JP2004536063A - 医薬の製造における組み合わせたnep/mp−抑制活性を有する化合物の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、NEPおよびIGS5を組合せたかまたは同時に抑制することによって緩和するかまたは予防することができる疾病または症状を患っているかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、中性エンドペプチダーゼ(NEP)とIGS5と呼称される新規メタロプロテアーゼ上での、組み合わされた、特に同時の抑制活性を有する化合物、またはその製薬学的に認容性の塩またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。特別な態様において、本発明は、big−ET−レベルが増加した疾病または症状、およびNEPおよびIGS5を組み合わせてかまたは同時に抑制することによって緩和または予防ができる疾病または症状を患っているかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する前記化合物の使用に関する。他の態様において、本発明は、ET−1が著しくアップレギュレーションされた疾病または症状であり、かつ、NEPおよびIGS5を組み合わせてかまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を患うかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、組み合わせたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する化合物の使用に関する。本発明において、組み合わせたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する化合物は、好ましくは、大型哺乳類、好ましくはヒトにおいて、より好ましくは、NEP/IGS5の組み合わせたかまたは同時の抑制によって緩和または予防することができる疾病または症状を患っているかまたはこれに感受性の患者の亜群において、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および/または予防に使用する。さらに、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す化合物と、NEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビター、たとえば、別個のACE−および/またはNEP−インヒビター、および/またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターとを付加的に組み合わせることは有利であってもよい。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ(NEP)と特異的メタロプロテアーゼ(MP)とを組み合わせたかまたは同時に作用するインヒビターとして働く化合物の新規医薬としての使用に関し、この場合、これらのインヒビターは、近年、クローニングされ、広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼとして新規に同定されているものである。
【背景技術】
【0002】
メタロプロテアーゼは、構造的および機能的に関連する酵素、たとえばペプチダーゼの特定のファミリーを形成するポリペプチドであり、この場合、これらは、種々の疾病の治療または予防において製薬学的または薬理的重要性を有するものである。幾つかの疾病において、メタロプロテアーゼがその疾病の病理において重要な役割を示すものであることが同定されている。たとえば、技術水準において、多くの亜鉛メタロプロテアーゼまたは構造的および機能的に関連する酵素の特定のファミリーが同定され、特徴付けられており、これによって、これらの酵素、たとえば、亜鉛メタロプロテアーゼの関与が、健康状態および疾病状態の双方に包含される生物学的機能の種々のアレイにおいて、重要な役割を果たすことが明らかになってきた。亜鉛メタロプロテアーゼは、その触媒機能が、活性部位での亜鉛イオンにクリティカルに依存する酵素のサブセットである。配列および構造情報の双方に基づいてクラス分けされた種々のファミリーを含むこれらの酵素群は、たとえば、肺の発生、軟骨および骨の形成、ペプチドホルモンのプロセッシング、生殖(reproduction)、心臓血管障害、関節炎および癌の過程に、密接に作用するものであると記載されている。したがって、健常時および疾病時におけるそれぞれのメタロプロテアーゼの重要な役割、およびこれらの潜在的相互関係を調べるばかりでなく、特に、前記メタロプロテアーゼが影響を及ぼす疾病の管理のために、改善された治療概念をデザインする上で、製薬技術において特に重要である。
【0003】
亜鉛メタロプロテアーゼの亜鉛結合部位周囲の配列および構造情報に基づいて、これらの酵素はいくつかのファミリーに分類されてもよく、この場合、これらのファミリーは、さらにスーパーファミリー、たとえば“メチジシン(metzincins)(アスタシン、セラチア、リプロライシン、マトリキシン)”、“グルジンシン(テルモライシン、ネプリライシン、アンジオテンシン変換酵素、アミノペプチダーゼ)”であるか、あるいはメチジシンおよびグルジンシンのスーパーフェミリーを含む“ジンシン”に分類されてもよい。このようなグループ分けは、一般的な触媒的および生合成的機序の解明手段であるだけでなく、類似の亜鉛結合モティーフを有する新規に同定されたタンパク質の機能を解明する手段でもある。メタロプロテアーゼ、たとえば、亜鉛酵素のいくつかの別個の例は、すでに技術水準において同定されているネプリライシン、エンドセリン変換酵素、アンジオテンシン変換酵素、サーモリシン、アミノペプチダーゼ、アスタシン、セラチア、リプロライシン、マトリキシン、インスリナーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびDD−カルボキシペプチダーゼを含む。
【0004】
中性エンドペプチダーゼ(NEP)、エンドセリン変換酵素(ECE)およびアンジオテンシン変換酵素(ACE)のような、特に重要なメタロプロテアーゼサブタイプのいくつかのより特異的特徴および関連する公知の活性については以下に説明する。
【0005】
アンジオテンシンI変換酵素(ACE;ペプチジル ジペプチダーゼ A;EC3.4.15.1)は、亜鉛メタロプロテアーゼのアンジオテンシン変換酵素ファミリーのメンバーである。ACEは、主に、内皮細胞、上皮細胞および神経上皮細胞(somatic ACE)の表面上で、細胞外酵素として発現し、この場合、細胞外酵素とは、1個または複数個の触媒部位を含むその塊の大部分が、細胞膜に固定され、細胞外環境に接していることを意味する。ACEは、血管内皮細胞の細胞膜中で見出され、その際、肺の血管内皮表面では、ACEの活性部位が循環物質を代謝しているかのように高いレベルで見出されている。ACEの内皮局在に加えて、酵素はさらに、小腸および腎臓近位の曲尿細管の吸収上皮のブラシ縁膜中で発現する。さらに、ACEは単核細胞、たとえば、マクロファージ分別後の単球およびT−リンパ球、さらには繊維芽細胞中で見出される。放射線ラベルした特異的ACEインヒビターを用いてのin vitro オートラジオグラフィーにおいて、および免疫組織化学的試験において、脳におけるACEの主な局在がマッピングされた。ACEは、主に、脈絡叢中で見出され、この場合、これらは、髄液、上衣、脳弓下器官、脳底神経節(尾状−被殻および淡蒼球)、黒質および下垂体中のACEに由来するものであってもよい。ACEの可溶性の形は、たとえば血清、精液、羊水および脳脊髄液の多くの生物学的流体中で検出されてもよい。ACEの可溶性の形は、内皮細胞の酵素の膜結合した形から誘導されることが明らかになった。ACEの主な生理学的活性は、C−末端ジペプチドを切断し、アンジオテンシンIから潜在的血管収縮性ペプチドであるアンジオテンシンIIを生成し、引き続いて、2個のC−末端ジペプチドを除去することによって、血管拡張性ペプチドブラジキニンを不活性化することである。血管作動性ペプチド アンジオテンシンIIとブラジキニンのこれら2種の代謝におけるACE関与の結果から、ACEは、高血圧および鬱血性心不全の治療における重要な分子標的となった。これは、高い効力および特異性を有するACEインヒビターを改善させ、これによりACEインヒビターは、高血圧および鬱血性心不全のこれらの症状をコントロールするための経口活性剤として、臨床的に重要でありかつ普及してきた。血管作動性ペプチドの代謝は、ACEの公知の生理学的機能を維持すると同時に、さらに酵素は、血圧調整に関連しない他の生理学的プロセスの範囲で、ACEの局在化および/または生物学的活性ペプチドのin vitroの切断範囲によって、たとえば、免疫、生殖および神経ペプチド代謝を包含する。
【0006】
中性エンドペプチダーゼ(NEP、ネプリライシン、EC3.4.24.11)は、亜鉛メタロプロテアーゼであり、かつ多くのネプリライシンファミリーに分類される。NEPは、ウサギ腎臓のブラシ縁膜から最初に単離された。その後に、NEP類似酵素が、ウサギ脳で、オピオイドペプチド、エンケファリンの分解において作用するものとして同定された。細胞外酵素NEPのクローニング、および引き続いての特定部位の突然変異誘発試験によって、サーモライシンと類似の特異性を有することが示され、さらに、類似の活性部位構成を有している。また、NEPは、疎水性残基のN−末端において、ペプチド切断に関してサーモライシン類似特異性を示す。NEPの一般的分布に関しては、脳および脊髄、さらには病変において測定されており、かつ電子顕微鏡試験は、一般に、NEPが主に神経的局在を示すことを支持するが、しかしながら酵素は、線条体−淡蒼球および線条体−黒質経路の線維によって取り囲まれた乏突起神経膠芽細胞上、および末梢神経系中のシュワン細胞上に存在していてもよい。NEPは、シナプスとして特異的な膜境界上での濃縮されることなく、むしろ神経核周囲部および神経樹状細胞の表面上に均一に分布している。末梢において、NEPは、特に、腎臓および小腸のブラシ縁膜、リンパ節および胎盤中に富み、かつ大動脈の血管壁を含む他の多くの組織中では低い濃度で見出されている。急性リンパ芽球白血病の共通抗原がNEPであることが見出されたことによって、さらに技術水準においては、酵素が、リンパ球生成細胞(Lymphohaematopoietic cell)の表面上で一時的に存在し、かつ特定の疾病において成熟リンパ球が高レベルで見出されたことが示されている。NEPにおける臨床的重要性、特に、有効な臨床薬としてのNEPインヒビターの重要性は、他の亜鉛メタロプロテアーゼと組合わせてのNEPの作用に由来し、この場合、他の亜鉛メタロプロテアーゼは、エンケファリンの分解、さらには心房性ナトリウム排泄増加ペプチド(ANP)の分解におけるその役割から、アミノペプチダーゼN(APN、膜アラニルアミノペプチダーゼ、EC3.4.11.2)である。たとえば、NEPとアンジオテンシン変換酵素(ACE)との二重のインヒビターは、有効な抗高血圧薬であることが公知であり、これによって、NEP抑制による心房性ナトリウム排泄増加ペプチドの循環レベルの増加と、ACE抑制によるアンジオテンシンIIの循環レベルの減少とを同時に生じる。末梢性酵素がナトリウム排泄増加ペプチドおよび利尿ペプチド、さらには心房性ナトリウム排泄増加ペプチドの分解を示す場合に、臨床的に有効なNEPインヒビターが得られることは興味深い。したがって、NEPインヒビターは、その抗高血圧特性について試験された。他の例から、合成NEPインヒビター、チオファンによるエンケファリン代謝による抑制が、マウスにおいてナロキソン可逆性抗侵害受容性応答を生じることは公知である。これは、その標的レセプターの範囲で内因性オピオイドを増加させることによって、モルホリンまたは他の古典的なアヘン剤の副作用からかなり解放される痛覚欠如が得られる可能性が見出された。これは、任意の顕著な効果を達成するために、他のエンケファリン−代謝酵素が、特にアミノペプチダーゼN(APN)を抑制しなければならないことを実現した。このようなNEP/APNの二重のインヒビターは、完全にエンケファリン代謝をブロックし、かつ強い抗侵害受容特性を有するものである。
【0007】
エンドセリン変換酵素(ECE)は、有効な血管収縮ペプチド エンドセリン(ET)の生合成における最終過程を触媒する。これは、不活性の中間産物、big−エンドセリン中のTrp−Val結合の切断に作用する。ECE−1は、中性エンドペプチダーゼ(NEP;ネプリライシン;EC3.4.24.11、前記)と同種の亜鉛メタロプロテアーゼである。NEPと同様に、ECE−1は、化合物ホスホラミドンによって抑制され、かつ、タイプIIの内在性膜タンパク質である。しかしながら、NEPとは異なり、ECE−1は、ジスルフィド結合二量体として存在し、かつ他のNEPインヒビター、たとえばチオファンによって抑制されることはない。免疫細胞化学的試験は、ECE−1が細胞外酵素として存在する、主な細胞−表面局在を示した。ECE−1は内皮細胞およびいくつかの分泌細胞、たとえば、膵臓中のβ−細胞、および平滑筋細胞に局在している。ECEの有効かつ選択的インヒビターであるか、あるいはECEおよびNEPの二重のインヒビターは、心臓血管系および腎臓系医薬における治療的適用を有していてもよい。2個の分子内ジスルフィド結合を有する、21アミノ酸の二環式ペプチドであるエンドセリン(ET)は、現在において最も有効な血管収縮性ペプチドの一つであると同定されており、かつ動物に投与することで、血圧の持続的増加を生じ、心臓血管調節におけるその有効な働きを増強させた。ヒトにおけるET−1の内在的産生は、基底部(basal)の血管緊張の維持に寄与する。したがって、エンドセリン系および関連酵素たとえばECEは、新規薬剤の改善のための適切な指標を示す。これによって、ECEにおける臨床的重要性、特に有効臨床薬としてのECEインヒビターの重要性は、特に、ETの生合成を含むECEの作用に由来する。したがって、顕著なエンドセリン変換酵素抑制活性を示す化合物は、ETによって誘発されるかまたは誘発が示唆される種々の疾病の治療および予防において有用である。
【0008】
技術水準から公知のメタロプロテアーゼまたはメタロエンドペプチダーゼの特別な基質は、たとえば、big−エンドセリン−1(big−ET−1)、心房性ナトリウム排泄増加ペプチド(ANP)、およびブラジキニンである。たとえば、big−ET−1は、エンドセリン−1(ET−1)の生物学的に不活性な前駆体であることが公知であり、この場合、これらは、特定のタンパク質分解過程を介して、その前駆体 big−エンドセリン−1から製造される、高い有効性を有する血管収縮ペプチドである。ET−1は、ヒトにおける基底部血管緊張の維持において生理学的役割を有しているが、しかしながら、高血圧、心不全およびアテローム性動脈硬化症のような種々の心臓血管疾病の原因であるともみられている。ET−1過剰の副作用を減衰させるための一つの試みは、big−ET−1のET−1への酵素的変換を抑制することである。しかしながら、エンドセリン変換酵素−1(ECE−1)は、1994年にクローニングされており(Xu Dら、Cell, 1994,78: 473-485)、この酵素は一般的に、big−ET−1のET−1への生理学的変換に応答性のエンドペプチダーゼとして認められるようになった。さらに、これ以来、NEP−インヒビダー ホスホラミドンは、さらに有効にECE−1を抑制するツール化合物として広範囲に認められるようになり;さらにその活性は、big−ET−1の注射液を投与された心不全の患者において確認されている(Love MP ら、Circ, 1996, 94: 2131-2137)。
【0009】
しかしながら、ECE−1が、big−ET−1を切断する能力を有するといった事実にもかかわらず、最近の報告では、ECE−1が生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるか疑わしいか、あるいは少なくとも、付加的な酵素がET−1の製造で影響しているにちがいないとの主張が報告された(Barker S ら、Mol Pharmacol,2001,59;163−169)。さらに、Barkerらによれば、エンドセリン−1(ET−1)は、高血圧、肺高血圧、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、および喘息における原因として挙げられた(Douglas, 1997, Tends Pharmacol Sci 18:408-412; Haynes and web, 1998, J Hypertension 16: 1081-1098; Goldie and Henry, 1999, Life Sci 65: 1-15)。多くの高ポテンシャルなET受容体アンタゴニストが、治療的適用に関して報告されているが、しかしながらこれらの化合物は一般に、ETA受容体選択的であるか、あるいは非−選択的ETA/ETBアンタゴニストである(Douglas, 1997,前記)。ETB受容体はいくつかの組織において優位であるが、しかしながら、選択的ETBまたは非−選択的ETA/ETBアンタゴニストによるブッロッキングに耐性である(Hay ら、1998, J Pharmacol Exp Ther 284: 669-677)。したがって、ECEインヒビターでのET−1合成の特異的抑制は、いくつかの条件下で、ET−1過剰の副作用を減衰させるための良好なアプローチであってもよい。
【0010】
本発明の目的は、メタロプロテアーゼ−関連疾病の治療および/または予防のための新規の治療概念を見出すことであり、この場合、これは、たとえば、第1段階においては、製薬学的に重要な別個のメタロプロテアーゼを特異的に抑制するか、あるいは、少なくとも2種の型のメタロプロテアーゼの選択的な組合せを、作用プロフィールの組み合わされた様式で特異的に抑制する、治療的に有用な化合物を供給することであり、かつ、第2段階においては、前記メタロプロテアーゼ抑制化合物の治療的に有用な組み合わせ物を提供することである。
発明の開示
ECE−1が、唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるとする技術水準が疑わしく(Barker S.ら、Mol Pharmacol, 2001,59: 163-169)、かつ、付加的な酵素が、ET−1の産生に影響しているに違いないといった推測から、本発明によって、これまで知られていないメタロプロテアーゼが、big−ET−1をET−1に変換する働きをしうるか、かつ、新規に同定されたメタロプロテアーゼに対する特異的なインヒビターが、この変換を抑制するかどうかについて試験するために、相同性クローニングをおこなった。これらの試みによって、メプロライシン メタロプロテアーゼファミリーの2個の最も特徴的なメンバーであるNEPに対する高いホモロジー(54%同一性)およびECE−1に対するやや低いホモロジー(37%同一性)を有する新規のヒト遺伝子が見出された。このヒト遺伝子のポリペプチド産物は、多くのヒト組織中において、多数発現することが見出され、かつ、“IGS5”として呼称されている(同時係争中の国際特許出願PCT/EP00/11532)。
【0011】
したがって、本発明は、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に、同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するかまたはこれらに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上および
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、メタロプロテアーゼIGS5上での、
組み合わされたか、特に、同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステル(biolabile ester)の使用に関する。
【0012】
特別な態様において、本発明は、big−ET−1レベルが増加する疾病または症状であり、かつ、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に、同時に抑制するによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0013】
他の特別な態様において、本発明は、ET−1が著しくアップレギュレーションされた疾病または症状であり、かつ、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬組成物)の製造のための、組み合わされたNEP/IGS5阻害活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0014】
他の特別な実施態様において、本発明は、大型哺乳類、特にヒトにおける高血圧症の二次的形態、たとえば、腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および/または予防のための医薬(医薬組成物)を製造するための、組み合わせたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する前記化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0015】
さらに、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す前記化合物と、NEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビター、たとえば、別個のACE−および/またはECE−および/またはNEP−インヒビターおよび/またはこれらメタロプロテアーゼの混合インヒビターとを付加的に組み合わせることは有利であってもよい。
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で使用された用語は、以下に別記しない限りは、本発明の技術分野における当業者が認識している通常の意味を有するものとする。以下のいくつかの定義は、本明細書中でしばしば使用される特定の用語の意味を簡単に説明するものである。
【0016】
“IGS5”は、特に、配列番号2、配列番号4および配列番号6の一つに示されたアミノ酸配列、またはこれらそれぞれの変異体を含むポリペプチドを意味する。したがって“IGS5”は、特に、IGS5PROT、IGS5PROT1およびIGS5PROT2を含む。
【0017】
“酵素活性”または“生物学的活性”は同様の活性または改善された活性か、あるいは、好ましくない副作用が減少したこれらの活性を含む、前記IGS5の代謝的または生理学的機能に関する。
【0018】
“IGS5−遺伝子”は、配列番号1、配列番号3および配列番号5の一つに示されたヌクレオチド配列、あるいはこれらそれぞれの変異体、たとえば、これらの突然変異体および/またはこれらの補体を含むポリヌクレオチドを意味する。
【0019】
本発明の技術分野において同一性の尺度として公知の“同一性”とは、2個またはそれ以上のポリペプチド配列、または2個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間での関連性を意味する。この技術分野において、さらに“同一性”は、ポリペプチド間またはポリヌクレオチド間の配列の関連性の度合いを意味し、たとえば、一般には最も大きいオーダーの適合率(matching)が得られるように配列を調節することによって、このような配列群間の適合を測定してもよい。したがって、“同一性”または二者択一的な用語“類似性”は、当業者によって認識されている意味を有するものであって、かつ公知方法によって簡単に算定できるものであるが、この場合、“Computational Molecular Biology”, Lesk, A.M., Ed., oxford University Press, New York, 1988; “Biocomputing: Informatics and Genome Projects”, Smith, D,W., Ed., Academic Press, New York, 1993; “Computer Analysis of Sequence Data”, PartI, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994; “Sequence Analysis Primer”Gribskov, M. and Devereux, J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものによって制限されることはない。同一性を測定するための好ましい方法は、試験された配列間で最も大きい適合性が得られるように設定される。同一性および類似性を測定するための方法は、市販のコンピュータープログラムで見出すことができる。2個の配列間の同一性および類似性を測定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 ( 1984)), BLASTP, BLASTNおよびFASTA(Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990))を含むが、これに制限されることはない。BLAST X プログラムは、NCBIおよび他の機関から公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。さらによく知られているSmith Waterman アルゴリズムは、同一性を測定するために使用されてもよい。それぞれ、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の同一性または類似性を測定するために有用な公的に利用可能なプログラムは、“gap”プログラムとして、Genetics Computer Group, マディソンWI から公知であり、この場合、これは、通常は、比較のためのデフォルトパラメータを用いておこなうものである(エンドギャップに対するペナルティーはないことに加えて)。ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータ(すなわちデフォルトパラメータ)は、以下のものを含む:Needleman and Wynsch,J.Mol.Biol.48:443−453(1970)で記載されたアルゴリズム;HentikoffおよびHentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915−10919(1992)からの比較マトリックスBLOSSUM62;ギャップペナルティー:12;ギャップ長ペナルティー:14。ポリヌクレオチドを比較するための好ましいパラメータ(すなわちデフォルトパラメータ)は、以下のものを含む:Needlman and Wynsch,J.Mol Biol.48:443−453(1970)によって記載されたアルゴリズム;比較マトリックス:マッチ数=±10、ミスマッチ数=0;ギャップペナルティー:50;ギャップ長ペナルティー:3である。用語“相同性”は用語“同一性”と置き換えることができる。
【0020】
たとえば、参考ヌクレオチド配列、たとえば、配列番号1、配列番号3および配列番号5の群から選択された参考ヌクレオチド配列に対して、たとえば、少なくとも95%の“同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が、それぞれ参考ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド当たり5箇所までの変異を含んでいてもよいことを除き、参考配列と同一であると見なされる。いいかえれば、参考ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一性のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参考配列中のヌクレオチド5%までが欠損しているかまたは他のヌクレオチドによって置換されていてもよいか、あるいは、参考配列中の全ヌクレオチドの5%までのヌクレオチド数が、参考配列中に挿入されるか、あるいは、参考ヌクレオチド中の全ヌクレオチドの5%までのヌクレオチド数が、欠損、挿入および置換の組合せで変異していてもよい。参考配列のこれらの変異は、参考ヌクレオチド配列の5’末端または3’末端で生じてもよいか、あるいは、参考配列中または参考配列の範囲内の一つまたはそれ以上の近接する群中のヌクレオチド中で、それぞれ別個に点在していてもよい。
【0021】
同様に、たとえば参考アミノ酸配列、たとえば、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択された参考アミノ酸配列に対して、少なくとも95%の“同一性”を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が、それぞれの参考アミノ酸配列の100アミノ酸当たり5個までのアミノ酸変異を含んでいてもよいことを除いて、参考配列と同一であるとみなされる。いいかえれば、参考アミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参考配列中の5%までのアミノ酸残基は、欠失されていてもよいかまたは他のアミノ酸によって置換されていてもよいか、あるいは、比較される配列中の5%までの全アミノ酸残基の多くのアミノ酸は、比較される配列中に挿入されていてもよい。比較配列のこれらの変異は、比較アミノ酸配列のアミノ末端基またはカルボキシ末端基で生じてもよいか、あるいは、これらの末端基中で、比較配列中の残基中でかまたは比較配列の範囲内で1個またはそれ以上の近接する群で別個に散在していてもよい。
【0022】
“ホモログ”は、対象となる配列に対する高い度合いの配列関連性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を示す、本発明の技術分野で使用される遺伝子学用語である。このような関連性は、ここで記載されたものと比較しての配列間で同一性および/または類似性の度合いを測定することによって定量されてもよい。この遺伝子学用語の範囲内において、用語“オルトログ”は他種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価物であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味し、かつ“パラログ”は同種の範囲を考慮した場合の機能的に類似する配列を意味するものである。したがって、たとえばヒトにおいて、エンドセリン変換酵素のファミリーの範囲内で、ECE−1は、他のメンバー、たとえばECE−2のパラログである。
メタロプロテアーゼの特異的インヒビターである、新規に同定されたメタロプロテアーゼIGS5の薬理学的評価
ECE−1が、唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるといった技術水準が疑わしく(Barker S.ら、Mol Pharmacol, 2001,59: 163-169)、かつ、付加的な酵素が、ET−1の産生において影響しているに違いないといった推測から、本発明によって、これまで知られていないメタロプロテアーゼが、big−ET−1をET−1に変換する働きをしうるか、かつ、新規に同定されたメタロプロテアーゼに対する特異的なインヒビターが、この変換を抑制するかどうかについて試験するために、相同性クローニングをおこなった。類似する活性を有する酵素は、これらのアミノ酸配列においても類似性を有するであろうといった仮定のもとに、ヒトゲノムを、2種の最も特徴的なネプリライシンメタリプロテアーゼファミリーのメンバーである、NEPおよびECEとのホモロジーを有するタンパク質をコードするDNA配列についてサーチした。これらの試みによって、NEPに対して高い相同性(54%同一性)およびECE−1に対するやや低い相同性(37%同一性)を有する新規のヒト遺伝子を発見するに至った。この遺伝子のポリペプチド産物は、多くのヒト組織中で多く発現することが見い出され、かつ “IGS5”と呼称されている。IGS5のクローニング、発現および基本的な生物学的特徴付けは、詳細には、同時係争中の国際特許出願PCT/EP00/11532に記載されており、この場合、これら全内容は、参考例のために以下IGS5についてそれぞれ詳細に例証されている。
【0023】
本発明の目的のために、IGS5の薬理学的酵素特性を特徴付け、かつ評価するために、ヒトIGS5タンパク質を、発現系として昆虫細胞系を使用することにより製造し、IGS5タンパク質の種々の有効な基質について試験した。IGS5は、big−ET−1、ブラジキニンおよびサブスタンスPを効率よく切断することが確認されており、これによって、さらにこの新規タンパク質が、メタロプロテアーゼ共通の特徴である広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼであることが確認され、かつ、これらの特徴は、NEP、ECE−1およびさらにACEに関しても報告されている。さらに本発明によれば、IGS5によるbig−ET−1のタンパク質分解は、驚くべきことに、ET−1の正確な形成を生じ、たとえば、big−ET−1は、正確に、アミノ酸Trp21とVal22との間を切断することが見出された。
【0024】
さらに、本発明によれば、big−ETのET−1への変換を抑制するメタロプロテアーゼインヒビター化合物の有効性を、蛍光ラベルされたbig−ET−1アナログを用いて最初に試験したものである。結果は、実施例部分の第9表に示した。In vivoにおけるbig−ETのET−1への変換抑制が公知であるホスホラミドンが、さらに本発明において使用された生化学的アッセイで、高いポテンシャルでIGS5を抑制し、さらにおどろくべきことに、ホスホラミドンによるIGS5の抑制が、実際にはかなりECE−1よりも高いことは興味深い。対照的に、選択的NEPインヒビター チオルファンならびに選択的ECE−1インヒビターSM−19712(4−クロロ−N−[[[(4−シアノ−3−メチル−1−フェニル−1H−ピラゾール−5−イル)アミノ]カルボニル]ベンズスルホンアミド、一ナトリウム塩;Umekawa K.Hasegawa H.Tsutsumi Y,Sato K,Matsumura Y,Ohashi N.,J Pharmcol 2000 Sep;84(1):7−15;Discovery Research Laboratories 1,Research Center,Sumitomo Pharmaceuticals Co,Ltd,Osaka,Japan)は、IGS5活性を示さなかった(第9表、実施例部分参照)。
【0025】
本発明の特別な態様において、最も重要でありかつ特徴的であるのは、メタロプロテアーゼインヒビターであるとして示された多くの化合物が、低いナノモル量での濃度、たとえば、約1〜10nMの範囲のIC50値を有する濃度であっても、IGS5酵素を抑制することが可能であることであり、これによって、特に製薬学的重要性を有する新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼを特異的に抑制することを明らかにした。
【0026】
したがって、本発明は、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上および
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、メタロプロテアーゼIGS5上での、
組み合わされた、特に、同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0027】
特別な態様において、本発明は、big−ET−1レベルが増加する疾病または症状であり、かつNEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、組合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0028】
他の態様において、本発明は、ET−1が著しくアップレギュレーションされる疾病または症状であり、かつNEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0029】
本発明において、“組合わされたかまたは特に同時の抑制活性”は、NEPおよびIGS5の双方の酵素系を同時にブロッキングすることによる少なくとも二重のNEPおよびIGS5の抑制を意味し、かつ場合により、第3の系の付加的な同時の抑制、たとえば、NEP、IGSおよびたとえばECE−1の酵素系の三重の抑制を意味する。本発明の結果から、NEPおよびIGS5の双方の酵素系の組合わされたか、同時の抑制が、異なる化合物によるブロッキングであるか、または単に、前記のそれぞれの酵素の別個のブロッキングよりも、より効果的であることが期待された。したがって本発明は、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防されてもよい特定の疾病または症状の治療および/または予防のための、組み合わせた、特に同時のNEPおよびIGSインヒビターの使用を提案することによる、新規治療概念を提供する。さらに、これに関連して、本発明は、NEPおよびIGS5の双方の組み合わされたか、または同時の抑制を示す化合物を提供し、これによって、考えられうる疾病または症状の治療および/または予防のために、改善された治療的価値を有する化合物の新規かつ期待される使用を提供する。
【0030】
治療的利点としての医学的に重要であるとされる、組み合わされた、特に同時に生じる作用機序は、それぞれの単独の系を別個に調節するよりも、より顕著であることが期待された。
【0031】
たとえば、エンドセリン−変換酵素インヒビターに関して、この原理の現在の状況および背景の解明、さらには関連する利点は、近年、B−M.Loeffler(J. Cardiovasc. Pharmacl. (2000), 35(Suppl.2), S79-S82)による論文で報告されている。Loefferらによれば、近年の研究により、有効な選択的または混合されたエンドセリン−変換酵素(ECE)、ECE/中性エンドペプチダーゼ(NEP)およびECE/NEPアンジオテンシン−変換酵素(ACE)インヒビターを見出したという。さらに、これらは、エンドセリン(ET)、レニン−アンジオテンシンおよびNEP系の、心臓血管系ホメオスタシスの調整のための機能が、複合的な調整ネットワークによって関連付けられている証拠を多く報告している。したがってLoefflerは、新規に可能な選択的かつ混合ECE−1インヒビターに関する将来的な研究課題は、一つ以上の心臓血管系の組み合わされた抑制が、選択的抑制よりも優れているかどうかを示すのに挑むことであるとみている。これに関して、本発明は、少なくともNEPおよびIGS5の酵素系の組み合わされたまたは同時の抑制に関する、技術水準に貢献する最初の優れた進歩を提供する。
【0032】
特別な態様において、本発明は、哺乳類、特にヒトでの、高血圧の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、ぜんそく、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌の疼痛の治療および/または予防に好ましい医薬を製造するための化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。特に、本発明において、好ましくは、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5−抑制活性を有する化合物を、NEPおよび/またはIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病また症状を有するかまたはこれに感受性の患者の部分母集団において、前記疾病または症状を治療および/または予防するために使用する。
【0033】
さらに、本発明による組み合わされたかまたは同時に生じるNEP/IGS5抑制活性を示す化合物と、組合わされたNEP/IGS5抑制活性以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターとを付加的に組合せることは有利であってもよい。組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物との組合せ物中で使用されてもよいこのような他のメタロプロテアーゼインヒビターは、たとえば、ACEインヒビター、たとえばカプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ホシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルであり;さらに、選択的ECEインヒビター、たとえば化合物SM−19712(Sumitomo、前記);選択的NEPインヒビター、たとえば、チオルファン;二重のNEP/ECEインヒビター、たとえば化合物CGS−35066(De Lombart ら、J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3): 488-504):またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビター、たとえば、オマパトリレートまたはサムパトリレートである。このタイプの組合せた治療および/または予防によって、組み合わされたかまたは同時に生じるNEP/IGS5抑制活性を有する化合物の治療的重要性は、さらに増加させることができ、この場合、これらは特に、前記に挙げられた疾病および/または症状に関するものである。したがって、他の態様において、本発明は、さらに以下のようにして記載された、併用療法および/または併用予防法に関する。
