CN1826349A - 伤口护理组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能抑制基质金属蛋白酶活性的多肽。这些多肽可用于治疗伤口，例如，慢性伤口。

Description

伤口护理组合物
发明领域
本发明通常涉及伤口愈合领域以及健康皮肤的修复与保养。
发明背景
慢性伤口不愈合的一个主要原因是，一类蛋白酶破坏了新形成的伤口床(bed)(Vaalamo等人，1997；Weckroth等人，1996；DiColandrea等人，1998；Moses等人，1996)。通常通过能与MMP形成非常特异性的抑制复合物的4种组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP 1-4)的作用，来防止这些基质金属蛋白酶(MMP)破坏伤口床(例如，Olson等人，1997；Taylor等人，1996；Howard等人，1991)。也即，每个TIMP仅仅抑制一个特定的MMP亚型。在慢性伤口中，MMP与TIMP的比率较高，以致大多数的MMP没有被抑制(Vaalamo等人，1996；Saarialho-Kere，1998)。实际上，随着蛋白酶水平的提高，TIMP分子自身被水解。天然不存在能单独抑制所有类型MMP的TIMP分子。
因此，需要另外的方法来使对基质金属蛋白酶的抑制最优化并改善伤口愈合。
发明概述
本发明提供了能抑制基质金属蛋白酶的多肽。本发明提供的多肽的例子包括包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20或SEQ IDNO：21的分离的多肽。还提供了编码本发明多肽的分离的核酸，例如，编码包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的多肽的核酸。这种分离的核酸的例子包括含有SEQ ID NO：6的核酸，以及在严格杂交条件下能与含有SEQ ID NO：6的核酸杂交的分离的核酸。
本发明的多肽可用于治疗伤口，包括慢性伤口。因此，本发明提供了一种组合物，其包括治疗有效量的含有SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的多肽抑制剂，以及药学上可接受的载体。该组合物能以例如洗剂、凝胶或乳膏的形式提供。可选择地，多肽可以以伤口敷料的形式提供。这种伤口敷料可包括含有SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的多肽以及药学上可接受的载体。
本发明进一步提供了一种治疗伤口的方法，包括对伤口施用治疗有效量的含有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20或SEQ IDNO：21的多肽。
本发明的多肽抑制剂具有很多有用的特性，例如，这些多肽抑制剂能促进伤口愈合，预防瘢痕形成，改善皮肤品质，或刺激光滑、健康皮肤的发育。此外，它们在哺乳动物血清或血浆中是稳定的。
本发明组合物、敷料和方法中的多肽抑制剂，能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中任何一种的蛋白酶活性。在一些实施方案中，多肽抑制剂能抑制超过一种这些基质金属蛋白酶。
附图描述
图1提供了显示来自重组克隆的DNA的1.5％琼脂糖凝胶的影印。连接的基因表达载体构建体转化到JM109中，生长于补充有氨苄青霉素的LB平板上。挑取单个菌落到液体培养基中，并从这些培养物中通过小量制备纯化质粒。3、6和8泳道含有大小与具有SEQ ID NO：6插入片段的质粒相应的DNA。这些质粒进一步通过限制酶切消化来表征(没显示)。挑取3泳道的质粒用于蛋白表达分析。
图2提供了SEQ ID NO：5多肽的最终能量最低化模型的分子显示影印。图2A提供了显示蛋白总的三个维度的固体CPK空间充满模型。注意来自基质金属蛋白酶结合表面的TIMP-2样延伸(分子的上左部)。图2B提供了与图2A相同的视图，该显示只示例了蛋白的二级结构元件。形成中央β桶基序的β链结构以浅灰色显示，环和转角以白色显示，而单个α螺旋以深灰色显示。蛋白以通过α碳的位置的迹线显示。两个示例都使用Rasmol制作。
图3示例了SEQ ID NO：5多肽的纯化，如通过麦芽糖结合蛋白(MBP)-SEQ ID NO：5多肽融合的12％SDS-PAGE分析估计的，以及纯化的SEQ ID NO：5多肽。蛋白的表达和纯化按照实施例1中所描述的方案。泳道1，大约5μg的MBP-SEQ ID NO：5多肽融合(级分II)；泳道2，大约10μg纯化的(级分IV)SEQ ID NO：5多肽。凝胶用考马斯染色来显示。
图4提供了概括抗SEQ ID NO：5多肽的多克隆抗体(pAbs)的ELISA分析图。将1μg级分IV的SEQ ID NO：5多肽吸附到微量滴定盘的孔中，并与指示稀度的纯化pAbs(实心圆圈)或免疫前血清(空心圆圈)反应。使用用Oregon Green-488标记的山羊抗-兔第二抗体来获得显示。使用带有485nm(激发)和538nm(发射)通带滤光片装置的Dynex荧光微量滴定板读数器。该图中绘制了荧光对抗体(或血清)稀度的对数值的图。
图5提供了示例基质金属蛋白酶-9酶促水解荧光素化胶原蛋白的图。该测定测量了作为时间函数的荧光素从胶原蛋白的释放。底物与酶在时间为0时混合，对胶原蛋白破坏监控1200秒(粗线)。在一个单独的反应中，于200秒时将等量的SEQ ID NO：5多肽加入到正在进行的水解反应中(图的箭标处)。下面的虚线表示在短暂的滞后阶段后，胶原蛋白破坏停止。激发波长为490nm，发射波长为520nm。
图6提供了示例用SEQ ID NO：5蛋白对基质金属蛋白酶-9进行的滴定图。使用荧光素释放测定来确定抑制剂作用的动力学参数。将指示化学计算量的SEQ ID NO：5多肽加入到基质金属蛋白酶-9中，混合物于室温温育5分钟。将荧光素化的胶原蛋白和缓冲液加入到混合物中，监控作为时间函数的荧光素的释放。激发波长为490nm，发射波长为520nm。
图7提供了示例确定的SEQ ID NO：5多肽对几种MMP的抑制常数的条线图。从图6的曲线求取瞬时速度值，并用于如方法部分所述计算Ki值。
图8提供了SEQ ID NO：5多肽的分子显示影印。α碳主链迹线(浅灰色)突出了三个二硫键(以深灰色显示)的位置。两个上面的二硫键有助于维持MMP结合区域的几何学，而下面的二硫键有助于把羧基末端锁定成更刚性的构象。单个色氨酸的位置也以浅灰色显示。
图9提供了示例天然的(实心圆圈)或还原的(空心圆圈)SEQ IDNO：5多肽的化学变性图。绘制了作为尿素浓度的函数解折叠的蛋白群体级分的图。通过在添加尿素之前把蛋白与1mM DTT一起温育来还原SEQ ID NO：5多肽。荧光发射值转化成如方法部分所述的解折叠的级分。
图10提供了示例SEQ ID NO：5多肽在人血清中稳定性的图。将1mg级分IV的SEQ ID NO：5多肽加入到1mL的人血清(实心圆圈，下面的线)、1mL PBS(实心圆圈，上面的线)或0.2mg MMP-9和1mL人血清中。样本在室温温育。在指示的时间把等分试样从混合物中移走，并冷冻于-20℃直到36小时阶段结束。然后使用纯化的抗SEQID NO：5多肽pAbs通过ELISA来分析等分试样中的SEQ ID NO：5多肽的含量。使用用Oregon Green-488标记的山羊抗-兔第二抗体来获得显示。使用带有485nm(激发)和538nm(发射)通带滤光片装置的Dynex荧光微量滴定板读数器。通过任意地把零时间点设定为100％来把荧光转换成剩余的SEQ ID NO：5多肽百分数。
图11提供了示例通过内在的色氨酸荧光监控的50μM SEQ IDNO：5多肽的热转化的图。收集数据并如实施例1中所述的进行分析。绘制了作为温度的函数解折叠的蛋白群体的级分的图。
图12提供了SEQ ID NO：5多肽的热力学特征。该图示例了通过内在的色氨酸荧光而测定的SEQ ID NO：5多肽作为温度函数的热力学稳定性。图中包括的是通过在尿素中使蛋白变性于20℃和30℃测定的自由能值(也参见图9)。根据实施例1中所述的方法计算自由能。
图13也提供了SEQ ID NO：5多肽的热力学特征。该图是通过内在色氨酸荧光监控的SEQ ID NO：5多肽热解折叠的范托夫图。绘制了平衡常数的自然对数对1000/T的图，其中T是绝对温度。
图14提供了示例SEQ ID NO：5多肽的分析型凝胶过滤分析的图。将500μg溶于PBS中的纯化SEQ ID NO：5多肽注射到BioSelect 125SEC柱中，并以0.5mL/分钟的流速在PBS中进行层析。绘制280nm处的吸光度对洗脱时间的图。图中叠加的是肌红蛋白(分子量12kDa)、BSA(分子量65kDa)的洗脱点，以及柱空隙体积(V0)与总的体积(Vt)的位置。
图15提供了基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与SEQ ID NO：5多肽之间的预测分子复合物模型。MMP-9(深灰色)与SEQ ID NO：5多肽(浅灰色)的三维坐标文件用作FTDOCK程序的输入值(Gabb等人，1997)。得到的模型是两种蛋白间形成的最可能的复合物。FTDOCK评估了计算对接(docking)相互作用时的几何学与静电因素。两项合并成稳健傅里叶相关函数。
图16提供了示例MMP-9～SEQ ID NO：5多肽结合与解离的SPR分析的图。BiaCore CM-5芯片表面与MMP-9通过激活的羧基-胺键合化学进行反应。纯化的SEQ ID NO：5多肽以10μL/分钟的速度流过该表面。结合的等温线显示了高度的亲和力(0到400秒)。在400秒时，用仅仅缓冲取代流动以观察离解相。
图17提供了通过HPLC分析示例SEQ ID NO：5多肽～MMP-9复合物形成的层析。将100μg的SEQ ID NO：5多肽与溶于PBS中的700μg MMP-9混合(大约每种蛋白1mM)，于室温将反应物温育30分钟，以实现结合。将该材料注射到BioSelect 125 SEC柱中，并在PBS中以0.5mL/分钟的流速进行层析。该迹线在图中标记为“复合物”。在另一个反应中，将相同量的SEQ ID NO：5多肽与MMP-9混合到一起，并立即注射到SEC柱中。该迹线在图中标记为“混合物”。
发明详述
本发明提供了可用于促进伤口愈合的基质金属蛋白酶的抑制剂。通常，本抑制剂与组合物能促进伤口愈合，预防瘢痕形成，改善皮肤品质以及刺激光滑、健康皮肤的发育。
根据本发明，与4种组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP 1-4)的区域具有足够氨基酸序列同一性程度的多肽能与多种基质金属蛋白酶形成抑制复合物。施用这种多肽来抑制基质金属蛋白酶，并减少伤口中的细胞外基质破坏速度。因此，这种多肽抑制剂能提供更快的伤口愈合速度。
大多数抑制策略包括用有机小分子防止基质金属蛋白酶的酶活性。这些化合物通常对身体是有毒的，而且不是天然存在的分子。使用天然多肽来抑制基质金属蛋白酶提供了高度的蛋白醇控制而没有毒副作用。与小分子抑制策略不同，本发明的多肽能用于同时抑制单个或所有的基质金属蛋白酶种类的激活。这些多肽能自由地引入到皮肤中，到伤口周围，或者它们能被固定到皮肤覆盖物或伤口敷料中，或通过其送递。
本发明提供了对用于愈合慢性伤口的蛋白酶活性水平的高度控制。例如，由于在慢性伤口愈合过程中需要一定量的蛋白酶水平(Agren等人，1999)，本领域的技术人员可以选择仅仅部分抑制蛋白酶的活性。通过调节应用的抑制剂多肽的类型的量，能控制基质金属蛋白酶的抑制程度。
多肽抑制剂
根据本发明，具有与TIMP相关的序列的多肽可用于伤口愈合，并用于促进健康皮肤的发育。如这里所提供的，术语多肽与术语蛋白是同义使用的。本发明提供的多肽能抑制多种类型基质蛋白酶的活性。但是，多肽抑制剂比天然存在的TIMP多肽更小并且更稳定。而且，本多肽抑制剂的序列可以调节到使它们的结合特性最优化，例如，该多肽序列可以调节到它能抑制广谱的金属蛋白酶，或可以改变该序列以致只能抑制一种或少数金属蛋白酶。
例如，人TIMP-1可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
  1 MAPFEPLASG ILLLLWLIAP SRACTCVPPH PQTAFCNSDL
 41 VIRAKFVGTP EVNQTTLYQR YEIKMTKMYK GFQALGDAAD
 81 IRFVYTPAME SVCGYFHRSH NRSEEFLIAG KLQDGLLHIT
121 TCSFVAPWNS LSLAQRRGFT KTYTVGCEEC TVFPCLSIPC
161 KLQSGTHCLW TDQLLQGSEK GFQSRHLACL PREPGLCTWQ
201 SLRSQIA
参见Docherty等人，Sequence of human tissue inhibitor ofmetalloproteinases and its identity to erythroid-potentiating activity，Nature 318(6041)，66-69(1985)。
人TIMP-2可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
  1 MGAAARTLRL ALGLLLLATL LRPADACSCS PVHPQQAFCN
 41 ADVVIRAKAV SEKEVDSGND IYGNPIKRIQ YEIKQIKMFK
 81 GPEKDIEFIY TAPSSAVCGV SLDVGGKKEY LIAGKAEGDG
121 KMHITLCDFI VPWDTLSTTQ KKSLNHRYQM GCECKITRCP
161 MIPCYISSPD ECLWMDWVTE KNINGHQAKF FACIKRSDGS
201 CAWYRGAAPP KQEFLDIEDP
参见Stetler-Stevenson等人，Tissue inhibitor ofmetalloproteinase(TIMP-2).A new member of themetalloproteinase inhibitor family，Biol.Chem.264(29)，17374-17378(1989)。
人TIMP-3可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
  1 MTPWLGLIVL LGSWSLGDWG AEACTCSPSH PQDAFCNSDI
 41 VIRAKVVGKK LVKEGPFGTL VYTIKQMKMY RGFTKMPHVQ
 81 YIHTEASESL CGLKLEVNKY QYLLTGRVYD GKMYTGLCNF
121 VERWDQLTLS QRKGLNYRYH LGCNCKIKSC YYLPCFVTSK
161 NECLWTDMLS NFGYPGYQSK HYACIRQKGG YCSWYRGWAP
201 PDKSIINATD P
参见Wick等人，A novel member of human tissue inhibitorof metalloproteinases(TIMP)gene family is regulated duringG1 progression，mitogenic stimulation，differentiation，andsenescence，J.Biol.Chem.269(29)，18953-18960(1994)。
人TIMP-4可具有下述的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
  1 MPGSPRPAPS WVLLLRLLAL LRPPGLGEAC SCAPAHPQQH
 41 ICHSALVIRA KISSEKVVPA SADPADTEKM LRYEIKQIKM
 81 FKGFEKVKDV QYIYTPFDSS LCGVKLEANS QKQYLLTGQV
121 LSDGKVFIHL CNYIEPWEDL SLVQRESLNH HYHLNCGCQI
161 TTCYTVPCTI SAPNECLWTD WLLERKLYGY QAQHYVCMKH
201 VDGTCSWYRG HLPLRKEFVD IVQP
参见Greene等人，Molecular cloning and characterizationof human tissue inhibitor of metalloptoteinase 4，J.Biol.Chem.271(48)，30375-30380(1996)。
本发明的多肽抑制剂具有与这些TIMP相关的序列。但是，本多肽比这些TIMP更短而且更稳定。具体而言，本多肽抑制剂比那些天然可用的TIMP少大约100个氨基酸。因此，它们更简单、更便宜且更容易制备。更突出地，本抑制剂具有高度稳定化的β桶拓扑结构，其已经通过整合额外的半胱氨酸残基而增强。这种拓扑结构提供了抗变性和蛋白酶作用的抑制剂。
本多肽抑制剂能抑制多种类型的基质金属蛋白酶的活性。本多肽还能防止酶原基质金属蛋白酶的激活，以及抑制成熟基质金属蛋白酶的酶活性。例如，含有在多种TIMP中较高保守性的序列的多肽可用于提供通常对多种基质金属蛋白酶有效的抑制剂。不过，含有在各种TIMP中较低保守性的序列的多肽，例如，对特异性TIMP唯一的序列，可用于提供对个别基质金属蛋白酶特异性的抑制剂。
因此，本发明预期具有与任何TIMP相关的序列的多肽，以及具有一个或更多氨基酸替代天然存在于TIMP中的氨基酸的变体多肽作为基质金属蛋白酶的抑制剂。具有不同序列的多肽混合物也是预期的。通常，多肽序列，多肽变体以及多肽混合物被制成药剂，并以使伤口愈合，皮肤再生，并防止瘢痕形成或生成健康皮肤最优化的方式应用。因此，本多肽组合物和制剂可进行改变以便获得较低或较高的抑制水平，只要能促进愈合即可。
多肽抑制剂的大小可以变化。通常，只有大约5个氨基酸的多肽太小了而不能提供最优的抑制。不过，超过大约8到9个氨基酸的多肽的长度足以提供抑制。因此，虽然全长不是关键的，但是本发明中应用的通常是长度超过8个氨基酸的多肽。本发明中应用的其它多肽是长度超过9个氨基酸的。本发明还应用长度超过10个氨基酸的其他多肽。而且，长度超过大约15个氨基酸的多肽也可用于本发明。
