JP2002541776A - ヒトｐｈｅｘの可溶性形態の組成物、方法及び合成試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、PHEXの可溶性形態に関しする。PHEXはII型の内在性膜糖タンパク質である。この酵素は、X染色体上のエンドペプチダーゼに対する相同性を有する、リン酸塩調節遺伝子の遺伝子産物である。PHEXの可溶性形態を製造するために、トランスメンブランアンカードメインはシグナルペプチドコーディング配列をコードするように修飾された。したがって、可溶性PHEXは活性エクトドメインを含んでなる。また、PHEXの不活性突然変異体は本発明の目的である。PHEXの可溶性および不活性の両方の突然変異は、PHEXに対するリガンドをスクリーニングするために使用することができる。これらのリガンドは、また、PHEXのインヒビターまたは基質として使用することができる。PHEXがリン酸塩尿性であるとき、そのインヒビターはリン酸塩尿症および／または低リン酸塩血症を治療するために使用されるであろう。反対に、PHEXの基質またはPHEXそれ自体は高リン酸塩血症を治療するために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景 PHEX遺伝子（従来名PEX；X染色体上の候補の遺伝子としてエンドペプチダーゼ
に対する相同性を有するリン酸調節遺伝子）は、位置クローニングアプローチに
より、X染色体性低リン酸塩血症（XLH）の候補の遺伝子として同定された（Fran
cis他、1995）。成長遅延、くる病性および骨軟化性骨疾患、リン酸塩再吸収お
よびビタミンD代謝の腎欠陥により特徴づけられるリン酸塩ホメオスタシスのメ
ンデル疾患である（RasmussenおよびTenenhouse、1995）。PHEX遺伝子の配列の
公開により入手可能となった情報、および当業者にとって明らかな標準的技術を
使用して、いくつかのグループはヒトおよびマウスPHEX／Phex cDNAをクローニ
ングし、配列決定した（Du他、1996；Lipman他、1998；Grieff他、1997；Beck他
、1997；GuoおよびQuarles、1997；Strom他、1997）（PHEX／Phexは、それぞれ
、ヒトおよびマウスの遺伝子である）。

【０００２】 アミノ酸配列を比較すると、候補の遺伝子の部分的配列において以前に観測さ
れたように、PHEX／Phexタンパク質と中性エンドペプチダーゼファミリーのメン
バーとの間の相同性が証明された（Francis他、1995）。中性エンドペプチダー
ゼファミリーのペプチダーゼは亜鉛を含有するII型内在性膜糖タンパク質であり
、これらのタンパク質は比較的短い細胞質N末端領域、単一のトランスメンブラ
ンドメイン、および酵素の活性部位を含む、長い細胞質外ドメインを有する（De
vault他、1987）。

【０００３】 PHEX機能の喪失がXLHにおいて観察される骨および腎臓の異常を誘発するメカ
ニズムは明らかではない。腎臓におけるPHEX／Phex mRNAの存在を示唆するデー
タは存在しない（Du他、1996；Beck他、1997；Grieff他、1997）。Hypマウスに
おける腎臓のリン酸塩外分泌の増加は、リン酸塩輸送因子のダウンレギュレーシ
ョンのためであり、これはネフロンからのリン酸塩の再吸収のために必要である
（Tenenhouse 1998）。

【０００４】 1,25（OH）₂D3（カルシトリオール）の血清濃度は、Hypマウスにおいて、正常
の同腹子と同一であることが見出された（Meyer 1980）。しかしながら、Hyp腎
臓は、活性が減少した代謝物質である1,24,25（OH）₃D3へのビタミンD代謝物質
の加速された分解を示す（Tenenhouse 1988）。リン酸塩に富んだ食事の存在下
に、Hypマウスは血清1,25（OH）₂D3の増加およびC−24酸化産物の低下を経験す
るが、正常マウスはこのような変化を経験しない（Tenenhouse 1980）。要約す
ると、HypマウスにおけるビタミンD代謝における腎臓障害はリン酸塩障害に対し
て二次的ように見える。

【０００５】 PHEX／Phex mRNAは、骨においてノザンブロットハイブリダイゼーションによ
り、他の成体および胎児の組織、例えば、肺、肝臓、筋肉、および卵においてRT
−PCRおよびRNアーゼタンパク質アッセイにより検出された（Du他、1996；Beck
他、1997）。胚および新生児のマウスの切片について実施されたin situハイブ
リダイゼーションは、骨芽細胞および象牙芽細胞におけるPhex mRNAの存在を示
した（Ruchon他、1998）。Phex遺伝子の発現は胚発生の第15日に検出可能であっ
た。これは骨における細胞内基質の沈着の開始と一致する。

【０００６】 そのうえ、3日齢および成体のマウスの頭蓋冠および歯からの全RNAのノザン分
析により、成体の骨および非成長歯においてPhex転写物の存在量は減少すること
が示された。ヒトPHEXに対して発生させたモノクローナル抗体を使用するウェス
タンブロッティングにより、新生児および成体の骨におけるPhexタンパク質の存
在を研究したとき、この結果は確証された。2月齢のマウスについての免疫組織
学的的研究は、骨における成熟骨芽細胞および骨細胞および歯における象牙芽細
胞の独占的標識化を示した。これらの研究を総合すると、PHEX／Phexがこれらの
組織における無機質化の発生および維持において重要な役割を演ずることを示唆
する。

【０００７】 腫瘍形成性骨軟化症（OOM）、すなわち、非常に類似する臨床的適用を有し腫
瘍関連散在性症状の症例についての実験的研究により、骨代謝におけるPHEXの役
割のそれ以上の洞察が提供された。腫瘍産生体液性因子は腎臓の骨軟化症を生ず
るリン酸塩再吸収再吸収およびビタミンD合成を阻害するという、強い証拠が存
在する（Nelson他、1997）。HypおよびGyマウス、ヒトXLのネズミモデルについ
ての実験的研究は、また、体液性因子の掛かり合いを示唆する。両方のマウスモ
デルにおいて、突然変異がPhex遺伝子において同定され、これはまた遺伝子産物
の機能の喪失を生ずるように思われる（Strom他、1997；Beck他、1997）。

【０００８】 PHEXタンパク質と酵素の金属ペプチダーゼファミリーの他のメンバーとの間の
類似性を考慮すると、腎臓の管のリン酸塩再吸収をモジュレートするペプチドホ
ルモンを代謝することが推測された。このような活動は、リン酸塩再吸収ホルモ
ン前駆体のその活性形態へのプロセシングまたは循環するリン酸塩尿性因子の不
活性化を包含するであろう。Hypマウスからの骨芽細胞の固有の異常性の証拠が
存在する（Ecarot他、1992）。

【０００９】 また、欠陥のあるリン酸塩輸送がHypマウスからの骨芽細胞において観察され
た（Rifas他、1994）。こうして、腎臓のリン酸塩再吸収をコントロールするこ
とによって腎臓のレベルにおいて間接的に、そして骨芽細胞または溶骨細胞また
は両方の機能をコントロールするトロフィックペプチド因子を不活性化すること
によって直接的に、PHEXは両方の方法で骨代謝をコントロールすることに関係す
ることがある。

【００１０】 機能化PHEX遺伝子の非存在は低リン酸塩血症に導くので、この酵素を阻害する
ことによって高リン酸塩血症を包含するヒト疾患をコントロールすることができ
るであろう。こうして、PHEXの阻害は血液のリン酸塩濃度を減少させ、ヒトおよ
び動物における高リン酸塩血症に関係する障害の予防および減少を可能とするで
あろう。腎機能の障害によるリンの腎外分泌の減少は、高リン酸塩血症の最も普
通の原因である。

【００１１】 二次的上皮小体機能亢進症（腎性骨形成異常）の特別の症例において、適切な
リン酸塩濃度は、また、内因性カルシトリオール産生の増加および／またはPTH
レベルの低下に導くことによって、患者にとって有益である。したがって、PHEX
の初期のかつ適切な阻害は腎性骨形成異常の重大な結果を緩和し、進行した腎性
骨形成異常の疼痛および運動性の問題なしに、生命・生活の質を改善する。成人
において、高リン酸塩血症は1.67mmol／L（5mg／dL）以上の血清リンの増加とし
て定義される。高リン酸塩血症は多数の原因を有する普通の発見である（Harris
on's 第14版 CD−ROM、McGraw Hill Health Professions、New York、N.
Y.、chapter 356）。

【００１２】 上皮小体機能亢進症または腎性骨形成異常は慢性腎不全の進行した特質から生
ずる。慢性腎不全の主要な原因は、US Medicare患者（65歳を超えた患者）の間
で、糖尿病（43％）、高血圧症（35％）および糸球体腎炎（14％）である。（Ha
rrison's 第14版 CD−ROM、McGraw Hill Health Professions、New York
、N. Y.、chapter 271、Figure 271.1）。

【００１３】 転移性カルシウム沈着のために、高リン酸塩血症は潜在的に危険である。唯一
の概算的指針であるが、70より大きいカルシウム−リンの積［血清Ca（mg／dL）
×血清（mg／dL）］はカルシウム沈着の潜在的脅威である。この疾患を有する患
者は、この疾患を有する患者は、骨および関節の疼痛、骨減少症、奇形、骨折、
筋肉の弱化および余分の骨格カルシウム沈着に悩まされる。 根元的原因に無関係に、この疾患は廃棄物を排除し、カルシトリオール（1,25
（OH）₂D3）を産生し、そしてリン酸塩を外分泌する腎臓の能力の漸進的喪失に
より特徴づけられる。リン酸塩外分泌の増加はPTHの増加とともに達成される。

【００１４】 PTHレベルに対するリン酸塩の直接的作用は十分に記載されている。増加する
濃度のリン酸塩の存在下に、無傷の新鮮な副甲状腺はPTH分泌の増加を示す（Alm
aden、1996）。高いリン酸塩の食事はPTHを増加させるが、血清リン酸塩を正常
に維持する；対照的に、同一食事を与えた副甲状腺摘出したラットはリン酸塩レ
ベルの増加を示した（Borie、1981およびDemeter、1991）。軽度〜中程度の腎不
全を有する患者における結果は、リン酸塩濃度がPTHと相関することを示した（K
ate、1997）。 PHEXの不適切な発現を包含する障害の治療は本発明の主要な目標であるが、そ
の逆は本発明の範囲内である。PHEXの欠乏症を包含する障害を治療するための、
可溶性活性PHEXまたはそれ腸溶性コーティング核酸を含んでなる組成物は、本発
明の目的である。

【００１５】 亜鉛金属ペプチダーゼファミリー（また、Zincinsとして知られている；Hoope
r FEBS Letters 354、1−6、1994参照）は、活性部位における亜鉛原子の存
在により特徴づけられる。この大きいファミリーは、活性部位の構造により区別
することができる、いくつかのサブクラスから成る。1つのこのようなサブファ
ミリーはグルジンシンであり、これらはHEXXHモチーフおよび第3亜鉛リガンドと
してのグルタミン酸により特徴づけられる。このサブファミリーは、サーモリシ
ン、ACE（アンギオテンシン変換酵素）、アミノペプチダーゼおよび中性エンド
ペプチダーゼまたはネプリシン（NEP）ファミリーの酵素を包含する。

【００１６】 NEPそれ自体は、ここでそのファミリーの酵素のプロトタイプとして考えられ
る。これらのペプチダーゼは、広範な配列および構造的類似性を共有する。NEP
に加えて、パブリックドメインにおいて5つの他の酵素が存在する：エンドセリ
ン変換酵素ECE−1、ECE−2、Kell、XCEおよびPHEX（外観については下記の文献
を参照のこと：TurnerおよびTanzawa、1977b）。いくつかのファミリーメンバー
は同一ペプチド基質を切断することができ、そして同一インヒビターは2以上のN
EP様酵素を阻害することができる。

