CN1226174A - 应用蛋白酶抑制剂预防或降低骨的吸收 - Google Patents

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Abstract

本发明关于,通过抑制与破骨细胞吸收活性有关的膜型基质金属蛋白酶(MT－MMP)或基质金属蛋白酶12(MMP－12)的产生或作用来治疗骨代谢疾病。MT－MMP和MMP－12和膜结合金属蛋白酶活性的抑制剂,包括利用PEGA微珠文库产生的肽和肽类似物,反义核酸和抗体。我们发现,蛋白酶MT1－MMP和MMP－12在破骨细胞内表达,并可以被选择性地抑制。

Description

应用蛋白酶抑制剂预防或降低骨的吸收
本发明涉及通过影响蛋白酶的作用或生成来降低骨吸收的速度。
人骨不断地经历重建。骨形成和骨吸收之间的精密平衡受局部和系统因素以及作用于各种细胞的物理力的调控，就骨环境而言，所述细胞包括成骨细胞和破骨细胞。但是，在有些骨代谢疾病(包括最主要骨质疏松和溶骨性骨转移)中，这样的平衡被打破，造成长期的病理性净骨吸收。
骨质疏松是一种系统性骨骼疾病，其特征在于骨质量低和骨组织微结构退化，以及由此导致的骨脆性增加和易骨折。绝经后骨质疏松是困扰着全世界众多妇女的一种慢性病，对社会产生着巨大的社会和经济冲击。
降低骨吸收被认为是防止和治疗多种代谢性骨病(包括骨质疏松和溶骨性骨转移)的合适方法。诸如甾体类激素(特别是雌激素)、降钙素和二磷酸酯等药物能够抑制骨吸收，并已经用于骨质疏松和/或溶骨性骨转移的预防和治疗。但有时，由于主观局限或药效的不确定，这类药物不能获得令人满意的效果。所以，需要一种新的预防/治疗方法来防止或治疗被认为是重点的骨吸收。
去除矿化的骨质(即埋在磷酸钙盐沉淀中的有机基质)是一个复杂的过程。虽然对此仍有争议，但是破骨细胞可能是唯一能够进行骨吸收的细胞。骨质疏松患者的进行性骨损失是由破骨细胞活性增加引起的。
据估计，破骨细胞的生长周期包括以下主要阶段：
1．补充新的造血干细胞，此为破骨细胞的早期前体。
2．增殖和分化，
3．融合成多核体，
4．附着到吸收性骨表面，
5．极化(polarisation)并去除矿化的骨质，
6．通过细胞程序性死亡、坏死或更随机的过程死亡。
但是，这些阶段并不一定是彼此分离的，所以，例如，破骨细胞的分化可能发生在向吸收性骨表面迁移的过程中，其融合可能发生在骨表面上。所有这些阶段提供了进行干预以调节骨吸收水平的可能性。
已知，蛋白水解酶在骨有机基质的降解中起着重要作用。涉及骨吸收的蛋白水解酶的知识主要来自对天然和特地合成的酶抑制剂的体内外研究。而且，骨细胞和骨组织内的组织化学和免疫细胞化学特性，以及最近确认的破骨细胞和其它骨细胞内编码酶的mRNA，丰富了涉及骨吸收的蛋白水解酶的信息。与破骨细胞的骨吸收有主要联系的蛋白水解酶似乎是半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶(MMP)家族的成员。
若干科技出版物和专利以及专利申请中提出了在疾病防治中应用蛋白酶抑制剂。对MMP抑制剂主要着重于抑制剂在治疗癌症和肿瘤转移方面的潜力，而且也已经将诸如关节炎、溃疡、牙病和骨病、HIV感染、角膜及其它眼病、糖尿病和心肌梗塞等疾病作为这些研究及此后的早期实验的目标(参见Birkedal-Hansen等，19932中的综述)。
但是，在某些具体情况中，研究侧重于有关蛋白酶抑制剂用于疾病控制的特别重要的结论和产品。通过动力学研究(基于与MMP-1、-2或-3一起孵育的发荧光合成肽底物)，选定的肽基衍生物已显示是金属蛋白酶的有效抑制剂，使得MMP-2的Ki值降低至5pM，而且该物质以合适剂量给小鼠口服有效并且无毒。(WO94/25434)。
膜型基质金属蛋白酶(MT-MMP)最早被发现于癌症细胞内并与癌细胞的迁移有关(Sato等199413)。根据这一发现，似乎，MT-MMP抑制剂应适用于降低肿瘤的扩散。但是，迄今还没有研究记述过MT-MMP抑制剂，所有也没有有关MT-MMP作为治疗疾病用药物的资料。因为合成MMP抑制剂通常选择性较低，可能，现有的某些合成MMP抑制剂将抑制MT-MMP。而且，尽管不十分具体，已经有人提出编码MT1-MMP(在文献中又称MT-MMP-1和MMP-4)的cDNA以及抗MT1-MMP抗体不仅可用于诊断领域而且可用于其它医药领域(EP-A-0685557和WO95/25171)。
抑制组织蛋白酶被认为是利用蛋白酶抑制剂来降低骨吸收的另一可能途径。数种组织蛋白酶是由破骨细胞产生的，虽然仍有争议，但是它们显然参与了次破骨细胞性吸收带酸性环境中有机基质的降解。最近，有几个独立的研究小组从破骨细胞和类破骨细胞克隆得到了一种新的组织蛋白酶，称为组织蛋白酶K、组织蛋白酶O或OC2。开发该蛋白酶的反义探针或合成抑制剂被认为可能对包括骨质疏松在内的数种疾病的治疗有价值。就组织蛋白酶L而言，已经生产出了多种化合物用作其特异性抑制剂来治疗和预防骨质疏松(EP-A-0611756)。
有些改进方法中已经提到了一般性地用杂交分子来赋予药物作用于细胞和组织的特异性，包括有三部分的杂交分子，它不仅包括结合细胞的配体和引入靶细胞内的化学物质部分，还包括一个介导部分，此介导部分构成了能令化学物质部分进入细胞的转运功能区(WO91/0987)。阻止肽和蛋白酶抑制剂在细胞内的清除和降解并促进其吸收的另一方法是将它们以脂质结合物的形式给药(WO93/01828)。
有关破骨细胞蛋白酶生物作用的研究几乎完全着重于它们在次破骨细胞吸收区内作为有机骨基质降解介导物的潜在能力。但是，我们最近的发现表明，蛋白水解酶对于破骨细胞向吸收表面的迁移和附着也十分重要(Blaviler&Delaisse,19953)。而且，不成熟破骨细胞的蛋白酶依赖性迁移似乎与其成熟为活性骨吸收性破骨细胞有关，并对导致融合成为多核体(即破骨细胞分化过程)十分重要。
作为破骨细胞生长周期的早期阶段，用蛋白水解酶抑制剂干扰破骨细胞的迁移和/或附着，可能比抑制直接参与吸收过程的酶更有效。这种干扰可能更容易实施，因为当迁移细胞分泌的酶被分泌到活跃的极化破骨细胞与骨附着形成的紧密封闭(sealed)吸收区内时，它们不受保护因而不能避免被抑制。
我们已经发现，破骨细胞表达的MT-MMP与MT1-MMP(早先在癌细胞内发现而与骨不相干)密切相关或相同。估计该破骨细胞MT1-MMP在破骨细胞的作用中起重要作用，可能参与细胞向其作用(骨降解)部位的迁移(参见实施例1，2,3-2和3-3和图1至3)。该发现表明，破骨细胞也可能产生其它膜结合金属蛋白酶，例如其它MT-MMP或属于膜金属蛋白酶非基质型家族的成员(例如meltrin和“A分解素(disintegrin)以及金属蛋白酶”，ADAM)。
而且，我们已经发现并鉴定了破骨细胞金属蛋白酶MMP-12的全长基因及其编码的蛋白，该蛋白酶迄今被认为几乎只特异性地在巨噬细胞内表达，该蛋白可能是巨噬细胞通过基底膜侵入组织所必需的。由于巨噬细胞和破骨细胞是密切相关的细胞类型，都来自于造血干细胞而在发育后期发生分化，MMP-12很可能在破骨细胞侵入和迁移中具有类似作用(参见实施例3-4和图4-6)。
本发明提供了一种物质在治疗骨代谢疾病用药物制造上的应用，其特征在于该物质的作用是抑制与破骨细胞吸收活性有关的膜结合蛋白酶或基质金属蛋白酶的产生或其作用。更好的是，本发明提供了一种物质在通过抑制涉及破骨细胞吸收活性的金属蛋白酶的产生或作用来治疗骨代谢疾病方面的应用。具体地说，不仅抑制MT-MMP的产生及其作用，而且也抑制其它膜结合金属蛋白酶(例如meltrin或ADAM)，以及分泌MMP(例如MMP-12)的产生和作用。
治疗的目的可以是预防或治愈所述的疾病。
较好的是，该金属蛋白酶参与破骨细胞前体细胞的更新、增殖、分化或迁移，或者参与破骨细胞的迁移、融合、附着、极化，清除矿化骨质的活动或死亡。
虽然由破骨细胞和破骨细胞前体产生的MT-MMP和MMP-12是本发明抑制剂的主要目标，本发明也包括通过抑制影响破骨细胞生长周期的非破骨细胞蛋白酶来调控骨代谢。其它骨细胞，例如成骨细胞和软骨细胞也能够产生潜在的和活性形式的MMP、组织蛋白酶和血纤蛋白溶酶原激活剂以及某些上述酶的天然抑制物。这些酶可能对于最早的骨表面降解十分重要，骨表面降解使得下层的矿化基质暴露而受到破骨细胞的继续作用(Delaisse和Vaes,19925)，而且，它们可能参与因破骨细胞作用而从骨中释放或在破骨细胞离开后仍留在吸收凹内的胶原纤维的降解(Foged等，19964)。而且，储存在骨内的破骨细胞酶的潜在性酶原形式可能在破骨细胞吸收作用过程中被激活。最后，非破骨细胞来源的蛋白水解酶可能在调控破骨细胞的迁移和成熟中起趋化作用。
所述物质选择性抑制MT1-MMP或广义MT-MMP，MMP-12或广义MMP，或膜结合金属蛋白酶或广义金属蛋白酶。
所述物质可能是与某种MT-MMP发生选择性免疫反应的抗体。这样的物质或者可以是针对参与MT-MMP生成的某基因的反义寡核苷酸或寡核苷酸类似物，或者是调节MT-MMP或某MT-MMP活性的物质。它可能是一种广谱基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，或一种广谱膜结合金属蛋白酶抑制剂。它也可以是一种肽、肽类似物或其它的肽模拟药物，通过在合适的文库中筛选与MT-MMP或MMP或膜结合金属蛋白酶反应的化合物来获得。
本发明提供的较好的抑制剂是肽S-K-Y-P-J-A-L-F-F-K(SEQ ID NO.1)(J是羟基脯氨酸的单字母代号)，以及其抑制性变体，例如肽类似物S-K-Y(NO2)-P-J-A-L-F-F-K(Abz)(SEQ ID NO.2)。
另一方面，本发明包括某物质治疗骨代谢疾病(即通过抑制破骨细胞前体细胞的更新、增殖、分化或迁移，或破骨细胞的迁移、融合、附着、极化和死亡)用药物制造方面的应用。较好的是，所述物质通过抑制蛋白酶的生成或作用来发挥其抑制作用。
本发明包括抗骨吸收药物，其中包含针对参与骨吸收的蛋白酶的活性蛋白酶抑制剂，它操作性地与一配体连接，所述配体具有将抑制剂定向于所述蛋白酶或蛋白酶环境的结合特异性。
本发明包括一种新的蛋白酶，称为家兔破骨细胞MT1-MMP，具有图1和图2中的氨基酸序列，和编码该蛋白的分离核酸，例如具有图1序列的核酸。本发明还包括与所述家兔破骨细胞MT1-MMP具有高度同源性(例如75％以上，90％或96％以上)的蛋白质，和人破骨细胞MT1-MMP及分离的其编码核酸序列。
本发明还包括一种新的蛋白酶，称为家兔破骨细胞MMP-12，具有图4和图5中的氨基酸序列，以及编码该蛋白的分离核酸，例如具有图4序列的核酸。本发明还包括人破骨细胞MMP-12和分离的其编码核酸序列，以及与所述家兔破骨细胞MMP-12具有高度同源性(例如至少50％、至少70、80或90％更好)的其它蛋白质和核酸序列。
可以通过多种途径和多类物质获得对蛋白水解活性的抑制。所述抑制作用可以是直接的，即通过某物质直接作用于蛋白酶的活性形式，从而抑制其蛋白酶活性或底物识别作用；或者作用于蛋白酶的潜在形式，抑制其转化为活性蛋白酶。蛋白酶最相关直接作用性抑制剂包括：
1．天然抑制剂，它们与活性蛋白酶，有时甚至与其潜在性原酶形成特异性复合体(例如金属蛋白酶的组织抑制剂，TIMP)；
2．抗体或抗体片段，它们中和活性位点或封闭底物识别位点；
3．合成伪底物，它们特异性地与催化位点反应(例如与螯合基团连接的合成肽)或与天然底物识别位点反应；和
4．所谓的诱捕试剂，它们是可切开的底物，在被切开时发生构象改变，导致蛋白酶的捕留(例如a-巨球蛋白)。
但是，抑制作用也可以是间接的，即利用调控蛋白酶的表达和/或生成的某物质(例如天然转录因子或其天然调控性系统或局部因子，或特异性结合并封闭编码该蛋白酶的mRNA的合成性反义探针)，或利用影响蛋白酶的天然调节物水平或活性的物质(例如负责催化性激活目标蛋白酶的酶的抑制剂)。
多种蛋白酶抑制剂的开发得助于蛋白酶本身是可获得的。可以在分离的破骨细胞培养物中直接生产蛋白酶，或者将包含编码蛋白酶的cDNA的表达质粒转染到受体细胞系内而间接生产蛋白酶。就在破骨细胞内生产蛋白酶而言，大部分(例如)MMP-9在产生时是其潜在的酶原形式(前-MMP-9)，所以，如果需要的是活性形式，则在此后需要活化过程。由破骨细胞产生的蛋白酶量受到以下因素的严格限制：
a)破骨细胞在培养物中的非增殖性，和
b)技术上难以大量和高纯度地分离天然破骨细胞。
为了说明，在实施例3-1中描述了破骨细胞的前-MMP-9的产生、纯化和活化。另一方面，根据转染到受体细胞内的表达质粒包含的是完整的cDNA还是缺失了编码潜在酶前肽部分区域的cDNA，利用重组技术既可以直接生产潜在蛋白酶也可以直接生产活性蛋白酶。由于活性蛋白酶通常不及其对应的潜在酶原稳定，而且在细胞培养条件下特别可能被降解，所以一般以生产潜在性蛋白酶为宜。为了说明，实施例1,2和3-4描述了编码多种破骨细胞MMP(包括MMP-9,MMP-12和MT1-MMP)或其部分的cDNA的鉴定和克隆。
除了金属蛋白酶(特别是MMP)产生及其活性的天然调节剂之外，参与破骨细胞生长周期某阶段或多阶段的金属蛋白酶(包括MMP特别是MT-MMP和MMP-12)抑制剂包括：
1．与金属蛋白酶或MMP某特异性位点反义的物质，由此降低其识别天然底物的蛋白水解活性，例如抗MMP抗体及其片段，以及合成的肽模拟蛋白酶抑制剂；
2．影响金属蛋白酶或MMP转录或翻译的物质；
3．激发金属蛋白酶或MMP天然抑制剂水平或活性的物质；
4．降低金属蛋白酶或MMP天然活化剂水平或活性，例如类似于1．和2．中所述物质，但是调控负责激活潜在MMP蛋白酶的物质。
实施例5和6说明了抑制剂的开发；抗蛋白酶抗体的生产和使用(实施例5)；合成肽模拟蛋白酶抑制剂的生产、鉴定和特性分析(实施例6a-e)；和蛋白酶mRNA的反义探针的设计和使用(实施例6f)。
抗蛋白酶抗体是开发蛋白酶抑制剂的主要工具，在合适的条件下其本身可以用作抑制剂(参见实施例5e和图9)。所以，抗蛋白酶抗体及其片段的用途是多种多样的，就抗MMP抗体及抗体片段而言，可以用于：
1．在重组MMP的生产中，用于免疫印迹法或类似的免疫检测方法来鉴定表达重组蛋白酶的克隆。
2．在天然或重组MMP的亲和性层析纯化中，固定在活化树脂(例如二乙烯基砜琼脂糖)上制备亲和层析柱。
3．在ELISA或RIA等免疫试验中，定量测定用于诊断分析的样品(例如组织提取物、血清或尿样)和用于研究性分析的样品(例如细胞培养物)中特定MMP的浓度。
4．通过与骨细胞或组织切片的孵育，在蛋白质水平上免疫细胞化学鉴定MMP的表达。如实施例5所示，这还可以显示某MMP的独特细胞定位，从而帮助阐明其生物学作用。
5．用作特异性抑制剂进行MMP活性的分析。在试管中，抗体作为MMP抑制剂表现出最高的特异性(即仅对某特定MMP有选择性而对其它的则没有)，所以是分析各蛋白酶特性的重要工具(Birkedal-Hansen等，19932)。具体地说，用模拟含某特定MMP催化位点的区域的肽免疫，产生的抗体可望用于干扰该MMP(而非MMP族内其它成员)的蛋白水解活性，所以对于证明特定的蛋白酶在骨代谢中的特殊作用十分重要。
6．在制造治疗骨代谢疾病用的药物中，直接用作MMP抑制剂，或用作杂和MMP抑制剂的组成部分。关于将抗MMP抗体或其片段用于治疗骨代谢疾病有两条总原则：作为蛋白酶活性的直接抑制剂或用作位点导向性药物，即只要保证另一抑制剂被输送到正确的靶细胞或靶组织(例如通过在蛋白质水平或基因水平上抗体或其片段与肽模拟合成抑制剂的杂和)。在两种情况中，将抗体用于治疗骨代谢疾病都要求以合适的药物组合物的形式给予动物或人，以避免降解并确保疗效。
蛋白酶的合成肽和肽模拟抑制剂是通过抑制蛋白酶的作用二用于治疗骨代谢疾病的有希望的药物，所示的蛋白酶参与破骨细胞前体细胞的更新、增殖、分化或迁移，或者参与破骨细胞的迁移、融合、附着、极化、矿化骨质的去除或死亡。生产肽及肽模拟抑制剂有多种方法，实施例6(a-e)说明了其中两种。
其一基于最近开发的珠状聚乙二醇交联聚酰胺(PEGA)树脂，该树脂被设计成用于肽合成，具有开放式结构，允许生物活性蛋白质进入其内部(Meldal等11，1994；Medal和Svendsen,199512)。为了通用地全面分析蛋白酶的特异性，开发出了PEGA微珠肽文库，它可以用来鉴定破骨细胞蛋白酶的第一合成肽底物，在了解功能底物之后，鉴定抑制剂。该方法的第一步，在众多随机合成的发荧光肽中筛选其在与破骨细胞蛋白酶孵育期间被水解的能力。这一步的主要目的是鉴定出适用于本方法第二步的合成肽底物，即鉴定该蛋白酶的抑制剂。但是，底物的鉴定可能直接得到抑制剂，因为对蛋白酶具有高度的亲和性但几乎不能被水解的底物(即伪底物)可以起可逆性抑制剂作用。在实施例6b中，我们报道经MMP-9与PEGA微珠底物文库孵育，鉴定发现了一种肽模拟分子(CL-1)，它不仅具有低Km值(3.4μM)而且具有低Kcat/Km(＜500M-1s-1)，这表明，它可以用作破骨细胞MMP-9的抑制剂。在对原先鉴定的底物进行修饰后，例如将肽模拟底物与螯合基团例如异羟肟酸根、巯基、膦酰胺基、膦酸根和磷酰胺基连接(参见Birkedal-Hansen等的综述)，或通过将伪底物设计成由于与酶上的结合位点相互作用易于形成酰基-蛋白酶复合物但是导致离去基团的水解缓慢(Baggio等，19961)，伪底物可能获得更好的抑制剂特性。
