a polipeptid membránkötődési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest - növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót tartalmaz. A szóban forgó eljárásban a módosított proteln-C vagy APC, illetve a módosított, aktív helyén gátolt Vlla, IXa, Xa faktor és APC alkalmazható.

A találmány egy másik szempontja értelmében eljárásokat tárunk fel véralvadás fokozására egy emlősben, melyek során az emlősnek egy K-vitamin-dependens polipeptid véralvadás fokozására hatásos mennyiségét adagoljuk. A K-vitamin-dependens polipeptid olyan módosított GLA-domént tartalmaz, amely a polipeptid membránkötődési affinitását - egy megfelelő, természetes K-vitamin-dependens polipeptidéhez képest növeli. A módosított GLA-domén legalább egy aminosavszubsztitúciót tartalmaz. A szóban forgó eljárásban a módosított VII. vagy Vlla faktor, valamint a módosított IX. és IXa faktor alkalmazható.

A találmány szerinti megoldást a következőkben kísérteti példákon keresztül szemléltetjük, de ez nem jelenti a találmány oltalmi körének a bemutatott specifikus megvalósítási módokra történő korlátozását.

1. példa

Megnövelt membránaffinitású és aktivitású VII. faktor

Felismertük, hogy a humán VII. véralvadási faktor membránkötődési affinitása helyspecifikus mutagenezissel fokozható. A P11Q,K33E-mutáns (melyet a leírásban VIIQ11E33 faktornak vagy mutáns VII. faktornak nevezünk; lásd 30. azonosító számú szekvencia) tulajdonságainak karakterizálásával a következőket állapítottuk meg. A vad típusú VII. faktorhoz képest membránaffinitása kb. 20-szorosára; a mutáns általi autoaktiválás legalább 100-szorosára növekedett. A VIIQ11E33 faktor aktivált alakja (VllaQ11E33) a X. faktort kb. 10-szer nagyobb mértékben aktiválta, mint a vad típusú Vlla faktor. A VllaQ11E33 faktor véralvadási aktivitása normálvérplazmában - oldható szöveti faktor jelenlétében - kb. 10-szerese volt a vad típusú Vlla faktorénak. Ugyanakkor, a VIIQ11E33-zimogén véralvadási aktivitása - normálszöveti faktor jelenlétében

HU 225 993 Β1 (amelyet 1:100 hfgítású tromboplasztin-HS alakjában biztosítottunk) 20-szorosa volt a vad típusú VII. faktorénak. Az aktivitás növekedésének mértéke a véralvadási feltételektől függően változó volt; a VI IQ 11E33 faktor akkor fejtett ki - a vad típushoz képest - lényegesen nagyobb aktivitást, ha csekély koagulációs stimulusok mellett vizsgáltuk.

A proteinek koncentrációját - standardként szarvasmarha-szérumalbumin alkalmazásával - Bradfordteszttel határoztuk meg [Bradford: Analyt. Biochem. 248-254. old. (1976)]. A moláris koncentrációk kiszámításához a VII. faktor molekulatömegét 50 kD-nak, a X. faktorét 55 kD-nak tekintettük. Hacsak másképpen nem jelezzük, az aktivitási méréseket standard pufferben (0,05 M Tris., pH=7,5; 100 mM NaCI) végeztük.

Mutáns VII. faktor előállítása

A mutáns VII. faktort vad típusú VII. faktor cDNSből (GenBank-nyilvántartási szám: M13232, NID g 182799) hoztuk létre [Petersen és munkatársai: Biochemistry 29, 3451 (1990)]. A vad típusú VII. faktor cDNS-ében a VII. faktor 11. prolinjának glutaminnal történő helyettesítését eredményező P11Q-mutációt, illetve 33. lizinjének glutaminsawal történő helyettesítését eredményező K33E-mutációt polimeráz-láncreakcióval (PCR) hoztuk létre, lényegében Valette és munkatársai eljárásával [Valette és munkatársai: Nucleic Acids. Rés. 17, 723 (1989)]. Ezen eljárás során a mutációdiagnosztikai eszközként szolgáló Xmalll-felismerési helyet elimináltuk. Az M13232 két mutáns fragmensének szintéziséhez négy PCR-láncindítót terveztünk. Az 1. mutáns fragmens a 221. és 301. pozíciók közötti Mlul/Bglll fragmens, a 2. mutáns fragmens pedig a 302. és 787. pozíciók közötti Bglll/Sstll fragmens. Ezeket a láncindítókat standard PCR-feltételek között (GENEAMP, Perkin-Elmer) - templátként a vad típusú VII. faktor cDNS-e 1 ng-jának alkalmazásával - a megfelelő fragmensek amplifikálására alkalmaztuk. A kapott fragmenseket gélelektroforézissel tisztítottuk, majd Mlul-gyel és Bglll-vel, illetve Bglll-vel és Sstll-vel emésztettük. A kétféle tisztított fragmenst Zem219b expressziós vektorban a VII. faktor cDNS-éhez ligáltuk (amelyből a megfelelő, vad típusú szekvenciákat Mlul/Sstll fragmensként előzőleg eltávolftottuk) (Petersen és munkatársai, lásd fentebb). A mutagenizált fragmenseket - a P11Q- és K33E-szubsztitúció ellenőrzése, illetve az egyéb PCR indukálta változások lehetőségének kiszűrése érdekében - teljes hosszúságukban megszekvenáltuk.

Transzfekció, szelekció és tisztítás

Újszülött hörcsög-eredetű vesesejteket (BHK) 10% magzati borjúszérummal és penicillinnel/sztreptomicinnel kiegészített - Dulbecco-féle módosított Eagletápközegben szaporítottunk. A konfluens állapot előtti stádiumban lévő sejteket a VII. faktor expressziós plazmidjával transzfektáltuk, melynek során „lipofectAMINE” reagenskészletet (Gibco BRL) alkalmaztunk (a gyártó útmutatásai szerint). A transzfekció után két nappal a sejteket tripszinnel kezeltük és - 1 μΜ metotrexátot (MTX) tartalmazó - szelekciós tápközegben hígítottuk. A stabilan transzfektálódott BHK-sejteket penicillinnel/sztreptomicinnel, 5 pg/ml K₁-vitaminnal és 1 μΜ metotrexáttal kiegészített - szérummentes Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben tenyésztettük. A kondicionált tápközeget immunaffinitási oszlopon [Affi-Gel 10 gyantához kapcsolt, kalciumdependens monoklonális antitest (CaFVII22) alkalmazásával; lásd Nakagaki és munkatársai: Biochemistry 30, 10 819 (1991)] kétszer tisztítottuk. A tisztított VIIQ11E33 faktor SDS-poliakrilamid gélen önálló csíkként volt megfigyelhető (a készítményben Vlla faktor nem volt kimutatható). A tiszta VII(P11Q, K33E)-mutáns 1400-2800 VII. faktor egység/mg aktivitást mutatott.

A VII. faktor aktiválása

Az aktivált VllaQ11E33 faktort a VIIQ11E33 faktor szarvasmarha-eredetű Xa faktorral végzett hasításával állítottuk elő (1:100 tömegarány, 37 °C-on egy órás inkubálás). Más módon, a VllaQ11E33 faktort - 7 μΜ VIIQ11E33 faktort, 0,7 μΜ oldható szöveti faktort (sTF) és foszfolipidet [25:75 arányban foszfatidil-szerin/foszfatidil-kolin (PS/PC) elegy (0,1 g/g protein)] tartalmazó elegyben - 37 °C-on 20 percig végzett autoaktiválással kaptuk.

A vad típusú Vlla faktor homogén, rekombináns protein volt (NOVO Nordisk). A két készítmény egyike kereskedelmi forgalomban beszerezhető, liofilizált termék, míg a másik liofilizálatlan termék volt. Az utóbbi proteint FPLC mono-Q oszlopon tovább tisztítottuk, és ez 80 000 egység/mg specifikus aktivitást mutatott („George King NPP” standarddal kalibrálva).

A VIIQ11E33 faktor fokozott membránkölcsönhatása

A protein membránhoz történő kötődésének mérését Nelsestuen és Lim leírása szerint [Biochemistry 30, 10 819 (1977)] végeztük. Korábbi leírások alapján nagy unilamelláris vezikulákat (LUV), illetve kis unilamelláris vezikulákat (SUV) állítottunk elő [Hope és munkatársai: Bochem. Biophys. Acta. 812, 55; Huang: Biochemistry 8, 344 (1969)]. Kloroformban nagy tisztaságú (szarvasmarhaagyból származó) foszfatidil-szerint és tojáseredetű foszfatidil-kolint (Sigma Chemical Co.) elegyítettünk. Az oldószert nitrogéngáz áramoltatásával eltávolítottuk, majd a száraz foszfolipideket pufferben szuszpendáltuk. A kis unilamelláris vezikulákat ultrahangozással és gélszűréssel, míg a nagy unilamelláris vezikulákat fagyasztással/felolvasztással és extrudálással állítottuk elő. A foszfolipidkoncentrációt szervesfoszfatáz-vizsgálati eljárással határoztuk meg (a foszforíoszfolipid tömegarányt 25-nek feltételezve).

A kis unilamelláris vezikulákat 25:75-ös vagy 10:90-es PS/PC aránnyal állítottuk elő. A proteint az 1. ábrán felsorolt tömegarányokban adtuk a foszfolipidhez. A protein membránhoz történő kötődését Nelsestuen és Lim eljárásával [(1977), lásd fentebb] a beeső fényre 90°-os szögben mért fényszóródás alapján határoztuk meg. Ennek során megmértük a foszfolipidvezikulák fényszórási intenzitását (I·,), majd a mérést a protein hozzáadása után is elvégeztük (l₂), és a kapott értékeket a puffemek és a nem kötődött proteinnek tulajdonítható háttérértékkel korrigáltuk. A protein/vezikula komplex molekulatömegének (M₂) a protein nélküli

HU 225 993 Β1 vezikulák molekulatömegéhez (M·,) viszonyított aránya az 1. egyenlet alapján határozható meg (amelyben δπ/δο az illető vezikulafajta törésmutatója):

Ι₂/Ιι=(Μ₂/Μ₁)²(δη/δο₂/δη/δθι)² (1. egyenlet)

Ha a foszfolipid- és a proteinkoncentráció ismert, meghatározható a kötött protein koncentrációja [P-PL] és a szabad protein koncentrációja [P]. Ezek az értékek - a vezikulák maximális proteinkötési kapacitásával [P'PL_max ] együtt (amelyet az összes protein tömegére vonatkoztatva 1,0 g/g-nak fogadunk el) - felhasználhatók a protein-membrán kölcsönhatás egyensúlyi állandójának 2. egyenlettel történő meghatározására (ahol valamennyi koncentráció a protein vagy proteinkötő helyek molaritásaként van kifejezve):

K_d=[P]lP-PL_max-P PL]/[P-PL] (2. egyenlet)

A kötődést 5 mM kalciumkoncentrációnál határoztuk meg, és nagyságát M₂/M₁ értékként fejeztük ki.