多肽的大小没有特定的上限。不过，较长的多肽比较短的多肽更稳定。本发明的多肽抑制剂一般短于大约400个氨基酸。本发明中使用的很多多肽抑制剂短于大约300个氨基酸。本发明中使用的其它多肽抑制剂短于大约200个氨基酸。也可使用短于大约150个氨基酸的多肽。同样地，短于大约125个氨基酸的多肽也可用于本发明。
本发明提供的一个多肽具有SEQ ID NO：5的序列，如下所示。
 1 MCSCSPVHPQ QAFSNADVVI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP
41 IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG
81 GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPW
在大肠杆菌(E.coli)中表达后，可以在SEQ ID NO：5多肽的N-末端进行切割以缺失N-末端甲硫氨酸。这种多肽具有SEQ ID NO：20的序列，如下所示。
 1  CSCSPVHPQ QAFSNADVVI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP
41 IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG
81 GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPW
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽抑制剂显示了对基质金属蛋白酶-9以及其它基质金属蛋白酶优良的抑制特性。SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：20多肽抑制剂具有几种基本的和期望的特性。第一，这些蛋白容易以完全折叠和可溶的形式纯化。通过改变表达载体，在非细菌性系统，杆状病毒(bacculovirus)或哺乳动物细胞系中生产这些蛋白是可能的。第二，这些蛋白极其稳定而且寿命长。这种特性与β桶拓扑结构有关，所述β桶拓扑结构通过添加能形成稳定二硫键的半胱氨酸残基来维持和增强。这种稳定性对于将被引入到伤口环境的分子来说是一个重要的因素。第三，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽抑制剂是好的、广范围的基质金属蛋白酶抑制剂。它们能与基质金属蛋白酶形成寿命长的化学计量的复合物。第四，这些SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽抑制剂是免疫原性的，从而能容易地产生抗它们的抗体。这些抗体可用于在原位实验中追踪蛋白。第五，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽抑制剂包含很多芳族氨基酸(一个色氨酸和四个酪氨酸)。这种芳族氨基酸使SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：20多肽能适应很多内在荧光实验，减少用外在荧光团修饰蛋白的需要。
使用分子建模方法来设计SEQ ID NO：5多肽抑制剂。通过比对四种TIMP分子的氨基酸序列以限定高氨基酸同一性区域来构建蛋白。从而SEQ ID NO：5序列组成了衍生自序列比对研究的共有氨基酸序列。对TIMP-基质金属蛋白酶结构的公开三维模型中的接触区域的分析，发现可以除去不参与结合相互作用的大约100个氨基酸的蛋白结构域。将二硫键引入到合成的蛋白抑制剂中以稳定新的羧基末端。
可以在大肠杆菌中以高的产量生产SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽，并纯化成同质性(Hodges等人，1998；Liu等人，1997)。应用麦芽糖结合蛋白融合纯化方案，以便在数日内从粗提取物制备均质的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽。但是，SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：20多肽的分离不依赖于麦芽糖结合蛋白融合方案的使用。如果需要，编码SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20多肽或本发明任何其它多肽的核酸能被克隆到可利用的任何表达载体中。
使用杂交与酶合成的组合，从一系列短的寡核苷酸在大约三周内构建了编码SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽的核酸。把全长基因序列直接克隆到蛋白表达载体中，且序列通过DNA测序进行检验。核苷酸水平的设计通过将限制性内切核酸酶位点整合到序列中而有助于克隆实验，它还通过使用大肠杆菌密码子偏倚而有助于使蛋白表达最大化。
编码SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：20多肽的核酸为，例如，下文提供的SEQ ID NO：6。
  1 ATGTGCAGCT GCAGCCCGGT GCATCCGCAG CAGGCGTTTA
 41 GCAACGCGGA TGTGGTGATT CGCGCGAAAG CGGTGAGCGA
 81 AAAAGAAGTC GATAGCGGCA ACGATATTTA TGGCAACCCG
121 ATTAAACGCA TTCAGTATGA AATTAAACAG ATTAAAATGT
161 TTAAAGGCCC GGAAAAAGAT ATTGAATTTA TTTATACCGC
201 GCCGAGCAGC GCGGTGTGCG GCGTGAGCCT GGATGTGGGC
241 GGCAAAAAAG AATATTGCAT TGCGGGCAAA GCGGAAGGCG
281 ATGGCAAAAT GCATATTACC CTGTGCGATT TTATTTGCCC
321 GTGGTAGAAG CTTATAGAC
本发明还提供了与SEQ ID NO：6类似的核酸。具体而言，本发明提供了能在严格条件下与含有SEQ ID NO：6的核酸杂交的核酸。核酸杂交上下文中的“严格杂交条件”与“严格杂交洗涤条件”，是稍微序列依赖性的，而且根据核酸环境条件而可能有所不同。例如，较长的序列趋向于特定地在较高的温度杂交。核酸杂交的广用指南可见于Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecularbiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1页，第2章“Overview of principles of hybridization and the strategyof nucleic acid probe assays”Elsevier，New York(1993)。也可参见J.Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，pp 9.31-9.58(1989)；J.Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，N.Y.(第3版.2001)。
一般，选择高度严格的杂交和洗涤条件为比特定的双链序列在限定的离子强度和pH时的热解链温度(Tm)低大约5℃。例如，在“高度严格条件”或“高度严格杂交条件”下，核酸将以比与其它序列可检测地更高程度与它的互补序列杂交(例如，至少高于背景2倍)。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定100％互补的核酸。
可选择地，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测较低程度的相似性(异种探测)。通常，严格条件为如下条件，其中pH 7.0到8.3时盐浓度低于大约1.5M钠离子，一般为大约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，而且对于短核酸(例如，10到50个核苷酸)的温度为至少大约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)的温度为至少大约60℃。严格条件也可用添加去稳定剂如甲酰胺来获得。
示例的低严格条件包括用30到35％的甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液于37℃杂交，并在1×到2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl和0.3M柠檬酸三钠)中于50到55℃洗涤。示例的中度严格条件包括在40到45％的甲酰胺，1.0M NaCl，1％ SDS中于37℃杂交，并在0.5×到1×SSC中于55到60℃洗涤。示例的高度严格条件包括在50％甲酰胺，1M NaCl，1％ SDS中于37℃杂交，并在0.1×SSC中于60℃到65℃洗涤。
杂交中获得的杂交体的互补性或序列同一性程度通常为杂交后洗涤的函数，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。杂交核酸的类型和长度也影响杂交是否发生，以及形成的杂交体在给定的一套杂交和洗涤条件下是否稳定。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(Anal.Biochem.138：267-284(1984))的方程式近似得来：
Tm81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L其中M为单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，L是碱基对中杂交体的长度。Tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。
非常严格条件为选择等于Tm。
在DNA或RNA印迹中的过滤器上，用于具有超过100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的例子为42℃时具有1mg肝素的50％甲酰胺，所述杂交进行过夜。高度严格条件的例子为0.15M NaCl于72℃进行大约15分钟。严格洗涤条件的例子为0.2×SSC于65℃洗涤15分钟(也参见Sambrook，见上)。通常，高度严格洗涤先于低严格洗涤，以除去背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中度严格的例子为1×SSC于45℃进行15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤条件的例子为4-6×SSC于40℃进行15分钟。对于短探针(例如，大约10到50个核苷酸)，严格条件一般包括pH7.0到8.3时，低于大约1.0M钠离子的盐浓度，一般大约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，温度一般为至少30℃。
严格条件也可通过添加去稳定剂如甲酰胺获得。一般，在特定杂交测定中，比对于不相关探针观察到的高2×(或更高)的信噪比表明检测到了特定的杂交。在严格条件下彼此不杂交的核酸也基本上是相同的，如果该核酸编码的蛋白基本上是相同的话。在例如使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸的拷贝时将出现这种情况。
变体和衍生的多肽抑制剂
具有SEQ ID NO：1-5或20中的任何一个的多肽可预期作为本发明的多肽抑制剂。不过，具有SEQ ID NO：1-5或20中的任何一个的多肽的多肽变体和衍生物也可用作多肽抑制剂。这种多肽变体和衍生物可具有一个或多个氨基酸替代、缺失、插入或其它的修饰，只要多肽变体或衍生物能抑制基质金属蛋白酶即可。
分离的多肽的氨基酸残基可以是遗传编码的L-氨基酸，天然存在的非遗传编码的L-氨基酸，合成的L-氨基酸或上述任何氨基酸的D-对映体。这里用于二十种遗传编码的L-氨基酸和常用的非编码氨基酸的氨基酸符号为常规的，并如表1所示。
表1
  氨基酸   单字母符号   常用缩写
  丙氨酸   A   Ala
  精氨酸   R   Arg
  天冬酰胺   N   Asn
  天冬氨酸   D   Asp
  半胱氨酸   C   Cys
  谷氨酰胺   Q   Gln
  谷氨酸   E   Glu
  甘氨酸   G   Gly
  组氨酸   H   His
  异亮氨酸   I   Ile
  亮氨酸   L   Leu
  赖氨酸   K   Lys
  甲硫氨酸   M   Met
  苯丙氨酸  F   Phe
  脯氨酸  P   Pro
  丝氨酸  S   Ser
  苏氨酸  T   Thr
  色氨酸  W   Trp
  酪氨酸  Y   Tyr
  缬氨酸  V   Val
  β-丙氨酸   Bala
  2，3-二氨基丙酸   Dpr
  α-氨基异丁酸   Aib
  N-甲基甘氨酸(肌氨酸)   MeGly
  鸟氨酸   Orn
  瓜氨酸   Cit
  叔丁基丙氨酸   t-BuA
  叔丁基甘氨酸   t-BuG
  N-甲基异亮氨酸   MeIle
  苯基甘氨酸   Phg
  环己基丙氨酸   Cha
  正亮氨酸   Nle
  萘基丙氨酸   Nal
  吡啶基丙氨酸
  3-苯并噻吩基丙氨酸
  4-氯苯基丙氨酸   Phe(4-Cl)
  2-氟苯基丙氨酸   Phe(2-F)
  3-氟苯基丙氨酸   Phe(3-F)
  4-氟苯基丙氨酸   Phe(4-F)
  青霉胺   Pen
  1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸   Tic
  β-2-噻吩基丙氨酸   Thi
  甲硫氨酸亚砜   MSO
  高精氨酸  Harg
  N-乙酰基赖氨酸  AcLys
  2，4-二氨基丁酸  Dbu
  对氨基苯基丙氨酸  Phe(pNH2)
  N-甲基缬氨酸  MeVal
  高半胱氨酸  Hcys
  高丝氨酸  Hser
  ε-氨基己酸  Aha
  δ-氨基戊酸  Ava
  2，3-二氨基丁酸  Dab
包含在本发明范围内的多肽的一个或更多氨基酸可以被相似的化学和/或物理特性的氨基酸替代，只要这些变体或衍生多肽保持抑制基质金属蛋白酶活性、刺激成纤维细胞或角质细胞的细胞生长或刺激成纤维细胞的细胞迁移的能力即可。
能互相替代的氨基酸通常属于相似的类或亚类。如本领域技术人员所知，氨基酸可以分成三个主要类型：亲水氨基酸、疏水氨基酸和半胱氨酸样氨基酸，这主要根据氨基酸侧链的特性。这些主要类型可以进一步划分成亚类。亲水氨基酸包括具有酸性、碱性或极性侧链的氨基酸，疏水氨基酸包括具有芳族或非极性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可以进一步细分为其中包括脂族氨基酸。这里使用的氨基酸类型的定义如下：
“疏水氨基酸”指具有在生理pH时不带电，而且被水溶液排斥的侧链的氨基酸。遗传编码的疏水氨基酸的例子包括Ile、Leu和Val。非遗传编码的疏水氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳族氨基酸”指其侧链含有至少一个具有共扼π-电子系统(芳族基)的环的疏水氨基酸。芳族基可以进一步用取代基团如烷基、链烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基以及其它的基团取代。遗传编码的芳族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传编码的芳族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
“非极性氨基酸”指其侧链一般在生理pH时不带电并且是非极性的疏水氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸的例子包括甘氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。非编码的非极性氨基酸的例子包括Cha。
“脂族氨基酸”指具有饱和或不饱和直链、支链或环烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非编码的脂族氨基酸包括Nle。
“亲水氨基酸”指具有受水溶液吸引的侧链的氨基酸。遗传编码的亲水氨基酸的例子包括Ser和Lys。非编码的亲水氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”指其侧链pK值小于7的亲水氨基酸。酸性氨基酸由于失去了氢离子，一般具有在生理pH时带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。
“碱性氨基酸”指其侧链pK值大于7的亲水氨基酸。碱性氨基酸由于与水合氢离子结合，一般具有在生理pH时带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括非环状氨基酸鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“极性氨基酸”指其侧链在生理pH时不带电的亲水氨基酸，但是其具有一个键，其中通常由两个原子共享的电子对更靠近其中的一个原子。遗传编码的极性氨基酸的例子包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸、N-乙酰基赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
