CN1520299A - 具有nep/mp-联合抑制活性的化合物在制备药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对中性肽链内切酶(NEP)和金属蛋白酶IGS5具有联合的、特别是具有同时的抑制活性的化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗患有可以通过联合的、特别是同时的抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。在一个特定方面，本发明涉及具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的所述化合物用于治疗患有big－ET－1水平升高并且可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的较大哺乳动物、优选人的用途。在另一特定方面，本发明涉及具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的所述化合物用于治疗患有ET－1显著上调并且可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的较大哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。在本发明中，具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的所述化合物优选用于治疗和/或预防哺乳动物，优选人，更优选患有可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的患者亚群的高血压，包括继发形式的高血压如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌疼痛。而且，另外将显示联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的所述化合物与其它单个和/或联合金属蛋白酶抑制剂(不是该NEP/IGS5抑制剂)，例如与单个ACE－和/或NEP－抑制剂和/或这些金属蛋白酶的混合抑制剂，联合可能是有益的。

Description

具有NEP/MP-联合抑制活性的 化合物在制备药物中的用途
发明领域
本发明涉及化合物的新的药用用途，该化合物起中性肽链内切酶(NEP)和特定金属蛋白酶(MP)的联合或同时抑制剂的作用，该特定金属蛋白酶最近已克隆并重新鉴定为具有广泛底物特异性的真正金属蛋白酶。
发明背景
金属蛋白酶是多肽，其形成一种结构和功能相关酶类的特定家族，例如肽酶，其在治疗各种疾病中已受到药用或药理上的关注。已经鉴定了几种疾病，其中金属蛋白酶在所述疾病的病理学中担当关键角色。例如，现有技术中已经鉴定和表征了许多锌金属蛋白酶或结构和功能相关酶类的特定家族，而且已经变得显然的是，这些酶(如锌金属蛋白酶)的参与在包含正常和疾病两种状况下的生物学功能多样性中担当角色。锌金属蛋白酶是这些酶中催化功能严重依赖位于活性位点的锌离子的子集。这组酶包括根据序列和结构信息分类的多个家族，例如据描述密切涉及诸如胚胎的发育、软骨和骨的形成、肽激素的加工、生殖、心血管疾病、关节炎和癌症的过程。因此，在制药领域特别感兴趣的不仅是调查每种金属蛋白酶的关键作用及其在健康和疾病中的潜在相互关系，而且特别是设计提高的治疗观念以控制与所述金属蛋白酶有关的疾病。
根据锌金属蛋白酶中锌结合位点周围的序列和结构信息，可以将这些酶分成几个家族，进而可以分成超家族，诸如“metzincins”(虾红素、沙雷菌、reprolysin、基质素)、“gluzincins”(嗜热芽孢菌蛋白酶、neprilysin、血管紧张素转化酶、氨肽酶)、或“zincins”(包含metzincins和gluzincins超家族)。这种分组不仅有助于阐明常见的催化和生物合成加工机制，而且在阐明最近鉴定的具有相似锌结合性基序的蛋白质的功能中是无价的。本领域早已鉴定的金属蛋白酶(如锌酶)的一些个别范例包括neprilysin、内皮素转化酶、血管紧张素转化酶、嗜热芽孢菌蛋白酶、氨肽酶、虾红素、沙雷菌、reprolysin、基质素、胰岛素酶、羧肽酶和DD-羧肽酶。
特别感兴趣的金属蛋白酶亚类，例如中性肽链内切酶(NEP)、内皮素转化酶(ECE)和血管紧张素转化酶(ACE)，它们的一些更具体的特征和相关的已知活性可以概括如下。
血管紧张素I转化酶(ACE；肽基二肽酶A；EC 3.4.15.1)是锌金属蛋白酶中血管紧张素转化酶家族的成员。ACE主要表达于内皮细胞、上皮细胞、和神经上皮细胞的表面(躯体ACE)作为胞外酶，即包括其催化位点在内的大部分质量锚定在质膜上并面向胞外环境。在血管内皮细胞的质膜中发现了ACE，在肺部血管内皮细胞表面发现了高水平的ACE，这样推测ACE的活性位点代谢循环物质。除了内皮细胞定位ACE以外，ACE还表达于小肠吸收性上皮细胞和肾近曲小管的刷状缘中。ACE还发现于单核的细胞(诸如巨噬细胞分化后的单核细胞和T淋巴细胞)和成纤维细胞中。采用放射性标记的特异性ACE抑制剂的体外放射自显影和免疫组织化学研究已经将ACE的重要位置定位于脑。ACE主要发现于脉络丛，其可能是脑脊液、室管膜、穹窿下器官、基底神经节(尾状核-豆状核和疮白球)、黑质、和垂体中ACE的来源。已经在许多生物学流体中检测到可溶性形式的ACE，诸如血清、精液、羊水和脑脊液。可溶性形式的ACE似乎衍生自内皮细胞中的膜联合形式的酶。ACE的主要生理学活性是切除血管紧张素I的C端二肽而生成有效的血管加压肽-血管紧张素II，并通过相续除去两个C-端二肽而灭活血管舒张肽-缓激肽。由于ACE涉及这两种血管活性肽(血管紧张素II和缓激肽)的新陈代谢，因此ACE已成为了高血压和充血性心力衰竭治疗的决定性靶分子。这导致了对高度有效且特异性的ACE抑制剂的开发，这些抑制剂已经成为临床上重要的且广泛使用的口服活性药物，用于控制这些高血压和充血性心力衰竭状况。代谢血管活性肽是对ACE了解得透彻的生理学功能，然而，由于ACE所处部位和/或对一系列生物学活性肽的体外切割，这种肽还涉及与血压调控无关的一系列其它生理学过程，诸如免疫、生殖和神经肽代谢。
中性肽链内切酶(NEP、neprilysin、EC 3.4.24.11)是一种锌金属蛋白酶，归类为neprilysin家族的成员。NEP最初由兔肾刷状缘膜分离。稍后，在大鼠脑中鉴定了涉及类鸦片肽、脑啡肽降解的NEP样酶。胞外酶NEP的克隆和随后的定点诱变试验显示，除了具有与嗜热芽孢菌蛋白酶相似的特异性以外，它还具有相似的活性位点组织。对于切割肽中疏水性残基的N-端一侧，NEP还显示嗜热芽孢菌蛋白酶-样特异性。关于NEP的一般分布，已经确定了在脑和脊髓中，而且损伤和电子显微镜研究总体上支持NEP主要定位于神经元，然而该酶能够存在于条纹灰质和条纹黑质途径的纤维周围的少突神经胶质细胞上和周围神经系统的施旺细胞上。NEP并未显示集中在特定膜界面(诸如突触)上，而是均一的分布于神经元核周体和树突的表面。在周边，NEP在肾和肠的刷状缘膜、淋巴结、和胎盘中特别丰富，而且以较低浓度发现于许多其它组织中，包括主动脉血管壁。已发现常见急性成淋巴细胞白血病抗原就是NEP，现有技术还显示该酶瞬时存在于淋巴造血细胞表面，并在某些疾病状态下在成熟淋巴细胞上以升高的水平存在。对NEP的临床关注，特别是对NEP抑制剂作为潜在临床试剂的关注，起源于NEP与另一种锌金属蛋白酶，氨肽酶N(APN，膜丙氨酰氨肽酶，EC 3.4.11.2)在脑啡肽降解中的作用及其在心房钠尿肽(ANP)降解中的作用。例如，已知NEP和血管紧张素转化酶(ACE)的双重抑制剂是有效的抗高血压药物，因为它同时升高心房钠尿肽的循环水平(由于NEP抑制)和降低血管紧张素II的循环水平(由于ACE抑制)。当周边酶出现降解循环钠尿肽和利尿肽、心房钠尿肽时，这引起了对NEP抑制剂的临床潜能的进一步关注。因此研究NEP抑制剂的抗高血压特性。由另一个实例知道，合成NEP抑制剂thiorphan对脑啡肽代谢的抑制在小鼠中引起纳洛酮(naloxone)可逆的抗疼痛应答。这说明有可能通过升高靶受体区域的内源鸦片样物质的水平来镇痛，而相对没有吗啡或其它经典鸦片剂药物的副作用。现已认识到，为了实现任何显著效果，还应当抑制其它脑啡肽代谢酶，特别是氨肽酶N(APN)。这些双重NEP/APN抑制剂完全阻断脑啡肽代谢，而且具有强烈的抗疼痛特性。
内皮素转化酶(ECE)催化有效血管收缩肽内皮素(ET)生物合成的最终步骤。这包括切割无活性中间物big-内皮素的Trp-Val键。ECE-1是与中性肽链内切酶(NEP；neprilysin；EC 3.4.24.11，见上文)同源的一种锌金属蛋白酶。与NEP一样，ECE-1受到化合物膦酰二肽的抑制，而且是II型整合膜蛋白。然而，与NEP不同的是，ECE-1以二硫键连接的二聚体形式存在，而且不受其它NEP抑制剂诸如thiorphan的抑制。免疫细胞化学研究指示ECE-1主要定位于细胞表面，其中它作为胞外酶存在。ECE-1定位于内皮细胞和一些分泌细胞(如胰β-细胞和平滑肌细胞)。有效且选择性的ECE抑制剂或ECE和NEP的双重抑制剂可能在心血管和肾医学中具有治疗作用。内皮素(ET)是由21个氨基酸通过两个分子内二硫键构成的双环肽，它是至今鉴定的最有效的血管收缩肽之一，而且对动物的施用导致血压持续升高，说明了它在心血管调控中的潜在角色。ET-1在人类内的内源生成有助于维持基础血管张力。因此，内皮素系统及其相关酶(如ECE)代表了新型制药学试剂开发的可能候选者。因此，对ECE的临床关注，特别是对ECE抑制剂作为潜在临床试剂的关注，起源于ECE的作用，特别是在ET生物合成方面。因此，显示显著内皮素转化酶抑制活性的化合物可用于治疗和预防由ET诱导或怀疑由它诱导的多种疾病。
本领域目前已知的金属蛋白酶或金属肽链内切酶的具体底物例如有big-内皮素-1(big-ET-1)、心房钠尿肽(ANP)和缓激肽。例如，big-ET-1已知是高效血管收缩肽内皮素-1(ET-1)的生物学非活性前体，ET-1由其前体big-ET-1经特异性蛋白加工而成。ET-1在保持人类基本血管紧张度方面具有生理作用，而且似乎是造成各种心血管疾病(如高血压、心力衰竭和动脉粥样硬化)发病的因素。一种使过量ET-1的副作用减小的手段是抑制big-ET-1向ET-1的酶促转化。由于在1994年已克隆出内皮素转化酶-1(ECE-1)(Xu D.等人，Cell，1994，78：473-485)，因此这种酶被普遍接受为可以引起big-ET-1向ET-1生理转化的肽链内切酶。同样自此，NEP-抑制剂膦酰二肽广泛地被接受为同样有效地抑制ECE-1的工具化合物；而且，其活性可以在注入big-ET-1的心力衰竭患者中得到证实(Love MP等人，Circ，1996，94：2131-2137)。
然而，尽管事实上ECE-1具有切割big-ET-1的能力，但是最近报道对于ECE-1是否为生理学相关的内皮素转化酶产生了怀疑，或者至少争论在ET-1产生中一定涉及其它酶(Barker S.等人，MolPharmacol，2001，59：163-169)。根据Barker等人，内皮素-1(ET-1)已被推断为引起高血压、肺高血压、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化和哮喘的致病因子(还参见Douglas，1997，Trends Pharmacol Sci 18：408-412；Haynes和Web，1998，J Hypertension 16：1081-1098；Goldie和Henry，1999，Life Sci 65：1-15)。许多高效ET受体拮抗剂已报道用于临床，但是这些化合物通常选择性地用于ETA受体或非选择性ETA/ETB拮抗剂(Douglas，1997，见上面)。尽管ETB受体在一些组织中占主导地位，但是它们对于选择性ETB或非选择性ETA/ETB拮抗剂的阻塞有耐受性(Hay等人，1998，J Pharmacol Exp Ther 284：669-677)。因此，用ECE抑制剂特异性地抑制ET-1合成可能是一种在某些条件下减轻过量ET-1的副作用的较好方法。
本发明的目的是产生新的治疗和/或预防与金属蛋白酶有关的疾病的治疗观念，例如首先通过提供对治疗有用的化合物或者特异性地抑制药学关注的单个金属蛋白酶，或者通过作用方案的联合模式特异性地抑制至少两种类型的金属蛋白酶的经选择的组合；其次通过提供所述金属蛋白酶抑制化合物的对治疗有用的组合。
发明概述
基于本领域目前(Barker S.等人，Mol Pharmacol，2001，59：163-169)对ECE-1是否是唯一生理学相关的内皮素转化酶的怀疑，以及在ET-1的产生中一定涉及其它酶的结论，根据本发明，进行同源性克隆方案，以便调查迄今未知的金属蛋白酶在big-ET-1向ET-1转化中是否可能起作用，并且调查对最近鉴定的金属蛋白酶的特异性抑制剂是否可能抑制该转化。这些努力使得发现了与NEP高度同源(54％同一性)的以及与ECE-1或多或少较低同源(37％同一性)的新的人类基因，它们是neprilysin金属蛋白酶家族中两种最具特征的成员。该人类基因的多肽产物被发现在许多人类组织中有丰富的表达，并命名为工作标题“IGS5”(参见待审国际专利申请PCT/EP 00/11532)。
因此总体而言，本发明涉及对以下酶具有联合的、特别是同时的抑制活性的化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途：
a)中性肽链内切酶(NEP)和
b)金属蛋白酶IGS5，它是一种包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽；
用于制备治疗(患有可以通过联合的、特别是同时的抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的)哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
在一特定方面，本发明涉及具有联合的NEP/IGS5抑制活性的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗(患有big-ET-1水平升高并且可以通过联合的、特别是同时的抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的)哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
在另一特定方面，本发明涉及具有联合的NEP/IGS5抑制活性的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗(患有ET-1显著上调并且可以通过联合的、特别是同时的抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的)哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
在另一特定方面，本发明涉及具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备优选用于治疗和/或预防较大哺乳动物、优选人的高血压，包括继发形式的高血压如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌疼痛的药物(药用组合物)。
而且，另外将所述显示联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的化合物与其它单个和/或联合的不同于NEP/IGS5抑制剂的金属蛋白酶抑制剂，例如与分开的ACE-和/或ECE-和/或NEP-抑制剂和/或这些金属蛋白酶的混合抑制剂联合，可能是有益的。
发明详述
定义
本申请所用的术语，除非本文后面另外明确定义的，具有与本发明领域的技术人员通常理解的含义。提供以下定义以便于理解本文中频繁使用的某些术语。
其中，“IGS5”尤其是指包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一列出的氨基酸序列的多肽或其各自的变体。因此，“IGS5”具体包括IGS5PROT、IGS5PROT1和IGS5PROT2。
“酶活性”或“生物学活性”是指所述IGS5的代谢或生理学功能，包括相似的活性或改进的活性或非希望副作用降低的活性。
“IGS5-基因”是指包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：5之一列出的核苷酸序列的多核苷酸或其各自的变体(如等位基因变体)和/或它们的互补序列。
作为本领域一种对同一性的度量，“同一性”是通过序列比较而测定的两种或多种多肽序列或者两种或多种多核苷酸序列之间的相关性。在本领域，“同一性”还指可以通过这些序列之间的匹配，例如一般通过对比序列使得获得最大程度匹配，由此而测定的多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度。因而，“同一性”和/或另一用词“相似性”具有本领域认可的含义，而且可以容易地通过已知方法测定，包括但不限于《Computational Molecular Biology》(计算分子生物学)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；《Biocomputing：Informatics of and Genome Projects》(生物计算：信息学和基因组计划)，Smith，D.W.编，大学出版社，纽约，1993；《Computer Analysisof Sequence Data》(序列数据的计算机分析)，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana出版社，新泽西，1994；《Sequence Analysisin Molecular Biology》(分子生物学中的序列分析)，von Heinje，G.，学术出版社，1987；《Sequence Analysis Primer》(序列分析引物)，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M Stockton出版社，纽约，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中所述的方法。用于测定同一性的优选方法是如此设计以给出待测序列之间的最大匹配。用于测定同一性和相似性的方法已编译成公众可获得的计算机程序。用于测定两种序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序软件包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)。公众可以由NCBI和其它来源获得BLAST X程序(BLAST手册，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于测定同一性。公众可获得的分别可用于测定多肽序列或多核苷酸序列的同一性或相似性的程序已知为来自Genetics ComputerGroup，Madison WI的“gap”(缺口)程序，其常常以默认参数(而且末端缺口没有罚分)运行该程序用于比较。用于多肽序列比较的优选(即默认)参数包括：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)所述的算法；Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919(1992)的比较矩阵BLOSSUM62；缺口罚分：12；缺口长度罚分：14。用于多核苷酸序列比较的优选(即默认)参数包括：Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)所述的算法；比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0；缺口罚分：50；缺口长度罚分：3。用词“同源性”可替代用词“同一性”。
例如，具有与参考核苷酸序列(例如选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：5的参考核苷酸序列)具有至少95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸是指，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列大致相同，只是在参考核苷酸序列的每100个核苷酸中多核苷酸序列可以包含多达5个点突变。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸，可以在参考序列中删除或用其它核苷酸替代多达5％的核苷酸，或者可以在参考序列中插入多达参考序列核苷酸总数5％的量的核苷酸，或者参考序列中多达参考序列核苷酸总数5％的量的核苷酸可以是删除、插入和替代的组合。参考序列中的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或者这些末端位置之间的任何位置，它们或是以单个核苷酸散布于参考序列中，或是以一个或多个连续组散布于参考序列中。
相似的，例如，具有与参考氨基酸序列(例如选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的参考氨基酸序列)具有至少95％“同一性”的氨基酸序列的多肽是指，多肽的氨基酸序列与参考序列大致相同，只是在参考氨基酸序列的每100个氨基酸中多肽序列可以包含多达5个氨基酸改变。换句话说，为了获得具有与参考氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，可以在参考序列中删除或用其它氨基酸替代多达5％的氨基酸残基，或者可以在参考序列中插入多达参考序列氨基酸残基总数5％的量的氨基酸。参考序列中的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或者这些末端位置之间的任何位置，它们或是以单个氨基酸散布于参考序列中，或是以一个或多个连续组散布于参考序列中。
“同系物”是本领域用于指示与目的序列具有高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列的一般术语。如本文所述，这种相关性可以通过测定待比较序列间的同一性和/或相似性程度来量化。这个一般术语包括术语“直向进化同源物(ortholog)”，是指其它物种中功能与该多核苷酸或多肽等同的多核苷酸或多肽，以及“平行进化同源物(paralog)”，是指相同物种中的功能相似序列。因此，例如在人类中，在内皮素转化酶家族中，ECE-1是其它成员(如ECE-2)的平行进化同源物。
最近鉴定的金属蛋白酶IGS5的特异性抑制剂对该金属蛋白酶的药理学评价
基于本领域目前(Barker S.等人，Mol Pharmacol，2001，59：163-169)对ECE-1是否是唯一生理学相关的内皮素转化酶的怀疑，以及在ET-1的产生中一定涉及其它酶的结论，根据本发明，进行同源性克隆方案，以便调查迄今未知的金属蛋白酶在big-ET-1向ET-1转化中是否可能起作用，并且调查特异性抑制剂对最近鉴定的金属蛋白酶作用是否可能抑制该转化。在假定具有相似活性的这些酶应在其氨基酸序列方面具有相似性的情况下，检索用于DNA序列编码与NEP和ECE具有同源性的蛋白质的人类基因组，它们是neprilysin金属蛋白酶家族中两种最具特征的成员。这些努力使得发现了与NEP高度同源(54％同一性)的以及与ECE-1或多或少较低同源(37％同一性)的新的人类基因，该基因的多肽产物发现在许多人类组织中有丰富的表达，并命名为工作标题“IGS5”。在待审国际专利申请PCT/EP00/11532(尤其将其全部内容加入本文作为参考以进一步描述下面地IGS5给出的各个细节)中详细描述了ISG5的克隆、表达和基本生物特性。
为了表征和评价为了本发明目的的IGS5的药理学酶促性能，使用昆虫细胞系作为该表达系统产生人类IGS5蛋白质，并测定大量IGS5蛋白质的潜在底物。证实IGS5有效地切割big-ET-1、缓激肽和底物P，因此进一步证实这种新的蛋白质是具有广泛底物特异性的真正的金属蛋白酶，它是金属蛋白酶的常规特性并且已对NEP、ECE-1以及ACE报道了其特征。还应注意的是根据本发明的发现，经IGS5蛋白质水解big-ET-1出人意料地正确地形成ET-1，例如big-ET-1在氨基酸Trp21和Val22之间被正确地切割。
而且，根据本发明，使用标记过的荧光big-ET-1类似物第一次测定了金属蛋白酶抑制剂化合物抑制big-ET向ET-1转化的功效。这些结果汇总于试验部分的表9中。令人关注的是已知在体内抑制big-ET向ET-1转化的膦酰二肽，在本发明所用的生物化学测定中也高效地抑制IGS5，并且出人意料的是IGS5被膦酰二肽的抑制实际上大大高于ECE-1。相反，选择性NEP抑制剂thiorphan以及选择性ECE-1抑制剂SM-19712(4-氯-N-[[(4-氰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)氨基]羰基]苯磺酰胺、一钠盐；Umekawa K、Hasegawa H、Tsutsumi Y、SatoK、Matsumura Y、Ohashi N.，J Pharmacol 2000年9月；84(1)：7-15；Discovery Research Laboratories I，Research Center，SumitomoPharmaceuticals Co，Ltd，Osaka，Japan)不影响IGS5的活性(表9，参见试验部分)。
本发明的一个非常特定的方面是最重要且独特地发现证实大量表现为金属蛋白酶抑制剂的化合物能够抑制IGS5酶，即使在低的毫微摩尔浓度下，例如在相当于IC50值是约1-10nM的浓度下，并且因此证实也特异性地抑制制药上特别关注的最近鉴定的IGS5金属蛋白酶。
因此，通常本发明包括对以下酶具有联合的、特别是同时的抑制活性的化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途：
a)中性肽链内切酶(NEP)和
b)金属蛋白酶IGS5，它是一种包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽；
用于制备治疗(患有可以通过联合的、特别是同时的抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的)哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
在一特定方面，本发明涉及具有联合的NEP/IGS5抑制活性的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗(患有big-ET-1水平升高并且可以通过联合的、特别是同时的抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的)哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
在另一特定方面，本发明涉及具有联合的NEP/IGS5抑制活性的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗(患有ET-1显著上调并且可以通过联合的、特别是同时的抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的)哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
本发明含义下的“联合的、或者特别是同时的抑制活性”是指通过同时阻断两种酶系统NEP和IGS5来至少双重抑制NEP和IGS5，并潜在地另外同时抑制第三个系统，例如三重抑制酶系统NEP、IGS5和例如ECE-1。根据本发明的结果，可以预料到，联合或同时抑制这两种酶系统NEP和IGS5，比通过不同化合物单独地阻断任一组或者仅阻断所述单个酶中的每一种更有效。因此，本发明提供了一种新的治疗观念，建议使用联合、特别是同时抑制NEP和IGS5来治疗和/或预防一系列可以通过联合、特别是同时抑制NEP和IGS5减轻或预防的疾病或症状。在这一点上，本发明还提供了表现为联合或同时抑制NEP和IGS5二者的化合物，由此提供了一种具有增加的治疗价值的化合物用于治疗和/或预防相关疾病或症状的新的和预期的用途。
联合、特别是同时的作用机理得到特别的医药关注，在于其治疗益处可以预期比单独地调节每一单一的系统更显著。
例如，就内皮素-转化酶抑制剂而言，在B.-M.Lffler(J.Cardiovasc.Pharmacol.(2000)，35(增刊2)，S79-S82)中报道了进一步阐明该原理的目前状态和前景及相关益处。根据Lffler最近研究使得发现有效的选择性或混合的内皮素-转化酶(ECE)、ECE/中性肽链内切酶(NEP)和ECE/NEP/血管紧张素-转化酶(ACE)抑制剂。还报道了越来越多的证据证实，内皮素(ET)、肾素-血管紧张素和NEP系统用于调节心脏血管动态平衡的作用是通过复杂的调节网络连接的。因此Lffler估计最近获得的选择性和混合的ECE-1抑制剂显示多种心血管系统的联合抑制是否好于选择性抑制将是未来研究的挑战性任务。在这一点上，本发明提供了一优异的进步，这是由于第一次联合或同时抑制至少NEP和IGS5酶系统以贡献于现有技术。
在此特定方面，本发明涉及一种化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备用于治疗和/或预防哺乳动物、优选人的高血压、包括继发形式的高血压如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌疼痛的药物(药用组合物)。特别是，在本发明中，优选将具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的化合物治疗和/或预防所述疾病或症状，用于患有可以用联合、特别是同时抑制NEP和IGS5来缓和或预防的疾病或症状或对该疾病或症状易感的患者亚群。
而且，另外可以有益地将本发明中显示联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的化合物与其它单个和/或联合金属蛋白酶抑制剂(不同于NEP/IGS5联合抑制剂)联合。可以与具有NEP/IGS5联合抑制活性的化合物联合使用的这些其它金属蛋白酶抑制剂例如有ACE抑制剂，如卡托普利、依那拉普利尔、赖诺普利、福辛普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利；以及，选择性ECE抑制剂，如化合物SM-19712(Sumitomo，见上面)；选择性NEP抑制剂，如thiorphan；双重NEP/ECE抑制剂，例如化合物CGS-35066(De Lombart等人，J.Med.Chem.2000年2月10日；43(3)：488-504)；或者这些金属蛋白酶的混合抑制剂，如omapatrilat或sampatrilat。通过这类联合治疗和/或预防，具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的化合物的治疗价值仍然可以进一步提高，特别是针对上面提到的疾病和/或症状。因此另一方面本发明还涉及下面进一步描述的联合治疗和/或联合预防。
特别是，按照本发明，发现最初为中性肽链内切酶抑制剂(NEP-抑制剂)的化合物也非常适合抑制药学上关注且最近鉴定的IGS5金属蛋白酶，甚至以所述低的毫微摩尔浓度，因此这些化合物证实具有联合作用模式，即例如联合或同时的选择性NEP/IGS5抑制活性谱的金属蛋白酶抑制剂。这些化合物可以具有式I的结构：