【0034】
特に、本発明によれば、主に中性のエンドペプチダーゼインヒビター(NEP−インヒビター)である化合物が、低いナノモル濃度であっても製薬学的重要性を有する新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼ酵素を十分に抑制し、これによって、これらの化合物が、組み合わされた作用プロフィール、たとえば、組み合わされたかまたは同時に書汁選択的NEP/IGS5抑制活性プロフィールを有するメタロプロテアーゼインヒビターであることが明らかにされた。このような化合物は、式I:
【0035】
【化1】
[式中、Aは式IIまたは式III
【0036】
【化2】
を有する基を示し、その際、式II中、
R1aは、フェニル環中で、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたはハロゲンによって置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基であるか、あるいはナフチル−低級−アルキル基を示し、
R2aは、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基であり、かつ、
式III中、
R1bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
R2bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
かつ、
R3は、水素であるか、あるいは生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する基を示す]の構造を有していてもよい化合物、および式Iの酸の製薬学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【0037】
式Iの化合物における置換基は、低級アルキルまたはアルコキシ基であるかまたはこれらを含んでおり、これらは、直鎖または分枝鎖であってもよく、かつ、特に1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含み、好ましくはメチルまたはメトキシである。置換基がハロゲンを含む場合には、特に、フッ素、塩素または臭素、好ましくはフッ素または塩素である。
【0038】
基R1aにおいて、低級アルキレン鎖は、1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含有していてもよい。R1は、特に、場合によってはハロゲン、低級アルコキシまたは低級アルキルによって1個またはそれ以上が置換されていてもよい、場合によっては置換されたフェニル基であるか、あるいはナフチルエチル基である。
【0039】
式Iaの化合物は、場合によってはエステル化されたジカルボン酸誘導体である。
【0040】
生分解可能なカルボン酸エステルを形成する適した基R3は、in vivoでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基である。たとえば、この目的のための適しているのは、低級アルキル基、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基であり、この場合、これらは場合によっては、低級アルキルまたは低級アルコキシまたは2個の隣合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によって、モノまたはポリ置換されていてもよく、ジオキソラニルメチル基、この場合、これらは、場合によってはジオキサン環中で低級アルキル基によって置換されていてもよいか、あるいは、C2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは、場合によっては低級アルキルによってオキシメチル基上で置換されていてもよい。生物的不安定性エステルを形成する基R3が低級アルキルを含む場合には、これらは、分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を有していてもよい。生物的不安定性エステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン鎖を有していてもよく、かつ好ましくはベンジルである。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これらは、3〜4個、好ましくは3個の炭素原子を有していてもよい。R3が場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これらは、2〜6個、好ましくは3〜5個の炭素原子を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を有していてもよく、かつ、たとえば、ピバロイルオキシメチル基(=tert−ブチルカルボニル−オキシメチル基)であってもよい。
【0041】
生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する適した基R2aは、in vivoでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基であり、かつ、基R3に関して挙げられた基に相当する。
【0042】
生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基として適した基R1bおよびR2bは、invivoでの生理学的条件下で、それぞれホスホン酸官能基を遊離させながら、除去されてもよい基である。たとえば、この目的に適した基は、低級アルキル基、場合によってはオキシメチル基上で低級アルキルによって置換されたC2〜C6−アルカノイルオキシメチル基、またはフェニル基またはフェニル−低級アルキル基であり、この場合、これらのフェニル環は、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたは2個の隣あった炭素原子と結合した低級アルキレン基によって、モノ−またはポリ置換される。生物的不安定性エステルを形成する基R1bおよび/またはR2bが低級アルキル基であるかまたはこれらを含む場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を含有していてもよい。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これは、好ましくは、2〜6個、より好ましくは3〜5個の炭素原子を有する分枝のアルカノイル基を有していてもよく、かつ、たとえばピバロイルオキシメチル基であってもよい(=tert−ブチルカルボニルオキシメチル基)。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン基を含んでいてもよい。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換されている場合には、これらは3〜4個、特に3個の炭素原子を含んでいてもよく、かつ置換されたフェニル環は特にインダニルである。
【0043】
式Iの酸の適した生理学的に認容性の塩は、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩、たとえばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩であるか、あるいは、生理学的に認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえば、ジエチルアミンまたはtert−ブチルアミン、またはフェニル−低級アルキルアミン、たとえば、α−メチルベンジルアミンとの塩である。
【0044】
式Iの化合物は、少なくとも1個のキラル炭素原子、すなわち、ベンズアゼピン構造の3位でアミド側鎖を有する炭素原子である。したがって、このような化合物は、2個の光学的活性の立体異性体の形またはラセミ体として存在していてもよい。本発明は、式Iの化合物のラセミ体混合物と異性体的に純粋な化合物との双方を含む。式Iの化合物において、基Aは式IIを示す場合には、式Iの化合物は2個のキラル炭素原子、すなわち環骨格の3位で、かつアミド側鎖を含む炭素原子、および基R1aを有するアミド側鎖の炭素原子を有する。したがって、基Aが式IIを意味する式Iのこれらの化合物は、いくつかの光学的活性の立体異性体の形でかまたはラセミ体として存在していてもよい。本発明によれば、ラセミ混合物と異性体的に純粋な化合物との双方を使用することができる。式Iの化合物において、基Aが式IIIを意味し、かつR1bおよびR2bは水素でなくそれぞれ異なる意味を有する場合には、ホスホン酸基のリン原子はキラルであってもよい。さらに本発明は、式Iの異性体混合物および異性体的に純粋な化合物に関し、その際、基Aはキラルのリン原子により形成される式IIIを意味する。
【0045】
本発明によれば、式Iの化合物、その塩およびその生物的不安定性エステルは、当業者に公知の方法で得られてもよい(以下参照のこと)。
【0046】
本発明の好ましい態様において、第1NEP−抑制化合物、たとえば式Iaの構造を有するベンズアゼピノン−N−酢酸誘導体、あるいは、式Ibの構造を有するホスホノ−置換されたベンズアゼピン誘導体が見出された。
【0047】
式Iaの構造を有する化合物はすでに、US5677297からのNEP−抑制化合物として公知であり、その際、化合物は、前記に示したような疾病または症状の治療に有用である。式Iの化合物は、以下の構造
【0048】
【化3】
[R1aは、フェニル環中で、低級アルキル、低級アルコキシまたは水素によって場合によっては置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基、あるいはナフチル−低級−アルキル基を示し、
R2aは、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を示し、かつ、
R3は、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を示す]を有する化合物および式Iの酸の製薬学的に認容性の塩である。
【0049】
式Iaの化合物における置換基が、低級アルキルまたはアルコキシ基であるか、あるいはこれを含有する場合には、これらは直鎖または分枝鎖であってもよく、かつ特に、1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含み、かつ、好ましくはメチルまたはメトキシである。置換基がハロゲンを含む場合には、特に適しているのはフッ素、塩素または臭素であり、好ましくはフッ素または塩素である。
【0050】
基R1aにおいて、低級アルキレン鎖は1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含有していてもよい。特にR1aは、場合によってはハロゲン、低級アルコキシまたは低級アルキルによって1個またはそれ以上が置換されていてもよい。場合によっては置換されたフェネチル基であるか、あるいはナフチルエチル基である。
【0051】
式Iaの化合物は、場合によってはエステル化されたジカルボン酸誘導体である。投与形態に依存して、生分解可能なモノエステル、特にR2aが生分解可能なエステルを形成する基であり、かつR3が水素である化合物であるか、あるいはジカルボン酸が好ましく、この場合、ジカルボン酸は特に静脈内投与(i.v.)に適している。
【0052】
生物的不安定性エステルを形成する、式Iaの化合物において適した基R2aおよびR3は、低級アルキル基、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基、この場合、これらは場合によってはフェニル環中で、低級アルキルによってかまたは2個の隣り合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によって置換されているか、オキソラニルメチル基、この場合、これらは、場合によってはジオキソラン環中で、低級アルキルによって置換されており、あるいは、C2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは、オキシメチル基上で場合によっては低級アルキルによって置換されている。生物的不安定性エステルを形成する基R2aまたは基R3が低級アルキル基である場合には、これは好ましくは、1〜4個、好ましくは2個の炭素原子を有する非分枝のアルキル基であってもよい。生物的不安定性エステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級−アルキル基である場合には、そのアルキレン基は1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有していてもよい。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これは、3〜4個、特に3個の炭素原子を含んでいてもよい。フェニル、ベンジルまたはインダニルが、特にフェニル含有置換基R2aおよび/またはR3として特に適している。R2aおよび/またはR3が場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これらのアルカノイルオキシ基は2〜6個、好ましくは3〜5個の炭素原子を含有していてもよく、かつ好ましくは、分枝であり、かつ、たとえば、ピバロイルオキシメチル基(=tert−ブチルカルボニル−オキシメチル基)であってもよい。
【0053】
式Iのジカルボン酸またはモノエステルの適した生理学的認容性の塩は、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩、たとえば、ナトリウムまたはカルシウム塩であるか、あるいは、生理学的に認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえばジエチルアミンまたはtert−ブチルアミンとの塩を含む。
【0054】
式Iaの化合物は、2個のキラルの炭素原子、すなわち、環骨格の3位で、かつアミド側鎖を有する炭素原子、および基R1aを有するアミド側鎖の炭素原子を含む。したがって、化合物は、いくつかの光学的活性の立体異性体の形であるかまたはラセミ体として存在していてもよい。本発明によれば、式Iaのラセミ体混合物と異性体的に純粋な化合物の双方を使用することができる。
【0055】
本発明によれば、式Iaの化合物およびその塩および生物的不安定性エステルは、当業者に公知の方法で、たとえば、US5677297に記載のようにして得ることができる。
【0056】
式Iの好ましい化合物は、たとえば、R2および/またはR3が生物的不安定性エステルを形成する基を意味する化合物、およびその生理学的に認容性の塩である。生物的不安定性エステルを形成する基は、低級アルキル基、またはフェニルまたはフェニル−低級−アルキル基であってもよく、特にフェニル基、ベンジル基またはインダニル基であり、この場合、これらは、場合によっては、低級アルキルまたは2個の隣合う炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によってフェニル環中で置換されていてもよいか、ジオキソラニルメチル基、特に(2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−イル)メチルであり、この場合、これらは場合によってはジオキソラン環中で、低級アルキルによって置換されていてもよいか、あるいはC2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、場合によってはオキシメチル基上で、低級アルキルによって置換されていてもよい。特に、式Iaの化合物は、R2が生物的不安定性エステルを形成する基であり、かつR3が水素であることを特徴とする化合物であることが好ましい。
【0057】
式Iaの化合物の特に好ましい例は、たとえば、
(3S,2’R)−3−{1−[2’−カルボキシ−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−1);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−2);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−ナフチルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−3);およびこれらの酸の製薬学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【0058】
式Iaの化合物の他の特別な例は、たとえば、
3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−tert−ブチルエステル、(化合物Ia−4);
3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1酢酸(化合物Ia−5);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−tert−ブチルエステル(化合物Ia−6);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−(カルボキシ−4’−フェニルブチル)シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1酢酸(化合物Ia−7);
3−{1−[2’−(tert−ブトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンジアゼピン−1−アセテート−tert−ブチルエステル(化合物Ia−8);
3−[1−(2’−カルボキシ−4’−フェニルブチル)シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−9);
3−{1−[2’−tert−ブトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−ベンジルエステル(化合物Ia−10);
3−[1−(2’−カルボキシ−4’−フェニルブチル)シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−ベンジルエステル(化合物Ia−11);
3−{1−[2’−(tert−ブチルカルボニルオキシメトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−ベンジルエステル(化合物Ia−12);
3−{1−[2’−(ピバロイルオキシメトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1酢酸(化合物Ia−13);
およびこれらの酸の生理学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【0059】
式Ibの構造を有する化合物は、NEP−抑制化合物、さらにはUS5952327からの弱いエンドセリン変換酵素インヒビター(ECE−インヒビター)としてすでに公知であり、その際、化合物は、前記に示されたような疾病または症状の治療に有用である。したがって、さらに本発明は、式Ib
【0060】
【化4】
[式中、R1bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性のホスホン酸エステルを形成する基であり、
R2bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性のホスホン酸エステルを形成する基であり、かつ、
R3は、水素であるか、あるいは生物的不安定性のカルボン酸エステルを形成する基である]の化合物および式Ibの酸の生理学的に認容性の塩に関する。
【0061】
式Ibの化合物は、カルボン酸およびホスホン酸を含む酸誘導体であり、この場合、これらは場合によっては、生分解可能なエステルを形成する基によってエステル化される。式Ibの生分解可能なエステルは遊離酸のプロドラックである。投与形態に依存して、生分解可能なエステルまたは酸が好ましく、特に酸は、静脈内投与に適している。
【0062】
生分解可能なホスホン酸エステルを形成する基として適した基R1bおよびR2bはin vivoでの生理学的条件下で、それぞれのホスホン酸官能基を遊離しながら、除去することができる。たとえば、本発明の目的のために適した基は低級アルキル基、C2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは場合によってはオキシメチル基上で低級アルキルによって置換されていてもよく、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基、この場合、これらは場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたは2個の隣合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によってフェニル環がモノまたはポリ置換されているものである。生分解可能なエステルを形成する基R1bおよび/または基R2bが低級アルキルであるかまたはこれを含有する場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を含有していてもよい。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたアルカノイルメチル基である場合には、好ましくは、2〜6個、好ましくは3〜5個の炭素原子を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を含有していてもよく、たとえば、ピバロイルオキシメチル基であってもよい(=tert−ブチルカルボニルオキシメチル基)。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン基を含んでいてもよい。フェニル環が低級アルキレン鎖によって置換されている場合には、これらは3〜4個、特に3個の炭素原子を含有していてもよく、かつ置換されたフェニル環は特にインダニルである。
【0063】
生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する式Ibの化合物のための適した基R3は、in vivoでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基である。たとえば、この目的のための適した基は、低級アルキル基、フェニル基またはフェニル−低級アルキル基であり、この場合これらは、フェニル環中で、低級アルキル基かまたは低級アルコキシ基によってか、あるいは2個の隣接した炭素原子と結合した低級アルキレン基によってモノ置換またはポリ置換されていてもよく、ジオキソラニルメチル基であり、この場合、これらはジオキサン環中で、低級アルキル基によって場合によっては置換されていてもよく、あるいはC2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは場合によっては、低級アルキル基によってオキシメチル基上で置換されていてもよい。生分解生エステルを形成する基R3基が低級アルキルであるかまたはこれを含む場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を含有していてもよい。生分解可能なエステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン基を含有してもよく、かつ好ましくはベンジル基である。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これらは、3〜4個、好ましくは3個の炭素原子を含有していてもよい。R3が、場合によってはアルカノイルオキシメチル基である場合には、この場合、これらは、炭素原子2〜6個、好ましくは3〜5個を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を含有していてもよく、たとえば、ピバロイルオキシ基であってもよい。
【0064】
本発明によれば、式Ibの化合物およびその塩、ならびにその生分解可能なエステルは、技術水準において当業者に公知の方法で得ることができる。
【0065】
式Ibの酸の適した生理学的に認容性の塩は、それぞれの場合において、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩であり、たとえば、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩、またはその生理学的認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえば、ジエチルアミン、tert−ブチルアミンまたはフェニル−低級アルカリアミン、たとえばα−メチルベンジルアミンとの塩である。
【0066】
式Ibの化合物はキラル炭素原子、すなわち、ベンズアゼピン構造の3位においてアミド側鎖を有する炭素原子を含む。したがって、化合物は、2個の光学的活性立体異性体の形またはラセミ体として存在していてもよい。本発明は、式Iのラセミ混合物と、異性体的に純粋な化合物との双方を包含する。式Ibの化合物においてR1bとR2bが水素でなく、かつそれぞれ異なる意味を有する場合には、ホスホン酸基のリン原子もまたキラルであってもよい。さらに、本発明は、キラルのリン原子により形成される、式Iの異性体混合物および異性体的に純粋な化合物に関する。
【0067】
式Ibの好ましい化合物は、R3が水素または低級アルキル、たとえば、C1〜C4−アルキル、特にC1〜C2−アルキルを意味する化合物、および式Ibの酸の生理学的に許容可能な塩である。
【0068】
式Ibの化合物の好ましい例は、たとえば、
ベンジル(3S)−3−(1−ジベンジルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−1);
(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(=化合物Ib−2);
ベンジル(3S)−3−(1−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−3);
エチル(3S)−3−(1−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−4);
エチル(3S)−3−(1−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−5);
エチル(3S)−3−[1−(ピバロイルオキシメチルエチルホスホノメチル)−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−6);
エチル(3S)−3−[1−(5−インダニルエチルホスホノメチル)−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−7);
tert−ブチル(3S)−3−(1−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−8);
ベンジル(3S)−3−(1−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−9);
ベンジル(3S)−3−(1−ジエチルホスホノメチル−1−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−10);
(3S)−3−(1−ジエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(=化合物Ib−11);
エチル(3S)−3−(1−ジエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−12);
エチル(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(化合物Ib−13);
ベンジル(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−14);
ベンジル(3S)−3−(1−ジイソプロピルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5,−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib=15);
エチル(3S)−3−(1−ベンジルイソプロピルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib=16);
tert−ブチル(3S)−3−(1−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−17);
tert−ブチル(3S)−3−[1−(ピバロイルオキシメチル−エチルホスホノメチル)−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−18);
tert−ブチル(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−19);
およびこれらの酸の生理学的に認容性の塩である。
【0069】
式Ibの化合物の特に好ましい例は、たとえば、化合物Ib−2、化合物Ib−8、化合物Ib−18または化合物Ib−19であり、最も好ましくは化合物Ib−8、およびこれらの生理学的に認容性の塩である。
【0070】
本発明は、技術水準から公知のECE−1メタロプロテアーゼに加えて、エンドセリン変換酵素のIGS5型が、さらに、big−ETをET−1に切断するのに特に作用するメタロプロテアーゼであると定められたことを、最初に証明するものである。したがって、本発明によるこれらの発見は、IGS5によって介在された、big−ETのET−1への切断によって、影響を受けるかおよび/またはこれを包含する種々の疾病の治療および/または予防のための、改善された治療概念に関して、新規かつ重要な有力な候補を提供するものであって、本発明によれば、公知のECE−1と結合する化合物を探索および使用よりもむしろ、治療的に活性の化合物、すなわち、特異的にIGS5型のメタロプロテアーゼを抑制する化合物の同定および使用を示唆した。
【0071】
前記に示された式Iaまたは式Ibの構造を有する化合物は、元来、そのNEP−抑制活性に基づいて、技術水準で選択された。したがって、in vitroでのIGS5に対する極めて高い効果は、驚くべきことに、本発明による化合物が、麻酔をかけられたラットにおけるbig−ETの血圧上昇作用を本質的に減少させる前記化合物の可能性によって、見出された。
【0072】
結論として、本発明による試験は、新規のECE−/NEP−様メタロプロテアーゼを見出し、この場合、これらはbig−ETを効果的に切断し、かつ、公知のエンドセリン変換酵素インヒビターホスホラミドンに対して感受性でないばかりか、さらに、式Iの構造を有する、好ましくは式Iaまたは式Ibの構造を有する多くの定義されたメタロプロテアーゼインヒビターに対しても感受性でない。したがって、IGS5が、ET−1製造において重要な役割を示し、かつ、式I、好ましくは式Iaまたは式Ibのような構造を有する化合物は、この新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼ酵素を抑制することによるそのin vitro作用を有してもよいことが考えられうる。
【0073】
したがって、種々の疾病において、好ましくは高血圧症、腎臓病および心不全における、IGS5の組織分布、生理学的機能および病理学的役割を明確にするさらなる試験は、本発明において、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す化合物を用いておこなわれた。
【0074】
30人の健康なボランティアを含む二重盲プラセボコントロール臨床試験において、化合物Ia−2が、big−ETによって誘発された圧力応答を用量依存的に抑制し、かつ、そのNEP−抑制特性の指標となる、ANPレベルにおいて明らかに用量に関連する増加を示した。ET−1レベルは、選択的NEPインヒビターから期待されるような増加を示すことなく、その一方で、big−ETレベルは、化合物Ia−2においてプラセボ群と比較して用量依存的に増加し、この場合、これは、big−ETの分解(breakdown)がさらに抑制されることを示している。ヒトにおける化合物Ia−2の臨床的効果およびその安全性に関する概念を立証するために、6種の臨床試験を、健康なボランティアで行い、かつ、2種の概念的試験を患者についておこなった:一つは、無作為プラセボコントロール二重盲試験を、高血圧症患者(N=191)について、もう一つはオープンな基線コントロール予備試験を、鬱血性心不全患者(N=29)についておこなった。結果は、化合物Ia−2の経口投与後の、ボランティアおよび患者の双方におけるANPおよびそのセカンドメッセンジャーであるcGMPの著しく増加しかつ維持された血漿濃度によって、中性エンドペプチダーゼ(NEP)の抑制が示された。さらに、鬱血性心不全患者における結果は、化合物Ia−2の投与後に、化合物Ia−1(化合物Ia−2の活性代謝物)のlog血漿濃度と、big−ET血漿レベルとの間の著しくポジティブな相関を示した(p<0.001)。実際に、big−ETの血漿レベルは、化合物Ia−2の投与後に基準線(200mg:4.9〜6.5fmol/ml(+32.6%);400mg:2.3〜3.5fmol/ml(+56%))から増加する傾向にあり、経口投与された化合物Ia−2の活性が、big−ETの切断を妨げるといった概念が支持された。最も重要なことは、化合物Ia−2は、WHO基準でI〜II度の高血圧症を有する患者で、近年行われた4週間に亘っての試験(N=191)で、顕著かつ臨床的な抗高血圧活性の証拠を最初に明らかにされたものであるということである。治療すべき患者群(Intent-to treat)(ITT)で、用量の最も高い試験において(200mg 一日二回bid)、プラセボに対するオフィス(office)最低血圧が−6.9mmHg減少し(治療下での最終値;p<0.001)、かつプラセボに対するオフィス最高血圧が−9.2mmHg減少した(治療下での最終値;p=0.003)。この観察で重要であるのは、純粋なNEPインヒビターが、ET−1を増加させ、その結果、血圧を減少させるよりむしろ増加させることを示したことであった。
【0075】
さらなる研究において、鬱血性心不全を有する患者の心臓血流力学パラメータ上においての、化合物Ia−2の用量依存的関係を試験し、さらに、高血圧症患者に対して一日一回の投与後の、抗−高血圧作用の時間経過について試験した。
本発明におけるIGS5メタロプロテアーゼ
本発明は、IGS5ポリペプチド(またはIGS5酵素またはIGS5メタロプロテアーゼ、たとえばIGS5PROT、IGS5PROT1またはIGS5PROT2、それぞれ)、特にヒトIGS5ポリペプチド(またはヒトIGS5酵素)に関する。IGS5ポリペプチドは、ポリペプチド、特にヒトのポリペプチドに相当し、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択された一つの配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、および特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも97%〜99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一のIGS5ポリペプチドを含有するものである。
【0076】
さらにこのようなポリペプチチドはIGS5ポリペプチド、特にヒトIGS5ポリペプチドを含み、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、および特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一のIGS5ポリペプチドを含む。
【0077】
本発明の他のポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の一つを含む配列を含有する単離されたIGS5ポリペプチドを含む。
【0078】
本発明のIGS5ポリペプチドは、ネプリライシンメタロプロテアーゼファミリーのメンバーであり、かつ特にヒトの種類のポリペプチドである。これらは、いくつかの機能不全、障害、疾病が前記で同定されており、かつこれらにおいて、新規に同定されたメタロプロテアーゼが、疾病の病理学において重要な役割を示すことから重要である。
【0079】
したがって本発明は、IGS5ポリペプチドが生物学的に活性のペプチドの代謝において作用していてもよく、かつ特に、このようなIGS5ポリペプチドが種々の血管作動性ペプチド上で作用しうるメタロプロテアーゼ型の酵素であることが見出された。技術水準から公知の血管作動性ペプチドは、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド(ANP)、ブラジキニン、bigエンドセリン(big ET−1)、エンドセリン(ET−1)、サブスタンスPおよびアンジオテンシン−1である。さらに、新規のヒトメタロプロテアーゼであるIGS5エクトドメインが、効果的に、たとえばin vitroで、前記の種々の血管作動性ペプチド、特にbig−ET−1、ブラジキニンおよびサブスタンスPを加水分解することが見出された。
【0080】
IGS5メタロプロテアーゼ型酵素は、ECE/NEP−特性を有する酵素に関する抑制活性、たとえばホスホラミドンのような化合物による抑制を測定するために使用される参考化合物によって抑制されてもよい。しかしながら、IGS5の抑制は、NEPを選択的に抑制する参考化合物によっては観察されることがなく、たとえば、チオルファンのような化合物によるIGS5の抑制は観察されないか、あるいはECEを選択的に抑制する参考化合物、たとえば、SM−19712(Sumitomo、前記)のような化合物に関してはIGS5の抑制は観察されることがなかった。
【0081】
IGS5の抑制は、NEP/ECEを抑制する参考化合物、たとえば、NEP/ECEインヒビターCGS−35066(DeLombartら、前記)に関してのみ、高い濃度で観察された。本発明のIGS5メタロプロテアーゼ型酵素の抑制に関するこれらの参考化合物の抑制データは、さらに以下の実施例において記載されている。
【0082】
本発明のIGS5ポリペプチドは、任意の適した方法で製造することができる。このようなポリペプチドは、天然由来のポリペプチド、組み換え技術によって製造されたポリペプチド、合成ポリペプチド、またはこれらの方法を組み合わせることによって製造されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを製造するための方法は、当業者に公知である。したがって、実施例におけるIGS5メタロプロテアーゼは、特に、同時係属出願である国際出願PCT/EP00/11532記載の方法によって製造することができ、この場合、これは、そのすべての内容に関して、特に、ヒトIGS5遺伝子の相同性クローニングおよび相当するヒトIGS5タンパク質の発現に関して、参考のためにのみ本明細書中に示されている。
【0083】
さらに、前記IGS5メタロプロテアーゼをコードするIGS5ポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技術を用いて、ヒト精巣組織の細胞におけるmRNA由来のcDNAライブラリーから、発現シークエンスtag(EST)分析を用いて得ることができる(Adams, M.D., et al. Science (1991) 252:1651-1656; Adams, M.D. et al., Nature, (1992) 355: 632-634; Adams, M.D., et al., Nature (1995) 377 Supp:3-174)。さらにIGS5ポリペプチドは、たとえばゲノミックDNAライブラリーのような天然源のものから得ることができるか、あるいは公知の方法および市販の技術を用いて合成することができる(たとえば、F.M. Ausubel et al., 2000, Current Protocols in Molecular Biology)。
【0084】