【００１７】 事実、いくつかの化学的実在物はグルジンシンサブファミリーの2以上の酵素
を阻害することができる（Roques B. P. Path Biol 1998、46、3、191−20
0）。したがって、既知のグルジンシンインヒビターをPHEX酵素アッセイにより
アッセイし、PHEXインヒビターとして同定することができる。本発明の方法の1
つは「PHEXインヒビター」の投与である。ここにおいて言及するとき、用語「PH
EXインヒビター」は、PHEXの酵素作用を阻害する化合物を包含する。

【００１８】発明の要約 この目的に向かって、我々はPHEXの組換え形態を産生しかつ細胞画分、使用済
み培地および組織抽出物からの組換え酵素および天然酵素の両方を精製するよう
に設計された種々の試薬およびツールを製造した。我々は全長のヒトPHEXをコー
ドするcDNAを種々の発現ベクターの中にクローニングした。COS−1（サル腎臓）
細胞、CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、およびLLC−PK1（ブタ腎臓）
を包含する種々の細胞系統の中に、トランスフェクションにより、これらのPHEX
コーディングベクターを導入した。永久的細胞系統を確立し、これらの細胞系統
は細胞表面においてPHEXタンパク質を安定に発現することが示された。組換えPH
EXタンパク質に富んだ膜画分を急速に調製する手法が確立された。

【００１９】 PHEXは、N末端に付近に位置する疎水性20アミノ酸配列により定着された、固
有の膜タンパク質である。固有の膜結合タンパク質を膜の脂質環境から遊離させ
るために、洗浄剤を使用することが必要である。これらの洗浄剤は酵素の触媒活
性を妨害することができる。そのうえ、特に濃縮された溶液および／または大量
、例えば、結晶化および高い処理量のスクリーニングアッセイに要求される量、
のタンパク質を必要とする場合、洗浄剤を使用して精製されたタンパク質は、通
常、安定性および溶解性の問題を提示する。完全に活性な酵素の高い収率で製造
および精製することを促進するために、PHEXの可溶性形態を使用して作業するこ
とが好ましい。

【００２０】 エクトドメインの全体から成るが、細胞質ゾルおよび疎水性トランスメンブラ
ンドメインを欠如するNEP（Lemay他、1989）およびECE（Korth他、1997）の可溶
性形態は構築され、天然の膜結合相同体の酵素活性に類似する活性を有すること
が示された。こうして、タンパク質のシグナルペプチド／トランスメンブラン領
域を修飾することによって、組換えPHEXの可溶性形態が構築された。可溶性PHEX
は、そのPHEXエクトドメインまたは触媒部分を含んでなる；PHEXのこの可溶性形
態をsecPHEXと呼ぶ。secPHEXをコードする発現ベクターをLLC−PK1細胞の中にト
ランスフェクトし、そして安定な基準でキメラPHEXタンパク質を発現する永久的
細胞系統が確立された。

【００２１】 この細胞系統の使用済み培地をウェスタンブロットで分析すると、それはsecP
HEXを高いレベルで含有ことが示された。イムノアフィニティーまたはイオン交
換クロマトグラフィーにより、このsecPHEXを精製した。イオン交換クロマトグ
ラフィーは、使用済み培地からsecPHEXを精製するために最も効率よいことが見
出された。基質としてPTHrP107−139を使用する酵素アッセイにおいて、精製さ
れたsecPHEXは活性であることが示された。そのうえ、このsecPHEXの入手可能性
により、抗PHEX抗体を産生するための抗原としてsecPHEXを使用することができ
る。

【００２２】 大腸菌（E. coli）において産生されたPHEX由来組換え融合タンパク質でマウ
スを免疫化することによって、PHEXに対して特異的なモノクローナル抗体を発生
させた。種々のイムノアフィニティー手順により組換えPHEXを精製するために、
これらのモノクローナル抗体を使用した。また、免疫組織学的技術およびウェス
タンブロッティングにより、骨におけるPHEXの発現を特性決定するために、PHEX
特異的抗体は有効であることが証明された。

【００２３】 本発明は、また、ヒトおよび動物におけるPHEX関係障害を治療する組成物に関
する。特に、本発明は、その最も頻繁な発現を包含する、高リン酸塩血症、二次
的上皮小体機能亢進症および腎性骨形成異常を治療するための組成物を提供する
。組成物は抗PHEX分子を含んでなり、この分子は、PHEX活性を阻害することによ
って、リン酸塩外分泌の増加ならびに腸リン酸塩吸収の減少を誘発し、こうして
高リン酸塩血症およびその最も頻繁な発現、二次的上皮小体機能亢進症および腎
性骨形成異常を減少および／または好ましくは予防する。

【００２４】 例えば、このような治療を使用して、PTH血清濃度を増加することと反対に、P
HEX活性を犠牲にして、軽度の腎不全を有する患者において正常リン酸塩血が維
持される。PHEX突然変異から生ずる表現型はPHEX阻害が毒性でありうることを示
唆し、生理学の注意深い研究は他のことを示唆する。リン酸塩外分泌の優勢の特
質は、所望の結果を達成するために、わずかに部分的阻害を必要とすることを示
唆する。ヘテロ接合体の雌における観察は、50％より非常に少ない阻害が要求さ
れることを示唆する。この低いレベルの阻害において、遺伝子投与依存的または
リン酸塩依存的であるXLHの他の特徴は十分でないことがある。

【００２５】 したがって、本発明の目的は、PHEX酵素または突然変異体、または抗PHEXリガ
ンドを含んでなる組成物を提供することである。これらの組成物は、ヒトおよび
動物においてPHEX関係障害の治療に特に有効である。それ以上の目的は下記のも
のを提供することである：（1）試料中のPHEXの存在または量を検出する診断キ
ット；（2）試料中のPHEXの存在または量を検出する方法；（3）PHEXまたはその
突然変異体を精製する装置；（4）PHEXリガンドをスクリーニングする装置；（5
）PHEXリガンドを得る方法；および（6）PHEXおよびPHEX基質を包含する酵素ア
ッセイ。

【００２６】本発明の特定の態様の説明 この説明の中で使用する用語を明瞭にかつ終始一貫して理解できるように、下
にいくつかの定義を提供する。特記しない限り、本明細書において使用する科学
的および技術的用語および専門用語は、本発明が関係する当業者により普通に理
解されるのと同一の意味を有する。

【００２７】 本明細書において使用するとき、表示「変異型」は、核酸またはアミノ酸配列
であるかどうかの配列の関係において、もとの配列の生物学的活性に実質的に類
似する生物学的活性（機能的または構造的）を保持する分子を意味する。この変
異型または同等物は天然の種内または種間の変異型であることができるか、ある
いは合成的に製造することができる。このような変異型は、タンパク質の生物学
的活性が保存されるかぎり、1またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付
加を有するアミノ酸配列を包含する。

【００２８】 配列の生物学的活性が一般に維持されるかぎり、これは1またはそれ以上のヌ
クレオチドの置換、欠失または付加を有することができる、核酸配列の誘導体に
適用される。タンパク質配列に関すると、置換するアミノ酸は置換されたアミノ
酸のそれに類似する化学物理学的特性を一般に有する。同様な化学物理学的特性
は、電荷、嵩、疎水性、ヒドロパシーおよびその他を包含する。用語「変異型」
は、本発明の主題の「フラグメント」、「セグメント」、「機能的誘導体」、「
アナローグ」または「化学的誘導体」を包含することを意図する。

【００２９】 用語「疎水性アミノ酸残基」は、下記の基から選択されるアミノ酸を意味する
ことを意図する：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチ
オニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはそれらの変異型（A. L. Le
hninger、Principles of Biochemistry（Worth Publishers，Inc.、1982）、
p. 101）。本発明の関係において、脂肪族アミノ酸は好ましい。 表現「抗PHEX」分子は、「アンチセンス核酸分子」、「抗体」、「インヒビタ
ー」または「アンタゴニスト」（すなわち、PHEX活性を障害することができる分
子）のような分子を意味することを意図する。

【００３０】 本発明は、また、例えば、本発明の核酸配列またはタンパク質の発現を減少ま
たは阻害するために使用することができる、アンチセンス核酸分子を提供する。
本発明によるアンチセンス核酸分子は、そのターゲッテッド核酸配列（DNAまた
はRNA）の一部分と安定な二重らせんまたはトリプレックスを形成することがで
きる分子を意味する。アンチセンス核酸分子の使用およびこのような分子の設計
および修飾はこの分野においてよく知られており、例えば、WO 96／32966、WO
96／11266、WO 94／15646、WO 93／08845および米国特許第5,593,974号に記
載されている。

【００３１】 本発明によるアンチセンス核酸分子は、よく知られている方法に従い核酸配列
から誘導し、修飾することができる。例えば、いくつかのアンチセンス分子は、
普通にこの分野において知られているように、分解に対していっそう耐性とし、
それらのターゲッテッド配列に対するそれらのアフィニティーを増加し、選択し
た細胞型または細胞区画へのそれらの輸送に影響を与え、および／またはヌクレ
オチドアナローグの使用および／またはそれらの選択した化学的フラグメントの
置換により、それらの脂質溶解度を増強するように、設計することができる。

【００３２】 一般に、抗体（モノクローナル抗体およびハイブリドーマを包含する）を製造
する技術および抗体を使用して抗原を検出する技術はこの分野においてよく知ら
れている（Campbell、1984、″Monoclonal Antibody Technology：Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology″、Elsevier Sci
ence Publishers、オランダ国アムステルダム）、およびHarlow他、Antibody−
A Laboratory Manual、CSH Laboratories）。本発明は、また、それらのそれ
ぞれの相互作用ドメインおよび／またはそれらに対する特異性を阻害または中和
する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはそれらのヒト化バージ
ョン、キメラ抗体およびその他を提供する。

【００３３】 普通に知られているように、「突然変異」は、娘細胞に伝達することができる
、遺伝物質における検出可能な変化である。よく知られているように、突然変異
は、例えば、1またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドの検出可能な変化で
あることができる。例えば、ヌクレオチドを付加し、欠失し、置換し、逆方向に
、または新しい位置に輸送することができる。自発的突然変異および実験的に誘
導された突然変異が存在する。核酸分子の突然変異の結果は突然変異体核酸分子
である。突然変異体ポリペプチドをこの突然変異体核酸分子からコードすること
ができる。突然変異は影響を受けない突然変異体、陰性または陽性に部分的に影
響を受けた突然変異体、または不活性突然変異体を生ずることができる。本発明
の態様において、PHEXに結合する特定の能力を有するが、不活性触媒部位を有す
る突然変異体が得られた。

【００３４】 本明細書において使用するとき、用語「精製された」は、細胞成分から分離さ
れた分子を意味する。こうして、例えば、「精製されたタンパク質」を自然にお
いて見出されないレベルに精製することができる。「実質的に純粋な」分子は、
大部分の他の細胞成分を欠如する分子である。

【００３５】 本明細書において使用するとき、用語「分子」または「リガンド」は、天然、
合成または半合成の分子または化合物を意味するために互換的にかつ広い意味で
使用される。したがって、用語「分子」は、例えば、化学物質、高分子、微小分
子、細胞または組織の抽出物（植物または動物からの）およびその他を意味する
。分子の非限定的例は、核酸分子、ペプチド、抗体、炭水化物または薬剤を包含
する。これらの因子は、ランダムスクリーニング、合理的選択を包含する種々の
手段により、そして、例えば、タンパク質またはリガンドのモデル化法、例えば
、コンピューターモデル化法を使用する合理的設計により、選択し、スクリーニ
ングすることができる。

【００３６】 用語「合理的的に選択する」または「合理的に設計する」は、本発明の相互作
用するドメインの立体配置に基づいて選択された化合物を定めことを意味する。
当業者は理解するように、天然に存在しない修飾を有する高分子は、また、用語
「分子」の範囲内に入る。「高分子」と「微小分子」との間の区別は大きさに基
づいてなされる。

【００３７】 例えば、それぞれ、約100以下のヌクレオチドまたはアミノ酸のオリゴヌクレ
オチドおよびペプチドは微小分子と考えられるが、遺伝子、完全なcDNAおよびタ
ンパク質は、それらのサイズが大きいために、一般に高分子と分類されるであろ
う。本発明の技術に従い同定された分子は、細胞および／または組織の生理学ま
たは恒常性がPHEX遺伝子産物の特質またはレベルにおける欠陥により危うくされ
る疾患または症状において、療法上の価値を有する。それらは、また、同一の疾
患または症状において診断上の価値を有することができる。