其中
A代表式II或III的基团
在式II中
R1a代表苯基-低级烷基，在其苯环上可以任选取代有低级烷基、低级烷氧基或卤素，或者代表萘基-低级烷基，
R2a是指氢或者是形成生物不稳定的酯的基团；和
在式III中
R1b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团，
R2b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团；
并且其中
R3是指氢或者是形成生物不稳定的羧酸酯的基团；
和式I的酸的药用可接受的盐或溶剂化物。
其中式I的化合物中的取代基是或者含有低级烷基或烷氧基，它们可以是直链或支链并且特别是含有1-4个，优选1-2个碳原子，并优选甲基或甲氧基。其中这些取代基含有卤素，特别合适的是氟、氯或溴，优选氟或氯。
在自由基R1a中，低级亚烷基链可以含有1-4个，优选1-2个碳原子。R1a特别代表一任选经取代的苯乙基，其中苯乙基可选地被卤素、低级烷氧基或低级烷基取代一次或多次，或者代表萘乙基。
式Ia的化合物任选是酯化的二羧酸衍生物。
形成生物不稳定的羧酸酯的合适基团R3是在体内的生理条件下可以切割以释放其羧酸的基团。例如，适用于此目的的基团是低级烷基、苯基或苯基-低级烷基(在苯环上任选一元取代或多元取代有低级烷基或低级烷氧基或者与两个相邻碳原子相连的低级亚烷基链)、二噁烷基甲基(在二噁烷环上任选取代有低级烷基或C2-C6-烷酰氧基甲基(在该氧基甲基上任选取代有低级烷基))。如果形成生物不稳定的酯的基团R3是或者含有低级烷基，那么它可以是支化或者非支化的并且可以含有1-4个碳原子。如果形成生物不稳定的酯的该基团是一任选经取代的苯基-低级烷基，那么它可以含有具有1-3个，优选1个碳原子的亚烷基链，优选是苯甲基。如果该苯环取代有低级亚烷基链，那么它可以含有3-4个，优选3个碳原子。如果R3是一任选经取代的烷酰氧基甲基，那么它可以含有一优选支化且具有2-6个，优选3-5个碳原子的烷酰氧基，并且例如可以是新戊酰氧基甲基自由基(＝叔丁基羰基-氧基甲基自由基)。
形成生物不稳定的羧酸酯的合适基团R2a是在体内的生理条件下可以切割以释放该羧酸的基团，并且相当于上面基团R3所列举的基团。
适宜作为形成生物不稳定的膦酸酯的基团的基团R1b和R2b是在体内的生理条件下可以除去以释放相应的膦酸官能团的基团。例如，适用于该目的的基团是低级烷基、C2-C6-烷酰氧基甲基(在该氧基甲基上任选取代有低级烷基)或者苯基或苯基-低级烷基(该苯环任选一元取代或多元取代有低级烷基、低级烷氧基或取代有与两个相邻碳原子相连的低级亚烷基链)。如果形成生物不稳定的酯的基团R1b和/或R2b是或者含有低级烷基，那么它可以是支化或非支化的并且可以含有1-4个碳原子。如果R1b和/或R2b是一任选经取代的烷酰氧基甲基，那么它可以含有一优选支化且具有2-6个，优选3-5个碳原子的烷酰氧，并且可以是例如新戊酰氧基甲基自由基(＝叔丁基羰基氧基甲基自由基)。如果R1b和/或R2b是一任选经取代的苯基-低级烷基，那么它可以含有一具有1-3个，优选1个碳原子的亚烷基链。如果该苯环取代有低级亚烷基链，那么它可以含有3-4个，特别是3个碳原子并且该经取代的苯环特别是二氢茚基。
式I的酸的合适的生理可接受的盐包括其碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，例如钠盐、钾盐或钙盐或者与生理上可接受的、药理上中性的有机胺类如二乙胺或叔丁基胺、或者苯基-低级烷基胺类如α-甲基苯甲基胺的盐。
式I的化合物含有至少一个手性碳原子，即在苯并氮杂(benzazepine)结构的3-位上带有酰胺侧链的碳原子。因此这些化合物可以两种光学活性的立体异构形式或作为外消旋体存在。本发明既包括式I的外消旋混合物，又包括式I的纯的异构化合物。如果式I的化合物中基团A代表式II，那么式I的化合物含有两个手性碳原子，即位于该环结构的3位并且带有酰胺侧链的碳原子，以及带有自由基R1a的酰胺侧链的碳原子。式I的这些化合物，其中基团A代表式II，因此可以几种光学活性的立体异构形式或作为外消旋体存在。根据本发明，这些外消旋混合物和纯的异构化合物都可以使用。如果在式I的化合物中基团A代表式III，那么R1b和R2b不是氢并且在每种情况下具有不同的含义，膦酸基团的磷原子也可以是手性的。本发明还涉及因手性磷原子形成的式I的异构体混合物和纯的异构化合物，其中基团A代表式III。
根据本发明，式I的化合物、其盐和生物不稳定的酯可以本领域本身已知的方式获得(参见下面)。
在本发明的优选实施方式中，发现最初NEP抑制化合物，例如具有式Ia的结构的苯并氮杂酮-N-乙酸衍生物，或者例如式Ib结构的膦酰基取代的苯并氮杂酮衍生物。
具有式Ia结构的化合物已经从US 5,677,297以NEP-抑制化合物得知，所述化合物可用于治疗上面所述的疾病或症状。式Ia的化合物具有以下结构
Figure A0281015400261
其中
R1a代表苯基-低级烷基(在其苯环上任选取代有低级烷基、低级烷氧基或卤素)或者萘基-低级烷基，
R2a是指氢或者形成生物不稳定的酯的基团，和
R3是指氢或者形成生物不稳定的酯的基团，
和式I的生理可接受的酸的盐。
当式Ia的化合物中的取代基是或者含有低级烷基或烷氧基时，它们是直链或支链并且特别是含有1-4个，优选1-2个碳原子，并且优选是甲基或甲氧基。当这些取代基含有卤素时，特别合适的是氟、氯或溴，优选氟或氯。
在自由基R1a中，低级亚烷基链可以含有1-4个，优选1-2个碳原子。R1a尤其是一种任选取代的苯乙基(它可以任选取代有一个或多个卤素、低级烷氧基或低级烷基)，或者是萘基乙基。
式Ia的化合物是任选经酯化的二羧酸衍生物。根据给药方式，优选生物不稳定的一酯，特别是R2a是形成生物不稳定的酯的基团并且R3是氢的化合物，或者是二羧酸，后者特别适合静脉注射给药。
在式Ia的化合物中形成生物不稳定的酯的合适的R2a和R3基团是低级烷基、苯基或苯基-低级烷基(在其苯环中任选取代有低级烷基或者是与两个相邻碳原子相连的低级亚烷基链)、二噁烷基甲基(在其二噁烷环中任选取代有低级烷基、或者C2-C6-烷酰氧基甲基(在其氧基甲基上任选取代有低级烷基))。当形成生物不稳定的酯的R2a或R3基团是低级烷基时，它可以是优选非支化的具有1-4个，优选2个碳原子的烷基。当形成生物不稳定的酯的基团是一任选经取代的苯基-低级烷基时，其亚烷基链可以含有1-3个，优选1个碳原子。当苯环取代有低级亚烷基链时，它可以含有3-4个，特别是3个碳原子。苯基、苄基或二氢茚基特别合适作为含苯基的取代基R2a和/或R3。当R2a和/或R3是一任选经取代的烷酰氧基甲基时，其烷酰氧基可以含有2-6个，优选3-5个碳原子，并且优选是支化的，例如可以是新戊酰氧基甲基自由基(＝叔丁基羰基-氧基甲基自由基)。
式I的合适的生理可接受的二羧酸盐或单酯包括其碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，例如钠盐或钙盐或者与生理可接受的、药用中性有机胺类如二乙胺或叔丁基胺的盐。
式Ia的化合物含有两个手性碳原子，即位于该环结构的3位并且带有酰胺侧链的碳原子，以及带有自由基R1a的酰胺侧链的碳原子。因此这些化合物可以几种光学活性的立体异构形式或作为外消旋体存在。根据本发明，式Ia的这些外消旋混合物和纯的异构化合物都可以使用。
根据本发明，式Ia的化合物及其盐和生物不稳定的酯可以本领域中本身已知的方式获得，例如US 5,677,297中所述的。
式Ia的优选化合物，例如其中R2和/或R3是形成生物不稳定的酯的基团，及其生理可接受的盐。形成生物不稳定的酯的基团可以是低级烷基，或者是苯基或苯基-低级烷基，特别是苯基、苄基或二氢茚基，在其苯环上任选取代有低级烷基或取代有与两个相邻碳原子相连的低级亚烷基链，或者是二噁烷基甲基，特别是(2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4-基)甲基(在其二噁烷环内上任选取代有低级烷基)、或者是C2-C6-烷酰氧基甲基(在其氧基甲基上任选取代有低级烷基)。特别优选R2是形成生物不稳定的酯的基团并且R3是氢的式Ia的化合物。
式Ia的化合物的特别优选的实例是例如
(3S，2′R)-3-{1-[2′-羧基-4′-苯基丁基]-环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(化合物Ia-1)；
(3S，2′R)-3-{1-[2′-(乙氧基羰基)-4′-苯基丁基]-环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(化合物Ia-2)；
(3S，2′R)-3-{1-[2′-(乙氧基羰基)-4′-萘基丁基]-环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(化合物Ia-3)；
及其生理可接受的酸的盐或溶剂化物。
式Ia化合物的进一步特定的实例是例如
3-{1-[2′-(乙氧基羰基)-4′-苯基丁基]-环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸-叔丁酯，(化合物Ia-4)；
3-{1-[2′-(乙氧基羰基)-4′-苯基丁基]环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(化合物Ia-5)；
(3S，2′R)-3-{1-[2′-乙氧基羰基]-4′-苯基丁基]环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸-叔丁酯，(化合物Ia-6)；
(3S，2′R)-3-{1-[2′-(羧基-4′-苯基丁基)环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(化合物Ia-7)；
3-{1-[2′-(叔丁氧基羰基)-4′-苯基丁基]环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸-叔丁酯，(化合物Ia-8)；
3-[1-(2′-羧基-4′-苯基丁基)环戊烷-1-羰基氨基]-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(化合物Ia-9)；
3-{1-[2′-(叔丁氧基羰基)-4′-苯基丁基]环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸-苄酯，(化合物Ia-10)；
3-[1-(2′-羧基-4′-苯基丁基)环戊烷-1-羰基氨基]-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸-苄酯，(化合物Ia-11)；
3-{1-[2′-(叔丁基羰基氧基甲氧基羰基)-4′-苯基丁基]环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸-苄酯，(化合物Ia-12)；
3-{1-[2′-(新戊酰氧基甲氧基羰基)-4′-苯基丁基]-环戊烷-1-羰基氨基}-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(化合物Ia-13)；
及其生理可接受的酸的盐或溶剂化物。
式Ib的结构的化合物已从US 5,952,327以NEP-抑制化合物得知，另外还略微知道是内皮素转化酶抑制剂(ECE-抑制剂)，所述化合物可用于治疗上述的疾病或症状。因此，本发明还涉及式Ib的化合物
Figure A0281015400291
其中
R1b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团，
R2b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团，和
R3是氢或者是形成生物不稳定的羧酸酯的基团
和式Ib的生理可接受的酸的盐。
式Ib的化合物是包括任选被形成生物不稳定的酯的基团酯化的羧酸和膦酸基团的酸衍生物。式Ib的生物不稳定的酯是自由酸的前药。根据给药方式，优选生物不稳定的酯或者这些酸，后者特别适合静脉注射给药。
合适用作形成生物不稳定的膦酸酯的基团的基团R1b和R2b是在体内的生理条件下可以除去以释放相应的膦酸官能团的基团。例如，适用于该目的的基团是低级烷基、C2-C6-烷酰氧基甲基(在该氧基甲基上任选取代有低级烷基)或者苯基或苯基-低级烷基(该苯环任选一元取代或多元取代有低级烷基、低级烷氧基或取代有与两个相邻碳原子相连的低级亚烷基链)。如果形成生物不稳定的酯的基团R1b和/或R2b是或者含有低级烷基，那么它可以是支化或非支化的并且可以含有1-4个碳原子。如果R1b和/或R2b是一任选经取代的烷酰氧基甲基，那么它可以含有一优选支化且具有2-6个，优选3-5个碳原子的烷酰氧，并且可以是例如新戊酰氧基甲基自由基(＝叔丁基羰基氧基甲基自由基)。如果R1b和/或R2b是一任选经取代的苯基-低级烷基，那么它可以含有一具有1-3个，优选1个碳原子的亚烷基链。如果该苯环取代有低级亚烷基链，那么它可以含有3-4个，特别是3个碳原子并且该经取代的苯环特别是二氢茚基。
式Ib的化合物中用于形成生物不稳定的羧酸酯的合适的基团R3是在体内的生理条件下可以除去以释放羧酸的基团。例如，适用于该目的的基团是低级烷基、苯基或苯基-低级烷基(该苯环任选一元取代或多元取代有低级烷基或低级烷氧基或者取代有与两个相邻碳原子相连的低级亚烷基链、二噁烷基甲基(在其二噁烷环中任选取代有低级烷基、或者C2-C6-烷酰氧基甲基(在其氧基甲基上任选取代有低级烷基)。当形成生物不稳定的酯的基团R3是或者含有低级烷基时，它可以是支化或非支化的并且可以含有1-4个碳原子。当形成生物不稳定的酯的基团是一任选经取代的苯基-低级烷基时，它可以含有1-3个，优选1个碳原子的亚烷基链，并优选苄基。当苯环取代有低级亚烷基链时，它可以含有3-4个，特别是3个碳原子。当R3是一任选经取代的烷酰氧基甲基时，它可以含有2-6个，优选3-5个碳原子，并且优选是支化的烷酰氧基，并且例如可以是新戊酰氧基甲基自由基。
根据本发明，式Ib的化合物及其盐和生物不稳定的酯可以本领域现有技术已知的方式获得。
式Ib的酸的合适的生理可接受的盐在每一情况下是其碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，例如其钠盐、钾盐或钙盐或者与生理上可接受的、药理上中性的有机胺类如二乙胺或叔丁基胺、或者苯基-低级烷基胺类如α-甲基苯甲基胺的盐。
式Ib的化合物含有一个手性碳原子，即在苯并氮杂结构的3-位上带有酰胺侧链的碳原子。因此这些化合物可以两种光学活性的立体异构形式或作为外消旋体存在。本发明既包括式I的外消旋混合物，又包括式I的纯的异构化合物。如果式Ib的化合物中R1b和R2b不是氢并且在每一情况下具有不同的含义，那么膦酸基团的磷原子也可以是手性的。本发明还涉及因手性磷原子形成的式I的异构体混合物和异构纯的化合物。
优选的式Ib化合物是R3代表氢或低级烷基，例如C1-C4-烷基，特别是C1-C2-烷基的那些，及式Ib的生理可接受的酸的盐。
式Ib的化合物的具体实例是例如
(3S)-3-(1-二苄基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸苄酯，(＝化合物Ib-1)；
(3S)-3-(1-膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(＝化合物Ib-2)；
(3S)-3-(1-苄基乙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸苄酯，(＝化合物Ib-3)；
(3S)-3-(1-苄基乙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸乙酯，(＝化合物Ib-4)；
(3S)-3-(1-乙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸乙酯，(＝化合物Ib-5)；
(3S)-3-[1-(新戊酰氧基甲基乙基膦酰基甲基)-环戊烷-1-羰基氨基]-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-苯并氮杂-1-乙酸乙酯，(＝化合物Ib-6)；
(3S)-3-[1-(5-二氢茚基乙基膦酰基甲基)-环戊烷-1-羰基氨基]-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-苯并氮杂-1-乙酸乙酯，(＝化合物Ib-7)；
(3S)-3-(1-苄基乙基膦酰基甲基-环戊烷]-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸叔丁酯，(＝化合物Ib-8)；
(3S)-3-(1-乙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-苯并氮杂-1-乙酸苄酯，(＝化合物Ib-9)；
(3S)-3-(1-二乙基膦酰基甲基-1-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-苯并氮杂-1-乙酸苄酯，(＝化合物Ib-10)；
(3S)-3-(1-二乙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸，(＝化合物Ib-11)；
(3S)-3-(1-二乙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸乙酯，(＝化合物Ib-12)；
(3S)-3-(1-膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸乙酯，(＝化合物Ib-13)；
(3S)-3-(1-膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸苄酯，(＝化合物Ib-14)；
(3S)-3-(1-二异丙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸苄酯，(＝化合物Ib-15)；
(3S)-3-(1-苄基异丙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸乙酯，(＝化合物Ib-16)；
(3S)-3-(1-乙基膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸叔丁酯，(＝化合物Ib-17)；
(3S)-3-[1-(新戊酰氧基甲基-乙基膦酰基甲基)-环戊烷-1-羰基氨基]-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-苯并氮杂-1-乙酸叔丁酯，(＝化合物Ib-18)；
(3S)-3-(1-膦酰基甲基-环戊烷-1-羰基氨基)-2，3，4，5-四氢-2-氧代-1H-1-苯并氮杂-1-乙酸叔丁酯，(＝化合物Ib-19)；
及其生理可接受的酸的盐。
式Ib化合物的特别优选的实例是例如化合物Ib-2、化合物Ib-8、化合物Ib-18或化合物Ib-19，最优选化合物Ib-8，及其生理可接受的酸的盐。
本发明首次提供了以下证据，除了本领域以前已知的ECE-1金属蛋白酶之外，IGS5型的内皮素转化酶也称得上是一种金属蛋白酶，特别是在将big-ET切割成ET-1中涉及的。因此，本发明的这些发现在提高的治疗观念上给治疗和/或预防受IGS5介导切割big-ET转变成ET-1的影响和/或暗示的各种疾病提供新的且关注的前景，正如本发明建议鉴定和使用特异性地抑制IGS5型金属蛋白酶的治疗活性的化合物，而不是寻找和使用与以前已知的ECE-1结合的化合物。
需要强调的是，具有前面提到的式Ia或式Ib的结构的化合物最初在本领域是以其NEP-抑制活性进行选择。因此，出人意料地发现本发明的这些化合物在体外对IGS5活性的非常高的效能与所述化合物实质性减轻big-ET在麻醉大鼠体内增加血压的效果的能力是并行的。
结论是，本发明的研究使得发现了抑制新的ECE/NEP-状金属蛋白酶，其有效地切割big-ET，并且不仅对已知的内皮素转化酶抑制剂膦酰二肽敏感，而且出人意料地对许多确定的具有式I结构，优选具有式Ia或式Ib结构的金属蛋白酶抑制剂敏感。因此可以想到，IGS5可以在ET-1的生成中起作用，并且具有例如式I，优选式Ia或式Ib的结构的化合物可以通过抑制所述最近鉴定的IGS5金属蛋白酶在体内发挥其效果。
因此，在本发明的上下文中已开始用表现联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的化合物进行进一步研究，以阐明组织分布、生理功能和IGS5在各种疾病，优选在高血压、肾病和心力衰竭中的病理生理学作用。
在包括13个健康自愿者的双盲安慰对比的临床研究中，化合物Ia-2以剂量依赖地抑制big-ET-诱导的血压反应并表现出明显的剂量相关的ANP水平的增加，以此指示其NEP-抑制性能。ET-1水平不象从选择性NEP抑制剂所预期的那样增加，而是在化合物Ia-2组中，与安慰组相比，big-ET水平以剂量依赖地增加，因此指示还抑制了big-ET分解。为了证实临床功效和化合物Ia-2在人体内的安全性，在健康自愿者内进行6个临床试验，并在患者中进行2个证实功效的试验：一个是在患高血压的患者(N＝191)中的随机、安慰对照的双盲试验，一个是在患充血性心力衰竭的患者(N＝29)中的开放、基线对照的记录线试验。结果显示在口服化合物Ia2之后在自愿者和患者中都显著增加并持续的ANP及其第二信使cGMP的血浆浓度来证实中性肽链内切酶(NEP)抑制，使得患充血性心力衰竭的患者在给药化合物Ia-2之后显示在log化合物Ia-1的血浆浓度(化合物Ia-2的活性代谢物)与big-ET的血浆水平之间显著成正比关系(p＜0.001)。事实上在给药化合物Ia-2之后big-ET的血浆水平从基线趋于增加(200mg：4.9-6.5fmol/ml(+32.6％)；400mg：2.3-3.5fmol/ml(+56％))，这样支持了口服化合物Ia-2防止big-ET切割的活性的观念。最重要的是，在最近完成的4-周研究(N＝191)中已证实，化合物Ia-2在患WHO I-II级高血压的患者中显示显著且临床相关的抗高血压活性。在故意去治疗的患者群(ITT)中，以研究的最高剂量(200mg bid)，正式舒张期血压相对于安慰组降低-6.9mmHg(治疗之后的最后值；p＜0.001)，收缩期血压相对于安慰组降低-9.2mmHg(治疗之后的最后值；p＝0.003)。由于已证实纯NEP抑制剂使ET-1增加并因此使血压上升，而不是降低，因此这一观察尤为重要。
计划进一步研究以调查化合物Ia2在患有充血性心力衰竭的患者中对心脏血液动力学参数的剂量反应关系，以及每日一次给药于患高血压的患者之后的抗高血压效果的反应进程。
本发明的IGS5金属蛋白酶
在本发明的上下文中参考IGS5多肽(或IGS5酶或IGS5金属蛋白酶，例如分别参考IGS5PROT、IGS5PROT1或IGS5PROT2)，特别是人类IGS5多肽(或人类IGS5酶)。这些IGS5多肽可以包括多肽、特别是人类物种的多肽，所述多肽含氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性，优选至少80％和特别是至少85％同一性、更优选至少90％同一性、仍更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％同一性。所述多肽包括那些包含一个与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4 SEQ和IDNO：6之一的氨基酸序列同一的IGS5多肽。
这些多肽也包括这样的IGS5多肽、特别是人类IGS5多肽，它们所具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4 SEQ和IDNO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性，优选至少80％和特别是至少85％同一性、更优选至少90％同一性、仍更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％同一性。这些多肽包括与选自SEQ ID NO：2、of SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列同一的IGS5多肽。
另外，本发明的多肽包括分离的IGS5多肽，它们包括在SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4 SEQ和ID NO：6之一中含有的序列。
本发明上下文中的IGS5多肽是neprilysin金属蛋白酶家族的成员，特别是它们是人类物种多肽。它们受到关注是因为已经鉴定了几种机能障碍、紊乱或疾病，其中最近鉴定的金属蛋白酶在这些疾病的病理学中担当重要角色。
因此，关于本发明的IGS5多肽，发现它们可能涉及生物学活性多肽的代谢。具体地说，发现这些IGS5多肽是可能作用于多种血管活性肽的金属蛋白酶类酶。现有技术已知的血管活性肽包括例如心房钠尿肽(ANP)、缓激肽、big-内皮素(big-ET-1)、内皮素(ET-1)、物质P和血管紧张素-1，而且发现IGS5胞外结构域是一种新型人类金属蛋白酶，它例如在体外有效水解多种所述血管活性肽，特别是big-ET-1、缓激肽和物质P。
这些IGS5金属蛋白酶类酶可能受到参考化合物的抑制，所述参考化合物用于确定对具有ECE/NEP特征的酶的抑制特性，例如受到诸如膦酰二肽等化合物的抑制。但是没有观察到选择性抑制NEP的参考化合物对IGS5具有抑制作用，例如IGS5不受化合物诸如thiorphan的抑制，或者不受选择性抑制ECE的参考化合物的抑制，例如没有观察到化合物诸如SM-19712(Sumitomo，见上面)对IGS5具有抑制作用。
可以观察到在较高浓度下只有抑制NEP/ECE的参考化合物对IGS5有抑制作用，例如一个实例是NEP/ECE抑制剂CGS-35066(DeLombart等人，见上面)。这些参考化合物对本发明IGS5金属蛋白酶类酶的抑制数据描述于下文的试验部分。
可以任何合适方式制备本发明的多肽。这些多肽包括分离的天然存在的多肽、重组生产的多肽、合成生产的多肽、或由这些方法联合产生的多肽。用于制备这些多肽的方法在本领域是众所周知的。因此，在一个实施例中该IGS5金属蛋白酶可以通过待审国际专利申请PCT/EP 00/11532中具体所述的方法产生，将该文献全文加入本文作为参考，特别是关于人类IGS5基因的同源性克隆和相应的人类IGS5蛋白质的表达。
也可以通过标准克隆和筛选技术，使用表达序列标签(EST)分析，由衍生自人睾丸组织细胞mRNA的cDNA文库获得编码所述IGS5金属蛋白酶的IGS5多核苷酸(Adams，M.D.等人，Science(1991)252：1651-1656；Adams，M.D.等人，Nature，(1992)355：632-634；Adams，M.D.等人，Nature(1995)377见上面：3-174)。还可以由天然来源诸如基因组DNA文库获得IGS5多核苷酸，或者可以使用众所周知的商品化技术进行合成(例如F.M.Ausubel等人，2000，《Current Protocols inMolecular Biology》(分子生物学现行方案))。
在将IGS5多核苷酸用于IGS5多肽的重组生产时，该多核苷酸自身可包含成熟多肽的编码序列；或者在读码框中包含成熟多肽的编码序列具有其它编码序列，诸如编码前导序列或分泌序列、前蛋白序列、蛋白原序列、前蛋白原序列、或其它融合肽部分的序列。例如，可编码有助于纯化融合多肽的标记序列。例如，该标记序列可以优选是六组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen公司)中提供的，且描述在Gentz等人，Proc Natl Acad.Sci.USA(1989)86：821-824，或者是HA标签。该多核苷酸还可以包含5′和3′非编码序列，诸如转录但不翻译的序列、剪接和聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和稳定mRNA的序列。与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5之一含有的核苷酸序列同一或足够同一的IGS5多核苷酸，可作为cDNA和基因组DNA的杂交探针或者作为或者作为核酸扩增反应(PCR)的引物，用于分离编码IGS5多肽的全长cDNA和基因组克隆，和用于分离与SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5之一具有高度序列相似性的其它基因(包括编码来自人类来源的平行进化同源物的基因和来自非人物种的直向进化同源物和平行进化同源物的基因)的cDNA和基因组克隆。通常，这些核苷酸序列与参照物至少70％同一，优选至少80％和特别是至少85％同一，更优选至少90％同一，最优选至少95％同一。探针或引物通常将包含至少15个核苷酸，优选至少30个核苷酸，而且可以具有至少50个核苷酸。特别优选的探针将具有30-50个核苷酸。特别优选的引物将具有20-25个核苷酸。
可以通过包括下列步骤的方法来获得编码IGS5多肽(特别是人类IGS5多肽)的IGS5多核苷酸：在严谨杂交条件下用具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5之一的序列或其片段的标记的探针筛选合适文库；并分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。这些杂交技术对熟练技术人员是众所周知的。优选的严谨杂交条件包括在包含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt氏液、10％硫酸葡聚糖(w/v)和20μg/ml变性剪碎鲑鱼精DNA的溶液中于42℃保温过夜，随后用0.1×SSC于大约65℃清洗滤膜。因此，IGS5多核苷酸可以通过在严谨杂交条件下用具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5之一的序列或其片段的标记探针筛选合适文库而获得的。
熟练技术人员将领会，在许多情况下，经分离的cDNA序列将是不完整的，即编码该多肽的区域在cDNA的5′端是切短的。这是逆转录酶具有固定低“持续合成能力”(对酶在聚合反应过程中保持附着在模板上的能力的量度)，不能在第一条cDNA链合成过程中完成mRNA模板的DNA拷贝导致的。本领域熟练技术人员众所周知几种可以获得的方法可用于获得全长cDNA或延伸短cDNA，例如基于cDNA末端快速扩增(RACE)的方法(参见例如，Frohman等人，PNASUSA 85，8998-9002，1988)。这种技术的最新修改，例如MarathonTM技术(Clontech Laboratories公司)，显著简化对较长cDNA的搜索。在MarathonTM技术中，由提取自选定组织的mRNA制备cDNA，并将“衔接头(adaptor)”序列连接到每个末端。然后使用基因特异的和衔接头特异的寡核苷酸引物组合进行核酸扩增反应(PCR)以扩增cDNA中“缺失的”5′末端。然后使用“嵌套”引物重复该PCR反应，其中“嵌套”引物即为设计成在扩增产物内退火的引物(通常是在衔接头序列3′端退火的衔接头特异引物，和在已知基因序列5′端退火的基因特异引物)。然后通过DNA测序分析此反应的产物，并通过将产物直接连接现有cDNA以产生完整序列，或者通过将新的序列信息用于设计5′端引物而进行单独的全长PCR，由此构建全长cDNA。
