CN1839203B - 因子VII或VIIa的GLA结构域变体 - Google Patents

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Abstract

人因子VII或人因子VIIa的Gla结构域变体，包括相对于人因子VII或人因子VIIa的1-15个氨基酸的修饰，其中通过位置34中的取代导入疏水氨基酸残基，或具有位置36中的氨基酸取代，或具有位置10和32中的氨基酸取，以及选自位置74、77或116中的至少一种其它氨基酸取代。

Description

因子VII或VIIa的GLA结构域变体
技术领域
本发明涉及凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽的新的Gla结构域变体，及所述多肽变体在治疗中的用途，具体是治疗多种凝血相关疾病的用途。
背景技术
凝血是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的过程，最终导致纤维蛋白凝块形成。通常参与被称为凝血“级联反应”的血液组分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，通过活化剂的作用其可转变为活性形式。FVII就是这些凝血因子中的一种。
FVII是一种维生素K依赖性血浆蛋白，在肝中合成，并以分子量为53kDa的单链糖蛋白形式分泌到血液中(Broze & Majerus，J.Biol.Chem 1980；255：1242-1247)。FVII酶原在单一位点R152-I153处被蛋白酶水解，产生由一个二硫键连接的双链，从而转变为活性形式(FVIIa)。FVIIa与组织因子的复合体(FVIIa复合体)可将凝血因子IX和凝血因子X均转变为其活性形式，接下来的反应导致快速的凝血酶产生以及纤维蛋白形成(Osterud & Rapaport，Proc Natl Acad Sci USA 1977；74：5260-5264)。
FVII经历翻译后修饰，包括依赖维生素K的羧基化，导致在该分子N末端区产生10个γ羧基谷氨酸残基。因此，SEQ ID NO：1中第6，7，14，16，19，20，25，26，29和35位残基是Gla结构域中对于FVII活性重要的γ羧基谷氨酸残基。其他翻译后修饰包括在第145和322位的两个天然产生的N-糖基化位点，以及在第52和60位的两个天然产生的O-糖基化位点处分别连接糖组分。
编码人FVII(hFVII)的基因被定位于13号染色体的q34-qter9(deGrouchy等，Hum Genet 1984；66：230-233)。其包含9个外显子，长度为12.8Kb(O′Hara等，Proc Natl Acad Sci USA 1987；84：5158-5162)。FVII的基因组构和蛋白结构与其它维生素K依赖性原凝血蛋白的结构相似，外显子1a和1b编码信号序列；外显子2编码多肽和Gla结构域；外显子3编码一段短的疏水区；外显子4和5编码表皮生长因子样结构域；以及外显子6到8编码丝氨酸蛋白酶的催化结构域(Yoshitake等，Biochemistry 1985；24：3736-3750)。
利用X射线晶体成像的方法(Banner等，Nature，1996；380：41和Zhang等，J.Mol.Biol，1999；285：2089)，已报道了hFVIIa(Pike等，PNAS.U.S.A.，1999；96：8925-30和Kemball-Cook等，J.Struct.Biol，1999；127-213-223)，hFVIIa与可溶性组织因子的复合体，以及hFVII的小片段的实验三维结构(Muranyi等，Biochemistry，1998；37：10605和Kao等，Biochemistry，1999；38：7097)。
关于FVII蛋白工程化突变体的报道相对较少(Dickinson & Ruf，J BioChem，1997；272：19875-19879，Kemball-Cook等，J Biol Chem，1998；273：8516-8521，Bharadwaj等，J Biol Chem，1996；271：30685-30691，Ruf等，Biochemsitry，1999；38：1957-1966)。
已报道了FVII在BHK或其他哺乳动物细胞中的表达(WO92/15686，WO91/11514，WO88/10295)，以及FVII和kex2内切蛋白酶在真核细胞中的共表达(WO00/28065)。
人重组FVIIa的商品化制剂以
Figure G04823777420060302D000021
的名称出售。指明用于治疗血友病A或B患者的出血发作。
Figure G04823777420060302D000023
是市售的可治疗出血发作的唯一有效并且可靠的rFVIIa。
WO91/1154中报道了FVII的一种无活性形式，其中152的精氨酸和/或153的异亮氨酸被修饰。这些氨基酸位于活化位点。WO96/12800描述了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂导致的FVIIa的失活；Petersen等说明了FVIIa在I153的α氨基酸基团氨甲酰化导致的失活(Eur J Biochem，1999；261：124-129)。这种失活形式可以与野生型FVII或FVIIa竞争对组织因子的结合以及抑制凝固活性(clotting activity)。这提示这种FVIIa的失活形式可用于治疗极易产生凝血的患者，如患脓毒病的患者，其易于发作心肌梗塞或血栓性中风。
对于治疗失控的出血诸如外伤等的情况，相信FVIIa能够活化FX为FXa而不与组织因子结合，并且所述活化反应据信主要见于活化的血小板(Hedher et al.Blood Coagulation & Fibrinolysis，2000；11；107-111)。然而，hFVIIa或rhFVIIa在缺乏组织因子的情况下对FX具有低活性，由此失控出血的治疗例如在外伤患者中，需要分别为高剂量和多个剂量的hFVIIa或rhFVIIa。因此，为更有效治疗失控出血(最小化失血)，需要改进的FVIIa分子，其在缺乏组织因子的条件下对FX具有高活性。所述改进的FVIIa分子与rhFVIIa相比，在用于失控的失血时，显示较低的凝血事件(作用较快/增加的凝固活性)。
FVII/FVIIa的Gla结构域变体公开于WO 99/20767，US 6,017,882和WO 00/66753，其中位于Gla结构域中的一些残基鉴定为对于磷脂膜结合而言是重要的，并由此对FX活化是重要的。具体地，发现残基10和32是关键的，且增加的磷脂膜结合亲和力，以及由此增强的FX活化，可通过进行突变P10Q和K32E实现。具体地，发现FX活化与rhFVIIa相比在边缘凝血条件诸如在存在低水平组织因子的条件下增强。
WO 01/58935公开通过定点糖基化或PEG化开发具有增加的半寿期等的FVII或FVIIa分子的新策略。
WO 03/093465公开FVII或FVIIa变体，其具有位于Gla结构域中的修饰并具有导入Gla结构域外的一或多种N-糖基化位点。
WO 2004/029091公开FVII或FVIIa变体，其具有位于组织因子结合位点的特定修饰。
本发明人现在鉴定了Gla结构域中其它残基，其可进一步增加磷脂膜结合亲和力并由此进一步增强FX活化。本发明的FVII或FVIIa变体还降低组织因子结合亲和力。
本发明的目标是提供改进的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa变体)，其能够比hFVIIa，rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa更为有效地活化FX为FXa。具体地，本发明的目标是提供改进的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa变体)，其能够在组织因子缺乏的条件下比hFVIIa，rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa更为有效地活化FX为FXa。这些目标通过本发明提供的FVII或FVIIa变体说明。
发明内容
本发明第一方面涉及因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽变体，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括具有相对于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的人因子VII(hFVII)或人因子VIIa(hFVIIa)的1-15个氨基酸的修饰，其中疏水氨基酸残基通过位置34中的氨基酸取代而被导入。
本发明第二方面涉及因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽变体，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括具有相对于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的人因子VII(hFVII)或人因子VIIa(hFVIIa)的1-15个氨基酸的修饰，其中所述氨基酸序列包含位置36中的氨基酸取代。
本发明第三方面涉及因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽变体，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括具有相对于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的人因子VII(hFVII)或人因子VIIa(hFVIIa)的3-15个氨基酸的修饰，其中氨基酸序列包含位置10和32中的氨基酸取代以及位于选自位置74，77或116的位置中的至少一种其它氨基酸取代。
本发明其它方面涉及本发明多肽变体的编码核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的表达载体，以及包括所述核苷酸序列或表达载体的宿主细胞。
本发明的其它方面涉及包含本发明多肽变体的药物组合物，本发明多肽变体或本发明的药物组合物作为药物的用途，以及利用本发明的多肽变体或药物组合物的治疗方法。
本发明的其它方面将从以下说明书以及所附权利要求显而易见。
附图说明
图1显示当在“全血测定法(Whole Blood Assay)”中测定时，凝固时间相对于本发明的变体浓度。
图2显示在“凝血图测定法(Thrombogram Assay)”中测定的本发明变体的最大组织因子-依赖性凝血酶生成速率。
图3显示在“凝血图测定法”中测定的本发明变体的最大磷脂-依赖性凝血酶生成速率。
发明详述
定义
在本申请和本发明的全文中，使用下列定义：
术语”FVII”或“FVII多肽”指以单链形式提供的FVII分子。FVII多肽的一个实例是野生型人FVII(hFVII)，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。但是，应理解术语“FVII多肽”还包括hFVII-样分子，诸如SEQ ID NO：1的片段或变体，具体是其序列与SEQ ID NO：1相比包含至少一个，诸如达15个，优选达10个氨基酸修饰的变体。
术语”FVIIa”或“FVIIa多肽”指以活化的两条链形式提供的FVIIa分子。当SEQ ID NO：1所示氨基酸序列用于描述FVIIa的氨基酸序列，应理解单-链形式的R152和I153之间的肽键被切割，并且所述链之一包含氨基酸残基1-152，其它链包含氨基酸残153-406。
术语“rFVII”和“rFVIIa”分别指重组技术产生的FVII和FVIIa分子。
术语“hFVII”和“hFVIIa”分别指野生型人FVII和FVIIa，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。
术语“rhFVII”和“rhFVIIa”指人野生型FVII和FVIIa，其具有氨基酸序列SEQ ID NO：1，通过重组方法制备。RhFVIIa的实例是
本文术语“Gla结构域”意图包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基1-45。
因此，术语“在Gla结构域外的位置”包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基46-406。
简写“FX”，“TF”和“TFPI”分别指因子X，组织因子和组织因子途径抑制物。
术语“蛋白酶结构域“用于N末端起的大约残基153-406。
术语“催化位点”用于指多肽变体的S344，D242和H193组成的催化三联体。
术语“亲代”意图指将根据本发明修饰/改进的分子。尽管将通过本发明修饰的亲代多肽可为任何FVII或FVIIa多肽，并因此来自任何来源，例如，非人哺乳动物来源，优选亲代多肽是hFVII或hFVIIa。
“变体”是与其亲代多肽有一或多个氨基酸残基不同的多肽，通常在1-15氨基酸残基中(例如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15氨基酸残基中)，诸如在1-10氨基酸残基中，例如在1-8，1-6，1-5或1-3个氨基酸残基中。通常，所述亲本多肽是hFVII或hFVIIa。
术语“偶联物”(或可互换为“偶联的多肽”)表示由一个或多个多肽与一个或多个非多肽组分(如聚合物分子、亲脂化合物、糖组分及有机衍生剂)共价连接而形成的异源(复合或嵌合的意思)分子。优选地，偶联物在有关浓度和条件下是可溶的，即在生理液体如血液中可溶。本发明偶联多肽的实施例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。
术语“共价连接”表示该多肽和非多肽组分或者彼此直接共价连接，或者通过至少一种间插组分，如桥、间隔子或连接部分，间接地相互共价连接。
本文所用术语“非多肽组分”表示分子，其与氨基酸单体组成的肽聚合物不同并且通过肽键相连在一起，所述分子能够与本发明多肽变体的连接基团偶联。此类分子的优选实例包括聚合物分子、糖组分、亲脂性化合物或有机衍生剂。在本文中用于本发明的偶联物时，应理解为非多肽组分通过多肽的连接基团连接到偶联的变体的多肽部分。如上说明，非多肽组分可能直接或间接共价连接到连接基团。
术语“聚合物分子”被定义为由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中所述单体无一是氨基酸残基，除非聚合物是人白蛋白或另一种丰富血浆蛋白。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换。该术语涵盖经体外糖基化连接的碳水化合物分子，所述体外糖基化即体外进行的合成性糖基化，其通常涉及碳水化合物分子与多肽变体的连接基团的共价连接，任选使用交联剂。
术语“糖部分”意图指含碳水化合物的分子，其包括一或多个单糖残基，能够通过体内糖基化与多肽变体相连(以产生糖基化的多肽变体形式的多肽变体偶联物)。术语“体内糖基化”意图指出现于体内的糖部分的任何连接，即在用于表达所述多肽变体的糖基化型细胞中的翻译后加工中，例如通过N连接的或O连接的糖基化。寡糖结构的确切结构，在很大程度上依赖于目的糖基化型生物体。
“N-糖基化位点”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸，苏氨酸或半胱胺酸，优选丝氨酸或苏氨酸，最优选苏氨酸。优选，位于相对于天冬酰胺的位置+3的氨基酸残基不是脯氨酸残基。
“O-糖基化位点”是丝氨酸或苏氨酸残基的OH-基团。
术语“连接基团”表示多肽变体的功能基团，具体是其氨基酸或碳水化合物部分的功能基团，其能够与非多肽组分如聚合物分子、糖组分、亲脂性化合物或有机衍生剂偶联。有用的连接基团及其相配的非多肽组分表示在下图中。
  连接基团   氨基酸  非多肽组分实例   偶联方法/活化的PEG   参考
  -NH2   N-末端，赖氨酸  聚合物，如PEG，具有酰胺或亚胺基团   mPEG-SPATresylatedmPEG   Shearwater Inc.Delgado等，critical reviews inTherapeutic Drug CarrierSystems9(3，4)：249-304(1992)
  -COOH   C-末端，天冬氨酸，谷氨酸  聚合物，如PEG，具有酯或酰胺基团碳水化合物组分   mPEG-Hz体外偶联   Shearwater Inc.