IGS5ポリヌクレオチドが、IGS5ポリペプチドの組み換え製造のために使用される場合には、ポリヌクレオチドは、それ自身が、成熟ポリペプチドのコーディング配列を含んでいるか、あるいは、他のコーディング配列を含むリーディングフレーム中で成熟ポリペプチドのためのコーディング配列を含んでいてもよく、たとえば、これらをコードするリーダー配列または分泌配列、プレ−、プロ−、またはプレプロ−タンパク質配列であるか、あるいは他の融合ペプチド部分を含む。たとえば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列がコードされてもよい。たとえば、マーカー配列は、好ましくはヘキサ−ヒスチジンペプチドであってもよく、この場合、これはpQEベクター中に提供され(Qiagen, Inc.)、かつGentzら、Proc Natl Acad Sci USA(1989)で記載されているか、あるいはHA tagであってもよい。さらにポリヌクレオチドが非コーディング5’および3’配列を含んでいてもよく、たとえば、転写、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボゾーム結合部位およびmRNAを安定化する配列を含んでいてもよい。配列番号1、配列番号3または配列番号5の一つに含まれるヌクレオチド配列と同一または十分に同一であるIGS5ポリヌクレオチドは、cDNAおよびゲノミックDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとしてか、あるいは核酸増幅反応(PCR)のためのプライマーとして、全長cDNAsおよびIGS5ポリペプチドをコードするゲノミッククローンを単離し、かつ、配列番号1、配列番号3および配列番号5の一つと、高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAおよびゲノミッククローンを単離するために使用されてもよい(ヒト由来のパラログ、およびヒト以外の種に由来するオルトログおよびパラログをコードする遺伝子を含む)。典型的に、これらのヌクレオチド配列は、指示されるものに対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、および特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有する。プローブまたはプライマーは、一般には少なくとも15個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも30個のヌクレオチドを含有していてもよく、かつ、少なくとも50個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは、30〜50個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプライマーは、20〜25個のヌクレオチドを有していてもよい。
【0085】
IGS5ポリヌクレオチドをコードするIGS5ポリペプチド、特にヒトIGS5ポリペプチドは、配列番号1、配列番号3または配列番号5、あるいはこれらのフラグメントの一つの配列を有するラベルされたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニング工程、および前記ポリヌクレオチド配列を含む全長cDNAおよびゲノミッククローンを単離する工程を含む方法によって得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に公知である。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xDenhart’s溶液、10%硫酸デキストラン(w/v)および20μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃で一晩に亘ってインキュベートし、その後に、0.1xSSC中で、約65℃でフィルターを洗浄することによっておこなった。したがって、IGS5ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3または配列番号5、またはこれらのフラグメントの一つの配列を有するラベルされたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニングすることによって得られてもよい。
【0086】
当業者は、多くの場合において、ポリペプチドをコードする領域が、cDNAの5’末端で短く切断されているために、単離されたcDNA配列が不完全であろうことを認識している。これは、固有の低い“プロセシング能力(重合反応中において、テンプレートに対して結合し続ける酵素能力の尺度)”を有する酵素である逆転写酵素によるものであり、第1ストランドのcDNA合成の間において、mRNAテンプレートのDNAコピーを完全にすることができないためである。考えられうる当業者に公知の、完全長cDNAを得るか、あるいは短いcDNAsを伸長させるためのいくつかの方法、たとえば、cDNA末端の急速増幅法(RACE)(たとえば、Frohmenら、 PNAS USA 85, 8998-9002, 1988 参照)に基づく方法がある。この技術の最近の変法は、Marathon TM技術によって例証されており(Clontech Laboratories Inc.)、より長いcDNAsをサーチするためにかなり簡略化されている。このMarathon TM技術において、cDNAは、選択組織から抽出されたmRNAと、それぞれの末端に結合された“アダプター配列”とから製造された。その後に核酸増幅法(PCR)は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーとの組合せ物を使用することによって、cDNAの5’末端の“欠損(missing)”の増幅を実施する。その後にPCR反応は、増幅産物の範囲内でアニールするようにデザインされた“ネストされた”プライマーを用いて反復させた(典型的に、アダプター配列の他の3’をアニーリングするアダプター特異的プライマーと公知の遺伝子配列中の他の5’をアニーリングする遺伝子特異的プライマーである)。この反応産物はその後に、DNAシークエンシングによって分析されてもよく、かつ完全な配列を得るために、産物を直接的に存在するcDNAに結合させるか、あるいは、5’プライマーのデザインに関する新規の配列情報を用いて、別個の完全長PCRを行うことによって、完全長cDNAを構築した。
【0087】
組み換えIGS5ポリペプチドは、発現系を有する遺伝子技術によって製造されたホスト細胞から、公知方法で製造されてもよく、この場合、この発現系は、1個または複数個のIGS5ポリヌクレオチドを含有する。このような発現系を用いて遺伝子技術によって製造されたホスト細胞は、組換え技術によってIGS5ポリペプチドを製造するために使用することができる。さらに、無細胞翻訳系は、このようなIGS5タンパク質を、IGS5DNAコンストラクト由来のRNAsを用いて製造するために使用することができる。IGS5ポリヌクレオチドのホスト細胞への導入は、多くの標準的な実験用マニュアルで記載された方法、たとえばDavisらによるMolecular Biology(1986)およびSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory manual,2nd Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)で実施することができる。このような方法は、たとえば、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、カチオン脂質−介在型トランスフェクション法、エレクトロポレーション方法、トランスダクション法、スクラップローディング法(scrape loading)、衝撃導入法(ballistic introduction)またはインフェクション法である。適切なホストの典型的な例は、細菌細胞、たとえば、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、E.Coli、ストレプトミセスおよびバチルススブチリス細胞;酵母菌、たとえばイースト菌およびアスペルギルス細胞;昆虫細胞、たとえば、Drosophia S2およびSpodoptera Sf9細胞、動物細胞、たとえばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK,HEK293およびBowsメラノーマ細胞、および植物細胞である。
【0088】
極めて多様の発現系は、たとえば、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピソーム、挿入要素、イースト染色体要素、ウイルス、たとえばバキュロウイルス、パボラウイルス、たとえばSV40、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、およびこれら組合せ物からのベクター、たとえば、プラスミドとバクテリオファージ遺伝的要素から誘導されたベクター、たとえばコスミドおよびファージミドであってもよい。発現系は、発現を調節ならびに発生させるコントロール領域を含んでいてもよい。一般には、ポリペプチドを製造するポリヌクレオチドをホスト中で保持、伝播または発現させる能力を有する任意の系またはベクターを使用してもよい。適したヌクレオチド配列は、任意の種々の公知および通常の技術によって、発現系中に挿入することができ、この場合、これらの方法は、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(前記)に記載されている。適切な分泌シグナルは、好ましいポリペプチド中に混合され、小胞体腔、細胞周辺腔または細胞外環境に、翻訳タンパク質を分泌する。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内在性のものであるか、あるいは、たとえば異なる種由来の異種シグナルであってもよい。
【0089】
ポリペプチドを、スクリーニングアッセイで使用するために発現させる場合には、一般には、IGS5ポリペプチドを、細胞表面上でか、または可溶性タンパク質の形で製造することができる。IGS5ポリペプチドが、媒体中に分泌される場合には、媒体はIGS5ポリペプチドを捕集および精製するために回収することができる。細胞内で製造する場合には、細胞は、最初に、IGS5ポリペプチドを捕集する前に溶解させなければならない。IGS5ポリペプチドが、細胞表面と結合する(膜結合ポリペプチド)場合には、通常は膜画分が、膜結合IGS5ポリペプチドを蓄積させるために製造される。IGS5ポリペプチドは捕集され、かつ、硫酸アンモニウム沈殿法またはエタノール沈殿法、酸抽出法、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水干渉クロマトグラフィー(hydrophobic interaction chromatography)、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組み換え細胞カルチャーから精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製のために使用する。タンパク質を再生するための公知の方法は、ポリペプチドが、細胞内合成、単離および/または精製中で変性される場合には、活性のコンフォメーションを再生するために使用されてもよい。
【0090】
IGS5ポリペプチドを製造するために使用される、単離されたIGS5ポリヌクレオチド、特に単離されたヒトIGS5ポリヌクレオチドは、通常、全コーディング領域上で、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたポリペプチドの1種をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。これに関連して、少なくとも97%の同一性を有するポリヌクレオチドが好ましいが、さらに少なくとも98〜99%の同一性を有するポリヌクレオチドがより好ましく、かつ少なくとも99%、特に99.9%の同一性を有するポリヌクレオチドは勿論好ましい。たとえば、このような単離された、特にIGS5ポリペプチドを製造するために使用されてもよいヒトIGS5ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3および配列番号5の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して、完全長で、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。これに関連して、配列番号1、配列番号3および配列番号5の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して、少なくとも97%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むIGS5ポリヌクレオチドが好ましく、さらに少なくとも98〜99%の同一性を有するものが特に好ましく、かつ少なくとも99%、特異99.9%の同一性を有するものが最も好ましい。配列番号1のIGS5ポリヌクレオチド配列(“IGS5DNA”と呼称される)は、第1表に示されており、この場合、これらは、長さ2076ヌクレオチドを有するヒト由来(ホモサピエンス)のcDNA配列を示しており、かつ、第2表に示された配列番号2のポリペプチド(“IGS5PROT”と呼称される)である、691アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列(1〜2073のヌクレオチド)を含む。配列番号3のヌクレオチド配列(“IGS5DNA1”と呼称される)は、第3表に示されており、この場合、これは、長さ2340ヌクレオチド(停止コドン tagを含む)を有するヒト由来(ホモサピエンス)のcDNA配列を示し、かつ第4表に示された配列番号4のポリペプチド(“IGS5PROT1”と呼称される)である、779アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列(ヌクレオチド1〜2337)を含む。配列番号5のヌクレオチド配列(“IGS5DNA2”と呼称される)は、第5表に示されており、この場合、これは、長さ2262ヌクレオチド(停止コドン tagを含む)を有するヒト(ホモサピエンス)由来のcDNA配列を示し、かつ、第6表に示された配列番号6のポリペプチド(“IGS5PROT2”と呼称される)である、753アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列(ヌクレオチド1〜2259)を含む。
新規の治療的概念として組み合わされたか、または同時に生じる選択的NEP/IGS5−抑制活性を有する化合物
本発明は、IGS5メタロプロテアーゼと、少なくとも1個の他のメタロプロテアーゼ、たとえば、特にNEP、さらに場合によってはECE/ACEとの組合せ物が、前記に示された疾病に関する1種またはそれ以上の生物学的機能に対して応答性であることを見出した。したがって、最も広範囲の態様において、本発明は、前記疾病を治療するための新規治療概念を提供するものであって、この場合、これは、中性エンドペプチダーゼ(NEP)およびメタロプロテアーゼIGS5上での、組み合わされたかまたは同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物または生分解可能なエステルについて、NEPとIGS5とを組み合わせて、または同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するために使用することを、初めて示唆するものである。
【0091】
IGSメタロプロテアーゼおよびNEPの機能を同時に抑制する、本発明による有用な化合物は、IGS5メタロプロテアーゼ、および場合によってはNEPを用いてのスクリーニング方法によって、適切な酵素阻害アッセイ法において同定されてもよい。このような酵素阻害アッセイ法は、詳細には、以下の実施例において記載されている。組み合わされたかまたは同時の選択的NEP/IGS5−抑制活性を有する化合物を同定するために、候補化合物を、別々に、NEP−抑制アッセイおよびIGS5−抑制アッセイの双方において試験することができる。NEP/IGS5−抑制化合物は、種々の源、たとえば、細胞、無細胞調製物、ケミカルライブラリー、および天然産物混合物から同定することができる。
【0092】
スクリーニング方法は、細胞媒体上に放出したポリペプチドの活性上であるか、あるいはポリペプチドを有する細胞または膜上での候補化合物の作用を簡単に測定することができる。二者択一的に、スクリーニング方法は、競合相手を用いての競合スクリーニングを含むものであってもよい。さらに、これらのスクリーニング方法は、候補化合物が、ポリペプチドの活性または抑制によって生成されたシグナルを生じるかどうかについて、細胞媒体中に放出されたポリペプチドの活性またはポリペプチドを有する細胞または膜に適した検出系を用いて試験することができる。ポリペプチド活性の抑制は、一般には、公知の基質の存在下でアッセイされ、かつ候補化合物の作用を、変更された活性によって、たとえば、候補化合物がポリペプチドの抑制を生じるかどうかについて試験することによって観察した。たとえば、スクリーニング方法は、簡単には、候補化合物、本発明において重要とされるポリペプチドを含有する溶液、さらには適した基質を混合することで混合物を形成し、混合物中のポリペプチド活性を測定し、かつ、混合物のポリペプチド活性と、候補化合物を含まないスタンダードとを比較する工程を含んでいてもよい。
【0093】
さらに、本発明は、当業者によって化合物、たとえば、候補化合物を、本発明によって見出されたものを含むスクリーニング方法を用いて同定することを可能にし、この場合、前記化合物は、特に、前記に示された機能不全、障害または疾病に期待される薬剤候補物として示されてもよい。当業者によれば、さらにIGSメタロプロテアーゼが、IGS5抑制化合物の構造に基づくデザインのための方法において、使用されてもよいことが容易に認識され、この場合、この方法は、
(a)まず、IGS5メタロプロテアーゼの三次元的構造を測定または使用し、
(b)IGS5インヒビターの1個または複数個の考えられうる反応部位かまたは結合部位に関する三次元構造を導きだし、
(c)導き出された結合部位または反応部位と結合または反応することが予想される候補化合物を合成し、かつ、
(d)候補化合物がさらにIGS5インヒビターであるかどうかについて試験する。さらに、これは通常反復工程であってもよいとみなされる。
【0094】
今日において、当業者であれば、有効な生理学的性質または薬理学的性質を試験すべき価値を有する新規物質または化合物を製造するために、有機合成の計画および実施のための近代的な戦略をよくこころえており、このような化合物は、特定の機能不全、障害または疾病の治療および/または予防のための期待される新規薬剤候補物として立証されることが期待される。したがって、今日においては、コンビナトリーケミストリー、たとえば、一般的かつ“直接的な”薬剤または化合物ライブラリーを用いて、化合物ライブラリーを提供することが一般的であり、この場合、このファルマコフォアの構造および多様性および残基または置換基は当業者に公知である。未知の構造を有するケミカルライブラリーまたは化合物ライブラリーが、スクリーニングアッセイにおいて試験される場合には、それにもかかわらず、有効性が期待される化合物、たとえば候補化合物を、今日において確立されている分析手段、たとえば質量分光分析、核磁気共鳴、赤外分光、融点、キラル化合物が含まれる場合にはその旋光性および元素分析によって、その構造および化学的性質について簡単に分析することができる。
【0095】
したがって、本発明は、IGS5ポリペプチドを抑制する能力を有する定義された化学構造を有する候補化合物を製造するための方法に関し、この場合、この方法は、化合物、その製薬学的に認容性の塩、またはその生物的不安定性エステルを、化学合成によって製造することを含み、この場合、IGS5ポリペプチドを抑制するための化合物の活性は、たとえば、本発明の実施例部分で記載されているようなスクリーニング方法によって同定することが可能である。
【0096】
たとえば、化学有機合成の詳細、および、化学的、分析的および物理的方法に関してのその詳細は、“Houben-Weyl”(Houben-Weyl, “Methoden der Organischen Chemie”, Georf Thieme Verlag, Stuttgart, New York)ハンドブック最新版に記載されている。
【0097】
本発明の1個の実施態様は、前記に示されたような式Iの化合物、およびその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルを、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)と、
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、完全長で、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるメタロプロテアーゼIGS5とを、
組み合わせてかまたは同時に抑制することによって、緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するために使用することに関する。
【0098】
本発明の好ましい実施態様は、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上および、
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、完全長で、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるメタロプロテアーゼIGS5上での、組み合わされたかまた同時の抑制活性を有する、本発明による化合物、特に式Iを有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生分解生エステルを、大型哺乳類、好ましくはヒトにおいて、高血圧症の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛を治療および/または予防するための医薬(医薬品組成物)を製造するために使用することに関する。
【0099】
式Iの化合物は、式Iaの化合物に関して適した、米国特許第5677297号明細書の開示、および式Ibの化合物に関して適した米国特許第5952327号明細書の開示にしたがって製造することができる。
ドラックデザインおよびリード構造の最適化における、タンパク質−リガンド複合体
他の態様において、本発明は、配列番号2、配列番号4および配列番号5のポリペプチドの一つに対して、少なくとも70%の同一性を有するIGS5ポリペプチドを含有するタンパク質−リガンド−複合体、およびIGS−化合物、好ましくは、少なくとも式Iの化合物またはこれに匹敵するIGS5抑制活性を有する化合物に関する。このようなタンパク質−リガンド−複合体は、特に、ドラックデザイン法、リード構造の発見、リード構造の最適化および修飾方法において特に有用である。これらの方法は、当業者に公知である。たとえばコンビナトリー合成および多次元NMR−スペクトルは文献に記載されており、かつ、これはタンパク質−リガンド−相互作用を認識するのに役立つ(Kressler, Angew. Chem. 1997, 109,857-859;James K. Chen et al., Angew. Chem. 107(1995), S. 1041-1058)。さらに、ドラックデザインにおけるツールとしての分子錯体のNMR試験は、Fesik(Journal of Medicinal Chemistry, 34 (1991), S.2937-2945)によって記載されており、かつ、ドラックデザインにおける手段として酵素/インヒビター複合体の構造を測定するためのNMR方法もFesikらによって示されてる(Biochemical Pharmacology 40 (1990), S. 161-167)。Rossらの極めて最新の報告(Journal of Biomolecular NMR, 16:139-146 (2000))によれば、NMR測定の自動化および標的タンパク質、たとえばレセプターを有する小さい分子の体系的スクリーニング相互作用に関するデータの評価が記載されている。
【0100】
したがって、さらに本発明は、配列番号2、配列番号4および配列番号6のポリペプチドの一つに対して、少なくとも70%の同一性を有するIGS5ポリペプチドと、IGS5結合活性およびIGS5抑制活性を有するリード構造のデザインおよび修飾または最適化のためのIGS5結合化合物とを含有するタンパク質−リガンド−複合体の使用に関する。
併用療法(NEP/IGS5抑制化合物およびECE/ACE−抑制化合物)
すでに前記に簡単に示したように、本発明による、組み合わせたかまたは同時に生じるNEP/IGS抑制活性を示す化合物、たとえば、式Iの化合物、好ましくは式Iaまたは式Ibの化合物と、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の、別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼ活性を有する化合物とを、付加的に組み合わせることは有利である。組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する前記化合物との組合せにおいて使用されてもよいこのような他のメタロプロテアーゼインヒビターは、たとえば、ACEインヒビター、たとえば、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルであり、さらに、選択的ECEインヒビター、たとえば、化合物SM−19712(Sumitomo前記);選択的NEPインヒビター、たとえば、チオファン、NEP/ECEの二重インヒビター、たとえば化合物CGS−35066(De Lombart et al., J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3): 488-504);またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビター、たとえばオマパトリエートまたはサンパトリエートである。組み合わされた治療および/または予防のこの型によって、組み合わされたかまたは同時に生じるNEP/IGS5抑制活性を有する化合物の治療的価値はさらに増加してもよく、特にこれは、前記疾病および/または症状に関するものである。したがって、本発明の他の態様において、併用治療および/または併用予防に関連する。併用治療および/または予防のこの型によって、組み合わせたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する前記化合物、特に式Iを有する化合物、好ましくは式IaまたはIbを有する化合物の治療的価値は、特に、前記に示された疾病および/または症状に関してさらに増加する。
【0101】
したがって、これに関連して、本発明は、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す第一化合物、または製薬学的に認容性の塩または溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関するが、本発明に関しては前記に記載したように、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも一つの付加的な化合物との組合せ物で、本発明に関連して、前記に示されたような任意の疾病または症状の組み合わされた治療および/または予防のための医薬品(医薬品組成物)の製造のために使用することができる。この場合、前記の付加的な化合物は、好ましくはACEインヒビター、選択的ECEインヒビター、選択的NEPインヒビター、NEP/ECEの二重のインヒビターおよびこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている。特に、前記の付加的な化合物の少なくとも1個との組合せにおいて、前記の第一化合物の本発明による使用は、第一化合物において、化合物が式Iの構造、好ましくは式IaまたはIbの構造を有する化合物であり、その際、これらの式は、本発明において前記に示されたものである。好ましくは、前記第一化合物と、少なくとも1個の前記付加的な化合物との組合せにおける使用は、さらに、組合せ物が、同時に効果的であり、好ましくは、相乗的に効果的であることを特徴とする。
【0102】
さらに、これに関して本発明は、前記に示された任意の疾病または症状の組み合わされた治療および/または組み合わされた予防のために、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量の、前記に示したように組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制を有する第一化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターから選択された少なくとも1個の付加的な化合物とを含有する医薬品組成物(医薬)に関し、その際、付加的な化合物は、好ましくは、ACEインヒビター、選択的ECEインヒビター、選択的NEPインヒビター、NEP/ECEの二重のインヒビター、およびこれらメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている。特に、本発明による医薬品組成物は、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量の、前記第一化合物と少なくとも1個の前記付加的化合物とを含有し、この場合、これらは、本発明に関して前記に示したように、第一化合物が、式Iの構造、好ましくは式Iaまたは式Ibの構造を有することを特徴とする。
【0103】
本発明による併用治療および/または併用予防が、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する第一化合物またはその製薬学的に認容性の塩またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個かおよび/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターから選択された付加的な化合物とを、同時に、第一化合物および第二化合物に関して、単一の医薬品組合せ製剤または別個の医薬品組成物として投与するか、別個に、たとえば、連続的または順次であってもよい投与計画または体系によってか、あるいは患者の緩和および/または予防すべき疾病または症状に適しているかどうかをみながら段階的に、このような治療および/または予防を必要とする患者に投与することによって達成することができることは当業者にとっては自明である。
配合および投与
前記のように本発明は、組み合わされたかまたは同時の選択的NEP/IGS5−抑制化合物、場合によっては、別個のACE−および/またはECE−抑制化合物との組み合わせ物、またはこれらそれぞれの製薬学的に認容性の塩、溶媒和物または生物的不安定性エステルが、有利な治療的活性を有することを示した。したがって、これらの化合物、場合によっては別個のACE−および/またはECE−インヒビターとの組合せ物は、大型哺乳類、特にヒトにおいて、高血圧の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛を治療および/または予防するための医薬として適している。NEP/IGS5−抑制化合物、場合によっては別個のACE−および/またはECE−抑制化合物との組み合わせ物は、すべての公知の投与経路で投与されてもよい。
【0104】
組成物は、投与経路に関して適用されてもよく、特に、全身的であるかまたは経口経路によるものである。全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を含む。他の注入経路、たとえば座薬、筋注または皮下注射が使用されてもよい。二者択一的な全身投与のための手段は、粘膜吸収および経皮吸収投与を包含し、この場合、これらは、浸透剤、たとえば胆汁酸塩またはフシジン酸塩または他のデタージェントを含む。さらに、化合物は、腸溶製剤またはカプセル化剤の形で処方されてもよく、さらに経口投与も可能であってもよい。このような化合物の投与はさらに、局所的および/または局在的に、軟膏、ペースト、ゲル等の形であってもよい。
【0105】
本発明による投与に関して、本発明において前記に示された疾病または症状を、緩和するかおよび/または予防する、NEP/IGS5−抑制化合物の治療的活性量は、通常の製薬学的助剤および/または添加剤を、固体または液体の製薬学的処方において包含することができる。
【0106】
固体の投与形の例は、たとえば固体、半固体、凍結乾燥粉末、タブレット、被覆タブレット、ピル、カプセル、粉末、顆粒または坐剤であってもよく、さらに、持効性製剤の形であってもよい。このような固体の投与形は、標準的な製薬学的無機および/または有機助剤を含有していてもよい。このような助剤は、製薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、硫酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム、さらに常用の製薬学的添加剤、たとえば、充填剤、潤滑剤またはタブレット崩壊剤を含む。液体製剤、たとえば活性成分の溶液、懸濁液または乳液は、通常の希釈剤、たとえば水、油および/または懸濁剤、たとえばポリエチレングリコール等を含有していてもよい、他の添加剤、たとえば保存剤、矯味剤等をさらに添加してもよい。
【0107】
活性成分は、公知の方法で、製薬学的助剤および/または添加剤と一緒に混合してもよいかまたは配合してもよい。固体の投与形態の製造に関して、たとえば、活性成分は、助剤および/または添加剤と一緒に混合されてもよく、かつ、ウェットまたはドライの工程で造粒されてもよい。顆粒または粉末は、直接的にカプセル中に装填されてもよいか、あるいは、タブレットコアの形に圧縮されてもよい。好ましい場合には、これらは公知の方法で被覆されてもよい。
【0108】
液体製剤は、化合物および場合によっては製薬学的アジュバントを、キャリアー、たとえば塩水溶液、水性デキストロースまたはエタノール中に溶解するかまたは分散することによって製造することで、溶液または懸濁液を形成することができる。
【0109】
投与すべき用量は、固体間で、かつ勿論、治療すべき症状の型およぶ投与経路に依存して異なっていてもよい。たとえば、局所的に適用可能な製剤、注入可能な製剤は、一般には、本質的に全身適応の製剤よりも低い活性物質の量を含む。このようにして、要求される用量範囲は、特に、化合物の選択、投与経路、処方の性質および患者の症状の点で担当の医師の判断にゆだねるものである。しかしながら、適した用量の範囲は、患者当たり0.1〜100μg/kgである。しかしながら、必要とされる投与量の広範囲の多様性は、化合物の種々の利用可能性および種々の投与経路の異なる効率の点で、予想されるものである。たとえば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予想される。これらの投与量における差異は、最適化のための標準的経験によってかまたは同様に技術水準において調整することができる。
IGS5DNAおよびIGS5タンパク質配列を含む表
【0110】
【表1】
【0111】
【表2】
【0112】
【表3】
【0113】
【表4】
【0114】
【表5】
【0115】
【表6】
【0116】
本明細書中で引用された、特許および特許出願に制限することのないすべての刊行物は、ここでは参考のためにのみ記載されているものである。
【0117】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例証するものであって、いずれの場合であっても、本発明の範囲を制限するものではない。
例1 ネプリライシン NEP/ECEメタロプロテアーゼファミリーの新規メンバーをコードするcDNAのクローニング
例1a IGS5のcDNAコーディング配列の相同性クローニングの概略
M13サブファミリーのメタロプロテアーゼは、種々の神経ペプチドおよびホルモンペプチドの代謝において含まれる。現在において、このサブファミリーは、ネプリライシン(NEP)、エンドセリン−変換酵素−1(ECE−1)、ECE−2、Kell、PexおよびXCEを含む。
【0118】
NEPおよびECEのインヒビターは、たとえば、心臓および胃腸における治療的使用のために開発されてきたものである。このファミリーの付加的なメンバーは、重要な薬剤の標的であってもよいことから、相同性クローニングを、ヒトゲノム中で新規の遺伝子を同定するために使用した。
【0119】
IGS5の相同性クローニングは、前記に示された一般的な記載および本明細書中で参考のために記載されている国際特許出願PCT/EP00/11532の実施例の部分においてさらに例証されている試験データによって実施された。方法は以下の通りである。
【0120】
発現配列tags(ESTs)のデータバンクにおいて、配列は、NEP/ECE−様のメタロプロテアーゼのC−末端部との類似を示す小さいオープンリーディングフレームを含んでいることが検出された。これらのEST配列およびNEP/ECE−様メタロプロテアーゼの保存的ペプチドモティーフに基づいて、我々は、ヒトの肺、心臓および精巣cDNAから完全なcDNA配列をクローニングするための変性PCRを使用した。
【0121】
cDNA配列はグリコシル化タンパク質、すなわちIGS5か、あるいは、二者択一的なヒト可溶性エンドペプチダーゼ(hSEP)をコードし、この場合、これは、M13ファミリーメンバーの特徴を示している。IGS5は、マウスSEP(78%)、マウス、ラットおよびヒトNEP(54%)およびヒトECE−1(39%)に対して高いアミノ酸配列の同一性を示した。マウスSEPおよびSEP△スプライシング変異体との類似性において、さらに、78bpで二者択一的なエキソンで異なる2種のIGS5スプライシングの型が検出された。これらのスプライシング型は、それぞれ、タンパク質の753および779残基をコードする。より長い型は、膜内外アンカーと近接して配置された推定タンパク質分解部位を含む。したがって、2種のスプライシング変異体は、IGS5タンパク質の膜結合および可溶性の形を示す。
【0122】
多重組織ドットブロット分析(multiple tissue dot blot analysis)および定量的PCRを用いての発現分析は、種々のヒト組織中で、精巣中で観察された最も強いシグナルでの発現を示した。さらに、IGS5mRNA発現は、たとえば、前立腺、小腸、胃、結腸、腎臓および脳で観察された。2種のスプライシング変異体は、顕著な発現パターンを示した。
【0123】
機能的特徴については、この酵素が、ネプリライシンファミリーの真性メンバーであり、かつECE活性を有することが確認された。
例1b.NEP/ECE メタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配列を含むIGS5のアライメント
オリジナルとしてクローニングされたIGS5に関して(実施例1参照)、最新のタンパク質データバンクおよび翻訳DNAデータバンクのホモロジーサーチは、BLASTアルゴリズムを用いて実施された(Altschul S.F. et al. [1997], Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)。これらのサーチは、オリジナルとして得られたIGS5タンパク質が、マウス、ラットおよびヒトの中性エンドペプチダーゼに対して最も類似していることを示した(SW:NEP_MOUSE 寄託番号Q61391;SW:NEP_RAT、寄託番号P07861およびSW:NEP_HUMAN、寄託番号P08473)。したがって、NEP/ECEファミリーの他のメンバーを含むほぼ完全なIGS5タンパク質配列のこのアライメントは、一般にはIGS5とメタロプロテアーゼとの関連性を示し、特に、NEPおよび/またはECEメタロプロテアーゼファミリーとの関連性を示した。この構造的アライメントから、IGS5が、メタロプロテアーゼの機能を有していると考えられ、したがって、これらは、動物およびヒトにおけるいくつかの不全症、障害または疾病において重要である。
例1c.IGS5の完全長コーディング配列を含むcDNAフラグメントのクローニング
付加的なIGS5cDNA配列を得るために、RT−PCRの他のラウンドを、ヒト肺RNA上で、前記条件下で、IGS5特異的リバースプライマーを用いておこなった。得られるコンティグは、“ATG”開始コドンで開始し、かつ、マウスSEPタンパク質のN−末端配列と高い類似性を示すタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた。
【0124】