可以通过本领域众所周知的过程由经遗传工程改造的包含表达系统的宿主细胞制备重组IGS5多肽，该表达系统包含一个或多个IGS5多核苷酸。用这些表达系统遗传改造的宿主细胞可以通过重组技术生产IGS5多肽。使用由IGS5 DNA构建物衍生的RNA，无细胞翻译系统也可用于生产这些IGS5蛋白质。可以通过许多标准实验室手册(诸如Davis等人，《Basic Methods in Molecular Biology》(分子生物学基本方法)(1986)和Sambrook等人，《Molecular.Cloning：A LaboratoryManual》(分子克隆：实验室手册)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989))中描述的方法，将IGS5多核苷酸导入宿主细胞。这些方法包括例如磷酸钙转染、由DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、显微注射、由阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、刮擦装载(scrapeloading)、轰击导入或感染。合适宿主的代表性实例包括细菌细胞，诸如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞和曲霉细胞；昆虫细胞，诸如果蝇S2和SpodopteraSf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。
可以使用很多种表达系统，例如由染色体、游离基因和病毒衍生的系统，如由细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母游离基因、插入元件、酵母染色体元件、病毒诸如杆状病毒、乳多空病毒(诸如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、和逆转录病毒衍生的载体，以及由上述组合衍生的载体，诸如由质粒和噬菌体遗传元件衍生的载体，诸如粘粒和噬菌粒。病毒系统可以包含调控以及引起表达的控制区。一般来说，可使用能够在宿主中保持、增殖或表达多核苷酸产生多肽的任何系统或载体。可以通过众所周知的常规技术，诸如Sambrook等人，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》(见上面)中所述，将合适的核苷酸序列插入表达系统。为了使翻译产生的蛋白质分泌进入内质网内腔、周质空间或胞外环境，可将合适的分泌信号掺入目的多肽。这些信号对于多肽而言可以是内源的，或者是外源的(即衍生自不同物种)。
如果将待表达的多肽用于筛选试验，通常有可能在细胞表面产生IGS5多肽或者是以可溶性蛋白质的形式表达。如果将IGS5多肽分泌进入培养基，则可回收培养基以回收并纯化IGS5多肽。如果生成于胞内，则在回收该IGS5多肽之前首先必需裂解细胞。如果IGS5多肽结合于细胞表面(膜结合型多肽)，那么通常制备膜部分，以累积膜结合的IGS5多肽。可通过众所周知的方法由重组细胞培养物回收并纯化IGS5多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。最优选的是，采用高效液相色谱来进行纯化。当多肽在胞内合成、分离和/或纯化过程中发生变性时，可采用众所周知的用于蛋白质重新折叠的技术来重新产生有活性的构象。
分离的IGS5多核苷酸，特别是分离的人类IGS5多核苷酸，它们可用于产生IGS5多肽，所述多核苷酸所含核苷酸序列与编码选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的多肽之一的核苷酸序列在整个编码区内具有至少70％同一性，优选至少80％和特别是至少85％同一性、更优选至少90％同一性、仍更优选至少95％同一性。在这一点上，高度优选具有至少97％同一性的多核苷酸，更高度优选具有至少98-99％同一性和至少99％的多核苷酸，特别是最高度优选具有99.9％同一性的多核苷酸。这些可用于产生IGS5多肽的分离的，特别是人类的IGS5多核苷酸包括在全长内与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：5之一的核苷酸序列具有至少70％同一性，优选至少80％和特别是至少85％同一性、更优选至少90％同一性、仍更优选至少95％同一性的核苷酸序列。在这一点上，高度优选包含或具有与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5之一的核苷酸序列具有至少97％同一性的核苷酸序列的IGS5多核苷酸，更高度优选具有至少98-99％同一性的多核苷酸，最高度优选至少99％、特别是99.9％同一性的多核苷酸。SEQ ID NO：1的IGS5多核苷酸序列(称为“IGS5DNA”)示于表1，代表智人(Homo sapiens)的cDNA序列，长度为2076个核苷酸，所含多肽编码序列(第1-2073位核苷酸)编码691个氨基酸的多肽，即SEQ ID NO：2的多肽(称为“IGS5PROT”)，它示于表2。SEQ ID NO：3的核苷酸序列(称为“IGS5DNA1”)示于表3，代表智人的cDNA序列，长度为2340个核苷酸(包含终止密码子标签)，所含多肽编码序列(第1-2337位核苷酸)编码779个氨基酸的多肽，即SEQ ID NO：4的多肽(称为“IGS5PROT1”)，它示于表4。SEQ ID NO：5的核苷酸序列(称为“IGS5DNA2”)示于表5，代表智人的cDNA序列，长度为2262个核苷酸(包含终止密码子标签)，所含多肽编码序列(第1-2259位核苷酸)编码753个氨基酸的多肽，即SEQID NO：6的多肽(称为“IGS5PROT2”)，它示于表6。
具有联合或同时的选择性NEP/IGS5-抑制活性的化合物作为新的治疗观念
本发明的发现已显示，IGS5金属蛋白酶，例如还与至少一种其它的金属蛋白酶诸如特别是NEP以及另外任选的ECE和/或ACE，负责一种或多种与本文前面提到的疾病有关的生物学功能。因此，在其最广大方面，本发明通常提供了治疗本文前面所述的疾病的新的治疗观念，它第一次建议使用对中性肽链内切酶(NEP)和金属蛋白酶IGS5具有联合或同时抑制活性的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯制备治疗较大哺乳动物，优选人(患有可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的症状或者对该症状易感的)药物(药用组合物)。
本发明所用的化合物因它们同时地抑制IGS5金属蛋白酶和NEP的功能，因此可以筛选方法使用IGS5金属蛋白酶和任选的NEP，在回收的酶抑制试验制剂中加以鉴定。这些酶抑制试验制剂详细描述在下面的试验部分。为了鉴定加以联合或同时的选择性NEP/IGS5-抑制活性的化合物，可以既在NEP-抑制试验又在IGS5-抑制试验中分别测定候选化合物。NEP/IGS5-抑制化合物可以从许多来源鉴定，例如细胞、无细胞制品、化学文库和天然产物混合物。
筛选方法可以是只测定候选化合物对分泌到培养基中的多肽活性或者对携带多肽的细胞或膜的影响。或者，筛选方法可包括竞争剂的竞争。另外，这些筛选方法可使用适用于分泌到培养基中的多肽或者携带多肽的细胞或膜的活性的检测系统来测试候选化合物是否导致由多肽的激活或抑制生成的信号。通常在存在已知底物的情况下测定对多肽活性的抑制，并通过活性改变来观察候选化合物的效果，例如通过测试候选化合物是否导致对多肽的抑制。例如，筛选方法可只包括下列步骤：混合候选化合物与含本发明多肽的溶液和合适底物以形成混合物，测定混合物的多肽活性，并比较混合物的活性与不含候选化合物的标准。
通过包括于本发明发现的筛选方法，本发明还使本领域技术人员能够鉴定化合物，例如候选化合物，所述化合物可证实作为预期的引物候选物，特别是针对上面已提到的机能障碍、紊乱或疾病。本领域技术人员易于领会的是，IGS5金属蛋白酶也可用于基于结构来设计IGS5抑制化合物的方法中，包括：
(a)首先测定或使用IGS5金属蛋白酶的三维结构；
(b)由三维结构推测IGS5抑制剂可能的反应或结合位点；
(c)合成预测可与推测的结合或反应位点结合或反应的候选化合物；并
(d)测试候选化合物是不是真的是IGS5抑制剂。
还应当领会，这通常是重复的过程。
如今，药物化学家对计划和进行有机合成的现代方法十分慎重，以便产生对潜在的生理或药理性能的研究有价值的新的物质或化合物，标签这些化合物能够证实是治疗和/或预防特定机能障碍、紊乱或疾病的预期的新的候选药物。而且，如今通常通过组合化学提供化合物文库，例如特别是常规或“直接”化学或化合物文库，其中物质的药效基因组和残基的结构和变体对本领域技术人员是已知的。如果在筛选试验中研究具有仍然未知结构的化合物的化学文库或化合物文库，例如候选化合物，无论如何，可以通过当今充分建立的分析方法，例如质谱、核磁共振、红外线谱、熔点、光学旋转(如果涉及手性化合物)和元素分析容易地分析其结构和化学性能。
因此本发明还涉及一种能够抑制IGS5多肽的化学结构确定的候选化合物的制备方法，所述方法包括通过化学合成制备一化合物或其药用可接受的盐或生物不稳定的酯，条件是该化合物抑制IGS5多肽的活性可以通过筛选方法鉴定，例如本发明试验部分中所述的筛选方法。
例如化学有机合成的细节，以及化学、分析和物理方法参见手册“Houben-Weyl”(Houben-Weyl，“Methoden der organischenChemie”，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，New York)的最新版本。
本发明的一个实施方式涉及上文给出的式I化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗(患有可以通过联合或同时的
a)中性肽链内切酶(NEP)和
b)金属蛋白酶IGS5，它是一种包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列在全长具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，
用于抑制减轻或预防的症状或者对该症状易感的)较大哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
本发明的一个实施方式涉及本发明化合物，特别是式I的化合物(它具有联合或同时的
a)中性肽链内切酶(NEP)和
b)金属蛋白酶IGS5，它是一种包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列在全长具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽
抑制活性)，
或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗较大哺乳动物、优选人的高血压，包括高血压的继发形式如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌的疼痛的药物(药用组合物)。
式I的化合物可以按照US 5,677,297中适用于式Ia的化合物的内容和按照US 5,952,327中适用于式Ib的化合物的内容制备。
药物设计中的蛋白质-配体复合物和前导结构最佳化
另一方面，本发明涉及一种蛋白质-配体-复合物，它包括与SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5之一的多肽具有至少70％同一性的IGS5多肽和一种IGS5-结合化合物，优选一种具有IGS5-抑制活性的化合物(至少或者能够与式I的化合物相容)。这些蛋白质配体-复合物在药物设计方法、前导结构发现、前导结构最佳化和调制方法中特别有用。这些方法在本领域为公知。例如参见相关文献，诸如组合合成和多维NMR-光谱及其理解蛋白质-配体相互作用的贡献(Kessler，Angew.Chem.1997，109，857-859；James K.Chen等人，Angew.Chem.107(1995)，S.1041-1058)。而且参见Fesik(Journal of MedicinalChemistry，34(1991)，S.2937-2945)(它描述了分子复合物作为药物设计的工具的NMR研究)；和Fesik等人(Biochemical Pharmacology 40(1990)，S.161-167)(它描述了作为药物设计的辅助测定酶/抑制剂复合物的结构的NMR法)。Ross等人的最近报告(Journal of BiomolecularNMR，16：139-146(2000))描述了自动化的NMR测定和系统筛选小分子与靶蛋白质如受体的数据评价。
因此，本发明还涉及一种包括与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一的多肽具有至少70％同一性的IGS5多肽和IGS5-结合化合物的蛋白质-配体-复合物用于设计和调制或最佳化具有IGS5-结合活性和IGS5-抑制活性的前导结构的用途。
联合治疗(NEP/IGS5-抑制化合物和ECE/ACE-抑制化合物)
正如上面已经简短叙及的，另外将显示联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的本发明的化合物，例如式I的化合物，优选式Ia或Ib的化合物，与其它单个和/或联合的金属蛋白酶抑制剂(不同于NEP/IGS5联合抑制剂)联合可能是有益的。可以与具有联合的NEP/IGS5抑制活性的所述化合物联合的这些其它的金属蛋白酶抑制剂例如有ACE抑制剂，诸如卡托普利、依那拉普利尔、赖诺普利、福辛普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利；以及选择性ECE抑制剂，诸如化合物SM-19712(Sumitomo，见上面)；选择性NEP抑制剂，诸如thiorphan；双重NEP/ECE抑制剂，诸如化合物CGS-35066(De Lombart等人，J.Med.Chem.2000年2月10日；43(3)：488-504)；或这些金属蛋白酶的混合抑制剂，诸如omapatrilat或sampatrilat。通过这种联合治疗和/或预防，具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的这些化合物的治疗价值可以进一步提高，特别是针对上述的疾病和/或症状。因此另一方面，本发明特别还涉及联合的治疗和/或联合的预防。通过这种联合的治疗和/或预防，具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的所述化合物(特别是式I的化合物，优选式Ia或Ib的化合物)的治疗价值进一步提高，特别是针对上述疾病和/或症状。
因此，在这一点上，本发明涉及显示联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的第一化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯，正如本发明上面所述的那些，与至少一种选自其它单个和/或联合金属蛋白酶抑制剂(不同于NEP/IGS5联合抑制剂)的其它化合物联合，所述其它化合物优选选自ACE抑制剂、选择性ECE抑制剂、选择性NEP抑制剂、双重NEP/ECE抑制剂和这些金属蛋白酶的混合抑制剂，用于制备联合治疗和/或联合预防本发明上面所述的疾病或症状的药物(药用组合物)的用途。特别是所述第一化合物与至少一种所述其它化合物联合的本发明的这种用途，其特征在于，第一化合物具有式I的结构，优选式Ia或式Ib的结构，这些式参见本发明上文。优选，所述第一化合物与至少一种所述其它化合物联合的用途，特征还在于该联合是共同有效的，优选协同有效的。
而且，在这一点上，本发明涉及药用组合物(药物)，它包括共同有效量，优选协同有效量的：具有联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的第一化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯，如本发明上文所述的那些；和至少一种选自单个和/或联合金属蛋白酶抑制剂(不同于NEP/IGS5联合抑制剂)的其它化合物，所述其它化合物优选选自ACE抑制剂、选择性ECE抑制剂、选择性NEP抑制剂、双重NEP/ECE抑制剂和这些金属蛋白酶的混合抑制剂，用于联合治疗和/或联合预防本发明上面所述的任何疾病或症状。特别是本发明的药用组合物可以概括共同有效量，优选协同有效量的所述第一化合物和至少一种所述其它化合物，其特征还在于，第一化合物具有式I的结构，优选式Ia或式Ib的结构，如本发明上文所述的这些式。
本领域技术人员自解释，本发明的联合治疗和/或联合预防可以通过向需要这种治疗和/或这种预防的患者同时给药联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的这种化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯以及选自其它单个和/或联合金属蛋白酶抑制剂(不同于NEP/IGS5联合抑制剂)的其它化合物，或者通过给药简单的药用联合制品或者以分开方式分开给药第一化合物和第二化合物的药用制品，例如以给定剂量机理或方案，它们可以是连续的或是顺序的，或者以分级方式，无论如何对患者而言似乎对待减轻和/或预防的疾病或症状是合适的。
制剂和给药
本发明前面的发现显示联合或同时的选择性NEP/IGS5-抑制化合物，任选与单个ACE-和/或ECE-抑制化合物联合，或其各自的药用可接受的盐或溶剂化物或生物不稳定的酯产生有益治疗活性。因此这些化合物，任选与各个ACE-和/或ECE-抑制剂联合，适宜作为治疗和/或预防较大哺乳动物，特别是人类的高血压，包括继发形式的高血压的药物，这些高血压诸如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌的疼痛。NEP/IGS5-抑制化合物，任选与单个ACE-和/或ECE-抑制化合物联合，可以通过所有已知的给药路径给予。
该组合物适合例如全身性或口服的给药路径。全身性给药的优选形式包括注射，典型地通过静脉内注射。可以使用其它注射路径，例如经皮下、肌内或腹膜内。全身性给药的其它方式包括使用渗透剂如胆汁盐或夫西地酸或其它洗涤剂透粘膜、透皮给药。此外可以肠或包囊形式配制化合物。也可以口服。这些化合物的给药也可以是局部和/或局部化，以软骨、糊剂、凝胶等的形式。
为了本发明的给药，减轻和/或预防本发明上文提到的疾病或症状的治疗活性量的NEP/IGS5-抑制化合物可以与常规药用赋形剂和/或添加剂一起以固体或液体药用制剂获得。
固体剂量形式的生理例如有固体、半固体、冻干粉、片剂、涂布片剂、丸剂、粉剂、颗粒和栓剂，还有缓释制剂形式。这些固体剂量形式可以含有标准制药用的无机和/或有机赋形剂。这些赋形剂包括药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等，另外还包括常规药用添加剂如填料、润滑剂或片剂崩解剂。液体制品如活性成分的溶液、悬液或乳液可以含有常规稀释剂如水、油和/或悬浮助剂，诸如聚乙二醇类等。也可以加入其它添加剂如防腐剂、风味剂等。
可以已知方式将这些活性成分与药用赋形剂和/或添加剂混合并配制。为了制备固体剂量形式，例如可以将这些活性成分与赋形剂和/或添加剂混合并以湿法或干法造粒。可以将颗粒或粉末直接填充到胶囊中或者压制成片剂核芯。如果需要的话，可以已知方式涂布它们。
通过将这些化合物和任选的药用助剂溶解在载体中，例如溶解在盐水、葡萄糖水溶液、甘油或乙醇中形成溶液或悬液，从而制得液体制品。
给药剂量在个体之间可以不同，并且通常随待治疗的症状和给药路径变化。例如，局部涂敷的制剂、可注射的制剂，通常含有比全身性涂敷的制剂量少得多的活性物质。因此，所需的剂量范围取决于主治医师的判断，特别是根据化合物的选择、给药路径、制品性质、和患者症状的性质。然而，合适的剂量是0.1-100μg/kg患者。然而，所需剂量的大的变化，可以根据所用化合物的不同和不同给药路径的不同功效预料到。例如，预料到口服要求比经静脉内注射高的剂量。这些剂量水平的变化可以使用标准经验惯例调整以最佳化，这是本领域公知的。
IGS5 DNA和IGS5蛋白质序列表
表1：SEQ ID NO：1的IGS5-DNA(“IGS5DNA”)
    5′-TGCACCACCCCTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGGATCCTCCAGAACATGGACCCGACCACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGCGGAGGCTGGCTGCGGCGCCACGTGATCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGACGTCCTCCGCGACGAGCTGGAGGTCATCCTCAAAGCGGTGCTGGAGAATTCGACTGCCAAGGACCGGCCGGCTGTGGAGAAGGCCAGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTGATAGAGAAGCGAGGCTCTCAGCCCCTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCGGTGGCGATGGACAGGTGGAACGAGACCGTAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGGCAGCTGGCGCTGATGAACTCACAGTTCAAC
    AGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGACGACCAGAACTCCAGCCGGCACATCATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCATGCCCTCCCGAGAGTACTACTTCAACGGCGGCAGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTCATGGTGTCAGTGGCCACGTTGCTGCGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTGGTGCAGGAGGACATGATGCAGGTGCTGGAGCTGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTACCCCAGGAGGAGAGACACGACGTCATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTGCAAAGCCAGTTTGGCCTGAAGGGATTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCCTCTGTCAAAATCAAGCTGCTGCCAGATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTGCAGAACCTTGAAAACATCATCGACACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTCTGGCGCCTGGTGCTGGACCGCATTGGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTGAACTACCGCAAGGCGCTGTTTGGCACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTGGGCTACGTCAACAGCAACATGGAGAACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTCCCTGGAGACAGCAAGAGCATGGTCAGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTGGAGACGCTGGACGAGCTGGGCTGGATGGACGAGGAGTCCAAGAAGAAGGCGCAGGAGAAGGCCATGAGCATCCGGGAGCAGATCGGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGGCGCCTGGACGAGGAGTACTCCAATCTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGTCTGCAGAACCTCAAGGTGGGCGCCCAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGACCCAAATCTCTGGATCATCGGGGCGGCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAACCAGATTGTATTCCCTGCCGGGATCCTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGCAGCCACAGGCCTTGAACTTTGGAGGCATTGGGATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGACGACAATGGCCGGAACTTCGACAAGAATGGCAACATGATGGATTGGTGGAGTAACTTCTCCACCCAGCACTTCCGGGAGCAGTCAGAGTGCATGATCTACCAGTACGGCAACTACTCCTGGGACCTGGCAGACGAACAGAACGTGAACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACATTGCTGACAACGGAGGGGTGCGGCAAGCCTATAAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAGGACCAGCAGCTGCCCGGCCTGGATCTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCCCAGGTGTGGTGCGGGTCCTACCGGCCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTCCACAGTCCCCTGAAGTACAGGGTACTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGACACGTTCCACTGTGCCCGGGGCACCCCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG-3′
表2：SEQ ID NO：2的IGS5-蛋白质(“IGS5PROT”)
    CTTPGCVIAAARILQNMDPTTEPCDDFYQFACGGWLRRHVIPETNSRYSIFDVLRDELEVILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSVIEKRGSQPLLDILEVVGGWPVAMDRWNETVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWNDDQNSSRHIIYIDQPTLGMPSREYYFNGGSNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCLVQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERHDVIALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLSSVKIKLLPDEEVVVYGIPYLQNLENIIDTYSARTIQNYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRVNYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSNMENAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFVETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIREQI
    GHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENSLQNLKVGAQRSLRKLREKVDPNLWIIGAAVVNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFDKNGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYGNYSWDLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQAYKAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYAQVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKYRVLGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW
表3：SEQ ID NO：3的IGS5-DNA-1(“IGS5DNA1”)