  -SH   半胱氨酸  聚合物，如PEG，具有二硫键，马来酰亚胺或乙烯砜基团碳水化合物组分   PEG-乙烯砜PEG-马来酰亚胺体外偶联   Shearwater Inc.Delgado等，critical reviews inTherapeutic Drug CarrierSystems9(3，4)：249-304(1992)
  -OH   丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、OH-  糖组分具有酯、醚、氨基甲酸酯、碳酸酯基团的PEG   体内O-连接的糖基化
  -CONH2   天冬酰胺作为部分N-糖基化位点  糖组分聚合物，如PEG   体内N-糖基化
  芳香族残基   苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸  碳水化合物组分   体外偶联
  -CONH2   谷氨酰胺  碳水化合物组分   体外偶联   Yan & Wold，Biochemistry，1984，Jul 31：23(16)：3759-65
  醛酮   氧化的寡糖  聚合物，如PEG，PEG-酰肼   PEG化   Andresz等，1978，Makromol.Chem.179：301，WO92/16555，WO00/23114
  胍   精氨酸  碳水化合物组分   体外偶联   Lundblad & Noyes，Chemical Reagents forProtein修饰，CRC PressInc.，Florida USA
  咪唑环   组氨酸  碳水化合物组分   体外偶联   同胍
对于体内N-糖基化来说，术语“连接基团”以非常规方式用于表示构成N-糖基化位点的氨基酸残基(序列为N-X-S/T/C，如上所述)。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是在糖基化期间与糖组分连接的残基，但这种连接不能完成，除非该N-糖基化位点存在其它氨基酸残基。
因此，当非多肽组分是糖组分，并且偶联是通过体内N-糖基化实现时，与目的多肽氨基酸序列改变相关的术语“含有非多肽组分连接基团的氨基酸残基”应理解为构成N-糖基化位点的一个或多个氨基酸残基被改变，改变方式是功能性的N-糖基化位点被导入氨基酸序列。
在本申请中，氨基酸命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)所定义的来使用，此定义基于IUPAC命名法(IUPAC命名法以及氨基酸和肽的符号(残基命名、原子命名等)，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)以及其勘误Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。
术语“氨基酸残基”表示包含任何天然或合成氨基酸残基，并主要意图值包含在20种天然存在的氨基酸组成的组中的氨基酸残基，即选自以下氨基酸残基组成的组：丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。
用于鉴定氨基酸位置的术语举例说明如下：G124表示SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第124位被甘氨酸残基占据，G124R表示第124位甘氨酸残基被精氨酸残基取代。备选取代可以“/”表示，如N145S/T表示其中第145位的天冬酰胺被丝氨酸或苏氨酸取代的氨基酸序列。多取代以“+”表示，如K143N+X145S/T表示这样的氨基酸序列，其中第143位赖氨酸残基被天冬酰胺残基所取代，并且第145位的天冬酰胺残基被丝氨酸残基或苏氨酸残基所取代。额外氨基酸的插入，如在G124之后插入一个丙氨酸残基，表示为G124GA。在G124之后插入两个其它丙氨酸残基表示为G124AA等。本发明中，术语“插入位置X中”或“在位置X插入”表示氨基酸被插入位置X和X+1之间的氨基酸残基。氨基酸残基的缺失以星号表示。例如，第124位甘氨酸的缺失表示为G124*。
除非另有说明，此处氨基酸残基的序号对应于SEQ ID NO：1所示野生型FVII/FVIIa的氨基酸序列。
此处所用与特定突变相关的术语“不同于”是指除特定的氨基酸差异外许可存在另外的差异。例如，除了意在增加FX活化的Gla结构域中进行的修饰以外，所述多肽可包含其它不必然与该效果相关的修饰。
因此，除了此处公布的氨基酸改变外，可理解如需要，本发明变体的氨基酸序列多肽的氨基酸序列可含有其它改变，即其他的取代、插入或缺失。例如，这些改变可能包括截短N-和/或C末端的一个或多个氨基酸残基(例如1-10个氨基酸残基)，或在N-和/或C末端导入一个或多个额外的氨基酸残基，如在N末端加入甲硫氨酸残基或将半胱氨酸残基导入C末端或其附近，以及“保守性氨基酸取代”，即，取代是在具有相似特性的氨基酸的组，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，极性氨基酸，碱性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸之间进行的。
所述保守取代的实例显示在下表中。
  1   丙氨酸(A)    甘氨酸(G)  丝氨酸(S)  苏氨酸(T)
  2   天冬氨酸(D)  谷氨酸(E)
  3   天冬酰胺(N)  谷氨酰胺(Q)
  4   精氨酸(R)    组氨酸(H)  赖氨酸(K)
  5   异亮氨酸(I)  亮氨酸(L)  甲硫氨酸(M)  颉氨酸(V)
  6   苯丙氨酸(F)  酪氨酸(Y)  色氨酸(W)
题为“Gla结构域外的修饰”和“Gla结构域外的其它修饰”的部分中还公开了其它修饰的其它实例。
术语“核苷酸序列”表示两个或多个核苷酸分子的连续片段。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其任意组合。
术语“载体”指质粒或其它核苷酸序列，其能够在宿主细胞中复制或整合入宿主细胞基因组，并由此用于与相容的宿主细胞(载体-宿主系统)联合执行不同的功能以促进核苷酸序列的克隆，即制备有用量的序列，指导所述序列编码的基因产物的表达，以及将所述核苷酸序列整合入宿主细胞基因组中。所述载体将根据其执行的功能而含有不同组分。
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“培养细胞”在本文中可互换使用并且这些术语都应当理解为包括细胞生长或培养所产生的后代。
“转化”和“转染”可互换使用，指将DNA导入细胞的过程。
“可操作连接的”指两个或多个核苷酸序列通过酶促连接等方式共价连接在彼此相关的构象中，使序列行使正常功能。通常，“可操作连接的”意指被连接的核苷酸序列是邻接的，并且在分泌引导区的情况下，是邻接的而且在阅读状态下。连接在方便的限制性位点来完成。如果不存在此类位点，那么使用合成的寡核苷酸衔接子或接头以及标准的重组DNA方法。
本发明术语“修饰”或“氨基酸修饰”意图包括氨基酸侧链的取代，氨基酸残基的取代，氨基酸残基的缺失或插入。
术语“导入”主要指氨基酸残基的导入，具体是通过取代现存氨基酸残基，或者通过插入另外的氨基酸残基。
术语“去除”指氨基酸残基的去除，具体是通过将该氨基酸残基用另外的氨基酸残基取代，或者使待去除的氨基酸残基缺失(没有取代)。
本发明术语“活性”应被理解为与测定法相关的活性，所述测定法中实际测定了该活性。
因此，术语“解酰胺基活性”用于指在“解酰胺测定法”中测定的活性。为了显示“解酰胺活性”，活性形式的本发明变体应具有在本文所述“解酰胺测定法”中测定的rhFVIIa的解酰胺活性的至少10％。本发明变体的优选实施方案中，其活化的形式应具有rhFVIIa的解酰胺活性的至少20％，诸如至少30％，例如至少40％，更优选至少50％，诸如至少60％，例如至少70％，更优选至少80％，诸如本文所述“解酰胺测定法”中测定的rhFVIIa的解酰胺活性的至少90％。在该变体的感兴趣的实施方案中，在其活化的形式中，所述变体具有与rhFVIIa基本相同的解酰胺活性，诸如rhFVIIa的解酰胺活性的75-125％。
术语“凝固活性”指在本发明所述“全血测定法”中测定的活性，即获得凝块形成所需的时间。因此，较少的凝固时间对应较高的凝固活性。
术语“增加的凝固活性”用于说明在可比条件下，在本发明的“全血测定法”中测定时，所述多肽变体的凝固时间与rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的凝固时间相比，在统计学上明显降低。
本发明术语“活性”也指变体将FX活化为FXa的能力。该活性也指“FX活化活性”或“FXa生成活性”并可在本文所述“TF-非依赖性因子X活化测定法”中测定。
术语“增加的FX活化活性”或“增加的FXa生成活性”用于指本发明的变体，在其活化的形式中，与参比分子诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，其活化FX为FXa的能力在统计学上明显增加。本发明的变体(在其活化的形式中)具有的FX活化活性增加的程度可方便地在本发明所述“TF-非依赖性因子X活化测定法”中测定。
与给定的物质联用的术语“免疫原性”旨在表示该物质可诱导免疫系统反应的能力。免疫反应可以是细胞或抗体介导的反应(对免疫原性更进一步的定义参见，如，Roitt：Essential Immunnology(8th Edition，Blackwell))。一般来说，抗体反应性下降提示免疫原性下降。免疫原性可通过本领域任何已知的方法来测定，如体内方法或体外方法。
术语“功能性体内半寿期”使用其通常的含义，即多肽在体内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者多肽的活性为最初活性的50％的时间。
作为测定功能性体内半寿期的另一种方法，可测定“血清半寿期”，即，50％多肽在被清除之前在血浆或血流中循环的时间。血清半寿期的测定常常比测定功能性体内半寿期简单并且血清半寿期的大小通常可以很好地说明功能性体内半寿期大小。血清半寿期的其它可替换术语包括“血浆半寿期”、“循环半寿期”、“血清清除率”、“血浆清除率”和“清除半寿期”。该多肽通过网状内皮系统(RES)、肾、脾或肝中一个或多个的作用，通过组织因子、SEC受体或其他受体介导的清除作用，或通过特异或非特异的蛋白水解作用而清除。通常清除依赖于大小(相对于肾小球过滤的截留值而言)、电荷、连接的碳水化合物链，以及是否存在该蛋白的细胞受体。保留的功能通常选自前凝血剂、蛋白酶解或受体结合活性。功能性体内半寿期和血清半寿期可通过本领域中已知的任何合适的方法来测定。
术语“增加的”功能性体内半寿期或血清半寿期指，如在可比条件(通常在试验动物中，诸如大鼠，兔，猪或猴中测定)测定的那样，多肽变体的相关半寿期相对于参比分子诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的相关半寿期而言在统计学上明显增加。
术语“AUCiv”或“静脉内给药时的曲线下面积”以其通常的含义使用，即作为血清-时间曲线中活性下的面积，其中所述多肽变体经静脉内给药，具体是在大鼠内静脉内给药。通常测定的活性是上述“凝固活性“。一旦确定活性-时间点，可通过计算机程序诸如GraphPad Prism 3.01方便地计算AUCiv。
将理解为直接比较不同分子(例如本发明的变体与参比分子诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa)的AUCiv值，应给予相同量的活性。因此，AUCiv-值通常被标准化(即校正了注射的剂量中的差异)并表达为给予的AUCiv/剂量。
术语“对蛋白酶解降低的敏感性”主要指经可比条件下的检测，该多肽变体与hFVIIa，rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，对蛋白酶解的敏感性降低。优选，蛋白酶解降低了至少10％，如至少25％(例如降低了10％-25％或10-50％)，诸如至少25％(例如25-50％，25-75％，或25-100％)，更优选降低了至少35％，如至少降低了50％(例如降低了50-75％或50-100％)，更优选降低了至少60％，诸如至少降低了75％(例如75-100％)，或甚至降低了至少90％。
术语“肾清除”使用其通常的含义，即发生在肾的清除，例如，通过肾小球过滤、肾小管排泄或在肾小管细胞中的降解来完成。肾清除取决于多肽的物理特性，包括大小(直径)流体体积、对称性、形状/刚性和电荷。通常来说，大约为67kDa的分子量被认为是肾清除的截留值。肾清除可通过任何合适的测定方法来建立，如已建立的体内测定方法。通常，肾清除通过将标记的(如，放射标记的或荧光标记的)多肽给予患者并测定从患者收集的尿液中的标记物活性来测定。肾清除的下降经过可比条件下与相应参照多肽rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa，进行比较而确定。优选，所述多肽变体的肾清除率比rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa降低至少50％，优选降低至少75％，最优选降低至少90％。
术语“组织因子结合位点”，“活性位点区”和“活性位点结合裂隙的脊”参照实施例1定义。
术语“疏水氨基酸残基”包括以下氨基酸残基：异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
术语“带负电的氨基酸残基”包括以下氨基酸残基：天门冬氨酸(D)和谷氨酸(E).