Az 1. ábrán a vad típusú Vlla faktor (üres körök) és a VIIQ11E33 faktor (fekete körök) 25:75 PC/PS összetételű (1A. ábra), illetve 10:90 PC/PS összetételű membránokhoz (1B. ábra) történő kötődésének grafikonjait mutatjuk be. Az eredményekből látható, hogy a VIIQ11E33 faktor sokkal nagyobb aktivitású volt, mint a vad típusú protein. A 25:75 PS/PC arányú membránhoz történő kötődés kvantitatív szintű volt, így a szabad protein koncentrációja gyakorlatilag nulla, így a «^értékek ebből az adatból nem határozhatók meg. Az 1. ábrán összehasonlítási alapként a szarvasmarhaeredetű X. faktor membránhoz történő kötődését is bemutatjuk (fekete háromszögek). A szarvasmarha-eredetű X. faktor a család legnagyobb affinitású proteinjeinek egyike: 2 mM kalciumkoncentrációnál a 20:80 PS/PC-összetételű membránhoz történő kötődésének K_d értéke 40 nM [McDonald és munkatársai: Biochemistry 36, 5120 (1997)]. A szarvasmarha-eredetű X. faktor K_d-értéke 0,55-os protein/foszfolipid aránynál (1. ábra) 0,025 μΜ-nak bizonyult.

A vad típusú és mutáns VII. faktor 10:90 PS/PC arányú membránokhoz történő kötődésének grafikonját az 1B. ábrán mutatjuk be. A VIIQ11E33 faktor kvantitatív szint alatt kötődött, így a 3. egyenlet alapján meghatározható a kötési állandó:

K_d=[protein_szabad] [kötőhely_szabad]/[protein_kötött] (3. egyenlet)

A szabad kötőhely-koncentrációt a 4. egyenletből maximális Μ₂/Μ_Ί értékként 1,0-et feltételezve - határoztuk meg {vagyis [kötőhely_összes]=[foszfolipid_tömeg konc/P^roteinMr]}· Ez az érték több, e családba tartozó proteinre jellemző [Id. McDonald és munkatársai: Biochemistry 36, 5120(1997)].

[Kötőhely_szabad]=[kötőhely_összesHprotein_kötött]

E feltételezések és 0,37-es protein/foszfolipid arány alkalmazásával a szarvasmarha-eredetű X. faktor K_dértéke 0,7 μΜ, a vad típusú VII. faktor K_d-értéke 5,5 μΜ, a VIIQ11E33 faktor K_d-értéke pedig 0,23 μΜ volt. Ilyenformán, nyilvánvaló, hogy a VIIQ11E33 faktor membránkötődési affinitása a vad típusú VII. faktoréhoz képes jelentős mértékben javult, és ez a K-vitamindependens proteinek között az egyik legnagyobb membránkötődési affinitású protein.

A VIIQ11E33 faktor fokozott mértékű aktiválása

A véralvadás első lépése a VII. faktor aktiválását foglalja magában. A VII. faktor autoaktiválását 100 nM sTF-et [nagymértékben tisztított rekombináns termék Dr. Walter Kisieltől; Fiore és munkatársai: J. Bioi. Chem. 269, 143 (1994)]; 36 nM VIIQ11E33 faktort és 25:75 PS/PC arányú foszfolipidet (22 pg/ml) tartalmazó oldatban végeztük. A VllaQ11E33 faktor aktivitását különböző időközönként 0,15 mM S-2288 szubsztrát (Kabi) hozzáadásával, és a p-nitro-fenil-foszfát termék felszabadulási sebességének - 405 nm-nél mért abszorbancia alapján történő - mérésével határoztuk meg. A VIIQ11E33 faktor kezdeti aktivitása a teljes aktivitású VllaQ11E33 faktor aktivitásának kevesebb mint 4%-a volt.

A VIIQ11E33 faktor az aktiválás sokkal jobb szubsztrátjának bizonyult, mint a vad típusú VII. faktor, a 2. ábrán a VIIQ11E33 faktor autoaktiválását mutatjuk be. Az adatokat az 5. egyenlet [Fiore és munkatársai (1994) fentebb említett cikkének 7. egyenlete] összefüggése alapján analizáltuk.

ln[Vlla]_t=ln[Vlla]₀+k_kat-y-t (5. egyenlet)

Az „ln[Vlla]_t a Vlla faktor t időpontban mért koncentrációja; „k_kat a Vlla faktor VII. faktorra ható katalitikus sebességi állandója; és „y” a Vlla faktor kötőhelyeinek frakcionális telítettsége. A vad típusú Vlla faktor esetében - 1 μΜ sTF-koncentráció mellett - ez az összefüggés 0,0045/s k_kat-értéket, illetve 7*10³ M^_1s^_1kkat/Km arányt adott [Id. Fiore és munkatársai (1994), lásd fentebb]. A VIIQ11E33 faktor esetében az autoaktiválás gyors volt (lásd 2. ábra), s a kkat-értékre csak egy alsó határértéket lehetett meghatározni. Ezt a Vlla faktor kb. 25 másodperces kettőzési idejéből kaptuk [^kkat⁼(^ln2)/ti/2]· A kapott kkat(min )=0,03/s érték a reakció szubsztrátkoncentrációjával (3,6*10^-8 M) együtt, és y értékeként 1,0-et feltételezve kkat/[S] arányra 8*10⁵M^_1s^_1 értéket kaptunk. Ez sokkal kisebb a VIIQ11E33 faktor valódi kkat/Km értékénél, de kb. 100-szor nagyobb volt a vad típusú Vlla faktor/sTF Fiore és munkatársai [(1994), lásd fentebb] által megbecsült k_kat/kM értékénél. Ennek megfelelően, a VllaQI1E33 enzim és a VIIQ11E33 faktor szubsztrát kombinálása a véralvadás aktiválási lépésében sokkal jobb eredményeket ad, mint a vad típusú proteinek. Ez arra utal, hogy a VIIQ11E33 faktor minimális szintű véralvadás-feltételek mellett sokkal előnyösebb, mint a vad típusú enzim.

A VllaQI 1E33 faktor megnövelt aktivitása

Képződését követően a Vlla faktor a X. vagy IX. faktort aktiválja. A szarvasmarha-eredetű X. faktor (0,1 μΜ) Vlla faktor általi aktiválását -100 mM NaCI-ot, 5 mM kalciumot, különböző mennyiségű foszfolipidet (PS/PC=25:75) és 1 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó - 50 mM Tris-HCI-pufferben (pH=7,5), 22,5 °C-on hajtottuk végre. Az oldathoz 0 időpontban Vlla faktort (0,06 nM VllaQI 1E33 vagy 0,6 nM vad típusú Vlla faktor) adtunk, majd 1., 3. és 5. perc végén meghatároztuk a Xa faktor aktivitását. A reakcióelegy aliquotjait (0,2 ml) 10 mM EDTA-t és 0,4 mM S-2222 kromogén szubsztrátot (Kabi) tartalmazó puf10

HU 225 993 Β1 ferrel (0,2 ml) elegyítettük. Az abszorbancia változását 405 nm-nél Beckman DU8 spektrofotométerrel határoztuk meg. A Xa faktor képződött mennyiségét a p-nitro-fenil-foszfát reakciótermék extinkciós állandója (1*10⁴ M^_1cm^_1) és a tisztított szarvasmarha-eredetű Xa faktor vizsgálati körülmények között mért szubsztráthidrolizálási sebessége (33 l/s) alapján határoztuk meg.

A 3. ábrán a vad típusú VI la faktor (üres körök) és a VllaQ11E33 faktor (sötét körök) tisztított rendszerben X. faktort aktiváló képességét hasonlítjuk össze. A VllaQI 1E33 faktor ebben az esetben is sokkal hatékonyabb volt, mint a vad típusú VI la faktor. A különbség kis foszfolipidkoncentrációnál volt legnagyobb, és 200 pg/ml foszfolipidkoncentrációnál kétszeresre csökkent. Ez várható volt azon tény alapján, hogy a nagy membránkoncentráció a vad típusú Vlla faktor nagyobb arányú - membránhoz történő - kötődését eredményezi. Még egyszer: a VllaQI 1E33 faktor fokozott aktivitása az alacsony foszfolipidkoncentrációnál volt a legnagyobb mértékű.

A VllaQI 1E33 faktor véralvadást serkentő aktivitása

A véralvadási vizsgálatokat 37 °C-on, manuális billentéses módszerrel végeztük. Humán vérplazmát (0,1 ml) 37 °C-on egy percig ekvilibráltunk, majd a plazmához 0,1 ml standard pufferben különböző reagenseket adagoltunk. Az oldható szöveti faktort (50 nm) és a foszfolipidet (PS/PC=10:90; 75 pg/ml) a Vlla faktor

4. ábrán feltüntetett koncentrációival együtt adtuk hozzá a vérplazmához, végül - a reakció beindítása céljából - az egészhez 0,1 ml 25 mM CaCI₂-ot adtunk, és mértük a vérrög kialakulásához szükséges időt. Eredményként többnyire ismételt kísérletek átlag ±szórás értékeit adtuk meg.

A 4. ábrán normál humán vérplazma vad típusú Vlla faktor és a VllaQI 1E33 faktor hatására bekövetkező véralvadásának idejét mutatjuk be. A véralvadást sTF és foszfoiipidvezikulák hozzáadásával segítettük elő. Az endogén vad típusú VII. faktor hozzávetőleg 10 nM koncentrációban volt jelen, és lényegében nem befolyásolta a véralvadási időt; a véralvadási idő alapértéke (háttérszínt) 120 másodperc volt (sTF jelenlétében vagy a nélkül). A VllaQ11E33 faktor az adott vizsgálati feltételek mellett kb. 8-szor nagyobb aktivitást mutatott, mint a vad típusú Vlla faktor. A Vili. faktorra nézve hiányos vérplazmával hasonló eredményeket kaptunk, ami arra utal, hogy a véralvadásban a fő reakcióét a X. faktor Vlla faktor általi közvetlen aktiválása. Összegzésül: a VllaQI 1E33 faktor - membránvezikulák és oldható szöveti faktor által segített - prokoaguláns aktivitása nagyobb, mint a vad típusú Vlla faktoré. A vad típusú zimogén e vizsgálati körülmények között gyakorlatilag nem fejtett ki aktivitást, amit az jelez, hogy oldható szöveti faktor jelenlétében vagy hiányában egyaránt kétperces véralvadási idő háttérszintet mértünk.

A normálszöveti faktor prokoaguláns aktivitása

Normál humán vérplazmában összehasonlítottuk a Vlla faktor és/vagy a VIIQ11E33 faktor oldható szöveti faktor (sTF) jelenlétében kifejtett aktivitását. Az endogén VII. faktor e vizsgálatban nem befolyásolta a véralvadási időt; a háttérszínt - oldható szöveti faktor jelenlétében vagy hiányában - két perc volt.