“半胱氨酸样氨基酸”指其侧链能与另一个氨基酸残基的侧链形成共价键如二硫键的氨基酸。一般，半胱氨酸样氨基酸通常具有含有至少一个硫羟(SH)基团的侧链。遗传编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括半胱氨酸。非遗传编码的半胱氨酸样氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
如本领域技术人员应当理解的，上述的分类不是绝对的。几种氨基酸显示了超过一种特征性特性，从而能包括在超过一种类型中。例如，酪氨酸既具有芳环又具有极性羟基。因此，酪氨酸具有双重特性，而且可以包括在芳族和极性类型中。类似地，除了能形成二硫键外，半胱氨酸也具有非极性特征。因此，虽然不能严格地划分为疏水或非极性氨基酸，但在很多情况中，半胱氨酸可用于使多肽具有疏水性。
本发明多肽和多肽类似物中的某些常见的氨基酸，其可能不是遗传编码的，而且可能存在或被一个氨基酸替代，包括但不限于，β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr)，4-氨基丁酸等等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；甲基甘氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；对氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸都落入上述定义的种类中。
上述的遗传编码和非遗传编码的氨基酸分类总结于下表2中。应当理解，表2只用于示例的目的，而不是为了对可能组成这里所述的多肽或多肽类似物的氨基酸残基的穷举。可用于制备这里所述的多肽和多肽类似物的其它氨基酸残基可见于如Fasman，1989，CRCPractical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology，CRCPress，Inc.，以及那里所引用的参考文献。基于已知的行为和/或它们的特征性化学和/或物理特性与具体确定的氨基酸相比较，这里没有具体提及的氨基酸可能被方便地划分到上述种类中。
表2
  分类   遗传编码的   遗传非编码的
  疏水的
  芳族的   F，Y，W   Phg，Nal，Thi，Tic，Phe(4-Cl)，Phe(2-F)，Phe(3-F)，Phe(4-F)，吡啶基Ala，苯并噻吩基Ala
  非极性的   M，G，P
  脂族的   A，V，L，I   t-BuA，t-BuG，MeIle，Nle，MeVal，Cha，bAla，MeGly，Aib
  亲水的
  酸性   D，E
  碱性   H，K，R   Dpr，Orn，hArg，Phe(p-NH2)，DBU，A2 BU
  极性的   Q，N，S，T，Y   Cit，AcLys，MSO，hSer
  半胱氨酸样的   C   Pen，hCys，β-甲基Cys
本发明的多肽的任何氨基酸都可以被任何相似分类的氨基酸替代，以产生变体或衍生多肽，只要多肽变体或衍生物保持抑制基质金属蛋白酶活性的能力即可。
因此，为了使本发明多肽抑制剂的结构和结合特性最优化，生产了全长氨基酸序列，其大约为四种已知TIMP序列的平均。这可以通过，例如，使用CLUSTAL程序(Higgins等人，1992)进行TIMP氨基酸序列的稳健逐对比对来完成。使用这种类型的比对构建共有序列。对于接触区域中的非保守氨基酸，可以进行保持接近的疏水特征，但是没有特定的侧链-侧链相互作用的替代。
可以鉴定参与结合的氨基酸，并与参与维持稳定的β桶拓扑结构的氨基酸区分开。在参与维持稳定的β桶拓扑结构的氨基酸中可以进行保守氨基酸替代。可以在参与与金属蛋白酶结合的氨基酸中进行保守性较差的，或者甚至不保守的氨基酸改变。
多肽抑制剂的C-末端结构域可以除去或添加额外的氨基酸。通过分析两种TIMP/MMP复合物的结构，很明显的只有N-末端TIMP区域与MMP的催化结构域显著接触。这后来通过使用MMP-9对接最终的蛋白模型而证实。
这种操作把SEQ ID NO：5蛋白的全长从一般TIMP大小的大约225个氨基酸减少到大约108个氨基酸。为了稳定化蛋白的新C-末端，在SEQ ID NO：5和20多肽中进行了两个另外的氨基酸的替代：Leu85和Val101变为半胱氨酸。结构研究显示，这两个残基正常在彼此的3内，而且如果变成半胱氨酸，则能形成二硫键。这样抑制剂多肽的最后的环状区域被在适当的位置锁定。而且，13位的半胱氨酸残基变为丝氨酸。从而SEQ ID NO：5和20多肽中的所有半胱氨酸残基(6)都参与了二硫键的形成。
可以进行类似的操作来调节SEQ ID NO：5和20多肽的稳定性或结合特性。例如，为了进一步增强本多肽抑制剂的稳定性，建立了最优化多肽抑制剂的同源模型。使用ProMod and SwissModel程序(Peitsch，1996；Peitsch等人，1996)，SEQ ID NO：5或20抑制剂的氨基酸序列可以穿过任何一种可用的TIMP的α碳的迹线。然后使用GROMOS 96 forcefield，对该模型进行能量最低化，使用SYBYLforcefield进行几轮分子力学几何学最优化(Clark等人，1989)。然后分析最终的最低化/最优化模型中差的侧链相互作用和扭转几何学。尽管已进行这些研究来产生含有SEQ ID NO：5序列的最优三维模型，但通过与TIMP-2比较(参见实施侧)进行了这些研究。通过与其它TIMP进行比较进行进一步分析，能产生具有改变的稳定性和结合特性的变体和衍生序列的多肽抑制剂。
最终的氨基酸序列然后可以逆向翻译，而且可以特定地选择核苷酸密码子来反映有机体中最优的密码子选择，在该有机体中表达多肽抑制剂，例如，在大肠杆菌，人类或昆虫细胞表达系统中。这些操作将使蛋白表达最大化。
SEQ ID NO：5多肽的长度为108个氨基酸，SEQ ID NO：20多肽的长度为107个氨基酸。本领域的技术人员可以选择进行一系列的羧基末端缺失来制备较短的多肽。在使用该方法的同时，本领域的技术人员可以选择保留C-末端附近的半胱氨酸残基。例如，SEQ ID NO：5多肽内的Cys101参与一个重要的二硫键相互作用。因此，可以在SEQID NO：5或20多肽上进行只有7个氨基酸的C-末端缺失，以产生稍微短点但是功能性的抑制剂多肽。可选择地，可以将半胱氨酸添加到截短的多肽抑制剂的C-末端，如果缺失了超过7个氨基酸的话。
在某些实施方案中还修饰了SEQ ID NO：5或20多肽的柔性环形区域，例如，通过缺失Val25与Glu47间的部分区域。这种缺失突变将保留主要的结合界面，但是可能除去了某些对TIMP-2样分子的结合特异性。
在一个实施方案中，本发明的多肽抑制剂包括任何一种具有SEQID NO：7的多肽。
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-
Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-
Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-
Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-
Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50-Xaa51-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Xaa55-Xaa56-
Xaa57-Xaa58-Xaa59-Xaa60-Xaa61-Xaa62-Xaa63-Xaa64-Xaa65-Xaa66-Xaa67-
Xaa68-Xaa69-Xaa70-Xaa71-Xaa72-Xaa73-Xaa74-Xaa75-Xaa76-Xaa77-Xaa78-
Xaa79-Xaa80-Xaa81-Xaa82-Xaa83-Xaa84-Xaa85-Xaa86-Xaa87-Xaa88-Xaa89-
Xaa90-Xaa91-Xaa92-Xaa93-Xaa94-Xaa95-Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaa100-
Xaa101-Xaa102-Xaa103-Xaa104-Xaa105-Xaa106-Xaa107-Xaa108
其中：
Xaa1、Xaa6、Xaa9、Xaa33、Xaa38、Xaa40、Xaa53、Xaa56、Xaa57、Xaa68、Xaa74、Xaa80、Xaa81、Xaa89、Xaa93、Xaa95、Xaa97和Xaa107分别为非极性氨基酸；
Xaa2、Xaa4、Xaa73、Xaa86、Xaa102和Xaa106分别为半胱氨酸样氨基酸；
Xaa3、Xaa5、Xaa10、Xaa11、Xaa14、Xaa15、Xaa26、Xaa32、Xaa34、Xaa37、Xaa39、Xaa45、Xaa46、Xaa50、Xaa65、Xaa66、Xaa69、Xaa70、Xaa76、Xaa85、和Xaa100分别为极性氨基酸；
Xaa7、Xaa12、Xaa16、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa22、Xaa24、Xaa25、Xaa30、Xaa36、Xaa41、Xaa44、Xaa48、Xaa51、Xaa61、Xaa64、Xaa67、Xaa71、Xaa72、Xaa75、Xaa77、Xaa79、Xaa87、Xaa88、Xaa91、Xaa99、Xaa101、和Xaa105分别为脂族氨基酸；
Xaa8、Xaa21、Xaa23、Xaa28、Xaa42、Xaa43、Xaa49、Xaa52、Xaa55、Xaa59、Xaa82、Xaa83、Xaa90、Xaa96和Xaa98分别为碱性氨基酸；
Xaa13、Xaa54、Xaa63和Xaa104分别为芳族氨基酸；
Xaa17、Xaa27、Xaa29、Xaa31、Xaa35、Xaa47、Xaa58、Xaa60、Xaa62、Xaa78、Xaa84、Xaa92、Xaa94和Xaa103分别为酸性氨基酸；而且
Xaa108为色氨酸；而且
其中该多肽具有β桶构象，并且能抑制基质金属蛋白酶的活性。
在一些实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa2、Xaa4、Xaa73、Xaa86、Xaa102和Xaa106位置具有半胱氨酸而不是半胱氨酸样氨基酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽在Xaa1位置具有甲硫氨酸。可选择地，由于在用于表达多肽抑制剂的细胞内天然发生的加工，Xaa1氨基酸丢失。落入SEQ ID NO：7内的目的多肽也可在Xaa53或Xaa97位置中的任何一个具有甲硫氨酸。
在其它实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa3、Xaa5、Xaa14、Xaa26、Xaa32、Xaa66、Xaa69、Xaa70、Xaa76或Xaa100位置中的任何一个具有丝氨酸或苏氨酸。
在其它实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa7、Xaa12、Xaa16、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa22、Xaa24、Xaa25、Xaa30、Xaa36、Xaa41、Xaa44、Xaa48、Xaa51、Xaa61、Xaa64、Xaa67、Xaa71、Xaa72、Xaa75、Xaa77、Xaa79、Xaa87、Xaa88、Xaa91、Xaa99、Xaa101或Xaa105位置中的任何一个具有丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa8或Xaa98位置中的任何一个具有组氨酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa6、Xaa9、Xaa40、Xaa57、Xaa68或Xaa107位置中的任何一个具有脯氨酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa10、Xaa11、Xaa15、Xaa34、Xaa39、Xaa45或Xaa50位置中的任何一个具有天冬酰胺或谷氨酰胺。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，Xaa13、Xaa54、Xaa63或Xaa104位置中的任何一个具有苯基丙氨酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa17、Xaa27、Xaa29、Xaa31、Xaa35、Xaa47、Xaa58、Xaa60、Xaa62、Xaa78、Xaa84、Xaa92、Xaa94或Xaa103位置中的任何一个具有天冬氨酸或谷氨酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa21、Xaa23、Xaa28、Xaa42、Xaa43、Xaa49、Xaa52、Xaa55、Xaa59、Xaa82、Xaa83、Xaa90或Xaa96位置中的任何一个具有赖氨酸或精氨酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa37、Xaa46、Xaa65或Xaa85位置中的任何一个具有酪氨酸。
在其它的实施方案中，落入SEQ ID NO：7内的目的多肽，在Xaa33、Xaa38、Xaa56、Xaa74、Xaa80、Xaa81、Xaa89、Xaa93或Xaa95位置中的任何一个具有甘氨酸。
因此，在一个实施方案中，本发明的多肽具有SEQ ID NO：21Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50-Xaa51-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Xaa55-Xaa56-Xaa57-Xaa58-Xaa59-Xaa60-Xaa61-Xaa62-Xaa63-Xaa64-Xaa65-Xaa66-Xaa67-Xaa68-Xaa69-Xaa70-Xaa71-Xaa72-Xaa73-Xaa74-Xaa75-Xaa76-Xaa77-Xaa78-Xaa79-Xaa80-Xaa81-Xaa82-Xaa83-Xaa84-Xaa85-Xaa86-Xaa87-Xaa88-Xaa89-Xaa90-Xaa91-Xaa92-Xaa93-Xaa94-Xaa95-Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaa100-Xaa101-Xaa102-Xaa103-Xaa104-Xaa105-Xaa106-Xaa107-Xaa108
其中：
Xaa1、Xaa53 and Xaa97分别为甲硫氨酸；
Xaa2、Xaa4、Xaa73、Xaa86、Xaa102和Xaa106分别为半胱氨酸；
Xaa3、Xaa5、Xaa14、Xaa26、Xaa32、Xaa66、Xaa69、Xaa70、Xaa76和Xaa100分别为丝氨酸或苏氨酸；
Xaa7、Xaa12、Xaa16、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa22、Xaa24、Xaa25、Xaa30、Xaa36、Xaa41、Xaa44、Xaa48、Xaa51、Xaa61、Xaa64、Xaa67、Xaa71、Xaa72、Xaa75、Xaa77、Xaa79、Xaa87、Xaa88、Xaa91、Xaa99、Xaa101和Xaa105分别为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；
Xaa8和Xaa98分别为组氨酸；
Xaa6、Xaa9、Xaa40、Xaa57、Xaa68和Xaa107分别为脯氨酸；
Xaa10、Xaa11、Xaa15、Xaa34、Xaa39、Xaa45和Xaa50分别为天冬酰胺和谷氨酰胺；
Xaa13、Xaa54、Xaa63和Xaa104分别为苯丙氨酸；
Xaa17、Xaa27、Xaa29、Xaa31、Xaa35、Xaa47、Xaa58、Xaa60、Xaa62、Xaa78、Xaa84、Xaa92、Xaa94和Xaa103分别为天冬氨酸或谷氨酸；
Xaa21、Xaa23、Xaa28、Xaa42、Xaa43、Xaa49、Xaa52、Xaa55、Xaa59、Xaa82、Xaa83、Xaa90和Xaa96分别为赖氨酸或精氨酸；
Xaa37、Xaa46、Xaa65和Xaa85分别为酪氨酸；
Xaa33、Xaa38、Xaa56、Xaa74、Xaa80、Xaa81、Xaa89、Xaa93和Xaa95分别为甘氨酸；
Xaa108为色氨酸；而且
其中该多肽具有β桶构象，并且能抑制基质金属蛋白酶的活性。
本发明的目的多肽抑制剂具有β桶构象。如这里所使用的，β桶构象指多肽的中心含有能折叠成桶状三级结构的β链二级结构。通过链内氢键结合和内部疏水堆积相互作用可以稳定β桶。β桶是蛋白结构和功能领域的技术人员已知的公认的三级结构。
本发明中，基础的β桶构象，可以通过能帮助维持折叠多肽的全面拓扑结构的设计的二硫键来进一步稳定。例如，具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20的多肽，能折叠成带有三个交联分离的β肽链的二硫键的6链β桶构象。参与结合基质金属蛋白酶的氨基酸呈现于桶状结构的表面。