术语“带正电的氨基酸残基”包括以下氨基酸残基：赖氨酸(K)，精氨酸(R)和组氨酸(H)。
本发明的变体
在亲本多肽的Gla结构域中的修饰优选产生这样的分子，其具有增加的磷脂膜结合亲和力，增加的活化FX为FXa的能力，和/或增加的凝固活性。本发明的变体也可具有降低的组织因子结合亲和力，并在与组织因子结合时具有降低的活性。
不受任何具体理论的限制，目前认为增强的磷脂膜结合亲和力导致其它凝血因子具体是FX附近的活化的多肽变体的局部浓度较高。由此，将FX活化为FXa的速率较高，仅仅由于活化的FVII变体与FX的更高的摩尔比。FX的活化速率提高导致活性凝血酶的量较高，由此纤维蛋白的交联率更高。
因此，认为利用本发明多肽变体的医学治疗可提供超过目前可得的rhFVIIa化合物()的优势，诸如剂量低，有效性增加和/或作用更快。
此外，相信组织因子-非依赖性变体，即与组织因子结合时与野生型人因子VIIa相比活性降低的变体，可在降低不需要的血凝块形成(例如血栓形成或血栓栓塞)危险性方面提供一些安全性优势，具体是用于治疗急性失控的出血事件诸如外伤时。
因此，在本发明高度优选的实施方案中，所述多肽变体，在其活化的形式中以及与参比分子rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比时，具有增加的FX活化活性，具体是在组织因子-非依赖性测定法诸如本文所述的“TF-非依赖性因子X活化测定法”中测定时。更具体，在本文所述“TF-非依赖性因子X活化测定法”中测定时，所述多肽变体的活性的形式的FX活化活性与参比分子的FX活化活性的比例优选为至少1.25。更优选，所述比例为至少1.5，诸如至少1.75，例如至少2，更优选至少3，诸如至少4，最优选至少5。
当参比分子为rhFVIIa时，在本文所述“TF-非依赖性因子X活化测定法”中测定的情况下，所述多肽变体的活性的形式的FX活化活性与参比分子的FX活化活性的比例优选至少约5，通常至少约10，诸如至少约15或20。
在本发明其它高度优选的实施方案中，本发明的变体与rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比具有增加的凝固活性(即减少的凝固时间)。本发明优选实施方案中，在本文所述“全血测定法”中测定时，对于变体而言达到血凝块形成的时间(t变体)与对于rhFVIIa(twt)或[P10Q+K32E]rhFVIIa而言达到血凝块形成的时间(tP10Q+K32E)的比例至多为0.9。更优选所述比例至多0.75，诸如0.7，更优选所述比例至多0.6，最优选所述比例至多0.5。
一或多种上述性质可通过本文所述修饰实现。
包括位置34中的疏水氨基酸残基的本发明的变体
如上所述，本发明第一个方面涉及FVII或FVIIa多肽变，其具有包括相对于hFVII或hFVIIa(SEQ ID NO：1)的1-15个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中疏水氨基酸残基通过位置34中的氨基酸取代导入。
将被导入位置34中的疏水氨基酸残基可选自以下残基组成的组：I，L，M，V，F，Y和W，优选I，L和V，具体是L。
优选实施方案中，所述变体还包含位置10中的氨基酸取代，具体是P10Q，和/或位置32中的氨基酸取代，具体是K32E。本发明一个具体优选实施方案中，所述变体包含位于位置10和32中的取代，诸如P10Q+K32E。
因此，在本发明感兴趣的实施方案中，所述变体包含取代P10Q+K32E+A34L。
在本发明具体的感兴趣的实施方案中，所述变体还包含在位置3和4之间的至少一种(通常一种)氨基酸残基的插入。优选插入的氨基酸残基是疏水氨基酸残基。最优选所述插入是A3AY。因此，在本发明具体感兴趣的实施方案中，所述变体包含修饰A3AY+P10Q+K32E+A34L。
除了上述任何修饰，所述变体可包括位于位置33中的其它取代。优选，疏水氨基酸残基通过位置33中的取代，具体是D33F来导入。
Gla结构域还可包含其它位置中的修饰，具体是位置8，11和28中的修饰，诸如R28F或R28E。另一方面，应理解Gla结构域不应被修饰到使得膜结合性质受损的程度。因此，优选在γ-羧化的残基中不进行修饰，即优选在残基6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中不进行修饰。在类似的方式中，通常优选不将非肽部分诸如糖部分和/或PEG基团导入Gla结构域。因此，优选在Gla结构域中不进行任何可产生体内N-糖基化位点的修饰。
最后，将理解本部分所述Gla结构域中的修饰可优选与Gla结构域以外的位置中的一或多种修饰组合(见下文题为“修饰Gla结构域外的”和“Gla结构域外的其它修饰”的部分)。
包括位置36中的氨基酸取代的本发明的变体
如上所述，本发明第二方面涉及FVII或FVIIa多肽变体，其具有包括相对于hFVII或hFVIIa(SEQ ID NO：1)的1-15个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含位置36中的氨基酸取代。
优选，将通过取代被导入位置36中的氨基酸残基是带负电的氨基酸残基，例如R36E或R36D，具体是R36E。
优选实施方案中，所述变体还包含位置10中的氨基酸取代，具体是P10Q，和/或位置32中的氨基酸取代，具体是K32E。本发明一个具体优选实施方案中，所述变体包含位置10和32中的取代，诸如P10Q+K32E。
本发明的变体还包含位置38中的取代。优选带负电的氨基酸残基通过取代导入位置38，例如K38E或K38D，具体是K38E。
因此，感兴趣的变体是包含以下取代的变体：取代P10Q+K32E+R36E或P10Q+K32E+R36E+K38E。
在具体感兴趣的实施方案中，所述变体还包含位置34中的氨基酸取代(即所得变体包含以下残基中的取代：10+32+34+36或10+32+34+36+38)。优选，带负电的氨基酸残基通过位置34中的取代例如A34E或A34D导入。
优选变体的具体实例是包括取代取代P10Q+K32E+A34E+R36E或P10Q+K32E+A34D+R36E+K38E的那些。
本发明感兴趣的实施方案中，所述变体还包含至少一种(通常一种)位于位置3和4之间的氨基酸残基的插入。优选，插入的氨基酸残基是疏水氨基酸残基。最优选所述插入是A3AY。
除了上述任何修饰，所述变体还包含位于位置33中的取代。优选，疏水氨基酸残基通过位置33中的取代具体是D33F导入。
Gla结构域可还含有其它位置中的修饰，具体是位置8，11和28中，诸如R28F或R28E。另一方面，应理解Gla结构域不应被修饰到使得膜结合性质受损的程度。因此，优选在γ-羧化的残基中不进行修饰，即优选在残基6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中不进行修饰。在类似的方式中，通常优选不将非肽部分诸如糖部分和/或PEG基团导入Gla结构域。因此，优选在Gla结构域中不进行任何可产生体内N-糖基化位点的修饰。
最后，将理解本部分所述Gla结构域中的修饰可优选与Gla结构域以外的位置中的一或多种修饰组合(见下文题为“Gla结构域外的修饰”和“Gla结构域外的其它修饰”的部分)。
包括位置74，77或116中的氨基酸取代的本发明的变体
如上所述，本发明第三方面涉及FVII或FVIIa多肽变体，其具有包括相对于hFVII或hFVIIa(SEQ ID NO：1)的3-15个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含位置10，32中的氨基酸取代以及至少一种位于选自位置74，77和116组成的组的位置中的氨基酸取代。
优选实施方案中，位置10中的氨基酸取代是P10Q，位置32中的氨基酸取代是K32E。
更优选，位置74，77或116中的取代选自：P74S，E77A和E116D组成的组。
在感兴趣的实施方案中，变体还包含位置34中的氨基酸取代。优选，带负电的氨基酸残基通过取代导入位置34，例如A34E或A34D，具体是A34E。
本发明感兴趣的实施方案中，所述变体还包含至少一种(通常一种)位于位置3和4之间的氨基酸残基的插入。优选，插入的氨基酸残基是疏水氨基酸残基。最优选所述插入是A3AY。
因此，感兴趣的变体的具体实例包括含有修饰A3AY+P10Q+K32E+E116D，A3AY+P10Q+K32E+E77A和P10Q+K32E+A34E+P74S的变体。
除了上述任何修饰，所述变体还包含位于位置33中的取代。优选，疏水氨基酸残基通过位置33中的取代具体是D33F导入。
Gla结构域可还含有其它位置中的修饰，具体是位置8，11和28中，诸如R28F或R28E。另一方面，应理解Gla结构域不应被修饰到使得膜结合性质受损的程度，即优选在残基6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中不进行修饰。优选在Gla结构域中不产生体内N-糖基化位点。
最后，将理解本部分所述Gla结构域中的修饰可优选与Gla结构域以外的位置中的一或多种修饰组合(见下文题为“Gla结构域外的修饰”和“Gla结构域外的其它修饰”的部分)。
Gla结构域外的修饰
2.3小时的循环rhFVIIa半寿期在““Summary Basis for Approval for
Figure G04823777420060302D000171
”，FDA参考号96-0597中有报道。相对较高的剂量和频繁的给药对于实现并保持所需治疗或预防效果是必须的。结果，难以实现适宜的剂量调控，并且对频繁的静脉内给药的需要对患者的生活方式造成限制。
具有较长循环半寿期和/或增加的生物利用度(诸如静脉内给药时与rhFVIIa相比具有增加的曲线下面积)将减少必要的给药次数。由于目前需要频繁注射并可能获得更佳的治疗性FVIIa水平同时提高治疗效果，很明显需要改进的FVII-或FVIIa-样分子。
因此，本发明的另一目的是提供改良的FVII或FVII分子(FVII或FVIIa变体)，其具有增加的生物利用度(诸如与参比分子诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，在经静脉内给药时，曲线下面积增加)，并且与参比分子诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比能更有效地将因子X活化为因子Xa(不与组织因子结合)(从而能更有效地治疗失控的出血，诸如外伤，或慢性疾病诸如血友病)。
因此，感兴趣的本发明的变体是这样的变体，在其活化的形式中，与参比分子诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，经静脉内给药时产生增加的曲线下面积(AUCiv)。这可通过在大鼠中经静脉内给药方便地确定。更具体，本发明感兴趣的变体是活化的形式中的所述变体的AUCiv与参比分子，诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的AUCiv的比例为至少1.25，诸如至少1.5，例如至少1.75，更优选至少2，诸如至少3，更优选至少4，诸如至少5，具体是在大鼠中(经静脉内)给药时。
该效应通常对应与参比分子，诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，增加的功能性体内半寿期和/或增加的血清半寿期。因此，在本发明其它感兴趣的实施方案中，所述活化的形式中的变体的功能性体内半寿期或血清半寿期与参比分子，诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的功能性体内半寿期或血清半寿期的比例为至少1.25.更优选，活化的形式中的所述变体的相关半寿期与参比分子，诸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的相关半寿期的比例为至少1.5，诸如至少1.75，例如至少2，更优选至少3，诸如至少4，例如至少5。
一种增加蛋白质循环半寿期的方法是保证蛋白质的肾清除率降低。这可通过将所述蛋白质与能够降低所述蛋白质的肾清除率的化学部分例如聚乙二醇(PEG)偶联来实现。
此外，化学部分与蛋白质相连或取代暴露于蛋白水解的氨基酸可有效阻断与蛋白水解酶的接触，否则该蛋白水解酶将导致该蛋白发生蛋白水解。
如上所述，由于蛋白水解导致的不稳定性是目前的rhFVIIa治疗的已知问题。蛋白水解因此是获得与冻干产品相反的溶液中的制备物的主要障碍。获得稳定可溶性制备物的优点在于使得患者更容易使用，并且在紧急情况下，能迅速起作用，这很可能会拯救生命。通过在主要蛋白水解位点的定点诱变来防止蛋白水解的努力已经公开于WO 88/10295。
WO 01/58935公开多种导致AUCiv，功能性体内半寿期和/或血清半寿期增加的修饰。WO 01/58935中公开的变体是通常用于开发改进的FVII或FVIIa分子的新策略的结果，所述策略也可用于本发明的亲代FVII或FVIIa多肽。