A vérplazmához oldható szöveti faktort (50 mM végkoncentráció) és Vlla faktort adtunk, majd a reakciót kalciumoldat hozzáadásával beindítottuk. A véralvadási időt különböző koncentrációjú Vlla faktort vagy VllaQI 1E33 faktort tartalmazó mintákban mértük. Kétféle (normál és Vili. faktorra nézve deficiens) humán vérplazmakészítményt teszteltünk.

A normálszöveti faktor által elősegített véralvadást kalciumot tartalmazó, standard nyúlagyeredetű tromboplasztin-HS (HS=nagy szenzitivitás) (Sigma Chemical Co.) alkalmazásával vizsgáltuk. Ez az elegy foszfolipideket és membránkötött szöveti faktort is tartalmazott. A nyúlagyeredetű tromboplasztin-HS-t pufferben 1:100 arányban hígítottuk, és a VII. faktor, illetve a VI IQ 11E33 faktor tesztelésére alkalmaztuk. A vizsgálati oldathoz a VII. faktort normál humán vérplazmaként alkalmaztuk (amely 10 nM VII. faktort tartalmaz), míg a VIIQ11E33 faktort tiszta proteinként adagoltuk. A reakció beindítása érdekében a plazma 0,1 ml-éhez 0,2 ml tromboplasztint adtunk, és mértük a vérrögképződéshez szükséges időt. A teszteket teljes hosszúságú tromboplasztin alkalmazásával is elvégeztük (a gyártó útmutatásai szerint).

A humán tromboplasztin optimális koncentrációjának jelenlétében a vad típusú VII. faktor normális aktivitást (kb. 1500 egység/mg) mutatott. Ez hozzávetőleg 25-ször kisebb, mint a vad típusú Vlla faktor aktivitása (amely 80 000 egység/mg). A VIIQ11E33 faktor standard vizsgálati feltételek mellett kb. 1500-3000 egység/mg aktivitást mutatott, amely csak kétszerese a vad típusú VII. faktorénak.

A vad típusú VII. faktor és a VIIQ 11E33 faktor aktivitása közötti különbség sokkal nagyobb volt, amikor a véralvadási feltételek nem voltak optimálisak. Az 5. ábrán a normális tromboplasztinkoncentráció csupán 0,01-át tartalmazó vizsgálati oldatban kapott véralvadási időket és zimogénkoncentrációkat mutatjuk be. Ilyen feltételek mellett a VIIQ11E33 faktor aktivitása hozzávetőleg 20-szor nagyobb volt, mint a vad típusú VII. faktoré. Ilyenformán, a mutáns VIIQ11E33 faktor nagyobb hatékonysága különösen akkor szembetűnő, ha a véralvadási feltételek nem optimálisak, ami in vivő számos esetben előfordul.

A DEGR-VllaQ11E33 véralvadásgátló aktivitása

Normál humán szérummal és humán tromboplasztinnal (pufferben 1:10 arányú hígítva) standard véralvadási teszteket végeztünk. A VllaQ11E33 faktor aktív helyét DEGR-rel módosítottuk [Sorenson és munkatársai (1997), lásd fentebb], A 6. ábrán a DEGR-VllaQ11E33 különböző koncentrációira (0-4 nM) kapott véralvadási időket mutatjuk be. A DEGR-VllaQ11E33-at - a vérplazma hozzáadása előtt 15 másodpercig - kalciumpufferben tromboplasztinnal inkubáltuk. A vérrögképződéshez szükséges időt manuális billegtetéses módszerrel határoztuk meg. Kb. 1 nM DEGR-VllaQ11E33 jelenlétében a véralvadási idő kb. 45 másodperc volt.

HU 225 993 Β1

2. példa

A VIIQ11E33 faktor keringési ideje patkányban

Két, nátrium-nembutollal altatott Sprague-Dawleypatkányba (325-350 g) - nyaki vénájukba ültetett kanülön keresztül - 0. időpontban 36 pg VIIQ11E33 faktort injektáltunk. A 7. ábrán feltüntetett időpontokban a patkányok carotisából - sebészeti beavatkozással beültetett kanülön keresztül - vért vettünk. A VIIQ11E33 faktor keringésben lévő mennyiségét VII. faktorra nézve deficiens humán vérplazma (amelyhez a patkányvérplazma 1:10 arányú hígításának 1 μΙ-ét adtuk) alvadási ideje alapján határoztuk meg. 1:100 hígítású nyúlagyeredetű tromboplasztin-HS-t (Sigma Chemical Co.) alkalmaztunk. A véralvadást az 1. példában leírtak szerint, manuális kémcső-billegtetéses módszerrel ellenőriztük. A vérplazmában a VI IQ 11E33 faktor injektálása előtt meghatároztuk a VII. faktor aktivitását, és ezt háttérértékként kivontuk az eredményekből. A VIIQ11E33 faktor keringésben mért koncentrációját lóg nM-ként adtuk meg. Végeztünk egy kontrollkísérletet is, amelynek során egy harmadik állatban elvégeztük a kanülbeültetéseket, de a VIIQ11E33 faktort nem adtuk be. Ebben az állatban a VII. faktor mennyisége a kísérlet ideje (100 perc) alatt nem változott. A kísérlet végén az állatokat feleslegben adagolt nátrium-nembutollal túlaltattuk.

A patkányok a kísérlet ideje alatt normálisnak tűntek; véralvadás jelét egyáltalán nem tapasztaltuk. Ilyenformán, a VIIQ11E33 faktor még a sebészeti beavatkozáson átesett patkányban sem okoz véletlenszerű véralvadást. A VIIQ11E33 faktor keringési ideje normális volt (7. ábra); kb. 60 perc alatt a protein hozzávetőleg 40%-a ürült ki, a maradék protein pedig még lassabban tűnt el a keringésből. Ez hasonló volt a szarvasmarha-protrombin patkányból történő kiürülési sebességéhez [Nelsestuen és Suttie: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 45, 198 (1971)]. E sokkal jobb eredmény a vad típusú, rekombináns Vlla faktorénál, amely funkcionális vizsgálat során 20-45 perces keringési felezési időt mutatott [Thomsen és munkatársai: Thromb. Haemost. 70,458 (1993)]. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a VIIQ11E33 faktort a szervezet nem ismeri fel rendellenes proteinként, és szokványos keringési felezési idővel ürül ki.

3. példa

A protein-C membránköto helyei számának és aktivitásának növelése

A szarvasmarha-eredetű és a humán protein-C GLA-doménjében (44 N-terminális aminosav) nagyfokú homológiát mutat, annak ellenére, hogy a humán protein-C membránaffinitása kb. 10-szer nagyobb. A szarvasmarha-eredetű protein-C a 11. pozícióban prolint, a humán protein-C ugyanezen a helyen hisztidint tartalmaz. Kísérletünkben a szarvasmarha-eredetű protein-C 11. prolinjának hisztidinnel történő helyettesítésének és a humán protein-C 11. hisztidinjének prolinnal végzett helyettesítésének hatását vizsgáltuk. Mindkét esetben a 11. helyen prolint tartalmazó protein mutatott kisebb membránkötési affinitást; a szarvasmarha-eredetű protein-C esetében 10-szer, a humán protein-C esetében ötször kisebb affinitást figyeltünk meg. A 11. pozícióban prolint tartalmazó aktivált humán protein-C (hAPC) - az alkalmazott vizsgálati rendszertől függően - 2,4-3,5-szer kisebb aktivitású volt, mint a vad típusú hAPC. A 11. pozícióban hisztidint tartalmazó, szarvasmarha-eredetű APC maximum 15-ször nagyobb aktivitást mutatott, mint a vad típusú hAPC. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy mutagenezissel a protein-C membránkötődési affinitása és aktivitása egyaránt növelhető.

A protein-C mutagenezise

Teljes hosszúságú humán protein-C-cDNS-klónt Dr. Johan Stenflótól (Dept. of Clinical Chemistry, University Hospital, Malmö, Svédország) kaptunk. A szarvasmarha-eredetű protein-C cDNS-klónját Dr. Donald Foster (ZymoGenetics, Inc., USA) bocsátotta rendelkezésünkre. A szarvasmarha-eredetű protein-C cDNSnukleotidszekvenciájának GenBank-nyilvántartási száma KO2435, NID gl63486; a humán protein-C cDNSnukleotidszekvenciájának pedig K02059, NID g190322.

Polimeráz-láncreakcióval helyspecifikus mutagenezist hajtottunk végre. A humán protein-C 11. hisztidinjének prolinnal történő helyettesítése érdekében végzett mutagenezis céljából a következő láncindító oligonukleotidokat szintetizáltuk: „A”: 5-AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCC AAG CTT-3’ (7. azonosító számú szekvencia; amely a pRc/CMV vektor 860-895. nukleotidjainak felel meg). Ez a láncindító a pRc/CMV és a protein-C szekvenciája között Hindi IIfelismerési hely beiktatását teszi lehetővé. A másik („B) láncindító szekvenciája a következő: 5-GCA CTC CCG CTC CAG GCT GCT GGG ACG GAG CTC CTC CAG GAA-3’ (8. azonosító számú szekvencia; amely a humán protein-C 4-17. aminosavait kódoló nukleotidszekvenciának felel meg. E láncindító alkalmazásával a humán protein-C 8. aminosava a szarvasmarha-eredetű protein-C 8. aminosavával kerül helyettesítésre (lásd aláhúzott nukleotidok).

A szarvasmarha-eredetű protein-C 11. prolinjának hisztidinnel történő helyettesítése érdekében végzett mutagenezis céljából a következő láncindító oligonukleotidokat szintetizáltuk: „A” (lásd fentebb); „C”: 5-ACG CTC CAC GTT GCC GTG CCG CAG CTC CTC TAG GAA—30 (9. azonosító számú szekvencia; amely a szarvasmarha-eredetű protein-C 4-15. aminosavainak felel meg). E láncindító alkalmazásával a szarvasmarha-eredetű protein-C 6. aminosavát a humán protein-C 6. aminosavával helyettesítjük (lásd aláhúzott nukleotidok). „D”: 5-TTC CTA GAG GAG CTG CGG CAC GGC AAC GTG GAG CGT-3' (10. azonosító számú szekvencia; amely a szarvasmarha-eredetű protein-C 4-15. aminosavainak felel meg). E láncindító alkalmazásával a szarvasmarha-eredetű protein-C 7. aminosavát a humán protein-C 7. aminosavával helyettesítjük (lásd aláhúzott nukleotidok). „E”: 5-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3’ (11. azonosító számú szekvencia; amely a pRc/CMV vektor 984-1019. nukleotidjainak felel meg.

HU 225 993 Β1

Az „E” láncindító alkalmazása a pRc/CMV és a protein-C nukleotidszekvenciája közé Xbal-felismerési hely beiktatását eredményezi.