すべての単離されたクローンのDNA配列のアセンブリは、2種のcDNA配列の存在を示し、この場合、これらは、ゲノミッククローンIGS5/S1の範囲内で最初に同定された、78bpセグメントの有無によって異なっていた。これらの2種の配列は同様に、二者択一的なスプライシングRNA分子に由来するものである。最も長いトランスクリプトは、2337ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み(779残基のタンパク質をコードする)、その一方で、最も短いトランスクリプトは、2259ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有している(753残基のタンパク質をコードする)。コーディング配列および長鎖のタンパク質配列は、IGS5DNA1(配列番号3で示され、停止コドンtagを含む2340bp)およびIGS5PROT1(配列番号4)としてそれぞれ呼称され、その一方で、短鎖のコーディング配列およびタンパク質配列は、IGS5DNA2(配列番号5;停止コドンtagを含む2262bp)およびIGS5PROT2(配列番号6)と、それぞれ呼称される。IGS5DNA1およびIGS5DNA2の範囲内で仮定されるメチオニン開始コドンの下流には、付加的なインフレームメチオニンコドンが、コドン位置10で存在する。開始コドンとしての第1メチオニンコドンに関しては、コドン位置10でいくつかの翻訳を開始(またはさらには排他的に)を排除することができないが、それというのも双方のメチオニンが、翻訳内容の同等に好ましい “Kozak”開始の範囲内で生じるためである(Koza M., Gene [1999]:234:187-208)。IGS5PROT1およびIGS5PROT2配列のハイドロパシー分析(Kyte J. et al., J. Mol. Biol. [1982]157:105-132; Klein P et al., Biochem. Biophys. Acta [1985]815: 468-476)は、残基22〜50の間のシングルトランスメンブレンドメインの存在を示した。これは、IGS5PROT1およびIGS5PROT2が、タイプIIの一体型膜タンパク質であることを示し、かつこれによって、NEP/ECEタンパク質ファミリーの他のメンバーとの膜トポロジー類似性を有する。
例1c.NEP/ECEメタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配列を含む、例1cのIGS5タンパク質配列のアライメント
例1cでクローニングされたIGS5に関して、今日のタンパク質データバンクおよび翻訳されたDNAデータバンクのホモロジーサーチを、BLASTアルゴリズムを用いて実施した(Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. [1997]25:3389-3402)。これらのサーチは、IGS5PROT1がマウスSEPと最も類似しており(778の配列された残基上での76%の同一性)(GenBank 寄託番号AF157105)、さらには、マウス、ラットおよびヒトの中性エンドペプチダーゼ(SW:NEP_MOUSE 寄託番号Q61391;SW:NEP_RAT、寄託番号P07861およびSW:NEP_HUMAN、寄託番号P08473)に対する696の配列された残基上で、54〜55%の同一性を示した。IGS5PROT2のホモロジーサーチは、この配列が、マウスSEPΔ(GenBank 配列番号AF157106)に対して最も類似していることを示した(752配列残基上の78%の同一性)。マウスSEPおよびSEPΔタンパク質との類似において、IGS5PROT1およびIGS5PROT2が、IGS5タンパク質の可溶性形態および膜結合形態をそれぞれ示すことが予想された。これは、二者択一的なスプライシング78bpエキソンの3’末端でコードされた二塩基性残基(KRK)の存在によって確立された。
【0125】
したがって、NEP/ECEファミリーの他のメンバーを含む完全なIGS5タンパク質配列のこのアライメントは、一般に、IGS5とNEP/ECE/メタロプロテアーゼとの関連性、特に、SEPとNEPファミリーメンバーとの関連性を示す。この構造的アライメントから、IGS5タンパク質が、メタロプロテアーゼの機能を有しており、これによって、動物およびヒトにおけるいくつかの不全症、障害または疾病において重要であることが推測された。
【0126】
例2.ヒトIGS5の可溶性HIS−tagエクトドメインの発現および精製
試験の目的は、バキュロウイルス発現系を用いて、可溶性IGS5タンパク質を製造することである。組み換えバキュロウイルスは、Sf9細胞系の感染を用いて、His6−tagIGS5エクトドメインの発現を構築する。その後に、可溶性IGS5タンパク質は、培養上清から、レンチル−レクチンおよびZn−IMACクロマトグラフィーを含む2段階工程で精製され、かつ、His6−ECE−1に関する技術水準でおこなった。
例2a.試験方法
キネティック発現分析
10%の不活化ウシ胎児血清を含むTC100培地(JRH Bioscience キット番号10084168)中で、27℃で、撹拌フラスコ中の懸濁液中で指数的に増殖させた519細胞(IGCL 83.0)を、低速の遠心分離によって捕集し、かつ、血清不含のTC100培地中で、5x105細胞/Fk(25cm2)で、血清不含のTC100媒体中に接種した。候補となる組み換えウイルスクローンを、3pfu/細胞の多重感染(MOI)で添加し、その後に、細胞/ウイルスを、27℃でインキュベートした、細胞および調製培地(CM)を、2回に亘っての連続的な低速遠心分離によって、感染の24、48および72時間後にハーベストした。試料をSDS PAGEによるゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングによって分析した。
脱グリコシル化試験
試料に最終濃度1%でSDSを添加し、かつ5分間に亘って95℃でインキュベートした。2xインキュベーションバッファー1容量(250mM リン酸バッファー、50mM EDTA、5% N−オクチルグリコシド、1% 2−メルカプトエタノール)を添加し、かつ付加的な5分間に亘っての95℃でのインキュベーション時間の後に、試料を37℃に冷却した。N−グリコシダーゼF 1U(Boehringer Mannheim, キット番号1365177)を添加し、かつ37℃で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、試料を100mM DTTで還元した(最終濃度)。
製造工程
10%の不活性化ウシ胎児血清を含むTC100培地(JRH Biosciences, キット番号56941)中で、27℃で、撹拌フラスコ中で、懸濁液中で指数的に増殖した519細胞(IGCL 83−2)を、低速の遠心分離によって回収し、かつ、TC100媒体中の2x106細胞/mlの密度で懸濁し、0.013 TIU アプロチニン/ml(Pentex)を添加した。組換えウイルスIGBV73を、2.25pfu/細胞の多重感染(MOI)で細胞に添加した(MOI3の代わりに、主要ウイルスバンクの低いタイターによって)。細胞/ウイルス懸濁液をその後に、27℃で、ガラスローラーボトル(3 x 500 ml /1260 cm2)中で、72時間に亘ってインキュベーションした。その後に、CM(1.5l)を、細胞および細胞崩壊物から、2回に亘っての連続的な低速遠心分離によって洗浄した。アリコートをウエスタンブロッティング分析による質的調整のために取り出し、かつ、エンドトキシンレベルを測定した。
例2b.結果
発現のキネティクス
3個の候補となる組換えウイルスクローンの発現のキネティクスを、ウエスタンブロット分析により試験した。ウエスタンブロットは、すべての候補となるクローンのCM中でほぼ81kDaで、明瞭なバンドを示し、この場合、これは、成熟タンパク質(81.2kDa)の理論的Mrに相当する。細胞溶解物に関しては、SDSゲルはオーバーロードであったために結果は得られなかった。全部で3個のクローンの発現レベルは、感染後48〜72時間でピークに達した。クローン2をさらに増幅させるために選択し、かつ、IGBV73として寄託した。最適なハーベスト時間は感染後72時間に設定した。
脱グリコシル化試験
可溶性のIGS5タンパク質配列は、8個のポテンシャルなN−グリコシル化部位を有している。精製工程は、CMおよび細胞溶解物のレンチル−レクチンカラム試料上での糖残基の結合を含むが、感染後72時間にハーベストされたものは、N−グリコシダーゼFでの脱グリコシル化のために使用し、組み換えの可溶性His6IGS5タンパク質がさらにグリコシル化タンパク質として発現されるかどうかを試験した。
【0127】
N−グリコシダーゼFによって処理されたCM試料、および非処理のコントロール群のウエスタンブロット分析は、試料が脱グリコシル化された場合にMr中でのシフトを示し、その際、溶解性のヒトHis−tagIGS5が、グリコシル化タンパク質として発現するかどうかを試験した。非処理の細胞溶解物中において、約80〜82kDaの3個のタンパク質バンドが観察されてもよい。N−グリコシダーゼF処理上で、おおよそ80kDaの1バンドは、依然として可視的であり、この場合、これは、非処理試料の最も低いMWバンドに相当する。
製造工程
CM 1.5lを、感染72時間後に、IGBV7感染されたSf9昆虫細胞からハーベストした。エンドトキシン内容を、0.0847EU/mlであると測定した。ウエスタンブロット分析は、CM中でおおよそ81kDaの明瞭なバンドを示し、この場合、これは、成熟した可溶性HistagIGS5のMWに相当する。細胞溶解物試料と比較した場合に、3個のタンパク質バンドが示され、弱い中程度のMrバンドに相当するCMタンパク質バンドが、細胞中に存在した。
例3.IGS5の精製
例3a.実験方法
試料処理
1タブレットのEDTA不含コンプレート(EFC;Roche Biochemicals, キット番号1873580)を300mlの精製されたバキュロCMに添加した。HEPES、グリセロールおよびTween20を、それぞれ20mM、5%(v/v)および0.005%(w/v)の最終濃度に添加した。CMのpHを7.4に調整し、かつ試料を、Durapora メンブレンフィルター 0.2μ GVで濾過した。すべての精製工程を4℃で実施した。
レンチル レクチン クロマトグラフィー
バキュロ試料を、C10/10カラム(Pharmacia)中の5ml レンチル レクチン セファロース樹脂上で、0.3ml/分で、一晩に亘ってロードし、この場合、このカラムは、1タブレットのEFC/500mlが添加されたバッファーA(20mM Hepes,150mM NaCl、5%グリセロール、0.005%Tween20)で平衡化した。カラムを、平衡化バッファーで、280nmでの吸光度が基準値に達するまで洗浄し、かつ結合タンパク質を、0.5M α−メチルピラノシドを含有するバッファーAを添加することによって溶離した。カラムに、100mMアセテート、500mM NaCl、pH5.0を添加することによって再生させた。溶離液および再生液を捕集し、かつプールを12.5%のPhastゲル(Pharmacia)上でのSDS−PAGEおよび銀染色によって分析した。前染色マーカー(Gibco)は、相対的な分子量マーカー(Mr)スタンダードとして含まれている。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)および透析
1mlのキレ−ト化HiTrap(Pharmacia)を製品説明書に記載されているように亜鉛イオンでロードし、かつバッファーB(20mM Hepes, 100mM NaCl, 5% グリセロール、0.005%(w/v)Tween20、pH7.2)で平衡化した。レンチル溶離プール1および2を別個に、HiTrapカラム上でそれぞれ0.5ml/分でロードした(IMACランAおよびIMACランB)。ブランクのランは、クロマトグラフィーの吸光プロフィールとの比較のために使用した。カラムをバッファーBで、基準値のレベルまで洗浄し、かつ結合タンパク質は、バッファーB中のイミダゾール勾配溶液(20、50、100および200mM)を添加することによって溶離した。画分を手動で捕集した。IMACカラムに、20mM Hepes、50mM EDTA、500mM NaCl、pH7.2を添加することによって再生させた。溶離プールおよび再生プールを、SDS−PAGE(12.5% Phast gels, Pharmacia)および銀染色によって分析した。200mM イミダゾールプールを、 slide a−lyzer−cassette(MWCO 10,000,Pierce)に移し、かつバッファーBに対して一晩に亘って透析した(130倍過剰量、バッファーは置換しない)。
タンパク質の定量化
透析プールにおける溶解性IGS5の量を、マイクロ−BCA法を用いて測定した(Pierce)。BSAは参考のために使用した。
タンパク質の特徴付け
透析されたバキュロIGS5を、生化学的に、(1)還元および非還元条件下でのSDS−PAGE、および(2)抗Hig−tagmAbでのウエスタンブロッティング、その後のアルカリフォスファターゼ標識ラビット抗−マウスIg(Dako)でのインキュベーション、およびNBT/BCIP染色による検出によって特徴付けした。溶解性のIGS5のグリコシル化状態を、PGNaseF処理によって検証した(Biorad)。
例3b.結果
0.5M α−メチルピラノシドを有するレシチル溶離プロフィールは、テーリングのあるピークを生じた。流動、洗浄および溶離プールを、SDS−PAGEおよび銀染色によって分析した。タンパク質の主要な量を、流動中で検索し、約85000のMrを有するIGS5−候補となるバンドを、溶離プール1〜3中で観察した。抗His tag mAbを有するレンチルクロマトグラフィーのウエスタンブロット分析は、溶解性hIGS5タンパク質(Mr=85000)が、定量的にレンチルレシチン樹脂と結合し、かつHis−tagタンパク質を、すべての溶離ピーク上で捕集されることを示したが、しかしながら主にプール1と2からであった。レンチルレクチン溶離プール1および2を、さらに亜鉛−IMACカラム(ランAおよびB)上で処理した。結合タンパク質を、イミダゾー勾配により溶離した。SDS−PAGE分析および銀染色は、コンタミネートされたタンパク質の塊が、20mMおよび50mMイミダゾール工程によって溶離したことを示した。hIGS5タンパク質は、100mMおよび200mMのイミダゾール溶離工程において検索された。溶離物中で、最大10%のhIGS5を含有する100mMイミダゾール溶離物は、依然としてMr>115000を有するタンパク質でのコンタミネーションがみられた。さらに、100mM中のIGS5バンドは、ダブルバンドであった。これは、10%未満の二重の弱い上部のバンドが、残留するバキュロウイルスによるコンタミネーションであるかまたはIGS5異性体型であるかどうか、あるいは、下部の(強い)バンドが、カルボキシ残基分解産物であるかどうかを試験するために残した。200mMイミダゾールプール中の85kDaのバンドは、SDS−PAGE上のシングルバンドであり、この場合、これらは、抗his−tag mAbと反応されたものである。
【0128】
銀染色では、IMACランAおよびランBから得られたhIGS5材料との間の任意の純度の違いについては示されない。これは、レシチン溶離物のプール1とプール2とが、さらにプールされ、かつ亜鉛−IMACカラム上の単一のランで同時に処理されてもよいことを示す。
【0129】
同一のバンドパターンは、還元または非還元条件下で、クマシン染色されたSDS−PAGEゲル上で観察され、その際、精製されたhIGS5が、ジスルフィドに基づくオチゴマーを含んでいないことを示した。PGNaseFでの処理は、約5kDaを含むSDS−PAGE上のMrを減少させた。エンドグリコシダーゼでの処理の後のバキュロ発現hIGS5のこの最小限のシフトは、CHO発現マウスSEPに関して観察されたイミグレーションシフトとは明らかに異なっていた(Ikeda et al., JBC, 274, 32469,1999)。
【0130】
バキュロCM 300mlから出発して、95%を上廻る純度のHis−taghIGS5エクトドメイン340μgが、2段階の精製工程によって得られた(すなわち、約1mg/lの収率)。その後に精製産物は、酵素抑制アッセイ中で、以下の実施例で示されたように使用される。
例4.IGS5酵素抑制アッセイ
本発明のIGS5ポリペプチド酵素活性は、生物学的活性ペプチドの代謝に関連して試験された。特に、これらのIGS5ポリペプチドが、当業者に公知の種々の血管作用性ペプチド、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド(ANP)、ブラジキニン、big−エンドセリン(big−ET−1)、エンドセリン(ET−1)、サブスタンスPおよびアンジオテンシン−1上で作用するかどうかについて試験した。本発明の範囲内では、特に、新規のヒトメタロプロテアーゼであるIGS5エクトドメインが、前記血管作用性ペプチドを加水分解するかどうかについて試験した。比較のために、アッセイをさらに、以前Emotoらによって示された可溶性分泌エンドペプチダーゼ(SEP)である、公知のメタロプロテアーゼファミリーメンバーに関しておこなった(J.Biol.Chem., Vol. 274 (1999): pp. 32469-32477)。さらに、big−ET−1アナログ(いわゆる17aabig−ET−1)に変換するIGS5活性が、ECEおよび/またはNEP−特性を有する酵素に関する抑制特性を測定するために使用された、参考化合物によって抑制されるかどうかについて試験した。big−ET−1アナログ上のIGS5−活性の抑制を試験するために使用された化合物は、NEP−特性を有するエンドペプチダーゼを抑制する化合物ホスホラミドン、NEPを選択的に抑制する化合物チオファン、およびNEP/ECEの二重のインヒビターである化合物CGS−35066である。
例4a.材料
酵素:IGS−5(sol hu)(his)6;または;His6−tag IGS5エクトドメイン;
ストック溶液:20mM HEPES pH7.2、5%グリセロール、0.005%Tween20、100mM NaCl、純度>99%;保存4℃
ワーキング溶液:ストック溶液をアッセイバッファーで10μg/mlに希釈した。
基質:Mca−Asp−IIe−Ala−Trp−Phe−Dpa−Thr−Pro−Glu−His−Val−Val−Pro−Tyr−Gly−Leu−Gly−COOH;
フルオレセンス−クエンチング big−ET−1アナログ;
Mca=7−メトキシクマリン−4−イル;
Dpa=3−[2,4−ジニトロフェニル]−L−2,3−ジアミノプロピオニル;
ストック溶液:アッセイバッファー中100μM;−20℃保存(次の供給元から市販されている:Polypeptide Laboratories, Wolfenbuettel, Germany)
アッセイバッファー:100mMトリスpH7.0、250mM NaCl
すべての試験化合物は、10mMのDMSO中で溶解され、かつさらにアッセイバッファーで希釈した。
例4b.アッセイ工程
10μlの酵素ワーキング溶液および10μlの試験化合物溶液を含有するアッセイバッファー 70μl量を、エッペンドルフチューブ中で混合し、かつ、37℃で15分間に亘ってプレインキュベートした。その後に、10μlの基質ストック溶液を添加し、かつ反応混合物を37℃で60分に亘ってインキュベートし、酵素的加水分解をおこなった。引き続いて酵素反応を、95℃で加熱することによって5分に亘って完了させた。遠心分離(Herawus Biofuge B 3分)の後に、上清についてHPLC分析をおこなった。
例4c.HPLC工程
消化産物からの残留する基質を分離するために、逆相HPLC技術を、CC125/4Nucleosil 300/5 C18 RPカラムおよびCC8/4 Nucleosil 100/5 C18 プレカラムを用いて使用した(Macherey-Nagel, Dueren, Germanyから商業的に入手可能である)。したがって、例7b中で得られた反応試料 60μlを、HPLC中に装入し、かつカラムを以下の勾配および溶液を適用させることによって、1ml/分の流量で溶離した:
溶液A:100% H2O+0.5M H3PO4、pH=2.0
溶液B:100% アセトニトリル+0.5M H3PO4
0〜2分 20% B
2〜6分 20〜60% B
6〜8分 60% B
8〜10分 60〜90% B
10〜13分 90% B
13〜15分 90〜100% B
ペプチドを、214nmの吸光度で、かつ励起波長328nmおよび放出波長393nmでのフルオレセンスによって検出した。
例4d.算定
加水分解後のクエンチングされていないMca−発けい団を用いての、ペプチドのHPLC−ピークの増加した蛍光シグナルが、任意の算定のためのベースとして使用された。
【0131】
このシグナルを、インヒビターを含むかまたは含まない試料と比較し、かつ抑制%をそれぞれのピーク面積に基づいて算定した。
抑制%=100★(1−A抑制/Aコントロール)
すべての試料について二重に流し、かつその平均値を使用した。
【0132】
スタンダードインヒビター(10nMおよび100nMホスホアミドン)および溶剤コントロール(0.1%)をそれぞれのアッセイのランに加えた。
例4e.結果
本発明のIGS5ポリペプチドに関して、例4の結果は、これらのIGS5メタロプロテアーゼポリペプチドが、in vitroで、当業者に公知の血管作用性ペプチドを加水分解することを示した。SEP活性と比較しての加水分解アッセイの結果は、第7表に示した。これらの結果から、IGS5は、前記生物学的血管作用性ペプチドの代謝において、特に影響を与えるものと推測される。
【0133】
【表7】
★ 500μg IGS5 ポリペプチド
★★ 10μg IGS5 ポリペプチド
★★★ アンジオテンシンIIの形成を生じないアンジオテンシンIの分解
★★★★ 17aabig−ET−1を、中性big−ET−1のアナログとして使用され;さらにIGS5の加水分解活性が、中性big−ET−1を用いて検出されたが、しかしながら、HPLC−検出を用いての困難性によって定量化されない。
例5.NEP酵素抑制アッセイ
中性エンドペプチダーゼ(E.C. 3.4.24.11)を、Geeらの方法によって、ブタの腎皮質から製造され(Biochem J 1985 May 15; 228 (1): 119-26)、かつReltonら(Biochem J 1983 Dec 1; 215 (3): 519-23)によって示されたように精製した。酵素抑制アッセイに関して、精製された酵素10ng、20μM基質(メチオニン−エンケファリン)および種々のインヒビター濃度を使用した。アッセイバッファーを、50mM トリス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタン/HCl pH7.4であり、全アッセイ容量は100μlであった。酵素およびインヒビターの5分間に亘ってのプレインキュベーション後に、基質を添加し、引き続いて酵素によって誘導される基質の加水分解のための第2インキュベーション工程を、37℃で30分に亘って開始した。酵素反応を、95℃で5分間に亘って加熱することによって停止させた。遠心分離の後に、上清についてHPLCをおこなった。酵素による基質加水分解の産物を、HPLC技術によって、本来の基質から分離し、かつインヒビターのポテンシャルを産物のピーク面積と、本来の基質のピーク面積とを、インヒビターを含むかまたは含まない(コントロール群)双方の試料について比較することによって算定した。酵素を含まないブランク、インヒビターを含まないコントロール群、インヒビターの代わりにインヒビター溶剤を含む試料、および標準的なインヒビターを含む試料を、それぞれのアッセイのランに加えた。
材料の供給元:
NEP:Dr.Philippe Crine,Univ.of Montreal,Canada
メチオニン−エンケファリン:Sigma,Deisenhofen,Germany
例6.ECE酵素抑制アッセイ
組み換えヒトCOOH−末端 His6−tag エンドセリン変換酵素−1を、Sf9−細胞中で発現させた。精製を、アフィニティークロマトグラフィーを用いておこなった。酵素抑制アッセイは、酵素(2.8μg)、5μg 基質(適度に改質化された17アミノ酸切断bigエントセリン−1)、種々の最終濃度でのインヒビターおよび100mMトリス−バッファー(トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン/HCl、pH7.0+150mM NaCl)を最終容量100μl中に含む。37℃で15分に亘ってのインヒビターを含む酵素のプレインキュベーションは、基質の添加および酵素加水分解のためのインキュベーション(37℃で60分)の前におこなった。酵素反応を、95℃で5分に亘っての加熱によって停止させた。遠心分離の後に、上清を、未分解基質からの酵素加水分解産物の分離のためにHPLCをおこなった。抑制%を、コントロール群と比較して、抑制反応に関しての産物および未切断の基質に関するピーク面積に基づいて算定した(インヒビター不含)。酵素を含まないブランク、インヒビターを含まないコントロール、インヒビターの代わりにインヒビター溶剤を含む試料および標準的なインヒビターを含む試料を、それぞれのアッセイのランに加えた。
材料の供給源:
ECE: Innogenetics,Ghent,Belgium
ECE基質:Polypeptide,Wolfenbuettel,Germany
例7:参考化合物と比較してのNEP/IGS5−抑制化合物の生化学的プロフィール
本発明の目的のための、IGS5の製薬学的酵素特性を特徴付け、かつ評価するために、ヒトIGS5タンパク質を、前記実施例中で記載したような発現系としての昆虫細胞を用いて製造し、かつ、IGS5タンパク質の種々のポテンシャルな基質を試験した。例4の結果によれば、IGS5は、big−ET−1、ANPおよびブラジキニンを効果的に消化することを見出し、これによって、新規タンパク質が、広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼであることを確認し、この場合、これは、メタロプロテアーゼの一般的な特徴であり、かつ、これらの特徴は、NEP、ECE−1さらにはACEに関して報告されている。さらに本発明によれば、big−ET−1のIGS5によるタンパク質分解は、驚くべきことに、ET−の正確な形成を生じ、この場合、これは、たとえばbig−ET−1が、正確にアミノ酸Trp21とVal22との間を切断されることによるものである。
【0134】
さらに、メタロプロテアーゼインヒビター化合物と、big−ETをET−1に変換するのを抑制する参考化合物とのポテンシャルは、標識化された蛍光big−ET−1アナログを使用して、例7に記載のようにして試験された。酵素アッセイにおいて適用された方法は、IGS5に関しては例4で前記に示されたように、NEPに関しては例5で、およびECEに関しては例6で記載されている。
【0135】
酵素抑制試験の結果は、第8表に示した。in vivoで、big−ETのET−1への変換を抑制することが知られているホスホラミドンは、さらに本発明において使用された生化学アッセイにおいて高いポテンシャルでIGS5を抑制し、かつ驚くべきことに、ホスホラミドンによるIGS5の抑制は、実際には、ECE−1よりもかなり高かった。対照的に、選択的NEPインヒビターチオファンならびに選択的ECE−1インヒビターSM−19712(4−クロロ−N−[[(4−シアノ−3−メチル−1−フェニル−1H−ピラゾール−5−イル)アミノ)カルボニル]ベンゼンスルホンアミド、一ナトリウム塩;Umekawa K,Hasegawa H,Tsutsumi Y,Sato K,Matsumura Y,Ohashi N.,J Pharmacol 2000 Sep;84(1):7−15;Discovery Research Laboratpories I,Research Center,Sumitomo Pharmaceuticals Co,Ltd,Osaka,Japan)は、IGS5の活性に作用しなかった(第8表)。
【0136】
【表8】
【0137】
本発明による結果は、特に以下の事実から極めて驚異的である。エンドセリン変換酵素−1(ECE−1)が、1994年にクローニングされ、この酵素は、一般にはbig−ET−1のET−1への生理学的変換に関して応答可能なエンドペプチダーゼとして認められるようになった。しかしながら、ECE−1がbig−ET−1を切断する能力を有するといった事実にもかかわらず、最近の報告によれば、ECE−1が唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるのかといった疑問、あるいは少なくとも付加的な酵素が、ET−1生成に係わっているに違いないといった意見が生じた。IGS5タンパク質は、NEPに対して高い類似性を有する(54%の同一性)メタロプロテアーゼであることが見出され、かつ、ECE−1に対してはやや低い類似性である(39%同一性)。例4以下の試験によって、この新規メタロプロテアーゼの酵素的性質を特徴付けるために、ポテンシャルな基質が探され、かつサブスタンスP、ブラジキニン、big−ET−1および効率の低いANP、アンジオテンシンIおよびET−1が、IGS5によって切断されることが見出された。IGS5の酵素活性は、中性pH(7.0〜7.5)で最適化される。big−ET−1のIGS5によるタンパク質分解が、ET−1の正確な形成中に生じることは重要である。
【0138】
本発明による例7の試験によって、IGS5による、big−ETのET−1への変換抑制のためのメタロプロテアーゼインヒビターのポテンシャルが、基質として標識化された蛍光big−ET−1アナログを用いて試験された。In vivoで、big−ETのET−1への変換を抑制することが知られているホスホラミドンは、さらに、生化学的アッセイにおいて、高いポテンシャル(IC50=18nM)でIGS5を抑制する(ECE−1よりも著しく高い)ことは興味深い。対照的に、Sumitomoからの選択的NEPインヒビター チオファンならびに選択的ECE−1インヒビター SM−19712は、IGS5の活性に作用するものではなかった。
【0139】
したがって、式Iの化合物、特に、式IaまたはIbを有する化合物は、それぞれ、驚くべきことに、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示した。式Iaの化合物の典型例として、式Ia−2の化合物、および式Ibの化合物の典型例として、式Ib−8の化合物が、本発明の例中で試験された。双方の化合物は、新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼの極めてポテンシャルなインヒビター(IC50=1.2および2.9nM)であることを示した。
【0001】
本発明は、中性エンドペプチダーゼ(NEP)と特異的メタロプロテアーゼ(MP)とを組み合わせたかまたは同時に作用するインヒビターとして働く化合物の新規医薬としての使用に関し、この場合、これらのインヒビターは、近年、クローニングされ、広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼとして新規に同定されているものである。
【背景技術】
【0002】
メタロプロテアーゼは、構造的および機能的に関連する酵素、たとえばペプチダーゼの特定のファミリーを形成するポリペプチドであり、この場合、これらは、種々の疾病の治療または予防において製薬学的または薬理的重要性を有するものである。幾つかの疾病において、メタロプロテアーゼがその疾病の病理において重要な役割を示すものであることが同定されている。たとえば、技術水準において、多くの亜鉛メタロプロテアーゼまたは構造的および機能的に関連する酵素の特定のファミリーが同定され、特徴付けられており、これによって、これらの酵素、たとえば、亜鉛メタロプロテアーゼの関与が、健康状態および疾病状態の双方に包含される生物学的機能の種々のアレイにおいて、重要な役割を果たすことが明らかになってきた。亜鉛メタロプロテアーゼは、その触媒機能が、活性部位での亜鉛イオンにクリティカルに依存する酵素のサブセットである。配列および構造情報の双方に基づいてクラス分けされた種々のファミリーを含むこれらの酵素群は、たとえば、肺の発生、軟骨および骨の形成、ペプチドホルモンのプロセッシング、生殖(reproduction)、心臓血管障害、関節炎および癌の過程に、密接に作用するものであると記載されている。したがって、健常時および疾病時におけるそれぞれのメタロプロテアーゼの重要な役割、およびこれらの潜在的相互関係を調べるばかりでなく、特に、前記メタロプロテアーゼが影響を及ぼす疾病の管理のために、改善された治療概念をデザインする上で、製薬技術において特に重要である。
【0003】
亜鉛メタロプロテアーゼの亜鉛結合部位周囲の配列および構造情報に基づいて、これらの酵素はいくつかのファミリーに分類されてもよく、この場合、これらのファミリーは、さらにスーパーファミリー、たとえば“メチジシン(metzincins)(アスタシン、セラチア、リプロライシン、マトリキシン)”、“グルジンシン(テルモライシン、ネプリライシン、アンジオテンシン変換酵素、アミノペプチダーゼ)”であるか、あるいはメチジシンおよびグルジンシンのスーパーフェミリーを含む“ジンシン”に分類されてもよい。このようなグループ分けは、一般的な触媒的および生合成的機序の解明手段であるだけでなく、類似の亜鉛結合モティーフを有する新規に同定されたタンパク質の機能を解明する手段でもある。メタロプロテアーゼ、たとえば、亜鉛酵素のいくつかの別個の例は、すでに技術水準において同定されているネプリライシン、エンドセリン変換酵素、アンジオテンシン変換酵素、サーモリシン、アミノペプチダーゼ、アスタシン、セラチア、リプロライシン、マトリキシン、インスリナーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびDD−カルボキシペプチダーゼを含む。
【0004】
中性エンドペプチダーゼ(NEP)、エンドセリン変換酵素(ECE)およびアンジオテンシン変換酵素(ACE)のような、特に重要なメタロプロテアーゼサブタイプのいくつかのより特異的特徴および関連する公知の活性については以下に説明する。
【0005】
アンジオテンシンI変換酵素(ACE;ペプチジル ジペプチダーゼ A;EC3.4.15.1)は、亜鉛メタロプロテアーゼのアンジオテンシン変換酵素ファミリーのメンバーである。ACEは、主に、内皮細胞、上皮細胞および神経上皮細胞(somatic ACE)の表面上で、細胞外酵素として発現し、この場合、細胞外酵素とは、1個または複数個の触媒部位を含むその塊の大部分が、細胞膜に固定され、細胞外環境に接していることを意味する。ACEは、血管内皮細胞の細胞膜中で見出され、その際、肺の血管内皮表面では、ACEの活性部位が循環物質を代謝しているかのように高いレベルで見出されている。ACEの内皮局在に加えて、酵素はさらに、小腸および腎臓近位の曲尿細管の吸収上皮のブラシ縁膜中で発現する。さらに、ACEは単核細胞、たとえば、マクロファージ分別後の単球およびT−リンパ球、さらには繊維芽細胞中で見出される。放射線ラベルした特異的ACEインヒビターを用いてのin vitro オートラジオグラフィーにおいて、および免疫組織化学的試験において、脳におけるACEの主な局在がマッピングされた。ACEは、主に、脈絡叢中で見出され、この場合、これらは、髄液、上衣、脳弓下器官、脳底神経節(尾状−被殻および淡蒼球)、黒質および下垂体中のACEに由来するものであってもよい。ACEの可溶性の形は、たとえば血清、精液、羊水および脳脊髄液の多くの生物学的流体中で検出されてもよい。ACEの可溶性の形は、内皮細胞の酵素の膜結合した形から誘導されることが明らかになった。ACEの主な生理学的活性は、C−末端ジペプチドを切断し、アンジオテンシンIから潜在的血管収縮性ペプチドであるアンジオテンシンIIを生成し、引き続いて、2個のC−末端ジペプチドを除去することによって、血管拡張性ペプチドブラジキニンを不活性化することである。血管作動性ペプチド アンジオテンシンIIとブラジキニンのこれら2種の代謝におけるACE関与の結果から、ACEは、高血圧および鬱血性心不全の治療における重要な分子標的となった。これは、高い効力および特異性を有するACEインヒビターを改善させ、これによりACEインヒビターは、高血圧および鬱血性心不全のこれらの症状をコントロールするための経口活性剤として、臨床的に重要でありかつ普及してきた。血管作動性ペプチドの代謝は、ACEの公知の生理学的機能を維持すると同時に、さらに酵素は、血圧調整に関連しない他の生理学的プロセスの範囲で、ACEの局在化および/または生物学的活性ペプチドのin vitroの切断範囲によって、たとえば、免疫、生殖および神経ペプチド代謝を包含する。
【0006】
中性エンドペプチダーゼ(NEP、ネプリライシン、EC3.4.24.11)は、亜鉛メタロプロテアーゼであり、かつ多くのネプリライシンファミリーに分類される。NEPは、ウサギ腎臓のブラシ縁膜から最初に単離された。その後に、NEP類似酵素が、ウサギ脳で、オピオイドペプチド、エンケファリンの分解において作用するものとして同定された。細胞外酵素NEPのクローニング、および引き続いての特定部位の突然変異誘発試験によって、サーモライシンと類似の特異性を有することが示され、さらに、類似の活性部位構成を有している。また、NEPは、疎水性残基のN−末端において、ペプチド切断に関してサーモライシン類似特異性を示す。NEPの一般的分布に関しては、脳および脊髄、さらには病変において測定されており、かつ電子顕微鏡試験は、一般に、NEPが主に神経的局在を示すことを支持するが、しかしながら酵素は、線条体−淡蒼球および線条体−黒質経路の線維によって取り囲まれた乏突起神経膠芽細胞上、および末梢神経系中のシュワン細胞上に存在していてもよい。NEPは、シナプスとして特異的な膜境界上での濃縮されることなく、むしろ神経核周囲部および神経樹状細胞の表面上に均一に分布している。末梢において、NEPは、特に、腎臓および小腸のブラシ縁膜、リンパ節および胎盤中に富み、かつ大動脈の血管壁を含む他の多くの組織中では低い濃度で見出されている。急性リンパ芽球白血病の共通抗原がNEPであることが見出されたことによって、さらに技術水準においては、酵素が、リンパ球生成細胞(Lymphohaematopoietic cell)の表面上で一時的に存在し、かつ特定の疾病において成熟リンパ球が高レベルで見出されたことが示されている。NEPにおける臨床的重要性、特に、有効な臨床薬としてのNEPインヒビターの重要性は、他の亜鉛メタロプロテアーゼと組合わせてのNEPの作用に由来し、この場合、他の亜鉛メタロプロテアーゼは、エンケファリンの分解、さらには心房性ナトリウム排泄増加ペプチド(ANP)の分解におけるその役割から、アミノペプチダーゼN(APN、膜アラニルアミノペプチダーゼ、EC3.4.11.2)である。たとえば、NEPとアンジオテンシン変換酵素(ACE)との二重のインヒビターは、有効な抗高血圧薬であることが公知であり、これによって、NEP抑制による心房性ナトリウム排泄増加ペプチドの循環レベルの増加と、ACE抑制によるアンジオテンシンIIの循環レベルの減少とを同時に生じる。末梢性酵素がナトリウム排泄増加ペプチドおよび利尿ペプチド、さらには心房性ナトリウム排泄増加ペプチドの分解を示す場合に、臨床的に有効なNEPインヒビターが得られることは興味深い。したがって、NEPインヒビターは、その抗高血圧特性について試験された。他の例から、合成NEPインヒビター、チオファンによるエンケファリン代謝による抑制が、マウスにおいてナロキソン可逆性抗侵害受容性応答を生じることは公知である。これは、その標的レセプターの範囲で内因性オピオイドを増加させることによって、モルホリンまたは他の古典的なアヘン剤の副作用からかなり解放される痛覚欠如が得られる可能性が見出された。これは、任意の顕著な効果を達成するために、他のエンケファリン−代謝酵素が、特にアミノペプチダーゼN(APN)を抑制しなければならないことを実現した。このようなNEP/APNの二重のインヒビターは、完全にエンケファリン代謝をブロックし、かつ強い抗侵害受容特性を有するものである。
【0007】
エンドセリン変換酵素(ECE)は、有効な血管収縮ペプチド エンドセリン(ET)の生合成における最終過程を触媒する。これは、不活性の中間産物、big−エンドセリン中のTrp−Val結合の切断に作用する。ECE−1は、中性エンドペプチダーゼ(NEP;ネプリライシン;EC3.4.24.11、前記)と同種の亜鉛メタロプロテアーゼである。NEPと同様に、ECE−1は、化合物ホスホラミドンによって抑制され、かつ、タイプIIの内在性膜タンパク質である。しかしながら、NEPとは異なり、ECE−1は、ジスルフィド結合二量体として存在し、かつ他のNEPインヒビター、たとえばチオファンによって抑制されることはない。免疫細胞化学的試験は、ECE−1が細胞外酵素として存在する、主な細胞−表面局在を示した。ECE−1は内皮細胞およびいくつかの分泌細胞、たとえば、膵臓中のβ−細胞、および平滑筋細胞に局在している。ECEの有効かつ選択的インヒビターであるか、あるいはECEおよびNEPの二重のインヒビターは、心臓血管系および腎臓系医薬における治療的適用を有していてもよい。2個の分子内ジスルフィド結合を有する、21アミノ酸の二環式ペプチドであるエンドセリン(ET)は、現在において最も有効な血管収縮性ペプチドの一つであると同定されており、かつ動物に投与することで、血圧の持続的増加を生じ、心臓血管調節におけるその有効な働きを増強させた。ヒトにおけるET−1の内在的産生は、基底部(basal)の血管緊張の維持に寄与する。したがって、エンドセリン系および関連酵素たとえばECEは、新規薬剤の改善のための適切な指標を示す。これによって、ECEにおける臨床的重要性、特に有効臨床薬としてのECEインヒビターの重要性は、特に、ETの生合成を含むECEの作用に由来する。したがって、顕著なエンドセリン変換酵素抑制活性を示す化合物は、ETによって誘発されるかまたは誘発が示唆される種々の疾病の治療および予防において有用である。
【0008】