更具体地，通过在FVII或FVIIa多肽中去除和/或导入包括非-多肽部分连接基团的的氨基酸残基，可特异性改造所述多肽使得所述分子更易于与所选非多肽部分偶联，从而优化偶联模式(例如保证非-多肽部分在FVII或FVIIa多肽变体表面的最佳分布和数量，并保证仅仅意图被偶联的连接基团存在于该分子中)，并由此获得新的偶联分子，其具有解酰胺活性以及与rhFVIIa相比而言一或多种改良的特性。
在本发明感兴趣的实施方案中，位于Gla结构域以外的一种以上的氨基酸残基被改变，例如所述改变包括去除以及导入含有用于所选非-多肽部分的连接基团的氨基酸残基。除外去除和/或导入氨基酸残基，所述多肽变体可包含与导入和/或去除包含用于非多肽部分的连接基团的氨基酸残基无关的其它取代。
所述多肽变体还可附着于丝氨酸蛋白酶抑制物以抑制所述多肽变体的催化位点。可选，存在于所述催化位点中的一或多种氨基酸残基(S344，D242和H193)可被突变以使得所得变体无活性。所述突变的一个实例是S344A。
包含用于非-多肽部分的连接基团的氨基酸残基无论是被去除还是导入，其基于所选非-多肽部分的性质，在大多数情况中，基于将实现多肽变体与非多肽部分之间的偶联的方法来选择。例如，当所述非多肽部分是聚合物分子诸如聚乙二醇或聚烯烃氧化物衍生的分子，包含连接基团的氨基酸残基选自以下残基组成的组：赖氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，以及酪氨酸，优选赖氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸以及谷氨酸，更优选赖氨酸和半胱氨酸，具体是半胱氨酸。
只要将非-多肽部分的连接基团导入亲本多肽或从亲本多肽中去除，将被修饰的氨基酸残基的位置优选位于亲本FVII或FVIIa多肽的表面，更优选被这样的氨基酸残基所占据，所述氨基酸残基的侧链有至少25％暴露于表面(如本文实施例1中定义的)，优选其侧链的至少50％暴露于表面(如本文实施例1中定义的)。所述位置已经基于对hFVII或hFVIIa分子的3D结构的分析来鉴定，如WO 01/58935所述。
此外，待修饰的位置优选选自FVII或FVIIa分子的一部分，其位于组织因子结合位点以外，和/或活性位点区域以外，和/或活性位点结合裂隙的脊以外。这些位点/区域在本文的实施例1以及WO 01/58935中鉴定。
在去除连接基团的情况中，包括这样的基团并占据如上定义的位置的相关氨基酸残基优选被不包含用于目的非多肽部分的连接基团的不同的氨基酸残基取代。通常，待去除的氨基酸残基是对其而言偶联是不利的残基，例如位于所述多肽功能位点或其附近的氨基酸残基(因为在所述位置的偶联由于例如受体识别受损而导致产生的偶联物失活或活性降低)。在本发明背景中，术语“功能位点”意图指对于FVII或FVIIa的功能或作用而言必不可少或者参与到其中的一或多种氨基酸残基。所述氨基酸残基是功能位点的一部分。所述功能位点通过本领域已知方法测定，并优选通过分析FVIIa-组织因子复合体(见Banner et al.，Nature 1996；380：41-46)的结构鉴定。
对于导入连接基团的情况，包含所述基团的氨基酸残基被导入相关位置，优选通过取代占据所述位置的氨基酸残基来导入。
FVII或FVIIa多肽中存在并可用于偶联的连接基团的确切数目有赖于需要通过偶联实现的效应。待获得的效应例如依赖偶联的性质和程度(例如非多肽部分的性质，需要或可能与所述多肽变体偶联的非多肽部分的数目，它们应当被偶联或应避免偶联的情况，等)。
位于亲本FVII或FVIIa多肽中Gla结构域以外的待修饰的氨基酸残基总数(与氨基酸序列SEQ ID NO：1相比)通常不超过10个。优选，FVII或FVIIa变体包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1中的氨基酸残基s 46-406在1-10氨基酸残基中不同，通常在1-8或2-8氨基酸残基，例如1-5或2-5个氨基酸残基，诸如1-4或1-3个氨基酸残基中不同，例如与SEQ ID NO：1中的氨基酸残基46-406有1，2或3个氨基酸残基不同。
类似地，本发明的多肽变体可含有1-10个(另外的)非-多肽部分，通常1-8或2-8个(另外的)非-多肽部分，优选1-5或2-5个(另外的)非-多肽部分，诸如1-4或1-3个(另外的)非-多肽部分，例如1，2或3个(另外的)非-多肽部分。应理解所述另外的非-多肽部分与位于Gla结构域外的连接基团共价相连。
非-多肽部分是糖部分的本发明的多肽变体
本发明优选实施方案中，糖部分的连接位点，诸如糖基化位点，具体是体内糖基化位点，诸如体内N-糖基化位点，已经被导入Gla结构域外的位置和/或从所述位置去除，优选导入所述位置。
本发明术语“天然存在的糖基化位点”包括位置N145，N322，S52和S60的糖基化位点。术语“天然存在的体内O-糖基化位点”包括位置S52和S60，术语“天然存在的体内N-糖基化位点”包括位置N145和N322。
因此，在本发明非常感兴趣的实施方案中，所述非-多肽部分是糖部分且导入的连接基团是糖基化位点，优选体内糖基化位点，诸如体内O-糖基化位点或体内N-糖基化位点，具体是体内N-糖基化位点。通常导入1-10个糖基化位点，具体是体内N-糖基化位点，优选1-8，1-6，1-4或1-3糖基化位点，具体是体内N-糖基化位点，被导入Gla结构域外的一或多个位置。例如1，2或3个糖基化位点，具体是体内N-糖基化位点，可被导入Gla结构域外，优选通过取代来导入。
应理解为制备包含一或多个糖基化位点的多肽变体，所述多肽变体必须在这样的宿主细胞中表达，所述宿主细胞能够在糖基化位点连接糖(寡糖)部分或者可选发生体外糖基化。糖基化型宿主细胞的实例见下文题为“偶联于糖部分”这一部分中。
导入了糖基化位点，具体是体内N-糖基化位点的位置的实例包括这样的氨基酸残基，其侧链有至少25％暴露于表面(如本文实施例1所述)，诸如至少50％的侧链暴露于表面。所述位置优选选自分子的一部分，其位于组织因子结合位点，和/或活性位点区域以外，和/或活性位点结合裂隙的脊以外。应理解术语“其侧链有至少25％(或至少50％)暴露于表面”用于体内N-糖基化位点的导入时，该术语指在实际连接的糖部分的位置中氨基酸侧链的表面可接近性。在许多情况下，需要在相对于实际连接了糖部分的精氨酸残基而言的位置+2中导入丝氨酸或苏氨酸残基，导入了丝氨酸或苏氨酸残基的这些位置被被允许埋藏，即其侧链有少于25％暴露于表面。
产生体内N-糖基化位点的所述取代的具体优选的实例包括选自以下组的取代：A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205S，I205T，V253N，T267N，T267N+S269T，S314N+K316S，S314N+K316T，R315N+V317S，R315N+V317T，K316N+G318S，K316N+G318T，G318N，D334N及其组合。更优选，所述体内N-糖基化位点通过选自以下取代组成的组的取代导入：A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T，S314N+K316T，R315N+V317T，K316N+G318T，G318N，D334N及其组合。更优选，体内N-糖基化位点通过选自以下取代组成的组的取代导入：T106N，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T及其组合，具体是T106N，I205T和V253N中的一个，两个或三个。
一个实施方案中，仅有一个体内N-糖基化位点通过取代导入。其它实施方案中，两个或更多个(诸如两个)体内N-糖基化位点通过取代导入。产生两个体内N-糖基化位点的优选取代的实例包括选自以下取代组成的组的取代：A51N+G58N，A51N+T106N，A51N+K109N，A51N+G124N，A51N+K143N+N145T，A51N+A175T，A51N+I205T，A51N+V253N，A51N+T267N+S269T，A51N+S314N+K316T，A51N+R315N+V317T，A51N+K316N+G318T，A51N+G318N，A51N+D334N，G58N+T106N，G58N+K109N，G58N+G124N，G58N+K143N+N145T，G58N+A175T，G58N+I205T，G58N+V253N，G58N+T267N+S269T，G58N+S314N+K316T，G58N+R315N+V317T，G58N+K316N+G318T，G58N+G318N，G58N+D334N，T106N+K109N，T106N+G124N，T106N+K143N+N145T，T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，T106N+S314N+K316T，T106N+R315N+V317T，T106N+K316N+G318T，T106N+G318N，T106N+D334N，K109N+G124N，K109N+K143N+N145T，K109N+A175T，K109N+I205T，K109N+V253N，K109N+T267N+S269T，K109N+S314N+K316T，K109N+R315N+V317T，K109N+K316N+G318T，K109N+G318N，K109N+D334N，G124N+K143N+N145T，G124N+A175T，G124N+I205T，G124N+V253N，G124N+T267N+S269T，G124N+S314N+K316T，G124N+R315N+V317T，G124N+K316N+G318T，G124N+G318N，G124N+D334N，K143N+N145T+A175T，K143N+N145T+I205T，K143N+N145T+V253N，K143N+N145T+T267N+S269T，K143N+N145T+S314N+K316T，K143N+N145T+R315N+V317T，K143N+N145T+K316N+G318T，K143N+N145T+G318N，K143N+N145T+D334N，A175T+I205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，A175T+S314N+K316T，A175T+R315N+V317T，A175T+K316N+G318T，A175T+G318N，A175T+D334N，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T，I205T+S314N+K316T，I205T+R315N+V317T，I205T+K316N+G318T，I205T+G318N，I205T+D334N，
V253N+T267N+S269T，V253N+S314N+K316T，V253N+R315N+V317T，V253N+K316N+G318T，V253N+G318N，V253N+D334N，T267N+S269T+S314N+K316T，T267N+S269T+R315N+V317T，T267N+S269T+K316N+G318T，T267N+S269T+G318N，T267N+S269T+D334N，S314N+K316T+R315N+V317T，S314N+K316T+G318N，S314N+K316T+D334N，R315N+V317T+K316N+G318T，R315N+V317T+G318N，R315N+V317T+D334N和G318N+D334N。更优选，所述取代选自：T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，A175T+I205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T和V253N+T267N+S269T组成的组，更优选选自T106N+I205T，T106N+V253N和I205T+V253N组成的组。
另一实施方案中，三个或更多个(诸如三个)体内N-糖基化位点通过取代导入。产生三个体内N-糖基化位点的优选取代的实例选自：I205T+V253N+T267N+S269T和T106N+I205T+V253N组成的组。
如上所述，优选体内N-糖基化位点被导入这样的位置，其不形成本文所述组织结合位点、活性位点区域或活性位点结合裂隙的脊的一部分。
应理解上述部分中所述的任何修饰可互相结合，还可与位置34和/或36中的上述取代，具体是A34E/L和/或R36E组合，优选与位置10和/或32中的上述取代，具体是P10Q和/或K32E组合。用于导入体内N-糖基化位点的修饰中，优选的修饰包括T106N，I205T和V253N中的一种，两种或三种，具体是这些修饰中的两种，即T106N+I205T，与T106N+V253N或I205T+V253N。
因此，本发明一个优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N。
另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含修饰P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