A humán és szarvasmarha-eredetű protein-CcDNS-eket a pRc/CMV vektor Hindlll- és Xbal-helye közé klónoztuk. A humán protein-C-cDNS 5’-terminálistól a 17. aminosavat kódoló nukleotidokig terjedő szakaszát templátként teljes humán protein-C-cDNS, illetve az „A és „B láncindító alkalmazásával amplifikáltuk. A polimeráz-láncreakciót 100 μΙ össztérfogatban végeztük. A reakcióelegy Tris-HCI-pufferben [10 mM Tris, 25 mM KCI, 5 mM (NH₄)₂SO₄ és 2 mM MgSO₄; pH=8,85j 0,25 μg templát-DNS-t, a négy dezoxiribonukleozid-trifoszfát mindegyikéből 200-200 μΜ-t, mindkét láncindítóból 0,5-0,5 mM-t és 2,5 egység PwoDNS-polimerázt tartalmazott. A minták polimeráz-láncreakcióját 30 ciklus ismétlésével, ciklusonként 94 °C-on 2 perces denaturálással, 55 °C-on 2 perces hibridizáltatással és 72 °C-on 2 perces lánchosszabbítással végeztük. Az amplifikáció után a DNS-t - 1 mM EDTA-t tartalmazó 40 mM Tris-acetát-pufferben - 0,8%-os agarózgélen elektroforizáltuk. A PCR-termékeket „JET Plasmid Miniprep reagenskészlet (Saveen Biotech AB, Svédország) alkalmazásával tisztítottuk. A megfelelő mutációkat tartalmazó humán protein-C-cDNS-t Hindi11mal és BsrBI-gyel hasítottuk, majd pRc/CMV vektorba klónoztuk - amelyet előzetesen Hindlll-mal és Xbalgyel hasítottunk, és amely a humán protein-C-cDNS BsrBI-helytől 3’-terminálisig húzódó szakaszát tartalmazta -, s ezáltal a mutációt hordozó, teljes hosszúságú humán protein-C-cDNS-t kaptuk.

A szarvasmarha-eredetű protein-C cDNS-ének 5’-terminálistól a 11. aminosavat kódoló nukleotidokig terjedő szakaszát az „A” és „B láncindító oligonukleotid, illetve - templátként - teljes hosszúságú humán protein-C-cDNS alkalmazásával amplifikáltuk. A cDNS

11. aminosavtól 3'-terminálisig terjedő szakaszát a „D és „E láncindítóval, templátként teljes hosszúságú humán protein-C-cDNS alkalmazásával amplifikáltuk. A kapott két cDNS-fragmenst - az „E” és „A” láncind ító alkalmazásával bevitt, mutagenizált aminosavakat kódoló - teljes hosszúságú, szarvasmarha-eredetű protein-C-cDNS amplifikálási templátjaként alkalmaztuk. A polimeráz-láncreakciót a hAPC esetében alkalmazott feltételekkel végeztük. A megfelelő mutációkat hordozó, szarvasmarha-eredetű protein-C-cDNS-t Hindlllmal és Bsu36l-gyel hasítottuk, majd a Hindlll/Bsu36l fragmenst olyan pRc/CMV vektorba klónoztuk, amely a szarvasmarha-eredetű protein-C cDNS-ének Bsu36lhelytől a 3’-terminálisig terjedő ép szakaszát hordozta, s ezáltal a mutációt hordozó, teljes hosszúságú, szarvasmarha-eredetű protein-C-cDNS-t kaptuk. A mutációk meglétét transzfektálás előtt DNS-szekvenálással ellenőriztük.

Sejttenyésztés és expresszáltatás

Adenovírussal transzfektált 293-as humán vesesejteket - 10% magzati borjúszérummal, 2 mM L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 egység/ml sztreptomicinnel és 10 pg/ml K_rvitaminnal kiegészített - DMEM-tápközegben szaporítottunk. A transzfekciót lipofekcióval végeztük [Id. Felgner és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413 (1987)]. Két pg DNS-t 2 mM L-glutamint tartalmazó - 0,1 ml DMEMtápközegben hígítottunk, majd a 2 mM L-glutamint tartalmazó DMEM-tápközeg 100 μΙ-éhez 10 μΙ lipofektint (1 mg/ml) adtunk. A DNS és a lipofektin elegyét összekevertük, majd 10-15 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. Az egyrétegű sejtszőnyeget (5 cm-es Petricsészében 25-50%-os konfluens állapot) 2 mM L-glutamint tartalmazó DMEM-tápközegben kétszer mostuk. A DNS/lipid elegyet 1,8 ml - 2 mM L-glutamint tartalmazó - DMEM-tápközegben hígítottuk, majd a sejtekhez adtuk, és 16 órás inkubálást végeztünk. A sejttenyészethez 2 ml - 10% magzati borjúszérumot tartalmazó

- komplettt tápközeget adtunk, további 48-72 óra hosszat inkubáltuk, majd tripszinnel kezeltük, és szelekciós tápközeget (10% szérummal és 400 pg/ml geneticinnel kiegészített DMEM-tápközeget) tartalmazó 10 cm-es Petri-csészékbe helyeztük át (1:5 arányú hígításban) [Yan és munkatársai: Bio/Technology 655-661 (1990)]. 3-5 hetes szelektálás után geneticinrezisztens telepeket kaptunk. Az egyes DNS-transzfekciókból 24-24 telepet izoláltunk, azokat konfluens állapot eléréséig tenyésztettük, és a tenyésztő tápközeget

- humán protein-C elleni monoklonális HPC4-antitest, illetve szarvasmarha-eredetű protein-C elleni monoklonális BPC5-antitest alkalmazásával végzett - „dot-blot” vizsgálattal protein-C termelődésére teszteltük. A protein-C-t nagy mennyiségben termelő kiónokat izoláltuk, és 10 pg/ml K_rvitamin jelenlétében - konfluens állapot eléréséig tenyésztettük,

A szarvasmarha-eredetű rekombináns protein-C és mutánsának tisztítását egy korábbi eljárás [Id. Rezair és Esmon: J. Bioi. Chem. 267, 26 104 (1992)] némileg módosított változatának alkalmazásával tisztítottuk. Stabilan transzfektált sejtek kondicionált, szérummentes tápközegét 4 °C-on 10 percig percenkénti 5000-es fordulatszámmal centrifugáltuk. A felülúszót 0,45 pm pórusméretű cellulóz-nitrát-membránokon (Micro Filtration Systems, Japán) leszűrtük. A 293-as sejtek kondicionált tápközegéhez 5 mM végkoncentrációban EDTA-t és 0,2 μΜ végkoncentrációban PPACK-ot adtunk, majd szobahőmérsékleten - Millipore Con Sep LC100 (Millipore, USA) alkalmazásával - Pharmacia FFQ anioncserélő oszlopon engedtük át. A proteint CaCI₂-gradiens alkalmazásával eluáltuk (kezdőoldat: 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI, pH=7,4; limitálóoldat: 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI/30 mM CaCI₂, pH=7,4). A kalcium-klorid-dialízissel és Chelex 100-as kezeléssel végzett eltávolítása után a proteint egy másik FFQoszlopon abszorbeáltuk, és NaCI-gradienssel eluáltuk (kezdőoldat: 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI, pH=7,4; limitálóoldat: 20 mM Tris-HCI/500 mM NaCI, pH=7,4). A tisztítás e szakaszában a vad típusú, illetve a mutáns, rekombináns, szarvasmarha-eredetű protein-C SDS-PAGE elektroforézissel végzett meghatározás alapján - homogénnek bizonyult.

A vad típusú és mutáns rekombináns humán protein-C tisztításához első oszlopként a szarvasmarhaeredetű protein-C tisztításánál leírt oszlopot, valamint a

HU 225 993 Β1 protein-S tisztítására Rezair és Esmon által leírt eljárás módosított változatát alkalmaztuk [Rezair és Esmon: J. Bioi. Chem. 267, 26 104 (1992); He és munkatársai: Eur. J. Biochem. 227, 433 (1995)]. Az anioncserélő oszlopról származó, protein-C-t tartalmazó frakciókat „dot-blot” vizsgálattal azonosítottuk. A pozitív frakciókat összeöntöttük és Ca²⁺-dependens HPC4-antitestet tartalmazó affinitási oszlopra vittük fel. Az oszlopot előzetesen - 5 mM benzamidin-HCI-ot és 2 mM CaCI₂-ot tartalmazó - 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI pufferrel ekvilibráltuk. A frakciók feltöltése után az oszlopot az előzővel azonos, de 1 M NaCI-ot tartalmazó pufferrel mostuk. A protein-C-t - 5 mM benzamidin-HCI-ot tartalmazó - 20 mM Tris-HCI/150 mM NaCI/5 mM EDTA (pH=7,4) összetételű pufferrel eluáltuk. Tisztítás után a humán és szarvasmarha-eredetű, rekombináns protein-C-készítmények tisztaságát SDS-PAGE gélelektroforézissel és ezüstfestéssel vizsgáltuk. A proteineket YM10 szűrők (Amicon) alkalmazásával betöményítettük, majd 50 mM Tris-HCI/150 mM NaCI pufferrel (pH=7,4) szemben 12 óra hosszat dializáltuk, végül 70 °C-on szárítottuk. A proteinek koncentrációját 280 nm hullámhossznál mért abszorbancia alapján határoztuk meg.

A normál és mutáns protein-C-molekulák membránokhoz történő kötődésének vizsgálata Az 1. példában leírtak szerint kis és nagy unilamelláris vezikulákat állítottunk elő. A protein-membrán kötődés mennyiségi meghatározását a VII. faktor esetében leírtak szerint (25 pg/ml PS/PC, 25:75), 5 mM kalciumkoncentrációnál (0,05 M Tris/0,1 M NaCI, pH=7,5), a beeső fényre merőleges fényszóródás alapján mértük.

A 11. pozícióban hisztidint tartalmazó, szarvasmarha-eredetű protein-C kb. 10-szer nagyobb affinitással kötődött a membránokhoz, mint a vad típusú protein. A 2. egyenletbe történő behelyettesítéssel a proteinC-H11-mutánsra 930±80 nM K_D-értéket, a vad típusú protein-C-re pedig 9200±95 nM K_D-értéket kaptunk (8A. ábra). Az affinitásban megfigyelhető különbség 25 °C-on kb. 1,5 kcal/mol-nak felelt meg. Valójában a szarvasmarha-eredetű protein-C-H11 membránaffinitása majdnem azonos volt a humán protein-C membránaffinitásával (660 nM, 8B. ábra). Ez arra utal, hogy a humán és szarvasmarha-eredetű proteinek membránkötődési helye közötti különbségek fő okát a 11. pozícióban lévő prolin képezi.

Fordított szubsztitúcióval - vagyis a humán protein-C 11. hisztidinjének prolinnal történő helyettesítésével - a membránaffinitás csökkent (8B. ábra). A 2. egyenletbe történő behelyettesítéssel ezekkel az adatokkal a vad típusú, humán protein-C-re 660±90 nM K_D-értéket, míg a humán protein-C-P11-mutánsra 3350±110 nM K_D-értéket kaptunk. A prolin behelyettesítésének hatása alig volt kisebb, mint a szarvasmarha-eredetű proteinek esetében.