【００３８】 方法モノクローナル抗体の製造 PHEXアミノ酸配列のアミノ酸121〜294（第2図において下線が引かれているセ
グメント）に対応するcDNAを使用して、大腸菌（E. coli）中でGST−融合タン
パク質を構築した。グルタチオン−セファローズカラム上のアフィニティークロ
マトグラフィーにより、この融合タンパク質を大腸菌（E. coli）抽出物から精
製した。トロンビン切断後、GST融合タンパク質のPHEX部分をポリアクリルアミ
ドゲルからの電気溶離によりさらに精製した。この物質を使用して4匹のマウス
を免疫化した（約50μgのPHEX_121-294の5回の注射）。免疫化スケジュール後、
血液を各マウスから収集し、大腸菌（E. coli）抽出物で被覆したマイクロタイ
タープレートを使用するELISAにより、マウス血清中の抗体の存在を評価した。

【００３９】 また、PHEX発現ベクターでトランスフェクトしたLLC−PK1細胞の抽出物をウェ
スタンブロッティングすることによって、マウス血清をまたPHEXの存在について
試験した。4匹のマウスのうちで、3匹はELISAおよびウェスタンブロットの両方
においてすぐれた結果を示した。PHEX特異的抗体の高い力価について選択した1
匹のマウス（ELISAにより測定して）を殺し、その脾細胞を収集し、骨髄腫細胞
（系統）との融合により永久分裂能化した。HAT選択培地中で増殖する能力につ
いて、ハイブリドーマ細胞を選択し、数ラウンドの限界希釈によりクローニング
した。

【００４０】トランスフェクトした細胞におけるヒトPHEXの発現 以前に記載されているように（Beck他、1997）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
により、全長のヒトPHEXをコードするcDNAを得た。このcDNAをpCR2.1（Invitrog
en）の中にクローニングすることによって、プラスミドpCR2.1−PHEX−FLBを発
生させた。全PHEXコーディング配列を含有する制限フラグメント（SpeI−EcoRV
）を消化し、平滑末端とし、哺乳動物の発現ベクター（pCDNA3／RSV）の中にサ
ブクローニングした。生ずるプラスミド（pCDNA3／RSV−PHEX−FLB）は、ラウス
肉腫ウイルス（RSV）プロモーターの制御下に全PHEX cDNAを含有した。

【００４１】 次いでこの組換えベクターをトランスフェクションによりCOS−1細胞中で一時
的に発現させた。5％CO₂雰囲気下に5％のCOSMIC（Hiclone）、100U／mlのペニシ
リン、および100μg／mlのストレプトマイシンを含有するダルベッコ変性イーグ
ル培地（DMEM）中でCOS−1細胞を37℃において成長させた。リン酸カルシウム−
DNA共沈手順を使用して、COS−1細胞をトランスフェクトした。トランスフェク
ションの次の日に、血清を含有する培地を、2.5μg／mlのインスリン、17.5μg
／mlのトランスフェリン、2μg／mlのエタノールアミン、100μg／mlの大豆トリ
プシンインヒビターおよび10μg／mlのアプロチニンを補充したDMEMから成る合
成培地と交換した。最後に、酪酸ナトリウムを合成培地に10mMの濃度に添加して
、RSVプロモーターを担持するプラスミドの発現を増強した。48時間後、細胞を
収集し、膜をKorth他（1977）の手順に従い調製した。

【００４２】 プラスミドpCDNA3／RSV−PHEX−FLBを、また、LLC−PK1細胞中でCaPO₄沈降法
によりトランスフェクトした。400μg／mlのG−418を培地に添加することによっ
て、トランスフェクトされた細胞を選択した。アール塩（Eale's salts）、2mM
のL−グルタミン、Hepesおよび5％の胎仔ウシ血清（FBS）、50単位／mlのペニシ
リン、および50μg／mlのストレプトマイシンを補充した重炭酸塩緩衝液を含む2
0mlの培地199を含有する150mmの皿中でG−418耐性細胞を成長させた。細胞をほ
ぼ1週間コンフルエンスまで成長させ、ゴムのポリスマンでこすりことによって
収集した。

【００４３】組換えPHEXの可溶性形態の構築および発現 組換えヒトPHEXの可溶性形態を得るために、分泌したタンパク質（プロオピオ
メラノコルチンまたはPOMC）のシグナル配列をコードするcDNAをヒトPHEXのエク
トドメインのcDNA配列にインフレームで融合することを我々は最初に試みた（第
1図、パネルA）。この戦略は、このペプチダーゼファミリーの他のメンバー、す
なわち、NEPおよびECEについて首尾よく使用され（Lemay他、1989；Korth他、19
97）は、トランスフェクトされた細胞の粗い内質の中に捕捉されたままである、
ミスフォルドPHEXタンパク質を産生した。結局、PHEXのN末端の疎水性膜アンカ
ー中の選択したアミノ酸を置換して、それを切断可能なシグナル配列に変換させ
ることから成る別の戦略を開発した。

【００４４】 切断可能なシグナル配列への膜アンカーのトランスフォーメーションはpCDNA3
／RSV／PHEX−FLBプラスミド上で実施した。センスプライマーとしてオリゴヌク
レオチド＃5136、5'CTGACAGTGATCGCTCAACAAACAACCAGTCAAGGTCTCTTAAGTCTCCAAG3'
およびアンチセンスプライマーとしてオリゴヌクレオチド＃5134、5'GGTTGTTTGT
TGAGCGATCACTGTCAGGACAAACACGACCAGGGCAATTCG3'を使用するポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）により、部位特異的突然変異（9コドン）および欠失（4コドン）を導
入した（第1図、パネルB）。生ずるプラスミド（pCDNA3／RSV／PHEX−MutEと表
示する）はPHEXの分泌された形態（secPHEX）をコードした。

【００４５】 次いで、前述したトランスフェクションにより、組換えベクターをCOS−1細胞
中で発現させた。16時間インキュベートした後、培地を回収し、セントリプレプ
（Centriprep）カートリッジ（Amicon）を使用する限外濾過（分子量カットオフ
＝30kDa）により濃縮した。LLC−PK₁細胞においてsecPHEXの安定な発現を誘導す
るために、CaPO₄沈降法によりプラスミドpCDNA3／RSV／PHEX−MutEをLLC−PK₁細
胞中でトランスフェクトした。400μg／mlのG−418を培地に添加することによっ
て、トランスフェクトした細胞を選択した。アール塩、2mMのL−グルタミン、He
pesおよび5％の胎仔ウシ血清（FBS）、100μg／mlのG−418、50単位／mlのペニ
シリン、および50μg／mlのストレプトマイシンを補充した重炭酸塩緩衝液を含
む20mlの培地199を含有する150mmの皿中でG−418耐性細胞を成長させた。細胞を
ほぼ1週間コンフルエンスまで成長させた。

【００４６】 secPHEXを産生するために、2.5μg／mlのインスリン、17.5μg／mlのトランス
フェリン、2μg／mlのエタノールアミン、100μg／mlの大豆トリプシンインヒビ
ターおよび10μg／mlのアプロチニンを補充した199培地から成る合成培地中で、
コンフルエント細胞を4日間インキュベートした。最後に、酪酸ナトリウムを合
成培地に10mMの濃度に添加して、RSVプロモーターの制御下にある、secPHEX遺伝
子の発現を増強した。4日後、培地を回収し、遠心し、サトコン・マイクロ・ユ
ニット（Sartocon Micro Unit）（Sartorius）を使用する交差流濾過（分子量
カットオフ＝30kDa）により濃縮した。典型的には、secPHEXトランスフェクテッ
ドLLC−PK1細胞からの600mlの粗製使用済み培地を30mlに濃縮した後、精製のた
めにイオン交換カラム上に負荷した。

【００４７】 イムノブロッティングによりsecPHEXを特性決定した。簡単に述べると、濃縮
した培地からのタンパク質を7.5％のSDS−PAGE上で分割し、0.45μmのニトロセ
ルロース膜上に移した。5％（w／v）のインスタント脱脂粉乳（Carnation）を補
充したTTBS（0.05％のTween−20を含有するTris緩衝化生理食塩水）中で、膜を1
時間インキュベートした。膜をTTBSで急速に洗浄し、1％（w／v）のBSAを補充し
たTTBS中の抗（ヒトPHEX）モノクローナル抗体（13B12）の1：200希釈物とイン
キュベートした。膜を洗浄し、化学発光試薬（NEN）を使用してプロセシングし
た。 他のシグナルペプチドコーディング配列は細胞外空間におけるPHEXの分泌を適
切に支配する限りにおいて、それらを使用することができる（使用する宿主細胞
、組織または生物に依存して培地または分泌流体）。

【００４８】免疫沈降アッセイ まずプロテインA−セファローズビーズ（Pharmacia）をウサギ抗マウスIgGで
飽和し、次いでハイブリドーマ上清からのマウス免疫グロブリンで飽和すること
によって、免疫沈降アッセイを実行した。PBS中の洗浄した後、免疫沈降（IPP）
緩衝液（20mMのTris−HCl、pH7.4、100mMのNaCl、2％のトリトンX−100、0.2％
のSDS、および0.2％のBSA）中で希釈したsecPHEX（40μgの全タンパク質）を産
生するLLC−PK1細胞の使用済み培地のアリコート中で、これらのビーズをインキ
ュベートした。ビーズを遠心によりペレット化し、IPP中で2回洗浄し、PBS中で1
回洗浄し、イムノブロット分析前に、電気泳動試料中でプロテインA−セファロ
ーズに結合したタンパク質を非共有結合方式で沸騰させることによって、イムノ
アフィニティー支持体に結合したsecPHEXの存在をアッセイした。

【００４９】可溶性形態のPHEXの精製 1） イオン交換クロマトグラフィーによるsecPHEXの精製 50mMのNaClを含有する50mMのリン酸ナトリウムpH6.6と前以て平衡化したSP−
セファローズカチオン交換カラム（Pharmacia）上に、濃縮した培地を負荷した
。カラムを10カラム体積の同一緩衝液で洗浄し、secPHEXを50mM〜1MのNaClの勾
配で溶離した。前述したように、画分をSDS−PAGEおよびイムノブロッティング
により分析し、secPHEXを含有する画分を銀染色により可視化した。

【００５０】 2） イムノアフィニティークロマトグラフィーによるsecPHEXの精製 抗体4C5aをアフィゲル（Affigel）（BioRad）に結合することによって、イム
ノアフィニティーカラムを構築した。免疫グロブリンを4C5腹水からプロテインG
カラム（Amersham−Pharmacia）上で精製し、供給業者（BioRad）が推奨するよ
うにアフィゲルマトリックスにカップリングさせた。2mgのIgGを4mlのカラム中
のマトリックスに結合させた。カラムを供給業者が推奨するように洗浄し、20mM
のTris−HCl、pH8.0中で平衡化させた。15mlの濃縮したLLC−PK1培地のアリコー
トをカラム上に一夜循環させた。カラムを5体積の平衡化緩衝液で洗浄した。タ
ンパク質を0.1MのトリエチルアミンpH11.5で溶離し、直ちに0.2体積の1Mのリン
酸塩緩衝液pH6.5の添加により中和した。画分中のタンパク質をSDS−PAGEおよび
イムノブロッティングにより分析した。

【００５１】PHEXを含有する刷子縁膜の調製 LLC−PK1細胞系統は培養において極性化単層を形成する。以前に記載されたよ
うに（Blais他、1987）、刷子縁（頂端）膜BBMをLLC−PK1細胞ホモジネートから
精製した。簡単に述べると、細胞膜を超音波処理により崩壊させた。4℃におい
て一定速度で撹拌しながらCaCl₂を13mMの最終濃度に添加することによって、非
頂端膜を沈降させた。950×gにおいて10分間、次いで35,000×gにおいて30分間
順次に遠心することによって、BBMを分画した。BBMを含有する最後ペレットを50
mMのTris−HCl、pH7.5で2回洗浄し、同一緩衝液の中に再懸濁させた。BBM中のse
cPHEXの存在をイムノブロッティングにより確認した。