在更常规的情况下，即通过PEGA微珠方法第一步骤或简单的常规方法实现了对适当合成底物(即表现出与蛋白酶孵育时的低Km和高Kcat/Km)的鉴定时，可以从PEGA微珠合成肽抑制剂文库中的众多随机设计的肽中鉴定到合成肽抑制剂(Medal和Svendsen,199512；Medal等，199721)。该筛选方法的基础是某些肽具备抑制已有合成肽模拟底物水解作用的稀有能力。用此方法还可以找到MMP、MT-MMP和膜结合金属蛋白酶的抑制剂。
为了优化MMP抑制剂的合成方法，对原来的PEGA微珠抑制剂技术进行了新的改进。已经证明(Galardy等，199219)，用含磷键(例如膦酯(-PO2-CH2-)、膦酰胺(-PO2-NH-)或膦酸(-PO2-O-)键)取代成纤维细胞胶原酶的肽底物内的可裂解肽键(-CO-NH-)，可导致对蛋白水解活性的抑制。该认识首次与PEGA微珠技术合用，它使得在PEGA微珠上合成假设的抑制性肽类似物的构建基材从天然氨基酸(包括羟基脯氨酸)及其对应的D-型，扩展到还包括了伪二肽，例如NH2-P1p/cp1’COOH、NH2-P1p/Np1’-COOH或NH2-P1p/cp1’-COOH，其中的两个普通氨基酸(P1和P1’)不是通过肽键连接而是通过膦酯、膦酰胺或膦酸键(P/c、P/N或P/c)连接。这样就能够合成随机PEGA微珠抑制剂文库，具有诸如X1-X2-P1P/cp1’-X3-X4-“接头”-PEGA的结构，其中的X1至X4是天然氨基酸，而P1P/cp1’是膦酯伪二肽(见实施例6c和图12至15)。
利用PEGA微珠底物文库技术，就可能鉴定出用于设计新的高特异性MMP-底物的肽序列(见实施例6a和b)。这样的底物有助于设计和使用PEGA微珠抑制剂文库，既可通过使用文库中的选择性底物之一，也可以通过使用底物的序列信息来设计文库中随机化抑制剂的结构(Meldal和Svendsen,199512；Meldal等，199721)。尤其是根据带有含磷键的抑制剂来设计PEGA微珠抑制剂文库时，底物信息被用来确定伪二肽膦酯、膦酰胺或膦酸键周围的两个氨基酸的R基团(见实施例6)。而且，这还有助于根据对新的MMP底物特异性的分析设计出选择性抑制剂(见实施例6b中CL-1,CL-21,CL-25和CL-29资料)。最后，在诊断和研究工作中，特异性底物可能成为选择性检测和定量测定组织样品中MMP的重要工具。
鉴定肽和肽模拟抑制剂的另一种方法，是基于使用位置组合性肽抑制剂文库。这类随机合成肽文库中的少量成员在单独一个氨基酸位置上具有一个非常规氨基酸(例如D-氨基酸而不是L-氨基酸)，它们有时可能由于伪底物效应而对某特定酶起抑制作用。如果将位置组合肽抑制剂文库与某蛋白酶或某具有基本蛋白酶活性的生物模型系统一起孵育，得到一抑制信号，则可以如实施例6(d-e)所述通过将文库系统性节段化(将位置组合肽抑制剂文库与胎鼠跖骨培养物一起孵育)鉴定出文库中造成该抑制作用的肽。本发明提供的较好的抑制剂文库和肽结构是文库：X-X-w-X-X，X-X-l-X-X和X-X-w-Y-X，和肽：C-L-w-Y-L,C-L-w-Y-M,C-Y-w-Y-L,V-Y-w-Y-M和L-F-w-Y-L，其中X是包括羟基脯氨酸在内的天然氨基酸，w和l分别是D-色氨酸和D-亮氨酸。(见实施例6e)
比较这两种方法，PEGA微珠文库的主要优点和缺点分别在于鉴定迅速和需要与最好是纯化的蛋白酶制剂在试管内孵育。位置组合肽抑制剂文库的主要优点和缺点分别在于可能在生物测试系统内直接筛选抑制作用，和需要对原文库进行繁重的节断工作以鉴定出最初引起抑制作用的物质。最后，位置组合肽抑制剂文库的特征之一即可能是有利也可能是不利的，因为对于这类文库在生物系统内诱导产生抑制性反应的功能背景尚不确定，即，抑制肽可能不是蛋白酶的抑制剂，而另有其它调控功能。
Eggleston和Mutter就生产模拟抑制性肽的抑制剂的方法在“Chemistry inBritain”May 1996,P.39-4118中有综述。其中所述的技术可以用于以上述方法鉴定肽。
使用蛋白酶的反义探针的优点可以分为两个主要方面，早期方面和晚期方面。反义探针是评价相应蛋白酶在生物过程中作用的重要工具，因为它们能够用于研究早期，即除了该蛋白酶的寡核苷酸序列之外其它什么都不知道的时候，而且这通常具有高度的特异性，即，如果反义探针和试验条件合适，与其它蛋白酶交叉反义的危险性很小。在细胞和组织培养物中进行评价时，反义探针成功地用于了抑制成纤维细胞的MMP合成(Lin等，19959)，并且干扰破骨细胞的质子泵活性(laitala和Vaananen,19948)。使用反义探针的另一方面是它们可以用于治疗因特定基因过表达引起的疾病。就特异性降低蛋白酶水平而言，使用MMP的反义探针的基因疗法可望是有效的。
在鉴定了破骨细胞的抗体衍生或合成肽模拟抑制剂后，可以随后对该化合物进行适当的修饰，以确保其用作治疗骨代谢病的药物的用途。有几条特征是必需的，具体地说，被活生物体充分吸收并具有足够的稳定性以确保疗效；足够的组织或细胞特异性，以确保与对非靶位置的作用相比较，其对生物体的靶位置具有最大的作用，其中包括可接受的副作用；和就治疗而言药理学上可接受的剂量-和时间-应答关系。
为了避免化合物的降解，给动物和人使用蛋白酶、肽和肽类物质时需要使用肽的保护性给药途径和/或保护性制剂。虽然用于口服的肽和肽类药物的保护胶囊技术正在经历着显著的改进，但最好在给药前将药物本身稳定化。就肽模拟MMP抑制剂而言，这可以通过对最早鉴定到的化合物进行不严重改变其抑制活性的化学修饰来做到(Brown和Giovazzi，19954和P.D.Brown personal communicationsJune 1996)。
一般有两种方法将蛋白酶抑制剂定向于破骨细胞和破骨细胞前体细胞。其一，抑制剂因其本身固有的特异性与所述细胞上的蛋白酶反应，原因或者是靶细胞上的蛋白酶特别容易被抑制剂所接触到(因为，例如，细胞的位置、细胞内蛋白酶的位置或只是因为蛋白酶的局部高浓度)，或者是蛋白酶被上述细胞表达时不同于被其它细胞和组织表达的蛋白酶(因为反应后修饰作用)。获得特异性的另一途径是通过制造杂和分子或交联体，其中将药物中具有蛋白酶抑制特性的部分与具有特定细胞或组织特异性的抗体或配体部分组合。这样的杂和分子可以通过克隆杂交cDNA后重组表达融合蛋白来制造。例如，一条cDNA编码破骨细胞特异性配体降钙素(或其受体结合部分)，可将它与另一条编码某破骨细胞蛋白酶肽抑制剂的cDNA连接。杂交分子还可以是两个分子的交联体，例如将对骨内羟基磷灰石具有高度亲和性的氨基-二膦酸酯，或将对暴露于破骨细胞膜表面的某成份(例如降钙素受体)具有特异性的抗体与肽或肽模拟蛋白酶抑制物化学连接。
以下将参照实施例和附图对本发明进行进一步的说明。其中：
图1是在家兔破骨细胞内鉴定得到的MT1-MMP或MT1-MMP类似物的核苷酸序列(SEQ IN NO.3)和推定氨基酸序列(SEQ IN NO.4)；
图2显示在家兔破骨细胞内鉴定的新的MT-MMP的氨基酸序列(SEQ INNO.4)与先前报道的人(SEQ IN NO.5)、大鼠(SEQ IN NO.6)和小鼠(SEQ INNO.7)MT1-MMP的氨基酸序列之间的比较。在4种蛋白质中具有氨基酸相同的位置以*标记；
图3以图的方式显示三种MT1-MMP cDNA构建体的结构和实施例3-2中所用的相应对照构建体的结构；
图4显示在家兔破骨细胞中鉴定的MMP-12或MMP-12类似物的核苷酸序列(SEQ IN NO.8)和推定氨基酸序列(SEQ IN NO.9)。
图5显示家兔破骨细胞内鉴定的新的MMP12的氨基酸序列(SEQ IN NO.9)与先前报道的人(SEQ IN NO.10)、大鼠(SEQ IN NO.11)和小鼠(SEQ INNO.12)MMP12的氨基酸序列之间的比较。在4种蛋白质中具有相同氨基酸的位置以*标记；
图6以图的方式显示MMP12 cDNA构建体的结构和实施例3-4中所用的相应对照构建体的结构；
图7显示各种蛋白酶抑制剂对纯化破骨细胞通过胶原覆盖的膜的迁移的作用。其中的值是在没有蛋白酶抑制剂时观察到的迁移数量的相对值。
图8显示MMP抑制剂对于接种在包有或没有明胶的牙质切片上的纯化破骨细胞形成吸收凹的作用。其中的值是与没有明胶包层和MMP-抑制剂时的对照值。
图9显示来自免疫小鼠的血清对MMP-9蛋白水解活性的剂量依赖性抑制作用，所述小鼠是单用交联fcmta-肽RSGAPVDQMFPGVPL(SEQ IN NO.13)(肽B，模拟家兔MMP-9血红素结合蛋白区)免疫，或与纯化的完整家兔破骨细胞前-MMP-9一起免疫。用来自非免疫小鼠的血清和来自用另一种非相关性的femta-肽(肽A)免疫的小鼠的血清，没有观察到抑制作用。其中的值是合成猝灭荧光底物Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2(Bachem)(SEQ ID NO.14)与纯化活性MMP-9及适当稀释的9种不同血清(非免疫的或用非相关性femta-肽免疫的)的预培养混合物孵育30分钟后产生的相对荧光度平均值；
图10显示用MMP-9或枯草杆菌蛋白酶与(A)MR2：Abz-G-P-L-G-L-Lnor-A-R-Y(NO2)NH2(SEQ ID NO.15)或(B)CL1:Abz-S-K-Y-P-J-A-L-F-Y(NO2)-D(SEQID NO.16)连续荧光计试验测定的酶水解初速度与底物浓度之间的关系。试验在37℃，pH7.5进行，在λex=320nm和λem=425nm处读取荧光。肽的来源和动力学参数见表1；
图11显示MMP-抑制剂RP59749对CL1的水解有抑制作用，而半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64则没有。MMP-9(80pmol)或枯草杆菌蛋白酶(3.4pmol)与RP59749或E-64以40μl总体积在37℃孵育5分钟。然后，加入1ml2.8μM的CL-1并孵育2至70小时。所示的是抑制剂的最终浓度。
图12显示羟基脯氨酸的膦酸酯(phosphinate)类似物的合成方法，后者用作以后产生羟基脯氨酸-甲硫氨酸膦酸酯伪二肽(见图13)的构建基材。反式羟基脯氨酸的膦酸类似物由D-或L-赤铜酸(erythronate)钾合成。在2位和4位被溴化以后，该酸以甲醇猝灭转化为甲基酯。通过氢溴酸钠还原反应还原2位，将酯转化为醇。大部分醇被次氯酸钠氧化成醛，并与三苯甲胺缩合。所得的亚胺与二-三甲基硅烷基氧基膦反应得到膦酸酯。在酸水解和溴的分子内取代之后得到游离的羟基脯氨酸；
图13显示用于制备PEGA微珠磷酸酯抑制剂文库Ⅱa(见实施例6c)的羟基脯氨酸-甲硫氨酸膦酸酯伪二肽的合成方法。用苄氧基羰基氯衍生羟基脯氨酸的膦酸类似物(见图12)。由二乙基丙二酸酯碳酸钠去垢作用和与甲基巯基乙基氯反应制得2-亚甲基-4-甲基巯基丁酸乙酯，然后在哌啶存在下，进行选择性碱性酯水解、酸脱羧和与甲醛反应。这些反应可以大规模进行。与羟基脯氨酸的膦酸类似物的反应生成二肽异硬脂酸膦酸酯。通过与溴金刚烷(adamantyl)反应保护该膦酸酯，然后用氢氧化钠进行酯水解。氢解切下Cbz基团，游离的胺通过与FmocCl和碳酸钠反应被保护；
图14显示用于制备PEGA微珠磷酸酯抑制剂文库Ⅱb(实施例6c)的甘氨酸-亮氨酸膦酸酯伪二肽的合成方法。由三苯甲胺和甲醛合成甘氨酸的膦酸类似物，然后与由膦酸铵和六甲基二硅氮烷(disilazane)生产的二-三甲基硅烷基氧基膦反应。产物用酸水解去保护，并用苄基氧基羰基氯衍生。由二乙基丙二酸酯碳酸钠去垢作用和与异丁基溴反应制得2-亚甲基-4-甲基戊酸乙酯，然后在哌啶存在下，进行选择性碱性酯水解、酸脱羧和与甲醛反应。与甘氨酸的膦酸类似物反应生成二肽异硬脂酸膦酸酯。通过与溴金刚烷反应保护该膦酸酯，然后用氢氧化钠进行酯水解。氢解切下Cbz基团，游离的胺通过与FmocCl和碳酸钠反应被保护；
图15显示基于羟基脯氨酸-甲硫氨酸膦酸酯伪二肽的PEGA微珠磷酸酯抑制剂文库Ⅱa的开发与结构。看不见的猝灭的荧光底物(在此是：Ac-Y(NO2)PLJMKGK(Abz)G-“接头”-)(SEQ ID NO.17)和随机可变膦酸酯抑制剂(在此是：X1X2Jp/cMX3X4-“接头”-)分别与PEGA微珠结合。或者，可以利用一FmocLys(Aloc)残基来正交保护和掺入这两种化合物，文库合成和底物的次序可以颠倒。这就可能用多种底物来利用同一文库。用对应于MR1的不可变底物(见表3)和随机可变膦酸酯抑制剂X1X2GP/cLX3X4-“接头”-，以类似方法制备类似物文库(Ⅱb)；
图16显示在位置组合五肽抑制剂文库存在下对培养4天的胎鼠跖骨培养物45Ca2+释放的抑制作用。来自5个选定文库的结果显示为序列X-X-D-X-X。在这5中情况中，D是D-异亮氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-丝氨酸或D-色氨酸，X是随机可变L氨基酸。与具有D-lys和D-ser的文库不同，在第三位具有D-ile、D-leu或D-trp的五肽文库诱导骨吸收的明显降低。MMP-抑制剂RP659749被作为阳性对照。实施例1破骨细胞蛋白酶编码片段的cDNA的分离
以下研究举例说明了在PCR中利用简并核苷酸引物对(根据描述蛋白酶氨基酸序列的现有资料设计而成)来克隆破骨细胞蛋白酶，由此鉴定了家兔破骨细胞内的MMP-9,MMP-12和MT1-MMP mRNA：a．破骨细胞的分离和纯化
根据原有技术但是略加改进，从10日龄的家兔(125-150g)分离破骨细胞(Tezuka等，199215)。简而言之，通过粉碎和机械搅拌从抽去骨髓的长骨和肩胛骨中分离骨细胞。离心(30×g,5分钟)制备富含破骨细胞的非分级分离骨细胞，并将其接种到组织培养皿上。放置90分钟后，去除非粘附细胞，在37℃、5％至7.5％CO2中，在补加有5％胎牛血清的a-MEM(pH7.3)中继续孵育20小时。用PBS洗涤细胞，然后用0.001％链霉蛋白酶E和0.02％EDTA处理约10分钟，藉此释放出全部非破骨细胞。纯化的破骨细胞再培养2小时，然后分离mRNA。b．用PCR扩增MMP cDNA片段，分子克隆和同源性分析
为了鉴定家兔破骨细胞可能的MMP基因表达，用根据MMP基因的保守区设计的简并引物，进行PCR，从纯化破骨细胞mRNA逆转录得到cDNA。简而言之，用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)制备纯化破骨细胞的聚(A)+RNA；用cDNA合成试剂盒(Pharmacia)从mRNA合成单链cDNA；用简并引物对各等份的合成cDNA进行PCR扩增，所述引物对应于MMP家族大多数成员都有的半胱氨酸开关区内的保守氨基酸序列(SEQ ID NO.19)或类似弗林蛋白酶切割位点的区域(RRKRYA(SEQ NI NO.19)和催化区(GDXHFDXXE(SEQIDNO.20)，其中X是可变氨基酸)。PCR如下循环45轮：94℃1分钟，55℃1分钟，74℃ 1分钟。经1％琼脂糖凝胶电泳得到三条cDNA条带，长度分别为330-340,380-390和560-570bp。根据指导手册，纯化cDNA，克隆到pCRⅡ载体内(Invitrogen,San Diego,CA)，然后用核苷酸测序法进行分析。
家兔破骨细胞高表达MMP-9 mRNA是众所周知的，根据以往对MMP-9基因的分析，在此处PCR中用简并引物扩增得到的MMP-9 cDNA片段估计其大小应为336bp。我们的克隆和其后的核苷酸测序证实，分离的330-340bp的cDNA源自MMP-9。
克隆分离的560-570bp cDNA，得到一个长度为567bp的克隆B4，根据核苷酸测序，发现其与人金属弹性蛋白酶(MMP-12)基因具有80％以上的相似性。以前，在对破骨细胞cDNA文库随机选取的cDNA部分测序时，初步在家兔破骨细胞内鉴定到了编码MMP-12的mRNA的存在(Sakai等，199512)(见实施例3-4)。
克隆分离的380-390bp cDNA，得到另一长度为387bp的克隆A3，它与人MT1-MMP(以前报道存在于癌细胞内)(Sato等，199413)的cDNA序列具有90％以上的相似性。因为迄今，未曾在破骨细胞内鉴定到MT-MMP或任何其它膜结合蛋白酶，该实施例其余部分及实施例2将描述对破骨细胞内A3和MT-MMP的研究。c．从破骨细胞cDNA文库分离MT1-MMP的cDNA
用随机引物产生的32p标记的A3PCR产物为探针，通过集落杂交筛选家兔的cDNA文库(Tezuka等，199415)。经对1×105个克隆的筛选，鉴定到一个阳性克隆，根据指导手册将其加入质粒中(Stratagene,λZAP载体)。该阳性克隆含有一段经分离和测序的1,842bp的DNA插入片段。在其中找到一个1716bp的开放读码框，从第127位核苷酸处的密码子ATG开始。根据基因库搜索，其中没有与之完全一致的核苷酸序列，与人MT1-MMP基因的相似性最高，为91％。图1显示该克隆插入片段的核苷酸序列。该插入片段的推定氨基酸序列与人MT1-MMP的相似性为96％(图2)。在与其它动物的MT1-MMP比较时，没有特定序列的加入或缺失。根据与其它物种MMP的进一步比较，我们的结论是分离得到的新cDNA，编码了MT1-MMP或与其密切相关但从未报道过的人破骨细胞MT-MMP的家兔同源体。d．核苷酸序列分析