多肽的构象可通过本领域技术人员可用的任何程序来确定。例如，可通过X-射线晶体学或通过计算机建模来确定构象。例如，计算机建模可以使用程序如Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)和Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)程序进行。建模工作可以在任何可用的具有足够速度和RAM的计算机上进行。例如，这里提供的很多计算机建模工作在运行Windows 95的Compaq PC，以及Silicon Graphics，Inc.Octane UNIX工作站上进行。此外，在OctaneUNIX工作站中使用来自Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子包。
为了进行比较，选择的基质金属蛋白酶(MMP)的三维结构文件可以从如下的蛋白数据库(Protein Databank)下载(文件名，参考文献)：MMP-1(1FBL，Li等人，1995)，MMP-2(1GEN，Libson等人，1995)，MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等人，1995；Reinemer等人，1994)，MMP-9(1MMQ，Browner等人，1995)，TIMP-2/MT-1 MMP复合物(1BUY，Fernandez-Catalan等人，1998)，TIMP-2(1BR9，Tuuttila等人，1998)和TIMP-1/MMP复合物(1UEA，Gomis-Ruth等人，1997；Huang等人，1996；Becker等人，1995)。这些文件可用于分析，并与天然存在的TIMP蛋白比较多肽抑制剂的三维结构，而且能促进鉴定负责与不同基质金属蛋白酶的特异性结合相互作用的氨基酸。
多肽抑制基质金属蛋白酶活性的能力可通过本领域技术人员可用的任何方法来评定。很多不同的测定方法可用于评定一种试剂能否用作蛋白酶活性的抑制剂。例如，可使用当被蛋白酶切割时能产生可检测信号的蛋白底物。在一些实施方案中，在存在和不存在测试抑制剂时，基质金属蛋白酶的活性可通过观察荧光素化的蛋白底物的酶促水解来测定，例如，作为时间的函数。这种荧光素化蛋白底物的一个例子是获自Molecular Probes，Inc.的荧光素化胶原蛋白。这种荧光素化蛋白底物可与选择的基质金属蛋白酶或选择的基质金属蛋白酶混合物一起温育。荧光素化蛋白底物的切割可通过观察随时间过去的吸光度增加来检测。在测定混合物中可使用各种量的底物和/或测试多肽抑制剂，来确定存在什么浓度作用，以及什么量的抑制剂对抑制基质金属蛋白酶是最优的。
从而可以改变本多肽的序列来调节多肽抑制剂对不同的基质金属蛋白酶的亲和力。因为需要某些蛋白酶活性(甚至在慢性伤口中)来调节细胞外的基质重组(Agren 1999)，所以在某些实施方案中，渴望构建不抑制具有极低的Ki值的基质金属蛋白酶的抑制剂。例如，本多肽的Ki值可为从大约1μM到1mM。这种多肽将具有使得可以有某种瞬时基质金属蛋白酶活性的能力(归因于相对高的Ki)。
多肽抑制剂([I])的抑制常数(Ki)可使用Segel(1993)提供的方法，利用Dixon图(1/v对[I])测定，即：
斜率(slope)＝Km/(Vmax Ki [S])        (1)
其中Km为米氏常数，Vmax是反应的最大速度，[S]为底物浓度。慢性伤口中也可通过调节抑制剂剂量和使用时间选择，来控制抑制剂活性的程度和时间选择。
期望本发明多肽抑制剂的毒性较低。但是，如果有担心，则细胞毒性可通过将各种量的多肽添加到培养物中的成纤维细胞或角质细胞来进行测定。可以监控这些细胞的生长和细胞完整性，来评定选择的多肽抑制剂是否具有任何负面作用。
可通过将选择的多肽导入到伤口中，并测量在存在该多肽时愈合速度是否改变，来评定选择的多肽抑制剂的愈合速度。例如，可测定存在和不存在多肽时的伤口愈合速度。虽然可使用任何伤口，但是优选具有预期特性的伤口模型。例如，存在可使用的两种动物慢性伤口模型。第一种是缺血性兔耳模型，第二种为诱导的糖尿病大鼠模型。
多肽修饰
本发明还预期修饰多肽抑制剂以使它们稳定，以促进它们的摄取和吸收，并改善本领域技术人员已知的多肽的任何其它特征或特性。例如，可以环化多肽抑制剂，可以中和多肽抑制剂上的电荷，而且可以把多肽连接到其它化学部分。
具有适于在多肽内或与其它部分形成这种键的功能基团的两种侧链间的各种反应，以及适于形成这种键的反应条件，对于本领域技术人员是显而易见的。所需的反应条件是足够温和的以便不降解多肽或另外损害多肽。用于保护必要的各种功能性的的合适的基团是本领域熟知的(参见，例如，Greene & Wuts，1991，第2版，John Wiley &Sons，NY)，用于制备这种被保护的分子的各种反应方案也是本领域熟知的。
在一个实施方案中，可以有效地除去N-末端和C-末端的电荷。这可通过本领域技术人员可用的任何方法来完成，例如，通过使N-末端乙酰化以及使C-末端酰胺化。
以各种方式制备和修饰多肽的方法是本领域所熟知的(参见，例如，Spatola，1983，Vega Data 1(3)的综述)；Spatola，1983，“Peptide Backbone Modifications”In：Chemistry andBiochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins(Weinstein，ed.)，Marcel Dekker，New York，p.267(综述)；Morley，1980，Trends Pharm.Sci.1：463-468；Hudson等人，1979，Int.J.Prot.Res.14：177-185(--CH2NH--，--CH2CH2--)；Spatola等人，1986，Life Sci.38：1243-1249(--CH2--S)；Hann，1982，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1：307-314(--CH＝CH--，顺式和反式)；Almquist等人，1980，J.Med.Chem.23：1392-1398(--COCH2--)；Jennings-White等人，Tetrahedron.Lett.23：2533(--COCH2--)；欧洲专利申请EP 45665(1982)CA：97：39405(--CH(OH)CH2--)；Holladay等人，1983，Tetrahedron Lett.24：4401-4404(--C(OH)CH2--)和Hruby，1982，Life Sci.31：189-199(--CH2--S--)。
伤口愈合组合物
本发明多肽可用于愈合伤口，尤其有益于慢性伤口愈合。单个多肽、多肽变体、多肽衍生物及其混合物(如具有不同序列的那些)可以组合在一种制剂中，来促进伤口愈合以及预防或治疗皮肤问题。最优的愈合和皮肤再生可能需要一些基质金属蛋白酶活性。因此，本发明的组合物和制剂不必要促进基质金属蛋白酶的最大抑制。相反，由于需要使愈合最优化和促进健康皮肤发育，可以改变多肽抑制剂制剂的活性。可通过改变抑制剂多肽的类型、含量和量来获得较低或较高水平的抑制，从而促进愈合和健康皮肤发育。
为了促进健康皮肤发育和/或治疗伤口，可以通过本领域技术人员选择的任何方式把本发明多肽导入到皮肤或伤口中。例如，多肽可以制成治疗组合物，其含有治疗有效量的一种或多种多肽和药物载体。可以以乳膏、喷雾、泡沫、凝胶或任何其它方式或制剂的形式，把这种组合物引入到皮肤或伤口中。在其它的实施方案中，本发明的多肽可以制成皮肤覆盖物或敷料，其含有浸渗到覆盖物或敷料物质中，与覆盖物或敷料物质共价附着或其它连接的治疗有效量的一种或多种多肽。在一个实施方案中，皮肤覆盖物或敷料可以释放多肽抑制剂。多肽抑制剂可以以无控制或控制的方式释放。从而，本发明的皮肤覆盖物或伤口敷料可提供多肽抑制剂向伤口中较慢的或定时的释放。皮肤覆盖物和敷料材料可以是本领域使用的任何材料，包括绷带、纱布、无菌包裹物、水凝胶、水胶体及类似材料。
本发明多肽的治疗有效量是，能抑制基质金属蛋白酶到促进健康皮肤发育和/或伤口愈合所需的程度的多肽量。例如，当存在于治疗或药物组合物中时，本发明多肽的量的范围为组合物重量的大约0.001％到大约35％。多肽可以构成组合物重量的大约0.5％到大约20％。可选择地，多肽构成组合物重量的大约1.0％到大约10％。多肽抑制剂的治疗有效量随施用途径可以必要地改变。例如，每kg体重30到112,000μg的治疗量可有效用于静脉内施用。不过，健康皮肤发育或伤口治疗所需的多肽抑制剂的量，不但随着施用途径而改变，而且还随被治疗的状况的性质以及患者的年龄和状况而改变，并最终由主治医师或临床医生判断。
施用的剂量和方法根据要治疗的皮肤或组织的位置和/或伤口的严重性可以改变。多肽和多肽缀合物的有用剂量，可通过使它们在这里所述的动物模型中的体外活性和体内活性相关联来确定。化合物可以以单位剂型方便地施用；例如，每单位剂型中含有大约0.001μg到大约10mg，方便地大约0.01μg到大约5mg，更方便地，大约0.10μg到大约1mg，甚至更方便地大约1.0μg到大约500μg多肽。所需的剂量可以存在于单次剂量中，作为分次剂量，或者作为连续输注。所需的剂量也可以以适当的间隔施用，例如，以每天两次，三次，四次或者更多的亚剂量(subdose)。本领域的技术人员可以使用这里提供的教导，很容易地从可用的信息制备和施用有效的制剂
本发明的多肽抑制剂可制备成药物组合物，并以适合于所选的施用途径的各种剂型施用给哺乳动物宿主如人类患者，所述施用途径即口服或肠胃外，通过静脉内、肌内、局部或皮下途径。
因此，多肽抑制剂可以全身施用，例如，通过静脉内或腹膜内输注或注射。可以在水中制备多肽抑制剂溶液，任选与无毒的表面活性剂混合。也可以在甘油、液态聚乙二醇、甘油三醋酸酯及其混合物和油类中制备分散体。在一般的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射或输注或局部应用的药物剂型包括含有活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其适于无菌的可注射或可输注溶液或分散体的临时制备，优选被囊化到脂质体中。在所有的情况中，最终剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、流动的并稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、聚乙二醇、液态聚乙二醇，等等)、植物油类、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以通过例如，形成脂质体，在分散体的情况中保持所需的颗粒大小，或通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氨丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等来防止微生物的作用。在一些情况中，本领域的技术人员可以选择包括等渗剂，例如，糖、缓冲液或氯化钠。可通过使用延迟吸收的试剂例如，单硬脂酸铝和明胶的组合物来延长可注射组合物的吸收。
如所需要的，无菌可注射溶液可通过把多肽或多肽缀合物以所需的量整合到带有上面所列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备，接着进行过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生了活性成分的粉末，再加上存在于预先无菌过滤溶液中的任何额外的所需成分。
在一些例子中，多肽抑制剂也可以组合药学上可接受的载体如惰性稀释剂或可同化的可食用载体经口施用。它们可以装入到硬或软壳明胶胶囊中，可以压缩成片剂，或可以直接与患者膳食的食物整合。对于口服治疗的施用，多肽抑制剂可以与一种或多种赋形剂组合，而且可以以可吸收的片剂、口腔片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等等的形式使用。这些组合物和制剂应含有至少0.1重量％的活性化合物。组合物和制剂的百分数，当然可以不同，而且方便地可以为给定单位剂型重量的大约2到大约60％。这种治疗有用的组合物中活性化合物的量为可获得有效剂量水平的量。
片剂、糖锭、药丸、胶囊等等也可含有下述成分：粘合剂如西黄著胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等等；润滑剂硬脂酸镁；且可添加增甜剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或增香剂如胡椒薄荷、冬绿油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除上述类型材料以外，它可含有液体载体，如植物油或聚乙二醇。也可存在各种其它材料作为涂层，或另外用于修饰固体单位剂型的物理形状。例如，片剂、药丸或胶囊也可用明胶、蜡、虫胶或糖等等涂敷。糖浆或酏剂也可含有活性组合物、蔗糖或果糖作为增甜剂，含有甲基和对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，含有染料和调味剂如樱桃或柑橘食用香料。当然，制备任何单位剂型中使用的任何材料必须是药学上可接受的而且在使用量基本上是无毒的。此外，多肽抑制剂可以整合到持续释放制剂和装置中。
有用的固体载体包括精细分割的固体，如滑石、粘土、微晶纤维素、硅石、氧化铝等等。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇掺和物，本化合物可以以有效水平溶解于或分散于其中，任选在非毒性表面活性剂的帮助下。也可加入佐剂如香料和额外的抗微生物剂以使给定应用的特性最优化。
增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料也可与液体载体一起使用，以形成可涂布的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等等，直接应用于使用者的皮肤。
总之，本发明的多肽可以局部施用，用于伤口治疗和促进健康皮肤发育。活性多肽可以通过任何方式直接或间接地局部施用给选择的组织，作为喷雾、泡沫、粉末、乳膏、胶冻、糊剂、栓剂或溶液。本文中使用的术语糊剂，应当包括如常直接应用于皮肤或涂布到绷带或敷料上的乳膏和其它粘稠的可涂布组合物。本发明的多肽可以共价附着到，稳定吸附到或者另外应用到皮肤覆盖物或伤口敷料材料上。为了在手术后促进愈合，本发明的活性多肽可直接应用于靶组织或假器官装置或可植入的持续释放装置。组合物可通过气溶胶作为泡沫或雾，带有或不带有其它试剂，直接施用到皮肤或伤口上。
多肽可以以制剂的形式施用，该制剂包括位于蜡、油、乳化剂、水和/或基本上水溶性的材料中的多肽乳剂，在存在水时可形成凝胶。该制剂提供乳剂所需的特性，因为它是可涂布的，而且具有乳剂的乳脂状的一致性，而当进行正常的灭菌操作如蒸汽灭菌时没有分解，因为凝胶使乳剂稳定。它还显示了比常规凝胶好的水保留性能，因为水被保持在乳剂和凝胶中。
制剂可以含有湿润剂，来减少水在乳膏或洗剂中的蒸气分压，以降低乳膏或洗剂干燥的速度。合适的湿润剂能与水很大程度的混合，并通常适合应用于皮肤。多元醇特别适于该目的，且合适的多元醇包括单丙二醇或丙三醇(甘油)。多元醇可以以总制剂的20-50％(按重量计算)的比例存在；可选择地该范围为30-40％。多元醇这种相对高的比例也确保了，如果糊剂干燥到任何程度，得到的糊剂保持柔软和柔韧，因为丙三醇可用作聚合物的增塑剂。例如，当糊剂应用到绷带时，它因此仍然可以很容易地从皮肤上除掉，而当糊剂失去水时没有必要割掉绷带。多元醇还具有当它与皮肤或伤口尤其是感染的伤口接触时，能防止细菌在糊剂中增殖的优点。
制剂可包括其它成分如抗细菌剂、抗真菌剂、抗炎剂等等。还发现其它的成分适于整合到制剂中。
用于乳剂的蜡的例子是单硬脂酸甘油酯，或单硬脂酸甘油酯与PEG100硬脂酸酯的组合，PEG100硬脂酸酯可作为CITHROL GMS/AS/NA从Croda Universal Ltd商业获得。该组合提供了蜡和乳化剂(PEG100硬脂酸酯)，该乳化剂特别与蜡相容，用于形成水中的乳剂。制剂中可包括第二种乳化剂，以增加乳剂的稳定性，例如，PEG20硬脂酸酯，如Croda Universal Ltd提供的CITHROL 10MS。乳膏中乳化剂的总浓度一般在3-15％范围内。使用两种乳化剂时，一个可以以大于另一个的浓度存在。
水不溶性材料与制剂的水形成凝胶。从而该材料是亲水的，但却不是任意大程度地溶于水。该材料可以是聚合材料，例如，水吸收的但不是水溶性的聚合物。不过，也可以使用与水形成凝胶，而且在升高的温度仍然稳定的非聚合材料，例如，粘土如高岭土或膨润土。本发明中使用的一些聚合物为高吸水性聚合物，如WO-92/16245中公开的那些聚合物，而且其包括部分交联以形成三维结构的亲水纤维素衍生物。合适的交联纤维素衍生物包括那些羟基低碳烷基纤维素，其中烷基包括1到6个碳原子，例如，羟乙基纤维素或羟丙基纤维素，或羧基纤维素例如羧甲基羟乙基纤维素或羧甲基纤维素。可用于本发明的聚合物的例子是部分交联的羧甲基纤维素钠聚合物，其由AkzoChemicals B.V.作为AKUCELL X181提供。该聚合物为高吸水性聚合物，因为它能吸收至少10倍于它自身重量的水。聚合物的交联结构预防它溶于水中，但是水能很容易地吸收到并保持于聚合物的三维结构中以形成凝胶。水从这种凝胶中比从溶液中较慢地失去，而且这在减慢或防止乳膏制剂干燥中是有利的。制剂的聚合物含量通常低于10％，例如，聚合物含量范围为按重量计算大约0.5％到大约5.0％，或按重量计算大约1.0％到大约2％。
可以将制剂灭菌，而且应该通过改变聚合物含量来选择制剂的成分，以提供成品所需的流动性能。也即，如果产品需要灭菌，必须选择制剂以在灭菌之前给出具有相对高的粘度/弹性的产品。如果制剂的某些成分不需要灭菌，可以在添加那些成分之前对制剂进行灭菌，或者每种成分可以单独灭菌。制剂可以通过在无菌条件下混合各种已灭菌的成分来进行制备。当成分单独进行灭菌，然后一起混合时，可以调整聚合物的含量来提供具有成品所需的流动性能的产品。乳剂的含量确定了制剂的处理性能和触感，较高的乳剂含量导致了提高的可涂布性和乳脂状。