    5′-ATGGGGAAGTCCGAAGGCCCCGTGGGGATGGTGGAGAGCGCTGGCCGTGCAGGGCAGAAGCGCCCGGGGTTCCTGGAGGGGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGTGACCGCTGCCCTGGTGGCCTTGGGTGTCCTCTACGCCGACCGCAGAGGGAAGCAGCTGCCACGCCTTGCTAGCCGGCTGTGCTTCTTACAGGAGGAGAGGACCTTTGTAAAACGAAAACCCCGAGGGATCCCAGAGGCCCAAGAGGTGAGCGAGGTCTGCACCACCCCTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGGATCCTCCAGAACATGGACCCGACCACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGCGGAGGCTGGCTGCGGCGCCACGTGATCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGACGTCCTCCGCGACGAGCTGGAGGTCATCCTCAAAGCGGTGCTGGAGAATTCGACTGCCAAGGACCGGCCGGCTGTGGAGAAGGCCAGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTGATAGAGAAGCGAGGCTCTCAGCCCCTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCGGTGGCGATGGACAGGTGGAACGAGACCGTAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGGCAGCTGGCGCTGATGAACTCACAGTTCAACAGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGACGACCAGAACTCCAGCCGGCACATCATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCATGCCCTCCCGAGAGTACTACTTCAACGGCGGCAGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTCATGGTGTCAGTGGCCACGTTGCTGCGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTGGTGCAGGAGGACATGATGCAGGTGCTGGAGCTGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTACCCCAGGAGGAGAGACACGACGTCATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTGCAAAGCCAGTTTGGCCTGAAGGGATTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCCTCTGTCAAAATCAAGCTGCTGCCAGATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTGCAGAACCTTGAAAACATCATCGACACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTCTGGCGCCTGGTGCTGGACCGCATTGGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTGAACTACCGCAAGGCGCTGTTTGGCACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTGGGCTACGTCAACAGCAACATGGAGAACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTCCCTGGAGACAGCAAGAGCATGGTCAGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTGGAGACGCTGGACGAGCTGGGCTGGATGGACGAGGAGTCCAAGAAGAAGGCGCAGGAGAAGGCCATGAGCATCCGGGAGCAGATCGGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGGCGCCTGGACGAGGAGTACTCCAATCTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGTCTGCAGAACCTCAAGGTGGGCGCCCAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGACCCAAATCTCTGGATCATCGGGGCGGCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAAC
    CAGATTGTATTCCCTGCCGGGATCCTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGCAGCCACAGGCCTTGAACTTTGGAGGCATTGGGATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGACGACAATGGCCGGAACTTCGACAAGAATGGCAACATGATGGATTGGTGGAGTAACTTCTCCACCCAGCACTTCCGGGAGCAGTCAGAGTGCATGATCTACCAGTACGGCAACTACTCCTGGGACCTGGCAGACGAACAGAACGTGAACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACATTGCTGACAACGGAGGGGTGCGGCAAGCCTATAAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAGGACCAGCAGCTGCCCGGCCTGGATCTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCCCAGGTGTGGTGCGGGTCCTACCGGCCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTCCACAGTCCCCTGAAGTACAGGGTACTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGACACGTTCCACTGTGCCCGGGGCACCCCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG-3′
表4：SEQ ID NO：4的IGS5-蛋白质-1(“IGS5PROT1”)
    MGKSEGPVGMVESAGRAGQKRPGFLEGGLLLLLLLVTAALVALGVLYADRRGKQLPRLASRLCFLQEERTFVKRKPRGIPEAQEVSEVCTTPGCVIAAARILQNMDPTTEPCDDFYQFACGGWLRRHVIPETNSRYSIFDVLRDELEVILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSVIEKRGSQPLLDILEVVGGWPVAMDRWNETVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWNDDQNSSRHIIYIDQPTLGMPSREYYFNGGSNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCLVQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERHDVIALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLSSVKIKLLPDEEVVVYGIPYLQNLENIIDTYSARTIQNYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRVNYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSNMENAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFVETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIREQIGHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENSLQNLKVGAQRSLRKLREKVDPNLWIIGAAVVNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFDKNGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYGNYSWDLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQAYKAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYAQVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKYRVLGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW
表5：SEQ ID NO：5的IGS5-DNA-2(“IGS5DNA2”)
    5′-ATGGGGAAGTCCGAAGGCCCAGTGGGGATGGTGGAGAGCGCCGGCCGTGCAGGGCAGAAGCGCCCGGGGTTCCTGGAGGGGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGTGACCGCTGCCCTGGTGGCCTTGGGTGTCCTCTACGCCGACCGCAGAGGGATCCCAGAGGCCCAAGAGGTGAGCGAGGTCTGCACCACCCCTGGCTGCGTGATAGCAGCTGCCAGGATCCTCCAGAACATGGACCCGACCACGGAACCGTGTGACGACTTCTACCAGTTTGCATGCGGAGGCTGGCTGCGGCGCCACGTGATCCCTGAGACCAACTCAAGATACAGCATCTTTGACGTCCTCCGCGACGAGCTGGAGGTCATCCTCAAAGCGGTGCTGGAGAATTCGACTGCCAAGGACCGGCCGGCTGTGGAG
    AAGGCCAGGACGCTGTACCGCTCCTGCATGAACCAGAGTGTGATAGAGAAGCGAGGCTCTCAGCCCCTGCTGGACATCTTGGAGGTGGTGGGAGGCTGGCCGGTGGCGATGGACAGGTGGAACGAGACCGTAGGACTCGAGTGGGAGCTGGAGCGGCAGCTGGCGCTGATGAACTCACAGTTCAACAGGCGCGTCCTCATCGACCTCTTCATCTGGAACGACGACCAGAACTCCAGCCGGCACATCATCTACATAGACCAGCCCACCTTGGGCATGCCCTCCCGAGAGTACTACTTCAACGGCGGCAGCAACCGGAAGGTGCGGGAAGCCTACCTGCAGTTCATGGTGTCAGTGGCCACGTTGCTGCGGGAGGATGCAAACCTGCCCAGGGACAGCTGCCTGGTGCAGGAGGACATGATGCAGGTGCTGGAGCTGGAGACACAGCTGGCCAAGGCCACGGTACCCCAGGAGGAGAGACACGACGTCATCGCCTTGTACCACCGGATGGGACTGGAGGAGCTGCAAAGCCAGTTTGGCCTGAAGGGATTTAACTGGACTCTGTTCATACAAACTGTGCTATCCTCTGTCAAAATCAAGCTGCTGCCAGATGAGGAAGTGGTGGTCTATGGCATCCCCTACCTGCAGAACCTTGAAAACATCATCGACACCTACTCAGCCAGGACCATACAGAACTACCTGGTCTGGCGCCTGGTGCTGGACCGCATTGGTAGCCTAAGCCAGAGATTCAAGGACACACGAGTGAACTACCGCAAGGCGCTGTTTGGCACAATGGTGGAGGAGGTGCGCTGGCGTGAATGTGTGGGCTACGTCAACAGCAACATGGAGAACGCCGTGGGCTCCCTCTACGTCAGGGAGGCGTTCCCTGGAGACAGCAAGAGCATGGTCAGAGAACTCATTGACAAGGTGCGGACAGTGTTTGTGGAGACGCTGGACGAGCTGGGCTGGATGGACGAGGAGTCCAAGAAGAAGGCGCAGGAGAAGGCCATGAGCATCCGGGAGCAGATCGGGCACCCTGACTACATCCTGGAGGAGATGAACAGGCGCCTGGACGAGGAGTACTCCAATCTGAACTTCTCAGAGGACCTGTACTTTGAGAACAGTCTGCAGAACCTCAAGGTGGGCGCCCAGCGGAGCCTCAGGAAGCTTCGGGAAAAGGTGGACCCAAATCTCTGGATCATCGGGGCGGCGGTGGTCAATGCGTTCTACTCCCCAAACCGAAACCAGATTGTATTCCCTGCCGGGATCCTCCAGCCCCCCTTCTTCAGCAAGGAGCAGCCACAGGCCTTGAACTTTGGAGGCATTGGGATGGTGATCGGGCACGAGATCACGCACGGCTTTGACGACAATGGCCGGAACTTCGACAAGAATGGCAACATGATGGATTGGTGGAGTAACTTCTCCACCCAGCACTTCCGGGAGCAGTCAGAGTGCATGATCTACCAGTACGGCAACTACTCCTGGGACCTGGCAGACGAACAGAACGTGAACGGATTCAACACCCTTGGGGAAAACATTGCTGACAACGGAGGGGTGCGGCAAGCCTATAAGGCCTACCTCAAGTGGATGGCAGAGGGTGGCAAGGACCAGCAGCTGCCCGGCCTGGATCTCACCCATGAGCAGCTCTTCTTCATCAACTACGCCCAGGTGTGGTGCGGGTCCTACCGGCCCGAGTTCGCCATCCAATCCATCAAGACAGACGTCCACAGTCCCCTGAAGTACAGGGTACTGGGGTCGCTGCAGAACCTGGCCGCCTTCGCAGACACGTTCCACTGTGCCCGGGGCACCCCCATGCACCCCAAGGAGCGATGCCGCGTGTGGTAG-3′
表6：SEQ ID NO：6的IGS5-蛋白质-2(“IGS5PROT2”)
    MGKSEGPVGMVESAGRAGQKRPGFLEGGLLLLLLLVTAALVALGVLYADRRGIPEAQEVSEVCTTPGCVIAAARILQNMDPTTEPCDDFYQFACGGWLRRHVIPETNSRYSIFDVLRDELEVILKAVLENSTAKDRPAVEKARTLYRSCMNQSVIEKRGSQPLLDILEVVGGWPVAMDRWNETVGLEWELERQLALMNSQFNRRVLIDLFIWNDDQNSSRHIIYIDQPTLGMPSREYYFNGGSNRKVREAYLQFMVSVATLLREDANLPRDSCLVQEDMMQVLELETQLAKATVPQEERHDVIALYHRMGLEELQSQFGLKGFNWTLFIQTVLSSVKIKLLPDEEVVVYGIPYLQNLENIIDTYSARTIQNYLVWRLVLDRIGSLSQRFKDTRVNYRKALFGTMVEEVRWRECVGYVNSNMENAVGSLYVREAFPGDSKSMVRELIDKVRTVFVETLDELGWMDEESKKKAQEKAMSIREQIGHPDYILEEMNRRLDEEYSNLNFSEDLYFENSLQNLKVGAQRSLRKLREKVDPNLWIIGAAVVNAFYSPNRNQIVFPAGILQPPFFSKEQPQALNFGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFDKNGNMMDWWSNFSTQHFREQSECMIYQYGNYSWDLADEQNVNGFNTLGENIADNGGVRQAYKAYLKWMAEGGKDQQLPGLDLTHEQLFFINYAQVWCGSYRPEFAIQSIKTDVHSPLKYRVLGSLQNLAAFADTFHCARGTPMHPKERCRVW
本说明书中所引证的所有文献，包括但不限于专利和专利申请，都加入本文作为参考，如同每个单个文献都具体地且单个地描述以全文加入本文作为参考。
以下实施例仅打算更详细地进一步描述本发明，因此决不要认为将这些实施例限制本发明的范围。
实施例1.编码NEPRILYSIN NEP/ECE金属蛋白酶家族新成员的cDNA的克隆
实施例1a.编码IGS5的cDNA的同源性克隆的概述
在各种神经元和激素肽的代谢中涉及到M13亚家族的金属蛋白酶。至今该亚家族包括neprilysin(NEP)、内皮素-转化酶-1(ECE-1)、ECE-2、Kell、Pex和XCE。
正在开发NEP和ECE的抑制剂用于例如心脏学和肠胃病学的治疗用途。由于这个家族的其它成员可能关注药物靶，因此使用同源性克隆鉴定人类基因组中的新基因。
按照上面的常规描述并根据国际专利申请PCT/EP 00/11532(加入本文作为参考)的试验部分进一步详细描述的试验细节进行IGS5的同源性克隆。该步骤概括如下：
在表达序列标签(EST)的数据库中，检测序列，它们所包含的小型开放读码框显示与NEP/ECE-样金属蛋白酶的C端部分的相似性。基于这些EST序列和NEP/ECE-样金属蛋白酶的保守肽基元，使用简并PCR由人类肺、心脏和睾丸cDNA克隆完整cDNA序列。
该cDNA序列编码糖基化蛋白质，命名IGS5或者人类可溶性肽链内切酶(hSEP)，显示M13家族成员的特性。IGS5显示与小鼠SEP(78％)、小鼠、大鼠和人类NEP(54％)和人类ECE-1(39％)高的氨基酸序列同一性。在与小鼠SEP和SEPΔ剪接变体类比中，我们也检测了两个在78bp可变外显子不同的IGS5剪接形式。这些剪接形式分别编码753和779残基的蛋白质。较长形式含有位于与跨膜锚定相邻的蛋白水解切割位点。因此这两个剪接变体可以代表结合IGS5蛋白质的膜和该IGS5蛋白质的可溶性形式。
使用多重组织斑点印迹分析和定量PCR的表达分析证实在各种人类组织中表达，并且在睾丸中观察到最强信号。并且在例如前列腺、小肠、胃、结肠、肾和大脑中观察到IGS5 mRNA表达。两个剪接变体显示清楚的表达图谱。
该功能特性证实该酶是neprylysin家族的真正成员，并且具有ECE活性。
实施例1b.IGS5与NEP/ECE金属蛋白酶家族的蛋白质序列的比对
对于最初克隆的IGS5序列(参见实施例1)，使用BLAST算法(Altschul S.F.等人，[1997]，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)执行对现有蛋白质数据库和翻译后DNA数据库的同源性搜索。这些搜索显示，该最初获得的IGS5蛋白质与小鼠、大鼠和人类中性肽链内切酶(SW：NEP_MOUSE，编号Q61391；SW：NEP_RAT，编号P07861；和SW：NEP_HUMAN，编号P08473)最相似(在大约700个比对残基上具有54-55％同一性)。因此，几乎完整的IGS5蛋白质序列与其它NEP/ECE家族成员的这一比对显示了IGS5与金属蛋白酶(一般来说)和与NEP和/或ECE金属蛋白酶家族(具体而言)的关系。由这种结构比对得出结论，IGS5具有金属蛋白酶的功能性，因而在动物和人的几种机能障碍、紊乱或疾病方面受到关注。
实施例1c.包括IGS5全长编码序列的cDNA片段的克隆
为了获得其它IGS5 cDNA序列，使用对IGS5特异的反向引物在上文所述条件下对人肺RNA进行另一轮RT-PCR反应。所得毗邻序列群包含一个起始于ATG起始密码子的开放读码框，编码的蛋白质显示与小鼠SEP蛋白质N端序列有高度相似性。
将所有分离克隆的DNA序列装配起来显示存在因最初在基因组克隆IGS5/S1中鉴定的78bp片段的存在与否而不同的两种cDNA序列。这两种序列有可能起源于不同剪接的RNA分子。最长的转录本包含2337个核苷酸(编码779个残基的蛋白质)的开放读码框，而较短的转录本包含2259个核苷酸(编码753个残基的蛋白质)的开放读码框。将长型的编码序列和蛋白质序列分别称为IGS5DNA1(以SEQ IDNO：3显示，2340bp，包括终止密码子标签)和IGS5PROT1(SEQ IDNO：4)，而将短型的编码序列和蛋白质序列分别称为IGS5DNA2(以SEQ ID NO：5显示，2262bp，包括终止密码子标签)和IGS5PROT2(SEQ ID NO：6)。在IGS5DNA1和IGS5DNA2中假定甲硫氨酸起始密码子的下游，在第10位密码子处存在另一个符合读码框的甲硫氨酸密码子。尽管已经采用了第一个甲硫氨酸密码子作为起始密码子，由于两个甲硫氨酸似乎处于同等有利的“Kozak”翻译起始范围内，因而不能排除翻译有时(或甚至完全的)由第10位密码子起始(Kozak M.，Gene[1999]：234：187-208)。IGS5PROT1和IGS5PROT2序列的亲水性分析(Kyte J.等人，J.Mol.Biol.[1982]157：105-132；Klein P.等人，Biochim.Biophys.Acta[1985]815：468-476)显示，在第22-50位残基之间存在单个跨膜结构域。这指示IGS5PROT1和IGS5PROT2是II型整合膜蛋白，因此具有与NEP/ECE蛋白质家族其它成员相似的膜拓扑学。
实施例1c.实施例1c的IGS5蛋白质序列与NEP/ECE金属蛋白酶家族的成员的蛋白质序列的比对
对实施例1c中克隆的IGS5序列，使用BLAST算法(Altschul S.F.等人，Nucleic Acids Res.[1997]，25：3389-3402)执行对现有蛋白质数据库和翻译后DNA数据库的同源性搜索。这些搜索显示，IGS5PROT1与小鼠SEP(GenBank编号AF157105)最相似(在778个比对残基上具有76％同一性)，还在696个比对残基上显示与小鼠、大鼠和人类中性肽链内切酶(SW：NEP_MOUSE，编号Q61391；SW：NEP_RAT，编号P07861；SW：NEP_HUMAN，编号P08473)有54-55％同一性。IGS5PROT2的同源性搜索显示，这种序列与小鼠SEPA(GenBank编号AF157106)最相似(在752个比对残基上具有78％同一性)。在与小鼠SEP和SEPΔ蛋白质的类比中，预计IGS5PROT1和IGS5PROT2分别代表IGS5蛋白质的膜结合形式和可溶性形式。这通过可变剪接的78bp外显子3′端编码的而碱性残基(KRK)的存在得到了确证。
因此，完整IGS5蛋白质序列与其它NEP/ECE家族成员的比对显示了IGS5与NEP/ECE金属蛋白酶(一般而言)和与SEP和NEP家族成员(具体而言)的关系。由这种结构比对得出结论，IGS5蛋白质具有金属蛋白酶的功能性，因而在动物和人的几种机能障碍、紊乱或疾病方面受到关注。
实施例2.HIS-标记的人IGS5胞外结构域的表达和纯化
本试验目的是使用杆状病毒表达系统生成可溶性IGS5蛋白质。构建在感染Sf9细胞系后表达His6-标记的IGS5胞外结构域的重组杆状病毒。然后在包括扁豆凝集素和Zn-IMAC色谱的两步流程中由培养物上清液纯化可溶性IGS5蛋白质，正如本领域对His6-ECE-1进行的。
实施例2a.试验步骤
动力学表达分析
通过低速离心收集在旋转烧瓶中在添加在添加10％灭活胎牛血清(Gibco BRL目录编号10084168)的TC100培养基(JRH Biosciences目录编号56941)中于27℃指数悬浮生长的519个细胞(IGCL 83.0)，并以5×105个细胞/瓶(25cm2)接种在无血清TC100培养基中。以感染复数(MOI)3pfu/细胞加入候选重组病毒克隆，随后将细胞/病毒培养物于27℃下保温。在感染24、48和72小时，通过两次连续低速离心收集细胞和条件培养基(CM)。通过SDS PAGE凝胶电泳和Western印迹分析样品。
脱糖基研究
向样品中加入SDS至最终浓度1％，并于95℃保温5分钟。加入1倍体积的2x培养缓冲液(250mM磷酸盐缓冲液、50mM EDTA、5％N-辛基糖苷、1％2-巯基乙醇)并于95℃下再次保温5分钟之后，将样品冷却至37℃。加入1 U N-糖苷酶F(Boehringer Mannheim目录编号1365177)，并在于37℃下培养过夜之后用100mM DTT(最终浓度)还原样品。
制备性生产
通过低速离心收集在旋转烧瓶中在添加在添加10％灭活胎牛血清(Gibco BRL目录编号10084168)的TC100培养基(JRH Biosciences目录编号56941)中于27℃指数悬浮生长的519个细胞(IGCL 83-2)，并以2×106个细胞/ml的密度重悬于添加0.013TIU/ml抑酶肽(Pentex)的TC100培养基中。以感染复数(MOI)2.25pfu/细胞，将重组病毒IGBV73加到细胞中。随后将细胞/病毒悬浮物在玻璃滚瓶(3×500ml/1260cm2)中于27℃下保温72小时。然后通过两次连续低速离心清洗将CM(1.5L)与细胞和细胞碎片分开。通过Western印迹分析并测定内毒素水平控制等分试样的质量。
实施例2b.结果
表达动力学
经Western印迹分析研究了3个候选重组病毒克隆的表达动力学。Western印迹揭示了所有候选克隆的CM中都有大约81kDa的清晰条带，符合该成熟蛋白质的理论相对分子量(81.2kDa)。就细胞水解物而言，由于SDS凝胶过载，因此不能得出结论。所有3个克隆的表达水平在感染后48-72小时达到峰值。选择2号克隆进一步扩增并作为IGBV73保藏。最佳收获时间设定为感染后72小时。
脱糖基研究
可溶性IGS5蛋白质序列含有8个潜在N-糖基化位点。既然纯化方案包括在扁豆凝集素柱上结合糖基，那么将感染后72小时收集的CM和细胞收集物用于N-糖苷酶F的脱糖基化研究，以检查重组体可溶性His6IGS5蛋白质是否确实作为糖基化蛋白质表达。
经N-糖苷酶F处理的CM样品和未处理对照的Western印迹分析显示，样品脱糖基化后Mr发生偏移，证明可溶性人His-标记的IGS5是作为糖基化蛋白质表达的。在未处理的细胞水解物中，可以获得约80-82kDa的3个蛋白质条带。经过N-糖苷酶F处理，约80kDa的1个条带保留可以见到，符合未处理的样品的最低分子量条带。
制备性生产
感染后72小时，从IGBV73感染的Sf9昆虫细胞中收集1.5升CM。测定内毒素含量是0.0847EU/ml CM。Western印迹分析揭示了在该CM中有大约81kDa的清晰条带，符合该成熟可溶性His标记的IGS5的分子量。与细胞水解物样品(显示3个蛋白质条带)相比，该CM蛋白质条带与细胞中存在的较弱的中间相对分子量条带一致。
实施例3.IGS5的纯化
实施例3a.试验步骤
样品预处理
向300ml澄清杆状病毒CM中加入1片无EDTA完整的(EFC；Roche Biochemicals，目录编号1873580)。分别加入HEPES、甘油和Tween20至最终浓度20mM、5％(v/v)和0.005％(w/v)。将CM的pH调整至7.4，并将样品过滤(Durapore膜滤器，0.2μGV)。所有纯化步骤都于4℃下进行。
扁豆凝集素色谱
将杆状病毒样品以0.3ml/min上样至装在C10/10柱(Pharmacia)中用添加1片EFC/500ml的缓冲液A(20mM Hepes，150mM NaCl、5％甘油、0.005％Tween20)平衡的5ml扁豆凝集素Sepharose树脂上过夜。用平衡缓冲液清洗柱直至280nm下的吸光值达到基线水平，并用含0.5Mα-甲基吡喃糖苷的缓冲液A洗脱结合的蛋白质。通过应用100mM醋酸盐、500mM NaCl，pH 5.0再生柱。手工收集洗脱液和再生液，并通过12.5％Phast凝胶(Pharmacia)的SDS-PAGE和银染分析合并液。包括有预染标记(Gibco)作为相对分子量(Mr)标准。
固定化金属亲和色谱(IMAC)和透析
如制造商所述将锌离子上样至1ml螯合HiTrap(Pharmacia)上，并用缓冲液B(20mM Hepes、100mM NaCl、5％甘油、0.005％(w/v)Tween20，pH 7.2)平衡。将1号和2号扁豆洗脱合并液以0.5ml/min分别上样至HiTrap柱(IMAC运行A和IMAC运行B)中。包括空白运行以比较色谱吸光值图谱。用缓冲液B清洗柱直至基线水平，并用溶于缓冲液B的咪唑分级梯度(20、50、100和200mM)洗脱结合的蛋白质。手工收集各级分。用20mM Hepes、50mM EDTA、500mMNaCl、pH 7.2再生IMAC柱。通过SDS PAGE(12.5％Phast凝胶，Pharmacia)和银染分析洗脱液和再生合并液。将200mM咪唑合并液转移至滑动a-lyzer-盒(MWCO 10.000，Pierce)并在缓冲液B(130倍过量，不更换缓冲液)中透析过夜。
蛋白质定量
使用micro-BCA法(Pierce)测定透析后合并液中可溶性IGS5的量。包括BSA为参照物。
蛋白质特性
通过(1)还原和非还原条件下的SDS-PAGE和(2)使用抗His标签的mAb(21E1B4，IG)的Western印迹，随后与碱性磷酸酶标记的兔抗小鼠lg(Dako)一起培养，并通过NBT/BCIP染色进行检测，由此在生物化学上表征透析后杆状病毒IGS5。通过PGN酶F处理(Biorad)确认了可溶性IGS5的糖基化状态。
实施例3b.结果
具有0.5Mα-甲基吡喃糖苷的扁豆洗脱液获得一尾峰。将该流出物洗涤并通过SDS-PAGE和银染分析洗脱合并液。大量蛋白质回收到该流出物中，而且在1-3号洗脱合并液中观察到大约85.000的IGS5候选条带。抗-His标签mAb对扁豆色谱的Western印迹分析显示，可溶性hIGS5蛋白质(相对分子量大约85000)定量结合于扁豆凝集素树脂上，而且His-标记的蛋白质在整个洗脱峰中回收，但是主要在1号和2号合并液中。在Zn-IMAC柱上进一步加工1号和2号扁豆凝集素洗脱合并液(运行A和B)。结合的蛋白质通过咪唑分级梯度洗脱。SDS-PAGE分析和银染显示，20mM和50mM咪唑梯度洗脱了大量杂质蛋白质。在100mM和200mM咪唑洗脱梯度中回收到hIGS5蛋白质。100mM咪唑洗脱液，(在洗脱液中含有最大10％的hIGS5)，仍然污染有相对分子量＞115000的蛋白质。在100mM中的IGS5条带也是一双带。它保留证实了模糊的上带(代表小于10％双峰)是否是残余的杆状病毒污染物或IGS5同种型，或者下面的(强)条带是否是羧基末端简并产物。200mM咪唑合并液中的85kDa条带在SDS-PAGE上是与抗his-标签mAb反应的单一条带。
银染没有证实在由IMAC运行的A和IMAC运行的B获得的hIGS5材料之间的纯度没有任何差异。这说明凝集素洗脱液的合并液1和合并液2在未来可以合并总兵在Zn-IMAC柱上简单运行地同时加工。
在还原和非还原条件下运行的Coomasssie染SDS-PAGE凝胶上观察到相同的条带轮廓，这说明纯化的hlGS5不含二硫化物基低聚物。用PGN酶F处理将SDS-PAGE上的相对分子量降低约5kDa。用内切糖苷酶处理之后的这种杆状病毒表达的hlGS5的微小偏移于对CHO表达的小鼠SEP(Ikeda等人，JBC，274，32469，1999)的偏移显著不同。
从300ml的杆状病毒CM开始，通过2步纯化步骤获得340μg纯度超过95％的His-标记的hIGS5胞外结构域(即产率为约1mg/l)。然后将该纯化产品用于下面实施例中所述的酶抑制试验中。
实施例4.IGS5酶抑制试验
针对生物学活性肽的代谢测试本发明IGS5多肽的酶活性。特别是，测试这些IGS5多肽是否作用于本领域现阶段知道的多种血管活性肽，诸如心房钠尿肽(ANP)、缓激肽、big-内皮素(big-ET-1)、内皮素(ET-1)、物质P和血管紧张素-1。在本发明的上下文中，具体地说，测试IGS5胞外结构域(新型人金属蛋白酶)是否水解上述血管活性肽。为了比较，还对早先由Emoto等人描述成可溶性分泌型肽链内切酶(SEP)(J.Biol.Chem.，第274卷(1999)：第32469-32477页)的金属蛋白酶家族已知成员进行测定。此外，测试了IGS5转化big-ET-1类似物(所谓的17个氨基酸的big-ET-1)的活性是否受到参考化合物的抑制，所述参考化合物用于测定对具有ECE和/或NEP-特征的抑制特性。用于测试IGS5对big-ET-1类似物的活性的抑制作用的化合物是抑制具有NEP特性的肽链内切酶的化合物膦酰二肽、选择性地抑制NEP的化合物thiorphan和是双重NEP/ECE抑制剂的化合物CGS-35066。
实施例4a.材料
酶：IGS-5(sol hu)(his)6；或：His6-标记的IGS5胞外结构域；
储存液：53μg/ml，溶于20mM HEPES pH 7.2、5％甘油、0.005％Tween20、100mM NaCl、纯度＞99％；保存于4℃。
工作液：用测定缓冲液将储存液稀释至10μg/ml。
底物：Mca-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-Dpa-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH；