利用双脱氧链终止法根据双链确认了A3 PCR片段和来自cDNA文库的家兔MT1-MMP cDNA的核苷酸序列分析，使用的是Qiagen纯化的质粒DNA(Qiagen，USA)，测序试剂盒(U.S.B.，USA)，和pBluescript SK引物(Stratagene,USA)或合成的寡核苷酸引物。实施例2破骨细胞内MT1-MMP的鉴定
以下实施例所述的研究进一步证实了破骨细胞MT1-MMP的新鉴定：a．用于制备RNA的细胞和器官
分离10日龄家兔的脑、肾、肝、肺、颅盖、脾和齿槽巨噬细胞。将非分级分离的家兔骨细胞培养在含10％FBS的α-MEM培养基中生长至铺满，从此培养物获取骨基质细胞(Tezuka等，199215)，然后传代4次。在各种情况下，均按照已有技术(Tezuka等，199215)，制备总RNA。b.Northern印迹法
为了研究纯化破骨细胞内MTl-MMP的mRNA表达，并将表达水平与其它组织和细胞内的相比较，我们进行了Northern印迹法。从各种器官和细胞分离总RNA，取5微克在甲醛琼脂糖凝胶电泳后印迹到尼龙薄膜上，与放射性探针杂交。用A3 PCR片段，和人MT1-MMP的一段cDNA片段(第1647至2880位，Sato等，199413)以及对应于28S核糖体RNA的一段合成寡核苷酸(为了定量标准化)作为探针。用[α-32P]dCTP，采用多引物DNA(multiprime DNA)标记系统(AmershamInternational plc.,Buckinghamshire,England)放射性标记cNDA探针，用[γ-32p]ATP，利用5’末端标记试剂盒(Amersham)放射性标记该寡核苷酸探针。按照已有技术(Tezuka等，199215)进行杂交，用Phosphorimager SF(Stratagene,La Jolla,CA)显影。对于两种MT1-MMP探针，我们发现其分布模式，与先前就成年人组织所报告的相同(Takino等，199514；Will和Hinzmann，199517)，此外还发现MT1-MMP主要在纯化的破骨细胞内表达。值得注意的是，在肝和脑中没有测得表达，在骨基质细胞和齿槽巨噬细胞内发现有低表达。c.原位杂交
通过家兔跖骨切片上的原位杂交，测定了破骨细胞内MT1-MMP的体内表达。按照已有技术，制备连续性新生家兔的掌骨石蜡切片(Blavier和Delaisse,19953)。将一段家兔MT1-MMP cDNA片段(1至318位，对应于MT1-MMP非编码5’区126个核苷酸和编码MT1-MMPN末端的区域内192个核苷酸)用于合成探针。使用DIG RNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)，按照指导手册制备洋地黄毒苷标记的反义或有义RNA探针，并与抗酒石酸磷酸酶染色(Blavier和Delaisse，19953)的石蜡切片比较。许多抗酒石酸磷酸酶阳性多核细胞为MT1-MMP阳性，不管它们附着于钙化的软骨还是硬骨。d．免疫细胞化学
过去研究的非破骨细胞细胞内MT1-MMP的重要特性是它们集中于质膜内。采用免疫细胞化学在蛋白质水平上研究了MT1-MMP的表达，及其在破骨细胞中的细胞内分布。将非分级分离家兔骨细胞接种到玻璃盖玻片上。培养1.5小时后，弃去不粘附的细胞，留下的细胞培养1至18小时，固定和加工后用于免疫细胞化学试验。它们在1-3μg/ml单克隆MT1-MMP抗体113-5BT(Fuji ChemicalIndusties,Ltd.,Takoaka,Japan)存在下培养90分钟。该抗体是针对氨基酸序列为CDGNFDTVAMLRGEM(SEQ ID NO.21)的合成肽的，该肽与对应的家兔序列有一个氨基酸的不同(第10位是家兔的V而不是人的M)。罗丹明标记的猴抗鼠IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.West Grove,PA)稀释200倍后用作第二抗体。当破骨细胞与抗MT1-MMP抗体一起培育时，我们在质膜的特定位置发现了荧光。在用非免疫IgG取代MT1-MMP抗体时，不呈现荧光。所有发光信号都集中于细胞与其底物接触的焦平面内。在移动细胞内，主要是lamellopodia两极发光。在铺展(spread)细胞内，信号以小点形式在细胞周边排列成环。这种方式令人想起足体(podosome)，这是当破骨细胞附着时，质膜略微伸展，变多而且以这种特殊形式组成足体。为了确定MT1-MMP与足体是否相关，我们在与第二抗体培育期间，加入10mg/ml荧光素标记的鬼笔毒环肽(Phalloidin Sigma，SaintLouis，MO)以同时进行细胞肌动蛋白染色。被广泛用于鉴定足体的肌动蛋白染色显示与用抗MT1-MMP抗体时相同的光点环。所以，MT1-MMP看来集中于足体上。但是，与清晰的肌动蛋白染色相比，MT1-MMP染色多少有些模糊，这可能是因为肌动蛋白丝束位于足体的中心，且其取向垂直于附着面，而MT1-MMP可能位于足体的表面。正如预计的，和使用抗MT1-MMP抗体一样，肌动蛋白染色也使得lamellopodia两极发光。在骨切片上培养破骨细胞时也发现类似的MT-MMP分布。所以，以上发现不仅证明在破骨细胞质膜内有蛋白水平的MT1-MMP存在，而且为MT1-MMP在质膜上的确切定位提供了新的信息，即定位在lamellopodia和足体的水平上。实施例33-1破骨细胞蛋白酶的产生、纯化和活化
正如发明概述中所述，破骨细胞蛋白酶的产生可以在破骨细胞培养物内进行，也可以在转染了编码破骨细胞蛋白酶或其部分的cDNA的细胞系中进行。在各种情况下都需要对产物进行纯化，当产生的是蛋白酶的潜在性酶原形式时，为了某些目的，还需要随后的活化。为了举例说明该过程，以下描述进行破骨细胞前-MMP-9的产生、纯化和活化：a．破骨细胞产生前-MMP-9
为了避免血清内蛋白酶和蛋白酶天然抑制剂的污染，家兔破骨细胞于37℃，5％CO2，无血清条件下培养，细胞向培养基内分泌92kDa的前-MMP-9。根据利用明胶酶-酶谱研究，在细胞培养物中加入40nM的佛波醇12-豆蔻酸酯13乙酸酯(PMA)，提高前-MMP-9的产量至少3倍。b．破骨细胞前-MMP-9的纯化
通过10kDa截留过滤(Amicon)浓缩破骨细胞条件培养基，再稀释于含0.04％Triton X-100的2.5mM磷酸钠缓冲液中，然后用于羟基磷灰石亲和层析柱(Bio-Rad，Hercules，CA)。通过这一新的MMP纯化法，发现包括前-MMP-9和前-MMP-12的明胶酶原能与羟基磷灰石层析柱有效结合。但是，将磷酸盐浓度提高至5-10mM时，前-MMP-9即被洗脱，而从柱上洗脱其它明胶酶原和明胶酶则需要更高的磷酸盐浓度(20mM以上)。c．破骨细胞前-MMP-9的活化
活化纯化的潜在性前-MMP-9既可用常规方法，即与1mM(4-氨基苯基)乙酸汞(APMA)在37℃孵育2至8小时，也可用催化性酶谱中所见的明胶酶活化的方法。在后一种方法中，对纯化的前-MMP-9进行制备型SDS-PAGE板明胶电泳。然后用Triton X-100替换SDS，将凝胶在含有50mM Tris-HCl,pH7.5,5mM CaCl2,1μM ZnCl2和1％Triton X-100的缓冲液中孵育16小时。将对应于分子量约为92+5kDa的化合物(但包括约685kDa的已经活化的MMP-9形式)电泳迁移距离的凝胶部分切下。从切下的凝胶中电泳洗脱活性MMP-9。3-2MT1-MMP融合蛋白的表达和特性分析
用具有外部SnaBⅠ位点的5’引物和具有外部NotⅠ位点的3’引物，PCR扩增编码氨基酸残基Gln40-Glu531,Ec1(包含家兔破骨细胞MT1-MMP的前肽、催化区、铰链区和血色素结合蛋白，但不包括信号肽、跨膜区和细胞质区，见图3)的MT1-MMP cDNA片段。该片段被插入到pGEX-6P-2载体(Pharmacia)的SmaⅠ和NotⅠ位点之间。用具有外部BamHⅠ位点的5’引物和具有外部XhoⅠ位点的3’引物，PCR扩增编码氨基酸残基Gln40-Asn322,Ec2(包含家兔破骨细胞MT1-MMP的前肽、催化区和铰链区，但不包括信号肽、血色素结合蛋白、跨膜区和细胞质区，见图3)和Gln40Leu282，Ec3(包含家兔破骨细胞MT1-MMP的前肽和催化区，但不包括信号肽、铰链区、血色素结合蛋白、跨膜区和细胞质区，见图3)的MT1-MMP cDNA片段。上述片段被插入到pGEX-6P-2载体(Pharmacia)的BamHⅠ位点和XhoⅠ位点之间。用这三种相应构建体在大肠杆菌BL21(Pharmacia)中表达谷胱甘肽S转移酶(GST)。
将用三种PGEX-MT1-MMP表达载体和单独PGEX载体(没有任何插入片段)转化的大肠杆菌BL21培养4昼夜，将培养物以500ml2×YTA培养液(Pharmacia)作1∶100稀释。培养物在37℃生长至OD600=1.0，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至0.1mM的终浓度以诱导表达。30℃培养3.5小时后，沉淀细胞并重悬在25ml冰冷的1×PBS中。其后的步骤都在4℃或在冰上进行。用超声波裂解大肠杆菌细胞(5次脉冲，每次10秒)。在与1％Triton X-100孵育30分钟后，3000rpm离心沉淀细胞碎片。
用GST纯化套件中的谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione Sepharose)4B，根据生产商(Pharmacia)的说明书，通过亲和性层析进行纯化。室温下孵育30分钟，将超声波裂解样品，经离心后获得的上清液吸收在1ml的50％的谷胱甘肽琼脂糖4B浆液(用PBS平衡)上。用1X的PBS洗涤数次后，用900μl谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM还原谷胱甘肽，以50mM Tris-Hcl pH8.0液配)洗脱融合蛋白。洗脱物存放于-20℃待用。
三种融合蛋白在SDS-PAGE中的迁移与大约85、60和55kDa的蛋白质(分别对应于据cDNA推定的大小：87、61和57kDa)相同。用与三种蛋白都反应的抗GST抗体，和与其中的大蛋白反应但不与两种较小蛋白反应的针对MT1-MMP血色素结合蛋白区的抗体，作Western印染，证实这些融合蛋白是GST-MT1-MMP融合蛋白。最后，对它们前肽区的氨基酸序列分析进一步证明这些蛋白是MT1-MMP的截短形式。3-3GST-MT1-MMP融合蛋白被胰蛋白酶或血纤蛋白溶醢活化后的蛋白水解活件
为了获得活性形式的截短MT1-MMP，将Ec1,Ec2和Ec3与胰蛋白酶或血纤蛋白溶酶一起孵育，以去除融合蛋白酶的GST部分和前肽区。a．胰蛋白酶活化
80μl(约20μg)洗脱的Ec1、Ec2、Ec3和纯GST标记稀释液，终体积为100μl，在25℃与5μg/ml胰蛋白酶(Promega)孵育15至60分钟，加入50μg/ml SBTI终止反应。b．血纤蛋白溶酶活化
25μl(约7μg)洗脱的Ec1、Ec2、Ec3和纯GST标记稀释液，最终体积为45μl，在25℃与2.7pmol人血纤蛋白溶酶(Boehringer)一起孵育30分钟，加入10μM抑蛋白酶肽终止反应。c．酶分析
在150mM NaCl,10mM CaCl2,0.05％(v/v)Brij-35(以50mM Tris-HCl pH7.5液配)中37℃孵育180分钟后，通过猝灭荧光肽底物Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2(Baehem)(SEQ ID NO.14)水解的荧光测定(激发波长：320nm，发射波长：387nm)来评价蛋白水解活性(见表1)。d.MMP抑制剂的作用
在上述条件下用胰蛋白酶或血纤蛋白溶酶处理的样品，在内源性MMP抑制剂TIMP-1(16.7μg/ml)或TIMP-2(16.7μg/ml)或合成的MMP抑制剂BB-94(0.8×10-5M,British Biotech)不存在或存在的条件下，37℃孵育30分钟。如上所述评价荧光底物的水解(见表1)。表1．每180分钟内，被胰蛋白酶或血纤蛋白溶酶活化的重组破骨细胞MT1-MMP截短形式，在MMP抑制剂存在或不存在条件下对合成底物的水解作用，以相对荧光单位(RFU)表示RFU/180分钟         胰蛋白酶活化的         血纤蛋白溶酶活化的
           -抑制剂 + TIMP-1 + TIMP-2 + BB94 -抑制剂 +BB94
Ec1        139.4       ND       ND      6.7   27.5   2.9
Ec2        172.4       148      7.1     6.0   104    3.2
Ec3        9.6         ND       ND      6.9   4.1    3.8
pGEX       8.6         ND       ND      6.8   3.8    3.5ND：没有进行3-4家兔破骨细胞MMP-12的克隆、重组表达、活化和特性分析
因为MMP-12在巨噬细胞内表达并用于细胞入侵，以及造血干细胞是破骨细胞和巨噬细胞的共同来源，我们检测了MMP-12是否也在破骨细胞内表达。如实施例1b和本实施例所示，情况的确如此，所以，我们估计，MMP-12在破骨细胞入侵和迁移中起着和在巨噬细胞中类似的作用。
就MT1-MMP cDNA而言(见实施例1，3-2和3-3)，从家兔破骨细胞cDNA文库中分离出MMP-12 cDNA并测序，然后进行MMP-12融合蛋白的表达、特性分析和重组生产。简言之，从家兔长骨获得破骨细胞制备物，采用基于MMP家族保守区的简并引物，PCR扩增这些破骨细胞的逆转录mRNA(见实施例1b)。在预定大小的数个PCR片段中，一个(B4)表现出与人MMP-12序列的同源性。用基于B4克隆PCR产物的随机引发的32P标记探针，筛选家兔破骨细胞cDNA文库时，鉴定到数个阳性克隆。其中之一含有一段1,792bp的cDNA插入片段，该片段包括一个编码464氨基酸多肽的开放读码框，该多肽与人、大鼠和小鼠MMP-12的同一性分别为74％，66％和65％(见图4和图5)。根据这一比较以及与其它已知蛋白序列的进一步比较，我们的结论是，分离得到的新cDNA，编码了MMP-12或一个密切相关但从未报道过的人MMP的家兔同系物。对B4 PCR片段和cDNA文库的家兔MMP-12 cDNA进行核苷酸序列分析，如同对MT1-MMP所述的那样做(见实施例1d)。用该cDNA作为探针进行Northern印迹法，我们比较了家兔各种细胞和组织内(包括颅盖、脑、胎盘、肺、肝、脾、肾、骨基质细胞、齿槽巨噬细胞和纯化破骨细胞)MMP-12的表达水平。有趣的是，在纯化破骨细胞内的表达水平和在巨噬细胞内的一样高，而在其它细胞和组织中几乎检测不到表达。为了确定在体内，MMP-12是否也在破骨细胞内表达，我们在新生家兔掌骨切片上进行了原位杂交，清晰地确定了在典型的破骨细胞中有MMP-12。
为了表达和特性分析MMP-12融合蛋白，用有义引物5’-CGGGATCCCTGTGGGTCACT TCTTCT-3’(SEQ ID NO.22)和反义引物5’-CCGCTCGAGCTGGCACCATT ACTAGC-3’(SEQ ID NO.23)对包含开放读码框(bp58-1437，见图4)的家兔MMP-12 cDNA进行PCR扩增。将该cDNA片段插入pGEX-6P-2载体的BamHⅠ位点和XhoⅠ位点之间，如同对MT1-MMP所述的那样。经直接序列分析证明，该cDNA正位于载体内GST编码部分的5’端，而且在具有质粒翻译起始位点的合适读码框内(见图6)。
单独用pGEX-6P-2(对照载体)和用pGEX-6P-2/MMP-12转化大肠杆菌BL-21，接种一在Luria肉汤(LB)琼脂板(含50μg/ml氨苄青霉素)上，37℃培养过夜。在30℃振荡培养箱内，将单菌落在含50μg/ml氨苄青霉素的50ml LB中培养过夜。然后，通宵培养物在400ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释100倍，并在30℃生长至OD=0.6-1.0。加入最终浓度为0.1mM的IPTG(Sigma)以诱导融合蛋白的产生，细胞在培养中再维持3小时。
将细胞沉淀重悬在含有2mg/ml溶菌酶的20ml Tris-HCl缓冲液(2mM CaCl2溶于25mM的Tris-HCl,pH7.6)中，然后在冰中超声波裂解1分钟(6次脉冲，每次8秒)。超声波裂解后，加入1ml20％的Triton X-100,4℃连续抽提30分钟。以20,000×g离心10分钟后，用于SDS-PAGE的融合蛋白就存在于沉淀中(估计分子量大约为75KD，与cDNA推测的83KD大小较为接近)。将该沉淀溶于含8M尿素的20ml缓冲液中，4℃搅拌1小时，4℃40,000×g离心30分钟澄清样品。然后，取上清液以Tris-HCl缓冲液作分步透析彻底去除尿素。取上清液做SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝R250染色蛋白质。使用抗GST部分的抗体以Western印迹法证实融合蛋白的表达。分级分离和随后的氨基酸序列分析确证重组家兔MMP-12蛋白质的存在。弹性蛋白和明胶酶谱证实了截短重组MMP-12的弹性蛋白水解活性。实施例4评价破骨细胞MMP在破骨细胞迁移中的作用