制剂可以包装到用于储存的试管、盆或其它合适形式的容器中，或者它可以涂布到基质上，然后接着包装。合适的基质包括敷料，包括膜敷料和绷带。
下述的实施例的目的是为了阐明而不是限制本发明。
实施例1：方法
该实施例提供了用于各个实验的材料和方法。
分子生物学方法：细菌生长条件和培养如Miller(1972)所述的进行。除非另有说明，该研究中进行的所有操作都根据Maniatis等人(1982)或Sambrook等人(1989)或Sambrook等人(2001)；包括，琼脂糖凝胶电泳和限制性内切核酸酶消化。所有PCR反应中使用的Vent DNA聚合酶都购自New England Biolabs，并与提供的缓冲液一起使用。DNA测序(Sanger等人，1977)使用Applied Biosystems，Inc.的自动测序仪进行，并通过Genosys，Inc.进行。DNA寡核苷酸由Genosys，Inc.合成。蛋白浓度使用牛血清清蛋白(BSA)作为标准物根据Bradford(1976)的方法确定，或者使用11,300M-1cm-1的计算摩尔吸光系数通过分光光度测定确定。使用来自BioRad，Inc.的7×250mm BioSelect SEC-125柱，根据Siegel和Monty(1966)所述进行分析型凝胶过滤实验。所有的细菌菌株购自New England Biolabs，Inc.。蛋白SDS PAGE凝胶按照Laemmli(1970)所述制备、运行和处理。化学试剂和层析树脂来自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)，除非有具体说明。
分子建模：分子建模利用两种可视化程序，Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)与Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)。建模工作在运行Windows 95的Compaq PC，以及SiliconGraphics，Inc.Octane UNIX工作站上进行。此外，来自MolecularSimulations，Inc.的Cerius2分子包可用于Octane上。选择的基质金属蛋白酶(MMP)的三维结构文件可从如下的蛋白数据库(文件名，参考文献)下载：MMP-1(1FBL，Li等人，1995)、MMP-2(1GEN，Libson等人，1995)、MMP-8(1JAO，1JAN，Grams等人，1995；Reinemer等人，1994)、MMP-9(1MMQ，Browner等人，1995)、TIMP-2/MT-1 MMP复合物(1BUV，Fernandez-Catalan等人，1998)、TMP-2(1BR9，Tuuttila等人，1998)和TIMP-1/MMP复合物(1UEA，Gomis-Ruth等人，1997；Huang等人，1996；Becker等人，1995)。这些文件可用于分析蛋白的三维结构，各个位置氨基酸的化学性质，以及MMP-TIMP接触界面的保守和变异氨基酸的鉴定。该信息可用于设计将结合很多基质金属蛋白酶的本发明的抑制剂。
第一步开始于全长氨基酸序列，其为四种已知TIMP序列的平均。使用CLUSTAL程序(Higgins等人，1992)计算四种TIMP氨基酸序列的文件逐对比对。基于这种比对构建共有序列。对于接触区域中的非保守氨基酸，可以进行保持接近的疏水特征，但是没有特定的侧链-侧链相互作用的替代。通过该实践，获得了共有的结合界面。TIMP-2的大柔性环部分，其在TIMP-1中是不明显的，被构建回到带有几个氨基酸序列改变的多肽抑制剂中。
第二步是除去共有抑制剂分子的C-末端结构域。通过分析两种TIMP/MMP复合物的结构，确定了只有N-末端TIMP区域与MMP的催化结构域显著接触。这后来通过使用MMP-9对接最终的蛋白模型而确认。这种操作把蛋白的全长从225个氨基酸减少到108个氨基酸。为了稳定化蛋白的新C-末端，进行了两个额外的氨基酸的替代：Leu85和Val101变为半胱氨酸。观察到这两个残基在彼此的3内。因此，用半胱氨酸进行替代将使得能够形成二硫键。这样蛋白的最后的环状区域被在适当位置锁定。而且，13位的半胱氨酸残基变为丝氨酸。从而最终蛋白抑制剂中的6个半胱氨酸残基可用于参与形成二硫键。
第三步需要构建新蛋白抑制剂的同源模型。利用ProMod andSwissModel程序(Peitsch，1996；Peitsch等人，1996)，抑制剂最后的108个氨基酸可穿过TIMP-2的α碳迹线。使用GROMOS 96forcefield，可对该模型进行能量最低化，使用SYBYL forcefield进行几轮分子力学几何学最优化(Clark等人，1989)。然后分析最终的最低化/最优化模型中差的侧链相互作用和扭转几何学。
来自这种三维建模的最终多肽抑制剂具有SEQ ID NO：5的序列，并命名为DST。该首字母缩略词为 Delta(最终蛋白的C-末端TIMP结构域缺失) Synthetic(它是基于制作的结构和同源建模的) TIMP(由于它基于TIMP1-2的结构)的缩写。
基因设计、构建和克隆：最终的SEQ ID NO：5氨基酸序列使用标准的遗传密码逆向翻译。密码子选择基于大肠杆菌的密码子偏倚，意思是选择用于特定氨基酸的最终密码子是大肠杆菌中于该氨基酸的最常用密码子。全长结构基因为327bp。为了构建该基因序列，横跨编码区的10条单链寡核苷酸由Genosys，Inc.合成。寡核苷酸长度为70个核苷酸。每条寡核苷酸都与另一条寡核苷酸互补，以便与它的结合配偶体杂交，得到的片段含有50个碱基对的中心双链体区域，而且每个末端侧面为10个核苷酸的单链区域。使用的寡核苷酸序列显示于表3中。
表3：用于构建抑制剂核酸的寡核苷酸
1：ATGTGCAGCT GCAGCCCGGT GCATCCGCAG CAGGCGTTTA
   GCAACGCGGA TGTGGTGATT CGCGCGAAAG-3′(SEQ ID NO：8)
2：CGGTGAGCGA AAAAGAAGTC GATAGCGGCA ACGATATTTA
   TGGCAACCCG ATTAAACGCA TTCAGTATGA-3′(SEQ ID NO：9)
3：AATTAAACAG ATTAAAATGT TTAAAGGCCC GGAAAAAGAT
   ATTGAATTTA TTTATACCGC GCCGAGCAGC-3′(SEQ ID NO：10)
4：GCGGTGTGCG GCGTGAGCCT GGATGTGGGC GGCAAAAAAG
   AATATTGCAT TGCGGGCAAA GCGGAAGGCG-3′(SEQ ID NO：11)
5：ATGGCAAAAT GCATATTACC CTGTGCGATT TTATTTGCCC
   GTGGTAGAAG CTTATAGAC-3′(SEQ ID NO：12)
6：TCGCTCACCG CTTTCGCGCG AATCACCACA TCCGCGTTGC
   TAAACGCCTG CTGCGGATGC ACCGGGCTGC AGCTGCACAT-3′
   (SEQ ID NO：13)
7：CTGTTTAATT TCATACTGAA TGCGTTTAAT CGGGTTGCCA
   TAAATATCGT TGCCGCTATC GACTTCTTTT-3′(SEQ ID NO：14)
8：CGCACACCGC GCTGCTCGGC GCGGTATAAA TAAATTCAAT
   ATCTTTTTCC GGGCCTTTAA ACATTTTAAT-3′(SEQ ID NO：15)
9：ATTTTGCCAT CGCCTTCCGC TTTGCCCGCA ATGCAATATT
   CTTTTTTGCC GCCCACATCC AGGCTCACGC-3′(SEQ ID NO：16)
10：GTCTATAAGC TTCTACCACG GGCAAATAAA ATCGCACAGG
    GTAATATGC-3′(SEQ ID NO：17)
11：ATGTGCAGCTGCAGCCCGGT-3′(SEQ ID NO：18)
12：GTCTATAAGC TTCTACCACG-3′(SEQ ID NO：19)
抑制剂核酸(SEQ ID NO：6)的构建以三个独立的步骤完成。
第一，5μg的每种寡核苷酸以及它的互补结合配偶体(用于5个独立反应)在10mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM NaCl中混合到一起，终体积为10μL。杂交混合物中使用的特定寡核苷酸为(参见表3)：(1与6)、(2与7)、(3与8)、(4与9)以及(5与10)。混合物在95℃的水浴中加热10分钟。停止加热，使整个水浴在5个小时时间段内冷却到室温。
第二步，把来自5个“缓慢冷却”反应中每个的等分试样(10μL)混合到一起(终体积为50μL)。试管于45℃加热10分钟，然后置于冰浴中。将T4 DNA连接酶和缓冲液(New England Biolabs)加入到试管中，反应物(终体积60μL)于16℃温育20小时。
第三步，具有SEQ ID NO：6的全长核酸使用两个PCR引物(表3，11和12)而选自那些片段混合物，其中两个PCR引物与结构基因的最5’和3’末端互补。该步骤确保只有全长核酸将被扩增。此外，3’扩增引物含有Hind III位点以促进克隆。PCR反应使用1μL前面一段中所述的连接混合物进行。使用的PCR条件如下：95℃，1分钟；49℃，1分钟；72℃，30秒。在Techne Progene PCR装置中进行30个循环的该程序。最后一个PCR循环之后，于72℃进行10分钟延伸温育。PCR反应产物通过DNA琼脂糖凝胶电泳确认。
PCR反应产物通过Promega DNA Wizard PCR纯化试剂盒进行纯化。在克隆之前，在存在ATP时用T4 DNA聚合物处理DNA片段，以确保完全双链的末端。该反应根据New England Biolabs，Inc.的说明书进行。DNA使用Promega DNA Wizard PCR纯化试剂盒进行再次纯化。然后DNA用Hind III消化，并通过乙醇沉淀进行纯化。最终的DNA重悬于小体积的10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA中。
克隆载体，pMAL-c2(New England Biolabs)，用Xmn I和HindIII进行消化，并使用Promega DNA纯化试剂盒进行纯化。该消化产生了线性载体，其含有与DNA片段的5’平端以及3’Hind III末端相容的3’平端和5’Hind III末端。该组合确保了SEQ ID NO：6 DNA片段的定向框内克隆。载体和SEQ ID NO：6 DNA片段以大约1∶10的摩尔比例混合，然后在存在T4 DNA连接酶时于16℃连接20个小时(总反应体积为20μL)。用5μL连接反应物转化感受态JM109细菌。在与带有60μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上生长后，选择单个菌落，并使用Promega小量制备DNA分离试剂盒，通过小量制备方法从这些菌落纯化质粒。通过DNA琼脂糖凝胶电泳，限制性内切核酸酶消化，最后通过DNA测序对分离的质粒进行估计。编码SEQ ID NO：5多肽的质粒构建体命名为pDSTe。
蛋白抑制剂的纯化：表达策略使用来自New England Biolabs，Inc.的T4 RNA聚合物超表达系统。用于蛋白表达的载体为pMAL，其含有位于多克隆位点上游的麦芽糖结合蛋白的基因序列。SEQ ID NO：6核酸插入到该多克隆位点。含有SEQ ID NO：6表达载体的1％TB-1细胞接种物(innoculum)于37℃生长于补充有1％葡萄糖和60μg/mL氨苄青霉素的Luria broth中。当细胞达到A595值为0.8时(大约在接种后3小时)，添加IPTG到终浓度为0.5mM。细胞收获前再持续生长5小时。一般，每升获得5g细胞。
通过在10,000xg离心10分钟对细胞进行沉淀，并重悬于1倍体积的10mM Tris-HCl，pH 8.0中。细胞如上所述的进行再次旋转(respin)，并于-70℃冷冻至少2小时。冷冻的沉淀重悬于两倍体积的BPER大肠杆菌蛋白提取缓冲液中。混合物于30℃温育20分钟并进行偶尔的混合。得到的提取物通过于12,000xg离心20分钟进行澄清，上清液对20mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM NaCl，1mM EDTA(缓冲液I)进行透析。透析过的材料用缓冲液I稀释到终浓度为2.5mg/mL，并命名为级分I。所有的后续层析步骤都于室温进行。
级分I用于已经预先用缓冲液I平衡过的10cm×7.6cc2直链淀粉树脂柱。然后柱子用缓冲液I(通常10倍的柱体积)充分洗涤，以除去未结合的材料。使用缓冲液I，10mM麦芽糖从柱子洗脱结合的融合蛋白。一般洗脱体积为大约2倍的柱体积。使用分光光度法测定级分的蛋白含量，合并含有蛋白的级分。该材料命名为级分II。通过Centricon(Amicon，Inc.)把蛋白浓度调整为1mg/mL。
级分II与凝血因子Xa蛋白酶以100∶1的重量/重量化学计量进行混合(一般反应物含有50mg的融合蛋白和0.5mg的凝血因子Xa)。切割反应于室温进行24小时。切割程度通过对整个反应过程的各个时间点取出的等分试样进行SDS PAGE分析来进行监控。最终的混合物对20mM Tris-HCl(pH8.0)，25mM NaCl，3mM EDTA进行透析，并命名为级分III。
级分III用于已经在10mM Tris-HCl(pH8.0)，25mM NaCl(缓冲液II)中平衡过的Mono Q离子交换柱(6cm×7.6cc2)。柱子进行如下操作：缓冲液II，30mL；具有25mM到500mM NaCl线性梯度的缓冲液II，40mL。麦芽糖结合蛋白洗脱自125mM NaCl中的柱子，在250mM NaCl中洗脱均匀的蛋白抑制剂，在400mM NaCl中洗脱凝血因子Xa蛋白酶。合并含有蛋白抑制剂的级分。该材料对缓冲液II进行透析，浓缩到10mg/mL，并命名为级分IV。蛋白以等分试样储存于-20℃。后面的所有实验都用级分IV蛋白进行，除非具体说明。纯化的SEQ ID NO：5蛋白命名为DST。
MMP抑制：使用的测定测量了MMP-9或其它基质金属蛋白酶对荧光素化胶原蛋白的酶促水解，其是时间的函数。将浓度为5μM的荧光素化胶原蛋白添加到反应缓冲液中(50mM Tris-HCl(pH7.6)，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1mM NaN3)，并置于Spectrosil石英荧光计比色皿中。浓度为0.1μM的MMP与各种量的多肽抑制剂(SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20)混合，并于25℃温育10分钟以实现结合。把蛋白混合物添加到胶原蛋白底物中，并进行混合。使用495nm的激发波长在Shimadzu RF5301荧光计中，测量了作为时间函数的520nm处的荧光发射强度。根据Segel(1993)利用Dixon图(1/v对[I])，使用荧光释放测定来确定基于蛋白的基质金属蛋白酶抑制剂([I])的抑制常数(Ki)，其中：
斜率＝Km/(VmaxKi[S])         (1)
其中Km为米氏常数，Vmax为反应最大速度，[S]为底物浓度。
多克隆抗体的生产：多克隆抗血清由Genosys，Inc.生产。通过把与弗氏完全佐剂以1∶1均匀混合的均一性SEQ ID NO：5多肽(300μg)皮下注射到雌性新西兰白兔中，来诱导抗SEQ ID NO：5多肽的多克隆抗体(pAb)。随后以一周的间隔注射三次带有不完全佐剂的抗原(200μg)。最后一次注射一周后，通过耳插管对兔取血。于14,000xg离心收集澄清的血浆，并储存于-20℃直到使用。
多克隆抗体的纯化：
通过在DEAE Affi-gel Blue上进行亲和层析把pAb纯化成均一性的。来自BioRad Labs，Inc.的兔多克隆抗体分离试剂盒根据提供的说明书进行使用，并带有几个小的修改。方案如下：澄清的兔血清(5mL)通过Econo-Pac 10DG脱盐柱。使用提供的工作缓冲液(0.02MTris HCl(pH8.0)，0.028M NaCl)从该柱子洗脱pAb，并收集作为单独的级分。在该阶段，使用Bradford测定来确定蛋白的浓度。全部血清样品(通常为25mL)以5mL为一批通过柱子。每批之间用40mL工作缓冲液(两倍柱体积)洗涤柱子。合并来自单个柱工作的最终脱盐样品。合并的样品用于DEAE Affi-gel Blue柱作为单个上样，用5倍柱体积的工作缓冲液(50mL)洗涤柱子，并使用5倍柱体积的洗脱缓冲液(0.025M Tris HCl(pH 8.0)，0.025M NaCl)从柱子洗脱pAb级分。收集洗脱的材料作为5mL的级分。IgG级分的纯度通过SDS PAGE进行估计。合并合适的级分，通过加压过滤浓缩到2mg/mL，并储存于-70℃直到需要。通过使用溶于工作缓冲液中的2M NaCl，1.5M硫氰酸钠(10倍柱体积)洗涤柱子，接着在工作缓冲液中进行再平衡，来使DEAE Affi-gel Blue柱再生。所有层析步骤的流速维持在1.0mL/min。