【００５２】PHEXの活性についてのアッセイ 150mMのNaClおよび基質として10μgのPTHrP107−139を含有する、200μlの体
積の50mMのMES（2−（N−モルホリノエタンスルホン酸、pH6.5）中で、2μgのタ
ンパク質を含有する精製したPHEXのアリコートを37℃において15分間インキュベ
ートした。インキュベーション期間後、トリフルオロ酢酸を0.1％の最終濃度に
添加することによって、加水分解を停止した。214nmにセットしたUV検出器を使
用してC18μボンダパック（Bondapak）分析カラム（Waters）上の逆相高性能液
体クロマトグラフィー（RP−HPLC）により、ペプチド産物を実行した。0.4ml／
分の流速で5％B〜85％Bの線形勾配により45分でペプチドを分割した［移動相A＝
0.1％のトリフルオロ酢酸；移動相B＝80％のアセトニトリル（CH₃CN）、0.1％の
トリフルオロ酢酸］。

【００５３】 結果モノクローナル抗体の産生 限界希釈法により、ELISAアッセイにおいてPHEX_121-294に結合し、ウェスタン
ブロットアッセイ（第3A図）において組換え全長PHEXを認識し、そしてsecPHEX
を免疫沈降させる（第3B図）能力について、ハイブリドーマを試験した。抗体15
D7は免疫沈降、イムノブロッティングおよびまた免疫蛍光実験（結果は示されて
いない）においてすぐれた結果を示した。この抗体をトランスフェクトした細胞
中のPHEXまたはsecPHEXの発現、または組織中のPHEXの発現をモニターするため
に選択した。PHEX特異的抗体を探求するかぎりにおいて、PHEXの他のセグメント
がPHEXに対して特異的である場合、これらのセグメントを抗原として使用するこ
とができる。

【００５４】COS−1細胞中の膜結合組換えPHEXの発現 RSVプロモーターから下流に挿入されたPHEXの全コーディング配列を含有する
発現ベクターで、COS−1細胞をトランスフェクトした。このベクターをpCDNA3／
RSV−PHEX−FLBと呼ぶ（方法参照）。細胞をトランスフェクション後16時間培養
し、膜画分を方法において説明したように調製した。ウェスタンブロットにおい
てモノクローナル抗体15D7を使用して、PHEXの発現をモニターした。第4図にお
いて見られるように、pCDNA3／RSV−PHEX−FLBベクターでトランスフェクトした
細胞の膜画分（レーン2）において、見掛けの分子量105,000に対応する移動性で
移動するバンドが観測された。このバンドは対照細胞の抽出物の中に存在しない
（レーン1）。

【００５５】組換えPHEXの可溶性形態の産生 次に、トランスフェクトした真核細胞からのPHEXの可溶性形態および活性形態
の分泌を促進するために、遺伝子工学技術を使用することができるかどうかを我
々は決定しようとした。明らかなように、この種の酵素は、洗浄剤を使用しない
で培養した細胞のインキュベーション培地から容易に精製することができ、それ
以上の構造の研究およびインヒビターのスクリーニングのための非常に有効であ
る。また、それは注射可能な治療剤としてまたは骨の鉱物化または骨の治癒の速
度を増加するために局所的用途において究極的に使用できるであろう。

【００５６】 PHEXはクラスIIの内在性膜タンパク質である。クラスIIの膜タンパク質は、そ
れらのアミノ末端付近に、粗面内質細網の膜を通してタンパク質を転位させるシ
グナルペプチドとして、そして細胞原形質膜の中にタンパク質を定着させるトラ
ンスメンブランドメインとして作用する、ユニークな疎水性ペプチドを有する。
切断可能なシグナルペプチドを有しかつ追加の膜スパニング疎水性配列（また、
膜透過停止配列と呼ばれる）により膜の中に定着されるクラスI膜タンパク質と
異なり、クラスII膜タンパク質は疎水性トランスメンブランドメインを欠失させ
ることによって可溶性形態に容易に変換することができない。

【００５７】 クラスII膜タンパク質において、定着セグメントはまたシグナルペプチドを除
去し、これによりPER中のタンパク質の転位および細胞表面へのその輸送を妨害
する。理論的には、膜結合クラスIIタンパク質を可溶性形態に変換する2つの異
なるアプローチが存在する：1）タンパク質の細胞外ドメインを異種切断可能な
シグナルペプチドに融合することができる；および2）トランスメンブランドメ
インの変化を導入して、シグナル／アンカーの組合わせを切断可能なシグナルペ
プチドに変換することができる。両方の戦略はNEPの可溶性形態の産生に首尾よ
く使用された（Lemay他、1989；Lemire他、1997）。

【００５８】 この研究において、ヒト酵素の完全なエクトドメインをコードする配列をPOMC
シグナルペプチドとインフレームで融合することによってまずPHEX分泌ベクター
を構築し（第1A図）、これらの配列はRSVプロモーターの制御下にある。PHEX免
疫反応性物質をトランスフェクトした細胞の細胞抽出物において検出できたとい
う事実にかかわらず、発現レベルは低く、酵素は分泌培地の中に見出すことがで
きなかった（結果は示されていない）。細胞関連PHEX免疫反応性物質をエンドグ
ルコシダーゼで消化し、ウェスタンブロットにより分析したとき、それはエンド
H感受性ことが見出され、PERにおいて組換えタンパク質が保持されることが示さ
れた（結果は示されていない）。

【００５９】 ライン2上に示す下線が引かれている配列によりトランスメンブラン領域の一
部分（第1B図中の下線が引かれている配列：配列1）を置換すると、トランスフ
ェクトしたCOS−1細胞から可溶性形態のPHEXが分泌された（結果は示されていな
い）。トランスメンブランとエクトドメインとの間の連結部における配列LFLVを
欠失させることによって、収率はさらに増加した（パネルB：配列3）。第4図（
レーン4）は、トランスフェクトしたCOS−1細胞によりインキュベーション培地
中で分泌された組換えタンパク質の量を補充した。同一ベクターを方法において
記載するようにLLC−PK1細胞においてトランスフェクトされ、そして安定なトラ
ンスフェクタントをそれらのG−418耐性について選択した。

【００６０】 G−418耐性細胞のプールは、ウェスタンブロッティングにより見られるように
、実質的な量のsecPHEX（600μg／L）を分泌することが見出された（結果は示さ
れていない）。secPHEXはエンドHに対して耐性であり、多分それがゴルジ装置を
を通して移行する間に、それが末端糖を獲得したことが示された（結果は示され
ていない）。次いでLLC−PK1細胞の培養物により分泌された酵素をイムノアフィ
ニティーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより精製することができるであ
ろう。

【００６１】イオン交換クロマトグラフィーによりsecPHEXの好ましい精製法 secPHEXトランスフェクテッドLLC−PK1細胞から濃縮した培地をSP−セファロ
ーズカラム上に負荷し、そして方法に記載されているように、タンパク質を溶離
した。溶出液を280nmにおいてモニターすると、1つの主要なタンパク質ピークが
明らかにされ（結果は示されていない）、これはイムノブロッティングによりse
cPHEXを含有することが示された（第5図）。塩化ナトリウムを含有する画分を7.
5％SDS−PAGE上で分析し、銀染色によりゲル中のタンパク質を検出すると、secP
HEXは画分の中に存在するタンパク質の90％より多くを表すことが示された。典
型的には、1.25mgの純粋なsecPHEXが600mlの非濃縮培地から得られた。

【００６２】 secPHEXが使用済み培地から回収されたが、現今、それらの器官がミルク中の
分泌産物としてPHEXを産生するように操作されている、反芻動物のような宿主を
得ることが可能である。組織中で発現可能な組換えベクターは、使用済み培地中
の塩化ナトリウムの産生に導くものに類似する構築物をインサートとして含んで
なる。この構築物に対する修飾は当業者によく知られている（プロモーター、シ
グナルペプチド、およびその他）。PHEXを産生するための組成物および方法の中
に、その組換えベクターを含める。 反対に、PHEXをサイレンスとすることが必要である場合、本発明の組成物およ
び方法の中に抗PHEX分子を含め、それらの投与によりPHEX活性を阻害する。

【００６３】イムノアフィニティーによるsecPHEXの精製 カラムから得られた画分のイムノブロット分析により、secPHEXは保持される
ことが示された。しかしながら、クーマッシーブルー染色により、他のタンパク
質もまた画分の中に存在することが示された。165mlの非濃縮LLC−PK1培地から
得られるsecPHEXの量は3μgのタンパク質として評価された。

【００６４】secPHEXの活性 方法に記載する条件下にsecPHEXで消化したPTHrP107−139をHPLCで分析すると
、secPHEXはこのペプチドを分解することが明らかになった。クロマトグラム上
のPTHrP107−139のピークは、わずかに15分のインキュベーションにより、その
もとの表面の15％に減少した（第6図）。代謝物に対応するピークはクロマトグ
ラム上に出現した。この酵素活性は、0.001MのEDTAおよび0.001MのO−フェナン
トロイン、すなわち、金属ペプチダーゼの2つの一般的インヒビター、により完
全に阻害された。活性はまたアセテート、HEPESおよび4.0〜8.5のpH範囲をカバ
ーするTris緩衝液において観測された。リン酸塩緩衝液は酵素活性を阻害した（
第6図）。

【００６５】 実施例実施例1： 骨中の組換えsecPHEXの天然基質を同定するためのその使用 PHEXを骨芽細胞中で発現させ、そしてその発現は培養した骨芽細胞中で（Beck
他、1997a；Du他、1996a；GuoおよびQuarles、1997a）そして発生の間に（Rucho
n他、2000）細胞外マトリックスの鉱物化に関係づけられる。これらの観察が示
唆するように、骨は関係するPHEX発現部位であり、そしてPHEXの突然変異と異常
な骨芽細胞仲介鉱物化との間に潜在的関係が存在する。

【００６６】 こうして、骨芽細胞仲介鉱物化のプロセスを調節する内因的または外因的因子
を鉱物化するように、PHEXは骨芽細胞において機能することができる。この仮説
の支持において、Hypマウスの培養した骨芽細胞におけるPHEX機能の喪失は、in
vitroにおいて細胞外マトリックスの鉱物化を阻害する1またはそれ以上の因子
の蓄積に関連することを最近の報告は示唆している（Xiao他、1998）。組換え可
溶性PHEXの入手可能性は、1系列の実験、例えば、後述する実験におけるPHEXの1
またはそれ以上の生理学的骨基質の同定を促進する。

【００６７】 Hypマウスの骨を解剖し、結合組織を分離し、筋肉を液体窒素中で凍結し、凍
結乾燥する。次いで骨を破砕して粉末にし、トリフルオロ酢酸（TFA）、ギ酸お
よび1MのNaClを含有する強く酸性の溶液で抽出する。この溶液の組成は、例えば
、すべてのプロテアーゼ活性を不活性化し、大きい分子量のタンパク質の可溶化
を回避するように選択する。次いで酸性抽出物を凍結乾燥し、生理的緩衝液pH約
7.0の中に再懸濁したほぼ100μgの全ペプチドを含有するアリコートを、前述し
たように、イオン交換クロマトグラフィーまたはイムノアフィニティークロマト
グラフィーにより精製した1〜10μgのPHEXで消化する。インキュベーション前に
酸性または熱処理により酵素調製物を不活性化する、対照実験を平行して実施す
る。

【００６８】 次いで試料の中に含有されるペプチドをC18μBondapakカラム上の逆相HPLCに
より分離し、0.1％のTFAおよび可変濃度のアセトニトリル（すなわち、0〜約80
％）を含有する緩衝液を使用する。活性または不活性化PHEXで消化したペプチド
のクロマトグラムを比較する。Hypマウスから採り、不活性化PHEX調製物とイン
キュベートした骨ペプチドの混合物は、PHEX基質を含有するであろう。しかしな
がら、同一混合物を活性PHEXとインキュベートすると、PHEX基質をペプチド代謝
物質に切断することができる。クロマトグラムを比較すると、PHEX基質およびそ
の代謝物質に対応するピークを同定することができる。次いで、このピークを収
集し、質量分析および／または自動化エドマン配列分解により同定する。 また、Hypマウス骨芽細胞の培養物から採ったコンディショニングした培地を
使用する同様な戦略により、PHEX基質の同定を実施することができる。