在骨组织培养物中，我们已经证明,MMP对破骨细胞更新至未来吸收位置十分重要(Blavier和Delaisse,1995)，但是，迄今为止，破骨细胞纯化技术仍不能证明这些MMP是来自破骨细胞还是其它细胞。所以，为了论述后一问题，我们开发了一种实验模型。简而言之，我们将纯化和非纯化破骨细胞接种到涂有Ⅰ型胶原的薄膜(孔径12微米)上，在MMP抑制剂存在或不存在的情况下培养通宵后，监测它们向薄膜下表面的迁移。我们发现，不仅在使用非纯化破骨细胞制备物时，而且在使用纯化破骨细胞制备物时，破骨细胞都能够将细胞过程延伸到膜的孔内，并在膜的下表面扩散。该迁移过程受合成伪底物型(RP59794和BB94)和天然(TIMP-2)MMP抑制剂的抑制(见图7)。这表明，通过一个MMP依赖性途径，无需其它细胞的参与，破骨细胞本身能够通过穿越明胶层的迁移来克服胶原屏障。
为了评价与其它蛋白酶相比，MMP对于该迁移过程有多重要，我们还测试了其它蛋白酶抑制剂对该迁移的作用。在次破骨细胞吸收区作为骨基质降解强力抑制剂的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，只对迁移略有影响，而丝氨酸蛋白酶抑制剂对此无任何作用(见图7)。所以，与其它蛋白酶相比，MMP在破骨细胞迁移中起着独一无二的作用。
为了证实MMP在完整的迁移/吸收过程中的作用，我们将纯化破骨细胞接种到牙质切片上，切片涂有或没涂有Ⅰ型胶原，在MMP抑制剂存在和不存在的情况下，将它们培养通宵，并监测牙质切片上吸收凹的形成。我们发现，MMP抑制剂只在涂有胶原的牙质切片上抑制吸收凹的形成(图8)。这清楚地表明，MMP的作用在于使破骨细胞向其将来的吸收位置迁移，而不是在骨吸收本身。实施例5MMP抗体的制备、分析和应用
两种方法用来产生抗MMP抗体。一种方法中，完整的或截短的、天然的或重组的MMP用作免疫原(见下文)，另一方法中，将模拟特定MMP区域的合成肽与大载体蛋白交联，然后用作免疫原(见下文b-d)：a．完整或截短MMP免疫原的制备和使用
作为第一种方法的实施例，如实施例1-3所述由破骨细胞培养物纯化得到的前MMP-9以其潜在形式，或以APMA激活或在SDS/Triton-X-100凝胶内处理激活后，用于免疫接种。每镉三周给雌性BALB/c-CF1杂交鼠腹膜内注射前MMP-9和MMP-9制备物。在脾切除3天之前，用无佐剂的蛋白质进行最后一次加强免疫。按照标准程序，在50％聚乙二醇4000存在下，取脾细胞与P3-X-63-Ag,8.653骨髓瘤细胞融合，并繁殖和克隆所得的杂交瘤细胞。用蛋白A亲和层析法从杂交瘤培养的条件培养液中纯化单克隆抗体。b．交联MMP模拟肽免疫原的制备
根据破骨细胞MT1-MMP的氨基酸序列(图1和2)和已知的MMP家族其它成员(例如MMP-9和MMP-12)的序列，根据以下特性选择15聚体(femtameric)序列(即有15个氨基酸构成的多肽序列)：
1．与MMP家族其它成员相比，它们对MMP家族的一个成员有特异性；
2．根据计算机运算推定的免疫原特性，该算法用于分析它们在完整MMP内的亲水性、位置和估计的二级结构；和
3．它们的保守性，即它们与人、家兔和小鼠相同MMP对应区序列的一致性或相似性。
根据选定的15聚体序列，在全自动肽合成仪中，在催化量的3,4-二氢-4-氧-1,2,3-苯并三嗪-3-基存在下,用Fmoc-氨基酸-O-五氟苯基酯合成15聚体肽。
将15肽与蛋白类载体分子(甲状腺球蛋白)交联。简而言之，甲状腺球蛋白与甘氨酸酐(1∶2w/w)在0.1M硼酸钠(pH9.0)中20℃孵育2小时，然后在Nap10/Sephadex G-25层析柱(Pharmacia)上脱盐，并真空离心干燥。载体重溶在0.01M磷酸钠(pH5.0)中，与等体积的新鲜制备的5mg/ml1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(CDI)20℃孵育3分钟。CDI活化的甲状腺球蛋白与等体积且等量(w/w)的15肽在0.2M磷酸钠(pH9.0)中，20℃孵育4小时。透析甲状腺球蛋白/CDI/15肽交联物，并测定其蛋白质含量。c．用交联肽免疫原产生多克隆抗体
将甲状腺球蛋白/CDI/15肽交联物与Freunds不完全佐剂混合，每月一次肌内注射雌性新西兰白兔。采集血样，并用硫酸铵沉淀法从血清中纯化免疫球蛋白组分。d．用交联肽免疫原产生单克隆抗体
将甲状腺球蛋白/CDI/15肽交联物与Freunds不完全佐剂混合，每三周腹膜内注射雌性BALB/c-CF1杂交鼠。在脾切除前3天，用不含佐剂的交联物进行最后的加强免疫。按照标准程序，在50％聚乙二醇4000存在下，取脾细胞与P3-X-63-Ag,8.653骨髓瘤细胞融合，并繁殖和克隆所得的杂交瘤细胞。用蛋白A亲和层析法从杂交瘤培养的条件培养液中纯化单克隆抗体。e．特异性抗MMP抗体的分析和使用
在96孔聚苯乙烯测试板上包被纯化的完整的MMP，或截短的MMP，或同源或异源的15肽交联物，进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，选择抗血清和单克隆抗体，并进行初步分析。如前所示，根据ELISA初步分析显示MMP特异性的抗血清和单克隆抗体具有多种用途。实例之一是，通过将抗MMP抗体与骨细胞或骨组织一起孵育，它们可用来对MMP表达在蛋白质水平上进行免疫组织化学鉴定。如实施例2d所述，用破骨细胞富含肌动蛋白膜区的MT1-MMP模拟肽免疫产生的单克隆抗体的结合，显示MMP抗体不仅是鉴定产生特定MMP细胞的最重要工具，而且可以显示MMP的细胞内位置，由此帮助阐明其生物学作用。
用甲状腺球蛋白交联的/15肽RSGAPVDQMFPGVPL(SEQID NO.13)(对应于家兔MMP-9血色素结合蛋白区内的一段)免疫小鼠，用同一交联物或用纯化的天然破骨细胞前MMP-9加强免疫，获得的血清表现出对活化MMP-9的抑制作用。将稀释血清与MMP-937℃预培30分钟，然后与合成的类肽底物Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2(Bachem)(SEQ ID NO.14)在150mM NaCl,10mM CaCl2,0.05％(v/v)Brij-35(以50mM Tris-Hcl pH7.5溶液配)中37℃孵育30分钟，在此基础上进行荧光测定酶学试验作出上述分析(见图9)。实施例6破骨细胞蛋白酶非免疫球蛋白抑制剂的生产
破骨细胞蛋白酶非免疫球蛋白抑制剂的生产主要以两类药物为目标，其一是肽或肽模拟蛋白酶抑制剂，另一类是特异性结合破骨细胞蛋白酶mRNA的反义探针。肽和肽模拟药物用两种方法生产：其一是基于PEGA微珠肽底物和抑制剂文库的技术(见下文a-c)，另一种是基于位置组合肽抑制剂文库的技术(见下文d-e)。f中说明了反义探针的设计和使用(见下文)：a．利用PEGA微珠文库鉴定MMP底物
根据已有技术说明(Medal等，199410)，产生了两个PEGA微珠肽底物文库，各含有大约106个不同微珠。每颗微珠含有一条序列的多份拷贝：NX1-X2-Y(NO2)-X3-X4-X5-X6-X7-X8-K(Abz)c-PEGA(PEGA微珠底物文库A)或NX1-X2-Y(NO2)-X3-X4-X5-X6-K(Abz)c-PEGA(PEGA微珠底物文库B)，其中的X1至X8是珠与珠之间随机变更的氨基酸，Y(NO2)和K(Abz)分别是猝灭3-硝基酪氨酸和产荧光赖氨酸(2-氨基苯甲酸)。将二文库在37℃与纯化并活化的破骨细胞前MMP-9(约0.1μM)一起孵育，然后在荧光显微镜下用微量移液管分离出产荧光的微珠。用氨基酸测序仪分析分离的微珠。
随机PEGA微珠底物文库的孵育鉴定出15颗明显发荧光的微珠，表明相比于文库内众多其它结构对应肽受到了特异性切割。被切割底物的氨基酸序列显示出某种一致性(见表2)。特别是，从切开位点的N末端起第3位脯氨酸是高度保守的。
表2．
由PEGA微珠文库(A)和(B)鉴定得到的猝灭产荧光肽底物的氨基酸序列和切割位点切割位点
   微珠 P7    P6  P5  P4    P3  P2  P1    P1’   P2’ P3’ P4’ P5’
    A2     S  K  Y’     P  J  A     L     F  F  K’
    A3  S     R  Y’  ?     P  J  G     L?     T  K’
    A5  W     G  Y’  E     A  J  G     F     T  K’
    B1     A  R  Y’     P  K  K     V     K’
    B2     N  J  Y’     P  J  J     Y     K’
    B3     Y  I  Y’     P  J  M     L     K’
    B5     R  P  Y’     P  Y  ?     K     K’
    B6     L  K  Y’     P  K  ?     L     K’
    B7  F     A  Y’  J     M     R  ?  K’
    B8  P     A  Y’  M     K     K  M  K’
    B9     P  L  Y’     M     S  ?  J  K’
    B10     P  V  Y’     M     R  G  J  K’
    B11     V  R  Y’     L     H  G  J  K’
b．利用PEGA微珠底物文库技术鉴定对肽的可溶性肽类似物的合成与分析
为了进一步评价与PEGA微珠结合的肽底物观察结果，用多柱肽合成法合成了一系列可溶性肽底物(Medal等，199411)。这些推定可溶性底物的氨基酸序列以单肽底物序列或根据PEGA微珠研究发现的共有序列为基础。利用标准荧光测定试验(激发波长：320纳米，发射波长：425纳米)分析可溶性肽受MMP-9和其它MMP水解的情况。
例如，从PEGA微珠肽底物文库分离得到的一个荧光微珠(表2中的A2)包含两条相似的肽，序列分别为：S-K-Y(NO2)-P-J-A-L-F-F-K(Abz)-PEGA(SEQ IDNO.2)和L-F-F-K(Abz)-PEGA(SEQ ID NO.24)，表明新的肽模拟底物S-K-Y(NO2)-P-J-A-L-F-F-K(Abz)(SEQ ID NO.2)在P1-P1’位置：A-L处被破骨细胞MMP-9水解。根据这一信息，合成了多条可溶性猝灭荧光肽(例如，CL-1和CL-6，见表3，以及图10和11)。将类似策略运用于在PEGA微珠底物文库A和B中鉴定的底物的其它氨基酸序列，用多柱肽合成法合成了头30种可溶性猝灭荧光肽作为MMP-9的候选底物(命名为CL-1至CL-30)。在37℃将其与破骨细胞的MMP-9和重组的截短MT1-MMP共温，并与作为对照的重组截短MMP-1和-3、破骨细胞半胱氨酸蛋白酶、降钙素K；和广谱反应性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶一起共育，测定了它们各自的动力学特性(Kcat和Km)。迄今合成的30种合成底物中有几个表现出对某一个或多个MMP的高度选择性；与降钙素K不反应或反应性极低；对MMP-9的Kcat/Km之比，较枯草杆菌蛋白酶高50倍。肽底物CL-21,CL-25和CL-29表现得尤其明显(参见表4)。而且，根据受MMP-9特异性切断的这30条肽获得的序列信息，和根据并非如此的其它肽获得的信息，设计出的肽底物可望导致合成选择性更高的其它合成性MMP底物。
对30个可溶性推定肽底物中的一些底物而言，其动力学表现与根据固定在PEGA微珠上的对应肽的水解所估计的有所不同。例如，根据伪底物(具有低Km(3.4μM)和低Kcat/Km之比(250M-1S-1))(见表3)估计，推定底物CL-1应该对MMP-9具抑制性。
表3对三种已知可溶性MMP-9底物(B，MR1，MR2)和由PEGA微珠文库B所得的结果设计的
两种可溶性底物(CL-1，CL-6)水解作用的动力学参数
名称     序列和MMP-9切割位点：*     Km(μM)     Kcat/Km(M-1S-1)
   MMP-9 枯草杆菌蛋白酶     MMP-9a 枯草杆菌蛋白酶
   B Mca-P-L-G*L-Dpa-A-R-NH2         (1)     7.4     21.3     9.1×105     1.1×107
 MR1b Abz-G-P-L-G*L-Y(NO2)-A-R-NH2    (2)     7.7     1.6     3.1×105     2.1×106
 MR2b Abz-G-P-L-G*L-Lnor-A-R-Y(NO2)NH2(3)     7.3     4.8     9.0×104     9.6×106
 CL1c Abz-S-K-Y-P-J-A*L-F-Y(NO2)-D    (4)     3.4     7.5     2.5×102     1.6×103
 CL6c S-K-Y(NO2)-P-J-A*L-F-F-K(Abz)-D (5)     20.0     9.5     3.1×102     6.4×104
a：因为缺乏合适的MMP-9标准物，所以对MMP-9的Kcat的估计不很准确。
b：肽B的类似物(Bachem M-1895)
c：根据分离得到的产荧光微珠：A2(见表2)。
1：SEQ ID NO.14
2：SEQ ID NO.25
3：SEQ ID NO.15
4：SEQ ID NO.16
5：SEQ ID NO.2
表4对PEGA微珠底物文库B所得结果设计的三种可溶性选择性MMP-9底物(CL-21，CL-25和CL-29)水解的动力学参数
所述动力学参数是Kcat/Km(μM-1min-1)和与MMP-9对应参数值的相对值(％)
肽     序列 微珠a   MMP-9 枯草杆菌蛋白酶 降钙素K  MMP-1  MMP-3  MT1-MMPb
CL-21  Y’PLJMKGK’G  B8/B9  5.5 100％ 0.09    2％ 0    0％ 0.28  5％ 0.05    1％ 0    0％
CL-25  NJY’PJJYK’G   B2  0.08 100％ 0      ＜6％ 0    ＜6％ 0    ＜6％ 0      ＜6％ 0    ＜6％
CL-29  Y’PJJMK’GJG  B2/B10  0.38 100％ 0.01    3％ 0    ＜2％ 0    ＜2％ 0.01    3％ 0.01  3％
a：这些合成肽是根据PEGA微珠底物文库中部分微珠上肽的氨基酸序列而没计的，所述微珠在与MMP-9孵育后会发荧光(见表2)。
b：以截短重组MT1-MMP，Ec2的胰蛋白酶活化形式为代表。
CL-21=SEQ ID NO.26
CL-25=SEQ ID NO.27
CL-29=SEQ ID NO.28
c.用PEGA微珠文库鉴定MMP抑制剂
根据已有技术(Medal等，199410,Medal&Svendsen,199511,Medal等，1997)，产生了一个包含大约106颗不同微珠的PEGA微珠肽底物文库(Ⅰ)，各自包含一条已完全确定的底物序列的多份拷贝，以及一条随机产生的推定抑制剂序列：NX1-X2-X3-D-X4-X5-X6-VC-PEGA(其中的X1至X6是珠与珠之间随机变更的L-氨基酸，D是一个珠与珠之间随机不同的D-氨基酸)的多份拷贝。将此文库37℃与活化MMP-9一起孵育，在荧光显微镜下用微量移液管分离出仍为猝灭态(即与大多数亮荧光微珠相比较暗)的微珠。用氨基酸测序仪对分离出的微珠进行分析，因为在N末端预先酰化，该底物序列不被Edman降解反应所降解，所以，所得的序列即对应于可能的肽模拟MMP-9抑制剂。
为了鉴定肽底物模拟MMP-抑制剂在易受切割的位点(即，对应底物估计的P1位点和P1’位点之间)是磷酸酯键而不是肽键，开发了一种新的PEGA微珠抑制剂文库。产生了两种PEGA微珠磷酸酯抑制剂文库(Ⅱa和Ⅱb)。各自含有大约106颗不同微珠，各微珠包含一条完全确定底物序列的多份拷贝，和一条随机产生的推定抑制剂序列：NX1-X2-JP/cM-X3-X4-“接头”-EGA(Ⅱa)或NX1-X2-Gp/cL-X3-X4-“接头”-PEGA(Ⅱb)(其中的X1至X4是珠与珠之间随机变化的L-氨基酸，Jp/cM和Gp/cL分别是文库Ⅱa和Ⅱb中所用的磷酸酯伪二肽)的多份拷贝，(见图12-15)。最初的两种膦酸酯伪二肽是根据新开发的MMP-9底物中合适的P1和P1’氨基酸的一致性设计的。还将根据用PEGA微珠底物文库发现的MMP选择性肽底物，对膦酯键周围伪氨基酸的其它组合形式进行研究。d．位置组合肽抑制剂文库