ELISA分析：使用Kaiser和Pollard(1993)或Quirk等人(1996)所述的方法进行ELISA。1μg的纯化SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20多肽被吸附到96孔微量滴定板(Immulon 2，Dynatech Labs)表面。孔用补充10％BSA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)封闭。封闭缓冲液中的多克隆抗体以各种稀度添加，并使其与结合的多肽抑制剂于室温反应1小时。在PBS中洗涤3次后，通过缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗-兔第二抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)进行显色。以1∶2000稀度于封闭缓冲液中添加第二抗体，并于室温温育1小时。在PBS中洗涤3次后，通过添加含有50mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸、1mg/mL邻-苯二胺和0.006％ H2O2的溶液获得显色。在适当的显色(一般为室温中温育5到10分钟)后，添加50μL 2M硫酸来终止反应并稳定产物。使用自动ELISA平板读数器(Molecular Dynamics，Inc.)，于490nm测量吸光度。可选择地，将荧光素化山羊抗-兔第二抗体(Molecular Probes，Inc.)用于ELISA。为了进行这些测定，应用了Dynex，Inc.荧光微量滴定板读数器，其具有485nm(激发)和510nm(发射)通带滤光片设备。
内在色氨酸荧光：化学变性在存在尿素时，通过经由ShimadzuRF5301荧光计中的内在色氨酸荧光(Lakowicz，1983)测量蛋白解折叠，来进行蛋白抑制剂的稳定性测量。激发和发射波长分别为295nm和340nm。激发和发射单色仪狭缝设为1.5nm。蛋白(20μM)与增加量的尿素(浓度范围为0到6.8M)混合，且样品于室温温育10小时以确保获得解折叠平衡。相对荧光根据关系式(Pace等人，1989)转化成自由能值：
ΔG＝-RT ln[(yf-yi)/(yi-yu)]         (2)
其中yf和yu分别为完全折叠和完全解折叠SEQ ID NO：5多肽的相对荧光值，yi为解折叠的中间物的相对荧光，T为绝对温度，R为气体常数。关系式ΔG对[尿素]的线性回归和外推用于在存在变性剂时测定自由能值(ΔGH2O)。类似地，根据下面的关系式(Pace等人，1989)，从荧光数据计算解折叠蛋白的级分(Fu)：
Fu＝(yf-yi)/(Yf-yu)          (3)
热变性
在Shimadzu RF5301荧光计(激发波长295nm，发射波长340nm)中测量位于25mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM NaCl中的均一性SEQID NO：5多肽的内在色氨酸荧光。通过搅动的水夹套密封石英荧光计比色皿，其连接到精确到+/-0.1℃的数字水浴锅上，来控制温度。干燥的氮气持续冲洗通过样品隔室来控制浓缩。温度改变设为以每分钟0.2℃的速度。在读取荧光之前使样品于室温温育5分钟，以确保系统已经达到了热平衡。从热实验中测定的荧光值使用上述的等式(3)进行归一化。计算的Fu值使用下述的等式(4)转换成平衡常数(KD)：
KD＝(1-Fu)/Fu       (4)
通过设定ln KD＝0，下述的范托夫等式(5)可用于计算转变温度(Tm)值，以及转变温度时的相应焓(ΔHm)(Arnold和Ulbrich-Hofmann，1997)：
d(ln KD)/d(1/T)＝-ΔH/R         (5)
如果Gibbs等式中ΔG设为0，那么可以如下计算转变温度时的熵(ΔSm)：
ΔSm＝ΔHm/Tm        (6)
转变温度区域的自由能值可从下面的等式计算：
ΔG＝-RT ln KD       (7)
这些自由能值替换到Gibbs-Helmholtz等式(8)中，来计算热容。
ΔG＝ΔHm(1-T/Tm)-ΔCp[(Tm-T)+T ln(T/Tm)](8)
最后，根据下面的等式(9)计算最大稳定性的温度(Tmax)：
Tmax＝Tmexp[-ΔHm/ΔCpTm]          (9)
表面等离子共振：将BiaCore，Inc.BiaCore-X表面等离子共振(SPR)装置用于测量SEQ ID NO：5多肽(也称作DST蛋白)与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)之间的相互作用。为了这些实验，羧甲基葡聚糖传感器芯片(CM-5，Lofas等人，1993)，使用50mM N-羟基琥珀酰亚胺，0.2M N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺以每分钟10μL的流速活化10分钟。浓度为75ng/μL的SEQ ID NO：5多肽，以每分钟10μL的流速偶联到活化的表面10分钟。通过使1M乙醇胺-HCl以每分钟10μL的速度流过传感器表面5分钟，对最终表面进行灭活。MMP-9以每分钟20μL的速度流过传感器表面，浓度范围为1到100nM。结合等温线通过使正向(ka)和反向(kd)速度常数同时满足以下关系式来估计：
d[DST～MMP-9]/dt＝(ka[DST][MMP-9])-(kd[DST～MMP-9])  (10)
(Karlsson和Falt，1997)，其中[DST]、[MMP-9]和[DST～MMP-9]分别为游离SEQ ID NO：5多肽(DST)、游离MMP-9和复合物的浓度。然后平衡亲和常数(KA)定义为：
KA＝ka/kd    (11)
等式10合适地根据SPR信号(Morton等人，1995)表示为：
dR/dt＝kaCRmax-(kaC+kd)R        (12)
其中R为时间t时的SPR信号(反应单位，RU)，Rmax为RU中的最大的MMP-9结合量，C为SEQ ID NO：5多肽的浓度。使用来自的Microcal，Inc.的Origin进行动力学分析(O’Shannessy等人，1993)。
实施例2：多肽抑制剂特性
分子克隆
基质金属蛋白酶(MMP)和MMP～TIMP三维结构的分子可视化分析，提供了设计SEQ ID NO：5多肽的结构信息。SEQ ID NO：5多肽的最终氨基酸序列能结合各种基质金属蛋白酶分子。编码SEQ ID NO：5多肽的SEQ ID NO：6核酸，使用了大肠杆菌的密码子偏倚以使表达最大化。
构建327个核苷酸的SEQ ID NO：6序列需要一系列短寡核苷酸，因为要构建长度超过100个碱基的核酸在目前是非常困难的。此外，较长的核酸分子难以有效地杂交。因此，使用一系列的杂交步骤进行构建。当以等摩尔量混合到一起时，单个的寡核苷酸(SEQ ID NO：8-19)通过“缓慢冷却”杂交步骤能有效地转变成双链体分子。用数小时从95℃缓慢降低温度，有利于形成短的双链体。
得到的片段包含50到60个碱基对的中心双链区域，其侧面为10个核苷酸的单链末端。这些“粘性末端”可用于驱动全长核酸的装配，也是通过杂交。通过于45℃加热双链体分子的等摩尔混合物10分钟来形成全长核酸。该步骤破坏了末端连接而形成的任何部分形成的双链体结构，但是不破坏完全形成的中心双链体区域。通过将反应试管置于冰上而对加热过的材料进行“快速冷却”。该杂交步骤有利于DNA的短区域杂交(即，10个碱基的粘性末端)。使用酶T4 DNA连接酶进行327bp DNA片段的磷酸二酯主链的闭合。
通过PCR扩增从得到的片段混合物中选择全长核酸。该步骤远远有效于从琼脂糖凝胶纯化全长核酸。该步骤也导致了大量用于后续克隆步骤的材料。通过使用T4 DNA聚合酶制备一个平头末端，并使用位于另一个末端的Hind III来产生一个Hind III相容末端，从而制备用于克隆的SEQ ID NO：6核酸的末端。这导致了能有效并定向地克隆到蛋白表达载体中的DNA分子。
图1显示了该克隆的结果。9个实验菌落中的3个包含具有正确插入片段(SEQ ID NO：6)的载体。可通过DNA测序来确认插入片段的正确性；几个克隆具有对应于SEQ ID NO：6的序列。
SEQ ID NO：5多肽的物理特性
SEQ ID NO：5多肽蛋白长度为108个氨基酸，而且总分子量为108kDa。使用SwissModel程序，使SEQ ID NO：5序列穿过TIMP-2的三维α碳主链，来制备SEQ ID NO：5多肽的三维模型。使用ProMod程序把最优的穿过结果转化成包含氨基酸侧链位置的三维结构。使这种起始模型进行一轮模拟退火以使侧链冲突最小化。几轮SYBYL水平的几何学最优化使所有的二面角和扭转变成合适的几何学。采用的最后一轮能量最低化使用GROMOS96参数设置，而不应用反应场(reaction field)。这些结果显示于表4中。最终的模型具有-3534kJ/mol的全部能量，并显示于图2。所有的氨基酸残基都位于允许的Ramachandran空间内(数据未显示)，而且没有空间冲突。
表4：同源模型的GROMOS 96能量最低化结果(只显示了来自forcefield的主要参数)。
  参数   能量(kJ/mol)
  键角扭转不合适的非键合的静电的约束总计   66541667103-3027-18840-3534
SEQ ID NO：5多肽的几种特性显示于表5。
表5：SEQ ID NO：5多肽的各种特性。
长度(氨基酸)：分子量：等电点：疏水性(％)：亲水性(％)：碱性(％)：酸性(％)：斯托克斯半径()：摩擦系数：α螺旋(％)：β链(％)：环/卷曲(％)：色氨酸(#)酪氨酸(#)   10811.86.539.833.313.913.0221.29622914
单个内部设计的色氨酸对内在荧光实验有很大的帮助(参见下述)。蛋白设计成能形成六链的β桶的单个多肽(图2)。分子的上部区域形成了分子扁平结构，其通过在Cys2-Cys73和Cys4-Cys102残基之间形成二硫键而部分结合到一起(图2)。该区域形成了结合结构域的基础。该区域侧面为由横跨Ser31到Lys41残基的柔性环形区域形成的TIMP-2样臂。通过一系列的氢键使环稳定化为主要结构。柔性环可充当TIMP识别结构域，且分子动力学模拟(数据未显示)表明它移动性很大，偏转超过4。SEQ ID NO：5多肽的分子尺寸大约为21×18×25(总的分子体积为94553，总的溶剂可到达表面面积为98672)。
在大肠杆菌中表达
纯化的SEQ ID NO：5多肽的氨基末端的氨基酸测序显示，由于翻译后修饰在大肠杆菌中除去了N-末端的甲硫氨酸。这种N-末端甲硫氨酸的除去产生了具有下述序列(SEQ ID NO：20)的多肽：
 1  CSCSPVHPQ QAFSNADVVI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP
41 IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG
81 GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPW
纯化
纯化来自大肠杆菌的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20多肽，得到了每升诱导的培养物大约5mg的蛋白。表6中描述的纯化方案需要大约3天来完成。SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：20多肽在大肠杆菌中超量生产了大约27倍。虽然在纯化实验过程中，SEQ ID NO：5/SEQID NO：20多肽只有通过SDS PAGE分析才能观察到，但是它可用于定义活性单位。该计算有助于估计SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：20多肽的产量，而且有助于量化活性。
SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：20多肽作为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合分离自细菌的事实有助于纯化方案。因为MBP是高可溶性并对麦芽糖有亲和力，所以可以直接表达和纯化该蛋白。通过细菌的化学裂解，接着通过离心使裂解物澄清，可有效获得粗细菌提取物制剂。从而在单个步骤中把融合蛋白纯化成均一性(图3，泳道1)。用蛋白酶凝血因子Xa处理该混合物，在大约12小时获得了融合产物的完全切割。没有可检测的SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：20蛋白的蛋白水解。最终利用MonoQ离子交换的层析步骤可有效地分离MBP、SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：20)多肽和凝血因子Xa。图3(泳道2)显示了从MonoQ柱洗脱后的均一性SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：20多肽的最终制剂。
表6：SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：20多肽的纯化
起始材料为诱导后的5g大肠杆菌。
  级分   步骤   浓度(mg/ml)   总蛋白(mg)   特定活性a(单位/mg)   纯化(n-倍)
  I.II.III.IV.   粗提取物直链淀粉树脂凝血因子Xa切割Mono Q   301.01.110   12525.025.05.2   327412383228747   1132527
aSEQ ID NO：5多肽的单位定义为标准测定中抑制50％MMP-9蛋白所需的蛋白浓度(μg/mL)。
抗体生产
在兔中制备抗SEQ ID NO：5多肽的多克隆抗血清。获得纯化的抗体库，其能在ELISA反应中很容易地检测纯化的SEQ ID NO：5多肽(图4)。当这些抗体被引入到慢性伤口环境中时，可用于检测并示踪SEQ ID NO：5多肽。抗体库使用大约1∶5,000的稀度常规检测SEQID NO：5多肽。
基质金属蛋白酶抑制
SEQ ID NO：5多肽可有效地抑制MMP-9对荧光素化胶原蛋白的水解。把蛋白添加到正在进行的酶反应物中时(图5)，98％的胶原蛋白水解在45秒滞后期内停止。用增加量的SEQ ID NO：5多肽滴定MMP-9(图6)，导致MMP-9以浓度依赖的方式失去水解活性。这些数据表明，抑制反应是化学计量的，这是在后面的实验中进一步证实的观察结果(参见下文)。
使用图6所示的动力学数据，获得MMP酶宿主的抑制常数(Ki)是可能的。荧光对时间图的瞬时速度用于构建线性Dixon图，从该图可能直接解决Ki。该分析假定SEQ ID NO：5多肽通过竞争性抑制机制发挥作用。
图7示例了SEQ ID NO：5多肽对于5种MMP酶的Ki值。所有的酶都在纳摩尔范围内有效地被抑制。令人惊讶地，SEQ ID NO：5多肽对MMP-1具有低于对MMP-9的Ki值(12对16nM)。不过，测试的所有基质金属蛋白酶获得的Ki值都较低，说明SEQ ID NO：5多肽能防止在慢性伤口中发现的所有主要MMP形式的酶活性。
抑制剂稳定性
图8提供了SEQ ID NO：5多肽的多肽主链和选择的氨基酸侧链的结构模型。该图示例了SEQ ID NO：5多肽的两个重要特征。第一个是对分子稳定性有贡献的3个二硫键的位置(参见下文)。第二个是用作所有内在荧光实验的基础的单个色氨酸分子的位置。
SEQ ID NO：5多肽以高度协同的方式解折叠。通过内在色氨酸荧光监控的平衡解折叠提供了发射荧光强度总共60％的降低，以及发射峰最大值向较大波长移动了10nm(数据未显示)。
如实施例1中所述，把荧光强度发射光谱转换成解折叠蛋白级分。图9显示了天然SEQ ID NO：5多肽的解折叠曲线中的中点，其出现在4.95M的尿素浓度中。解折叠转变开始于4.4M尿素，并在5.4M尿素的变性浓度完成。该数据(未显示)的第一个派生图中单峰的存在支持了蛋白变性作为高度协同的两种状态过程的假说。
把解折叠曲线转化成自由能对尿素浓度的图(参见实施例1)，以及通过不存在尿素时通过对自由能的线性回归进行的外推，显示多肽抑制剂具有7.4kcal mol-1的天然自由能。当在变性实验之前，多肽抑制剂用二硫苏糖醇进行还原时，稳定性明显降低。然后解折叠转变开始于2.4M尿素，并于4.4M尿素的变性浓度完成，转变中点为2.75M尿素。解折叠过程仍然是高度协同的、两种状态过程。
还原的SEQ ID NO：5多肽具有4.3kcal mol-1的天然自由能。从而SEQ ID NO：5多肽中的3个二硫键贡献了大约3.1kcal mol-1的稳定化能量。
SEQ ID NO：5蛋白在人类血清中是寿命长的。在人类血清中温育SEQ ID NO：5多肽，以模拟该多肽暴露于慢性伤口中存在的液体类型中。用人类血浆于室温温育SEQ ID NO：5多肽超过36小时导致SEQ ID NO：5多肽仅仅降低了9％(图10)。如果SEQ ID NO：5预先结合到化学计算量的MMP-9上，那么在超过同样36小时的过程中，该材料仅仅降低了4％。对照反应，其中SEQ ID NO：5多肽温育于PBS中，温育36小时后导致100％的该材料的剩余。通过化学变性研究进一步显示SEQ ID NO：5多肽的稳定性。但是血清稳定性表明，SEQ ID NO：5多肽对蛋白酶降解不敏感。稳定性和蛋白酶抗性在慢性伤口环境中是重要的。
SEQ ID NO：5多肽的热解折叠转化通过内在色氨酸荧光进行监控。热转化曲线示于图11中。SEQ ID NO：5多肽的内在色氨酸荧光显示了在25到60℃较小的变异，与低于热转化点的温度时的热稳定天然构象一致。在高于60℃的温度时，SEQ ID NO：5多肽以高度协同的方式解折叠。热诱导的结构转化在该研究中进行的加热/冷却率时是完全可逆的(数据未显示)。SEQ ID NO：5多肽的熔融性状是焓过程而不是熵过程。热力学稳定性参数如表7所示。
   表7：热力学稳定性参数
 参数   值
 化学：ΔGnat(kcal mol-1)ΔGred(kcal mol-1)ΔΔG(kcal mol-1)mnat(cal mol-1M-1)mred(cal mol-1M-1)urea1/2nat(M)urea1/2red(M)热：Tm(℃)ΔHm(kcal mol-1)ΔSm(cal mol-1K-1)ΔG71.5℃(kcal mol-1)ΔG30℃(kcal mol-1)Tmax(℃)ΔCp(kcal mol-1K-1) 7.424.323.10308431124.952.7571.51002501.326.7137.82.84
SEQ ID NO：5多肽作为温度函数的稳定性使用Gibbs-Helmholtz函数(等式7)进行确定，表示为图12中的ΔG对温度。存在尿素时，包括通过化学变性于较低温度测定的ΔG值用于比较。这些较低温度的化学变性研究也可通过内在色氨酸荧光进行测定(参见图9)。稳定性差异在该研究测量的整个温度范围都持续。