如上所述，这些修饰的任何一或多种还可与至少一种氨基酸残基通常是单氨基酸残基在位置3和4之间的插入组合，其中所插入的残基优选为疏水氨基酸残基。最优选所述插入是A3AY。因此，本发明另一优选实施方案中，FVII或FVIIa变体包含选自下组的修饰：
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T；
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N；
A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N；
A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T；
A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N；
A3AY+P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N；
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T；
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N；
A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
Gla结构域外的其它修饰
本发明另一实施方案中，FVII或FVIIa变体除了含有本文以上部分所述的修饰以外，还可含有已知可增加多肽内在活性的突变，例如WO02/22776中所述的那些。
例如，所述变体可包含至少一种位于选自以下位置中的修饰：157，158，296，298，305，334，336，337或374。优选的取代的实例包括选自下组的取代：V158D，E296D，M298Q，L305V或K337A。更优选，所述取代选自：V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A，
V158D+E296D+M298Q+K337A，V158D+E296D+M298Q+L305V，V158D+E296D+M298Q，M298Q，L305V+K337A，L305V或K337A。
本发明另一实施方案中，FVII或FVIIa变体除了含有本文以上部分所述的修饰以外，还可含有其它突变，诸如Neuenschwander et al，Biochemistry，1995；34：8701-8707公开的取代K341Q。其它可能的另外的取代包括D196K，D196N，G237L，G237GAA及其组合。
对于FVII和FVIIa变体与非-多肽部分的偶联的其它详述见WO01/58935和WO 03/093465，上述文件为对比文件并包含在此作为参考。
制备本发明偶联的变体的方法
通常，本发明偶联的变体可通过以下方法制备：在可诱导所述变体多肽表达的条件下培养合适的宿主细胞，回收所述变体多肽，其中a)所述变体多肽包含至少一个N-或O-糖基化位点，所述宿主细胞是能够进行体内糖基化的真核宿主细胞，和/或b)所述变体多肽与非-多肽部分在体外偶联。
与聚合物分子的偶联
与多肽偶联的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或杂聚物，通常所述分子的分子量范围约为300-100000Da，如约500-20000Da，更优选约为500-15000Da，甚至更优选的范围约为2-15kDa，如约为3-10kDa。当此处所用术语“约”涉及某一分子量时，术语“约”就表示大约的平均分子量，且反映这样一个事实，即在一定的聚合物制品中通常有一定的分子量分布。
均聚物的实例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。杂聚物是包含不同的偶联基团，如羟基基团和氨基基团的聚合物。
合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子组成的组：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共马来酸酐，聚苯乙烯共马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，或任何其它适于降低免疫原性和/或增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期的生物聚合物。聚合物分子的另一实例是人白蛋白或另一种丰富的(abundant)血浆蛋白。一般来说，聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、无毒的、无抗原性的、无免疫原性的，具有各种水溶性特性并易于从活的生物中排出。
PEG是优选的聚合物分子，因为其与例如多糖诸如葡聚糖相比仅仅具有极少量能够交联的反应性基团。具体地，感兴趣的是单功能PEG，如单甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因为其偶联的化学相对简单(仅仅一个反应基团可用于与多肽上的连接基团偶联)。因此，交联的危险被消除，所得偶联的变体更均一，并且聚合物分子与变体多肽的反应更易于控制。
为了使聚合物分子与变体多肽共价结合，聚合物分子的羟基末端基团必须为活化的形式，即具有反应性功能基团(其实例包括伯胺基团、酰肼(HZ)、巯基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。适当活化的聚合物分子可购得，例如可得自Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
用于本发明的活化的线性和分支的聚合物分子的具体实例在NektarMolecule Engineering Catalog 2003(Nektar Therapeutics)中描述，其包含在本文作为参考。
活化的PEG聚合物的具体实例包括下列线性PEG：NHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，和支链PEG如PEG2-NHS和US 5,932,462和US 5,643,575中所公开的那些，将两篇参考文献包含在本文供参考。公开了有用的聚合物分子，PEG化化学以及偶联方法的其它公开出版物在WO 01/58935和WO 03/093465中列出。
尤其优选用于与半胱胺酸残基偶联的活化的PEG聚合物的具体实例，包括以下线性PEG：乙烯基砜-PEG(VS-PEG)，优选乙烯基砜-mPEG(VS-mPEG)；马来酰亚胺-PEG(MAL-PEG)，优选马来酰亚胺-mPEG(MAL-mPEG)和正吡啶基(orthopyridyl)-二硫-PEG(OPSS-PEG)，优选直吡啶基-二硫-mPEG(OPSS-mPEG)。通常，所述PEG或mPEG聚合物的大小约5kDa，约10kD，约12kDa或约20kDa。
本领域技术人员技术人员会知道根据所述变体多肽的连接基团(以上已给出实例)以及聚合物的功能基团(例如，是氨基、羟基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀酰亚胺，马来酰亚胺，乙烯砜(vinysulfone)或卤代乙酸基团)来使用激活方法和/或偶联化学。PEG化可以与变体多肽上的所有可利用的基团(即，暴露于多肽表面的连接基团)偶联，或可以与一个或多个特定的连接基团如，N-末端氨基(如US5985265描述的)或与半胱氨酸残基偶联。而且，偶联可以在一步中完成或以多步方式(如，WO99/55377中所述的)来完成。
为对半胱胺酸残基PEG化(见上文)，通常在PEG化前用还原剂诸如二硫苏糖醇处理FVII或FVIIa变体。所述还原剂随后通过常规方法去除，诸如通过脱盐。PEG与半胱胺酸残基的偶联通常在适宜缓冲液中、pH6-9、4℃-25℃进行达16小时的时间。
将理解PEG化被设计为使得产生就连接的PEG分子数目、所述分子的大小和形式(例如它们是否是线性或支化的)以及所述变体多肽中的连接位点而言最佳的分子。将要使用的聚合物的分子量可根据待实现的所需效果来选择。
对于与蛋白质上的仅仅单个连接基团(例如N-末端氨基基团)的偶联，优选所述聚合物分子，其可为线性或支化的，具有高分子量，优选约10-25kDa，诸如约15-25kDa，例如约20kDa。
通常，聚合物偶联在目的在于使尽可能多的可得聚合物连接基团与聚合物分子反应的条件下进行。这通过使得所述聚合物的摩尔数相对于多肽的摩尔数有适宜的过量来实现。通常，活化的聚合物分子与多肽的摩尔比达约1000-1，诸如达约200-1，或达约100-1。然而一些情况中，所述比例可更低，诸如达约50-1，10-1，5-1，2-1或1-1以获得最佳反应。
还涉及根据本发明通过接头偶联聚合物分子与多肽。适宜接头是本领域技术人员已知的；也见WO 01/58935。
偶联后，残余的活化的聚合物分子根据本领域已知的方法封闭，例如通过将伯胺加入反应混合物，并且通过适宜的方法去除产生的失活的聚合物分子。
将理解根据情况，例如变体多肽的氨基酸序列，所用活化的PEG化合物的性质以及具体的PEG化条件，包括PEG与多肽的摩尔比，可获得不同程度的PEG化，较高程度的PEG化通常利用较高的PEG与变体多肽的比例获得。然而，得自任何给定的PEG化方法的PEG化的变体多肽将通常包含PEG化程度稍有不同的的偶联的多肽变体的随机分布。
与糖组分的偶联
为了实现包含一个或多个糖基化位点的FVII分子的体内糖基化，编码该变体多肽的核苷酸序列必须被插入到糖基化型真核表达宿主中。表达宿主细胞可选自真菌(丝状真菌或酵母)、昆虫、或动物细胞，或选自转基因植物细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞或HEK细胞，如HEK293细胞，或昆虫细胞，如SF9细胞，或者酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或任何下文进一步描述的宿主细胞。
糖部分(诸如葡聚糖)与所述变体多肽的氨基酸残基的体外共价偶联可如例如WO 87/05330和Aplin et al.，CRC Crit Rev.Biochem，pp.259-306，1981中所述进行。也参见WO 03/093465中关于FVII或FVIIa的变体的体外糖基化的其它信息。
丝氨酸蛋白酶抑制剂的连接
丝氨酸蛋白酶抑制剂的连接可根据WO 96/12800中所述方法进行。
制备本发明的多肽变体的方法
本发明的多肽变体，可选为糖基化的形式，可通过本领域已知的任何适宜方法制备。所述方法包括构建编码所述变体多肽的核苷酸序列并在适宜的经转化或转染的宿主中表达所述序列。优选，所述宿主细胞是gamma-羧化型宿主细胞诸如哺乳动物细胞。然而，尽管效率较低，多肽本发明的变体可通过化学合成或化学合成的组合或化学合成与重组DNA技术的组合来制备。
编码本发明多肽的核苷酸序列可通过以下方法构建：分离并合成编码亲本FVII，诸如具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的hFVII的核苷酸序列，然后改变所述核苷酸序列使得实现相关氨基酸残基的导入(即插入或取代)或去除(即删除或取代)。
根据常规方法通过定点诱变方便地修饰核苷酸序列。可选通过化学合成例如通过利用寡核苷酸合成物制备核苷酸序列，其中寡核苷酸基于所需多肽的氨基酸序列设计，并优选选择在产生重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。例如数种编码部分所需多肽的小寡核苷酸可通过PCR(聚合酶链反应)、接合或接合链反应(LCR)(Barany，Proc Natl Acad Sci USA88：189-193，1991)合成并集合。单独的寡核苷酸通常含有5’和3’突出端用于互补集合。
一旦集合(通过合成，定点诱变或其它方法)，编码所述多肽的核苷酸序列被插入重组载体并可操作连接于在所需的经转化的宿主细胞中表达FVII所需的控制序列。
本领域技术人员将能够选择适宜载体，表达控制序列以及宿主用于表达所述多肽。所述重组载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。另外，导入宿主细胞时，该载体可整合到宿主细胞基因组中并且与其整合到其中的染色体一起复制。
所述载体优选是表达载体，其中编码本发明多肽变体的核苷酸序列可操作地连接于核苷酸序列转录所需的另外的片段。所述载体通常来源于质粒或病毒DNA。许多用于在本文所述宿主细胞中表达的表达载体是可商购的或在文献中描述。用于表达FVII的适宜载体的详细信息见WO 01/58935，包含在本文作为参考。
术语“控制序列”在本文中包括对本发明多肽表达必需的或有利的所有成分。每个控制序列对编码该多肽变体的核苷酸序列来说可以是天然的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、增强子或上游活化序列、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子。
本发明可以使用各种各样的表达控制序列，例如WO 01/58935公开的任何控制序列所述文献包含在本文作为参考。