技術水準から公知のメタロプロテアーゼまたはメタロエンドペプチダーゼの特別な基質は、たとえば、big−エンドセリン−1(big−ET−1)、心房性ナトリウム排泄増加ペプチド(ANP)、およびブラジキニンである。たとえば、big−ET−1は、エンドセリン−1(ET−1)の生物学的に不活性な前駆体であることが公知であり、この場合、これらは、特定のタンパク質分解過程を介して、その前駆体 big−エンドセリン−1から製造される、高い有効性を有する血管収縮ペプチドである。ET−1は、ヒトにおける基底部血管緊張の維持において生理学的役割を有しているが、しかしながら、高血圧、心不全およびアテローム性動脈硬化症のような種々の心臓血管疾病の原因であるともみられている。ET−1過剰の副作用を減衰させるための一つの試みは、big−ET−1のET−1への酵素的変換を抑制することである。しかしながら、エンドセリン変換酵素−1(ECE−1)は、1994年にクローニングされており(Xu Dら、Cell, 1994,78: 473-485)、この酵素は一般的に、big−ET−1のET−1への生理学的変換に応答性のエンドペプチダーゼとして認められるようになった。さらに、これ以来、NEP−インヒビダー ホスホラミドンは、さらに有効にECE−1を抑制するツール化合物として広範囲に認められるようになり;さらにその活性は、big−ET−1の注射液を投与された心不全の患者において確認されている(Love MP ら、Circ, 1996, 94: 2131-2137)。
【0009】
しかしながら、ECE−1が、big−ET−1を切断する能力を有するといった事実にもかかわらず、最近の報告では、ECE−1が生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるか疑わしいか、あるいは少なくとも、付加的な酵素がET−1の製造で影響しているにちがいないとの主張が報告された(Barker S ら、Mol Pharmacol,2001,59;163−169)。さらに、Barkerらによれば、エンドセリン−1(ET−1)は、高血圧、肺高血圧、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、および喘息における原因として挙げられた(Douglas, 1997, Tends Pharmacol Sci 18:408-412; Haynes and web, 1998, J Hypertension 16: 1081-1098; Goldie and Henry, 1999, Life Sci 65: 1-15)。多くの高ポテンシャルなET受容体アンタゴニストが、治療的適用に関して報告されているが、しかしながらこれらの化合物は一般に、ETA受容体選択的であるか、あるいは非−選択的ETA/ETBアンタゴニストである(Douglas, 1997,前記)。ETB受容体はいくつかの組織において優位であるが、しかしながら、選択的ETBまたは非−選択的ETA/ETBアンタゴニストによるブッロッキングに耐性である(Hay ら、1998, J Pharmacol Exp Ther 284: 669-677)。したがって、ECEインヒビターでのET−1合成の特異的抑制は、いくつかの条件下で、ET−1過剰の副作用を減衰させるための良好なアプローチであってもよい。
【0010】
本発明の目的は、メタロプロテアーゼ−関連疾病の治療および/または予防のための新規の治療概念を見出すことであり、この場合、これは、たとえば、第1段階においては、製薬学的に重要な別個のメタロプロテアーゼを特異的に抑制するか、あるいは、少なくとも2種の型のメタロプロテアーゼの選択的な組合せを、作用プロフィールの組み合わされた様式で特異的に抑制する、治療的に有用な化合物を供給することであり、かつ、第2段階においては、前記メタロプロテアーゼ抑制化合物の治療的に有用な組み合わせ物を提供することである。
発明の開示
ECE−1が、唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるとする技術水準が疑わしく(Barker S.ら、Mol Pharmacol, 2001,59: 163-169)、かつ、付加的な酵素が、ET−1の産生に影響しているに違いないといった推測から、本発明によって、これまで知られていないメタロプロテアーゼが、big−ET−1をET−1に変換する働きをしうるか、かつ、新規に同定されたメタロプロテアーゼに対する特異的なインヒビターが、この変換を抑制するかどうかについて試験するために、相同性クローニングをおこなった。これらの試みによって、メプロライシン メタロプロテアーゼファミリーの2個の最も特徴的なメンバーであるNEPに対する高いホモロジー(54%同一性)およびECE−1に対するやや低いホモロジー(37%同一性)を有する新規のヒト遺伝子が見出された。このヒト遺伝子のポリペプチド産物は、多くのヒト組織中において、多数発現することが見出され、かつ、“IGS5”として呼称されている(同時係争中の国際特許出願PCT/EP00/11532)。
【0011】
したがって、本発明は、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に、同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するかまたはこれらに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上および
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、メタロプロテアーゼIGS5上での、
組み合わされたか、特に、同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステル(biolabile ester)の使用に関する。
【0012】
特別な態様において、本発明は、big−ET−1レベルが増加する疾病または症状であり、かつ、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に、同時に抑制するによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0013】
他の特別な態様において、本発明は、ET−1が著しくアップレギュレーションされた疾病または症状であり、かつ、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬組成物)の製造のための、組み合わされたNEP/IGS5阻害活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0014】
他の特別な実施態様において、本発明は、大型哺乳類、特にヒトにおける高血圧症の二次的形態、たとえば、腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および/または予防のための医薬(医薬組成物)を製造するための、組み合わせたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する前記化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0015】
さらに、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す前記化合物と、NEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビター、たとえば、別個のACE−および/またはECE−および/またはNEP−インヒビターおよび/またはこれらメタロプロテアーゼの混合インヒビターとを付加的に組み合わせることは有利であってもよい。
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で使用された用語は、以下に別記しない限りは、本発明の技術分野における当業者が認識している通常の意味を有するものとする。以下のいくつかの定義は、本明細書中でしばしば使用される特定の用語の意味を簡単に説明するものである。
【0016】
“IGS5”は、特に、配列番号2、配列番号4および配列番号6の一つに示されたアミノ酸配列、またはこれらそれぞれの変異体を含むポリペプチドを意味する。したがって“IGS5”は、特に、IGS5PROT、IGS5PROT1およびIGS5PROT2を含む。
【0017】
“酵素活性”または“生物学的活性”は同様の活性または改善された活性か、あるいは、好ましくない副作用が減少したこれらの活性を含む、前記IGS5の代謝的または生理学的機能に関する。
【0018】
“IGS5−遺伝子”は、配列番号1、配列番号3および配列番号5の一つに示されたヌクレオチド配列、あるいはこれらそれぞれの変異体、たとえば、これらの突然変異体および/またはこれらの補体を含むポリヌクレオチドを意味する。
【0019】
本発明の技術分野において同一性の尺度として公知の“同一性”とは、2個またはそれ以上のポリペプチド配列、または2個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間での関連性を意味する。この技術分野において、さらに“同一性”は、ポリペプチド間またはポリヌクレオチド間の配列の関連性の度合いを意味し、たとえば、一般には最も大きいオーダーの適合率(matching)が得られるように配列を調節することによって、このような配列群間の適合を測定してもよい。したがって、“同一性”または二者択一的な用語“類似性”は、当業者によって認識されている意味を有するものであって、かつ公知方法によって簡単に算定できるものであるが、この場合、“Computational Molecular Biology”, Lesk, A.M., Ed., oxford University Press, New York, 1988; “Biocomputing: Informatics and Genome Projects”, Smith, D,W., Ed., Academic Press, New York, 1993; “Computer Analysis of Sequence Data”, PartI, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994; “Sequence Analysis Primer”Gribskov, M. and Devereux, J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものによって制限されることはない。同一性を測定するための好ましい方法は、試験された配列間で最も大きい適合性が得られるように設定される。同一性および類似性を測定するための方法は、市販のコンピュータープログラムで見出すことができる。2個の配列間の同一性および類似性を測定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 ( 1984)), BLASTP, BLASTNおよびFASTA(Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990))を含むが、これに制限されることはない。BLAST X プログラムは、NCBIおよび他の機関から公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。さらによく知られているSmith Waterman アルゴリズムは、同一性を測定するために使用されてもよい。それぞれ、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の同一性または類似性を測定するために有用な公的に利用可能なプログラムは、“gap”プログラムとして、Genetics Computer Group, マディソンWI から公知であり、この場合、これは、通常は、比較のためのデフォルトパラメータを用いておこなうものである(エンドギャップに対するペナルティーはないことに加えて)。ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータ(すなわちデフォルトパラメータ)は、以下のものを含む:Needleman and Wynsch,J.Mol.Biol.48:443−453(1970)で記載されたアルゴリズム;HentikoffおよびHentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915−10919(1992)からの比較マトリックスBLOSSUM62;ギャップペナルティー:12;ギャップ長ペナルティー:14。ポリヌクレオチドを比較するための好ましいパラメータ(すなわちデフォルトパラメータ)は、以下のものを含む:Needlman and Wynsch,J.Mol Biol.48:443−453(1970)によって記載されたアルゴリズム;比較マトリックス:マッチ数=±10、ミスマッチ数=0;ギャップペナルティー:50;ギャップ長ペナルティー:3である。用語“相同性”は用語“同一性”と置き換えることができる。
【0020】
たとえば、参考ヌクレオチド配列、たとえば、配列番号1、配列番号3および配列番号5の群から選択された参考ヌクレオチド配列に対して、たとえば、少なくとも95%の“同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が、それぞれ参考ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド当たり5箇所までの変異を含んでいてもよいことを除き、参考配列と同一であると見なされる。いいかえれば、参考ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一性のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参考配列中のヌクレオチド5%までが欠損しているかまたは他のヌクレオチドによって置換されていてもよいか、あるいは、参考配列中の全ヌクレオチドの5%までのヌクレオチド数が、参考配列中に挿入されるか、あるいは、参考ヌクレオチド中の全ヌクレオチドの5%までのヌクレオチド数が、欠損、挿入および置換の組合せで変異していてもよい。参考配列のこれらの変異は、参考ヌクレオチド配列の5’末端または3’末端で生じてもよいか、あるいは、参考配列中または参考配列の範囲内の一つまたはそれ以上の近接する群中のヌクレオチド中で、それぞれ別個に点在していてもよい。
【0021】
同様に、たとえば参考アミノ酸配列、たとえば、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択された参考アミノ酸配列に対して、少なくとも95%の“同一性”を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列が、それぞれの参考アミノ酸配列の100アミノ酸当たり5個までのアミノ酸変異を含んでいてもよいことを除いて、参考配列と同一であるとみなされる。いいかえれば、参考アミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参考配列中の5%までのアミノ酸残基は、欠失されていてもよいかまたは他のアミノ酸によって置換されていてもよいか、あるいは、比較される配列中の5%までの全アミノ酸残基の多くのアミノ酸は、比較される配列中に挿入されていてもよい。比較配列のこれらの変異は、比較アミノ酸配列のアミノ末端基またはカルボキシ末端基で生じてもよいか、あるいは、これらの末端基中で、比較配列中の残基中でかまたは比較配列の範囲内で1個またはそれ以上の近接する群で別個に散在していてもよい。
【0022】
“ホモログ”は、対象となる配列に対する高い度合いの配列関連性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を示す、本発明の技術分野で使用される遺伝子学用語である。このような関連性は、ここで記載されたものと比較しての配列間で同一性および/または類似性の度合いを測定することによって定量されてもよい。この遺伝子学用語の範囲内において、用語“オルトログ”は他種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価物であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味し、かつ“パラログ”は同種の範囲を考慮した場合の機能的に類似する配列を意味するものである。したがって、たとえばヒトにおいて、エンドセリン変換酵素のファミリーの範囲内で、ECE−1は、他のメンバー、たとえばECE−2のパラログである。
メタロプロテアーゼの特異的インヒビターである、新規に同定されたメタロプロテアーゼIGS5の薬理学的評価
ECE−1が、唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるといった技術水準が疑わしく(Barker S.ら、Mol Pharmacol, 2001,59: 163-169)、かつ、付加的な酵素が、ET−1の産生において影響しているに違いないといった推測から、本発明によって、これまで知られていないメタロプロテアーゼが、big−ET−1をET−1に変換する働きをしうるか、かつ、新規に同定されたメタロプロテアーゼに対する特異的なインヒビターが、この変換を抑制するかどうかについて試験するために、相同性クローニングをおこなった。類似する活性を有する酵素は、これらのアミノ酸配列においても類似性を有するであろうといった仮定のもとに、ヒトゲノムを、2種の最も特徴的なネプリライシンメタリプロテアーゼファミリーのメンバーである、NEPおよびECEとのホモロジーを有するタンパク質をコードするDNA配列についてサーチした。これらの試みによって、NEPに対して高い相同性(54%同一性)およびECE−1に対するやや低い相同性(37%同一性)を有する新規のヒト遺伝子を発見するに至った。この遺伝子のポリペプチド産物は、多くのヒト組織中で多く発現することが見い出され、かつ “IGS5”と呼称されている。IGS5のクローニング、発現および基本的な生物学的特徴付けは、詳細には、同時係争中の国際特許出願PCT/EP00/11532に記載されており、この場合、これら全内容は、参考例のために以下IGS5についてそれぞれ詳細に例証されている。
【0023】
本発明の目的のために、IGS5の薬理学的酵素特性を特徴付け、かつ評価するために、ヒトIGS5タンパク質を、発現系として昆虫細胞系を使用することにより製造し、IGS5タンパク質の種々の有効な基質について試験した。IGS5は、big−ET−1、ブラジキニンおよびサブスタンスPを効率よく切断することが確認されており、これによって、さらにこの新規タンパク質が、メタロプロテアーゼ共通の特徴である広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼであることが確認され、かつ、これらの特徴は、NEP、ECE−1およびさらにACEに関しても報告されている。さらに本発明によれば、IGS5によるbig−ET−1のタンパク質分解は、驚くべきことに、ET−1の正確な形成を生じ、たとえば、big−ET−1は、正確に、アミノ酸Trp21とVal22との間を切断することが見出された。
【0024】
さらに、本発明によれば、big−ETのET−1への変換を抑制するメタロプロテアーゼインヒビター化合物の有効性を、蛍光ラベルされたbig−ET−1アナログを用いて最初に試験したものである。結果は、実施例部分の第9表に示した。In vivoにおけるbig−ETのET−1への変換抑制が公知であるホスホラミドンが、さらに本発明において使用された生化学的アッセイで、高いポテンシャルでIGS5を抑制し、さらにおどろくべきことに、ホスホラミドンによるIGS5の抑制が、実際にはかなりECE−1よりも高いことは興味深い。対照的に、選択的NEPインヒビター チオルファンならびに選択的ECE−1インヒビターSM−19712(4−クロロ−N−[[[(4−シアノ−3−メチル−1−フェニル−1H−ピラゾール−5−イル)アミノ]カルボニル]ベンズスルホンアミド、一ナトリウム塩;Umekawa K.Hasegawa H.Tsutsumi Y,Sato K,Matsumura Y,Ohashi N.,J Pharmcol 2000 Sep;84(1):7−15;Discovery Research Laboratories 1,Research Center,Sumitomo Pharmaceuticals Co,Ltd,Osaka,Japan)は、IGS5活性を示さなかった(第9表、実施例部分参照)。
【0025】
本発明の特別な態様において、最も重要でありかつ特徴的であるのは、メタロプロテアーゼインヒビターであるとして示された多くの化合物が、低いナノモル量での濃度、たとえば、約1〜10nMの範囲のIC50値を有する濃度であっても、IGS5酵素を抑制することが可能であることであり、これによって、特に製薬学的重要性を有する新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼを特異的に抑制することを明らかにした。
【0026】
したがって、本発明は、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上および
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである、メタロプロテアーゼIGS5上での、
組み合わされた、特に、同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0027】
特別な態様において、本発明は、big−ET−1レベルが増加する疾病または症状であり、かつNEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、組合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0028】
他の態様において、本発明は、ET−1が著しくアップレギュレーションされる疾病または症状であり、かつNEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を有するか、あるいはこれに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。
【0029】
本発明において、“組合わされたかまたは特に同時の抑制活性”は、NEPおよびIGS5の双方の酵素系を同時にブロッキングすることによる少なくとも二重のNEPおよびIGS5の抑制を意味し、かつ場合により、第3の系の付加的な同時の抑制、たとえば、NEP、IGSおよびたとえばECE−1の酵素系の三重の抑制を意味する。本発明の結果から、NEPおよびIGS5の双方の酵素系の組合わされたか、同時の抑制が、異なる化合物によるブロッキングであるか、または単に、前記のそれぞれの酵素の別個のブロッキングよりも、より効果的であることが期待された。したがって本発明は、NEPおよびIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防されてもよい特定の疾病または症状の治療および/または予防のための、組み合わせた、特に同時のNEPおよびIGSインヒビターの使用を提案することによる、新規治療概念を提供する。さらに、これに関連して、本発明は、NEPおよびIGS5の双方の組み合わされたか、または同時の抑制を示す化合物を提供し、これによって、考えられうる疾病または症状の治療および/または予防のために、改善された治療的価値を有する化合物の新規かつ期待される使用を提供する。
【0030】
治療的利点としての医学的に重要であるとされる、組み合わされた、特に同時に生じる作用機序は、それぞれの単独の系を別個に調節するよりも、より顕著であることが期待された。
【0031】
たとえば、エンドセリン−変換酵素インヒビターに関して、この原理の現在の状況および背景の解明、さらには関連する利点は、近年、B−M.Loeffler(J. Cardiovasc. Pharmacl. (2000), 35(Suppl.2), S79-S82)による論文で報告されている。Loefferらによれば、近年の研究により、有効な選択的または混合されたエンドセリン−変換酵素(ECE)、ECE/中性エンドペプチダーゼ(NEP)およびECE/NEPアンジオテンシン−変換酵素(ACE)インヒビターを見出したという。さらに、これらは、エンドセリン(ET)、レニン−アンジオテンシンおよびNEP系の、心臓血管系ホメオスタシスの調整のための機能が、複合的な調整ネットワークによって関連付けられている証拠を多く報告している。したがってLoefflerは、新規に可能な選択的かつ混合ECE−1インヒビターに関する将来的な研究課題は、一つ以上の心臓血管系の組み合わされた抑制が、選択的抑制よりも優れているかどうかを示すのに挑むことであるとみている。これに関して、本発明は、少なくともNEPおよびIGS5の酵素系の組み合わされたまたは同時の抑制に関する、技術水準に貢献する最初の優れた進歩を提供する。
【0032】
特別な態様において、本発明は、哺乳類、特にヒトでの、高血圧の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、ぜんそく、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌の疼痛の治療および/または予防に好ましい医薬を製造するための化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関する。特に、本発明において、好ましくは、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5−抑制活性を有する化合物を、NEPおよび/またはIGS5を組み合わせて、特に同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病また症状を有するかまたはこれに感受性の患者の部分母集団において、前記疾病または症状を治療および/または予防するために使用する。
【0033】
さらに、本発明による組み合わされたかまたは同時に生じるNEP/IGS5抑制活性を示す化合物と、組合わされたNEP/IGS5抑制活性以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターとを付加的に組合せることは有利であってもよい。組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する化合物との組合せ物中で使用されてもよいこのような他のメタロプロテアーゼインヒビターは、たとえば、ACEインヒビター、たとえばカプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ホシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルであり;さらに、選択的ECEインヒビター、たとえば化合物SM−19712(Sumitomo、前記);選択的NEPインヒビター、たとえば、チオルファン;二重のNEP/ECEインヒビター、たとえば化合物CGS−35066(De Lombart ら、J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3): 488-504):またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビター、たとえば、オマパトリレートまたはサムパトリレートである。このタイプの組合せた治療および/または予防によって、組み合わされたかまたは同時に生じるNEP/IGS5抑制活性を有する化合物の治療的重要性は、さらに増加させることができ、この場合、これらは特に、前記に挙げられた疾病および/または症状に関するものである。したがって、他の態様において、本発明は、さらに以下のようにして記載された、併用療法および/または併用予防法に関する。
【0034】
特に、本発明によれば、主に中性のエンドペプチダーゼインヒビター(NEP−インヒビター)である化合物が、低いナノモル濃度であっても製薬学的重要性を有する新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼ酵素を十分に抑制し、これによって、これらの化合物が、組み合わされた作用プロフィール、たとえば、組み合わされたかまたは同時に書汁選択的NEP/IGS5抑制活性プロフィールを有するメタロプロテアーゼインヒビターであることが明らかにされた。このような化合物は、式I:
【0035】
【化1】
[式中、Aは式IIまたは式III
【0036】
【化2】
を有する基を示し、その際、式II中、
R1aは、フェニル環中で、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたはハロゲンによって置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基であるか、あるいはナフチル−低級−アルキル基を示し、
R2aは、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基であり、かつ、
式III中、
R1bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
R2bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
かつ、
R3は、水素であるか、あるいは生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する基を示す]の構造を有していてもよい化合物、および式Iの酸の製薬学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【0037】
式Iの化合物における置換基は、低級アルキルまたはアルコキシ基であるかまたはこれらを含んでおり、これらは、直鎖または分枝鎖であってもよく、かつ、特に1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含み、好ましくはメチルまたはメトキシである。置換基がハロゲンを含む場合には、特に、フッ素、塩素または臭素、好ましくはフッ素または塩素である。
【0038】
基R1aにおいて、低級アルキレン鎖は、1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含有していてもよい。R1は、特に、場合によってはハロゲン、低級アルコキシまたは低級アルキルによって1個またはそれ以上が置換されていてもよい、場合によっては置換されたフェニル基であるか、あるいはナフチルエチル基である。
【0039】
式Iaの化合物は、場合によってはエステル化されたジカルボン酸誘導体である。
【0040】
生分解可能なカルボン酸エステルを形成する適した基R3は、in vivoでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基である。たとえば、この目的のための適しているのは、低級アルキル基、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基であり、この場合、これらは場合によっては、低級アルキルまたは低級アルコキシまたは2個の隣合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によって、モノまたはポリ置換されていてもよく、ジオキソラニルメチル基、この場合、これらは、場合によってはジオキサン環中で低級アルキル基によって置換されていてもよいか、あるいは、C2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは、場合によっては低級アルキルによってオキシメチル基上で置換されていてもよい。生物的不安定性エステルを形成する基R3が低級アルキルを含む場合には、これらは、分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を有していてもよい。生物的不安定性エステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン鎖を有していてもよく、かつ好ましくはベンジルである。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これらは、3〜4個、好ましくは3個の炭素原子を有していてもよい。R3が場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これらは、2〜6個、好ましくは3〜5個の炭素原子を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を有していてもよく、かつ、たとえば、ピバロイルオキシメチル基(=tert−ブチルカルボニル−オキシメチル基)であってもよい。
【0041】
生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する適した基R2aは、in vivoでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基であり、かつ、基R3に関して挙げられた基に相当する。
【0042】
生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基として適した基R1bおよびR2bは、invivoでの生理学的条件下で、それぞれホスホン酸官能基を遊離させながら、除去されてもよい基である。たとえば、この目的に適した基は、低級アルキル基、場合によってはオキシメチル基上で低級アルキルによって置換されたC2〜C6−アルカノイルオキシメチル基、またはフェニル基またはフェニル−低級アルキル基であり、この場合、これらのフェニル環は、場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたは2個の隣あった炭素原子と結合した低級アルキレン基によって、モノ−またはポリ置換される。生物的不安定性エステルを形成する基R1bおよび/またはR2bが低級アルキル基であるかまたはこれらを含む場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を含有していてもよい。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これは、好ましくは、2〜6個、より好ましくは3〜5個の炭素原子を有する分枝のアルカノイル基を有していてもよく、かつ、たとえばピバロイルオキシメチル基であってもよい(=tert−ブチルカルボニルオキシメチル基)。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン基を含んでいてもよい。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換されている場合には、これらは3〜4個、特に3個の炭素原子を含んでいてもよく、かつ置換されたフェニル環は特にインダニルである。
【0043】
式Iの酸の適した生理学的に認容性の塩は、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩、たとえばナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩であるか、あるいは、生理学的に認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえば、ジエチルアミンまたはtert−ブチルアミン、またはフェニル−低級アルキルアミン、たとえば、α−メチルベンジルアミンとの塩である。
【0044】
式Iの化合物は、少なくとも1個のキラル炭素原子、すなわち、ベンズアゼピン構造の3位でアミド側鎖を有する炭素原子である。したがって、このような化合物は、2個の光学的活性の立体異性体の形またはラセミ体として存在していてもよい。本発明は、式Iの化合物のラセミ体混合物と異性体的に純粋な化合物との双方を含む。式Iの化合物において、基Aは式IIを示す場合には、式Iの化合物は2個のキラル炭素原子、すなわち環骨格の3位で、かつアミド側鎖を含む炭素原子、および基R1aを有するアミド側鎖の炭素原子を有する。したがって、基Aが式IIを意味する式Iのこれらの化合物は、いくつかの光学的活性の立体異性体の形でかまたはラセミ体として存在していてもよい。本発明によれば、ラセミ混合物と異性体的に純粋な化合物との双方を使用することができる。式Iの化合物において、基Aが式IIIを意味し、かつR1bおよびR2bは水素でなくそれぞれ異なる意味を有する場合には、ホスホン酸基のリン原子はキラルであってもよい。さらに本発明は、式Iの異性体混合物および異性体的に純粋な化合物に関し、その際、基Aはキラルのリン原子により形成される式IIIを意味する。
【0045】
本発明によれば、式Iの化合物、その塩およびその生物的不安定性エステルは、当業者に公知の方法で得られてもよい(以下参照のこと)。
【0046】
本発明の好ましい態様において、第1NEP−抑制化合物、たとえば式Iaの構造を有するベンズアゼピノン−N−酢酸誘導体、あるいは、式Ibの構造を有するホスホノ−置換されたベンズアゼピン誘導体が見出された。
【0047】
式Iaの構造を有する化合物はすでに、US5677297からのNEP−抑制化合物として公知であり、その際、化合物は、前記に示したような疾病または症状の治療に有用である。式Iの化合物は、以下の構造
【0048】
【化3】
[R1aは、フェニル環中で、低級アルキル、低級アルコキシまたは水素によって場合によっては置換されていてもよいフェニル−低級−アルキル基、あるいはナフチル−低級−アルキル基を示し、
R2aは、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を示し、かつ、
R3は、水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を示す]を有する化合物および式Iの酸の製薬学的に認容性の塩である。
【0049】
式Iaの化合物における置換基が、低級アルキルまたはアルコキシ基であるか、あるいはこれを含有する場合には、これらは直鎖または分枝鎖であってもよく、かつ特に、1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含み、かつ、好ましくはメチルまたはメトキシである。置換基がハロゲンを含む場合には、特に適しているのはフッ素、塩素または臭素であり、好ましくはフッ素または塩素である。
【0050】
基R1aにおいて、低級アルキレン鎖は1〜4個、好ましくは1〜2個の炭素原子を含有していてもよい。特にR1aは、場合によってはハロゲン、低級アルコキシまたは低級アルキルによって1個またはそれ以上が置換されていてもよい。場合によっては置換されたフェネチル基であるか、あるいはナフチルエチル基である。
【0051】
式Iaの化合物は、場合によってはエステル化されたジカルボン酸誘導体である。投与形態に依存して、生分解可能なモノエステル、特にR2aが生分解可能なエステルを形成する基であり、かつR3が水素である化合物であるか、あるいはジカルボン酸が好ましく、この場合、ジカルボン酸は特に静脈内投与(i.v.)に適している。
【0052】
生物的不安定性エステルを形成する、式Iaの化合物において適した基R2aおよびR3は、低級アルキル基、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基、この場合、これらは場合によってはフェニル環中で、低級アルキルによってかまたは2個の隣り合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によって置換されているか、オキソラニルメチル基、この場合、これらは、場合によってはジオキソラン環中で、低級アルキルによって置換されており、あるいは、C2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは、オキシメチル基上で場合によっては低級アルキルによって置換されている。生物的不安定性エステルを形成する基R2aまたは基R3が低級アルキル基である場合には、これは好ましくは、1〜4個、好ましくは2個の炭素原子を有する非分枝のアルキル基であってもよい。生物的不安定性エステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級−アルキル基である場合には、そのアルキレン基は1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有していてもよい。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これは、3〜4個、特に3個の炭素原子を含んでいてもよい。フェニル、ベンジルまたはインダニルが、特にフェニル含有置換基R2aおよび/またはR3として特に適している。R2aおよび/またはR3が場合によっては置換されたアルカノイルオキシメチル基である場合には、これらのアルカノイルオキシ基は2〜6個、好ましくは3〜5個の炭素原子を含有していてもよく、かつ好ましくは、分枝であり、かつ、たとえば、ピバロイルオキシメチル基(=tert−ブチルカルボニル−オキシメチル基)であってもよい。
【0053】