【００６９】 あるいは、組織（例えば、骨）または血清の粗製抽出物からPHEX基質を精製す
るためのアフィニティー試薬として、クロマトグラフィーの支持体上に固定化し
たPHEXの不活性な可溶性形態を使用することができる。C末端のエクステンショ
ンの付加により、酵素活性を妨害されないで、ネプリシンファミリーからの細胞
表面金属ペプチダーゼを修飾することができる（Howell他、1995；Yang他、1995
）。NEPについて以前に説明されたように（Howell他、1995）、インフレームで
合成オリゴヌクレオチドを融合することによって、ほぼ20〜25アミノ酸残基の追
加のC末端のペプチドにより延長された、PHEXの可溶性形態（ここでsecPHEX−EC
）を構築する。

【００７０】 追加の配列をシステイン残基により終止させて、例えば、活性化チオール−セ
ファローズ4B［アガロース−2−ピリジルジサルファイド）］（Pharmacia、Fine
Chemical AB、Uppsala、Sweden）に対する効率よいカップリングを可能とす
る。例えば、secPHEXの産生に使用するLLC−PK1細胞系を使用して、secPHEX−EC
を産生する。secPHEXの精製について記載した条件に類似する条件を使用して、
イオン交換クロマトグラフィーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィー
により、組換えペプチドを精製する。画分をSDS−PAGEにより分析し、クーマッ
シーブルー染色により純度を確認する。

【００７１】 精製された組換えタンパク質を固相に結合させるために、チオール−セファロ
ーズ樹脂を再水和してほぼ1mlのゲル体積を得る。このゲルを緩衝液A（0.1MのBi
s−Tris、0.5MのNaCl、pH7.0）と平衡化し、一定速度で撹拌しながら4℃におい
てほぼ3mgのsecPHEX−ECと緩衝液A（2〜4ml）中で一夜インキュベートした。次
いでスラリーをまずほぼ1mlの緩衝液B（0.1MのBis−Tris、5mMのDTT、pH7.0）で
洗浄し、次いで緩衝液Aでよく洗浄した。少量のゲル上のフラッドフォード（Bra
dford）アッセイ（BioRad）により、支持体に結合したタンパク質の量を測定す
る。

【００７２】 PHEXインヒビターをスクリーニングするための固相試薬として、固定化secPHE
X−ECを使用する。位置582に触媒のグルタミン酸残基上にそれをバリンに変化す
る突然変異を担持する形態のsecPHEX−ECを結合することによって、この物質の
酵素的に不活性な変異型をまた調製する。NEPのコーディング配列中の同様な突
然変異は、それにもかかわらず、インヒビターおよび基質に対する完全な結合活
性を保持する、触媒的に不活性な酵素を生ずることが示された（Devault他、198
8）。粗製組織抽出物中のPHEXペプチド基質を結合し、精製するために、このよ
うなアフィニティー試薬を使用する。同一アプローチを使用して、存在する場合
、レセプターを見出すことができる。また、インヒビター化合物のスクリーニン
グを実行することができるが、活性PHEXは好ましいことがある。

【００７３】 前述したように調製した組織抽出物を緩衝液、例えば、0.1MのBis−Tris、pH7
.5中で一定速度で撹拌しながら1mlのアフィニティー樹脂と4℃においてインキュ
ベートする。同一結合緩衝液中で洗浄した後、緩衝液のpHを上昇または低下させ
および／またはイオン強度を増加することによって、結合したペプチドをゲルか
ら溶離することができる。多数の他の突然変異をもくろむことができ、その目的
はグルジシンに対して特異的であるグルタミン酸残基の置換または排除を維持す
ることである。例えば、バリンが首尾よく置換アミノ酸として試験されたが、他
のアミノ酸、例えば、疎水性、好ましくは脂肪族、アミノ酸を同等に使用するこ
とができる。

【００７４】実施例II： 酵素アッセイ 例えば、PTHrP107−139の切断部位をスパンする10アミノ酸残基から成るペプ
チドを固相ペプチド合成法により合成し、PHEX基質として使用する。LC−MS器具
で見出されるような、液体試料入口を装備し、分離をインラインまたはオフライ
ンで達成する、質量分析器を使用して、酵素産物をアッセイすることによって、
切断部位を決定する。デカペプチド（10μg）を精製したPHEX（1〜10gの全タン
パク質）の存在下にMES pH6.5中で37℃において60分間インキュベートする。TF
Aを0.1％の最終濃度で添加して反応を停止させる。C18μBondapakカラム（Water
s）を使用して、代謝物質を分析する。例えば、0.1％のトリフルオロ酢酸中の0
〜40％のアセトニトリルの45分の線形勾配で1.0ml／分の速度で、代謝物質を分
割することができる。

【００７５】 214および254nmにおける吸収をモニターすることによって、溶離したペプチド
を検出する。デカペプチドは異なる保持時間で溶離される2つの短いペプチドに
切断される。これらの2つのペプチドに対応するピーク画分を収集し、それらの
分子量を質量分析により測定して切断部位の位置を同定する。いったんPHEX基質
として確認されると、前述の合成ペプチドは、例えば、蛍光基、色素形成基また
は放射性原子を担持するアミノ酸誘導体を組込むように、修飾することができる
。次いで、実施例IIIに記載されているように、組織抽出物中のPHEXをさらに定
量しかつ特性決定するために、これらのペプチドを使用して、高速、感受性、耐
久力の大きい酵素アッセイを構築する。

【００７６】実施例III： クエンチドフルオレセント基質についてのスクリーニング 実施例IIにおいて同定されたペプチドを使用して、PHEXの内部的にクエンチさ
れたフルオレセントペプチド基質を設計し、合成する。小さいペプチドライブラ
リーを一方の極端に蛍光体および他方にクエンチャーを有する、小さいペプチド
ライブラリーを調製する（Meldal、1998）。記載された戦略を使用して基質を同
定することができる（Apletalina他、1998）。各ヘキサペプチドライブラリーに
ついて、1つの位置に1つの残基の同一性は一定に止まるが、残部はランダム化さ
れている（合計6×20＝120の個々のライブラリーについて）。各ライブラリーは
3.2×10⁶の異なる膜から構成されており、そしてヘキサペプチドに沿った一定残
基の位置およびその同一性の両方により同定される。

【００７７】 PHEX酵素の精製された調製物を各ライブラリーに添加し、蛍光を記録する。デ
ータを体制化して、ヘキサペプチドに沿った各位置について最も蛍光を産生する
ライブラリーを同定する。この配置は、ヘキサペプチドに沿った各位置において
重要な残基の同定を示唆する。最良の示唆を表すヘキサペプチドを調製し、同様
な方式で試験する。この設定から、最良の蛍光を有するヘキサペプチドを選択す
る。化合物の組合わせライブラリー中のインヒビターを同定する、高い処理量の
スクリーニングを構成するために、このアッセイは有用であることがある。

【００７８】実施例IV： 治療的用途における組換えPHEXタンパク質の使用 ネズミHypモデルは、ヒトX染色体性低リン酸塩血症（XLH）、腎性リン酸塩（P
i）喪失を引き起こす遺伝性疾患、重度のくる病および軟骨化症の特徴を再現す
る。PHEX遺伝子中の突然変異による腎性リン酸塩消耗の存在は、ホスファトニン
と呼ぶ、まだ同定されてないリン酸塩尿性ホルモンをこのエンドペプチダーゼは
分解すること示唆する（Kumar、1997）。この仮説を直接試験するために、近位
管状細胞の正常の特徴を表す、一次マウス近位管状細胞培養物（MPTC）を調製す
る。

【００７９】 MPTC培養の最後の48時間の間におけるHAMF12／DMEM培地（1mMのPi）中の10％
のHypマウス血清の存在は、投与量および時間に依存する方法で、正常マウス血
清と比較したとき、45.7＋／−3.9％だけPi吸収を減少させることが以前に見出
された（Lajeunesse他、1996）。循環に到達しかつ腎性リン酸塩再吸収を阻害す
る因子の解放および／または変更に、Hypマウス骨芽細胞におけるPHEX遺伝子の
欠陥が関係する場合、PHEXの精製した調製物で血清を前処理することによって、
Pi吸収に対するHypマウス血清の作用を壊滅することができる。次いで、MPTC細
胞によるリン酸塩の吸収を測定することによって、Hypマウス血清に対するPHEX
（1〜10μgの精製された組換えsecPHEX）の作用をモニターする。

【００８０】 対照実験は、同様に条件下であるが、熱または酸不活性化PHEXと血清試料をイ
ンキュベートすることを包含する。PHEX処理は正常リン酸塩吸収を回復すること
が見出された場合、こうしてまず動物モデル（例えば、Hypマウス）において、
次いでX染色体性低リン酸塩血性くる病で特徴づけられる病理学的状態を有する
患者において、正常リン酸塩レベルを回復するための治療剤として組換え可溶性
PHEXを使用することができる。 稀な障害である腫瘍形成性低リン酸塩血性軟骨化症を患う患者は、X染色体性
低リン酸塩血性くる病の患者で見出されるものに類似する異常を表す。したがっ
て、可溶性PHEX酵素の投与により、これらの患者における正常リン酸塩血を再確
立することができる。

【００８１】実施例V： PHEX抗体の産生および使用 本研究において示されるように、PHEX cDNA配列の知識を使用して特異的抗体
を発生させることができる。例えば、ペプチダーゼ間の相同性が低い領域（アミ
ノ酸残基121〜294）を使用して、cDNAの翻訳から推定された配列を有するペプチ
ドを合成することができる。あるいは、例えば、GSTに融合したcDNAの細菌的に
発現されたフラグメントを精製し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗
体を産生するためにウサギまたはマウスに注射することができる。これらの抗体
または誘導された「診断試薬」は、通常標識化抗体を含んでなり、下記の目的で
使用することができる：

【００８２】 − ペプチダーゼが機能しているペプチド作用性経路を免疫組織化学的に同定
する； − 生物学的流体またはバイオプシーの試料についてイムノブロッティングま
たは免疫組織化学によりPHEXの生理病理学を研究する； − PHEXインヒビターを同定する高い処理量のスクリーニングアッセイを構成
する。これは、例えば、PHEXを固体支持体に結合する抗体を使用することによっ
て、実施することができる；

【００８３】 − 1つの組の条件においてPHEXに選択的に結合することができる抗体を同定
し、そして典型的にはPHEXを変性しないで大きいpHまたは塩濃度の変化を包含す
る、他の条件においてそれを解放することによって、免疫沈降またはアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより前記抗体でPHEXを精製する； − PHEX活性をブロックする抗体を同定し、それらの抗体を治療剤として使用
する。実施例IIに記載されているようにin vitro酵素アッセイに抗血清または
腹水を添加し、PHEX活性の阻害について検査することによって、ブロッキング抗
体を同定することができる。次いでブロッキング抗体を正常および疾患のモデル
動物に注射して、in vivo作用について試験することができる。

【００８４】実施例VI： 組換え可溶性PHEX酵素を産生する別法 上に示したように、組換え活性secPHEX−ECは哺乳動物細胞におけるPHEX cDN
Aの発現により得ることができる。このファミリーの他のメンバー、ネプリシン
を使用する過去の実験から（Devault他、1992；Fossiez他、1992；Ellefsen、19
99）、適当な発現ベクター中のPHEX cDNAのクローニング後、また、他の発現系
において発現を実行することができる。これらの発現系はバキュロウイルス／昆
虫細胞または幼虫系およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）をベースと
する酵母系を包含する。