荧光淬火的big-ET-1类似物；
Mca＝7-甲氧基香豆素-4-基；
Dpa＝3-[2，4-二硝基苯基]-L-2，3-二氨基丙酰基；
储存液：100μM，溶于测定缓冲液；保存于-20℃。
(可以从供应商Polypeptide Laboratories，Wolfenbuttel，德国获得)
测定缓冲液：100mM Tris pH 7.0，250mM NaCl。
将所有待测化合物以10mM溶于DMSO，并用测定缓冲液进一步稀释。
实施例4b.试验步骤
将70μl测定缓冲液、10μl酶工作液和10μl测定化合物溶液在Eppendorf管中混合，并于37℃预先培养15分钟。然后，加入10μl底物储存液，并将反应化合物于37℃保温60分钟，从而能够进行酶促水解。随后，通过于95℃加热5分钟来终止酶促反应。离心(HeraeusBiofuge B，3min)之后，对上清液进行HPLC分析。
实施例4c.HPLC步骤
为了将剩余底物与切割产物分开，使用CC 125/4 Nucleosil 300/5C18 RP柱和CC 8/4 Nucleosil 100/5 C18预柱(可以从Macherey-Nagel，Duren，德国商购获得)进行反相HPLC技术。因而，将60μl在实施例4b中获得的反应样品注射到HPLC中，并以1ml/min的流速用下列梯度和溶液洗脱色谱柱：
溶液A：100％    H2O+0.5M H3PO4，pH＝2.0
溶液B：100％    乙腈+0.5M H3PO4
0-2min  20％       B
2-6min  20-60％    B
6-8min  60％       B
8-10min    60-90％    B
10-13min   90％       B
13-15min   90-100％   B
通过214nm的吸光值和通过激发波长328nm和发射波长393nm的荧光来检测肽。
实施例4d.计算
将水解后含未淬灭Mca荧光团肽的HPLC峰的荧光信号增值作为任何计算的基础。
对含和不含抑制剂的样品比较该信号，并根据各自的峰计算％抑制。
％抑制＝100×(1-A抑制/A对照)
所有样品运行双份，并使用平均值。
在每次测定运行中加入标准抑制剂(10nM和100nM膦酰二肽)和溶剂对照(0.1％)。
实施例4e.结果
关于本发明的IGS5多肽，实施例4的结果显示这些IGS5金属蛋白酶多肽在体外水解本领域现阶段已知的多种血管活性肽。表7显示了与SEP活性相比的水解测定的结果。由这些结果得出结论，IGS5可以特别涉及所述生物学血管活性肽的代谢。
表7：与SEP(可溶性分泌型肽链内切酶)相比IGS5多肽对血管活性肽的水解
血管活性肽     ％水解作用IGS5多肽   ％水解作用SEP(Emoto等人)
  条件：100μg IGS5多肽；0.5μM底物；2h，37℃   条件：10μg SEP；0.5μM底物；12h，37℃
ANP   5(80*)   ＞95
缓激肽   100(62**)   ＞95
ET-1   ＜30   92
物质P   100   ＞95
血管紧张素1   15***   ＞95
17个氨基酸的big-ET-1**** 41 n.d.
*    500μg IGS5多肽
**   10μg IGS5多肽
***  血管紧张素降解不会导致小肠血管紧张素II
**** 将17个氨基酸的big-ET-1用作天然big-ET-1的类似物；还使用天然big-ET-1检测IGS5的水解活性，但是难以用HPLC-检测，因此不能定量。
实施例5.NEP酶抑制试验
按照Gee等人的方法(Biochem J 1985年5月15日；228(1)：119-26)由猪肾皮层制备中性肽链内切酶(E.C.3.4.24.11)并通过Relton等人(Biochem J 1983年12月1日；215(3)：519-23)报道的纯化。为了该酶抑制试验，使用10ng纯化的酶、20μM底物(甲硫氨酸-脑啡肽)和各种抑制剂浓度。试验缓冲液是50mM Tris-(羟基甲基)-氨基甲烷/HClpH7.4，试验总体积是100μl。将酶和抑制剂预培养5分钟之后，加入底物，接着开始37℃下酶诱导底物水解的第二培养相，持续30分钟。通过在95℃下加热5分钟来停止该酶促反应。离心之后将上清液经过HPLC。将酶底物水解的产物与天然底物通过HPLC技术分离，并通过将产物的峰面积与天然底物的峰面积比较(有和没有抑制剂(对照)的样品)计算抑制剂效力。没有酶的空白、没有抑制剂的对照、用抑制剂溶剂代替抑制剂的样品以及有标准抑制剂的样品分别加入到各自运行试验中。
材料的供应商：
NEP：Dr.Philippe Crine，加拿大蒙特利尔大学
甲硫氨酸-脑啡肽：Sigma，Deisenhofen，德国
实施例6.ECE酶抑制试验
将重组人类COOH-末端的His6-标记的内皮素转化酶-1在Sf9-细胞中表达。通过亲和色谱进行纯化。该酶抑制试验包括酶(2.8μg)、5μg底物(适当改性的17个氨基酸切短的big-内皮素-1)、不同最终浓度的抑制剂和100mM Tris-缓冲液(Tris-羟基甲基氨基甲烷/HCl，pH7.0+150mM NaCl)，最终体积为100μl。将酶和抑制剂在37℃下预培养15分钟，之后加入底物并培养(60min，37℃)用于酶促水解。通过在95℃下加热5分钟使酶促反应停止。离心之后对上清液进行HPLC以将酶促水解产物与未降解的底物分离。以抑制反应中产物和未切割的底物的峰面积为基础，并与对照(没有抑制剂)相比，计算％抑制。没有酶的空白、没有抑制剂的对照、用抑制剂溶剂代替抑制剂的样品以及有标准抑制剂的样品分别加入到各自运行试验中。
材料的供应商：
ECE：Innogenetics，Ghent，比利时
ECE底物：Polypeptide，Wolfenbuttel，德国
实施例7.与参考化合物相比NEP/IGS5-抑制化合物的生物化学图谱
为了本发明的目的以便表征和评价IGS5的药理学酶促性能，如上面实施例中所述，使用昆虫细胞系作为表达系统产生人类IGS5蛋白质，并测定IGS5蛋白质的许多潜在底物。根据实施例4的结果，发现IGS5有效地切割big-ET-1、ANP和缓激肽，因此证实这种新的蛋白质是具有广泛底物同一性的真正的金属蛋白酶，它是金属蛋白酶的普通特征并且其特征已对NEP、ECE-1以及ACE进行了报道。还应注意的是，根据本发明的发现，经IGS5的big-ET-1的蛋白质水解出人意料地导致正确地形成ET-1，例如big-ET-1在氨基酸Trp21和Val22之间正确地切割。
而且，如本实施例7所述，使用标记的荧光big-ET-1类似物测定了金属蛋白酶抑制剂化合物和参考化合物抑制big-ET向ET-1转化的效力。该酶试验所用的步骤以在实施例4中针对IGS5、实施例5中针对NEP和实施例6中针对ECE进行了描述。
酶抑制试验的结果汇总于表8。关注已知在体内抑制big-ET向ET-1转化的膦酰二肽，在本发明的生物化学试验中也高效地抑制IGS5，并且出人意料地发现IGS5被膦酰二肽抑制实际上大大高于ECE-1。相反，选择性NEP抑制剂thiorphan以及选择性ECE-1抑制剂SM-19712(4-氯-N-[[(4-氰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)氨基]羰基]苯磺酰胺、一钠盐；Umekawa K、Hasegawa H、Tsutsumi Y、SatoK、Matsumura Y、Ohashi N.，J Pharmacol 2000年9月；84(1)：7-15；Discovery Research Laboratories I，Research Center，SumitomoPharmaceuticals Co，Ltd，Osaka，Japan)不影响IGS5的活性(表8)。
表8：NEP/IGS5-抑制化合物和参考化合物的生物化学图谱
    化合物     IGS5IC50/nM     NEPIC50/nM     ECE-1IC50/nM
    膦酰二肽     18     2.0     300
    CGS-35066     1300     42     5
    Thiorphan     ＞1000     2.4     ＞10000
    SM-19712     ＞10000     ＞1000     11.7
    化合物la-2活性药     1.2     2.9     1000
    化合物la-2活性药     2.9     1.7     3279
    化合物la-2活性药     2.8     4     374
本发明的结果非常出人意料，具体地说是根据以下事实。由于内皮素转化酶-1(ECE-1)已在1994年克隆，该酶通常以负责big-ET-1向ET-1的生理转化的肽链内切酶接受。然而，尽管ECE-1具有切割big-ET-1的能力的事实，最近报道对ECE-1是否是唯一的生理相关的内皮素转化酶产生了怀疑，或者至少争论在生产ET-1时必需涉及其它酶。发现该IGS5蛋白质是与NEP高度相似(54％同一性)的金属蛋白酶，并且与ECE-1或多或少较低的相似性(39％同一性)。为了通过实施例4的试验表征该新型金属蛋白酶的酶促性能，寻找潜在底物并且发现物质P、缓激肽、big-ET-1和效率较低的ANP、血管紧张素I和ET-1被IGS5切割。IGS5的该酶促活性在中性pH(7.0-7.5)最佳。应注意的是big-ET-1被IGS5蛋白水解导致正确地形成ET-1。
通过本实施例7的试验，使用标记的荧光big-ET-1类似物作为底物，测定了金属蛋白酶抑制剂经IGS5抑制big-ET向ET-1转化的效力。应关注已知在体内抑制big-ET向ET-1转化的膦酰二肽，在我们的生物化学试验中也高效地抑制(大大高于ECE-1)。相反，选择性NEP抑制剂thiorphan以及来自Sumitomo的选择性ECE-1抑制剂SM-19712不影响IGS5的活性。
因此具有式I的化合物，特别是分别具有式Ia或Ib，出人意料地显示联合或同时的NEP/IGS5-抑制活性。作为式Ia化合物的代表性实例化合物Ia-2和式Ib化合物的代表性实例化合物Ib-8，已在本实施例7的试验中进行了研究。这两种化合物证实是最近鉴定的IGS5金属蛋白酶的非常有效的抑制剂(IC50＝1.2和2.9nM)。
                                 序列表
<110>SOLVAY医药GmbH
<120>具有结合NEP/MP-抑制物活性的化合物在制备药物中的用途
<130>HA 00.17-WO
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2076
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2073)
<400>1
tgc acc acc cct ggc tgc gtg ata gca gct gcc agg atc ctc cag aac  48
Cys Thr Thr Pro Gly Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn
  1               5                  10                  15
atg gac ccg acc acg gaa ccg tgt gac gac ttc tac cag ttt gca tgc  96
Met Asp Pro Thr Thr Glu Pro Cys Asp Asp Phe Tyr Gln Phe Ala Cys
             20                  25                  30
gga ggc tgg ctg cgg cgc cac gtg atc cct gag acc aac tca aga tac  144
Gly Gly Trp Leu Arg Arg His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr
         35                  40                  45
agc atc ttt gac gtc ctc cgc gac gag ctg gag gtc atc ctc aaa gcg  192
Ser Ile Phe Asp Val Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Ala
     50                  55                  60
gtg ctg gag aat tcg act gcc aag gac cgg ccg gct gtg gag aag gcc  240
Val Leu Glu Asn Ser Thr Ala Lys Asp Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala
 65                  70                  75                  80
agg acg ctg tac cgc tcc tgc atg aac cag agt gtg ata gag aag cga   288
Arg Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg
                 85                  90                  95
ggc tct cag ccc ctg ctg gac atc ttg gag gtg gtg gga ggc tgg ccg   336
Gly Ser Gln Pro Leu Leu Asp Ile Leu Glu Val Val Gly Gly Trp Pro
            100                 105                 110
gtg gcg atg gac agg tgg aac gag acc gta gga ctc gag tgg gag ctg   384
Val Ala Met Asp Arg Trp Asn Glu Thr Val Gly Leu Glu Trp Glu Leu
        115                 120                 125
gag cgg cag ctg gcg ctg atg aac tca cag ttc aac agg cgc gtc ctc   432
Glu Arg Gln Leu Ala Leu Met Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu
    130                 135                 140
atc gac ctc ttc atc tgg aac gac gac cag aac tcc agc cgg cac atc   480
Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser Ser Arg His Ile
145                 150                 155                 160
atc tac ata gac cag ccc acc ttg ggc atg ccc tcc cga gag tac tac   528
Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr
                165                 170                 175
ttc aac ggc ggc agc aac cgg aag gtg cgg gaa gcc tac ctg cag ttc   576
Phe Asn Gly Gly Ser Asn Arg Lys Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe
            180                 185                 190
atg gtg tca gtg gcc acg ttg ctg cgg gag gat gca aac ctg ccc agg   624
Met Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Arg Glu Asp Ala Asn Leu Pro Arg
        195                 200                 205
gac agc tgc ctg gtg cag gag gac atg atg cag gtg ctg gag ctg gag   672
Asp Ser Cys Leu Val Gln Glu Asp Met Met Gln Val Leu Glu Leu Glu
    210                 215                 220
aca cag ctg gcc aag gcc acg gta ccc cag gag gag aga cac gac gtc   720
Thr Gln Leu Ala Lys Ala Thr Val Pro Gln Glu Glu Arg His Asp Val
225                 230                 235                 240
atc gcc ttg tac cac cgg atg gga ctg gag gag ctg caa agc cag ttt   768
Ile Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Ser Gln Phe
                245                 250                 255
ggc ctg aag gga ttt aac tgg act ctg ttc ata caa act gtg cta tcc   816
Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Thr Val Leu Ser
            260                 265                 270
tct gtc aaa atc aag ctg ctg cca gat gag gaa gtg gtg gtc tat ggc   864
Ser Val Lys Ile Lys Leu Leu Pro Asp Glu Glu Val Val Val Tyr Gly
        275                 280                 285
atc ccc tac ctg cag aac ctt gaa aac atc atc gac acc tac tca gcc   912
Ile Pro Tyr Leu Gln Asn Leu Glu Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ser Ala
    290                 295                 300
agg acc ata cag aac tac ctg gtc tgg cgc ctg gtg ctg gac cgc att   960
Arg Thr Ile Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile
305                 310                 315                 320
ggt agc cta agc cag aga ttc aag gac aca cga gtg aac tac cgc aag   1008
Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Asp Thr Arg Val Asn Tyr Arg Lys
                325                 330                 335
gcg ctg ttt ggc aca atg gtg gag gag gtg cgc tgg cgt gaa tgt gtg   1056
Ala Leu Phe Gly Thr Met Val Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val
            340                 345                 350
ggc tac gtc aac agc aac atg gag aac gcc gtg ggc tcc ctc tac gtc   1104
Gly Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Ser Leu Tyr Val
        355                 360                 365
agg gag gcg ttc cct gga gac agc aag agc atg gtc aga gaa ctc att   1152
Arg Glu Ala Phe Pro Gly Asp Ser Lys Ser Met Val Arg Glu Leu Ile
    370                 375                 380
gac aag gtg cgg aca gtg ttt gtg gag acg ctg gac gag ctg ggc tgg   1200
Asp Lys Val Arg Thr Val Phe Val Glu Thr Leu Asp Glu Leu Gly Trp
385                 390                 395                 400
atg gac gag gag tcc aag aag aag gcg cag gag aag gcc atg agc atc   1248
Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Met Ser Ile
                405                 410                 415
cgg gag cag atc ggg cac cct gac tac atc ctg gag gag atg aac agg   1296
Arg Glu Gln Ile Gly His Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg
            420                 425                 430
cgc ctg gac gag gag tac tcc aat ctg aac ttc tca gag gac ctg tac   1344
Arg Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Asn Leu Asn Phe Ser Glu Asp Leu Tyr
        435                 440                 445
ttt gag aac agt ctg cag aac ctc aag gtg ggc gcc cag cgg agc ctc   1392
Phe Glu Asn Ser Leu Gln Asn Leu Lys Val Gly Ala Gln Arg Ser Leu
    450                 455                 460
agg aag ctt cgg gaa aag gtg gac cca aat ctc tgg atc atc ggg gcg   1440
Arg Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Pro Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala
465                 470                 475                 480
gcg gtg gtc aat gcg ttc tac tcc cca aac cga aac cag att gta ttc   1488
Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ile Val Phe
                485                 490                 495
cct gcc ggg atc ctc cag ccc ccc ttc ttc agc aag gag cag cca cag   1536
Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Glu Gln Pro Gln
            500                 505                 510
gcc ttg aac ttt gga ggc att ggg atg gtg atc ggg cac gag atc acg   1584
Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr
        515                 520                 525
cac ggc ttt gac gac aat ggc cgg aac ttc gac aag aat ggc aac atg   1632
His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met
    530                 535                 540
atg gat tgg tgg agt aac ttc tcc acc cag cac ttc cgg gag cag tca   1680
Met Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser
545                 550                 555                 560
gag tgc atg atc tac cag tac ggc aac tac tcc tgg gac ctg gca gac   1728
Glu Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Gly Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp
                565                 570                 575
gaa cag aac gtg aac gga ttc aac acc ctt ggg gaa aac att gct gac   1776
Glu Gln Asn Val Asn Gly Phe Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp
            580                 585                 590
aac gga ggg gtg cgg caa gcc tat aag gcc tac ctc aag tgg atg gca   1824
Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala
        595                 600                 605
gag ggt ggc aag gac cag cag ctg ccc ggc ctg gat ctc acc cat gag   1872
Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gln Leu Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu
    610                 615                 620
cag ctc ttc ttc atc aac tac gcc cag gtg tgg tgc ggg tcc tac cgg  1920
Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg
625                 630                 635                 640
ccc gag ttc gcc atc caa tcc atc aag aca gac gtc cac agt ccc ctg  1968
Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu
                645                 650                 655
aag tac agg gta ctg ggg tcg ctg cag aac ctg gcc gcc ttc gca gac  2016
Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Ala Ala Phe Ala Asp
            660                 665                 670
acg ttc cac tgt gcc cgg ggc acc ccc atg cac ccc aag gag cga tgc  2064
Thr Phe His Cys Ala Arg Gly Thr Pro Met His Pro Lys Glu Arg Cys
        675                 680                 685
cgc gtg tgg tag                                                  2076
Arg Val Trp
    690
<210>2
<211>691
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Cys Thr Thr Pro Gly Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn
  1               5                  10                  15
Met Asp Pro Thr Thr Glu Pro Cys Asp Asp Phe Tyr Gln Phe Ala Cys
             20                  25                  30
Gly Gly Trp Leu Arg Arg His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr
         35                  40                  45