式Iのジカルボン酸またはモノエステルの適した生理学的認容性の塩は、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩、たとえば、ナトリウムまたはカルシウム塩であるか、あるいは、生理学的に認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえばジエチルアミンまたはtert−ブチルアミンとの塩を含む。
【0054】
式Iaの化合物は、2個のキラルの炭素原子、すなわち、環骨格の3位で、かつアミド側鎖を有する炭素原子、および基R1aを有するアミド側鎖の炭素原子を含む。したがって、化合物は、いくつかの光学的活性の立体異性体の形であるかまたはラセミ体として存在していてもよい。本発明によれば、式Iaのラセミ体混合物と異性体的に純粋な化合物の双方を使用することができる。
【0055】
本発明によれば、式Iaの化合物およびその塩および生物的不安定性エステルは、当業者に公知の方法で、たとえば、US5677297に記載のようにして得ることができる。
【0056】
式Iの好ましい化合物は、たとえば、R2および/またはR3が生物的不安定性エステルを形成する基を意味する化合物、およびその生理学的に認容性の塩である。生物的不安定性エステルを形成する基は、低級アルキル基、またはフェニルまたはフェニル−低級−アルキル基であってもよく、特にフェニル基、ベンジル基またはインダニル基であり、この場合、これらは、場合によっては、低級アルキルまたは2個の隣合う炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によってフェニル環中で置換されていてもよいか、ジオキソラニルメチル基、特に(2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−イル)メチルであり、この場合、これらは場合によってはジオキソラン環中で、低級アルキルによって置換されていてもよいか、あるいはC2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、場合によってはオキシメチル基上で、低級アルキルによって置換されていてもよい。特に、式Iaの化合物は、R2が生物的不安定性エステルを形成する基であり、かつR3が水素であることを特徴とする化合物であることが好ましい。
【0057】
式Iaの化合物の特に好ましい例は、たとえば、
(3S,2’R)−3−{1−[2’−カルボキシ−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−1);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−2);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−ナフチルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−3);およびこれらの酸の製薬学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【0058】
式Iaの化合物の他の特別な例は、たとえば、
3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−tert−ブチルエステル、(化合物Ia−4);
3−{1−[2’−(エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1酢酸(化合物Ia−5);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−エトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−tert−ブチルエステル(化合物Ia−6);
(3S,2’R)−3−{1−[2’−(カルボキシ−4’−フェニルブチル)シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1酢酸(化合物Ia−7);
3−{1−[2’−(tert−ブトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンジアゼピン−1−アセテート−tert−ブチルエステル(化合物Ia−8);
3−[1−(2’−カルボキシ−4’−フェニルブチル)シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(化合物Ia−9);
3−{1−[2’−tert−ブトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−ベンジルエステル(化合物Ia−10);
3−[1−(2’−カルボキシ−4’−フェニルブチル)シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−ベンジルエステル(化合物Ia−11);
3−{1−[2’−(tert−ブチルカルボニルオキシメトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]シクロペンタン−1−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート−ベンジルエステル(化合物Ia−12);
3−{1−[2’−(ピバロイルオキシメトキシカルボニル)−4’−フェニルブチル]−シクロペンタン−カルボニルアミノ}−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1酢酸(化合物Ia−13);
およびこれらの酸の生理学的に認容性の塩または溶媒和物である。
【0059】
式Ibの構造を有する化合物は、NEP−抑制化合物、さらにはUS5952327からの弱いエンドセリン変換酵素インヒビター(ECE−インヒビター)としてすでに公知であり、その際、化合物は、前記に示されたような疾病または症状の治療に有用である。したがって、さらに本発明は、式Ib
【0060】
【化4】
[式中、R1bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性のホスホン酸エステルを形成する基であり、
R2bは、水素であるか、あるいは生物的不安定性のホスホン酸エステルを形成する基であり、かつ、
R3は、水素であるか、あるいは生物的不安定性のカルボン酸エステルを形成する基である]の化合物および式Ibの酸の生理学的に認容性の塩に関する。
【0061】
式Ibの化合物は、カルボン酸およびホスホン酸を含む酸誘導体であり、この場合、これらは場合によっては、生分解可能なエステルを形成する基によってエステル化される。式Ibの生分解可能なエステルは遊離酸のプロドラックである。投与形態に依存して、生分解可能なエステルまたは酸が好ましく、特に酸は、静脈内投与に適している。
【0062】
生分解可能なホスホン酸エステルを形成する基として適した基R1bおよびR2bはin vivoでの生理学的条件下で、それぞれのホスホン酸官能基を遊離しながら、除去することができる。たとえば、本発明の目的のために適した基は低級アルキル基、C2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは場合によってはオキシメチル基上で低級アルキルによって置換されていてもよく、フェニルまたはフェニル−低級アルキル基、この場合、これらは場合によっては低級アルキル、低級アルコキシまたは2個の隣合った炭素原子と結合した低級アルキレン鎖によってフェニル環がモノまたはポリ置換されているものである。生分解可能なエステルを形成する基R1bおよび/または基R2bが低級アルキルであるかまたはこれを含有する場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を含有していてもよい。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたアルカノイルメチル基である場合には、好ましくは、2〜6個、好ましくは3〜5個の炭素原子を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を含有していてもよく、たとえば、ピバロイルオキシメチル基であってもよい(=tert−ブチルカルボニルオキシメチル基)。R1bおよび/またはR2bが場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは、1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン基を含んでいてもよい。フェニル環が低級アルキレン鎖によって置換されている場合には、これらは3〜4個、特に3個の炭素原子を含有していてもよく、かつ置換されたフェニル環は特にインダニルである。
【0063】
生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する式Ibの化合物のための適した基R3は、in vivoでの生理学的条件下で、カルボン酸を遊離しながら切断されてもよい基である。たとえば、この目的のための適した基は、低級アルキル基、フェニル基またはフェニル−低級アルキル基であり、この場合これらは、フェニル環中で、低級アルキル基かまたは低級アルコキシ基によってか、あるいは2個の隣接した炭素原子と結合した低級アルキレン基によってモノ置換またはポリ置換されていてもよく、ジオキソラニルメチル基であり、この場合、これらはジオキサン環中で、低級アルキル基によって場合によっては置換されていてもよく、あるいはC2〜C6−アルカノイルオキシメチル基であり、この場合、これらは場合によっては、低級アルキル基によってオキシメチル基上で置換されていてもよい。生分解生エステルを形成する基R3基が低級アルキルであるかまたはこれを含む場合には、これらは分枝または非分枝であってもよく、かつ1〜4個の炭素原子を含有していてもよい。生分解可能なエステルを形成する基が、場合によっては置換されたフェニル−低級アルキル基である場合には、これらは1〜3個、好ましくは1個の炭素原子を有するアルキレン基を含有してもよく、かつ好ましくはベンジル基である。フェニル環が、低級アルキレン鎖によって置換される場合には、これらは、3〜4個、好ましくは3個の炭素原子を含有していてもよい。R3が、場合によってはアルカノイルオキシメチル基である場合には、この場合、これらは、炭素原子2〜6個、好ましくは3〜5個を有する好ましくは分枝のアルカノイルオキシ基を含有していてもよく、たとえば、ピバロイルオキシ基であってもよい。
【0064】
本発明によれば、式Ibの化合物およびその塩、ならびにその生分解可能なエステルは、技術水準において当業者に公知の方法で得ることができる。
【0065】
式Ibの酸の適した生理学的に認容性の塩は、それぞれの場合において、そのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩であり、たとえば、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩、またはその生理学的認容性の、薬理学的に中性の有機アミン、たとえば、ジエチルアミン、tert−ブチルアミンまたはフェニル−低級アルカリアミン、たとえばα−メチルベンジルアミンとの塩である。
【0066】
式Ibの化合物はキラル炭素原子、すなわち、ベンズアゼピン構造の3位においてアミド側鎖を有する炭素原子を含む。したがって、化合物は、2個の光学的活性立体異性体の形またはラセミ体として存在していてもよい。本発明は、式Iのラセミ混合物と、異性体的に純粋な化合物との双方を包含する。式Ibの化合物においてR1bとR2bが水素でなく、かつそれぞれ異なる意味を有する場合には、ホスホン酸基のリン原子もまたキラルであってもよい。さらに、本発明は、キラルのリン原子により形成される、式Iの異性体混合物および異性体的に純粋な化合物に関する。
【0067】
式Ibの好ましい化合物は、R3が水素または低級アルキル、たとえば、C1〜C4−アルキル、特にC1〜C2−アルキルを意味する化合物、および式Ibの酸の生理学的に許容可能な塩である。
【0068】
式Ibの化合物の好ましい例は、たとえば、
ベンジル(3S)−3−(1−ジベンジルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−1);
(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(=化合物Ib−2);
ベンジル(3S)−3−(1−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−3);
エチル(3S)−3−(1−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−4);
エチル(3S)−3−(1−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−5);
エチル(3S)−3−[1−(ピバロイルオキシメチルエチルホスホノメチル)−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−6);
エチル(3S)−3−[1−(5−インダニルエチルホスホノメチル)−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−7);
tert−ブチル(3S)−3−(1−ベンジルエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−8);
ベンジル(3S)−3−(1−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−9);
ベンジル(3S)−3−(1−ジエチルホスホノメチル−1−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−10);
(3S)−3−(1−ジエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−酢酸(=化合物Ib−11);
エチル(3S)−3−(1−ジエチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−12);
エチル(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(化合物Ib−13);
ベンジル(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−14);
ベンジル(3S)−3−(1−ジイソプロピルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5,−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib=15);
エチル(3S)−3−(1−ベンジルイソプロピルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib=16);
tert−ブチル(3S)−3−(1−エチルホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−17);
tert−ブチル(3S)−3−[1−(ピバロイルオキシメチル−エチルホスホノメチル)−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ]−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−18);
tert−ブチル(3S)−3−(1−ホスホノメチル−シクロペンタン−1−カルボニルアミノ)−2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−1H−1−ベンズアゼピン−1−アセテート(=化合物Ib−19);
およびこれらの酸の生理学的に認容性の塩である。
【0069】
式Ibの化合物の特に好ましい例は、たとえば、化合物Ib−2、化合物Ib−8、化合物Ib−18または化合物Ib−19であり、最も好ましくは化合物Ib−8、およびこれらの生理学的に認容性の塩である。
【0070】
本発明は、技術水準から公知のECE−1メタロプロテアーゼに加えて、エンドセリン変換酵素のIGS5型が、さらに、big−ETをET−1に切断するのに特に作用するメタロプロテアーゼであると定められたことを、最初に証明するものである。したがって、本発明によるこれらの発見は、IGS5によって介在された、big−ETのET−1への切断によって、影響を受けるかおよび/またはこれを包含する種々の疾病の治療および/または予防のための、改善された治療概念に関して、新規かつ重要な有力な候補を提供するものであって、本発明によれば、公知のECE−1と結合する化合物を探索および使用よりもむしろ、治療的に活性の化合物、すなわち、特異的にIGS5型のメタロプロテアーゼを抑制する化合物の同定および使用を示唆した。
【0071】
前記に示された式Iaまたは式Ibの構造を有する化合物は、元来、そのNEP−抑制活性に基づいて、技術水準で選択された。したがって、in vitroでのIGS5に対する極めて高い効果は、驚くべきことに、本発明による化合物が、麻酔をかけられたラットにおけるbig−ETの血圧上昇作用を本質的に減少させる前記化合物の可能性によって、見出された。
【0072】
結論として、本発明による試験は、新規のECE−/NEP−様メタロプロテアーゼを見出し、この場合、これらはbig−ETを効果的に切断し、かつ、公知のエンドセリン変換酵素インヒビターホスホラミドンに対して感受性でないばかりか、さらに、式Iの構造を有する、好ましくは式Iaまたは式Ibの構造を有する多くの定義されたメタロプロテアーゼインヒビターに対しても感受性でない。したがって、IGS5が、ET−1製造において重要な役割を示し、かつ、式I、好ましくは式Iaまたは式Ibのような構造を有する化合物は、この新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼ酵素を抑制することによるそのin vitro作用を有してもよいことが考えられうる。
【0073】
したがって、種々の疾病において、好ましくは高血圧症、腎臓病および心不全における、IGS5の組織分布、生理学的機能および病理学的役割を明確にするさらなる試験は、本発明において、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す化合物を用いておこなわれた。
【0074】
30人の健康なボランティアを含む二重盲プラセボコントロール臨床試験において、化合物Ia−2が、big−ETによって誘発された圧力応答を用量依存的に抑制し、かつ、そのNEP−抑制特性の指標となる、ANPレベルにおいて明らかに用量に関連する増加を示した。ET−1レベルは、選択的NEPインヒビターから期待されるような増加を示すことなく、その一方で、big−ETレベルは、化合物Ia−2においてプラセボ群と比較して用量依存的に増加し、この場合、これは、big−ETの分解(breakdown)がさらに抑制されることを示している。ヒトにおける化合物Ia−2の臨床的効果およびその安全性に関する概念を立証するために、6種の臨床試験を、健康なボランティアで行い、かつ、2種の概念的試験を患者についておこなった:一つは、無作為プラセボコントロール二重盲試験を、高血圧症患者(N=191)について、もう一つはオープンな基線コントロール予備試験を、鬱血性心不全患者(N=29)についておこなった。結果は、化合物Ia−2の経口投与後の、ボランティアおよび患者の双方におけるANPおよびそのセカンドメッセンジャーであるcGMPの著しく増加しかつ維持された血漿濃度によって、中性エンドペプチダーゼ(NEP)の抑制が示された。さらに、鬱血性心不全患者における結果は、化合物Ia−2の投与後に、化合物Ia−1(化合物Ia−2の活性代謝物)のlog血漿濃度と、big−ET血漿レベルとの間の著しくポジティブな相関を示した(p<0.001)。実際に、big−ETの血漿レベルは、化合物Ia−2の投与後に基準線(200mg:4.9〜6.5fmol/ml(+32.6%);400mg:2.3〜3.5fmol/ml(+56%))から増加する傾向にあり、経口投与された化合物Ia−2の活性が、big−ETの切断を妨げるといった概念が支持された。最も重要なことは、化合物Ia−2は、WHO基準でI〜II度の高血圧症を有する患者で、近年行われた4週間に亘っての試験(N=191)で、顕著かつ臨床的な抗高血圧活性の証拠を最初に明らかにされたものであるということである。治療すべき患者群(Intent-to treat)(ITT)で、用量の最も高い試験において(200mg 一日二回bid)、プラセボに対するオフィス(office)最低血圧が−6.9mmHg減少し(治療下での最終値;p<0.001)、かつプラセボに対するオフィス最高血圧が−9.2mmHg減少した(治療下での最終値;p=0.003)。この観察で重要であるのは、純粋なNEPインヒビターが、ET−1を増加させ、その結果、血圧を減少させるよりむしろ増加させることを示したことであった。
【0075】
さらなる研究において、鬱血性心不全を有する患者の心臓血流力学パラメータ上においての、化合物Ia−2の用量依存的関係を試験し、さらに、高血圧症患者に対して一日一回の投与後の、抗−高血圧作用の時間経過について試験した。
本発明におけるIGS5メタロプロテアーゼ
本発明は、IGS5ポリペプチド(またはIGS5酵素またはIGS5メタロプロテアーゼ、たとえばIGS5PROT、IGS5PROT1またはIGS5PROT2、それぞれ)、特にヒトIGS5ポリペプチド(またはヒトIGS5酵素)に関する。IGS5ポリペプチドは、ポリペプチド、特にヒトのポリペプチドに相当し、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択された一つの配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、および特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも97%〜99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一のIGS5ポリペプチドを含有するものである。
【0076】
さらにこのようなポリペプチチドはIGS5ポリペプチド、特にヒトIGS5ポリペプチドを含み、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、および特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも97〜99%の同一性を有するアミノ酸配列を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一のIGS5ポリペプチドを含む。
【0077】
本発明の他のポリペプチドは、配列番号2、配列番号4および配列番号6の一つを含む配列を含有する単離されたIGS5ポリペプチドを含む。
【0078】
本発明のIGS5ポリペプチドは、ネプリライシンメタロプロテアーゼファミリーのメンバーであり、かつ特にヒトの種類のポリペプチドである。これらは、いくつかの機能不全、障害、疾病が前記で同定されており、かつこれらにおいて、新規に同定されたメタロプロテアーゼが、疾病の病理学において重要な役割を示すことから重要である。
【0079】
したがって本発明は、IGS5ポリペプチドが生物学的に活性のペプチドの代謝において作用していてもよく、かつ特に、このようなIGS5ポリペプチドが種々の血管作動性ペプチド上で作用しうるメタロプロテアーゼ型の酵素であることが見出された。技術水準から公知の血管作動性ペプチドは、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド(ANP)、ブラジキニン、bigエンドセリン(big ET−1)、エンドセリン(ET−1)、サブスタンスPおよびアンジオテンシン−1である。さらに、新規のヒトメタロプロテアーゼであるIGS5エクトドメインが、効果的に、たとえばin vitroで、前記の種々の血管作動性ペプチド、特にbig−ET−1、ブラジキニンおよびサブスタンスPを加水分解することが見出された。
【0080】
IGS5メタロプロテアーゼ型酵素は、ECE/NEP−特性を有する酵素に関する抑制活性、たとえばホスホラミドンのような化合物による抑制を測定するために使用される参考化合物によって抑制されてもよい。しかしながら、IGS5の抑制は、NEPを選択的に抑制する参考化合物によっては観察されることがなく、たとえば、チオルファンのような化合物によるIGS5の抑制は観察されないか、あるいはECEを選択的に抑制する参考化合物、たとえば、SM−19712(Sumitomo、前記)のような化合物に関してはIGS5の抑制は観察されることがなかった。
【0081】
IGS5の抑制は、NEP/ECEを抑制する参考化合物、たとえば、NEP/ECEインヒビターCGS−35066(DeLombartら、前記)に関してのみ、高い濃度で観察された。本発明のIGS5メタロプロテアーゼ型酵素の抑制に関するこれらの参考化合物の抑制データは、さらに以下の実施例において記載されている。
【0082】
本発明のIGS5ポリペプチドは、任意の適した方法で製造することができる。このようなポリペプチドは、天然由来のポリペプチド、組み換え技術によって製造されたポリペプチド、合成ポリペプチド、またはこれらの方法を組み合わせることによって製造されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを製造するための方法は、当業者に公知である。したがって、実施例におけるIGS5メタロプロテアーゼは、特に、同時係属出願である国際出願PCT/EP00/11532記載の方法によって製造することができ、この場合、これは、そのすべての内容に関して、特に、ヒトIGS5遺伝子の相同性クローニングおよび相当するヒトIGS5タンパク質の発現に関して、参考のためにのみ本明細書中に示されている。
【0083】
さらに、前記IGS5メタロプロテアーゼをコードするIGS5ポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技術を用いて、ヒト精巣組織の細胞におけるmRNA由来のcDNAライブラリーから、発現シークエンスtag(EST)分析を用いて得ることができる(Adams, M.D., et al. Science (1991) 252:1651-1656; Adams, M.D. et al., Nature, (1992) 355: 632-634; Adams, M.D., et al., Nature (1995) 377 Supp:3-174)。さらにIGS5ポリペプチドは、たとえばゲノミックDNAライブラリーのような天然源のものから得ることができるか、あるいは公知の方法および市販の技術を用いて合成することができる(たとえば、F.M. Ausubel et al., 2000, Current Protocols in Molecular Biology)。
【0084】
IGS5ポリヌクレオチドが、IGS5ポリペプチドの組み換え製造のために使用される場合には、ポリヌクレオチドは、それ自身が、成熟ポリペプチドのコーディング配列を含んでいるか、あるいは、他のコーディング配列を含むリーディングフレーム中で成熟ポリペプチドのためのコーディング配列を含んでいてもよく、たとえば、これらをコードするリーダー配列または分泌配列、プレ−、プロ−、またはプレプロ−タンパク質配列であるか、あるいは他の融合ペプチド部分を含む。たとえば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列がコードされてもよい。たとえば、マーカー配列は、好ましくはヘキサ−ヒスチジンペプチドであってもよく、この場合、これはpQEベクター中に提供され(Qiagen, Inc.)、かつGentzら、Proc Natl Acad Sci USA(1989)で記載されているか、あるいはHA tagであってもよい。さらにポリヌクレオチドが非コーディング5’および3’配列を含んでいてもよく、たとえば、転写、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボゾーム結合部位およびmRNAを安定化する配列を含んでいてもよい。配列番号1、配列番号3または配列番号5の一つに含まれるヌクレオチド配列と同一または十分に同一であるIGS5ポリヌクレオチドは、cDNAおよびゲノミックDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとしてか、あるいは核酸増幅反応(PCR)のためのプライマーとして、全長cDNAsおよびIGS5ポリペプチドをコードするゲノミッククローンを単離し、かつ、配列番号1、配列番号3および配列番号5の一つと、高い配列類似性を有する他の遺伝子のcDNAおよびゲノミッククローンを単離するために使用されてもよい(ヒト由来のパラログ、およびヒト以外の種に由来するオルトログおよびパラログをコードする遺伝子を含む)。典型的に、これらのヌクレオチド配列は、指示されるものに対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、および特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有する。プローブまたはプライマーは、一般には少なくとも15個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも30個のヌクレオチドを含有していてもよく、かつ、少なくとも50個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは、30〜50個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプライマーは、20〜25個のヌクレオチドを有していてもよい。
【0085】
IGS5ポリヌクレオチドをコードするIGS5ポリペプチド、特にヒトIGS5ポリペプチドは、配列番号1、配列番号3または配列番号5、あるいはこれらのフラグメントの一つの配列を有するラベルされたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニング工程、および前記ポリヌクレオチド配列を含む全長cDNAおよびゲノミッククローンを単離する工程を含む方法によって得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に公知である。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xDenhart’s溶液、10%硫酸デキストラン(w/v)および20μg/mlの変性サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃で一晩に亘ってインキュベートし、その後に、0.1xSSC中で、約65℃でフィルターを洗浄することによっておこなった。したがって、IGS5ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3または配列番号5、またはこれらのフラグメントの一つの配列を有するラベルされたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニングすることによって得られてもよい。
【0086】
当業者は、多くの場合において、ポリペプチドをコードする領域が、cDNAの5’末端で短く切断されているために、単離されたcDNA配列が不完全であろうことを認識している。これは、固有の低い“プロセシング能力(重合反応中において、テンプレートに対して結合し続ける酵素能力の尺度)”を有する酵素である逆転写酵素によるものであり、第1ストランドのcDNA合成の間において、mRNAテンプレートのDNAコピーを完全にすることができないためである。考えられうる当業者に公知の、完全長cDNAを得るか、あるいは短いcDNAsを伸長させるためのいくつかの方法、たとえば、cDNA末端の急速増幅法(RACE)(たとえば、Frohmenら、 PNAS USA 85, 8998-9002, 1988 参照)に基づく方法がある。この技術の最近の変法は、Marathon TM技術によって例証されており(Clontech Laboratories Inc.)、より長いcDNAsをサーチするためにかなり簡略化されている。このMarathon TM技術において、cDNAは、選択組織から抽出されたmRNAと、それぞれの末端に結合された“アダプター配列”とから製造された。その後に核酸増幅法(PCR)は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーとアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーとの組合せ物を使用することによって、cDNAの5’末端の“欠損(missing)”の増幅を実施する。その後にPCR反応は、増幅産物の範囲内でアニールするようにデザインされた“ネストされた”プライマーを用いて反復させた(典型的に、アダプター配列の他の3’をアニーリングするアダプター特異的プライマーと公知の遺伝子配列中の他の5’をアニーリングする遺伝子特異的プライマーである)。この反応産物はその後に、DNAシークエンシングによって分析されてもよく、かつ完全な配列を得るために、産物を直接的に存在するcDNAに結合させるか、あるいは、5’プライマーのデザインに関する新規の配列情報を用いて、別個の完全長PCRを行うことによって、完全長cDNAを構築した。
【0087】
組み換えIGS5ポリペプチドは、発現系を有する遺伝子技術によって製造されたホスト細胞から、公知方法で製造されてもよく、この場合、この発現系は、1個または複数個のIGS5ポリヌクレオチドを含有する。このような発現系を用いて遺伝子技術によって製造されたホスト細胞は、組換え技術によってIGS5ポリペプチドを製造するために使用することができる。さらに、無細胞翻訳系は、このようなIGS5タンパク質を、IGS5DNAコンストラクト由来のRNAsを用いて製造するために使用することができる。IGS5ポリヌクレオチドのホスト細胞への導入は、多くの標準的な実験用マニュアルで記載された方法、たとえばDavisらによるMolecular Biology(1986)およびSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory manual,2nd Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)で実施することができる。このような方法は、たとえば、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、カチオン脂質−介在型トランスフェクション法、エレクトロポレーション方法、トランスダクション法、スクラップローディング法(scrape loading)、衝撃導入法(ballistic introduction)またはインフェクション法である。適切なホストの典型的な例は、細菌細胞、たとえば、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、E.Coli、ストレプトミセスおよびバチルススブチリス細胞;酵母菌、たとえばイースト菌およびアスペルギルス細胞;昆虫細胞、たとえば、Drosophia S2およびSpodoptera Sf9細胞、動物細胞、たとえばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK,HEK293およびBowsメラノーマ細胞、および植物細胞である。
【0088】
極めて多様の発現系は、たとえば、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、たとえば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピソーム、挿入要素、イースト染色体要素、ウイルス、たとえばバキュロウイルス、パボラウイルス、たとえばSV40、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、およびこれら組合せ物からのベクター、たとえば、プラスミドとバクテリオファージ遺伝的要素から誘導されたベクター、たとえばコスミドおよびファージミドであってもよい。発現系は、発現を調節ならびに発生させるコントロール領域を含んでいてもよい。一般には、ポリペプチドを製造するポリヌクレオチドをホスト中で保持、伝播または発現させる能力を有する任意の系またはベクターを使用してもよい。適したヌクレオチド配列は、任意の種々の公知および通常の技術によって、発現系中に挿入することができ、この場合、これらの方法は、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(前記)に記載されている。適切な分泌シグナルは、好ましいポリペプチド中に混合され、小胞体腔、細胞周辺腔または細胞外環境に、翻訳タンパク質を分泌する。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内在性のものであるか、あるいは、たとえば異なる種由来の異種シグナルであってもよい。
【0089】
ポリペプチドを、スクリーニングアッセイで使用するために発現させる場合には、一般には、IGS5ポリペプチドを、細胞表面上でか、または可溶性タンパク質の形で製造することができる。IGS5ポリペプチドが、媒体中に分泌される場合には、媒体はIGS5ポリペプチドを捕集および精製するために回収することができる。細胞内で製造する場合には、細胞は、最初に、IGS5ポリペプチドを捕集する前に溶解させなければならない。IGS5ポリペプチドが、細胞表面と結合する(膜結合ポリペプチド)場合には、通常は膜画分が、膜結合IGS5ポリペプチドを蓄積させるために製造される。IGS5ポリペプチドは捕集され、かつ、硫酸アンモニウム沈殿法またはエタノール沈殿法、酸抽出法、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水干渉クロマトグラフィー(hydrophobic interaction chromatography)、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組み換え細胞カルチャーから精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製のために使用する。タンパク質を再生するための公知の方法は、ポリペプチドが、細胞内合成、単離および/または精製中で変性される場合には、活性のコンフォメーションを再生するために使用されてもよい。
【0090】
IGS5ポリペプチドを製造するために使用される、単離されたIGS5ポリヌクレオチド、特に単離されたヒトIGS5ポリヌクレオチドは、通常、全コーディング領域上で、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたポリペプチドの1種をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。これに関連して、少なくとも97%の同一性を有するポリヌクレオチドが好ましいが、さらに少なくとも98〜99%の同一性を有するポリヌクレオチドがより好ましく、かつ少なくとも99%、特に99.9%の同一性を有するポリヌクレオチドは勿論好ましい。たとえば、このような単離された、特にIGS5ポリペプチドを製造するために使用されてもよいヒトIGS5ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3および配列番号5の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して、完全長で、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、特に少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。これに関連して、配列番号1、配列番号3および配列番号5の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して、少なくとも97%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むIGS5ポリヌクレオチドが好ましく、さらに少なくとも98〜99%の同一性を有するものが特に好ましく、かつ少なくとも99%、特異99.9%の同一性を有するものが最も好ましい。配列番号1のIGS5ポリヌクレオチド配列(“IGS5DNA”と呼称される)は、第1表に示されており、この場合、これらは、長さ2076ヌクレオチドを有するヒト由来(ホモサピエンス)のcDNA配列を示しており、かつ、第2表に示された配列番号2のポリペプチド(“IGS5PROT”と呼称される)である、691アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列(1〜2073のヌクレオチド)を含む。配列番号3のヌクレオチド配列(“IGS5DNA1”と呼称される)は、第3表に示されており、この場合、これは、長さ2340ヌクレオチド(停止コドン tagを含む)を有するヒト由来(ホモサピエンス)のcDNA配列を示し、かつ第4表に示された配列番号4のポリペプチド(“IGS5PROT1”と呼称される)である、779アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列(ヌクレオチド1〜2337)を含む。配列番号5のヌクレオチド配列(“IGS5DNA2”と呼称される)は、第5表に示されており、この場合、これは、長さ2262ヌクレオチド(停止コドン tagを含む)を有するヒト(ホモサピエンス)由来のcDNA配列を示し、かつ、第6表に示された配列番号6のポリペプチド(“IGS5PROT2”と呼称される)である、753アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコーディング配列(ヌクレオチド1〜2259)を含む。