A 11. pozícióban lévő prolin hatása az aktivált protein-C aktivitására

Az aktivált protein-C-t trombinos hasítással állítottuk elő (a vad típusú és a mutáns proteinek esetében azonos feltételeket alkalmazva). A különböző proteinC-készítmények 150 pg-ját (1 mg/ml) szarvasmarhaeredetű trombinnal (3 pg) elegyítettük, majd 37 °C-on 5 óra hosszat inkubáltuk. A reakcióterméket 0,05 M NaCI-ot tartalmazó 0,025 M Tris-pufferben hígítottuk, majd 1 ml térfogatú SP-Sephadex C-50 oszlopra töltöttük. Az oszlopot az előzővel azonos puffer 1 ml-ével mostuk, és az átfolyt frakciót aktivált protein-C-ként gyűjtöttük össze. Az oszlopra felvitt protein kb. 65-80%-át nyertük ki. Az APC-aktivitást 25 °C-on az S2366 (0,1 mM) proteolízisével határoztuk meg. A készítményeket nagyobb mennyiségben előállított, standard készítményekkel hasonlítottuk össze. Standard humán APC-t Dr. Walter «isiéitől kaptunk. Szarvasmarha-eredetű proteinként nagy tételben előállított, trombinnal aktivált APC-t alkalmaztunk. A szarvasmarha-eredetű APC aktivitása a normál- és mutáns proteinek valamennyi készítményének aktivitásával összemérhető volt (±5%). Az összehasonlításra két szarvasmarha-eredetű APC-készítményt alkalmaztunk. A trombinból előállított humán APC standardhoz viszonyított aktivitása 55-60% volt. Az itt említett koncentrációértékek az S2366 proteolízisére vonatkozó - és a standardhoz viszonyított - aktivitásra értendők.

Standard APTT-teszt során szarvasmarha-eredetű vagy humán plazmát, illetve standard APTT-reagenst (Sigma Chemical Co.) alkalmaztunk (a gyártó előírásainak megfelelően). Más módon, a foszfolipidet rendkívüli tisztaságú foszfolipidekből előállított vezikulák alakjában biztosítottuk. A vizsgálat során szarvasmarha-eredetű vérplazmát (0,1 ml) 35 °C-on 5 percig kaolinnal [0,1 M NaCI-ot tartalmazó 0,05 M Tris-pufferben (pH=7,5) 0,1 ml 5 mg/ml koncentrációjú oldat] vagy ellagsawal (pufferben 0,1 mM) inkubáltuk. A véralvadást 0,1 ml - foszfolipidet tartalmazó - puffer, majd a megadott mennyiségű APC, végül 0,1 ml 25 mM kalciumklorid hozzáadásával indítottuk be. Valamennyi reagenst standard pufferben (0,05 M Tris-puffer, 0,1 M NaCI, pH=7,5) alkalmaztuk. A H11-mutáns hatásának megkétszerezéséhez a vad típusú, szarvasmarha-eredetű APC-ből (bAPC) átlagosan 14-szer nagyobb koncentrációra volt szükség. A 10 nM koncentrációjú bAPC-H11 esetében mért véralvadási idő 12 perc feletti volt. Ugyanezen vérplazma esetében standard APTT-reagenssel (Sigma Chemical Co.) 35 °C-on kb. 61 másodperces véralvadási időt mértünk. A vérrög képződéséhez szükséges időt manuális módszerrel mértük. Úgy terveztük, hogy e vizsgálatban limitálókomponens a foszfolipid mennyisége legyen, és a megadott véralvadási időket eredményezze; foszfolipidként kisméretű, unilamelláris vezikulákat (SUV; a végső vizsgálati oldat 0,4 ml-ében 45 pg; PS/PS=10:90), illetve nagyméretű, unilamelláris vezikulákat (LUV, a végső vizsgálati oldat 0,4 ml-ében 120 pg; PS/PS=25:75) alkalmaztunk.

Az aktivált protein-C véralvadásgátló aktivitását több vizsgálatban teszteltük. A 9. ábrán a limitálófoszfolipiddel végzett APTT-tesztben kapott eredményeket mutatjuk be. E teszt vizsgálati feltételei mellett a véralvadási idők csaknem lineárisan - a foszfolipid koncent14

HU 225 993 Β1 rációjával fordított arányban - csökkentek. A szarvasmarha-eredetű APC-H11 hatásának kifejtéséhez hozzávetőleg 14-szeres koncentrációjú vad típusú, szarvasmarha-eredetű APC-re volt szükség.

A 9. ábrán bemutatott vizsgálat bizonyos részeit 25:75 PS/PC arányú, nagyméretű unilamelláris vezikulákkal (LUV) is megismételtük. Az aktivitást ebben az esetben is a foszfolipid mennyisége korlátozta, és koncentrációját úgy állítottuk be, hogy a kontroll véralvadási idő 360 másodperc legyen (0,4 ml vizsgálati oldatban 120 pg 25% PS-tartalmú LUV). A H11-mutánséval azonos hatás eléréséhez a vad típusú enzimből hozzávetőleg 15-ször nagyobb koncentrációra volt szükség. A kísérletet végül standard APTT-reagenssel (Sigma Chemical Co., standard véralvadási idő 50±2 másodperc) is elvégeztük. A véralvadási idő megkétszerezéséhez (102±5 másodpercre) a vad típusú enzim hozzávetőleg 10,0±0,7 mM koncentrációjára volt szükség. Ugyanezen véralvadási sebesség eléréséhez a szarvasmarha-eredetű APC-H11-mutáns 2,2±0,1 nM koncentrációja kellett. A standard vizsgálatban a foszfolipid nem sebességkorlátozó tényező, így a membránaffinitásra kisebb hatást vártunk.

A humán proteinekkel kapott eredményeket a 8B. ábrán mutatjuk be. A 11. pozícióban prolint tartalmazó humán APC-ből kb. 2,5-szer nagyobb koncentrációra volt szükség ahhoz, hogy a véralvadási időt a vad típusú APC alkalmazásával elért mértékben hosszabbítsuk meg. A prolin 11. pozícióban történő behelyettesítésének kisebb mértékű hatása arra utal, hogy a humán proteinek membránaffinitásában kisebb eltérések figyelhetők meg (9B. ábra).

Az Va faktor inaktiválásának vizsgálata

Az Va faktor inaktiválását Nicolaes és munkatársai [Thrombosis and Haemostasis 76, 404 (1996)] eljárásával vizsgáltuk. A szarvasmarha-eredetű proteinek teszteléséhez szarvasmarha-eredetű vérplazmát 0,1 M NaCI-ot, 1 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumint és 5 mM kalciumot tartalmazó 0,05 M Tris-pufferben (pH=7,5) - 1000-szeresére hígítottunk. A hígított vérplazmához az V. faktor aktiválása céljából foszfolipidvezikulákat (0,24 ml vizsgálati térfogatban 5 pg) és 5 μΙ 190 nM trombint adtunk. 37 °C-on 10 percig végzett inkubálás után az elegyhez APC-t adtunk, és az inkubálást hat percig folytattuk. Ezután az elegyhez szarvasmarha-eredetű protrombint (10 μΜ végkoncentrációban) és Xa faktort (0,3 nM végkoncentrációban) adtunk, és az elegyet 37 °C-on egy percig inkubáltuk. Az aktiválási reakcióelegy 20 μΙ-es mintáját 0,38 ml pufferhez (0,05 M Tris, 0,1 M NaCI, 5 mM EDTA, pH=7,5) adtuk, amely 60 μΜ S2288-szubsztrátot tartalmazott. A trombin mennyiségét a 405 nm-nél mért abszorbancia változása alapján határoztuk meg (e =1,0-10⁴ M^_1s^_1; a trombin k_kat-értéke=100/s). A humán proteinek vizsgálata céljából humán protein-Shiányos vérplazmát (Biopool Canada, Inc.) 100-szorosára hígítottunk, az V. faktort humán trombinnal aktiváltuk, és a termelődött Va faktort a szarvasmarhaeredetű proteineknél alkalmazott reagensekkel teszteltük.

A szarvasmarha-eredetű APC-H11-mutáns az Va faktor inaktiválásában 9,2-szer nagyobb aktivitást mutatott, mint a vad típus (10A. ábra). Hasonlóan a membránkötődéshez (lásd fentebb), a humán proteinek esetében a 11. pozícióban lévő prolin hatása kisebb volt; a vad típusú, illetve P11-mutáns görbéi között átlagosan 2,4szeres különbséget tapasztaltunk (10B. ábra). Normál humán vérplazmával hasonló eredményeket kaptunk.

4. példa

A K-vitamin-dependens polipeptidek membránkapcsolódási helye őstípusának azonosítása

Különféle humán és szarvasmarha-eredetű proteinC-mutánsok és egyéb K-vitamin-dependens polipeptidek összehasonlítása alapján a membránkapcsolódási hely egy feltételezett őstípusát azonosítottuk. Az elektrosztatikus őstípus a protein egy felületén lévő pozitív magból áll, amelyet a protein aminosavaiból származó negatív töltés által körülvett, kötött kalciumionok hoznak létre. Minél jobban megközelítik e proteincsalád tagjai ezt az elektrosztatikus mintázatot, membránaffinltásuk annál nagyobb.

A protein-membrán kölcsönhatási vizsgálatok, az aktiválási és mennyiségi meghatározási vizsgálatok, az aktivitási tesztek, valamint az ezek során alkalmazott foszfolipidvezikulák és a vad típusú, szarvasmarhaeredetű protein-C leírását lásd a 3. példában.

Rekombináns, mutáns protein-C-t a következő eljárással állítottunk elő. Polimeráz-láncreakció alkalmazásával helyspecifikus mutagenezist hajtottunk végre. Erre a célra a következő oligonukleotidokat szintetizáltuk: „A” (lásd 3. példa): „F”: 5-GCA TTT AGG TGA CAC TAT AGA ATA GGG CCC TCT AGA-3’ (11. azonosító számú szekvencia: megfelel a pRc/CMV-vektor 984—1019. nukleotidjainak); ez a láncindító a pRc/CMV és a protein-C kódolószekvenciája között Xbal-hely beépülését eredményezi: „G” láncindító: 5-GAA GGC CAT TGT GTC TTC CGT GTC TTC GAA AAT CTC CCG AGC-3' (12. azonosító számú szekvencia, amely megfelel a szarvasmarha-eredetű protein-C 40-27. aminosavainak, és amelyben a 8. és 9. aminosavat mutációval QN-ről ED-re változtattuk, amit aláhúzással jelöltünk); „H” láncindító: 5-CAG TGT GTC ATC CAC ATC TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3’ (13. azonosító számú szekvencia, amely megfelel a humán protein-C 38-27. aminosavainak, és amelyben a 6. és 7. aminosavat mutációval QN-ről ED-re változtattuk, amit aláhúzással jelöltünk); „I” láncindító: 5-GCC AAG GAA ATT TTC GAA GAT GTG GAT GAC ACA CTG-3' (14. azonosító számú szekvencia, amely megfelel a humán protein-C 27-38. aminosavainak, és amelyben a 6. és 7. aminosavat mutációval QN-ről ED-re változtattuk, amit aláhúzással jelöltünk) „J” láncindító: 5-CAG TGT GTC ATC CAC ATT TTC GAA AAT TTC CTT GGC-3’ (15. azonosító számú szekvencia, amely megfelelő a humán protein-C 38-27. aminosavainak, és amelyben a 7. aminosavat mutációval Q-ról E-re változtattuk, amit aláhúzással jelöltünk); „K” láncindító: 5-GCC AAG GAA ATT TTC GAA AAT GTG GAT GAC ACA

HU 225 993 Β1

CTG-3’ (16. azonosító számú szekvencia, amely megfelel a humán protein-C 27-38. aminosavainak, és amelyben a 6. aminosavat mutációval Q-ról E-re változtattuk, amit aláhúzással jelöltünk).