Ser Ile Phe Asp Val Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Ala
     50                  55                  60
Val Leu Glu Asn Ser Thr Ala Lys Asp Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala
 65                  70                  75                  80
Arg Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg
                 85                  90                  95
Gly Ser Gln Pro Leu Leu Asp Ile Leu Glu Val Val Gly Gly Trp Pro
            100                 105                 110
Val Ala Met Asp Arg Trp Asn Glu Thr Val Gly Leu Glu Trp Glu Leu
        115                 120                 125
Glu Arg Gln Leu Ala Leu Met Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu
    130                 135                 140
Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser Ser Arg His Ile
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr
                165                 170                 175
Phe Asn Gly Gly Ser Asn Arg Lys Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe
            180                 185                 190
Met Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Arg Glu Asp Ala Asn Leu Pro Arg
        195                 200                 205
Asp Ser Cys Leu Val Gln Glu Asp Met Met Gln Val Leu Glu Leu Glu
    210                 215                 220
Thr Gln Leu Ala Lys Ala Thr Val Pro Gln Glu Glu Arg His Asp Val
225                 230                 235                 240
Ile Ala Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Ser Gln Phe
                245                 250                 255
Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Thr Val Leu Ser
            260                 265                 270
Ser Val Lys Ile Lys Leu Leu Pro Asp Glu Glu Val Val Val Tyr Gly
        275                 280                 285
Ile Pro Tyr Leu Gln Asn Leu Glu Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ser Ala
    290                 295                 300
Arg Thr Ile Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile
305                 310                 315                 320
Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys Asp Thr Arg Val Asn Tyr Arg Lys
                325                 330                 335
Ala Leu Phe Gly Thr Met Val Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val
            340                 345                 350
Gly Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Ser Leu Tyr Val
        355                 360                 365
Arg Glu Ala Phe Pro Gly Asp Ser Lys Ser Met Val Arg Glu Leu Ile
    370                 375                 380
Asp Lys Val Arg Thr Val Phe Val Glu Thr Leu Asp Glu Leu Gly Trp
385                 390                 395                 400
Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Met Ser Ile
                405                 410                 415
Arg Glu Gln Ile Gly His Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg
            420                 425                 430
Arg Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Asn Leu Asn Phe Ser Glu Asp Leu Tyr
        435                 440                 445
Phe Glu Asn Ser Leu Gln Asn Leu Lys Val Gly Ala Gln Arg Ser Leu
    450                 455                 460
Arg Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp Pro Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala
465                 470                 475                 480
Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ile Val Phe
                485                 490                 495
Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Glu Gln Pro Gln
            500                 505                 510
Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr
        515                 520                 525
His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met
    530                 535                 540
Met Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser
545                 550                 555                 560
Glu Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Gly Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp
                565                 570                 575
Glu Gln Asn Val Asn Gly Phe Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp
            580                 585                 590
Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala
        595                 600                 605
Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gln Leu Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu
    610                 615                 620
Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg
625                 630                 635                 640
Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu
                645                 650                 655
Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Ala Ala Phe Ala Asp
            660                 665                 670
Thr Phe His Cys Ala Arg Gly Thr Pro Met His Pro Lys Glu Arg Cys
        675                 680                 685
Arg Val Trp
    690
<210>3
<211>2340
<212>DNA
<213>智人
<220>
<22l>CDS
<222>(1)..(2337)
<400>3
atg ggg aag tcc gaa ggc ccc gtg ggg atg gtg gag agc gct ggc cgt  48
Met Gly Lys Ser Glu Gly Pro Val Gly Met Val Glu Ser Ala Gly Arg
  1               5                  10                  15
gca ggg cag aag cgc ccg ggg ttc ctg gag ggg ggg ctg ctg ctg ctg  96
Ala Gly Gln Lys Arg Pro Gly Phe Leu Glu Gly Gly Leu Leu Leu Leu
             20                  25                  30
ctg ctg ctg gtg acc gct gcc crg gtg gcc ttg ggt gtc ctc tac gcc  144
Leu Leu Leu Val Thr Ala Ala Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Tyr Ala
         35                  40                  45
gac cgc aga ggg aag cag ctg cca cgc ctt gct agc cgg ctg tgc ttc   192
Asp Arg Arg Gly Lys Gln Leu Pro Arg Leu Ala Ser Arg Leu Cys Phe
     50                  55                  60
tta cag gag gag agg acc ttt gta aaa cga aaa ccc cga ggg atc cca   240
Leu Gln Glu Glu Arg Thr Phe Val Lys Arg Lys Pro Arg Gly Ile Pro
 65                  70                  75                  80
gag gcc caa gag gtg agc gag gtc tgc acc acc cct ggc tgc gtg ata   288
Glu Ala Gln Glu Val Ser Glu Val Cys Thr Thr Pro Gly Cys Val Ile
                 85                  90                  95
gca gct gcc agg atc ctc cag aac atg gac ccg acc acg gaa ccg tgt   336
Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn Met Asp Pro Thr Thr Glu Pro Cys
            100                 105                 110
gac gac ttc tac cag ttt gca tgc gga ggc tgg ctg cgg cgc cac gtg   384
Asp Asp Phe Tyr Gln Phe Ala Cys Gly Gly Trp Leu Arg Arg His Val
        115                 120                 125
arc cct gag acc aac tca aga tac agc atc ttt gac gtc ctc cgc gac   432
Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr Ser Ile Phe Asp Val Leu Arg Asp
    130                 135                 140
gag ctg gag gtc atc ctc aaa gcg gtg ctg gag aat tcg act gcc aag   480
Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Ala Val Leu Glu Asn Ser Thr Ala Lys
145                 150                 155                 160
gac cgg ccg gct gtg gag aag gcc agg acg ctg tac cgc tcc tgc atg   528
Asp Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala Arg Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met
                165                 170                 175
aac cag agt gtg ata gag aag cga ggc tct cag ccc ctg ctg gac atc   576
Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg Gly Ser Gln Pro Leu Leu Asp Ile
            180                 185                 190
ttg gag gtg gtg gga ggc tgg ccg gtg gcg atg gac agg tgg aac gag   624
Leu Glu Val Val Gly Gly Trp Pro Val Ala Met Asp Arg Trp Asn Glu
        195                 200                 205
acc gta gga ctc gag tgg gag ctg gag cgg cag ctg gcg ctg atg aac   672
Thr Val Gly Leu Glu Trp Glu Leu Glu Arg Gln Leu Ala Leu Met Asn
    210                 215                 220
tca cag ttc aac agg cgc gtc ctc atc gac ctc ttc atc tgg aac gac   720
Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp
225                 230                 235                 240
gac cag aac tcc agc cgg cac atc atc tac ata gac cag ccc acc ttg   768
Asp Gln Asn Ser Ser Arg His Ile Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu
                245                 250                 255
ggc atg ccc tcc cga gag tac tac ttc aac ggc ggc agc aac cgg aag   816
Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Gly Gly Ser Asn Arg Lys
            260                 265                 270
gtg cgg gaa gcc tac ctg cag ttc atg gtg tca gtg gcc acg ttg ctg   864
Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe Met Val Ser Val Ala Thr Leu Leu
        275                 280                 285
cgg gag gat gca aac ctg ccc agg gac agc tgc ctg gtg cag gag gac   912
Arg Glu Asp Ala Asn Leu Pro Arg Asp Ser Cys Leu Val Gln Glu Asp
    290                 295                 300
atg atg cag gtg ctg gag ctg gag aca cag ctg gcc aag gcc acg gta   960
Met Met Gln Val Leu Glu Leu Glu Thr Gln Leu Ala Lys Ala Thr Val
305                 310                 315                 320
ccc cag gag gag aga cac gac gtc atc gcc ttg tac cac cgg atg gga   1008
Pro Gln Glu Glu Arg His Asp Val Ile Ala Leu Tyr His Arg Met Gly
                325                 330                 335
ctg gag gag ctg caa agc cag ttt ggc ctg aag gga ttt aac tgg act   1056
Leu Glu Glu Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr
            340                 345                 350
ctg ttc ata caa act gtg cta tcc tct gtc aaa atc aag ctg ctg cca   1104
Leu Phe Ile Gln Thr Val Leu Ser Ser Val Lys Ile Lys Leu Leu Pro
        355                 360                 365
gat gag gaa gtg gtg gtc tat ggc atc ccc tac ctg cag aac ctt gaa   1152
Asp Glu Glu Val Val Val Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Gln Asn Leu Glu
    370                 375                 380
aac atc atc gac acc tac tca gcc agg acc ata cag aac tac ctg gtc   1200
Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ser Ala Arg Thr Ile Gln Asn Tyr Leu Val
385                 390                 395                 400
tgg cgc ctg gtg ctg gac cgc att ggt agc cta agc cag aga ttc aag   1248
Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys
                405                 410                 415
gac aca cga gtg aac tac cgc aag gcg ctg ttt ggc aca atg gtg gag   1296
Asp Thr Arg Val Asn Tyr Arg Lys Ala Leu Phe Gly Thr Met Val Glu
            420                 425                 430
gag gtg cgc tgg cgt gaa tgt gtg ggc tac gtc aac agc aac atg gag   1344
Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val Gly Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu
        435                 440                 445
aac gcc gtg ggc tcc ctc tac gtc agg gag gcg ttc cct gga gac agc   1392
Asn Ala Val Gly Ser Leu Tyr Val Arg Glu Ala Phe Pro Gly Asp Ser
    450                 455                 460
aag agc atg gtc aga gaa ctc att gac aag gtg cgg aca gtg ttt gtg   1440
Lys Ser Met Val Arg Glu Leu Ile Asp Lys Val Arg Thr Val Phe Val
465                 470                 475                 480
gag acg ctg gac gag ctg ggc tgg atg gac gag gag tcc aag aag aag   1488
Glu Thr Leu Asp Glu Leu Gly Trp Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys
                485                 490                 495
gcg cag gag aag gcc atg agc atc cgg gag cag atc ggg cac cct gac   1536
Ala Gln Glu Lys Ala Met Ser Ile Arg Glu Gln Ile Gly His Pro Asp
            500                 505                 510
tac atc ctg gag gag atg aac agg cgc ctg gac gag gag tac tcc aat   1584
Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg Arg Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Asn
        515                 520                 525
ctg aac ttc tca gag gac ctg tac ttt gag aac agt ctg cag aac ctc   1632
Leu Asn Phe Ser Glu Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ser Leu Gln Asn Leu
    530                 535                 540
aag gtg ggc gcc cag cgg agc ctc agg aag ctt cgg gaa aag gtg gac   1680
Lys Val Gly Ala Gln Arg Ser Leu Arg Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp
545                 550                 555                 560
cca aat ctc tgg atc atc ggg gcg gcg gtg gtc aat gcg ttc tac tcc   1728
Pro Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser
                565                 570                 575
cca aac cga aac cag att gta ttc cct gcc ggg atc ctc cag ccc ccc   1776
Pro Asn Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro
            580                 585                 590
ttc ttc agc aag gag cag cca cag gcc ttg aac ttt gga ggc att ggg   1824
Phe Phe Ser Lys Glu Gln Pro Gln Ala Leu Asn Phe Gly Gly IIe Gly
        595                 600                 605
atg gtg atc ggg cac gag atc acg cac ggc ttt gac gac aat ggc cgg   1872
Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg
    610                 615                 620
aac ttc gac aag aat ggc aac atg atg gat tgg tgg agt aac ttc tcc   1920
Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met Met Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser
625                 630                 635                 640
acc cag cac ttc cgg gag cag tca gag tgc atg atc tac cag tac ggc   1968
Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser Glu Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Gly
                645                 650                 655
aac tac tcc tgg gac ctg gca gac gaa cag aac gtg aac gga ttc aac   2016
Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp Glu Gln Asn Val Asn Gly Phe Asn
            660                 665                 670