新規の治療的概念として組み合わされたか、または同時に生じる選択的NEP/IGS5−抑制活性を有する化合物
本発明は、IGS5メタロプロテアーゼと、少なくとも1個の他のメタロプロテアーゼ、たとえば、特にNEP、さらに場合によってはECE/ACEとの組合せ物が、前記に示された疾病に関する1種またはそれ以上の生物学的機能に対して応答性であることを見出した。したがって、最も広範囲の態様において、本発明は、前記疾病を治療するための新規治療概念を提供するものであって、この場合、これは、中性エンドペプチダーゼ(NEP)およびメタロプロテアーゼIGS5上での、組み合わされたかまたは同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物または生分解可能なエステルについて、NEPとIGS5とを組み合わせて、または同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するために使用することを、初めて示唆するものである。
【0091】
IGSメタロプロテアーゼおよびNEPの機能を同時に抑制する、本発明による有用な化合物は、IGS5メタロプロテアーゼ、および場合によってはNEPを用いてのスクリーニング方法によって、適切な酵素阻害アッセイ法において同定されてもよい。このような酵素阻害アッセイ法は、詳細には、以下の実施例において記載されている。組み合わされたかまたは同時の選択的NEP/IGS5−抑制活性を有する化合物を同定するために、候補化合物を、別々に、NEP−抑制アッセイおよびIGS5−抑制アッセイの双方において試験することができる。NEP/IGS5−抑制化合物は、種々の源、たとえば、細胞、無細胞調製物、ケミカルライブラリー、および天然産物混合物から同定することができる。
【0092】
スクリーニング方法は、細胞媒体上に放出したポリペプチドの活性上であるか、あるいはポリペプチドを有する細胞または膜上での候補化合物の作用を簡単に測定することができる。二者択一的に、スクリーニング方法は、競合相手を用いての競合スクリーニングを含むものであってもよい。さらに、これらのスクリーニング方法は、候補化合物が、ポリペプチドの活性または抑制によって生成されたシグナルを生じるかどうかについて、細胞媒体中に放出されたポリペプチドの活性またはポリペプチドを有する細胞または膜に適した検出系を用いて試験することができる。ポリペプチド活性の抑制は、一般には、公知の基質の存在下でアッセイされ、かつ候補化合物の作用を、変更された活性によって、たとえば、候補化合物がポリペプチドの抑制を生じるかどうかについて試験することによって観察した。たとえば、スクリーニング方法は、簡単には、候補化合物、本発明において重要とされるポリペプチドを含有する溶液、さらには適した基質を混合することで混合物を形成し、混合物中のポリペプチド活性を測定し、かつ、混合物のポリペプチド活性と、候補化合物を含まないスタンダードとを比較する工程を含んでいてもよい。
【0093】
さらに、本発明は、当業者によって化合物、たとえば、候補化合物を、本発明によって見出されたものを含むスクリーニング方法を用いて同定することを可能にし、この場合、前記化合物は、特に、前記に示された機能不全、障害または疾病に期待される薬剤候補物として示されてもよい。当業者によれば、さらにIGSメタロプロテアーゼが、IGS5抑制化合物の構造に基づくデザインのための方法において、使用されてもよいことが容易に認識され、この場合、この方法は、
(a)まず、IGS5メタロプロテアーゼの三次元的構造を測定または使用し、
(b)IGS5インヒビターの1個または複数個の考えられうる反応部位かまたは結合部位に関する三次元構造を導きだし、
(c)導き出された結合部位または反応部位と結合または反応することが予想される候補化合物を合成し、かつ、
(d)候補化合物がさらにIGS5インヒビターであるかどうかについて試験する。さらに、これは通常反復工程であってもよいとみなされる。
【0094】
今日において、当業者であれば、有効な生理学的性質または薬理学的性質を試験すべき価値を有する新規物質または化合物を製造するために、有機合成の計画および実施のための近代的な戦略をよくこころえており、このような化合物は、特定の機能不全、障害または疾病の治療および/または予防のための期待される新規薬剤候補物として立証されることが期待される。したがって、今日においては、コンビナトリーケミストリー、たとえば、一般的かつ“直接的な”薬剤または化合物ライブラリーを用いて、化合物ライブラリーを提供することが一般的であり、この場合、このファルマコフォアの構造および多様性および残基または置換基は当業者に公知である。未知の構造を有するケミカルライブラリーまたは化合物ライブラリーが、スクリーニングアッセイにおいて試験される場合には、それにもかかわらず、有効性が期待される化合物、たとえば候補化合物を、今日において確立されている分析手段、たとえば質量分光分析、核磁気共鳴、赤外分光、融点、キラル化合物が含まれる場合にはその旋光性および元素分析によって、その構造および化学的性質について簡単に分析することができる。
【0095】
したがって、本発明は、IGS5ポリペプチドを抑制する能力を有する定義された化学構造を有する候補化合物を製造するための方法に関し、この場合、この方法は、化合物、その製薬学的に認容性の塩、またはその生物的不安定性エステルを、化学合成によって製造することを含み、この場合、IGS5ポリペプチドを抑制するための化合物の活性は、たとえば、本発明の実施例部分で記載されているようなスクリーニング方法によって同定することが可能である。
【0096】
たとえば、化学有機合成の詳細、および、化学的、分析的および物理的方法に関してのその詳細は、“Houben-Weyl”(Houben-Weyl, “Methoden der Organischen Chemie”, Georf Thieme Verlag, Stuttgart, New York)ハンドブック最新版に記載されている。
【0097】
本発明の1個の実施態様は、前記に示されたような式Iの化合物、およびその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルを、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)と、
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、完全長で、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるメタロプロテアーゼIGS5とを、
組み合わせてかまたは同時に抑制することによって、緩和または予防することができる症状を有するかまたはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するために使用することに関する。
【0098】
本発明の好ましい実施態様は、
a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上および、
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、完全長で、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるメタロプロテアーゼIGS5上での、組み合わされたかまた同時の抑制活性を有する、本発明による化合物、特に式Iを有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生分解生エステルを、大型哺乳類、好ましくはヒトにおいて、高血圧症の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛を治療および/または予防するための医薬(医薬品組成物)を製造するために使用することに関する。
【0099】
式Iの化合物は、式Iaの化合物に関して適した、米国特許第5677297号明細書の開示、および式Ibの化合物に関して適した米国特許第5952327号明細書の開示にしたがって製造することができる。
ドラックデザインおよびリード構造の最適化における、タンパク質−リガンド複合体
他の態様において、本発明は、配列番号2、配列番号4および配列番号5のポリペプチドの一つに対して、少なくとも70%の同一性を有するIGS5ポリペプチドを含有するタンパク質−リガンド−複合体、およびIGS−化合物、好ましくは、少なくとも式Iの化合物またはこれに匹敵するIGS5抑制活性を有する化合物に関する。このようなタンパク質−リガンド−複合体は、特に、ドラックデザイン法、リード構造の発見、リード構造の最適化および修飾方法において特に有用である。これらの方法は、当業者に公知である。たとえばコンビナトリー合成および多次元NMR−スペクトルは文献に記載されており、かつ、これはタンパク質−リガンド−相互作用を認識するのに役立つ(Kressler, Angew. Chem. 1997, 109,857-859;James K. Chen et al., Angew. Chem. 107(1995), S. 1041-1058)。さらに、ドラックデザインにおけるツールとしての分子錯体のNMR試験は、Fesik(Journal of Medicinal Chemistry, 34 (1991), S.2937-2945)によって記載されており、かつ、ドラックデザインにおける手段として酵素/インヒビター複合体の構造を測定するためのNMR方法もFesikらによって示されてる(Biochemical Pharmacology 40 (1990), S. 161-167)。Rossらの極めて最新の報告(Journal of Biomolecular NMR, 16:139-146 (2000))によれば、NMR測定の自動化および標的タンパク質、たとえばレセプターを有する小さい分子の体系的スクリーニング相互作用に関するデータの評価が記載されている。
【0100】
したがって、さらに本発明は、配列番号2、配列番号4および配列番号6のポリペプチドの一つに対して、少なくとも70%の同一性を有するIGS5ポリペプチドと、IGS5結合活性およびIGS5抑制活性を有するリード構造のデザインおよび修飾または最適化のためのIGS5結合化合物とを含有するタンパク質−リガンド−複合体の使用に関する。
併用療法(NEP/IGS5抑制化合物およびECE/ACE−抑制化合物)
すでに前記に簡単に示したように、本発明による、組み合わせたかまたは同時に生じるNEP/IGS抑制活性を示す化合物、たとえば、式Iの化合物、好ましくは式Iaまたは式Ibの化合物と、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の、別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼ活性を有する化合物とを、付加的に組み合わせることは有利である。組み合わされたNEP/IGS5抑制活性を有する前記化合物との組合せにおいて使用されてもよいこのような他のメタロプロテアーゼインヒビターは、たとえば、ACEインヒビター、たとえば、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、フォシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルであり、さらに、選択的ECEインヒビター、たとえば、化合物SM−19712(Sumitomo前記);選択的NEPインヒビター、たとえば、チオファン、NEP/ECEの二重インヒビター、たとえば化合物CGS−35066(De Lombart et al., J. Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3): 488-504);またはこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビター、たとえばオマパトリエートまたはサンパトリエートである。組み合わされた治療および/または予防のこの型によって、組み合わされたかまたは同時に生じるNEP/IGS5抑制活性を有する化合物の治療的価値はさらに増加してもよく、特にこれは、前記疾病および/または症状に関するものである。したがって、本発明の他の態様において、併用治療および/または併用予防に関連する。併用治療および/または予防のこの型によって、組み合わせたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する前記化合物、特に式Iを有する化合物、好ましくは式IaまたはIbを有する化合物の治療的価値は、特に、前記に示された疾病および/または症状に関してさらに増加する。
【0101】
したがって、これに関連して、本発明は、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す第一化合物、または製薬学的に認容性の塩または溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用に関するが、本発明に関しては前記に記載したように、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも一つの付加的な化合物との組合せ物で、本発明に関連して、前記に示されたような任意の疾病または症状の組み合わされた治療および/または予防のための医薬品(医薬品組成物)の製造のために使用することができる。この場合、前記の付加的な化合物は、好ましくはACEインヒビター、選択的ECEインヒビター、選択的NEPインヒビター、NEP/ECEの二重のインヒビターおよびこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている。特に、前記の付加的な化合物の少なくとも1個との組合せにおいて、前記の第一化合物の本発明による使用は、第一化合物において、化合物が式Iの構造、好ましくは式IaまたはIbの構造を有する化合物であり、その際、これらの式は、本発明において前記に示されたものである。好ましくは、前記第一化合物と、少なくとも1個の前記付加的な化合物との組合せにおける使用は、さらに、組合せ物が、同時に効果的であり、好ましくは、相乗的に効果的であることを特徴とする。
【0102】
さらに、これに関して本発明は、前記に示された任意の疾病または症状の組み合わされた治療および/または組み合わされた予防のために、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量の、前記に示したように組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制を有する第一化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターから選択された少なくとも1個の付加的な化合物とを含有する医薬品組成物(医薬)に関し、その際、付加的な化合物は、好ましくは、ACEインヒビター、選択的ECEインヒビター、選択的NEPインヒビター、NEP/ECEの二重のインヒビター、およびこれらメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている。特に、本発明による医薬品組成物は、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量の、前記第一化合物と少なくとも1個の前記付加的化合物とを含有し、この場合、これらは、本発明に関して前記に示したように、第一化合物が、式Iの構造、好ましくは式Iaまたは式Ibの構造を有することを特徴とする。
【0103】
本発明による併用治療および/または併用予防が、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を有する第一化合物またはその製薬学的に認容性の塩またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個かおよび/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターから選択された付加的な化合物とを、同時に、第一化合物および第二化合物に関して、単一の医薬品組合せ製剤または別個の医薬品組成物として投与するか、別個に、たとえば、連続的または順次であってもよい投与計画または体系によってか、あるいは患者の緩和および/または予防すべき疾病または症状に適しているかどうかをみながら段階的に、このような治療および/または予防を必要とする患者に投与することによって達成することができることは当業者にとっては自明である。
配合および投与
前記のように本発明は、組み合わされたかまたは同時の選択的NEP/IGS5−抑制化合物、場合によっては、別個のACE−および/またはECE−抑制化合物との組み合わせ物、またはこれらそれぞれの製薬学的に認容性の塩、溶媒和物または生物的不安定性エステルが、有利な治療的活性を有することを示した。したがって、これらの化合物、場合によっては別個のACE−および/またはECE−インヒビターとの組合せ物は、大型哺乳類、特にヒトにおいて、高血圧の二次的形態、たとえば腎性高血圧または肺性高血圧を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛を治療および/または予防するための医薬として適している。NEP/IGS5−抑制化合物、場合によっては別個のACE−および/またはECE−抑制化合物との組み合わせ物は、すべての公知の投与経路で投与されてもよい。
【0104】
組成物は、投与経路に関して適用されてもよく、特に、全身的であるかまたは経口経路によるものである。全身投与の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を含む。他の注入経路、たとえば座薬、筋注または皮下注射が使用されてもよい。二者択一的な全身投与のための手段は、粘膜吸収および経皮吸収投与を包含し、この場合、これらは、浸透剤、たとえば胆汁酸塩またはフシジン酸塩または他のデタージェントを含む。さらに、化合物は、腸溶製剤またはカプセル化剤の形で処方されてもよく、さらに経口投与も可能であってもよい。このような化合物の投与はさらに、局所的および/または局在的に、軟膏、ペースト、ゲル等の形であってもよい。
【0105】
本発明による投与に関して、本発明において前記に示された疾病または症状を、緩和するかおよび/または予防する、NEP/IGS5−抑制化合物の治療的活性量は、通常の製薬学的助剤および/または添加剤を、固体または液体の製薬学的処方において包含することができる。
【0106】
固体の投与形の例は、たとえば固体、半固体、凍結乾燥粉末、タブレット、被覆タブレット、ピル、カプセル、粉末、顆粒または坐剤であってもよく、さらに、持効性製剤の形であってもよい。このような固体の投与形は、標準的な製薬学的無機および/または有機助剤を含有していてもよい。このような助剤は、製薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、硫酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム、さらに常用の製薬学的添加剤、たとえば、充填剤、潤滑剤またはタブレット崩壊剤を含む。液体製剤、たとえば活性成分の溶液、懸濁液または乳液は、通常の希釈剤、たとえば水、油および/または懸濁剤、たとえばポリエチレングリコール等を含有していてもよい、他の添加剤、たとえば保存剤、矯味剤等をさらに添加してもよい。
【0107】
活性成分は、公知の方法で、製薬学的助剤および/または添加剤と一緒に混合してもよいかまたは配合してもよい。固体の投与形態の製造に関して、たとえば、活性成分は、助剤および/または添加剤と一緒に混合されてもよく、かつ、ウェットまたはドライの工程で造粒されてもよい。顆粒または粉末は、直接的にカプセル中に装填されてもよいか、あるいは、タブレットコアの形に圧縮されてもよい。好ましい場合には、これらは公知の方法で被覆されてもよい。
【0108】
液体製剤は、化合物および場合によっては製薬学的アジュバントを、キャリアー、たとえば塩水溶液、水性デキストロースまたはエタノール中に溶解するかまたは分散することによって製造することで、溶液または懸濁液を形成することができる。
【0109】
投与すべき用量は、固体間で、かつ勿論、治療すべき症状の型およぶ投与経路に依存して異なっていてもよい。たとえば、局所的に適用可能な製剤、注入可能な製剤は、一般には、本質的に全身適応の製剤よりも低い活性物質の量を含む。このようにして、要求される用量範囲は、特に、化合物の選択、投与経路、処方の性質および患者の症状の点で担当の医師の判断にゆだねるものである。しかしながら、適した用量の範囲は、患者当たり0.1〜100μg/kgである。しかしながら、必要とされる投与量の広範囲の多様性は、化合物の種々の利用可能性および種々の投与経路の異なる効率の点で、予想されるものである。たとえば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予想される。これらの投与量における差異は、最適化のための標準的経験によってかまたは同様に技術水準において調整することができる。
IGS5DNAおよびIGS5タンパク質配列を含む表
【0110】
【表1】
【0111】
【表2】
【0112】
【表3】
【0113】
【表4】
【0114】
【表5】
【0115】
【表6】
【0116】
本明細書中で引用された、特許および特許出願に制限することのないすべての刊行物は、ここでは参考のためにのみ記載されているものである。
【0117】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例証するものであって、いずれの場合であっても、本発明の範囲を制限するものではない。
例1 ネプリライシン NEP/ECEメタロプロテアーゼファミリーの新規メンバーをコードするcDNAのクローニング
例1a IGS5のcDNAコーディング配列の相同性クローニングの概略
M13サブファミリーのメタロプロテアーゼは、種々の神経ペプチドおよびホルモンペプチドの代謝において含まれる。現在において、このサブファミリーは、ネプリライシン(NEP)、エンドセリン−変換酵素−1(ECE−1)、ECE−2、Kell、PexおよびXCEを含む。
【0118】
NEPおよびECEのインヒビターは、たとえば、心臓および胃腸における治療的使用のために開発されてきたものである。このファミリーの付加的なメンバーは、重要な薬剤の標的であってもよいことから、相同性クローニングを、ヒトゲノム中で新規の遺伝子を同定するために使用した。
【0119】
IGS5の相同性クローニングは、前記に示された一般的な記載および本明細書中で参考のために記載されている国際特許出願PCT/EP00/11532の実施例の部分においてさらに例証されている試験データによって実施された。方法は以下の通りである。
【0120】
発現配列tags(ESTs)のデータバンクにおいて、配列は、NEP/ECE−様のメタロプロテアーゼのC−末端部との類似を示す小さいオープンリーディングフレームを含んでいることが検出された。これらのEST配列およびNEP/ECE−様メタロプロテアーゼの保存的ペプチドモティーフに基づいて、我々は、ヒトの肺、心臓および精巣cDNAから完全なcDNA配列をクローニングするための変性PCRを使用した。
【0121】
cDNA配列はグリコシル化タンパク質、すなわちIGS5か、あるいは、二者択一的なヒト可溶性エンドペプチダーゼ(hSEP)をコードし、この場合、これは、M13ファミリーメンバーの特徴を示している。IGS5は、マウスSEP(78%)、マウス、ラットおよびヒトNEP(54%)およびヒトECE−1(39%)に対して高いアミノ酸配列の同一性を示した。マウスSEPおよびSEP△スプライシング変異体との類似性において、さらに、78bpで二者択一的なエキソンで異なる2種のIGS5スプライシングの型が検出された。これらのスプライシング型は、それぞれ、タンパク質の753および779残基をコードする。より長い型は、膜内外アンカーと近接して配置された推定タンパク質分解部位を含む。したがって、2種のスプライシング変異体は、IGS5タンパク質の膜結合および可溶性の形を示す。
【0122】
多重組織ドットブロット分析(multiple tissue dot blot analysis)および定量的PCRを用いての発現分析は、種々のヒト組織中で、精巣中で観察された最も強いシグナルでの発現を示した。さらに、IGS5mRNA発現は、たとえば、前立腺、小腸、胃、結腸、腎臓および脳で観察された。2種のスプライシング変異体は、顕著な発現パターンを示した。
【0123】
機能的特徴については、この酵素が、ネプリライシンファミリーの真性メンバーであり、かつECE活性を有することが確認された。
例1b.NEP/ECE メタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配列を含むIGS5のアライメント
オリジナルとしてクローニングされたIGS5に関して(実施例1参照)、最新のタンパク質データバンクおよび翻訳DNAデータバンクのホモロジーサーチは、BLASTアルゴリズムを用いて実施された(Altschul S.F. et al. [1997], Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)。これらのサーチは、オリジナルとして得られたIGS5タンパク質が、マウス、ラットおよびヒトの中性エンドペプチダーゼに対して最も類似していることを示した(SW:NEP_MOUSE 寄託番号Q61391;SW:NEP_RAT、寄託番号P07861およびSW:NEP_HUMAN、寄託番号P08473)。したがって、NEP/ECEファミリーの他のメンバーを含むほぼ完全なIGS5タンパク質配列のこのアライメントは、一般にはIGS5とメタロプロテアーゼとの関連性を示し、特に、NEPおよび/またはECEメタロプロテアーゼファミリーとの関連性を示した。この構造的アライメントから、IGS5が、メタロプロテアーゼの機能を有していると考えられ、したがって、これらは、動物およびヒトにおけるいくつかの不全症、障害または疾病において重要である。
例1c.IGS5の完全長コーディング配列を含むcDNAフラグメントのクローニング
付加的なIGS5cDNA配列を得るために、RT−PCRの他のラウンドを、ヒト肺RNA上で、前記条件下で、IGS5特異的リバースプライマーを用いておこなった。得られるコンティグは、“ATG”開始コドンで開始し、かつ、マウスSEPタンパク質のN−末端配列と高い類似性を示すタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた。
【0124】
すべての単離されたクローンのDNA配列のアセンブリは、2種のcDNA配列の存在を示し、この場合、これらは、ゲノミッククローンIGS5/S1の範囲内で最初に同定された、78bpセグメントの有無によって異なっていた。これらの2種の配列は同様に、二者択一的なスプライシングRNA分子に由来するものである。最も長いトランスクリプトは、2337ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み(779残基のタンパク質をコードする)、その一方で、最も短いトランスクリプトは、2259ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有している(753残基のタンパク質をコードする)。コーディング配列および長鎖のタンパク質配列は、IGS5DNA1(配列番号3で示され、停止コドンtagを含む2340bp)およびIGS5PROT1(配列番号4)としてそれぞれ呼称され、その一方で、短鎖のコーディング配列およびタンパク質配列は、IGS5DNA2(配列番号5;停止コドンtagを含む2262bp)およびIGS5PROT2(配列番号6)と、それぞれ呼称される。IGS5DNA1およびIGS5DNA2の範囲内で仮定されるメチオニン開始コドンの下流には、付加的なインフレームメチオニンコドンが、コドン位置10で存在する。開始コドンとしての第1メチオニンコドンに関しては、コドン位置10でいくつかの翻訳を開始(またはさらには排他的に)を排除することができないが、それというのも双方のメチオニンが、翻訳内容の同等に好ましい “Kozak”開始の範囲内で生じるためである(Koza M., Gene [1999]:234:187-208)。IGS5PROT1およびIGS5PROT2配列のハイドロパシー分析(Kyte J. et al., J. Mol. Biol. [1982]157:105-132; Klein P et al., Biochem. Biophys. Acta [1985]815: 468-476)は、残基22〜50の間のシングルトランスメンブレンドメインの存在を示した。これは、IGS5PROT1およびIGS5PROT2が、タイプIIの一体型膜タンパク質であることを示し、かつこれによって、NEP/ECEタンパク質ファミリーの他のメンバーとの膜トポロジー類似性を有する。
例1c.NEP/ECEメタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配列を含む、例1cのIGS5タンパク質配列のアライメント
例1cでクローニングされたIGS5に関して、今日のタンパク質データバンクおよび翻訳されたDNAデータバンクのホモロジーサーチを、BLASTアルゴリズムを用いて実施した(Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. [1997]25:3389-3402)。これらのサーチは、IGS5PROT1がマウスSEPと最も類似しており(778の配列された残基上での76%の同一性)(GenBank 寄託番号AF157105)、さらには、マウス、ラットおよびヒトの中性エンドペプチダーゼ(SW:NEP_MOUSE 寄託番号Q61391;SW:NEP_RAT、寄託番号P07861およびSW:NEP_HUMAN、寄託番号P08473)に対する696の配列された残基上で、54〜55%の同一性を示した。IGS5PROT2のホモロジーサーチは、この配列が、マウスSEPΔ(GenBank 配列番号AF157106)に対して最も類似していることを示した(752配列残基上の78%の同一性)。マウスSEPおよびSEPΔタンパク質との類似において、IGS5PROT1およびIGS5PROT2が、IGS5タンパク質の可溶性形態および膜結合形態をそれぞれ示すことが予想された。これは、二者択一的なスプライシング78bpエキソンの3’末端でコードされた二塩基性残基(KRK)の存在によって確立された。
【0125】
したがって、NEP/ECEファミリーの他のメンバーを含む完全なIGS5タンパク質配列のこのアライメントは、一般に、IGS5とNEP/ECE/メタロプロテアーゼとの関連性、特に、SEPとNEPファミリーメンバーとの関連性を示す。この構造的アライメントから、IGS5タンパク質が、メタロプロテアーゼの機能を有しており、これによって、動物およびヒトにおけるいくつかの不全症、障害または疾病において重要であることが推測された。
【0126】
例2.ヒトIGS5の可溶性HIS−tagエクトドメインの発現および精製
試験の目的は、バキュロウイルス発現系を用いて、可溶性IGS5タンパク質を製造することである。組み換えバキュロウイルスは、Sf9細胞系の感染を用いて、His6−tagIGS5エクトドメインの発現を構築する。その後に、可溶性IGS5タンパク質は、培養上清から、レンチル−レクチンおよびZn−IMACクロマトグラフィーを含む2段階工程で精製され、かつ、His6−ECE−1に関する技術水準でおこなった。
例2a.試験方法
キネティック発現分析
10%の不活化ウシ胎児血清を含むTC100培地(JRH Bioscience キット番号10084168)中で、27℃で、撹拌フラスコ中の懸濁液中で指数的に増殖させた519細胞(IGCL 83.0)を、低速の遠心分離によって捕集し、かつ、血清不含のTC100培地中で、5x105細胞/Fk(25cm2)で、血清不含のTC100媒体中に接種した。候補となる組み換えウイルスクローンを、3pfu/細胞の多重感染(MOI)で添加し、その後に、細胞/ウイルスを、27℃でインキュベートした、細胞および調製培地(CM)を、2回に亘っての連続的な低速遠心分離によって、感染の24、48および72時間後にハーベストした。試料をSDS PAGEによるゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングによって分析した。
脱グリコシル化試験
試料に最終濃度1%でSDSを添加し、かつ5分間に亘って95℃でインキュベートした。2xインキュベーションバッファー1容量(250mM リン酸バッファー、50mM EDTA、5% N−オクチルグリコシド、1% 2−メルカプトエタノール)を添加し、かつ付加的な5分間に亘っての95℃でのインキュベーション時間の後に、試料を37℃に冷却した。N−グリコシダーゼF 1U(Boehringer Mannheim, キット番号1365177)を添加し、かつ37℃で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、試料を100mM DTTで還元した(最終濃度)。
製造工程
10%の不活性化ウシ胎児血清を含むTC100培地(JRH Biosciences, キット番号56941)中で、27℃で、撹拌フラスコ中で、懸濁液中で指数的に増殖した519細胞(IGCL 83−2)を、低速の遠心分離によって回収し、かつ、TC100媒体中の2x106細胞/mlの密度で懸濁し、0.013 TIU アプロチニン/ml(Pentex)を添加した。組換えウイルスIGBV73を、2.25pfu/細胞の多重感染(MOI)で細胞に添加した(MOI3の代わりに、主要ウイルスバンクの低いタイターによって)。細胞/ウイルス懸濁液をその後に、27℃で、ガラスローラーボトル(3 x 500 ml /1260 cm2)中で、72時間に亘ってインキュベーションした。その後に、CM(1.5l)を、細胞および細胞崩壊物から、2回に亘っての連続的な低速遠心分離によって洗浄した。アリコートをウエスタンブロッティング分析による質的調整のために取り出し、かつ、エンドトキシンレベルを測定した。
例2b.結果
発現のキネティクス
3個の候補となる組換えウイルスクローンの発現のキネティクスを、ウエスタンブロット分析により試験した。ウエスタンブロットは、すべての候補となるクローンのCM中でほぼ81kDaで、明瞭なバンドを示し、この場合、これは、成熟タンパク質(81.2kDa)の理論的Mrに相当する。細胞溶解物に関しては、SDSゲルはオーバーロードであったために結果は得られなかった。全部で3個のクローンの発現レベルは、感染後48〜72時間でピークに達した。クローン2をさらに増幅させるために選択し、かつ、IGBV73として寄託した。最適なハーベスト時間は感染後72時間に設定した。
脱グリコシル化試験
可溶性のIGS5タンパク質配列は、8個のポテンシャルなN−グリコシル化部位を有している。精製工程は、CMおよび細胞溶解物のレンチル−レクチンカラム試料上での糖残基の結合を含むが、感染後72時間にハーベストされたものは、N−グリコシダーゼFでの脱グリコシル化のために使用し、組み換えの可溶性His6IGS5タンパク質がさらにグリコシル化タンパク質として発現されるかどうかを試験した。
【0127】
N−グリコシダーゼFによって処理されたCM試料、および非処理のコントロール群のウエスタンブロット分析は、試料が脱グリコシル化された場合にMr中でのシフトを示し、その際、溶解性のヒトHis−tagIGS5が、グリコシル化タンパク質として発現するかどうかを試験した。非処理の細胞溶解物中において、約80〜82kDaの3個のタンパク質バンドが観察されてもよい。N−グリコシダーゼF処理上で、おおよそ80kDaの1バンドは、依然として可視的であり、この場合、これは、非処理試料の最も低いMWバンドに相当する。
製造工程
CM 1.5lを、感染72時間後に、IGBV7感染されたSf9昆虫細胞からハーベストした。エンドトキシン内容を、0.0847EU/mlであると測定した。ウエスタンブロット分析は、CM中でおおよそ81kDaの明瞭なバンドを示し、この場合、これは、成熟した可溶性HistagIGS5のMWに相当する。細胞溶解物試料と比較した場合に、3個のタンパク質バンドが示され、弱い中程度のMrバンドに相当するCMタンパク質バンドが、細胞中に存在した。
例3.IGS5の精製
例3a.実験方法
試料処理
1タブレットのEDTA不含コンプレート(EFC;Roche Biochemicals, キット番号1873580)を300mlの精製されたバキュロCMに添加した。HEPES、グリセロールおよびTween20を、それぞれ20mM、5%(v/v)および0.005%(w/v)の最終濃度に添加した。CMのpHを7.4に調整し、かつ試料を、Durapora メンブレンフィルター 0.2μ GVで濾過した。すべての精製工程を4℃で実施した。
レンチル レクチン クロマトグラフィー
バキュロ試料を、C10/10カラム(Pharmacia)中の5ml レンチル レクチン セファロース樹脂上で、0.3ml/分で、一晩に亘ってロードし、この場合、このカラムは、1タブレットのEFC/500mlが添加されたバッファーA(20mM Hepes,150mM NaCl、5%グリセロール、0.005%Tween20)で平衡化した。カラムを、平衡化バッファーで、280nmでの吸光度が基準値に達するまで洗浄し、かつ結合タンパク質を、0.5M α−メチルピラノシドを含有するバッファーAを添加することによって溶離した。カラムに、100mMアセテート、500mM NaCl、pH5.0を添加することによって再生させた。溶離液および再生液を捕集し、かつプールを12.5%のPhastゲル(Pharmacia)上でのSDS−PAGEおよび銀染色によって分析した。前染色マーカー(Gibco)は、相対的な分子量マーカー(Mr)スタンダードとして含まれている。
固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)および透析
1mlのキレ−ト化HiTrap(Pharmacia)を製品説明書に記載されているように亜鉛イオンでロードし、かつバッファーB(20mM Hepes, 100mM NaCl, 5% グリセロール、0.005%(w/v)Tween20、pH7.2)で平衡化した。レンチル溶離プール1および2を別個に、HiTrapカラム上でそれぞれ0.5ml/分でロードした(IMACランAおよびIMACランB)。ブランクのランは、クロマトグラフィーの吸光プロフィールとの比較のために使用した。カラムをバッファーBで、基準値のレベルまで洗浄し、かつ結合タンパク質は、バッファーB中のイミダゾール勾配溶液(20、50、100および200mM)を添加することによって溶離した。画分を手動で捕集した。IMACカラムに、20mM Hepes、50mM EDTA、500mM NaCl、pH7.2を添加することによって再生させた。溶離プールおよび再生プールを、SDS−PAGE(12.5% Phast gels, Pharmacia)および銀染色によって分析した。200mM イミダゾールプールを、 slide a−lyzer−cassette(MWCO 10,000,Pierce)に移し、かつバッファーBに対して一晩に亘って透析した(130倍過剰量、バッファーは置換しない)。
タンパク質の定量化
透析プールにおける溶解性IGS5の量を、マイクロ−BCA法を用いて測定した(Pierce)。BSAは参考のために使用した。
タンパク質の特徴付け
透析されたバキュロIGS5を、生化学的に、(1)還元および非還元条件下でのSDS−PAGE、および(2)抗Hig−tagmAbでのウエスタンブロッティング、その後のアルカリフォスファターゼ標識ラビット抗−マウスIg(Dako)でのインキュベーション、およびNBT/BCIP染色による検出によって特徴付けした。溶解性のIGS5のグリコシル化状態を、PGNaseF処理によって検証した(Biorad)。
例3b.結果