【００８５】 組換えPHEX酵素の産生は、タンパク質の天然に存在する膜結合または可溶性形
態、またはこの酵素の遺伝子操作された可溶性形態を包含する。後者は、以前に
実施されたように（Lemay他、1989a）、細胞質ゾルまたはトランスメンブランド
メインを切断可能なシグナルペプチド、例えば、プロオピオメラノコルチンのそ
れと置換するか、あるいは以前に実施されたように（Lemire他、1997b）、遺伝
学的操作により非切断可能シグナルペプチド膜アンカードメインを切断可能なシ
グナルペプチドに変換するか、あるいは他の研究において実施されたように、天
然に存在する可溶性NEP様酵素、例えば、NL−1のアミノ末端ドメイン（イニシエ
ーターメチオニンからアミノ酸残基300まで）にPHEX酵素のエクトドメインを融
合することによって得ることができる。

【００８６】実施例VII： インヒビターの同定 合成ライブラリー、ビオタ抽出物、現在の文献、から、そしてX線結晶学およ
び置換基の活性の関係を使用して、合理的に設計されたインヒビターから、イン
ヒビターを同定することができる。前述の酵素試験を使用して、各分子または抽
出画分を阻害活性について試験する。既知の手順に従い、最大の阻害に関係する
分子をさらに試験してその薬理学的および毒物学的特性を決定する。いくつかの
この分野において認識されているin vitro法を使用して、酵素的PHEX分解のin
vitro阻害をスクリーニングすることができる。

【００８７】 これらの方法において、ペプチド（「基質」）をPHEX酵素に暴露する。基質は
骨に関係するペプチド、任意の他のファミリーメンバーにより切断されることが
知られているペプチドまたはPHEX酵素による分解に対して感受性であるペプチド
の基質であることができる。ペプチドを分解すると、特異的代謝物質の遊離する
。遊離した代謝物質（または維持されたペプチド）の量をモニターして、酵素に
より基質の分解度を決定することができる。すなわち、PHEX酵素インヒビターを
試験して、特定の酵素による特定の基質の分解により遊離する代謝物質の量を減
少させる、それらの性向を決定することができる。

【００８８】 一般に、これらのin vitroモデルは、試験試料（PHEX酵素インヒビターまた
はペプチド基質）および対照試料（PHEXインヒビターを含まない基質を含有する
）から成る。各試料を特定のインヒビターに暴露し、次いで試料を比較して、試
験試料よりも有意に多い代謝物質（またはすくない基質）が対照試料の中に存在
するかどうかを決定する。試験試料よりも有意に多い代謝物質（またはすくない
基質）が対照試料の中に存在する場合、被検化合物は1またはそれ以上の実施例
のインヒビターである。1つのこのような方法は前述された。

【００８９】 ネプリシン（NEP）のインヒビターとしてZn金属ペプチダーゼについて網羅的
な文献が入手可能である（Roques、1982a；Roques、1982b；Ondetti、1984；Roq
ues、1985；Roques、1986；Chipkin、1986；Thorsett、1987；Rich、1990；Vall
ee、1990）。Zn⁺⁺カチオンを配位することができる多数の既知の官能基の中で、
チオール、カルボキシル、ヒドロキシアミルおよびホスホリル基のすべては首尾
よくACEおよびNEPインヒビターの開発において使用されてきている。PHEX酵素（
PHEXインヒビター）の阻害活性を表示する、すべてのこのような分子は、本発明
に包含される。

【００９０】 上に示したように、PHEXは同様な特性、例えば、同一インヒビターに対する感
受性および同一基質をプロセスする能力を共有する酵素ファミリーのメンバーで
ある。PHEX酵素インヒビターおよびそれらの製造方法は文献に記載されており、
そして本発明の方法において有用である。このようなインヒビターは下記の文献
に記載されており、これらすべては引用することによって本明細書の一部とされ
る：

【００９１】 米国特許第4,380,350号（Sarantakis、1983年4月19日発行）；米国特許第4,43
2,242号（Wilkinson他、1983年12月27日発行）；米国特許第4,474,795号（Green
berg他、1984年10月2日発行）；米国特許第4,504,492号（Wilkinson他、1985年3
月12日発行）；米国特許第4,513,009号（Roques他、1985年4月23日発行）；米国
特許第4,514,391号（Gordon他、1985年4月30日発行）；米国特許第4,528,296号
（Vecchietti他、1985年7月9日発行）；米国特許第4,552,866号（Delaney他、19
85年11月12日発行）；米国特許第4,567,198号（Delevallee他、1986年1月28日発
行）；米国特許第4,610,816号（Berger他、1986年9月9日発行）；米国特許第4,6
11,002号（Ondett他、1986年9月9日発行）；米国特許第4,618,708号（Roques他
、1986年10月21日発行）；

【００９２】 米国特許第4,636,522号（Gordon他、1987年1月13日発行）；米国特許第4,670,
541号（Delaney他、1987年6月2日発行）；米国特許第4,681,960号（Kakimoto他
、1987年7月21日発行）；米国特許第4,721,726号（Berger他、1988年1月26日発
行）；米国特許第4,722,810号（Delaney他、1988年2月2日発行）；米国特許第4,
939,261号（Ksander他、1990年7月3日発行）；米国特許第5,096,925号（Ksander
他、1992年3月17日発行）；米国特許第5,098,934号（Vevert他、1992年3月24日
発行）；米国法定発明登録第11642号（Floyd他、1989年6月6日発行）；英国特許
公開第8111322号（Wilkinson他、1981年11月4日発行）；英国特許公開、Wilkins
on他、1983年11月21日発行）；

【００９３】 欧州特許公開第161,769号（Delaney他、1985年11月21日発行）；欧州特許公開
第341,081号（Kwamura他、1989年11月8日発行）；欧州特許公開第474,533号（Sh
ibhara他、1992年3月11日発行）；PCT特許公開第92／03410号（Neustadt他、199
2年3月5日発行）；Fournie−Zaluski他、″Differential Recognition of ‘
Enkephalinase’ and angiotensin−Coverting Enzyme by New Carboxyla
lkyl Inhibitors″、31 Life & L 2947−2954（1982）；Mimura他、″A N
ovel Class of Enkephalinase Inhibitors Containing a C−Terminal
Sulfo Group″、35.！. Med. Chem. 602−608（1992）。

【００９４】 本発明の方法において有用な好ましいPHEX酵素インヒビターは式（I）の一般
構造を有する化合物およびそれらの薬学上許容される塩である： L−(CH₂)_m−CH（R¹）−(CH₂)_n−A−B−CH（R²）−CH₂）_p−X （I） 式中、 （1） Lは−S−R³または−C（＝O）−R⁴であり、ここでR³は水素または−C（＝
O）−R⁵であり、ここでR⁵は低級アルキルであり、そしてR⁴はヒドロキシまたは
−NHOHである； （2） R¹は水素、低級アルキル、アリール、アリールアルキルである； （3） AはC（＝O）−、−NH−C（＝O）−、または−N（R⁶）であり、ここでR⁶
は水素または低級アルキルである；

【００９５】 （4） Bは−NH−、−O−、−S−、または−C（＝O）−である； （5） R²は水素、低級アルキル、アリール、アリールアルキル（好ましくはフ
ェニルメチル）である； （6） Xは−C（＝O）−NH−R⁷または−C（＝O）−O−R⁷であり、ここでR⁷は水
素、低級アルキル、フェニル、またはアリールアルキルである； （7） mは0〜約2である； （8） nは0または1（好ましくは0）である；そして （9） pは0〜約4（好ましくは0または1）である。

【００９６】 他の好ましいPHEX酵素インヒビターは式（II）の一般構造を有する化合物およ
びそれらの薬学上許容される塩である： L−(CH₂)_m−CH（R¹）−(CH₂)_n−A−Z−R⁷ （II） 式中、 （1） L、R¹、A、m、およびnは式（I）に記載した通りである； （2） Zは−NH−、−O−、−S−、−C（＝O）−、またはゼロである； （3） R⁷は炭素環式環または複素環式環、好ましくはベンゼンスルホン酸、ピ
リジル、またはモルホリニルである。

【００９７】 他の好ましいPHEX酵素インヒビターは、米国特許第4,721,726号（Berger、198
8年1月26日発行、に記載されており、式（III）の一般構造を有する化合物およ
びそれらのラセミ体、鏡像異性体およびジアステレオマーおよびそれらの薬学上
許容される塩である： R₁CH（COR₂）−NH−CHR₃−CONH（CH₂）CR₄R₅−COR₆ （III） 式中、

【００９８】 R₁は1〜6個の炭素原子を有するアルキル、アダマンチルメチル、4〜8個の炭素
原子を有するシクロアルキルメチル、またはA−X_m−C_nH_2n−であり、ここでXは
酸素または硫黄であり、Aは基Y置換されていてもよいフェニルであり、ここでY
はハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、1〜6個の炭素原子を有するアル
コキシ、1〜6個の炭素原子を有するアルキル、2−および3−フラニル、2−およ
び3−チエニル、またはフェニル（これはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロ
メチル、1〜6個の炭素原子を有するアルコキシまたは1〜6個の炭素原子を有する
アルキルで置換されていてもよい）、ベンジル（そのフェニル環はここにおいて
定義した基Yで置換されていてもよい）、1−および2−ナフチル、2−および3−
フラニルまたは2−および3−チエニルであである；mはoまたは1である、そしてn
は0、1、2、3、または4である；

【００９９】 R₂およびR₆は同一であるか、または異なり、そしてヒドロキシ、1〜8個の炭素
原子を有するアルコキシ、B−X_m−C_nH_2n−O−であり、ここでBはフェニル（これ
はここにおいて定義した基Yで置換されていてもよい）、1−および2−ナフチル
であり、X、m、およびnはここにおいて定義した通りであり、ただしn＝0、m＝0
であるとき、R²およびR⁶は3〜8個の炭素原子を有する−OCH₂OCO−アルキル、−O
CH₂CO−フェニル（そのフェニル環はここにおいて定義した基Yで置換されていて
もよい）、1−グリセリル、

【０１００】

【化１】

【０１０１】 であり、ここでR₇は水素、1〜6個の炭素原子を有するアルキル、またはフェニル
（これはここにおいて定義した基Yで置換されていてもよい）であり、そしてR₈
は水素または1〜6個の炭素原子を有するアルキルである； R₂はまた−NR₇R₈であることができ、ここでR₇およびR₈はここにおいて定義し
た通りである；

【０１０２】 R₃は1〜6個の炭素原子を有するアルキル、4〜8個の炭素原子を有するシクロア
ルキルメチル、2−および3−チエニルメチル、2−および3−フラニルメチル、1
−および2−ナフチルメチル、またはベンジル（そのフェニル環はここにおいて
定義した基Yで置換されていてもよい）である； R₄はD−C_nH_2nO_m−であり、ここでDは水素、1〜4個の炭素原子を有するアルキ
ルまたはフェニル（これは基Z置換されていてもよく、ここでZはハロゲン、ヒド
ロキシ、トリフルオロメチル、1〜6個の炭素原子を有するアルコキシまたは1〜6
個の炭素原子を有するアルキル）である；ここでmおよびnはここにおいて定義し
た通りである；

【０１０３】 R₄はまた−NR₅COR₇（ここでR₅およびR₇はここにおいて定義した通りである）
、およびNR₅CO₂R₉（ここでR₅はここにおいて定義した通りであり、そしてR₉は1
〜6個の炭素原子を有するアルキルまたはフェニル（これはここにおいて定義し
た基Yで置換されていてもよい）であり、ただしpは1または2である； R₅は水素または1〜6個の炭素原子を有するアルキルである；そしてpは0、1ま
たは2である。

【０１０４】 他の好ましいPHEX酵素インヒビターは、Mimura他、″A Novel Class of E
nkephalinase Inhibitors Containing a C−Terminal Sulfo Group″、35
1、Med. Chem. 602−608に記載されており、一般構造（IV）を有する：