A szarvasmarha-eredetű és humán protein-C teljes hosszúságú cDNS-ét pRc/CMV vektor Hindlll- és Xbalhelye közé klónoztuk. A szarvasmarha-eredetű protein-C E33D34-mutánsának előállítása céljából a célDNS polimeráz-láncreakciós amplifikációját a következők szerint végeztük. A szarvasmarha-eredetű proteinC-cDNS 5’-terminálistól 40. aminosavat kódoló nukleotidokig terjedő szakaszát az „A és „C” láncindító, illetve templátként teljes szarvasmarha-eredetű protein-CcDNS alkalmazásával - a 3. példában leírt reakciófeltételekkel - amplifikáltuk. A polimeráz-láncreakciót 30 ciklussal - ciklusonként 94 °C-on 2 perces denaturálással; 55 °C-on 2 perces hibridízáltatással és 72 °C-on 2 perces lánchosszabbítással - végeztük. Amplifikáció után a DNS-t 1 mM EDTA-t tartalmazó 40 mM Tris-acetát-pufferben, 0,8%-os agarózgélen 20 elektroforizáltuk. A PCR-termékeket „Geneclean ΙΙΓ reagenskészlet (BIO 101, Inc., USA) alkalmazásával tisztítottuk, és a szarvasmarha-eredetű protein-C cDNS-ének - megfelelő mutációkat tartalmazó - PCRfragmensét Hindlll-mal és Bbsl-gyel hasítottuk. A Hin- 25 dlll/Bbsl fragmenst és a humán protein-C Bbsl-felismerési helytől 3’-terminálisig terjedő szakaszát a pRc/CMV vektor Hindii- és Xbal-helye közé klónozva a mutációkat hordozó, teljes hosszúságú, szarvasmarhaeredetű protein-C-cDNS-t kaptuk. A szarvasmarhaeredetű protein-C H11E33D34-mutánsát hasonló módon, de templátként a szarvasmarha-eredetű proteinC-H11 cDNS-ének alkalmazásával állítottuk elő.

A humán protein-C-cDNS 5’-terminálistól 38. aminosavig terjedő szakaszát teljes humán protein-CcDNS (templát), illetve az „A” és „D” láncindító alkalmazásával amplifikáltuk. A humán protein-C-cDNS 27. aminosavtól 3’-terminálisig terjedő szakaszát templátként a teljes humán protein-C-cDNS, illetve a „B” és „E” láncindító alkalmazásával amplifikáltuk. Ezt a két cDNS-fragmenst használtuk templátként a teljes hosszúságú, szarvasmarha-eredetű - E33 és D34 mutagenizált aminosavakat hordozó - protein-C cDNSének „A” és „B” láncindítókkal végzett amplifikálására.

A humán protein-C E33-mutánsát a következők szerint 45 kaptuk. A humán protein-C-cDNS 5’-terminálistól 38. aminosavig terjedő szakaszát templátként a teljes humán protein-C-cDNS, illetve az „A” és „F” láncindító alkalmazásával amplifikáltuk. A humán protein-C cDNSének 27. aminosavtól 3'-terminálisig terjedő szakaszát tempóiként a teljes humán protein-C-cDNS, illetve a „B” és „G” láncindító alkalmazásával amplifikáltuk. Ezt a két cDNS-fragmenst használtuk a teljes hosszúságú, 5 szarvasmarha-eredetű - E33-mutációt hordozó - protein-C cDNS-ének „A” és „B” láncindítókkal végzett amplifikálására. A polimeráz-láncreakciót a fentebb leírt reakcióelegy és program alkalmazásával hajtottuk végre. A megfelelő mutációkat hordozó humán protein10 C-PCR-fragmenseket Hindlll-mal és Sall-gyel hasítottuk, majd az így kapott Hindlll/Sall fragmenst - a humán protein-C teljes Sall/3’-terminális fragmensével együtt - a pRc/CMV vektor Hindlll- és Xbal-helye közé klónoztuk, miáltal a megfelelő mutációkat hordozó, tel15 jes hosszúságú humán protein-C-cDNS-t kaptuk. A transzfektálás előtt valamennyi mutációt DNS-szekvenálással ellenőriztük.

Az adenovírussal transzfektált 293-as humán vesesejteket a 3. példában leírtak szerint tenyésztettük és transzfektáltuk. A szarvasmarha-eredetű és humán rekombináns protein-C-t és mutánsait szintén a 3. példában ismertetett módon tisztítottuk.

A K-vitamin-dependens proteinek - standard membránhoz mutatott affinitásuk alapján - négy csoportba sorolhatók (lásd 4. táblázat), összehasonlításul megadjuk néhány releváns protein - köztük a humán protein-C (hC), szarvasmarha-eredetű protein-C (bC), szarvasmarha-eredetű protrombin (bPT), szarvasmarha-eredetű X. faktor (bX) és humán VII. faktor (hVII) 30 N-terminális aminosavszekvenciáját (ahol „X” jelentése Gla (γ-karboxi-glutaminsav) vagy Glu.

bPT: ANKGFLXXVRKuGNLXRXCLXXzíPCSRXXAFXA₃iLXSLSATDAF₄₁WAKY (17. azonosító számú szekvencia);

bX: ANS-FLXXVKQnGNLXRXCLXXz^CSLXXARXV₃₁FXDAXQTDXF₄₁WSKY (18. azonosító számú szekvencia);

hC: ANS-FLXXLRHnSSLXRXCIXXzilCDFXXAKXI₃₁FQNVDDTLAF₄₁WSKH (1. azonosító számú szek40 vencia);

bC: ANS-FLXXLRP₁₁GNVXRXCSXX₂₁VCXFXXARXI₃₁FQNTXDTMAF₄₁WSFY (2. azonosító számú szekvencia);

hVII: ANA-FLXXLRP₁ GSLXRXCKXX₂₁QCSFXXARXI₃₁FKDAXRTKLF₄iWISY (3. azonosító számú szekvencia);

hVII: ANA-FLXXLRP₁₁GSLXRXCKXX₂₁QCSFXXARXI₃₁FKDAXRTKLF₄₁WISY (3. azonosító számú szekvencia).

4. táblázat

A K-vitamin-dependens polipeptidek töltése és affinitása

	Aminosav
11+29+33+34=Sum	összesen	K_D (nM)
I. osztály
bZ	-2	+	-2	-1	-4	-6	0,23-32

HU 225 993 Β1

4. táblázat (folytatás)

	Aminosav
11+29+33+34=Sum	összesen	K_D(nM)
hZ	-2	+	-2		-3	-5	2.0M70
II. osztály
bPT-TNBS			-2		-2	-1	<10
KVII-Q11E33		+	-2	-1	-2	-2	10
hS		+	-2	-1	-2	-2	40
bX		+	-2	-1	-2	-3	40
bC-E33D34	P	+	-2	-1	-2	-4	125
hX	+	+	-2	-1	-1	-2	160
bPT	+		-2		-1	0	100
hPT	+		-2		-1	-1	-
bS	+	+	-2		0	0	120
III. osztály
blX		+	-2		-1	-1	1 000
hlX		+	-2		-1	-1	1 000
hC		+			+1	-2	660
bC-H11		+			+1	-1	930
IV. osztály
hC	P	+			+1	-2	3 300
hvn	P	+	+	-1	+1	+1	4 000
bC	P	+			+1	-1	9 200
bVII	P	+	+		+1	0	15 000

^a A nagyobb affinitási értékek K_{disszociáció}/1 -10⁷ M-¹s~¹ értéknek felelnek meg; a nevező az egyéb proteinek esetében jellemző

Xasszociáció'^^k.

A 4. táblázatban a mutáns K-vitamin-dependens polipeptideket félkövér betűtípussal szedtük. A töltésösszeg (1-34. aminosavak) hét kalciumiont (+14) és az N-terminálist (+1) foglalja magában.

A protein-Z-t disszociációs sebességi állandója alapján soroltuk az I. osztályba, mivel az a többi proteinekénél 100-szor, 1000-szer kisebb volt. Ha a proteinZ-nek normális asszociációs sebességi állandója (kb. 10⁷ M^_1s^_1) lenne, K_D-értéke kb. 10^_1° M-nak adódna [Wei és munkatársai: Biochemistry 21, 1949 (1982)]. Az utóbbi affinitás valószínűleg a K-vitamin-dependens proteinek lehető legnagyobb affinitási értéke. A IV. osztályba tartozó proteinek a III. osztály proteinjeitől a 11. prolin jelenlétében térnek el, amely az affinitást nem elektrosztatikus módon befolyásolja.

Bár a membránaffinitás és az 1-34. aminosavak nettó negatív töltése között viszonylag csekély összefüggés tapasztalható, kiváló korrelációt figyelhetünk meg, ha csak az 5., 11., 29., 33. és 34. aminosavakat vesszük figyelembe (lásd 4. táblázat). Ezek az aminosavak a protein felszínén helyezkednek el. Számos proteint modelleztünk úgy, hogy a protrombinstruktúrába aminosavakat helyettesítettünk, és elektrosztatikus potenciáljukat „DelPhi” program alkalmazásával értékeltük. A 11. ábrán szarvasmarha-eredetű protein-Z elektrosztatikus potenciálja alapján készült vázlatot mutatunk be. A 7., 8., 26., 30., 33., 34. és 11. pozícióban lévő negatív töltésű helyek a kalciumot tartalmazó, pozitív töltésű magot körülvevő burkot képeznek (11. ábra). Minél jobban megközelíti egy protein szerkezete ezt a modellt, annál nagyobb a membránaffini50 tása. Ez az összefüggés a vad típusú proteinekre, mutánsokra és kémiailag módosított proteinekre egyaránt jellemző.

Az egyéb proteinekből hiányzó, töltéssel bíró csoportok vizsgálata alapján más struktúramintázatokra is következtethetünk. Például a szarvasmarha-eredetű protrombin 11. lizinje és 10. argininje pozitív töltésű régiókat képez; a protein-C-ben és a VII. faktorban a 33. Gla hiánya az adott régiókban kisebb negatív töltést eredményez. A nagyobb affinitás mindegyik esetben olyan szerkezettel áll összefüggésben, amely negatív

HU 225 993 Β1 töltésű proteinfelülettel teljesen beburkolt pozitív magot tartalmaz (ahogy az a protein-Z esetében látható). E szabály alól kivételt képeznek a 11. pozícióban prolint tartalmazó proteinek, amelyek szerkezeti hatás következtében kisebb affinitásúak lehetnek, illetve a 12. pozícióban szerint (amely az egyetlen, töltés nélküli aminosav) tartalmazó proteinek (humán protein-C).