acc ctt ggg gaa aac att gct gac aac gga ggg gtg cgg caa gcc tat   2064
Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr
        675                 680                 685
aag gcc tac ctc aag tgg atg gca gag ggt ggc aag gac cag cag ctg   2112
Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gln Leu
    690                 695                 700
ccc ggc ctg gat ctc acc cat gag cag ctc ttc ttc atc aac tac gcc   2160
Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala
705                 710                 715                 720
cag gtg tgg tgc ggg tcc tac cgg ccc gag ttc gcc atc caa tcc atc   2208
Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile
                725                 730                 735
aag aca gac gtc cac agt ccc ctg aag tac agg gta ctg ggg tcg ctg   2256
Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu
            740                 745                 750
cag aac ctg gcc gcc ttc gca gac acg ttc cac tgt gcc cgg ggc acc   2304
Gln Asn Leu Ala Ala Phe Ala Asp Thr Phe His Cys Ala Arg Gly Thr
        755                 760                 765
ccc atg cac ccc aag gag cga tgc cgc gtg tgg tag                   2340
Pro Met His Pro Lys Glu Arg Cys Arg Val Trp
    770                 775
<210>4
<211>779
<212>PRT
<213>现代人
<400>4
Met Gly Lys Ser Glu Gly Pro Val Gly Met Val Glu Ser Ala Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ala Gly Gln Lys Arg Pro Gly Phe Leu Glu Gly Gly Leu Leu Leu Leu
             20                  25                  30
Leu Leu Leu Val Thr Ala Ala Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Tyr Ala
         35                  40                  45
Asp Arg Arg Gly Lys Gln Leu Pro Arg Leu Ala Ser Arg Leu Cys Phe
     50                  55                  60
Leu Gln Glu Glu Arg Thr Phe Val Lys Arg Lys Pro Arg Gly Ile Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Gln Glu Val Ser Glu Val Cys Thr Thr Pro Gly Cys Val Ile
                 85                  90                  95
Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn Met Asp Pro Thr Thr Glu Pro Cys
            100                 105                 110
Asp Asp Phe Tyr Gln Phe Ala Cys Gly Gly Trp Leu Arg Arg His Val
        115                 120                 125
Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr Ser Ile Phe Asp Val Leu Arg Asp
    130                 135                 140
Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Ala Val Leu Glu Asn Ser Thr Ala Lys
145                 150                 155                 160
Asp Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala Arg Thr Leu Tyr Arg Ser Cys Met
                I65                 170                 175
Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg Gly Ser Gln Pro Leu Leu Asp Ile
            180                 185                 190
Leu Glu Val ValGly Gly Trp Pro Val Ala Met Asp Arg Trp Asn Glu
        195                200                 205
Thr Val Gly Leu Glu Trp Glu Leu Glu Arg Gln Leu Ala Leu Met Asn
    210                 215                 220
Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu Ile Asp Leu Phe Ile Trp Asn Asp
225                 230                 235                 240
Asp Gln Asn Ser Ser Arg His Ile Ile Tyr Ile Asp Gln Pro Thr Leu
                245                 250                 255
Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Gly Gly Ser Asn Arg Lys
            260                 265                 270
Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe Met Val Ser Val Ala Thr Leu Leu
        275                 280                 285
Arg Glu Asp Ala Asn Leu Pro Arg Asp Ser Cys Leu Val Gln Glu Asp
    290                 295                 300
Met Met Gln Val Leu Glu Leu Glu Thr Gln Leu Ala Lys Ala Thr Val
305                 310                 315                 320
Pro Gln Glu Glu Arg His Asp Val Ile Ala Leu Tyr His Arg Met Gly
                325                 330                 335
Leu Glu Glu Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu Lys Gly Phe Asn Trp Thr
            340                 345                 350
Leu Phe Ile Gln Thr Val Leu Ser Ser Val Lys Ile Lys Leu Leu Pro
        355                 360                 365
Asp Glu Glu Val Val Val Tyr Gly Ile Pro Tyr Leu Gln Asn Leu Glu
    370                 375                 380
Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ser Ala Arg Thr Ile Gln Asn Tyr Leu Val
385                 390                 395                 400
Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile Gly Ser Leu Ser Gln Arg Phe Lys
                405                 410                 415
Asp Thr Arg Val Asn Tyr Arg Lys Ala Leu Phe Gly Thr Met Val Glu
            420                 425                 430
Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val Gly Tyr Val Asn Ser Asn Met Glu
        435                 440                 445
Asn Ala Val Gly Ser Leu Tyr Val Arg Glu Ala Phe Pro Gly Asp Ser
    450                 455                 460
Lys Ser Met Val Arg Glu Leu Ile Asp Lys Val Arg Thr Val Phe Val
465                 470                 475                 480
Glu Thr Leu Asp Glu Leu Gly Trp Met Asp Glu Glu Ser Lys Lys Lys
                485                 490                 495
Ala Gln Glu Lys Ala Met Ser Ile Arg Glu Gln Ile Gly His Pro Asp
            500                 505                 510
Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg Arg Leu Asp Glu Glu Tyr Ser Asn
        515                 520                 525
Leu Asn Phe Ser Glu Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ser Leu Gln Asn Leu
    530                 535                 540
Lys Val Gly Ala Gln Arg Ser Leu Arg Lys Leu Arg Glu Lys Val Asp
545                 550                 555                 560
Pro Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala Ala Val Val Asn Ala Phe Tyr Ser
                565                 570                 575
Pro Asn Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gln Pro Pro
            580                 585                 590
Phe Phe Ser Lys Glu Gln Pro Gln Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly
        595                 600                 605
Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp Asn Gly Arg
    610                 615                 620
Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met Met Asp Trp Trp Ser Asn Phe Ser
625                 630                 635                 640
Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser Glu Cys Met Ile Tyr Gln Tyr Gly
                645                 650                 655
Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp Glu Gln Asn Val Asn Gly Phe Asn
            660                 665                 670
Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Val Arg Gln Ala Tyr
        675                 680                 685
Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala Glu Gly Gly Lys Asp Gln Gln Leu
    690                 695                 700
Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu Gln Leu Phe Phe Ile Asn Tyr Ala
705                 710                 715                 720
Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg Pro Glu Phe Ala Ile Gln Ser Ile
                725                 730                 735
Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu Lys Tyr Arg Val Leu Gly Ser Leu
            740                 745                 750
Gln Asn Leu Ala Ala Phe Ala Asp Thr Phe His Cys Ala Arg Gly Thr
        755                 760                 765
Pro Met Hi s Pro Lys Glu Arg Cys Arg Val Trp
    770                  775
<210>5
<211>2262
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2259)
<400>5
atg ggg aag tcc gaa ggc cca gtg ggg atg gtg gag agc gcc ggc cgt  48
Met Gly Lys Ser Glu Gly Pro Val Gly Met Val Glu Ser Ala Gly Arg
  1               5                  10                  15
gca ggg cag aag cgc ccg ggg ttc ctg gag ggg ggg ctg ctg ctg ctg  96
Ala Gly Gln Lys Arg Pro Gly Phe Leu Glu Gly Gly Leu Leu Leu Leu
             20                  25                  30
ctg ctg ctg gtg acc gct gcc ctg gtg gcc ttg ggt gtc ctc tac gcc   144
Leu Leu Leu Val Thr Ala Ala Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Tyr Ala
         35                  40                  45
gac cgc aga ggg atc cca gag gcc caa gag gtg agc gag gtc tgc acc   192
Asp Arg Arg Gly Ile Pro Glu Ala Gln Glu Val Ser Glu Val Cys Thr
     50                  55                  60
acc cct ggc tgc gtg ata gca gct gcc agg atc ctc cag aac atg gac   240
Thr Pro Gly Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn Met Asp
 65                  70                  75                  80
ccg acc acg gaa ccg tgt gac gac ttc tac cag ttt gca tgc gga ggc   288
Pro Thr Thr Glu Pro Cys Asp Asp Phe Tyr Gln Phe Ala Cys Gly Gly
                 85                  90                  95
tgg ctg cgg cgc cac gtg atc cct gag acc aac tca aga tac agc atc   336
Trp Leu Arg Arg His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr Ser Ile
            100                 105                 110
ttt gac gtc ctc cgc gac gag ctg gag gtc atc ctc aaa gcg gtg ctg   384
Phe Asp Val Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Ala Val Leu
        115                 120                 125
gag aat tcg act gcc aag gac cgg ccg gct gtg gag aag gcc agg acg   432
Glu Asn Ser Thr Ala Lys Asp Arg Pro Ma Val Glu Lys Ala Arg Thr
    130                 135                140
ctg tac cgc tcc tgc atg aac cag agt gtg ata gag aag cga ggc tct   480
Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg Gly Ser
145                 150                 155                 160
cag ccc ctg ctg gac atc ttg gag gtg gtg gga ggc tgg ccg gtg gcg   528
Gln Pro Leu Leu Asp Ile Leu Glu Val Val Gly Gly Trp Pro Val Ala
                165                 170                 175
atg gac agg tgg aac gag acc gta gga ctc gag tgg gag ctg gag cgg   576
Met Asp Arg Trp Asn Glu Thr Val Gly Leu Glu Trp Glu Leu Glu Arg
            180                 185                 190
cag ctg gcg ctg atg aac tca cag ttc aac agg cgc gtc ctc atc gac   624
Gln Leu Ala Leu Met Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu Ile Asp
        195                 200                 205
ctc ttc atc tgg aac gac gac cag aac tcc agc cgg cac atc atc tac   672
Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser Ser Arg His Ile Ile Tyr
    210                 215                 220
ata gac cag ccc acc ttg ggc atg ccc tcc cga gag tac tac ttc aac   720
Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn
225                 230                 235                 240
ggc ggc agc aac cgg aag gtg cgg gaa gcc tac ctg cag ttc atg gtg   768
Gly Gly Ser Asn Arg Lys Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe Met Val
                245                 250                 255
tca gtg gcc acg ttg ctg cgg gag gat gca aac ctg ccc agg gac agc   816
Ser Val Ala Thr Leu Leu Arg Glu Asp Ala Asn Leu Pro Arg Asp Ser
            260                 265                 270
tgc ctg gtg cag gag gac atg atg cag gtg ctg gag ctg gag aca cag   864
Cys Leu Val Gln Glu Asp Met Met Gln Val Leu Glu Leu Glu Thr Gln
        275                 280                 285
ctg gcc aag gcc acg gta ccc cag gag gag aga cac gac gtc atc gcc   912
Leu Ala Lys Ala Thr Val Pro Gln Glu Glu Arg His Asp Val Ile Ala
    290                 295                 300
ttg tac cac cgg atg gga ctg gag gag ctg caa agc cag ttt ggc ctg   960
Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu
305                 310                 315                 320
aag gga ttt aac tgg act ctg ttc ata caa act gtg cta tcc tct gtc   1008
Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Thr Val Leu Ser Ser Val
                325                 330                 335
aaa atc aag ctg ctg cca gat gag gaa gtg gtg gtc tat ggc atc ccc   1056
Lys Ile Lys Leu Leu Pro Asp Glu Glu Val Val Val Tyr Gly Ile Pro
            340                 345                 350
tac ctg cag aac ctt gaa aac atc atc gac acc tac tca gcc agg acc   1104
Tyr Leu Gln Asn Leu Glu Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ser Ala Arg Thr
        355                 360                 365
ata cag aac tac ctg gtc tgg cgc ctg gtg ctg gac cgc att ggt agc   1152
Ile Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile Gly Ser
    370                 375                 380
cta agc cag aga ttc aag gac aca cga gtg aac tac cgc aag gcg ctg   1200
Leu Ser Gln Arg Phe Lys Asp Thr Arg Val Asn Tyr Arg Lys Ala Leu
385                 390                 395                 400
ttt ggc aca atg gtg gag gag gtg cgc tgg cgt gaa tgt gtg ggc tac   1248
Phe Gly Thr Met Val Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val Gly Tyr
                405                 410                 415
gtc aac agc aac atg gag aac gcc gtg ggc tcc ctc tac gtc agg gag   1296
Val Asn Ser Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Ser Leu Tyr Val Arg Glu
            420                 425                 430
gcg ttc cct gga gac agc aag agc atg gtc aga gaa crc att gac aag   1344
Ala Phe Pro Gly Asp Ser Lys Ser Met Val Arg Glu Leu Ile Asp Lys
        435                 440                 445
gtg cgg aca gtg ttt gtg gag acg ctg gac gag ctg ggc tgg atg gac   1392
Val Arg Thr Val Phe Val Glu Thr Leu Asp Glu Leu Gly Trp Met Asp
    450                 455                 460
gag gag tcc aag aag aag gcg cag gag aag gcc atg agc atc cgg gag   1440
Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Met Ser Ile Arg Glu
465                 470                 475                 480
cag atc ggg cac cct gac tac atc ctg gag gag atg aac agg cgc ctg   1488
Gln Ile Gly His Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg Arg Leu