范托夫图提供于图13中，其示例了通过内在色氨酸荧光测定的平衡常数(KD)。37.8℃的最大稳定性计算温度，对将被引入到伤口中或其它生理学环境中的肽是理想的。
蛋白-蛋白间的相互作用
BioSelect 125凝胶排阻柱上的SEQ ID NO：5多肽的层析行为，与预期的单体蛋白一致。分析型凝胶过滤实验的结果显示于图14中。在该实验中，SEQ ID NO：5蛋白比肌红蛋白标准物(12kDa)稍晚从柱子上洗脱。洗脱特征与分子量为大约11.8kDa的单体蛋白SEQ ID NO：5多肽一致。
计算的斯托克斯半径为22。该值与原子模型的尺寸非常一致。洗脱特征表明该蛋白实际上是基本对称的，因为其摩擦系数为1.2。但是摩擦系数为1.2表明SEQ ID NO：5多肽具有扁球面特征，其可以表明环形区域在决定蛋白的流体动力特性上起作用。
在3个独立实验中确定了SEQ ID NO：5多肽与MMP-9之间的复合物形成。
第一个实验中，将两种分子的原子坐标文件用作FTDOCK程序(Gabb等人，1977)的输入值。该程序计算了两种分子的分子表面，然后固定一个分子，并使第二个分子对第一个分子进行刚体旋转。考虑几何学和静电学因素计算每个取向的配合分数。最后提供一系列最好的取向结构用于检查。这些两个分子间最可能的分子缔合显示于图15。注意SEQ ID NO：5多肽与基质金属蛋白酶沿着设计者建议的结合区域显著接触。此外，SEQ ID NO：5多肽的柔性环形区域也与基质金属蛋白酶有特异性的接触。对复合物所确定的结构测定用于隐藏了大约3002的SEQ ID NO：5多肽表面区域。
第二个实验中，SEQ ID NO：5多肽与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)之间的分子缔合，使用表面等离子共振技术直接进行测量。为了进行该实验，MMP-9偶联到羧甲基葡聚糖传感器芯片上。使SEQ ID NO：5多肽溶于PBS的溶液自由地流过MMP-9结合表面。图16显示了该相互作用的结合等温线。该曲线适于缔合-解离模型，其中同时符合正向(Ka)和反向(Kd)速度常数。这样的符合得到了2×105M-1s-1的Ka值和1.3×10-3s-1的Ka值。这得到了平衡亲和常数(KA)1.5×108M-1。
在第三个实验中，分析型凝胶过滤用于观察预先形成的SEQ ID NO：5多肽-MMP-9复合物。两种蛋白以化学计量混合到一起(1mM)，并于室温进行温育。30分钟后，整个反应物注射到BioSelect 125凝胶过滤柱上。混合物以80kDa表观分子量的单个分子量种类从该柱上进行洗脱(图17)。这些数据表明，SEQ ID NO：5多肽与MMP-9按1∶1的化学计量结合。作为对照实验，将两种蛋白混合到一起，并立即注射到柱子上以显示单个的蛋白洗脱位置。如图17中所示，在这些条件下，形成了可检测量的复合物。
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所有的出版物和专利都在此引入作为参考，正如其单独引入作为参考。本发明不局限于显示和描述的精确细节，这是因为应当理解可以进行很多改变和修饰但仍然在权利要求所限定的精神和范围内。
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<213>智人
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Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe Val Gly
        35                  40                  45
Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg Tyr Glu Ile Lys
    50                  55                  60
Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe
                85                  90                  95
His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu
            100                 105                 110
Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp
        115                 120                 125
Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr
    130                 135                 140
Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys
145                 150                 155                 160
Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln
                165                 170                 175
Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg
            180                 185                 190
Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala
        195                 200                 205
<210>2
<211>220
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Arg Leu Ala Leu Gly Leu Leu Leu
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Leu Leu Arg Pro Ala Asp Ala Cys Ser Cys Ser Pro Val
            20                  25                  30
His Pro Gln Gln Ala Phe Cys Asn Ala Asp Val Val Ile Arg Ala Lys
        35                  40                  45
Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser Gly Ash Asp Ile Tyr Gly Ash
    50                  55                  60
Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys
65                  70                  75                  80
Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile Tyr Thr Ala Pro Ser Ser Ala
                85                  90                  95
Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly Gly Lys Lys Glu Tyr Leu Ile
            100                 105                 110
Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met His Ile Thr Leu Cys Asp
        115                 120                 125
Phe Ile Val Pro Trp Asp Thr Leu Ser Thr Thr Gln Lys Lys Ser Leu
    130                 135                 140
Asn His Arg Tyr Gln Met Gly Cys Glu Cys Lys Ile Thr Arg Cys Pro
145                 150                 155                 160
Met Ile Pro Cys Tyr Ile Ser Ser Pro Asp Glu Cys Leu Trp Met Asp
                165                 170                 175
Trp Val Thr Glu Lys Asn Ile Asn Gly His Gln Ala Lys Phe Phe Ala
            180                 185                 190
Cys Ile Lys Arg Ser Asp Gly Ser Cys Ala Trp Tyr Arg Gly Ala Ala
        195                 200                 205
Pro Pro Lys Gln Glu Phe Leu Asp Ile Glu Asp Pro
    210                 215                 220
<210>3
<211>211
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Met Thr Pro Trp Leu Gly Leu Ile Val Leu Leu Gly Ser Trp Ser Leu
 1               5                  10                  15
Gly Asp Trp Gly Ala Glu Ala Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln
            20                  25                  30
Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly
        35                  40                  45
Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile
    50                  55                  60
Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu
                85                  90                  95
Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys
            100                 105                 110
Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr
        115                 120                 125
Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn
    130                 135                 140
Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys
145                 150                 155                 160
Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly
                165                 170                 175
Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys
            180                 185                 190
Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala
        195                 200                 205
Thr Asp Pro
    210
<210>4
<211>224
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Pro Gly Ser Pro Arg Pro Ala Pro Ser Trp Val Leu Leu Leu Arg
 1               5                  10                  15
Leu Leu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Gly Leu Gly Glu Ala Cys Ser Cys
            20                  25                  30
Ala Pro Ala His Pro Gln Gln His Ile Cys His Ser Ala Leu Val Ile
        35                  40                  45
Arg Ala Lys Ile Ser Ser Glu Lys Val Val Pro Ala Ser Ala Asp Pro
    50                  55                  60
Ala Asp Thr Glu Lys Met Leu Arg Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Lys Met
65                  70                  75                  80
Phe Lys Gly Phe Glu Lys Val Lys Asp Val Gln Tyr Ile Tyr Thr Pro
                85                  90                  95
Phe Asp Ser Ser Leu Cys Gly Val Lys Leu Glu Ala Asn Ser Gln Lys
            100                 105                 110
Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Gln Val Leu Ser Asp Gly Lys Val Phe Ile
        115                 120                 125
His Leu Cys Asn Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Asp Leu Ser Leu Va1 Gln
    130                 135                 140
Arg Glu Ser Leu Asn His His Tyr His Leu Asn Cys Gly Cys Gln Ile
145                 150                 155                 160
Thr Thr Cys Tyr Thr Val Pro Cys Thr Ile Ser Ala Pro Asn Glu Cys
                165                 170                 175
Leu Trp Thr Asp Trp Leu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala
            180                 185                 190
Gln His Tyr Val Cys Met Lys His Val Asp Gly Thr Cys Ser Trp Tyr
        195                 200                 205
Arg Gly His Leu Pro Leu Arg Lys Glu Phe Val Asp Ile Val Gln Pro
    210                 215                 220
<210>5
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽抑制剂
<400>5