除了使用PEGA微珠肽文库来鉴定可能的MMP抑制剂之外，还可以利用五肽结构X-X-D-X-X(其中的D是20种普通氨基酸(半胱氨酸除外)之一或羟基脯氨酸的D形式，X是随机变化的20种普通氨基酸之一或羟基脯氨酸的天然L形式)产生20个不同的的位置组合肽抑制剂文库(Houghten等，19917)。为了去除对骨组织培养物有毒的盐和其它物质，在胎鼠跖骨培养物中测定对破骨细胞迁移和骨吸收的抑制作用之前，先用高效液相层析对肽文库进行纯化。20个文库各自包含有30μmol多达214(194,418)种不同结构的五肽。e．用于体外研究破骨细胞迁移和吸收的胎鼠跖骨培养物
从17日龄NRM1小鼠胚胎分离得到跖骨，以45Ca2+预先标记，用作器官培养物模型(Blavier和Delaisse,19953)。简而言之，在鼠怀孕的第16天给孕鼠皮下注射45Ca2+标记胎骨。第二天分离的胎跖骨因而多有在子宫内于第16-17天之间发育产生的45Ca2+标记的钙化骨基质。在包围钙化骨基质的骨膜中存在大量破骨细胞前体细胞。对应于跖骨内骨和骨髓体内的发育过程，接着将分离得的跖骨在含30nM 1a,25二羟基维生素D3和0.1％Albumax的BGJB培养基中培养1至7天，引起了破骨细胞前体细胞的分化、融合和迁移，使得成熟的破骨细胞出现在中心钙化骨基质中，破骨细胞在此重吸收骨并形成初级骨髓穴。通过在不同时刻测定释放到培养基中的45Ca2+和显微镜镜检抗酒石酸酸性磷酸酯酶染色的破骨细胞在跖骨培养物的位置，来估计破骨细胞的发育情况和骨重吸收活性。原已发现的在跖骨培养物模型中抑制破骨细胞迁移并因而减少45Ca2+释放的通用(general)MMP抑制剂，RP59749，在所有试验中用作阳性对照(Blavier和Delaisse，19953)。
在第1,2和4天，测定释放到处理跖骨条件培养液中累积的45Ca2+与对应的、来自同一胚胎另一条腿的非处理跖骨培养液中的45Ca2+的相对变化(％)，由此评价20种X-X-D-X-X组合文库对骨吸收的作用。在同一实验中，各文库分别在4个相互独立的跖骨培养物中接受测试，有时需要重复实验。
20个文库每个的使用浓度为3mM总肽，相当于，一个文库194,481种结构各自的浓度约为15nM。20个文库的大多数不明显影响骨吸收，但其中之一(D=ile)在第4天明显降低45Ca2+释放(见图16)，最重要的是，其中2个文库(D=leu和D=trp)在第2和第4天表现出对骨吸收的明显抑制(见图16和表5)。
表54日龄跖骨培养物中加入某X-X-D-X-X组合文库引起的45Ca2+释放变化(％)
    文库     0-1日     0-2日     0-4日
    X-X-trp-X-X     0％(ns) -20％(0.02) -40％(0.05)
    X-X-Ieu-X-X     0％(ns) -34％(0.0001) -48％(0.0005)
p值表示经处理和对应的非处理组之间变化的明显程度(n均等于4)。
利用在4个X位置之一的选定变异对28个文库再次筛选，对X-X-trp-X-X文库作进一步研究。使用了以下4种构象：U-X-trp-X-X，X-U-trp-X-X，X-X-trp-U-X和X-X-trp-X-U，其中U是以下各亚组之一中的L氨基酸随机混合物：U1:K和R(n=2)；U2:H,Y,F和W(n=4)；U3:E和Q(n=2)；U4:T,D,S和N(n=4)；U5:C,V,L,I和M(n=5)；U6:P和J(n=2)；U7:A和G(n=2)。28个文库各自的使用浓度均为1.6-4.0mM总肽，相当于一个文库中18,522至46,305种结构各自的浓度约为85nM。28个文库中的大多数不明显影响骨吸收，但是其中5个在第1,2和/或4日明显和/或勉强算是明显地降低了45Ca2+释放(见表6)。
表64日跖骨培养物中加入U-X-trp-X-X,X-U-trp-X-X,X-X-trp-U-X或X-X-trp-X-U组合文库引起的45Ca2+释放变化(％)
    文库     0-1日     0-2日     0-4日
U5-X-w-X-X     -20％(0.28) -21％(0.12) -15％(0.11)
X-U2-w-X-X     -15％(0.35) -23％(0.05) -18％(0.15)
X-U5-w-X-X     -43％(0.007) -28％(0.04) -11％(0.05)
X-X-w-U2-X     -23％(0.21) -20％(0.003) -16％(0.001)
X-X-w-X-U5     -23％(0.15) -24％(0.0008) -15％(0.07)
利用4个X位置之一的一种变异对23个文库第三次筛选，对U5-X-trp-X-X,X-U2/5-trp-X-X,X-X-trp-U2-X和X-X-trp-X-U5文库作进一步研究。使用了以下构象：Z5-X-trp-X-X,X-Z2/5-trp-X-X,X-X-trp-Z2-X和X-X-trp-X-Z5,其中的Z2,Z5或Z2/5分别是U2,U5或U2和U5亚组中的一种氨基酸。除少数例外，23个文库的使用浓度均为3.3mM总肽，相当于同一个文库中9,261种结构各自的浓度约为340nM。23个文库中半数以上对骨吸收没有明显影响，但是其中11个在第1,2和/或4日明显和/或勉强算是明显地降低了45Ca2+释放(见表7)。
表74日跖骨培养物中加入Z5-X-trp-X-X,X-Z2/5-trp-X-X,X-X-trp-Z2-X或X-X-trp-X-Z5组合文库引起的45Ca2+释放变化(％)
    文库(浓度)     0-1日     0-2日     0-4日
C-X-trp-X-X(3.2mM)     -22％(0.09)     -38％(0.03)     -34％(0.006)
V-X-trp-X-X(3.2mM)     -6％(0.33)     -30％(0.17)     -23％(0.11)
L-X-trp-X-X(3.2mM)     -23％(0.07)     -32％(0.01)     -20％(0.06)
X-W-trp-X-X(3.2mM)     -19％(0.22)     -26％(0.003)     -22％(0.08)
X-Y-trp-X-X(3.2mM)     -26％(0.04)     -27％(0.06)     -18％(0.17)
X-F-trp-X-X(3.2mM)     -20％(0.19)     -33％(0.06)     -23％(0.09)
X-C-trp-X-X(3.2mM)     -39％(0.02)     -18％(0.14)     -10％(0.13)
X-L-trp-X-X(3.2mM)     -19％(0.39)     -26％(0.07)     -24％(0.20)
X-X-trp-Y-X(3.2mM)(0.8mM)(0.8mM)     -25％(0.05)-45％(0.07)-39％(0.003)     -48％(0.0003)-26％(0.14)-30％(0.02)     -38％(0.0006)-8％(0.22)-18％(0.03)
X-X-trp-X-L(3.2mM)     -12％(0.34)     -34％(0.21)     -17％(0.18)
X-X-trp-X-M(3.2mM)     -26％(0.21)     -26％(0.14)     -18％(0.03)
曾经试图鉴定单一的肽抑制剂结构，为此对20种结构为C/V/L-Y/F/W/C/L-trp-Y-M/L(根据第三次筛选结果，认为这是可能的候选物)的肽进行第四次筛选。20种单一结构肽的使用浓度均为13μM。20种肽中的大多数对骨吸收没有明显影响，但是其中5种在第1,2和/或4日明显和/或勉强算是明显地降低了45Ca2+释放(见表8)。根据前4次筛选的结果，通过进一步的研究可能获得更好的单肽抑制剂。尤其是对X-X-trp-Y-X组合文库的进一步研究和对X-X-leu-X-X的类似筛选方法看来很有希望。
表84日跖骨培养物中加入序列C/V/L-Y/F/W/C/L-trp-Y-M/L的单肽结构引起的45Ca2+释放变化(％)
    文库     0-1日     0-2日     0-4日
    C-L-w-Y-L -30％(0.02) -22％(0.03) -15％(0.005)
    C-L-w-Y-M -29％(0.06) -26％(0.05) -13％(0.04)
    C-Y-w-Y-L -17％(0.008) -18％(0.009) -12％(0.11)
    V-Y-w-Y-M -17％(0.21) -21％(0.04) -15％(0.02)
    L-F-w-Y-L -34％(0.003) -37％(0.007) -26％(0.04)
f.MMP的反义探针的设计和使用
制造了针对各种MMP的反义寡核苷酸探针，目的是在骨细胞和组织培养物中，以及在动物模型中研究它们对骨代谢和破骨细胞生物学的影响，反义寡核苷酸探针的设计，是选择对特定MMP具有特异性并与任何可能相关的哺乳动物基因相似性尽可能小的序列。在各种情况中，都将有义探针和/或可谓拼凑(scrambled)探针用作阴性对照与反义探针比较。为了使探针稳定化，有些在生成时以部分硫代磷酸化形式，以保护它们不被核酸酶降解(是硫代磷酸键而不是普通的磷酸二酯键在图中以*标出)。为了使探针递送入破骨细胞内，将部分探针包含在脂质体内，然后用于细胞或组织培养物。
这类实验的方法可以小鼠和家兔MMP-9的反义探针的设计、合成和测试结果为例。
下表显示两组对鼠MMP-9的探针(17聚体)：表9：在小鼠细胞和组织内有MMP-9表达的实验中所用的选定探针：
 5’-T*G*GTATGTGG TCTGT*G*T    拼凑(SEQ IN NO.29)第1组5’-T*G*TGGTTCAG TTGTG*G*T    反义(SEQ IN NO.30)
 5’-A*C*CACAACTGAACCA*C*A     有义(SEQ IN NO.31)第2组5’-G*GAC*T*CA*TGG*TGAG*G*A*C 反义(SEQ IN NO.32)
 5’-C*GGA*T*ACAGG*TG*TC*G*G*A 有义(SEQ IN NO.33)将以上探针用于实施例6e所述的小鼠跖骨系统和小鼠前破骨细胞培养物系统中。后一系统是在如下非分级分离骨细胞基础上建立的，即从12日龄小鼠分离骨细胞，在5％胎牛血清存在下培养7天，以去除所有多核化破骨细胞只留下基质细胞和破骨细胞前体。在2μ.g/ml PEG2存在下继续培养大约10天，形成了新的成熟破骨细胞。根据对应的条件培养液的明胶酶酶谱研究，该培养系统内前破骨细胞向成熟细胞的连续分化与原MMP-9的产生具有良好的相关性。对于两个系统，都以1至10μg/ml的浓度向培养液中加入探针，并且每日更换培养液基。
如下表所示，构建了7条针对家兔MMP-9的反义探针(14至18聚体)：表10：在家兔细胞和组织内有MMP-9表达的实验中所用的选定探针：探针1(起始密码子)G*T*C*TGG*GGC*T*CA*TGG*T*G*A (SEQ IN NO.34)探针2(起始密码子)G*G*CT*CA*TGG*TGA*G*G        (SEQ IN NO.35)探针3(起始密码子)G*G*GC*T*CA*TGG*TG*AGG*G*G*A (SEQ IN NO.36)探针4(起始密码子)C*T*CA*TGG*TG*AGG*GGA*G*C*A  (SEQ IN NO.37)探针5(起始密码子)A*T*GG*TG*AGG*GGAG*CA*G*C*G  (SEQ IN NO.38)探针6(茎环结构)  A*G*GT*GAG*TGG*CGT*CA*C*C*G  (SEQ IN NO.39)探针7(茎环结构)  G*C*TGT*CA*AAG*T*TGGA*A*G*T  (SEQ IN NO.40)拼凑探针1        G*G*CC*T*C*TAC*CG*CAACT*G*C  (SEQ IN NO.41)拼凑探针2        G*G*C*C*T*C*TAGG*GGAAC*T*G*C (SEQ IN NO.42)
5条反义探针覆盖了mRNA的起始密码子，2条针对翻译区内的单链环(根据mRNA二级结构推算而确定)。
从8至10日龄家兔长骨分离的破骨细胞内，测试反义探针和拼凑探针对家兔MMP-9的作用。破骨细胞培养在牛骨切片上的5％胎牛血清中，每日更新培养液和寡核苷酸。在明胶酶酶谱法中定量MMP-9，研究破骨细胞的形态和数量，以及利用酶试验定量测定分泌到破骨细胞条件培养液中的抗酒石酸酸性磷酸酶，由此对结果进行评价。
参考文献1．Baggio R,Ski Y,Wu Y,Abeles R H.劣底物至优良抑制剂：丝氨酸和硫醇抑制剂的设计(From poor substrates to good inhibitors:Design ofinkibitors for serine andthiol proteases.)生物化学(Biochem)35:3351-3353.1996.2．Birkedal-Hansen H, Moore W G I,Bodden M K,Windsor L J,Birkedal-Hansen B,DeCarlo A,Engler J A.基质金属蛋白酶：综述(Matrix metalloproteinases:A review.)口腔生物医学评论(Crit Rev Oral Biol Med)4:197-250.1993.3．Blavier L,Delaiss J-M.基质金属蛋白酶是前破骨细胞向发育的早期长骨骨髓穴迁移所必需的(Matrix metalloproteinases are obligatory for the migration ofpreosteoclaststothe developing marrow cavity of primitive long bones)。细胞科学杂志(J Cell Sci)108:3649-3659.1995。4．Brown P D,Giavazzi R.基质金属蛋白酶抑制作用：抗肿瘤活性综述(Matrixmetalloproteinaseinhibition:a review of anti-tumour activity.)肿瘤学年报(Annals ofOncology)6:967-974.1995。5．Delaiss J-M,Vaes G.破骨细胞骨吸收作用中矿物质溶解和基质降解的机制(Mechanism of mineral solubilization and matrix degradation in osteoclastic boneresorption.)破骨细胞的生物学和生理学(Biology and physiology ofthe osteoclast)(编辑：RifkinB R,Gay C V),pp289-314.BocaRaton,CRCPress.1992。6．Foged NT,DelaisséJ-M,Hou P,Lou H,Sato T,Winding B,Bonde M.利用酶联免疫吸附试验定量分离的破骨细胞的溶胶原活性(Quantification ofthe collagenolyticactivity ofisolated osteoclasts by enzyme-linkedimmunosorbent assay.)骨矿物质研究杂志(J.Bone Miner Res)11∶226-237.1996.7．Houghten R A,Pinilla C,Blondelle S E,Apell J R,Dooley C T,Cuervo J H.用于基础研究和药物开发的合成肽组合的建立和使用(Generation and use of syntheticpeptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery.)自然(Nature)354:84-96 19918．Laitala T,Vaananen H K．针对碳酸酐酶Ⅱ或液泡H+-ATP酶两亚基的反义RNA和NDA分子对骨吸收的体外抑制作用(Inhibition of bone resorption in vitro by   antisense RNA and DNA molecules targeted against carbomc anhydraseⅡor twosubunits ofvacuolar H+-ATPase.)临床研究杂志(J ClinInvest)93∶2311-2318.1994。9．Lin M,Hultquist K L,Oh D H,Bauer E A,Hoeffler W K.补骨脂素反义寡核苷酸在表皮成纤维细胞内对Ⅰ型胶原酶表达的抑制(Inhibition of collagenase type Iexpression by psoralen antisense oligonucleotides in dermal fibroblasts.)FASEB9∶1371-1377.1995.10．Meldal M,SvendsenⅠ,Breddam K,Auzanneau F-I.用于制作内切蛋白酶特异性亚
位点全图的淬产灭荧光底物的部分混合肽文库(Portion-mixing peptide libraries of
quenched fiuorogenic substrates for complete subsite mapping of endoprotease