0.5M α−メチルピラノシドを有するレシチル溶離プロフィールは、テーリングのあるピークを生じた。流動、洗浄および溶離プールを、SDS−PAGEおよび銀染色によって分析した。タンパク質の主要な量を、流動中で検索し、約85000のMrを有するIGS5−候補となるバンドを、溶離プール1〜3中で観察した。抗His tag mAbを有するレンチルクロマトグラフィーのウエスタンブロット分析は、溶解性hIGS5タンパク質(Mr=85000)が、定量的にレンチルレシチン樹脂と結合し、かつHis−tagタンパク質を、すべての溶離ピーク上で捕集されることを示したが、しかしながら主にプール1と2からであった。レンチルレクチン溶離プール1および2を、さらに亜鉛−IMACカラム(ランAおよびB)上で処理した。結合タンパク質を、イミダゾー勾配により溶離した。SDS−PAGE分析および銀染色は、コンタミネートされたタンパク質の塊が、20mMおよび50mMイミダゾール工程によって溶離したことを示した。hIGS5タンパク質は、100mMおよび200mMのイミダゾール溶離工程において検索された。溶離物中で、最大10%のhIGS5を含有する100mMイミダゾール溶離物は、依然としてMr>115000を有するタンパク質でのコンタミネーションがみられた。さらに、100mM中のIGS5バンドは、ダブルバンドであった。これは、10%未満の二重の弱い上部のバンドが、残留するバキュロウイルスによるコンタミネーションであるかまたはIGS5異性体型であるかどうか、あるいは、下部の(強い)バンドが、カルボキシ残基分解産物であるかどうかを試験するために残した。200mMイミダゾールプール中の85kDaのバンドは、SDS−PAGE上のシングルバンドであり、この場合、これらは、抗his−tag mAbと反応されたものである。
【0128】
銀染色では、IMACランAおよびランBから得られたhIGS5材料との間の任意の純度の違いについては示されない。これは、レシチン溶離物のプール1とプール2とが、さらにプールされ、かつ亜鉛−IMACカラム上の単一のランで同時に処理されてもよいことを示す。
【0129】
同一のバンドパターンは、還元または非還元条件下で、クマシン染色されたSDS−PAGEゲル上で観察され、その際、精製されたhIGS5が、ジスルフィドに基づくオチゴマーを含んでいないことを示した。PGNaseFでの処理は、約5kDaを含むSDS−PAGE上のMrを減少させた。エンドグリコシダーゼでの処理の後のバキュロ発現hIGS5のこの最小限のシフトは、CHO発現マウスSEPに関して観察されたイミグレーションシフトとは明らかに異なっていた(Ikeda et al., JBC, 274, 32469,1999)。
【0130】
バキュロCM 300mlから出発して、95%を上廻る純度のHis−taghIGS5エクトドメイン340μgが、2段階の精製工程によって得られた(すなわち、約1mg/lの収率)。その後に精製産物は、酵素抑制アッセイ中で、以下の実施例で示されたように使用される。
例4.IGS5酵素抑制アッセイ
本発明のIGS5ポリペプチド酵素活性は、生物学的活性ペプチドの代謝に関連して試験された。特に、これらのIGS5ポリペプチドが、当業者に公知の種々の血管作用性ペプチド、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド(ANP)、ブラジキニン、big−エンドセリン(big−ET−1)、エンドセリン(ET−1)、サブスタンスPおよびアンジオテンシン−1上で作用するかどうかについて試験した。本発明の範囲内では、特に、新規のヒトメタロプロテアーゼであるIGS5エクトドメインが、前記血管作用性ペプチドを加水分解するかどうかについて試験した。比較のために、アッセイをさらに、以前Emotoらによって示された可溶性分泌エンドペプチダーゼ(SEP)である、公知のメタロプロテアーゼファミリーメンバーに関しておこなった(J.Biol.Chem., Vol. 274 (1999): pp. 32469-32477)。さらに、big−ET−1アナログ(いわゆる17aabig−ET−1)に変換するIGS5活性が、ECEおよび/またはNEP−特性を有する酵素に関する抑制特性を測定するために使用された、参考化合物によって抑制されるかどうかについて試験した。big−ET−1アナログ上のIGS5−活性の抑制を試験するために使用された化合物は、NEP−特性を有するエンドペプチダーゼを抑制する化合物ホスホラミドン、NEPを選択的に抑制する化合物チオファン、およびNEP/ECEの二重のインヒビターである化合物CGS−35066である。
例4a.材料
酵素:IGS−5(sol hu)(his)6;または;His6−tag IGS5エクトドメイン;
ストック溶液:20mM HEPES pH7.2、5%グリセロール、0.005%Tween20、100mM NaCl、純度>99%;保存4℃
ワーキング溶液:ストック溶液をアッセイバッファーで10μg/mlに希釈した。
基質:Mca−Asp−IIe−Ala−Trp−Phe−Dpa−Thr−Pro−Glu−His−Val−Val−Pro−Tyr−Gly−Leu−Gly−COOH;
フルオレセンス−クエンチング big−ET−1アナログ;
Mca=7−メトキシクマリン−4−イル;
Dpa=3−[2,4−ジニトロフェニル]−L−2,3−ジアミノプロピオニル;
ストック溶液:アッセイバッファー中100μM;−20℃保存(次の供給元から市販されている:Polypeptide Laboratories, Wolfenbuettel, Germany)
アッセイバッファー:100mMトリスpH7.0、250mM NaCl
すべての試験化合物は、10mMのDMSO中で溶解され、かつさらにアッセイバッファーで希釈した。
例4b.アッセイ工程
10μlの酵素ワーキング溶液および10μlの試験化合物溶液を含有するアッセイバッファー 70μl量を、エッペンドルフチューブ中で混合し、かつ、37℃で15分間に亘ってプレインキュベートした。その後に、10μlの基質ストック溶液を添加し、かつ反応混合物を37℃で60分に亘ってインキュベートし、酵素的加水分解をおこなった。引き続いて酵素反応を、95℃で加熱することによって5分に亘って完了させた。遠心分離(Herawus Biofuge B 3分)の後に、上清についてHPLC分析をおこなった。
例4c.HPLC工程
消化産物からの残留する基質を分離するために、逆相HPLC技術を、CC125/4Nucleosil 300/5 C18 RPカラムおよびCC8/4 Nucleosil 100/5 C18 プレカラムを用いて使用した(Macherey-Nagel, Dueren, Germanyから商業的に入手可能である)。したがって、例7b中で得られた反応試料 60μlを、HPLC中に装入し、かつカラムを以下の勾配および溶液を適用させることによって、1ml/分の流量で溶離した:
溶液A:100% H2O+0.5M H3PO4、pH=2.0
溶液B:100% アセトニトリル+0.5M H3PO4
0〜2分 20% B
2〜6分 20〜60% B
6〜8分 60% B
8〜10分 60〜90% B
10〜13分 90% B
13〜15分 90〜100% B
ペプチドを、214nmの吸光度で、かつ励起波長328nmおよび放出波長393nmでのフルオレセンスによって検出した。
例4d.算定
加水分解後のクエンチングされていないMca−発けい団を用いての、ペプチドのHPLC−ピークの増加した蛍光シグナルが、任意の算定のためのベースとして使用された。
【0131】
このシグナルを、インヒビターを含むかまたは含まない試料と比較し、かつ抑制%をそれぞれのピーク面積に基づいて算定した。
抑制%=100★(1−A抑制/Aコントロール)
すべての試料について二重に流し、かつその平均値を使用した。
【0132】
スタンダードインヒビター(10nMおよび100nMホスホアミドン)および溶剤コントロール(0.1%)をそれぞれのアッセイのランに加えた。
例4e.結果
本発明のIGS5ポリペプチドに関して、例4の結果は、これらのIGS5メタロプロテアーゼポリペプチドが、in vitroで、当業者に公知の血管作用性ペプチドを加水分解することを示した。SEP活性と比較しての加水分解アッセイの結果は、第7表に示した。これらの結果から、IGS5は、前記生物学的血管作用性ペプチドの代謝において、特に影響を与えるものと推測される。
【0133】
【表7】
★ 500μg IGS5 ポリペプチド
★★ 10μg IGS5 ポリペプチド
★★★ アンジオテンシンIIの形成を生じないアンジオテンシンIの分解
★★★★ 17aabig−ET−1を、中性big−ET−1のアナログとして使用され;さらにIGS5の加水分解活性が、中性big−ET−1を用いて検出されたが、しかしながら、HPLC−検出を用いての困難性によって定量化されない。
例5.NEP酵素抑制アッセイ
中性エンドペプチダーゼ(E.C. 3.4.24.11)を、Geeらの方法によって、ブタの腎皮質から製造され(Biochem J 1985 May 15; 228 (1): 119-26)、かつReltonら(Biochem J 1983 Dec 1; 215 (3): 519-23)によって示されたように精製した。酵素抑制アッセイに関して、精製された酵素10ng、20μM基質(メチオニン−エンケファリン)および種々のインヒビター濃度を使用した。アッセイバッファーを、50mM トリス−(ヒドロキシメチル)−アミノメタン/HCl pH7.4であり、全アッセイ容量は100μlであった。酵素およびインヒビターの5分間に亘ってのプレインキュベーション後に、基質を添加し、引き続いて酵素によって誘導される基質の加水分解のための第2インキュベーション工程を、37℃で30分に亘って開始した。酵素反応を、95℃で5分間に亘って加熱することによって停止させた。遠心分離の後に、上清についてHPLCをおこなった。酵素による基質加水分解の産物を、HPLC技術によって、本来の基質から分離し、かつインヒビターのポテンシャルを産物のピーク面積と、本来の基質のピーク面積とを、インヒビターを含むかまたは含まない(コントロール群)双方の試料について比較することによって算定した。酵素を含まないブランク、インヒビターを含まないコントロール群、インヒビターの代わりにインヒビター溶剤を含む試料、および標準的なインヒビターを含む試料を、それぞれのアッセイのランに加えた。
材料の供給元:
NEP:Dr.Philippe Crine,Univ.of Montreal,Canada
メチオニン−エンケファリン:Sigma,Deisenhofen,Germany
例6.ECE酵素抑制アッセイ
組み換えヒトCOOH−末端 His6−tag エンドセリン変換酵素−1を、Sf9−細胞中で発現させた。精製を、アフィニティークロマトグラフィーを用いておこなった。酵素抑制アッセイは、酵素(2.8μg)、5μg 基質(適度に改質化された17アミノ酸切断bigエントセリン−1)、種々の最終濃度でのインヒビターおよび100mMトリス−バッファー(トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン/HCl、pH7.0+150mM NaCl)を最終容量100μl中に含む。37℃で15分に亘ってのインヒビターを含む酵素のプレインキュベーションは、基質の添加および酵素加水分解のためのインキュベーション(37℃で60分)の前におこなった。酵素反応を、95℃で5分に亘っての加熱によって停止させた。遠心分離の後に、上清を、未分解基質からの酵素加水分解産物の分離のためにHPLCをおこなった。抑制%を、コントロール群と比較して、抑制反応に関しての産物および未切断の基質に関するピーク面積に基づいて算定した(インヒビター不含)。酵素を含まないブランク、インヒビターを含まないコントロール、インヒビターの代わりにインヒビター溶剤を含む試料および標準的なインヒビターを含む試料を、それぞれのアッセイのランに加えた。
材料の供給源:
ECE: Innogenetics,Ghent,Belgium
ECE基質:Polypeptide,Wolfenbuettel,Germany
例7:参考化合物と比較してのNEP/IGS5−抑制化合物の生化学的プロフィール
本発明の目的のための、IGS5の製薬学的酵素特性を特徴付け、かつ評価するために、ヒトIGS5タンパク質を、前記実施例中で記載したような発現系としての昆虫細胞を用いて製造し、かつ、IGS5タンパク質の種々のポテンシャルな基質を試験した。例4の結果によれば、IGS5は、big−ET−1、ANPおよびブラジキニンを効果的に消化することを見出し、これによって、新規タンパク質が、広範囲の基質特異性を有する真性メタロプロテアーゼであることを確認し、この場合、これは、メタロプロテアーゼの一般的な特徴であり、かつ、これらの特徴は、NEP、ECE−1さらにはACEに関して報告されている。さらに本発明によれば、big−ET−1のIGS5によるタンパク質分解は、驚くべきことに、ET−の正確な形成を生じ、この場合、これは、たとえばbig−ET−1が、正確にアミノ酸Trp21とVal22との間を切断されることによるものである。
【0134】
さらに、メタロプロテアーゼインヒビター化合物と、big−ETをET−1に変換するのを抑制する参考化合物とのポテンシャルは、標識化された蛍光big−ET−1アナログを使用して、例7に記載のようにして試験された。酵素アッセイにおいて適用された方法は、IGS5に関しては例4で前記に示されたように、NEPに関しては例5で、およびECEに関しては例6で記載されている。
【0135】
酵素抑制試験の結果は、第8表に示した。in vivoで、big−ETのET−1への変換を抑制することが知られているホスホラミドンは、さらに本発明において使用された生化学アッセイにおいて高いポテンシャルでIGS5を抑制し、かつ驚くべきことに、ホスホラミドンによるIGS5の抑制は、実際には、ECE−1よりもかなり高かった。対照的に、選択的NEPインヒビターチオファンならびに選択的ECE−1インヒビターSM−19712(4−クロロ−N−[[(4−シアノ−3−メチル−1−フェニル−1H−ピラゾール−5−イル)アミノ)カルボニル]ベンゼンスルホンアミド、一ナトリウム塩;Umekawa K,Hasegawa H,Tsutsumi Y,Sato K,Matsumura Y,Ohashi N.,J Pharmacol 2000 Sep;84(1):7−15;Discovery Research Laboratpories I,Research Center,Sumitomo Pharmaceuticals Co,Ltd,Osaka,Japan)は、IGS5の活性に作用しなかった(第8表)。
【0136】
【表8】
【0137】
本発明による結果は、特に以下の事実から極めて驚異的である。エンドセリン変換酵素−1(ECE−1)が、1994年にクローニングされ、この酵素は、一般にはbig−ET−1のET−1への生理学的変換に関して応答可能なエンドペプチダーゼとして認められるようになった。しかしながら、ECE−1がbig−ET−1を切断する能力を有するといった事実にもかかわらず、最近の報告によれば、ECE−1が唯一の生理学的に関連するエンドセリン変換酵素であるのかといった疑問、あるいは少なくとも付加的な酵素が、ET−1生成に係わっているに違いないといった意見が生じた。IGS5タンパク質は、NEPに対して高い類似性を有する(54%の同一性)メタロプロテアーゼであることが見出され、かつ、ECE−1に対してはやや低い類似性である(39%同一性)。例4以下の試験によって、この新規メタロプロテアーゼの酵素的性質を特徴付けるために、ポテンシャルな基質が探され、かつサブスタンスP、ブラジキニン、big−ET−1および効率の低いANP、アンジオテンシンIおよびET−1が、IGS5によって切断されることが見出された。IGS5の酵素活性は、中性pH(7.0〜7.5)で最適化される。big−ET−1のIGS5によるタンパク質分解が、ET−1の正確な形成中に生じることは重要である。
【0138】
本発明による例7の試験によって、IGS5による、big−ETのET−1への変換抑制のためのメタロプロテアーゼインヒビターのポテンシャルが、基質として標識化された蛍光big−ET−1アナログを用いて試験された。In vivoで、big−ETのET−1への変換を抑制することが知られているホスホラミドンは、さらに、生化学的アッセイにおいて、高いポテンシャル(IC50=18nM)でIGS5を抑制する(ECE−1よりも著しく高い)ことは興味深い。対照的に、Sumitomoからの選択的NEPインヒビター チオファンならびに選択的ECE−1インヒビター SM−19712は、IGS5の活性に作用するものではなかった。
【0139】
したがって、式Iの化合物、特に、式IaまたはIbを有する化合物は、それぞれ、驚くべきことに、組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示した。式Iaの化合物の典型例として、式Ia−2の化合物、および式Ibの化合物の典型例として、式Ib−8の化合物が、本発明の例中で試験された。双方の化合物は、新規に同定されたIGS5メタロプロテアーゼの極めてポテンシャルなインヒビター(IC50=1.2および2.9nM)であることを示した。
Claims (25)
- NEPとIGS5とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって、緩和または予防することができる症状を患うか、あるいはこれに感受性である哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、
c)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上および、
d)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドである、メタロプロテアーゼIGS5上での、
組み合わされた、特に同時の抑制活性を有する化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。 - big−ET−1レベルが増加する疾病または症状であり、かつ、NEPとIGS5とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる症状を患うか、あるいはこれに感受性である哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項1に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- ET−1が著しくアップレギュレーションされる疾病または症状であり、かつ、NEPとIGS5とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病または症状を患うか、あるいはこれに感受性である哺乳類、好ましくはヒトを治療するための、医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項1に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- 大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および/または予防の医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項1から3までのいずれか1項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- 大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、アテローム性動脈硬化症の治療および予防のための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項2または3に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- 大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および/または予防のための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項2または3に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- メタロプロテアーゼIGS5が、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項1から6までのいずれか1項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- メタロプロテアーゼに含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも95%の同一性を有する、請求項1から7までのいずれか1項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物または生物的不安定性エステルの使用。
- メタロプロテアーゼに含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つと同一である、請求項8に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- a)中性エンドペプチダーゼ(NEP)上と
b)配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、メタロプロテアーゼIGS5とを、組み合わせてまたは同時に抑制することによって、緩和または予防することができる疾病または症状を患うか、あるいはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、
式I
R2aは水素であるか、あるいは生物的不安定性エステルを形成する基を意味し;かつ、
式III中、R1bは水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、
R2bは水素であるか、あるいは生物的不安定性ホスホン酸エステルを形成する基であり、かつ、その際、R3は、水素であるか、あるいは生物的不安定性カルボン酸エステルを形成する基を意味する]の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。 - big−ET−1レベルが増加する疾病または症状であり、かつ、NEPとIGS5とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病(症状)を患うか、あるいはこれに感受性の大型哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項10から12までのいずれか1項に記載の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- ET−1が著しくアップレギュレーションされた疾病(症状)であり、かつ、NEPとIGS5とを組み合わせてまたは同時に抑制することによって緩和または予防することができる疾病(症状)を患うか、あるいはこれらに感受性の哺乳類、好ましくはヒトを治療するための医薬品(医薬品組成物)を製造するための、請求項10から12までのいずれか1項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- 大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および/または予防のための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項10から14までのいずれか1項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- 大型哺乳類、好ましくはヒトにおける、アテローム性動脈硬化症の治療および/または予防のための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項13または14に記載の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- 哺乳類、好ましくはヒトにおける、腎性高血圧または肺性高血圧のような高血圧の二次的形態を含む高血圧症、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心肥大、大脳虚血、末梢血管障害、クモ膜下出血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息、腎臓病、アテローム性動脈硬化症、および結腸直腸癌または前立腺癌おける疼痛の治療および/または予防のための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項13または14に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- メタロプロテアーゼIGS5が、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して、少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項10から17までのいずれか1項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- メタロプロテアーゼIGS5に含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも95%の同一性を有する、請求項10から18までのいずれか1項に記載の化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- メタロプロテアーゼIGS5に含まれるか、あるいはそれ自体であるアミノ酸配列が、配列番号2、配列番号4および配列番号6の群から選択されたアミノ酸配列の一つに対して同一である、請求項19に記載の化合物、またはその製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルの使用。
- 請求項1から20までのいずれか1項に記載の疾病または症状を、併用治療および/または併用予防するための医薬(医薬品組成物)を製造するための、請求項1から20までのいずれか1項に記載の組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す第一化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも1種の付加的な化合物との組合せ物の使用において、この付加的な化合物が、好ましくはACEインヒビター、選択的ECEインヒビター、選択的NEPインヒビター、二重のNEP/ECEインヒビター、およびこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターから選択されている、請求項1から20までのいずれか1項に記載の組み合わされたかまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す第一化合物、その製薬学的に認容性の塩、その溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組み合わされたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組み合わされたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも1種の付加的な化合物との組合せ物の使用。
- 第一化合物が、請求項10から12までのいずれか1項に記載の式Iの構造、好ましくは請求項11に記載の式Iaの構造または請求項12に記載の式Ibの構造を有する、請求項21に記載の、第一化合物と少なくとも1種の付加的な化合物との組合せ物の使用。
- 組合せ物が、同時に効果的であるか、好ましくは相乗効果を示す、請求項21または22に記載の、第一化合物と少なくとも1種の付加的な化合物との組合せ物の使用。
- 請求項1から20までのいずれか1項に記載の疾病または症状の併用治療および/または併用予防のための、請求項1から20までのいずれか1項に記載の、組合せまたは同時のNEP/IGS5抑制活性を示す第一化合物、その製薬学的に認容性の塩またはその溶媒和物またはその生物的不安定性エステルと、組合されたNEP/IGS5インヒビター以外の他の別個および/または組合されたメタロプロテアーゼインヒビターの群から選択された少なくとも1種の付加的な化合物とを、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量で含有する医薬品組成物において、この付加的な化合物が、好ましくは、ACEインヒビター、選択的ECEインヒビター、選択的NEPインヒビター、二重のNEP/ECEインヒビター、およびこれらのメタロプロテアーゼの混合インヒビターの群から選択されている、医薬品組成物。
- 第一化合物が、請求項10から12までのいずれか1項に記載の式Iの構造、好ましくは請求項11に記載の式Iaまたは請求項12に記載の式Ibの構造を有する、第一化合物と少なくとも1種の付加的な化合物とを、同時に効果的な、好ましくは相乗効果を示す量で含有する、請求項24に記載の医薬品組成物。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008524159A (ja) * | 2004-12-15 | 2008-07-10 | ゾルファイ ファーマスーティカルズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | NEP阻害剤、内因性エンドセリン産生系の阻害剤およびHMGCoAレダクターゼ阻害剤を含有する医薬組成物 |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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AU784327B2 (en) | 1999-11-19 | 2006-03-09 | Abbvie B.V. | Human enzymes of the metalloprotease family |
WO2004010106A2 (en) * | 2002-07-24 | 2004-01-29 | Ptc Therapeutics, Inc. | METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLEDULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY |
US7427611B2 (en) | 2003-09-26 | 2008-09-23 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl)-cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
US7452875B2 (en) | 2003-09-26 | 2008-11-18 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
US7262184B2 (en) | 2003-09-26 | 2007-08-28 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Amidomethyl-substituted 1-(carboxyalkyl) cyclopentyl-carbonylamino-benzazepine-N-acetic acid compounds, process and intermediate products for their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
WO2005067937A1 (en) * | 2004-01-12 | 2005-07-28 | Solvay Pharmaceuticals B.V. | Neutral endopeptidase (nep) and human soluble endopeptidase (hsep) inhibitors for prophylaxis and treatment of neurodegenerative disorders |
US7232813B2 (en) | 2004-01-12 | 2007-06-19 | Solvay Pharmaceuticals B.V. | Neutral endopeptidase (NEP) and human soluble endopeptidase (hSEP) inhibitors for prophylaxis and treatment of neuro-degenerative disorders |
US20050267124A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Pharmaceutical compositions comprising NEP-inhibitors, inhibitors of the endogenous producing system and PDEV inhibiitors |
EP1753432A1 (en) * | 2004-05-14 | 2007-02-21 | Solvay Pharmaceuticals GmbH | Medicaments containing dually acting inhibitors of neutral endopeptidase and of human soluble endopeptidase for the treatment of sexual dysfunction |
US20050267072A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Pharmaceutical compositions containing dually acting inhibitors of neutral endopeptidase for the treatment of sexual dysfunction |
US20050288272A1 (en) * | 2004-06-23 | 2005-12-29 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Pharmaceutical compositions comprising NEP-inhibitors, inhibitors of the endogenous endothelin producing system and AT1 receptor antagonists |
EP1776095A1 (en) * | 2004-06-23 | 2007-04-25 | Solvay Pharmaceuticals GmbH | Pharmaceutical compositions comprising nep-inhibitors, inhibitors of the endogenous endothelin producing system and at1-receptor antagonists |
BRPI0608184A2 (pt) * | 2005-02-18 | 2009-11-17 | Solvay Pharm Gmbh | composições farmacêuticas compreendendo inibidores da nep, inibidores da nep, inibidores do sistema de produção de endotelina endógena e diuréticos |
US20060205625A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-09-14 | Solvay Pharmaceuticals Gmbh | Pharmaceutical compositions comprising NEP-inhibitors, inhibitors of the endogenous endothelin producing system and diuretics |
KR101970505B1 (ko) * | 2012-12-26 | 2019-04-19 | (주)아모레퍼시픽 | 멜라닌 형성 억제제를 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물 |
MD3259253T2 (ro) | 2015-02-16 | 2020-06-30 | Univ Queensland | Sulfoniluree și compuși înrudiți și utilizări ale acestora |
TWI752907B (zh) * | 2015-05-08 | 2022-01-21 | 美商拜奧馬林製藥公司 | 用於治療cln2疾病之tpp1調配物及方法 |
TWI789401B (zh) | 2017-07-07 | 2023-01-11 | 愛爾蘭商英弗雷佐姆有限公司 | 新穎化合物 |
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US11926600B2 (en) | 2017-08-15 | 2024-03-12 | Inflazome Limited | Sulfonylureas and sulfonylthioureas as NLRP3 inhibitors |
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UY37847A (es) | 2017-08-15 | 2019-03-29 | Inflazome Ltd | Sulfonilureas y sulfoniltioureas útiles como inhibidores de nlrp3 |
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---|---|---|---|---|
KR880007441A (ko) * | 1986-12-11 | 1988-08-27 | 알렌 제이.스피겔 | 스피로-치환된 글루타르아미드 이뇨제 |
CA2096418C (en) * | 1990-11-26 | 2001-11-20 | Philip J. Barr | Expression of pace in host cells and methods of use thereof |
DE19510566A1 (de) * | 1995-03-23 | 1996-09-26 | Kali Chemie Pharma Gmbh | Benzazepin-, Benzoxazepin- und Benzothiazepin-N-essigsäurederivate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
DE19638020A1 (de) * | 1996-09-18 | 1998-03-19 | Solvay Pharm Gmbh | Die gastrointestinale Durchblutung fördernde Arzneimittel |
DE19750002A1 (de) * | 1997-11-12 | 1999-05-20 | Solvay Pharm Gmbh | Phosphonsäure-substituierte Benzazepinon-N-essigsäurederivate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
US20020086405A1 (en) * | 2000-09-25 | 2002-07-04 | Inmaculada Silos-Santiago | 56638, a novel human neprilysin protease and uses thereof |
DE19906310A1 (de) * | 1999-02-16 | 2000-08-17 | Solvay Pharm Gmbh | Arzneimittel zur Behandlung von Bluthochdruck |
DE19932555A1 (de) * | 1999-07-13 | 2001-01-18 | Solvay Pharm Gmbh | Arzneimittel mit protektiver Wirkung gegen oxidativ-toxische und insbesondere gegen kardiotoxische Substanzen |
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US6991916B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-01-31 | Pfizer Inc. | Compounds for the treatment of sexual dysfunction |
GB0017387D0 (en) * | 2000-07-14 | 2000-08-30 | Pfizer Ltd | Novel enzyme |
US20030119714A1 (en) * | 2000-12-15 | 2003-06-26 | Naylor Alasdair Mark | Treatment of male sexual dysfunction |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008524159A (ja) * | 2004-12-15 | 2008-07-10 | ゾルファイ ファーマスーティカルズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | NEP阻害剤、内因性エンドセリン産生系の阻害剤およびHMGCoAレダクターゼ阻害剤を含有する医薬組成物 |
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