                485                 490                 495
gac gag gag tac tcc aat ctg aac ttc tca gag gac ctg tac ttt gag   1536
Asp Glu Glu Tyr Ser Asn Leu Asn Phe Ser Glu Asp Leu Tyr Phe Glu
            500                 505                 510
aac agt ctg cag aac ctc aag gtg ggc gcc cag cgg agc ctc agg aag   1584
Asn Ser Leu Gln Asn Leu Lys Val Gly Ala Gln Arg Ser Leu Arg Lys
        515                 520                 525
ctt cgg gaa aag gtg gac cca aat ctc tgg atc atc ggg gcg gcg gtg   1632
Leu Arg Glu Lys Val Asp Pro Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala Ala Val
    530                 535                 540
gtc aat gcg ttc tac tcc cca aac cga aac cag att gta ttc cct gcc   1680
Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala
545                 550                 555                 560
ggg atc ctc cag ccc ccc ttc ttc agc aag gag cag cca cag gcc ttg   1728
Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Glu Gln Pro Gln Ala Leu
                565                 570                 575
aac ttt gga ggc att ggg atg gtg atc ggg cac gag atc acg cac ggc   1776
Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly
            580                 585                 590
ttt gac gac aat ggc cgg aac ttc gac aag aat ggc aac atg atg gat   1824
Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met Met Asp
        595                 600                 605
tgg tgg agt aac ttc tcc acc cag cac ttc cgg gag cag tca gag tgc   1872
Trp Trp Ser Asn Phe Ser Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser Glu Cys
    610                 615                 620
atg atc tac cag tac ggc aac tac tcc tgg gac ctg gca gac gaa cag   1920
Met Ile Tyr Gln Tyr Gly Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp Glu Gln
625                 630                 635                 640
aac gtg aac gga ttc aac acc ctt ggg gaa aac att gct gac aac gga   1968
Asn Val Asn Gly Phe Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly
                645                 650                 655
ggg gtg cgg caa gcc tat aag gcc tac ctc aag tgg atg gca gag ggt   2016
Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala Glu Gly
            660                 665                 670
ggc aag gac cag cag ctg ccc ggc ctg gat ctc acc cat gag cag ctc   2064
Gly Lys Asp Gln Gln Leu Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu Gln Leu
        675                 680                 685
ttc ttc atc aac tac gcc cag gtg tgg tgc ggg tcc tac cgg ccc gag   2112
Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln Val Trp Cys Gly Ser Tyr Arg Pro Glu
    690                 695                 700
ttc gcc atc caa tcc atc aag aca gac gtc cac agt ccc ctg aag tac   2160
Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu Lys Tyr
705                 710                 715                 720
agg gta ctg ggg tcg ctg cag aac ctg gcc gcc ttc gca gac acg ttc   2208
Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Ala Ala Phe Ala Asp Thr Phe
                725                 730                 735
cac tgt gcc cgg ggc acc ccc atg cac ccc aag gag cga tgc cgc gtg   2256
His Cys Ala Arg Gly Thr Pro Met His Pro Lys Glu Arg Cys Arg Val
            740                 745                 750
tgg tag                                                           2262
Trp
<210>6
<211>753
<212>PRT
<213>现代人
<400>6
Met Gly Lys Ser Glu Gly Pro Val Gly Met Val Glu Ser Ala Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ala Gly Gln Lys Arg Pro Gly Phe Leu Glu Gly Gly Leu Leu Leu Leu
             20                  25                  30
Leu Leu Leu Val Thr Ala Ala Leu Val Ala Leu Gly Val Leu Tyr Ala
         35                  40                  45
Asp Arg Arg Gly Ile Pro Glu Ala Gln Glu Val Ser Glu Val Cys Thr
     50                  55                  60
Thr Pro Gly Cys Val Ile Ala Ala Ala Arg Ile Leu Gln Asn Met Asp
 65                  70                  75                  80
Pro Thr Thr Glu Pro Cys Asp Asp Phe Tyr Gln Phe Ala Cys Gly Gly
                 85                  90                  95
Trp Leu Arg Arg His Val Ile Pro Glu Thr Asn Ser Arg Tyr Ser Ile
            100                 105                 110
Phe Asp Val Leu Arg Asp Glu Leu Glu Val Ile Leu Lys Ala Val Leu
        115                 120                 125
Glu Asn Ser Thr Ala Lys Asp Arg Pro Ala Val Glu Lys Ala Arg Thr
    130                  135                  140
Leu Tyr Arg Ser Cys Met Asn Gln Ser Val Ile Glu Lys Arg Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gln Pro Leu Leu Asp Ile Leu Glu Val Val Gly Gly Trp Pro Val Ala
                165                 170                 175
Met Asp Arg Trp Asn Glu Thr Val Gly Leu Glu Trp Glu Leu Glu Arg
            180                 185                 190
Gln Leu Ala Leu Met Asn Ser Gln Phe Asn Arg Arg Val Leu Ile Asp
        195                 200                 205
Leu Phe Ile Trp Asn Asp Asp Gln Asn Ser Ser Arg His Ile Ile Tyr
    210                 215                 220
Ile Asp Gln Pro Thr Leu Gly Met Pro Ser Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn
225                 230                 235                 240
Gly Gly Ser Asn Arg Lys Val Arg Glu Ala Tyr Leu Gln Phe Met Val
                245                 250                 255
Ser Val Ala Thr Leu Leu Arg Glu Asp Ala Asn Leu Pro Arg Asp Ser
            260                 265                 270
Cys Leu Val Gln Glu Asp Met Met Gln Val Leu Glu Leu Glu Thr Gln
        275                 280                 285
Leu Ala Lys Ala Thr Val Pro G1n Glu Glu Arg His Asp Val Ile Ala
    290                 295                 300
Leu Tyr His Arg Met Gly Leu Glu Glu Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu
305                 310                 315                 320
Lys Gly Phe Asn Trp Thr Leu Phe Ile Gln Thr Val Leu Ser Ser Val
                325                 330                 335
Lys Ile Lys Leu Leu Pro Asp Glu Glu Val Val Val Tyr Gly Ile Pro
            340                 345                 350
Tyr Leu Gln Asn Leu Glu Asn Ile Ile Asp Thr Tyr Ser Ala Arg Thr
        355                 360                 365
Ile Gln Asn Tyr Leu Val Trp Arg Leu Val Leu Asp Arg Ile Gly Ser
    370                 375                 380
Leu Ser Gln Arg Phe Lys Asp Thr Arg Val Asn Tyr Arg Lys Ala Leu
385                 390                 395                 400
Phe Gly Thr Met Val Glu Glu Val Arg Trp Arg Glu Cys Val Gly Tyr
                405                 410                 415
Val Asn Ser Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Ser Leu Tyr Val Arg Glu
            420                 425                 430
Ala Phe Pro Gly Asp Ser Lys Ser Met Val Arg Glu Leu Ile Asp Lys
        435                 440                 445
Val Arg Thr Val Phe Val Glu Thr Leu Asp Glu Leu Gly Trp Met Asp
    450                 455                 460
Glu Glu Ser Lys Lys Lys Ala Gln Glu Lys Ala Met Ser Ile Arg Glu
465                 470                 475                 480
Gln Ile Gly His Pro Asp Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg Arg Leu
                485                 490                 495
Asp Glu Glu Tyr Ser Asn Leu Asn Phe Ser Glu Asp Leu Tyr Phe Glu
            500                 505                 510
Asn Ser Leu Gln Asn Leu Lys Val Gly Ala Gln Arg Ser Leu Arg Lys
        515                 520                 525
Leu Arg Glu Lys Val Asp Pro Asn Leu Trp Ile Ile Gly Ala Ala Val
    530                 535                 540
Val Asn Ala Phe Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala
545                 550                 555                 560
Gly Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Lys Glu Gln Pro Gln Ala Leu
                565                 570                 575
Asn Phe Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly
            580                 585                 590
Phe Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met Met Asp
        595                 600                 605
Trp Trp Ser Asn Phe Ser Thr Gln His Phe Arg Glu Gln Ser Glu Cys
    610                 615                 620
Met Ile Tyr Gln Tyr Gly Asn Tyr Ser Trp Asp Leu Ala Asp Glu Gln
625                 630                 635                 640
Asn Val Asn Gly Phe Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly
                645                 650                 655
Gly Val Arg Gln Ala Tyr Lys Ala Tyr Leu Lys Trp Met Ala Glu Gly
            660                 665                 670
Gly Lys Asp Gln Gln Leu Pro Gly Leu Asp Leu Thr His Glu Gln Leu
        675                 680                 685
Phe Phe Ile Asn Tyr Ala Gln ValTrp Cys Gly Ser Tyr Arg Pro Glu
    690                 695                700
Phe Ala Ile Gln Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Leu Lys Tyr
705                 710                 715                 720
Arg Val Leu Gly Ser Leu Gln Asn Leu Ala Ala Phe Ala Asp Thr Phe
                725                 730                 735
His Cys Ala Arg Gly Thr Pro Met His Pro Lys Glu Arg Cys Arg Val
            740                 745                 750
Trp

Claims (25)

1、一种对以下酶具有联合的、特别是具有同时的抑制活性的化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途：
c)中性肽链内切酶(NEP)和
d)金属蛋白酶IGS5，它是一种包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽；
用于制备治疗患有可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的症状或者对该症状易感的哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
2、如权利要求1的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗患有big-ET-1水平升高并且可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
3、如权利要求1的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗患有ET-1显著上调并且可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
4、如权利要求1-3任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗和/或预防较大哺乳动物、优选人的高血压，包括继发形式的高血压如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌疼痛的药物(药用组合物)。
5、如权利要求2或3任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗和/或预防较大哺乳动物、优选人的动脉粥样硬化的药物(药用组合物)。
6、如权利要求2或3任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗和/或预防较大哺乳动物、优选人的高血压，包括继发形式的高血压如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌疼痛的药物(药用组合物)。
7、如权利要求1-6任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，金属蛋白酶IGS5是与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。
8、如权利要求1-7任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，所述包含于金属蛋白酶IGS5或者就是金属蛋白酶IGS5的氨基酸序列与选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少95％同一性。
9、如权利要求8的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，所述包含于金属蛋白酶IGS5或者就是金属蛋白酶IGS5的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQID NO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少95％同一性。
10、式I的化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，
Figure A028101540004C1
其中
A代表式II或III的基团
在式II中
R1a代表苯基-低级烷基，在其苯环上可选被低级烷基、低级烷氧基或卤素取代，或者代表萘基-低级烷基，
R2a是指氢或者是形成生物不稳定的酯的基团；和
在式III中
R1b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团，
R2b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团；
并且其中
R3是指氢或者是形成生物不稳定的羧酸酯的基团；
用于制备治疗患有可以通过联合或同时抑制
a)中性肽链内切酶(NEP)和
b)金属蛋白酶IGS5，它是包含与选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病或症状易感的哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
11、如权利要求10的化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，式I的化合物选自具有式Ia的结构的化合物的亚类，
Figure A028101540005C1
其中
R1a代表苯基-低级烷基，在其苯环上可选被低级烷基、低级烷氧基或卤素取代，或者代表萘基-低级烷基，
R2a是指氢或者形成生物不稳定的酯的基团，和
R3是指氢或者形成生物不稳定的酯的基团，
及其生理可接受的酸的盐或溶剂化物。
12、如权利要求10的化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，式I的化合物选自具有式Ib的结构的化合物的亚类，
其中
R1b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团，
R2b是氢或者是形成生物不稳定的膦酸酯的基团，和
R3是氢或者是形成生物不稳定的羧酸酯的基团
及其生理可接受的酸的盐或溶剂化物。
13、如权利要求10-12任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗患有big-ET-1水平升高并且可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病(或症状)易感的哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
14、如权利要求10-12任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗患有ET-1显著上调并且可以通过联合或同时抑制NEP和IGS5来减轻或预防的疾病或症状的或者对该疾病(或症状)易感的哺乳动物、优选人的药物(药用组合物)。
15、如权利要求10-14任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗和/或预防较大哺乳动物、优选人的高血压，包括继发形式的高血压如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌疼痛的药物(药用组合物)。
16、如权利要求13或14任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗和/或预防较大哺乳动物、优选人的动脉粥样硬化的药物(药用组合物)。
17、如权利要求13或14任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，用于制备治疗和/或预防较大哺乳动物、优选人的高血压，包括继发形式的高血压如肾或肺高血压、心力衰竭、心绞痛、心律不齐、心肌梗死、心脏肥大、脑缺血、周围血管疾病、蛛网膜下出血、慢性梗阻肺病(COPD)、哮喘、肾病、动脉粥样硬化和结肠直肠癌或前列腺癌疼痛的药物(药用组合物)。
18、如权利要求10-17任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，金属蛋白酶IGS5是与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。
19、如权利要求10-18任意项的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，所述包含于金属蛋白酶IGS5或者就是金属蛋白酶IGS5的氨基酸序列与选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少95％同一性。
20、如权利要求19的化合物、或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯的用途，其特征在于，所述包含于金属蛋白酶IGS5或者就是金属蛋白酶IGS5的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6之一的氨基酸序列具有至少95％同一性。
21、如权利要求1-20任意项的显示联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的第一化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯与至少一种附加化合物联合的用途，所述附加化合物选自不同于NEP/IGS5联合抑制剂的其它单个和/或联合金属蛋白酶抑制剂的，优选选自ACE抑制剂、选择性ECE抑制剂、选择性NEP抑制剂、双重NEP/ECE抑制剂和这些金属蛋白酶的混合抑制剂，用于制备联合治疗和/或联合预防如权利要求1-20任意项所述的疾病或症状的药物(药用组合物)。
22、如权利要求21的所述第一化合物与至少一种所述附加化合物联合的用途，其特征在于，第一化合物具有如权利要求10-12之一所述的式I的结构，优选如权利要求11所述的式Ia的结构或者如权利要求12所述的式Ib的结构。
23、如权利要求21-22任意项的所述第一化合物与至少一种所述附加化合物联合的用途，其特征在于，该联合是共同有效的，优选协同有效的。
24、药用组合物，它包括共同有效量，优选协同有效量的：
如权利要求1-20任意项的显示联合或同时的NEP/IGS5抑制活性的第一化合物或其药用可接受的盐或其溶剂化物或其生物不稳定的酯；和至少一种附加化合物，所述附加化合物选自不同于NEP/IGS5联合抑制剂的其它单个和/或联合金属蛋白酶抑制剂的，优选选自ACE抑制剂、选择性ECE抑制剂、选择性NEP抑制剂、双重NEP/ECE抑制剂和这些金属蛋白酶的混合抑制剂，用于制备联合治疗和/或联合预防如权利要求1-20任意项所述的疾病或症状的药物(药用组合物)。
25、如权利要求24的药用组合物，它包括共同有效量，优选协同有效量的所述第一化合物和至少一种所述附加化合物，其特征在于，第一化合物具有如权利要求10-12之一所述的式I的结构，优选如权利要求11所述的式Ia的结构或者如权利要求12所述的式Ib的结构。
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