specificity.)美国科学院院报(Proc Natl Acad Sci)9l∶3314-3318.1994.11．Meldal M,SvendsenⅠ.利用含有猝灭产荧光底物的部分混合抑制剂文库直接显示
酶抑制剂(Direct visulaization of enzyme inhibitors using a portion mixing inhibitor
library containing a quenched fluorogenic substrate.)J Chem Soc Perkin Trans：1591-
1596.1995.12．Sakai D,Tong H-S,Minkin C.利用cDNA测序研究破骨细胞分子表型(Osteoclast
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surface ofinvasive tumour cells.)自然(Nature)370∶61-65.1994。14．Takino T,Sato H,Yamamoto E,Seiki M.可能编码新的具有C末端跨膜区的基质
金属蛋白酶人基因的克隆(Cloning of a human gene potentially encoding a novel
matrix matalloproteinase having a C-terminal transmembrane domain.)基因(Gene)
155∶293-298.1995.15．Tezuka K,Sato T,Kamioka H,Nijweide P J,Tanaka K,Matsuo T,Ohm M,Kurihara
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mRNA的组织分布(cDNA sequence and mRNA tissue distribution of a novel human
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序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：
    (A)姓名：Center for Clinical & Basic Research
    (B)街道：Ballerup Byvej 222,
    (C)城市：Ballerup
    (E)国家：Denmark
    (F)邮政编码(邮编)：DK-2750
(ⅱ)发明名称：应用蛋白酶抑制剂预防和降低骨的吸收
(ⅲ)序列数目：23
(ⅳ)计算机可读形式：
    (A)记录介质类型：软盘
    (B)计算机：IBMPC兼容型
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)
(ⅵ)原先申请资料：
    (A)申请号：GB 9615976.9
    (B)申请日：30-7月-1996(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：10氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：5
    (D)其他信息：/产物=″x 是羟基脯氨酸″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ IDNO:1：
Ser Lys Tyr Pro Xaa Ala Leu Phe Phe Lys
1               5                   10(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：10氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅸ )特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：3
    (D)其他信息：/产物=″X是Y(NO2)″
(ⅸ )特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：5
    (D)其他信息：/产物=″X 是羟基脯氨酸″
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：10
    (D)其他信息：/产物=″X 是K(Abz)″
(ⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2：
Ser Lys Xaa Pro Xaa Al a Leu Phe Phe Xaa
1               5                    10(2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2546碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：否
(ⅳ )反义：否
(ⅵ)最初来源：
    (A)生物体：穴兔(Oryctolagus cuniculus)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：3：TAACGCAGAG TTACATATAC ATACCTGGGG GGGGGGGGGG GGTTCTACTA ATGTAGCGTA            60CATATAAGAT TCTACTACTT ATTCATGTAG CGATCACTAA TGTAGATTTT TCTAAATGTT           120AGATTTTTAT TTATTTCCTA TATACTTTAC TTATTATTTA TTTCTTTGAT TATATTATCA           180TTAGCACACG CAAACTTACA ACACAGAGTT CTATCCTATC CCTATTAGTT ACCTTATTAG           240TTACCTATTA GTTACCTTAT TAGTTACCTA TTAGTTTTAC CTTATTAGTT TTACCTATTA           300GTTTTACCTT ATTAGTTTTA CCTATTAGTT TTAAACTACT AATGTAGCGA GAATCTACTA           360AATGTTAGCC GCTAGGAATC CAAAGTCGGT GCCTCCGGAA GACAAAGGCG CCCCCGAGGG           420AGATGGCGGC GCGACCCCTA GGCGAGGGCC CCGCCGCGGA ACCGCCCAGC CCGGCTGACC           480CCGACGGTCG CGGACCATGT CTCCCGCCCC ACGACCCTCC CGCAGGCTCC TGAACTCCCC           540CTGCTCACAC TCGGCACCGC ACTCGCCTCC CTCGGCTCGG CCAAAAGCAA AACAGCTTCA           600GCCCCGAAGC CTGGCTGCAG CAGTATGGCT ACCTGCCTCC AGGGAAGACC TACGCACCCA           660CACACAGCGC TCTCCTCAGT CACTGTCAGC TGCCATTGCT AAGCCATGCA GAGGTTCTAC           720GGTTTGCGAG TGACAGGCAA GGCCGATACA GACACCAAAT GAAGGCCATG AGGCGCCCCC           780GCTGCGGTGT TCCAGACAAG TTTGGGGCTG AGAAATCAAG GCCAATGTCC GAAGGAAGCG           840CTACGCCATC  CAGGGCCTCA  AATGGCAGAA  CATAATGAGA  TCACTTTCTG  CATCCAGAAT          900TACACCCCCA  AGGTGGGCGA  ATATAAAATC  TAAATGTTAG  GCCACATTCG  AGGCCATTCG          960CAAGGCATTC  CGCGTGTGGG  AGAGCGCCAC  ACCGAAATCT  ACTAAATGTA  GCGTAGACTG         1020CGCTTCCGCG  AGGTGCACTA  TGCCTACATC  CGCGATGGCC  GTGAGAAGCA  GAAGCCGACA         1080TCATGATCTT  CTTTGCCGAG  GGCTTCCATG  GCGACAGCAC  GCCCTTCAAG  ATGGCGAGGG         1140TGGCTTCCTG  GCCCACGCCT  ACTTCCCGGG  CCCCAACATT  GGAAAACTCT  ACTAAATGTT         1200AGAATCTACT  AAATGTTAGG  GGGACACCCA  CTTTGACTCC  GCGGAGCCCT  GGACTGTCCG         1260GAATGAGGAC  CTGAAAACGG  GAATGACATC  TTCCTGGTGG  CTGTGCATGA  GCTGGGCCAT         1320GCCCTGGGCA  ACTGGAGCAC  TCCAATGACC  CCTCAGCCAT  CATGGCACCG  TTTTACCAAT         1380GGATGAAGAC  ACAGAGAACT  TCGTGCTGCC  TGATGATGAC  CGCCGGGGCA  TCCAACAGCT         1440TAATATGGGA  GCCAGTCGGG  GTCCCCCACA  AAGATGCCTC  CTCCACCCAG  GACAACCAAT         1500CCCGGACTTT  TATCCCCGAT  AAGCCCAGGA  ACCCCACCTA  CGGGCCCAAC  ATCAATGTGA         1560CGGGAACTTT  GACACTGTGG  CCGTGCTCCG  AGGAGAGATG  TTTGTCTTCA  AAAGGAGCGC         1620TGGTTCTGGA  GGGTGAGGAA  CAACCAAGTG  ATGGACGGCT  ACCCAAAATG  CCCATCGGCC         1680AGTTCTGGCG  GGGCCTGCCT  GCTTCCATCA  ACACCGCCTA  CAAGAGAGGA  AGGATGGCAA         1740ATTCGTCTTC  TTCAAAGGAG  ATAAGCACTG  GGTGTTTAAG  ACGAGGCTTC  CCTGGAGCCT         1800GGCTACCCCA  AGCACATCAA  GGAGCTGGGC  CGAAACTCTA  CTAAATGTTA  GGGGCTTCCC         1860ACCGACAAGA  TCGATGCCGC  TCTCTTCTGG  ATGCCCAATG  GAAAGAATCT  ACTAAATGTT         1920AGAACCTACT  TCTTCCGGGG  AAACAAGTAC  TACCGATTCA  ACGAGGAGCT  CAGGGCAAAG         1980TGGACAGCGA  GTACCCCAAG  AACATCAAAG  TGTGGGAAGG  CATCCCCGAG  TCTAACCCAG         2040AGGGTCGTTC  ATGGGCAGTG  ATGAAGTCTT  CACTTACTTC  TACAAGGGGA  AAACAAATAC         2100TGGAAATTCA  ACAACCAGAA  GCTGAAGGTG  GAGCCCGGCT  ACCCCAAAAG  TCCGCCCTGC         2160GGGACTGGAT  GGGCTGCCCG  GCTGGGGGCC  GTCCGGATGA  GAAGGGACTG  AGGAAGAGAC         2220GGAGGTGATC  ATCATCGAGG  TGGACGAGGA  GGGCAGCAAG  GAGCCGTGAG  CGCGGCCGCC         2280GTGGTGCTGC  CCGTGCTGCT  GCTACTCCTG  GTGAACTGGC  CGTGGGCCTG  GCGGTCTTCT         2340TCTTCAGGCG  CCACGGGACT  CCGAAGCGAA  ACTGCTCTAC  TGCCAGCGTT  CCCTGCTGGA         2400CAAGGTCTGA  CCCCCACCGC  TGGCCAACAC  CCACTCCCAC  CGCAAGGACT  TTGCTCTTCC         2460GATTGTATCC  AATAAAAAAT  AAGCATCAGC  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  ATAGAATCTA         2520CTAAATGTTA  GAACTACTAA  TGTAGA                  2546(2)SEQ ID NO：4的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：582氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅲ)假设：否(ⅵ)最初来源：
(A)生物体：穴兔(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4：Met Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser Arg Arg Leu Leu Leu Pro Leu Leu1               5                   10                  15Thr Leu Gly Thr Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Lys Ser Asn Ser
        20                  25                  30Phe Ser Pro Glu Ala Trp Leu Gln Gln Tyr Gly Tyr Leu Pro Pro Gly
    35                  40                  45ASp Leu Arg Thr His Thr Gln Arg Ser Pro Gln Ser Leu Ser Ala Ala
50                  55                  60Ile Ala Ala Met Gln Arg Phe Tyr Gly Leu Arg Val Thr Gly Lys Ala65                  70                  75                  80Asp Thr Asp Thr Met Lys Ala Met Arg Arg Pro Arg Cys Gly Val Pro
            85                  90                  95Asp LysPhe Gly Ala Glu Ile Lys Ala Asn Val Arg Arg Lys Arg Tyr
       100                 105                 110Ala Ile Gln Gly Leu Lys Trp Gln His Asn Glu Ile Thr Phe Cys Ile
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370                 375                 380Asp Lys His Trp Val Phe Asp Glu Ala Ser Leu Glu Pro Gly Tyr Pro285                 390                 395                 400Lys His Ile Lys Glu Leu Gly Arg Gly Leu Pro Thr Asp Lys Ile Asp
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：582氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅳ )反义：否
(ⅵ)最初来源：
    (A)生物体：智人