Az elektrosztatikus eloszlás őstípuselméletének további vizsgálata céljából a szarvasmarha-eredetű és humán protein-C 33. glutaminjának és 34. aszparaginjának glutaminsawal, illetve aszparaginsawal történő helyettesítése (19. azonosító számú szekvencia) céljából helyspecifikus mutagenezist végeztünk. A 33. glutaminsav a protein érési folyamata során Gla-ra módosítható. Ezek a változások a szarvasmarha-eredetű protein-C elektrosztatikus potenciálját a szarvasmarhaeredetű X. faktoréval megegyezővé tették. A mutáns protein membránaffinitása - a 11. prolin jelenléte miatt - várhatóan kisebb, mint a X. faktoré. Valóban, a szarvasmarha-eredetű protein-C-mutáns membránaffinitása hasonló a szarvasmarha-eredetű protrombinéhoz (12A. ábra), és valamivel kisebb, mint a szarvasmarhaeredetű X. faktoré (4. táblázat).

Még érdekesebb, hogy az APC véralvadást gátló hatása a mutáns esetében nagyobb, mint a vad típusé (12B. és 12C. ábra). A szarvasmarha-eredetű protein-C P11H-mutánsára a 3. példában kapott eredmények bevonásával megállapítottuk, hogy a 11., 33. és 34. pozíciókban lévő aminosavak cseréivel olyan proteincsaládok hozhatók létre, amelyek különböző membránaffinitásúak és aktivitásúak.

Az E33- és E33D34-mutációt tartalmazó humán protein-C-mutánsok a membránkötődési affinitás kismértékű növekedését mutatták (13A. ábra). E mutánsok aktivitása valamivel kisebb volt, mint a vad típusú enzimé (13B. ábra). A szarvasmarha-eredetű protein-C mutánsaival kapott eredmények arra utalnak, hogy a humán proteinben az E33D34-mutáció hatásának elmaradását a proteinben lévő H11 és/vagy egyéb egyedi aminosavak jelenléte okozhatja. A 14A. ábrán az látható, hogy a szarvasmarha-eredetű protein-C H11-mutánsa kb. 10-szer nagyobb affinitással kötődik a membránhoz, mint a vad típusú protein; ugyanakkor, az E33D34-mutáns kb. 70-szer nagyobb affinitású; míg a H11E33D34 tripla mutáns affinitása alig volt nagyobb a H11-mutánsénál. Ez az összefüggés tükröződik az e mutánsokból létrehozott APC-k aktivitásában is (14B. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a H11 jelenléte csökkentette az E33D34-mutáció membránkötődési affinitásra gyakorolt hatását.

A felsorolt eredmények azt jelzik, hogy az E33D34mutáció nem mindegyik protein esetében optimális, így a lehető legnagyobb mértékben megnövelt membránaffinitású E33D34-mutációt tartalmazó - humán protein-C létrehozásához egyéb mutációk beiktatására lehet szükség. A szarvasmarha-eredetű proteinnel kapott eredmények arra utalnak, hogy e jelenség elsődleges oka a 11. hisztidin jelenléte, így ezt az aminosavat a humán protein-C-ben glutaminnal vagy egyéb aminosawal helyettesíthetjük (az E33D34 mutáció mellett).

Egy másik, affinitást befolyásoló aminosav a 12. pozícióban lévő szerin, amely specifikusan a humán protein-C-re jellemző. Ezek a további módosítások elősegíthetik a fokozott membránaffinitású proteinek létrehozását.

Az elektrosztatikus őstípust humán és szarvasmarha-eredetű X. faktor összehasonlításával is vizsgáltuk. A humán X. faktorban a 11. lizin jelenléte azt sugallja, hogy membránaffinitásának a szarvasmarha-eredetű X. faktorénál kisebbnek kell lennie. Ez a következtetés a 15. ábrán bemutatott eredményeken alapul.

Korábbi vizsgálatokkal kimutatták, hogy a szarvasmarha-eredetű és humán protrombin 1. fragmensének trinitro-benzol-szulfonsawal (TNBS) végzett módosítása viszonylag kevéssé (0-5-szörös mértékben) növelte a membránaffinitást [Weber és munkatársai: J. Bioi. Chem. 267, 4564 (1992); Welsch és munkatársai: Biochemistry 27, 4933 (1988)]. A reakciófeltételek az N-terminális derivatizálását eredményezték, s ez a változás csökkent membránaffinitással függ össze [Welsch és Nelsestuen: Biochemistry 27, 4939 (1988)]. A proteint kalcium jelenlétében módosítva - ami megvédi az N-terminálist - olyan, TNBS-sel módosított proteint nyerhetünk, amelynek membránaffinitása sokkal nagyobb, mint az eredeti 1. fragmensé.

Az az elmélet, hogy az őstípust a protein-Z képviseli, disszociációs sebességi állandóján, valamint azon alapul, hogy normális asszociációs sebességi állandó esetén K_D értéke 10^_1° M lenne, amelynek elérése valószínűtlen. Lehetséges, hogy a protein-Z kis asszociációs sebességét a nem megfelelő hajtogatódás („folding) okozza (ami a membránkötődésre alkalmas konformáció kis koncentrációját eredményezi). Ha a feltételeket a protein-folding javítása irányába módosíthatnánk, a protein-Z asszociációs sebessége növelhető lenne. Valóban, a protein-Z asszociációs sebességi állandóját a pH megváltoztatásával sikerült javítani. E jelenség a protrombinstruktúra szokatlan sajátságával függhet össze, miszerint az N-terminális (pH=7,5-nél +1-es töltés) a 2. és 3. kalciumionok közelében helyezkedik el. Az N-terminális +1 töltése felelős azért, hogy közvetlenül az 1. kalciumion felett (lásd 11. ábra) kismértékben pozitív régió található. A kalciumion és az N-terminális közötti elektrosztatikus taszítás destabilizálhatja a protein harmadlagos szerkezetét, és komoly problémát okozhat egy olyan protein esetében, amelynek „hajtogatódási stabilitása” kicsi.

Az 5. táblázatban az őstípusmodell további bizonyítékait soroljuk fel. Bemutatjuk a ionos csoportok 1. és 8. stronciumtól mért távolságát (ami az 1. kalciumnak és egy további - a protrombin Sr röntgenkrisztallográfiás szerkezetében található - kétértékű fémionnak felel meg). Az eredmények azt mutatják, hogy minél kisebb egy ionos csoport e fémionoktól mért távolsága, annál nagyobb a membránaffinitásra gyakorolt hatása. Ez alól kivételt képez a 16. arginin, amely hozzájárul a pozitív mag töltéséhez. Az összes többi pozícióban a negatív töltés nagyobb affinitással függ össze. Ez a korreláció érvényes a gamma-karboxi-glutaminsavra is.

HU 225 993 Β1

5. táblázat

Az ionos csoportok 1. és 8. stronciumtól mért távolsága és annak hatása

Pozíció (aminosav-protein)	Atom³	Iontól mért távolság (Angström)	K_D (K_M) értékre gyakorolt hatás
1.Sr	8. Sr
3(K-PT)	ε-Ν	22,1	21,7	kicsi vagy ismeretlen
5(K-IX)	para-C(F)	20,1	20,8	«
19(K/R-VII)	C5(L)	20,2	17,8	n
22(K-IX)	C4(P)	17,0	18,5	»
10(R)	C6(R)	16,8	12,9
25(R-PT)	C6(R)	11,2	13,8
24(X/D-PC)	O(S)	8,1	12,0
11(K-PT, hX, bS; Gla-PZ)	e-C(K)	14,7	7,4	3-10-szeres^b
33(Gla)	rC(E)	11,6	7,5
34(D)	O(S)	15,3	12,1
29(R)	para-C(F)	7,5	8,4	n
16(R)	C6(R)	14,2	10,6	C
Gla^d
Kevésbé jelentős
7.		12,8	13,3	+2 (<2)
15.		20	16	<2 (<2)
20.		19,4	17,8	<2 (<2)
21.		17,2	15	4(3)
33.		11,6	7,5	?®(<2)
Nagy jelentőségű
8.		8,7	10,9	?® (20)
26.		3,6	9,5	?³ (50)
17.		11,1	9,1	>200 (100)
27.		8,4	10,6	>200 (85)
30.		3,4	4,2	>200 (25)

³ Ebben az oszlopban azokat az atomokat soroljuk fel, amelyeknek az Sr-protrombin 1. fragmensének struktúrájában lévő 1. és 8. stronciumtól való távolságát mértük (zárójelben feltüntettük a protrombin e mérésben alkalmazott aminosavát) [Seshadri és munkatársai: Biochemistry 33, 1087 (1994)].

^b Valamennyi kation csökkentette, illetve valamennyi anion növelte az affinitást (kivételt képez a 16—R).

^c Thariath és munkatársai: Biochem. J. 322, 309 (1997).

^d A Glu->Asp mutációk esetében a gamma-karboxilcsoport szénatomjai távolságának átlagát tüntettük fel.

^e A kötődés kisebb kapacitású volt vagy aggregációját okozott, ami az összehasonlítást bizonytalanná tette.

A 15C. ábra eredményei azt mutatják, hogy a pro- 55 tein-Z asszociációs sebessége 9-es pH-η (amelynél az N-terminálisnak töltés nélkülinek kell lennie) jelentős mértékben javult. Az adatokból kapott sebességi állandó 9-es pH-η kb. 12-szer nagyobb volt, mint 7,5-es pH-η (15C. ábra). 60

Bár a találmány szerinti megoldást a részletes leírással szemléltettük, ez nem jelenti azt, hogy a leírás a találmány igényelt oltalmi körét bármilyen módon korlátozná. A találmány szerinti megoldás egyéb szempontjai és módosításai szintén az igényelt oltalmi körbe tartoznak.