【化２】

【０１０５】 式中、 R₁はフェニル、p−メチルフェニル、p−メトキシフェニル、p−フルオロフェ
ニル、p−トリフルオロメチルフェニル、p−ニトロフェニル、p−ジメチルアミ
ノフェニル、p−フェニルフェニル、フェニルエチル、1−ナフチル、3−ピリジ
ル、1,2−ベンゾイソキサゾリル−3−イル、または1−メチルエチルから選択さ
れる； R₂は水素またはシクロプロピルから選択される；そして R₃はCR₂、CH₂−CH₂、CH₂−CH₂−CH₂、CH（CH₃）、CH（CH₂CH（CH₃）₂）、o−
フェニル、m−フェニル、p−フェニル、p−フェニルメチル、および1,4−ナフタ
レンから選択される。

【０１０６】 本発明の方法において有用な特に好ましいPHEX酵素インヒビターは下記のもの
を包含する：（DL−3−メルカプト−2−ベンジルプロパノイル）−グリシン；1
−（DL−3−メルカプト−2−メチルプロパノイル）−L−プロリン；2−ベンジル
−3−（N−ヒドロキシカルボキシアミド）−プロパノイル−L−アラニン；2−ベ
ンジル−3−（N−ヒドロキシカルボキシアミド）−プロパノイル−L−フェニル
アラニン；（±）−N−（2−アセチルチオ）メチル−1−オキソ−3−フェニルプ
ロピルグリシンベンジルエステル；N−モルホリニル−2−フェニルメチル−3−
メルカプトプロパンアミド；アルファ−（メルカプトメチル）−N−（4−ピリジ
ル）ベンゼンプロパンアミド；N−［2−ベンジル−3−（N−ヒドロキシカルボキ
シアミド）−プロパノイル］−3−アミノ−4−フェニル酪酸；N−［（R,S）−2
−ベンジル−3−［（S）（2−アミノ−4−メチルチオ）ブチルジチオ］−1−オ
キソプロピル］−L−Phe−ベンジルエステル；N−（2−ベンジル−3−（メルカ
プトプロパノイル）メタニル酸；およびN−［（R,S）−2−カルボキシ−3−フェ
ニル−プロパノイル］−L−Leu。

【０１０７】 最良の分布、薬理学的作用と低い毒性との組合わせを有するインヒビターは、
薬剤を製造するために選択されるであろう。インヒビターまたはその許容される
塩の薬学上許容される処方物は、既知賦形剤と混合して錠剤、カプセル剤または
注射可能な溶液を形成することによって製造することができる。1〜500mgの薬剤
は患者に投与される。

【０１０８】実施例VIII： 療法上の使用 本発明は、また、その最も頻繁な発現、二次的上皮小体機能亢進症および腎性
骨形成異常を包含する、低リン酸塩血症を治療する方法を提供する。この方法は
、循環するリン酸塩の減少、こうして、低リン酸塩血症およびその最も頻繁な結
果を減少させるか、あるいは好ましくは防止するPHEXインヒビターを投与するこ
とを含んでなる。

【０１０９】 上に示したように、PHEXは、上に示したように、同一インヒビターに対するそ
れらの感受性および同一基質をプロセシングするそれらの能力を包含する、同様
な特性を共有する金属プロテアーゼファミリーのメンバーである。多数のNEP様
酵素インヒビター、およびそれらの製造方法は文献に記載されており、そして本
発明の方法において有用である。

【０１１０】 阻害活性を有するPHEXインヒビターは、体重約250gのラットに1mg／kgの投与
量で投与される。対照グループは、PHEXインヒビターを使用しないで同一ベヒク
ルを投与するラットの他のグループから成る。血清および尿は標準的方法を使用
して試験動物から得られる。次いで血清および尿中のリン酸塩濃度は標準的方法
により測定される。リン酸塩濃度の変化を誘導することができるPHEXインヒビタ
ーは、低リン酸塩血性であるといわれる。このような化合物は、高リン酸塩血症
の患者を治療する目的に好ましい「低リン酸塩血性PHEXインヒビター」である。

【０１１１】 「最少の有効投与量」は、血清リン酸塩またはPTH濃度の有意な減少を誘導す
るために必要な最小投与量である。好ましくは、治療はこのような投与量で開始
されるであろう。好ましくは、治療はリン酸塩またはPTH血液濃度または両方（
ここにおいておよび以後において血液パラメーター）の減少を達成するために十
分な期間の間、「低リン酸塩血性PHEXインヒビター」を投与することを包含する
。好ましくは、正味の減少は患者の値と正常個体群の値との間の差の約25％、よ
り好ましくは患者の値と正常個体群の値との間の差の少なくとも約50％である。

【０１１２】 被検体の血液パラメーターのこの減少を達成するために十分な特定の期間は種
々の因子に依存するであろう。このような因子は、例えば、使用する特定の低リ
ン酸塩血性インヒビター、投与量、被検体の年齢およびジェンダー、治療すべき
特定の障害、使用する付随的治療（使用する場合）、被検体の一般的身体的健康
（他の障害の存在を包含する）、個体における疾患の重症度、および個体の栄養
的習慣を包含する。

【０１１３】 本発明の方法によれば、「投与」は、健全な医学的実施において、本発明にお
いて使用する低リン酸塩血性インヒビターを、血液パラメーターの減少の達成に
おいて有効である方法において、治療すべき被検体に送達する方法を意味する。
低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターは、下記の種々の既知の方法で投与するこ
とができる：例えば、経口的、皮膚粘膜的（例えば、皮膚、舌下、鼻内、および
経直腸）、非経口的（例えば、皮下注射、筋肉内注射、関節内注射、静脈内注射
）、および吸入。こうして、特定の投与モードは、例えば、下記のものを包含す
る：経口、経皮、粘膜、舌下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下の投与、および局
所的適用。低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターを送達する好ましいモードは、
医学的に必要な長さおよび頻度における、経口的投与である。期間および頻度は
、血清リン酸塩、PTHおよびビタミンD代謝物質の規則的測定後に調節される。

【０１１４】 こうして、本発明の好ましい方法は、下記の工程を含んでなる：その最も頻繁
な発現、二次的上皮小体機能亢進症および腎性骨形成異常を包含する、低リン酸
塩血症を検出するためにヒト被検体について診断を実行し、前記診断から陽性結
果が得られたとき、本発明の方法に従い低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターを
投与する。その最も頻繁な発現、二次的上皮小体機能亢進症および腎性骨形成異
常を包含する、低リン酸塩血症を検出するために適当な方法は、この分野におい
てよく知られている。このような方法は、血液、血清、血漿または尿のリン酸塩
の測定または血液、血清または血漿のPTHの測定を包含する。

【０１１５】実施例IX： 投与形態 本明細書に記載する低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターは、種々の薬学上許
容される組成物の形態で投与することができる。したがって、例えば、低リン酸
塩血性PHEX酵素インヒビターを投与するための組成物は、下記の成分を含んでな
る： （a） 約1.0mg〜約10000mgの低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビター；および （b） 薬学上許容される担体。

【０１１６】 薬学上許容される担体は、ヒトまたは下等動物への投与に適当な、固体または
液体の充填希釈剤またはカプセル化物質、およびそれらの混合物を包含する。用
語「適合性」は、本明細書において使用するとき、通常の使用状況下に医薬組成
物の薬学的効能を実質的に減少する、相互作用が存在しないような方法で、薬学
上の組成物の成分を低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビター、および互いに混合で
きることを意味する。薬学上許容される担体は、もちろん、治療するヒトまたは
下等動物への投与に適当とするために十分に高い純度および十分に低い毒性をも
たなくてはならない。

【０１１７】 薬学上の担体として働くことができる物質のいくつかの例は次の通りである：
糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；澱粉、例えば、コーン
スターチおよびジャガイモ澱粉；セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリ
ウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース；粉末状
トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシ
ウム；植物油、例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ
油およびカカオバター；ポリオール、例えば、プロピレングリコール、グリセリ
ン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール；寒天；アル
ギン酸；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水；リン酸塩緩衝液；湿潤剤およ
び滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；香味剤；および保存剤。他
の適合性薬学上の添加剤および低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターは、本発明
の組成物において使用するための薬学上許容される担体の中に含めることができ
る。

【０１１８】 活性物質と組合わせて使用すべき薬学上許容される担体の選択は、活性物質を
投与する方法により決定される。活性物質を注射すべき場合、好ましい薬学上許
容される担体は無菌の水、生理食塩水、またはそれらの混合物である。このよう
な非経口的組成物のpHは好ましくは約7.4に調節される。局所的適用のために薬
学上許容される担体は、クリーム、ゲル、テープ、パッチ、および同様な局所的
デリバリー手段において使用するためにこの分野において知られている担体を包
含する。

【０１１９】 低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターと組合わせて使用する薬学上許容される
担体は、投与関係に対して実際的サイズを提供するために十分な濃縮で使用され
る。薬学上許容される担体は、合計、本発明の医薬組成物の約0.1重量％〜約99.
9重量％、好ましくは約5重量％〜約80重量％、最も好ましくは約10重量％〜約50
重量％を構成することができる。 示したように、低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターを投与する好ましい方法
は、投与すべき活性成分のクラスに依存する。低リン酸塩血性PHEXインヒビター
のために、好ましい投与方法は、経口的に、単位投与形態（すなわち、健全な医
学的実施に従い、1回の単一投与量で投与するために適当な活性成分の量を含有
する投与形態）でである。

【０１２０】 好ましい単位投与形態は、安全なかつ有効な量の活性成分を含んでなる、錠剤
、カプセル剤、懸濁液、および溶液を包含する。経口投与のための単位投与形態
の製造に適当な薬学上許容される担体は、この分野においてよく知られている。
それらの選択は、本発明の目的について決定的ではない、味覚、コスト、貯蔵安
定性のような二次的考察に依存し、そして当業者により困難なく行うことができ
る。好ましくは、低リン酸塩血性PHEX酵素インヒビターの経口的単位投与形態は
、約1.0mg〜約1000mgのインヒビターを含んでなる。

【０１２１】 本発明は下記のものをさらにを包含する：（1）試料中のPHEXの存在または量
を検出する診断キット；（2）試料中のPHEXの存在または量を検出する方法；（3
）PHEXまたはその突然変異体を精製する装置；（4）PHEXリガンドをスクリーニ
ングする装置；および（5）PHEXリガンドを得る方法。さらに詳しくは、診断キ
ットは抗体および／または可溶性PHEX酵素を含んでなる。PHEXに対する抗体PHEX
を精製する装置において使用することができ、そしてPHEXまたはその突然変異体
はPHEXリガンドをスクリーニングする装置において使用することができる。本明
細書に記載しないが、診断キットおよび本発明に含まれる装置の操作可能性に関
する、より一般的面はこの分野において知られており、そして容易に入手可能で
ある。

【０１２２】 PHEXの存在または量を検出する方法は、下記の工程を含んでなる： − 免疫複合体を形成できる条件下に、PHEXを含有する試料を抗体と接触させ、
そして − 試料中のPHEXの存在または量の指示として免疫複合体を検出する。 PHEXリガンドを得る方法は下記の工程を含んでなる： − 1またはそれ以上の分子とPHEXとの結合が起こることができるような条件下
に、前記1またはそれ以上の分子を含有する試料をPHEX突然変異体酵素と接触さ
せ、 − 試料中のPHEXリガンドの存在の指示として前記分子とPHEXとの結合を検出し
、そして − PHEXリガンドを選択する。

【０１２３】 詳細に説明したが、前述の方法を実施するための実験条件に関する特定事項は
当業者の技量の範囲内であり、当業者により容易に適用可能である。 本発明をその特定の態様に関して記載したが、理解されるように、それ以上の
変更が可能であり、この出願は、一般に本発明の原理に従いかつ本発明が関係す
る既知の普通の実施の範囲内に入るこの開示からの逸脱を包含し、前述の本質的
特徴に適用することができ、かつ添付された特許請求の範囲の範囲に入る、本発
明の任意の変動、使用、または適応を包含することを意図する。