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5：Met Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser Arg Cys Leu Leu Leu Pro Leu Leu1               5                   10                  15Thr Leu Gly Thr Ala Leu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Gln Ser Ser Ser
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        100                 105                 110Ala Ile Gln Gly Leu Lys Trp Gln His Asn Glu Ile Thr Phe Cys Ile
    115                 120                 125Gln Asn Tyr Thr Pro Lys Val Gly Glu Tyr Ala Thr Tyr Glu Ala Ile
130                 135                 140Arg Lys Ala Phe Arg Val Trp Glu Ser Ala Thr Pro Leu Arg Phe Arg145                 150                 155                 160Glu Val Pro Tyr Ala Tyr Ile Arg Glu Gly His Glu Lys Gln Ala Asp
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530                 535                 540Pro Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Leu Ala Val Phe545                 550                 555                 560Phe Phe Arg Arg His Gly Thr Pro Arg Arg Leu Leu Tyr Cys Gln Arg
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        580(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：582氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅳ )反义：否
(ⅵ)最初来源：
    (A)生物体：褐家鼠
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6：Met Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu Leu1               5                   10                  15Thr Leu Gly Thr Thr Leu Ala Ser Leu Gly Trp Ala Gln Ser Ser Asn
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            85                  90                  95Asp Lys Phe Gly Thr Glu Ile Lys Ala Asn Val Arg Arg Lys Arg Tyr
        100                 105                 110Ala Ile Gln Gly Leu Lys Trp Gln His Asn Glu Ile Thr Phe Cys Ile
    115                 120                 125Gln Asn Tyr Thr Pro Lys Val Gly Glu Tyr Ala Thr Phe Glu Ala Ile
130                 135                 140Arg Lys Ala Phe Arg Val Trp Glu Ser Ala Thr Pro Leu Arg Phe Arg145                 150                 155                 160Glu Val Pro Tyr Ala Tyr Ile Arg Glu Gly His Glu Lys Gln Ala Asp
            165                 170                 175Ile Met Ile Leu Phe Ala Glu Gly Phe His Gly Asp Ser Thr Pro Phe
        180                 185                 190Asp Gly Glu Gly Gly Phe Leu Ala His Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Asn
    195                 200                 205Ile Gly Gly Asp Thr His Phe Asp Ser Ala Glu Pro Trp Thr Val Gln
210                 215                 220Asn Glu Asp Leu Asn Gly Asn Asp Ile Phe Leu Val Ala Val His Glu225                 230                 235                 240Leu Gly His Ala Leu Gly Leu Glu His Ser Asn Asp Pro Ser Asp Ile
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        340                 345                 350Tyr Pro Met Pro Ile Gly Gln Phe Trp Arg Gly Leu Pro Ala Ser Ile
    355                 360                 365Asn Thr Ala Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Lys Phe Val Phe Phe Lys Gly
370                 375                 380Asp Lys His Trp Val Phe Asp Glu Ala Ser Leu Glu Pro Gly Tyr Pro385                 390                 395                 400Lys His Ile Lys Glu Leu Gly Arg Gly Leu Pro Thr Asp Lys Ile Asp
            405                 410                 415Ala Ala Leu Phe Trp Met Pro Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Arg Gly
        420                 425                 430Asn Lys Tyr Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Phe Arg Ala Val Asp Ser Glu
    435                 440                 445Tyr Pro Lys Asn Ile Lys Val Trp Glu Gly Ile Pro Glu Ser Pro Arg
450                 455                 460Gly Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr Tyr Phe Tyr Lys Gly465                 470                 475                 480Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Lys Leu Lys Val Glu Pro Gly
            485                 490                 495Tyr Pro Lys Ser Ala Leu Arg Asp Trp Met Gly Cys Pro Ser Gly Gly
        500                 505                 510Arg Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu Val Ile Ile Ile Glu
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530                 535                 540Pro Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Leu Ala Val Phe545                 550                 555                 560Phe Phe Arg Arg His Gly Thr Pro Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Gln Arg
            565                 570                 575Ser Leu Leu Asp Lys Val
        580(2)SEQ ID NO:7的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：582氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅵ)最初来源：
    (A)生物体：家鼠(Mus CooKⅱ)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Met Ser Pro Ala Pro Arg Pro Ser Arg Ser Leu Leu Leu Pro Leu Leu1               5                   10                  15Thr Leu Gly Thr Ala Leu Ala Ser Leu Gly Trp Ala Gln Gly Ser Asn
        20                  25                  30Phe Ser Pro Glu Ala Trp Leu Gln Gln Phe Gly Tyr Leu Pro Arg Gly
    35                  40                  45Asp Leu Arg Thr His Thr Gln Arg Ser Pro Gln Thr Leu Ser Val Asp
50                  55                  60Ile Ala Ala Ile Gln Lys Phe Tyr Gly Leu Tyr Val Thr Gly Lys Ala65                  70                  75                  80Tyr Ser Glu Thr Met Lys Ala Met Arg Arg Pro Arg Cys Gly Val Pro
            85                  90                  95Asp Lys Phe Gly Thr Glu Ile Lys Ala Asn Val Arg Arg Lys Arg Tyr
        100                 105                 110Ala Ile Gln Gly Leu Lys Trp Gln His Asn Glu Ile Thr Phe Cys Ile
    115                 120                 125Gln Asn Tyr Thr Pro Lys Val Gly Glu Tyr Ala Thr Phe Glu Ala Ile
130                 135                 140Arg Lys Ala Phe Arg Val Trp Glu Ser Ala Thr Pro Leu Arg Phe Arg145                 150                 155                 160Glu Val Pro Tyr Ala Tyr Ile Arg Glu Gly His Glu Lys Gln Ala Asp
            165                 170                 175Ile Met Ile Leu Phe Pro Glu Gly Leu His Gly Asp Ser Thr Pro Phe
        180                 185                 190Asp Gly Glu Gly Gly Phe Leu Ala His Ala Tyr Phe Pro Gly Pro Asn
    195                 200                 205Ile Gly Gly Asp Thr His Phe Asp Ser Ala Glu Pro Trp Thr Val Gln
210                 215                 220Asn Glu Asp Leu Asn Gly Asn Asp Ile Phe Leu Val Ala Val His Glu225                 230                 235                 240Leu Gly His Ala Leu Gly Leu Glu His Ser Asn Asp Pro Ser Asp Ile
            245                 250                 255Met Ser Pro Phe Tyr Gln Trp Met Asp Thr Glu Asn Phe Val Leu Pro
        260                 265                 270Asp Asp Asp Arg Arg Gly Ile Gln Gln Leu Tyr Gly Ser Lys Ser Gly
    275                 280                 285Ser Pro Thr Lys Met Pro Pro Gln Pro Arg Thr Thr Ser Arg Pro Ser
290                 295                 300Val Pro Asp Lys Pro Lys Asn Pro Ala Tyr Gly Pro Asn Ile Cys Asp305                 310                 315                 320Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Net Leu Arg Gly Glu Net Phe Val Phe
            325                 330                 335Lys Glu Ar9 Trp Leu Trp Arg Val Arg ASn Asn Gln Val Met Asp Gly
        340                 345                 350Tyr Pro Met Pro Ile Gly Gln Phe Trp Arg Gly Leu Pro Ala Ser Ile