HU 225 993 Β1

SZEKVENCIALISTA <110> Regents of the University of Minnesota <120> MÓDOSÍTOTT K-VITAMIN-DEPENDENS POLIPEPTIDEK <130> 09531/002WO1 <150> 08/955, 636 <151> 1997-10-23 <160> 35 <170> Fást SEQ fór Windows Version 3.0 <210> 1 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav

<400> 1

Alá 1

Asn

Ser

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

His 10

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Xaa 20

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa 25

Xaa

Alá

Lys

Xaa

Ile 30

Phe

Gin

Asn

Val

Asp

Thr

Leu

Alá

Phe

Trp

Ser

Lys

His

40 <210>2 <211 >44 <212> PRT <213> Bős taurus <220>

<221 > MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400> 2

Alá 1

Asn

Ser

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

Pro 10

Gly

Asn

Val

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Ser

Xaa

Val

Cys

Xaa

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Ile

Phe

Gin

20

25

30

Asn

Thr

Xaa

Asp

Thr

Met

Alá

Phe

Trp

Ser

Phe

Tyr

40 <210>3 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens

HU 225 993 Β1 <220 <221 > M0D_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400 3

Alá Asn Alá 1

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

Pro 10

Gly Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Ile

Phe

Lys

20

25

30

Asp

Alá

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

40 <210>4 <211 >44 <212> PRT <213> Bős taurus <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400> 4

Alá 1

Asn

Gly

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

Pro 10

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Arg

Xaa

Leu

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

His

Xaa

Ile

Phe

Arg

20

25

30

Asn

Xaa

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Trp

Val

Ser

Tyr

40 <210>5 <211 >45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221 > MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400> 5

Tyr 1

Asn

Ser

Gly

Lys 5

Leu

Xaa

Phe

Val 10

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa 15

Arg

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Val

Phe

20

25

30

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

40 45 <210>6 <211 >46

HU 225 993 Β1 <212> PRT <213> Bős taurus <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400> 6

Tyr 1

Asn

Ser

Gly

Lys 5

Leu

Xaa Xaa

Phe

Val 10

Gin Gly Asn Leu Xaa 15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Val

Phe

20

25

30

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Lys

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

35

40

45

<210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 7 aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctt <210> 8 <211 >42 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 8 gcactcccgc tccaggctgc tgggacggag ctcctccagg aa <210>9 <211 >36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 9 acgctccacg ttgccgtgcc gcagctcctc taggaa <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia

HU 225 993 Β1 <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 10 ttcctagagg agctgcggca cggcaacgtg gagcgt 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 11 gcatttaggt gacactatag aatagggccc tctaga 36 <210> 12 <211 >42 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 12 gaaggccatt gtgtcttccg tgtcttcgaa aatctcccga gc 42 <210> 13 <211 >36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 13 cagtgtgtca tccacatctt cgaaaatttc cttggc 36 <210> 14 <211 >36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 14 gccaaggaaa ttttcgaaga tgtggatgac acactg 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia

HU 225 993 Β1 <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 15 cagtgcgtca tccacatttt cgaaaattttc cttggc 36 <210> 16 <211 >36 <212> DNA <213> Mesterséges szekvencia <220>

<223> Mutagenizált protein-C-oligonukleotid <400> 16 gccaaggaaa ttttcgaaaa tgtggatgac acactg 36 <210> 17 <211 >45 <212> PRT <213> Bős taurus <220>

<221 > MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav

<400> 17

Alá

Asn

Lys

Gly

Phe

Leu

Xaa

Val

Arg

Lys

Gly

Asn

Leu

Xaa

Arg

1

5

10

15

Xaa

Cys

Leu

Xaa

Pro

Cys

Ser

Arg

Xaa

Alá

Phe

Xaa

Alá

Leu

20

25

30

Xaa

Ser

Leu

Ser

Alá

Thr

Asp

Alá

Phe

Trp

Alá

Lys

Tyr

40 45 <210> 18 <211 >44 <212> PRT <213> Bős taurus <220>

<400> 18

Alá

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Val

Lys

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Leu

Xaa

Alá

Cys

Ser

Leu

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Val

Phe

Xaa

20

25

30

Asp

Alá

Xaa

Gin

Thr

Asp

Xaa

Phe

Trp

Ser

Lys

Tyr

40

HU 225 993 Β1 <210> 19 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<400> 1

9

Alá

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

His

Ser

Leu

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Alá

Lys

Xaa

Ile

Phe

Glu

20

25

30

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Alá

Phe

Trp

Ser

Lys

His

40 <210> 20 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221>MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav

<400> 20

Alá

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Gin

Ser

Leu

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Alá

Lys

Xaa

Ile

Phe

Glu

20

25

30

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Alá

Phe

Trp

Ser

Lys

His

40 <210> 21 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221 > MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400> 21

Alá Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Glu Ser Ser Leu Xaa Arg Xaa 15 10 15

Cys Ile Xaa Xaa Ile Cys Asp Phe Xaa Xaa Alá Lys Xaa Ile Phe Glu 20 25 30

HU 225 993 Β1

Asp Val Asp Asp Thr Leu Alá Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 22 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<400> 2

2

Alá

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Asp

Ser

Leu

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Ile

Xaa

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa

Alá

Lys

Xaa

Ile

Phe

Glu

20

25

30

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Alá

Phe

Trp

Ser

Lys

His

40 <210> 23 <211 >44 <212> PRT <213> Bős taurus <220>

<400> 23

Alá

Asn

Ser

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

His

Gly

Asn

Val

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Ser

Xaa

Val

Cys

Xaa

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Ile

Phe

Gin

20

25

30

Asn

Thr

Xaa

Asp

Thr

Met

Alá

Phe

Trp

Ser

Phe

Tyr

40 <210> 24 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400> 24

Alá Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Gin Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa 15 10 15

HU 225 993 Β1

Cys Ile Xaa Xaa Ile Cys Asp Phe Xaa Xaa Alá Lys Xaa Ile Phe Glu 20 25 30

Asp Val Asp Asp Thr Leu Alá Phe Trp Ser Lys His 35 40 <210> 25 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<400> 25

Alá 1

Asn

Ser

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

His 10

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Xaa 20

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa 25

Xaa

Alá

Phe

Xaa

Ile 30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Alá

Phe

Trp

Ser

Lys

His

40 <210> 26 <211>44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-g!utaminsav vagy glutaminsav <400> 26

Alá 1

Asn Alá

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg Glu 10

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Ile

Phe

Lys

20

25

30

Asp

Alá

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

40 <210> 27 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

HU 225 993 Β1

<400> 2

7

Alá

Asn

Alá

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Asp

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Ile

Phe

Lys

20

25

30

Asp

Alá

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

40 <210> 28 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<400> 28

Alá 1

Asn

Alá

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

Pro 10

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Lys

Xaa

Xaa 20

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa 25

Xaa

Alá

Phe

Xaa

Ile 30

Phe

Lys

Asp

Alá

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

40 <210> 29 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221 > MOD_RES <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav <400> 29

Alá

Asn

Alá

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Ile

Phe

Asp

20

25

30

Asp

Alá

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

40 <210> 30 <211> 44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221 > MÓD RÉS

HU 225 993 Β1 <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav

<400> 3

0

Alá

Asn

Alá

Phe

Leu

Xaa

Leu

Arg

Gin

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg

Xaa

1

5

10

15

Cys

Lys

Xaa

Gin

Cys

Ser

Phe

Xaa

Alá

Arg

Xaa

Ile

Phe

Glu

20

25

30

Asp

Alá

Xaa

Arg

Thr

Lys

Leu

Phe

Trp

Ile

Ser

Tyr

40 <210> 31 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<400> 31

Tyr 1

Asn

Ser

Gly

Lys 5

Leu

Xaa

Phe

Val 10

Asp

Gly

Asn

Leu

Xaa 15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa 20

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe 25

Xaa

Alá

Arg

Xaa 30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr 35

Xaa

Arg

Thr

Xaa 40

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr 45

<210> 32 <211 >45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221 > MÓD RÉS <222> (0)...(0) <223> Xaa=gamma-karboxi-glutaminsav vagy glutaminsav

<400> 32

Tyr 1

Asn

Ser

Gly

Lys 5

Leu

Xaa

Phe

Val 10

Glu

Gly

Asn

Leu

Xaa 15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa 20

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe 25

Xaa

Alá

Arg

Xaa 30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

40 45 <210> 33 <211 >45 <212> PRT <213> Homo sapiens

HU 225 993 Β1 <220>

<400> 33

Tyr 1

Asn

Ser

Gly

Lys 5

Leu

Xaa

Phe

Val 10

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa 15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa 20

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe 25

Xaa

Alá

Phe

Xaa 30

Val

Phe

Xaa

Asn

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

40 45 <210> 34 <211 >45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<400> 34

Tyr 1

Asn

Ser

Gly

Lys 5

Leu

Xaa

Phe

Val 10

Gin

Gly

Asn

Leu

Xaa 15

Arg

Xaa

Cys

Met

Xaa 20

Xaa

Lys

Cys

Ser

Phe 25

Xaa

Alá

Arg

Xaa 30

Val

Phe

Xaa

Asp

Thr

Xaa

Arg

Thr

Xaa

Phe

Trp

Lys

Gin

Tyr

40 45 <210> 35 <211 >44 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<400> 35

Alá 1

Asn

Ser

Phe

Leu 5

Xaa

Leu

Arg

Glu 10

Gly

Ser

Leu

Xaa

Arg 15

Xaa

Cys

Ile

Xaa

Xaa 20

Ile

Cys

Asp

Phe

Xaa 25

Xaa

Alá

Lys

Xaa

Ile 30

Phe

Glu

Asp

Val

Asp

Thr

Leu

Alá

Phe

Trp

Ser

Lys

His

40

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Emlősökben a véralvadás csökkentésére hatásos protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid olyan módosított GLA-domén-tartalommal, amely fokozza a membránkötő affinitást a megfelelő natív protein-Chez vagy aktivált protein-C-polipeptidhez viszonyítva; az említett módosított GLA-domén az 1. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmazza legalább egy aminosavszubsztitúcióval a 10., 11., 28. vagy 33. gyököknél.
2. Az 1. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol az említett legalább egy aminosavszubsztitúció a 10. gyöknél van.
3. Az 1. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol az említett legalább egy aminosavszubsztitúció a 11. gyöknél van.
4. Az 1. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol az említett legalább egy aminosavszubsztitúció a 28. gyöknél van.
5. Az 1. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol az említett legalább egy aminosavszubsztitúció a 33. gyöknél van.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol az említett módosított GLA-domén az 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazza három aminosavszubsztitúcióval a következő gyököknek megfelelő pozíciók közül: 10., 11.,28.,32. és 33.
7. A 6. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol az említett három aminosavszubsztitúció a 11., 32. és 33. gyököknél van.
8. A 7. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol a 32. gyök glutaminsav.
9. A 7. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol a 33. gyök aszparaginsav.
10. A 7. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol a 32. gyök glutaminsav és a 33. gyök aszparaginsav.
11. A 7. igénypont szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid, ahol a 11. gyök glicin.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti protein-C vagy aktivált protein-C, ahol a protein-C vagy aktivált protein-C humán rekombináns protein-C vagy humán rekombináns aktivált protein-C.
13. Gyógyászati készítmény, amely az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti protein-C-t vagy aktivált protein-C-polipeptidet és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
14. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid alkalmazása trombózis kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
15. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid alkalmazása véralvadás csökkentésére alkalmas gyógyszer előállítására.
16. A 14. vagy 15. igénypontok egyike szerinti alkalmazás parenterális beadásra alkalmas gyógyszer előállítására.
17. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid alkalmazása alvadási rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.
18. Emlősgazdasejt, amely egy nukleinsawektort tartalmaz, az említett vektor pedig valamely, 1-12. igénypontok bármelyike szerinti protein-C-t vagy aktivált protein-C-polipeptidet kódol.
19. Egy emlősgazdasejt alkalmazása az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti protein-C vagy aktivált protein-C-polipeptid előállítására.
20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az emlősgazdasejt egy adenovírussal átfertőzött emberi vese 293 sejt.