本发明编码多肽变体的核苷酸序列，无论是通过定点诱变、合成、PCR或其他方法制备的，可选择地包括编码信号肽的核苷酸序列。如多肽变体需要从表达它的细胞中分泌则需要信号肽。这种信号肽，如果存在，应该能被选择用于表达所述多肽的细胞识别。该信号肽可与所述多肽同源(如，通常与hFVII相连)或异源(如其起源于不是hFVII的其它来源)，或者可以与宿主细胞同源或异源，即通常所述信号肽是自该宿主细胞表达的信号肽或者通常其不是自该宿主细胞表达的信号肽。
可以使用任何合适的宿主产生本发明的多肽变体，包括细菌(但不是特别优选的)、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的实例包括革兰氏阳性细菌诸如芽孢杆菌属，如短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、假单孢菌属或链霉菌属的菌株，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌菌株。合适的丝状真菌宿主细胞的实例包括曲霉属菌株，如米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉，镰刀菌属(Fusarium)或木霉菌属。合适的酵母宿主细胞的实例包括糖酵母属的菌株，如酿酒酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属，如巴斯德毕赤酵母或P.Methanolica、汉逊酵母属，如多形汉逊酵母或Yarrowia。合适昆虫宿主细胞的实例包括鳞翅目细胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉纹夜蛾细胞(High Five)(US5077214)。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、绿猴细胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(如，NS/O)、仓鼠幼鼠肾脏(BHK)细胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人细胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))。另外合适的细胞系在本领域中是已知的并可购自公共的保藏中心如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)可按US5047335所述方法进行改性来表达唾液酸转移酶，如，1，6-唾液酸转移酶，以便改进变体多肽的糖基化。
为了增加分泌，使本发明多肽与内切蛋白酶，具体是PACE(配对的碱性氨基酸转化酶)(如US5986079中所述)，诸如Kex2内切蛋白酶(如WO00/28065中所述)一起制备是有利的。
用于将外源DNA导入上述细胞类型的方法以及关于FVII变体的表达、制备和纯化的其它信息见WO 01/58935，包含在本文作为参考。
本发明的药物组合物及其用途
另一个方面，本发明涉及组合物，具体涉及药物组合物，其包含本发明的变体多肽以及可药用的载体或赋形剂。
本发明的多肽变体或药物组合物可用做药物。
用于上述改进的性质，本发明的多肽变体，或本发明的药物组合物尤其可用于治疗外伤患者、血小板减少症患者、抗凝治疗的患者以及患有静脉曲张所致的出血或其它上胃肠道出血的肝硬化患者、接受常位肝移植或肝切除(允许无输血手术)或血友病患者中的失控出血事件。
外伤定义为外来因素导致的活体组织损伤。它在美国是导致死亡的第四位原因并对经济造成了较大的财政负担。
外伤分类为钝性或穿透性。钝性外伤导致内部挤压，器官损伤和内部出血，而穿透性外伤(作为穿透身体并破坏组织，血管和器官的因素的结果)导致外部出血。
外伤可由多种事件导致，例如交通事故，枪伤，跌到，机器事故以及刺伤。
肝硬化可由直接肝损伤，包括长期酗酒，慢性病毒性肝炎(乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎)和自身免疫性肝炎，以及由胆道损伤导致的直接损伤，包括原发性胆管硬化，原发性硬化性胆管炎和胆道闭锁导致。肝硬化较不常见的原因包括遗传疾病导致的直接肝损伤，诸如囊性纤维化，alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏，血色素沉着病，Wilson病，半乳糖血症以及糖原储存疾病。移植是治疗晚期肝硬化患者的关键的介入措施。
因此，本发明另一方面涉及本发明的多肽变体，其用于制备治疗需血凝块形成的疾病或病症的药物。本发明另一方面涉及治疗患有需要血凝块形成的疾病或病症的哺乳动物的方法，包括给予需要的哺乳动物有效量的本发明的多肽变体或药物组合物。
需要增加的凝块形成的疾病/病症的实例包括，但不限于，出血，包括脑出血，以及患有严重的失控的出血，诸如外伤的患者。其它实例包括接受活体移植的患者，接受切除的患者以及患有静脉曲张所致的出血的患者。本发明的多肽可用于增加其中的血凝块形成的其它广泛的疾病/病症是血友病，例如von Willebrand病，血友病A，血友病B或血友病C。
以治疗有效剂量给予本发明的多肽变体，所述剂量大约与用rFVII如
Figure G04823777420060302D000311
治疗所采用的剂量相同或更高。本文中“治疗有效剂量”是指对所治疾病状态足以产生预期效果的剂量。给药的准确剂量取决于具体情况，可通过本领域技术人员通过公知的方法加以确定。一般来说，所述剂量应当能够防止或减小被治疗疾病或症状的严重性或扩散。对本领域技术人员显而易见的是本发明多肽变体或组合物的有效量取决于疾病、剂量、给药时间表、多肽变体或组合物是单独给药还是与其它治疗剂联合给药、组合物的血清半寿期和患者的总体健康状况。
本发明的多肽变体优选以组合物形式给药，其中包括可药用载体或赋形剂。“可药用”意指在给药的患者中不引起任何不利作用的载体或赋形剂。这些可药用载体和赋形剂在本领域中是公知的(参见，如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany(1990)；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。
本发明的多肽变体可以“原形(as is)”使用和/或以其盐的形式使用。合适的盐包括但不限于与碱金属或碱土金属如钠、钾、钙和镁形成的盐，以及如锌盐。这些盐或复合物可作为晶体和/或无定形结构存在。
本发明的药物组合物可单独给予也可以与其他治疗制剂联合给予。这些制剂可以作为同一药物组合物中的一个组成部分给予，或者与本发明多肽变体同时或依照一定的治疗时间表分别给予。此外，本发明的多肽变体或药物组合物可用做其他治疗的佐剂。
本发明中“患者”包括人和其他哺乳动物。因此所述方法医用兽用均可。
本发明多肽变体的药物组合物可以多种形式配置，如以液体，凝胶，冻干的或压制的固体形式。优选的形式根据治疗的具体需要而异，这对于本领域技术人员是显而易见的。
尤其，本发明多肽变体的药物组合物以冻干的形式或稳定溶液形式配制。所述多肽变体可通过多种公知方法冻干。多肽变体可通过将本文所述蛋白酶解位点去除或掩盖，制备成稳定的溶液形式。获得稳定溶液的优点在于更便于患者使用，而且在紧急情况时，作用更快，这可能可以救生。优选的形式根据治疗的具体需要而异，这对于本领域技术人员是明显的。
本发明制剂可以多种方式给药，包括但不限于，口服、经皮下、静脉内、小脑内、鼻内、真皮内、腹腔内、肌肉内、肺内、经阴道、经直肠、眼内或以任何其它适宜的方式。制剂可连续灌注给予，尽管大药丸注射(bolus injection)是可接受的，但需利用本领域公知技术，如泵或植入。一些情况下所述制剂可以溶液或喷雾直接给予。
非胃肠道给药剂(Parentals)
药物组合物的优选实例是设计成非肠道给药的溶液。尽管在很多情况下，药物溶液制剂可以以适用于立即使用的液体形式提供，但所述非肠道制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者的情况下，所述组合物在使用前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可药用稀释剂如灭菌注射用水或灭菌生理盐水溶液重新配制。
在非胃肠道给药的情况下，制成冻干制剂或水溶液备用，这通过将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)进行适当混合来制备，所述可药用载体、赋形剂或稳定剂如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子表面活性剂或去污剂、抗氧化剂和/或其它各种添加剂诸如膨胀剂或填充剂，鳌合剂，抗氧化剂和助溶剂。
有关适于给药FVII变体的胃肠外制剂以及持续释放的制剂的详细信息见WO 01/58935和WO 03/093465，所述文献包含在本文中作为参考。
本发明还通过以下非限制性实施例描述。
材料和方法
活性位点区
活性位点区定义为任何这样的残基，所述残基在催化三联体(残基H193，D242，S344)内任何原子的
Figure G04823777420060302D000331
距离内具有至少一个原子。
对蛋白酶解降低的敏感性的检测
蛋白酶解可通过US5580560的实施例5中说明的方法检测，其中所述蛋白水解是自主蛋白酶解。
此外，降低的蛋白酶解可利用放射性标记的样品在体内模型中进行检测，通过取血样，并对这些血样进行SDS-PAGE和放射自显影来对比rhFVIIa和本发明多肽变体的蛋白酶解作用。
无论使用何种分析确定蛋白酶解，“降低的蛋白酶解”是指与利用rhFVIIa获得的裂解相比，裂解的明显降低，这是通过对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶的凝胶扫描、HPLC来测定的，或利用下述组织因子非依赖性活性测定发通过相对于野生型的保守的催化活性来测定的。
对多肽变体的分子量的确定
多肽变体的分子量是通过SDS-PAGE、凝胶过滤、Western印迹、基质辅助的激光解吸(matrix assisted laser deserption)、质谱分析或平衡离心，如SDS-PAGE根据Laemmli，UK(Nature Vol 227(1970)，pp.680-85)所述测定的。
测定磷脂膜结合亲和力
磷脂膜结合亲和力如Nelsestuen et al.，Biochemistry，1977；30；10819-10824或US 6,017,882的实施例1所述测定。
TF-非依赖性因子X活化测定法
该测定法在Nelsestuen et al.，J Biol Chem，2001；276：39825-39831的第39826页中描述。
简而言之，待侧定的分子(hFVIIa，rhFVIIa或活化的形式的本发明的多肽变体)与磷脂来源(优选磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸比例为8∶2)以及再脂化的(relipidated)因子X在含有BSA的Tris缓冲液中混合。保温规定的时间后，反应通过加入过量EDTA终止。因子Xa的浓度随后通过在加入生色原底物(S-2222，Chromogenix)之后于405nm的吸光度改变来测定。相对于背景校正以后，rhFVIIa(awt)的组织因子非依赖性活性作为10分钟后的吸光度改变来测定，本发明的多肽变体(a变体)的组织因子非依赖性活性作为10分钟后的吸光度改变来测定。活化的形式的多肽变体的活性与rhFVIIa的活性的比例定义为a变体/awt。
凝血测定法
FVIIa及其变体的凝固活性在一阶段测定法中测定，凝固时间记录在Thrombotrack IV凝血计(Medinor)上。溶解因子VII-耗尽的人血浆(AmericanDiagnostica)并在室温平衡15-20分钟。随后将50微升血浆转移到血凝计杯中。
FVIIa及其变体在Glyoxaline缓冲液(5.7mM巴比妥酸盐，4.3mM柠檬酸钠，117mM NaCl，1mg/ml BSA，pH 7.35)中稀释。将50μl样品加入血凝计杯中并在37℃保温2分钟。
促凝血酶原激酶(Medinor)用水溶解，并加入CaCl2至终浓度4.5mM。通过加入100μl促凝血酶原激酶启动反应。
为测定缺乏TF时的凝固活性，使用相同测定法而不加入促凝血酶原激酶。数据利用PRISM软件分析。
全血测定法
FVIIa及其变体的凝固活性在一阶段测定法中测定，凝固时间记录在Thrombotrack IV凝血计(Medinor)上。100μl FVIIa或其变体在含有10mMglycylglycine，50mM NaCl，37.5mM CaCl2，pH 7.35的缓冲液中稀释并转移到反应杯。凝血反应通过加入含有10％0.13M柠檬酸三钠作为抗凝剂的50μl血液启动。数据利用Excel或PRISM软件分析。
解酰胺测定法