    355                 360                 365Asn Thr Ala Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Thr Phe Val Phe Phe Lys Gly
370                375                  380Asp Lys His Trp Val Cys Val Glu Ala Ser Leu Glu Pro Gly Tyr Ala385                 390                 395                 400Asn His Ile Lys Glu Leu Val Arg Gly Leu Pro Ser Asp Lys Ile Asp
            405                 410                 415Thr Ala Leu Phe Trp Met Pro Asn Gly Lys Thr Tyr Phe Phe Arg Gly
        420                 425                 430Asn Lys Tyr Tyr Arg Phe Asn Glu Glu Phe Arg Ala Val Asp Ser Glu
    435                 440                 445Tyr Pro Lys Asn Ile Lys Val Trp Glu Gly Ile Pro Glu Ser Pro Arg
450                 455                 460Gly Ser Phe Met Gly Ser Asp Glu Val Phe Thr Tyr Phe Tyr Lys Gly465                 470                 475                 480Asn Lys Tyr Trp Lys Phe Asn Asn Gln Lys Leu Lys Val Glu Pro Gly
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        500                 505                 510Arg Pro Asp Glu Gly Thr Glu Glu Glu Thr Glu Val Ile Ile Ile Glu
    515                 520                 525Val Asp Glu Glu Gly Ser Gly Ala Val Ser Ala Ala Ala Val Val Leu
530                 535                 540Pro Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Val Gly Leu Ala Val Phe545                 550                 555                 560Phe Phe Arg Arg His Gly Thr Pro Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Gln Arg
            565                 570                 575Ser Leu Leu Asp Lys Val
        5802)SEQ ID NO:8的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：9氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ )反义：否
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：1
    (D)其他信息：/产物=″X是Abz-G″
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：6
    (D)其他信息：/产物=″X是Lnor″
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：9
    (D)其他信息：/产物=″X是Y(NO2)″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8：Xaa Pro Leu Gly Leu xaa Ala Arg Xaa1               5(2)SEQ ID NO:9的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：10氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ )反义：否
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：1
    (D)其他信息：/产物=″X是Abz-S″
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：5
    (D)其他信息：/产物=″X是羟基脯氨酸″
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：9
    (D)其他信息：/产物=″X是Y(NO2)″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9：
Xaa Lys Tyr Pro Xaa Ala Leu Phe Xaa Asp
1               5                   10(2)SEQ ID NO:l0的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：15氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ )反义：否
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10：
Cys Asp Gly Asn Phe Asp Thr Val Ala Met Leu Arg Gly Glu Met
1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO:11的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：6氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ )反义：否
(ⅸ )特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：1
    (D)其他信息：/产物=″X是Mac-P″
(ⅸ )特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：5
    (D)其他信息：/产物=″X是Dpa-A″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11：
Xaa Leu Gly Leu Xaa Arg
1               5(2)SEQ ID NO:12的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：26碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：NO
(ⅳV)反义：否
(ⅵ)最初来源：穴兔
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12：CGGGATCCCT GTGGGTCACT TCTTCT       26(2)SEQ ID NO:13的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：26碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：否
(ⅳ )反义：是
(ⅵ)最初来源：
    (A)生物体：穴兔
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13：CCGCTCGAGC TGGCACCATT ACTAGC         26(2)SEQ ID NO:14的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：4氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：否
(ⅳ)反义：否
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：4
    (D)其他信息：/产物=″X是K(Abz)-PEGA″
(ⅱ)序列描述：SEQ ID NO:14：
Leu Phe Phe Xaa
1(2)SEQ ID NO:15的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：8氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ )反义：否
(ⅸ )特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：1
    (D)其他信息：/产物=″X是Abz-G″
(ⅸ )特征：
    (A)名称/关键符号：切割位点
    (B)定位：4..5
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15：
Xaa Pro Leu Gly Leu Xaa Ala Arg
1               5(2)SEQ ID NO:16的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：9氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ)反义：否
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：4
    (D)其他信息：/产物=″X=J″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16：
Tyr Pro Leu Xaa Met Lys Gly Lys Gly
1               5(2)SEQ ID NO:17的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：9氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ)反义：否
(ⅸ )特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：2..6
    (D)其他信息：/产物=″每个X都是J″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17：
Asn Xaa Tyr Pro Xaa Xaa Tyr Lys Gly
1               5(2)SEQ ID NO:18的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：9氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅲ)假设：是
(ⅳ)反义：否
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键符号：修饰位点
    (B)定位：3..8
    (D)其他信息：/产物=″每个X都是J″
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18：
Tyr Pro Xaa Xaa Met Lys Gly Xaa Gly
1               5(2)SEQ ID NO:19的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：是
(ⅳ)反义：否
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19：TGGTATGTGG TCTGTGT      17(2)SEQ ID NO:20的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：是
(ⅳ)反义：是
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:TGTGGTTCAG TTGTGGT    17(2)SEQ ID NO:21的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：是
(ⅳ )反义：否
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21：ACCACAACTG AACCACA    17(2)SEQ ID NO:22的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：是
(ⅳ)反义：是
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22：GGACTCATGG TGAGGAC    17(2)SEQ ID NO:23的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅲ)假设：是
(ⅳ)反义：否
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:CGGATACAGG TGTCGGA     17

Claims (12)

1．一种物质在制造治疗骨代谢疾病用药物中的用途，其特征在于，该物质通过抑制与破骨细胞骨吸收活性有关的膜结合蛋白酶或基质金属蛋白酶MMP-12的产生或作用来起作用。
2．根据权利要求1所述的用途，其中所述的物质通过抑制与破骨细胞的吸收活性有关的膜型基质金属蛋白酶(MT-MMP)或基质金属蛋白酶MMP12的产生或作用而起作用。
3．根据权利要求2所述的用途，其中参与破骨细胞前体细胞的更新、增殖、分化或迁移的蛋白酶，或参与破骨细胞的迁移、融合、附着、极化、去除矿化骨基质活性或死亡的蛋白酶受到所述物质的抑制。
4．根据前述权利要求中任一项诉述的用途，其中所述的物质是与所述蛋白酶选择性免疫反义的抗体。
5．根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中诉述的物质是针对参与诉述蛋白酶产生的基因的反义寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
6．根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述的物质是蛋白酶底物模拟抑制剂。
7．根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述的物质是广谱基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂或广谱膜结合金属蛋白酶抑制剂。
8．根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述的物质是MTl-MMP、MMP-12、或以meltrin和ADAM为例的膜结合金属蛋白酶家族中特定成员的选择性抑制剂。
9．根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述的物质是通过在肽文库中筛选与所述蛋白酶起反应的肽而获得的肽或肽类似物。
10．一种物质在制造治疗骨代谢疾病用药物中的用途，其特征在于，该物质通过抑制破骨细胞前体细胞的更新、增殖、分化或迁移，或抑制参与破骨细胞的迁移、融合、附着、极化、或死亡起作用。
11．根据权利要求10所述的用途，其中所述的物质通过抑制蛋白酶的产生或作用发挥其抑制作用。
12．一种抗骨吸收药物，它包含蛋白酶抑制剂，该抑制剂具有抗骨吸收相关蛋白酶的活性，将该抑制剂与具有结合特异性的配体操作性连接，所述特异性将所述抑制剂导向所述蛋白酶或蛋白酶所处的环境。
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