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【図面の簡単な説明】

【図１】 第1図： PHEXの可溶性形態の構築物。第1A図（構築物1）は、酵素の自然膜結
合形態、およびPOMCシグナルペプチドが自然酵素（構築物2）のエクトドメイン
とインフレームで融合されている構築物の概略的構造を表す。第1B図は、構築物
1中の疎水性トランスメンブランドメインの配列の一部分（下線が引かれている
）が構築物2中のより親水性ドメインにより置換されている、構築物を表す。構
築物3において、疎水性配列の一部分は、構築物2におけるように親水性配列の挿
入に加えて、欠失されている。

【図２】 第2図： ヒトPHEXのアミノ酸配列。ボックスの配列は疎水性シグナルペプチ
ド／トランスメンブランドメインを表す。下線が引かれている配列は、モノクロ
ーナル抗体を産生するための大腸菌（E. coli）GST−融合タンパク質をつくる
ために使用した配列を表す。

【図３】 第3図： PHEXモノクローナル抗体のスクリーニング。まず、ELISAアッセイに
おけるハイブリドーマ培養の使用済み培地を使用することによって試験したとき
、大腸菌（E. coli）中で産生されたPHEX_121-294フラグメントに結合する能力
について、モノクローナル抗体を選択した。次に、PHEX発現ベクターでトランス
フェクトされたLLC−PK1細胞からの膜結合PHEXに結合する能力について、陽性培
養物からの免疫グロブリンを試験した。第3A図は、種々のハイブリドーマ上清で
染色したLLC−PK1抽出物のウェスタンブロット分析である。トラック12は、ウサ
ギにおいて調製したPHEXポリクローナル抗体を使用して得られた染色パターンで
ある。第3B図：PHEXの可溶性形態（secPHEX）の免疫沈降。まず、材料および方
法の節において説明するように、PHEXの可溶性形態をコードするベクターでLLC
−PK1細胞をトランスフェクトした。次いで、免疫沈降実験のためのsecPHEX源と
して、トランスフェクトされたLLC−PK1細胞の使用済み培地を使用した。まず、
プロテインA−セファローズビーズ（Pharmacia）をウサギ抗マウスIgG画分で飽
和し、次いで第3A図に示すように選択したハイブリドーマ上清からのマウス免疫
グロブリンで飽和することによって、免疫沈降を実行した。洗浄後、secPHEXを
産生するLLC−PK1細胞の使用済み培地のアリコート（40μgの全タンパク質）中
で、これらのビーズをインキュベートした。ビーズを遠心によりペレット化し、
洗浄し、電気泳動試料の緩衝液中のプロテインA−セファローズに結合したタン
パク質を沸騰させ、次いでPHEXポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッ
ト分析により、secPHEXの存在を評価した。トラック10は、ウサギPHEXポリクロ
ーナル抗血清と同一条件下に実施した免疫沈降の結果を示す。トラック10および
11は、モックトランスフェクトした細胞から調製した対照実験を示す。

【図４】 第4図： COS−1細胞中の組換えPHEXの膜結合形態および可溶性形態の発現。P
HEXの全コーディング配列（左のパネル）を含有する発現ベクターまたはPHEXの
分泌を促進することができる構築物（方法参照）（右のパネル）を含有する発現
ベクターで、COS−1細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、細
胞を16時間培養し、方法において説明するように、膜画分（左のパネル）または
使用済み培地（右のパネル）を調製した。モノクローナル抗体15D7を使用するウ
ェスタンブロットにおいて、PHEXの発現をモニターした。左のパネルにおいて見
られるように、pCDNA3／RSV−PHEX−FLBベクターでトランスフェクトした細胞の
膜画分の中に、105,000の見掛けのMrに対応する移動度で移動するバンドが存在
した（レーン2）。このバンドは対照細胞の抽出物には存在しなかった（レーン1
）。右のパネルは、PHEXの分泌された可溶性形態がトランスフェクトした細胞の
使用済み培地の中に存在するが、対照のモックトランスフェクトした細胞の中に
存在しないことを示す。

【図５】 第5図： secPHEXのイオン交換クロマトグラフィー精製。LLC−PK1細胞を発現
するsecPHEXからの濃縮された使用済み培地をSP−セファローズカラム上に負荷
し、タンパク質を線形NaCl勾配で溶離した。画分を7.5％SDSポリアクリルアミド
ゲル上で分析し、イムノブロッティング（第5A図）または銀染色（第5B図）によ
り検出した。

【図６】 第6図： secPHEXについて酵素アッセイ。精製されたsecPHEX（2μg）を10μg
のPTHrP107−139の存在下にインキュベートし、反応混合物をRP−HPLCにより分
析した。第6A図は、secPHEXの非存在下にPTHrP107−139をインキュベートしたと
き得られたクロマトグラムを示す。第6B図は、secPHEXによるPTHrP107−139の消
化を示す。反応混合物に0.001MのEDTAを添加することによって、この消化は完全
に阻害された（第6C図）。secPHEXによるPTHrP107−139の切断はリン酸塩濃度に
対して感受性である（第6D図〜第6H図：それぞれ、1、5、10、25、50mMのリン酸
塩）。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年６月４日（２００１．６．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/12 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｂ０６５ 19/08 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｍ 1/00 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/48 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/37 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 9/48 33/577 Ｂ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA19 BA14 CA04 DA02 EA04 FA18 GA11 4B029 AA27 BB16 BB17 CC03 4B050 CC04 DD11 FF11E FF14E LL01 4B063 QA01 QA05 QQ03 QQ20 QQ36 QQ79 QQ95 QR16 QR48 QR57 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4B065 AA90X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA25 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA22 DC02 ZA962 ZC192 ZC202 ZC212 4C085 AA13 AA14 BB22 CC02 DD63 DD88 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 AA40 BA10 CA40 DA75 DA76 DA89 EA20 EA50 FA72 FA74 GA23 GA26 【要約の続き】

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 精製された可溶性ヒトPHEX酵素およびその変異型。
2. 【請求項２】 不活性であるが、PHEXに対するリガンド分子に対する結合能
   力を保持する、請求項１に記載の酵素の突然変異体。
3. 【請求項３】 位置582にグルタミン酸残基が変異しているPHEX酵素から本
   質的に成る、請求項２に記載の突然変異体。
4. 【請求項４】 位置582のグルタミン酸残基が疎水性アミノ酸残基で置換さ
   れているPHEX酵素から本質的に成る、請求項２に記載の突然変異体。
5. 【請求項５】 位置582のグルタミン酸残基がバリン残基で置換されているP
   HEX酵素から本質的に成る、請求項２に記載の突然変異体。
6. 【請求項６】 PHEX C末端のエクトドメインが活性または不活性であり、
   切断可能なシグナルペプチドを含むように修飾されたPHEX膜−アンカードメイン
   をコードする末端切除PHEX遺伝子配列を含んでなる核酸。
7. 【請求項７】 前記切断可能なシグナルペプチドがプロ−オピオメラノコル
   チンシグナルペプチドである、請求項６に記載の核酸。
8. 【請求項８】 請求項６または７に記載の核酸を含んでなる組換えベクター
   。
9. 【請求項９】 発現ベクターである、請求項８に記載の組換えベクター。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の組換えベクターを含んでなる組換え宿主
    。
11. 【請求項１１】 請求項９に記載の組換えベクターを含んでなる組換え宿主
    。
12. 【請求項１２】 工程： − 請求項１１に記載の組換え宿主が核酸を発現するようにさせ、そして − 前記組換え宿主の分泌産物として可溶性PHEX酵素またはその突然変異体を回
    収する、 を含んでなる、可溶性PHEX酵素またはその不活性突然変異体を産生する方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素を含んでなる、
    抗原性組成物。
14. 【請求項１４】 PHEXに結合することができる、請求項１〜５のいずれか一
    項に記載の酵素に対して発生させた抗体またはそのフラグメント。
15. 【請求項１５】 前記フラグメントがPHEXのアミノ酸配列の残基１２１から
    残基２９４に延びる、請求項１４に記載の抗体。
16. 【請求項１６】 モノクローナル抗体である、請求項１４に記載の抗体。
17. 【請求項１７】 モノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
18. 【請求項１８】 PHEX中和性抗体である、請求項１６に記載の抗体。
19. 【請求項１９】 請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の抗体を産生する
    ハイブリドーマ。
20. 【請求項２０】 請求項１に記載の酵素または請求項６に記載の核酸と、薬
    学上許容される担体とを含んでなる組成物。
21. 【請求項２１】 請求項２〜５のいずれか一項に記載の酵素と、薬学上許容
    される担体とを含んでなる組成物。
22. 【請求項２２】 請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抗体と、薬学上
    許容される担体とを含んでなる組成物。
23. 【請求項２３】 請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抗体を含んでな
    る、PHEXの存在または量を検出する診断試薬。
24. 【請求項２４】 請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抗体を含んでな
    る、PHEXの存在または量を検出する診断キット。
25. 【請求項２５】 可溶性PHEX酵素をさらに含んでなる、請求項２４に記載の
    診断キット。
26. 【請求項２６】 工程： − 免疫複合体を形成できる条件下に、試料を請求項１４〜１８のいずれか一項
    に記載の抗体と接触させ、そして − 前記試料中のPHEXの存在または量の指示として免疫複合体を検出する、 を含んでなる、試料中のPHEXの存在または量を検出する方法。
27. 【請求項２７】 請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抗体を含んでな
    る、PHEXまたはその突然変異体を精製する装置。
28. 【請求項２８】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の可溶性PHEX酵素また
    はその突然変異体を含んでなる、PHEXリガンドをスクリーニングする装置。
29. 【請求項２９】 前記抗体が固体支持体上に固定されている、請求項２７に
    記載の装置。
30. 【請求項３０】 前記PHEX酵素または突然変異体が固体支持体上に固定され
    ている、請求項２８に記載の装置。
31. 【請求項３１】 それ自体前記固体支持体上に固定された抗PHEX抗体に対す
    るその結合を通して、前記PHEX酵素または突然変異体が固体支持体上に固定され
    ている、請求項３０に記載の装置。
32. 【請求項３２】 前記固体支持体に対してPHEXをカップリングさせることが
    できる残基または基で終わるC末端のアミノ酸エクステンションを通して、前記P
    HEX酵素または突然変異体が固体支持体上に固定されている、請求項３０に記載
    の装置。
33. 【請求項３３】 工程： − 1またはそれ以上の分子とPHEXとの結合が起こることができるような条件下
    に、前記1またはそれ以上の分子を含有する試料を請求項２〜５のいずれか一項
    に記載のPHEX突然変異体酵素と接触させ、 − 前記試料中のPHEXリガンドの存在の指示として前記結合を検出し、そして − 前記PHEXリガンドを選択する、 を含んでなる、PHEXリガンドを得る方法。
34. 【請求項３４】 前記リガンドがPHEXインヒビターまたは基質である、請求
    項３３に記載の方法。
35. 【請求項３５】 試料をPTHrP107−139と実質的に無リン酸塩条件下に接触
    させ、そして試料中のPHEX活性の指示としてPTHrP107−139の切断産物の出現を
    観測する工程を含んでなる、試料中のPHEX活性を評価する方法。
36. 【請求項３６】 試料中の前記PHEX活性を陽性対照として請求項１に記載の
    PHEX酵素の活性と比較する工程をさらに含んでなる、請求項３５に記載の方法。
37. 【請求項３７】 工程： − 分子を請求項１に記載のPHEX酵素と実質的に無リン酸塩条件下に接触させ、
    そして − 前記分子がPHEX基質である指示として前記分子の切断産物を観測する、 を含んでなる、PHEXの基質である能力について分子の活性を評価する方法。
38. 【請求項３８】 前記分子を陽性対照としてPTHrP107−139と比較する工程
    をさらに含んでなる、請求項３７に記載の方法。
39. 【請求項３９】 工程： − 分子をPTHrP107−139および請求項１に記載のPHEX酵素と実質的に無リン酸
    塩条件下に接触させ、そして − 分子がPHEXインヒビターである指示としてPTHrP107−139の切断産物の形成
    の阻害を観測する、 を含んでなる、PHEXのインヒビターである能力について分子の活性を評価する方
    法。
40. 【請求項４０】 請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法を実行する
    ためのキット。