变体切割小肽底物的能力利用生色原底物S-2288(D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide)测定。在测定缓冲液(50mM Na-Hepes pH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％BSA，1U/ml肝素)中将FVIIa稀释到约10-90nM。此外，可溶性TF(sTF)在测定缓冲液中稀释到50-450nM。120μl测定缓冲液与20μl FVIIa样品以及20μl sTF混合。轻柔震摇下在室温保温5分钟，然后在37℃保温10分钟以后，所述反应通过加入S-2288底物到1mM启动，并在数个时间点测定405nm的吸光度。
ELISA测定法
FVII/FVIIa(或变体)浓度通过ELISA测定。微量滴定板的孔用针对蛋白酶结构域的抗体、利用2μg/ml的PBS溶液(100μl每孔)包被。在R.T.(室温)包被过夜后，用THT缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.20.05％Tween-20)洗涤孔四次。随后，每孔加入200μl 1％酪蛋白(利用100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.2，通过稀释2.5％母液制备)进行封闭。在R.T.保温1hr以后，倒空孔，加入100μl样品(可选在稀释缓冲液(THT+0.1％酪蛋白)中稀释)。再在室温保温1hr以后，用THT缓冲液洗涤孔四次，并加入100μl针对EGF-样结构域(1μg/ml)的生物素标记的抗体。再在R.T.保温1小时，然后用THT缓冲液再洗涤4次，加入100μl链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，1/10000稀释)。再在R.T.保温1小时，然后用THT缓冲液再洗涤4次，加入100μl TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine)，Kem-en-Tech A/S，Denmark)。在R.T.、暗处保温30分钟，加入100μl1M H2SO4并测定OD450nm。利用rhFVIIa(
Figure G04823777420060302D000361
)制备标准曲线。
可选，FVII/FVIIa或变体可通过Gla结构域而不是通过蛋白酶结构域定量。在该ELISA模式中，用抗EGF样结构域抗体包被孔过夜，并且为检测，使用钙依赖性单克隆抗Gla结构域抗体(2μg/ml，100μl每孔)。在该步中，将5mM CaCl2加入THT和稀释缓冲液。
凝血图测定法
hFVIIa，rhFVIIa或FVIIa变体对人血浆凝血酶生成的影响在Hemker etal.(2000)Thromb Haemost 83：589-91中589页所述的改良版本的测定法中检测。简而言之，待测定的分子(either hFVIIa，rhFVIIa或变体)与含有再脂化的组织因子(诸如Dade Behring的Innovin)或磷脂(比例为8∶2的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，或比例为4∶2∶4的磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸与磷脂酰乙醇胺)的FVII-耗尽的血小板贫乏血浆(PPP)混合。
反应通过加入产荧光凝血酶底物和氯化钙启动。连续测定荧光，凝血酶解酰胺活性通过计算荧光曲线的斜率(荧光随时间的增加)来测定。在这种方法中，获得达最大凝血酶解酰胺活性的时间(Tmax)，以及凝血酶生成速率(凝血酶活性的最大增加)，并可计算总凝血酶功(曲线下面积(AUC))。
冷冻柠檬酸化FVII-耗尽的血浆在谷物胰蛋白酶抑制剂(100μg/ml血清)存在以抑制凝血接触途径的条件下解冻。向96孔板的每个孔中加入80μl血浆和20μl含有终浓度0.1-100nM的受试rhFVII或变体的缓冲液。将重组人组织因子(rTF)加入5μl测定缓冲液至终浓度1pM。测定缓冲液为含有20mMHepes，150mM NaCl和60mg/ml BSA的蒸馏水溶液。所述反应通过加入含有0.1M氯化钙的20μl底物溶液启动。所述测定板和试剂预加热到37℃，反应在此温度进行。所用荧光计是BMG Fluormeter，其具有390nm的激发滤波器和460nm的发射滤波器。以20-40秒的间隔在30-180分钟内测定96孔净底板(96-well clear bottom plates)的每个孔中的荧光。数据利用PRISM软件分析。
组织因子结合表面胞质团共振测定法(Biacore测定法)
表面胞质团共振分析用于测定野生型因子VIIa及其变体与可溶性组织因子的相对结合。含有细胞外结构域的重组可溶性组织因子通过NHS/EDC偶联而偶联于Biacore CM5芯片上的270反应单元。可溶性组织因子在pH4.5偶联以使得能与芯片表面反应。
在该测定法中，因子VII蛋白的组织因子结合在单个FVIIa或变体浓度下，比较以允许所述变体与野生型的相对比较。该浓度通过在芯片上流动的、浓度75和0μg/ml的野生型FVIIa的标准曲线来测定。加入10mMEDTA去除FVIIa。通过这种方式测定浓度15μg/ml产生线性范围内的结合。FVIIa变体随后以15μg/ml在芯片上流动以测定FVIIa或变体与组织因子的相对结合强度。
实施例
实施例1
将Banner et al.，J Mol Biol，1996；285：2089的与可溶性组织因子复合的hFVIIa的X光结构用于该实施例。关于该实施例中计算的其它信息见WO 01/58935。
表面暴露
进行分级ASA计算，确定以下残基有超过25％的侧链暴露于其表面：A1，N2，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，S12，L13，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，F24，E25，E26，R28，E29，F31，K32，D33，A34，E35，R36，K38，L39，W41，I42，S43，S45，G47，D48，Q49，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，D63，Q64，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，T83，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，E99，S103，D104，H105，T106，G107，T108，K109，S111，R113，E116，G117，S119，L120，L121，A122，D123，G124，V125，S126，T128，P129，T130，V131，E132，I140，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，V158，P160，K161，E163，L171，N173，G174，A175，N184，T185，I186，H193，K197，K199，N200，R202，N203，I205，S214，E215，H216，D217，G218，D219，S222，R224，S232，T233，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H249，Q250，P251，V253，T255，D256，E265，R266，T267，E270，R271，F275，V276，R277，F278，L280，L287，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，E296，N301，M306，T307，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，V317，G318，D319，S320，P321，N322，T324，E325，Y326，Y332，S333，D334，S336，K337，K341，G342，H351，R353，G354，Q366，G367，T370，V371，G372，R379，E385，Q388，K389，R392，S393，E394，P395，R396，P397，G398，V399，L400，L401，R402，P404和P406(A1-S45位于Gla结构域内，其余位置位于Gla结构域外)。
确定以下残基有超过50％的侧链暴露于其表面：A1，A3，F4，L5，E6，E7L8，R9，P10，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，E25，E26，E29，K32，A34，E35R36，K38，L39，I42，S43，G47，D48，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，T106，G107，T108，K109，S111，E116，S119L121，A122，D123，G124，V131，E132，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，P160，N173，G174，A175，K197，K199，N200，R202，S214，E215，H216，G218，R224，V235，P236，G237，T238，H249，Q250，V253，D256，T267，F275，R277，F278，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，N301，M306，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，G318，D319，N322，E325，D334，K341，G354，G367，V371，E385，K389，R392，E394，R396，P397，G398，R402，P404和P406(A1-S43位于Gla结构域内，其余位置位于Gla结构域外)。
组织因子结合位点
通过ASA计算，FVII中的以下残基在复合物中改变其ASA。这些残基被定义为组成受体结合位点的残基：L13，K18，F31，E35，R36，L39，F40，I42，S43，S60，K62，D63，Q64，L65，I69，C70，F71，C72，L73，P74，F76，E77，G78，R79，E82，K85，Q88，I90，V92，N93，E94，R271，A274，F275，V276，R277，F278，R304，L305，M306，T307，Q308，D309，Q312，Q313，E325和R379。
活性位点区
活性位点区是具有至少一个与催化三联体(残基H193，D242，S344)中任何原子的间距在范围内的原子的任何残基：I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344，G345，G346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405。
活性位点结合槽的脊
活性位点结合槽的脊通过对FVIIa结构1FAK.pdb的目测观察定义为：N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370。
实施例2
设计用于在哺乳动物细胞中表达人凝血因子VII的表达盒
用于表达rhFVII的表达盒的设计和克隆见WO 01/58935的实施例2。
实施例3
构建编码本发明变体的表达盒
序列突出端延伸(SOE)PCR用于通过标准方法产生构建体，其具有变体FVII开放读框，其中含有取代的密码子。
实施例4
在CHO K1细胞中表达多肽变体
在T-25培养瓶中接种50％满底的细胞系CHO K1(ATCC#CCL-61)，该培养瓶含有MEMα，10％FCS(Gibco/BRLCat#10091)，P/S和5μg/ml植醌，使细胞生长直到满底。满底的单层细胞用5μg上述相关质粒，以Lipofectamine 2000为转染试剂(Life technologies)，按照生产商的方法进行转染。转染后24小时对培养液取样，并利用利用识别hFVII的EGF1结构域的ELISA定量。在此时间点，可对细胞进行相关选择(例如潮霉素B)以产生稳定转染体的集合。使用CHO K1细胞并用潮霉素B抗性基因作为质粒上的选择标记的情况下，通常在1周之内完成。
实施例5
制备稳定表达多肽变体的CHO K1细胞
将一小瓶CHO-K1转染子集落解冻，并将细胞接种于含25ml MEMα，10％FCS，植醌(5μg/ml)，100U/l青霉素，100μg/l链霉素的175cm2组织培养瓶中，生长24小时。收集细胞，将其稀释并以1/2-1个细胞/孔的密度铺96孔微滴定平板。生长一周后，约20-100个细胞的集落出现于孔中，将仅包含一个集落的那些孔进行标记。再生长2周后，用200μl新鲜培养基替换含有仅一个集落的所有孔中的培养基。24小时后，取出培养基样品并通过例如ELISA分析。选出高产量克隆并用于大规模制备FVII或变体。
实施例6
多肽变体的纯化和随后的活化
FVII和FVII变体如下纯化：所述方法在4℃进行。从大规模生产收获的培养基利用具有30kDa截留Pellicon膜的Millipore TFF系统超滤。浓缩所述培养基以后，加入柠檬酸盐至5mM，调节pH到8.6。如果有必要，降低传导率至10mS/cm。随后将所述样品上样于Q-sepharose FF柱，所述柱用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6平衡。用100mM NaCl，10mM Tris pH 8.6，然后用150mM NaCl，10mM Tris pH 8.6洗涤后，用10mM Tris，25mM NaCl，35mM CaCl2，pH 8.6洗脱FVII。
对于第二个层析步骤，通过将单克隆钙依赖性抗Gla结构域抗体与CNBr活化的SepharoseFF偶联来制备亲和柱。约5.5mg抗体偶联于每ml树脂。该柱用10mM Tris，100mM NaCl，35mM CaCl2，pH 7.5平衡。将NaCl加入样品至浓度100mM NaCl，pH调节到7.4-7.6。样品的O/N应用后，用100mM NaCl，35mM CaCl2，10mM Tris pH 7.5洗柱，用100mM NaCl，50mM柠檬酸盐，75mM Tris pH 7.5洗脱FVII蛋白。
对于第三次层析，如必要，使样品的导电率降低到低于10mS/cm，pH调节到8.6。随后以密度约3-5mg蛋白每ml凝胶将样品加于Q-sepharose柱(用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6平衡)以获得有效的活化。应用后，用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6洗柱约4小时，流率为3-4柱体积(cv)每小时。FVII蛋白利用0-100％500mM NaCl，10mM Tris pH 8.6的梯度在40cv洗脱。汇集含有FVII的级分。
对于最后的层析步骤，导电率降低到低于10mS/cm。随后，将样品以浓度3-5mg蛋白每ml凝胶加于Q-sepharose柱(用140mM NaCl，10mMglycylglycine pH 8.6洗涤)。所述柱随后用140mM NaCl，10mM glycylglycinepH 8.6洗涤，FVII用140mM NaCl，15mM CaCl2，10mM glycylglycine pH 8.6洗脱。洗脱物稀释到10mM CaCl2，pH调节到6.8-7.2。最后，加入Tween-80至0.01％，调节pH至5.5，储存在-80℃。
实施例7
试验结果-FX活化活性
对本发明的变体进行“TF-非依赖性因子X活化测定法”，得到以下结果(所述结果表示为参比P10Q+K32E变体的活性的百分比)：
表1
如上述结果所示，本发明的变体显示与rhFVIIa以及[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，其FX活化活性有实质的改善。
实施例8
试验结果-“全血测定法”中的凝固活性
对本发明的变体进行“全血测定法”显示，它们与rhFVIIa以及[P10Q+K32E]rhFVIIa相比显示明显增加的凝固活性(即降低的凝固时间)。试验结果显示在图1以及下表2中。
Figure G04823777420060302D000421
表2
实施例9
试验结果-“凝血测定法”中的凝固活性
当在TF依赖性凝血测定法(上文材料和方法部分所述的“凝血测定法”)中检测时，很明显地，具有R36E取代的本发明变体的凝固活性与rhFVII或本发明的其它变体相比明显降低。见下表3。然而，如上文实施例7所述，具有取代R36E的变体在“TF-非依赖性因子X活化测定法”中具有明显降低的凝固活性。
Figure G04823777420060302D000422
Figure G04823777420060302D000431
表3
实施例10
试验结果-凝血图测定法中的凝血酶生成
利用磷脂(PL)-依赖性和组织因子(TF)-依赖性凝血图(将上文凝血图测定法中的描述)，在不同变体蛋白浓度下测定FVIIa变体的最大凝血酶生成速率。通过对最大凝血酶生成速率(表示为FU(荧光单位)每秒2)作为以pM表示的变体浓度的函数绘图，获得显示在图2中(最大组织因子-依赖性凝血酶生成速率)和图3(最大磷脂-依赖性凝血酶生成速率)中的结果。
从这些结果明显可见，根据所述反应为PL依赖性或TF依赖性的，FVIIa变体P10Q K32E A34E R36E具有不同的凝血酶生成能力。该变体的最大TF-依赖性凝血酶生成速率与FVIIa变体P10Q K32E或A3AY P10Q K32EA34L相比降低大约10倍(图2中的点线)。P10Q K32E A34E R36E的滞后时间，达峰时间，峰高度和(较小程度上)AUC与其它变体(结果为显示)相比降低。与TF依赖的活性相反，P10Q K32E A34E R36E变体的PL依赖的活性等同于实施例中所检测的其它变体的所述活性(见图3)，即，该变体即使在TF依赖的活性基本上降低的情况下也具有完全的PL活性。
在相同试验中，将变体P10Q K32E A34E R36E与变体P10Q K32EA34E P74S直接比较，后者具有图2所示的高TF-依赖性凝血酶生成速率。这两种变体的TF-结合的差异(即变体P10Q K32E A34E R36E的降低的TF-结合)据信是由于R36E取代的存在直接导致的，其可能与A34E取代协同作用。
实施例11
试验结果-Biacore测定法中FVIIa与组织因子的结合
利用TF芯片，在Biacore系统上，如材料和方法部分所述，通过表面胞质团共振对本发明的变体进行检测，得到以下结果：
表4            *n＝2
与来自凝血图测定法(实施例10)的TF-依赖性凝血酶生成速率数据一致，表4中的结果表明R36E取代与组织因子的结合较弱。
在相同的测定法中，也检测具有与表4所示变体相同的修饰以及另外两种导入两个糖基化位点的修饰(T106N和V253N或I205T)的FVIIa变体，与组织因子的结合。结果显示在下表5中。
表5
这些结果与表4的一致并显示与表4中没有其它糖基化位点的相同的变体(或野生型)相比，表5的变体中两种新糖基化位点的存在使得组织因子结合(进一步)减弱。与表4的变体的情况一样，糖基化变体中T36E取代的存在也导致组织因子结合水平基本上低于没有所述取代的其它糖基化变体的组织因子结合。
Figure IYZ000001360193500011

Claims (57)

1.具有凝血活性的因子VII或因子VIIa多肽变体，其包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO：1所示的人因子VII或人因子VIIa的氨基酸序列具有1-15个氨基酸修饰的不同，其中带负电的氨基酸残基通过SEQ ID NO：1的位置36中的取代导入。
2.权利要求1的变体，其中所述取代是R36D。
3.权利要求1的变体，其中所述取代是R36E。
4.权利要求1中的变体，还包括位置34中的氨基酸取代。
5.权利要求4的变体，其中带负电的氨基酸残基通过位置34中的取代导入。
6.权利要求5的变体，其中所述取代是A34E。
7.权利要求6的变体，包括取代A34E+R36E。
8.权利要求4的变体，其中疏水氨基酸残基通过位置34中的取代导入。
9.权利要求8的变体，其中所述取代选自下组的取代：A34I，A34L，A34M，A34V，A34F，A34Y和A34W。
10.权利要求9的变体，其中所述取代选自下组的取代：A34I，A34L和A34V。
11.权利要求10的变体，其中所述取代是A34L。
12.权利要求11的变体，包括取代A34L+R36E。
13.权利要求1的变体，还包括位置10和/或32中的氨基酸取代。
14.权利要求13的变体，其包括取代K32E。
15.权利要求13的变体，其包括取代P10Q。
16.权利要求13的变体，其包括取代P10Q+K32E。
17.权利要求16的变体，其包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E。
18.权利要求16的变体，其包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E。
19.权利要求1的变体，其中包括用于非-多肽部分的连接基团的至少一个氨基酸残基已被导入位于Gla结构域外的位置。
20.权利要求19的变体，其中所述连接基团是糖基化位点。 
21.权利要求20的变体，其中所述糖基化位点是通过取代导入的体内N-糖基化位点。
22.权利要求21的变体，其中所述N-糖基化位点通过选自下组的取代导入：A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205S，I205T，V253N，T267N，T267N+S269T，S314N+K316S，S314N+K316T，R315N+V317S，R315N+V317T，K316N+G318S，K316N+G318T，G318N，D334N及其组合。
23.权利要求22的变体，包括至少一种选自下组的取代：T106N，I205T和V253N。
24.权利要求23的变体，包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T。
25.权利要求23的变体，包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N。
26.权利要求23的变体，包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N。
27.权利要求23的变体，包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T。
28.权利要求23的变体，包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N。
29.权利要求23的变体，包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
30.权利要求1的变体，还包括位于位置3和4之间的至少一个氨基酸残基的插入。
31.权利要求30的变体，包括位于位置3和4之间的一个氨基酸残基的插入。
32.权利要求30的变体，其中疏水氨基酸残基在位置3和4之间插入。
33.权利要求32的变体，其中所述插入是A3AY。
34.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34E+R36E。
35.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34L+R36E。 
36.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T。
37.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N。
38.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N。
39.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T。
40.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N。
41.权利要求33的变体，包括插入A3AY和取代P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
42.权利要求1的变体，其中在相对于SEQ ID NO：1的位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中没有进行修饰。
43.权利要求1-42的变体，其中所述变体是其活化的形式。
44.权利要求1-42的变体，其中当在本文所述“TF-非依赖性因子X活化测定法”中测定时，所述变体的活化形式的FX活化活性与rhFVIIa的FX活化活性的比例为至少5。
45.核苷酸序列，其编码权利要求1-42任一项的变体。
46.表达载体，其包含权利要求45的核苷酸序列。
47.宿主细胞，其包含权利要求45的核苷酸序列或权利要求46的表达载体。
48.权利要求47的宿主细胞，其中所述宿主细胞是能够进行体内糖基化的gamma-羧化细胞。
49.组合物，包括权利要求1-44任一项的变体以及至少一种可药用的载体或赋形剂。
50.权利要求1-44任一项的变体在制备需要凝块形成而治疗疾病或病症的药物中的用途。
51.根据权利要求50的用途，其中所述疾病或病症选自下组的疾病或病症：严重的失控的出血，接受移植或切除术的哺乳动物中的出血，静脉曲张所致的出血，肝硬化患者中的上胃肠道出血，血小板减少症和血友病。 
52.根据权利要求50的用途，其中所述疾病或病症是外伤。
53.根据权利要求51的用途，其中所述疾病或病症是血友病。
54.根据权利要求52的用途，其中所述外伤是钝性外伤。
55.根据权利要求52的用途，其中所述外伤是穿透性外伤。
56.根据权利要求50的用途，其中所述疾病或病症是出血。
57.根据权利要求56的用途，其中所述出血是脑出血。 
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