Met Cys Ser Cys Ser Pro Val His Pro Gln Gln Ala Phe Ser Asn Ala
 1               5                  10                  15
Asp Val Val Ile Arg Ala Lys Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser
            20                  25                  30
Gly Asn Asp Ile Tyr Gly Asn Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile
        35                  40                  45
Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile
    50                  55                  60
Tyr Thr Ala Pro Ser Ser Ala Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly
65                  70                  75                  80
Gly Lys Lys Glu Tyr Cys Ile Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys
                85                  90                  95
Met His Ile Thr Leu Cys Asp Phe Ile Cys Pro Trp
            100                 105
<210>6
<211>339
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽抑制剂的核酸序列
<400>6
atgtgcagct gcagcccggt gcatccgcag caggcgttta gcaacgcgga tgtggtgatt     60
cgcgcgaaag cggtgagcga aaaagaagtc gatagcggca acgatattta tggcaacccg    120
attaaacgca ttcagtatga aattaaacag attaaaatgt ttaaaggccc ggaaaaagat    180
attgaattta tttataccgc gccgagcagc gcggtgtgcg gcgtgagcct ggatgtgggc    240
ggcaaaaaag aatattgcat tgcgggcaaa gcggaaggcg atggcaaaat gcatattacc    300
ctgtgcgatt ttatttgccc gtggtagaag cttatagac                           339
<210>7
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽抑制剂
<220>
<221>SITE
<222>7，12，16，18-20，22，24-25，30，36，41，44，48，51，61，64，67，71-72，75，77，79，87-88，91，99，101，105
<223>Xaa＝任何脂族氨基酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸
<220>
<221>SITE
<222>17，27，29，31，35，47，58，60，62，78，84，92，94，103
<223>Xaa＝任何酸性氨基酸、天冬氨酸或谷氨酸
<220>
<221>SITE
<222>2，4，73，86，102，106
<223>Xaa＝任何半胱氨酸样氨基酸或半胱氨酸
<220>
<221>SITE
<222>21，23，28，42-43，49，52，55，59，82-83，90，96
<223>Xaa＝任何碱性氨基酸、赖氨酸或精氨酸
<220>
<221>SITE
<222>13，54，63，104
<223>Xaa＝任何芳族氨基酸或苯丙氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸、甲硫氨酸或无氨基酸
<220>
<221>SITE
<222>(53)...(53)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甲硫氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(97)...(97)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甲硫氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(9)...(9)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(33)...(33)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(38)...(38)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(40)...(40)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(56)...(56)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(57)...(57)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(68)...(68)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(74)...(74)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(80)...(80)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(81)...(81)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(89)...(89)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(93)...(93)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(95)...(95)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(107)...(107)
<223>Xaa＝任何非极性氨基酸或脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(3)...(3)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(5)...(5)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(10)...(10)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(11)...(11)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(14)...(14)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(15)...(15)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(26)...(26)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(32)...(32)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(34)...(34)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(37)...(37)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(39)...(39)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(45)...(45)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(46)...(46)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(50)...(50)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(65)...(65)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(66)...(66)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(69)...(69)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(70)...(70)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(76)...(76)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(85)...(85)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸或酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(100)...(100)
<223>Xaa＝任何极性氨基酸、丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(8)...(8)
<223>Xaa＝任何碱性氨基酸或组氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(98)...(98)
<223>Xaa＝任何碱性氨基酸或组氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(108)...(108)
<223>Xaa＝色氨酸
<400>7
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                85                  90                  95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105
<210>8
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>8
atgtgcagct gcagcccggt gcatccgcag caggcgttta gcaacgcgga tgtggtgatt      60
cgcgcgaaag                                                             70
<210>9
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>9
cggtgagcga aaaagaagtc gatagcggca acgatattta tggcaacccg attaaacgca      60
ttcagtatga                                                             70
<210>10
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>10
aattaaacag attaaaatgt ttaaaggccc ggaaaaagat attgaattta tttataccgc      60
gccgagcagc                                                             70
<210>11
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>11
gcggtgtgcg gcgtgagcct ggatgtgggc ggcaaaaaag aatattgcat tgcgggcaaa      60
gcggaaggcg                                                             70
<210>12
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>12
atggcaaaat gcatattacc ctgtgcgatt ttatttgccc gtggtagaag cttatagac      59
<210>13
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>13
tcgctcaccg ctttcgcgcg aatcaccaca tccgcgttgc taaacgcctg ctgcggatgc     60
accgggctgc agctgcacat                                                 80
<210>14
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>14
ctgtttaatt tcatactgaa tgcgtttaat cgggttgcca taaatatcgt tgccgctatc     60
gacttctttt                                                            70
<210>15
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>15
cgcacaccgc gctgctcggc gcggtataaa taaattcaat atctttttcc gggcctttaa     60
acattttaat                                                            70
<210>16
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>16
attttgccat cgccttccgc tttgcccgca atgcaatatt cttttttgcc gcccacatcc      60
aggctcacgc                                                             70
<210>17
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>17
gtctataagc tt ctaccacg ggcaaataaa atcgcacagg gtaatatgc                 49
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>18
atgtgcagct gcagcccggt                                                  20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<400>19
gtctataagc ttctaccacg                                                  20
<210>20
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽抑制剂
<400>20
Cys Ser Cys Ser Pro Val His Pro Gln Gln Ala Phe Ser Asn Ala Asp
 1               5                  10                  15
Val Val Ile Arg Ala Lys Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser Gly
            20                  25                  30
Asn Asp Ile Tyr Gly Asn Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile Lys
        35                  40                  45
Gln Ile Lys Met Phe Lys Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile Tyr
    50                  55                  60
Thr Ala Pro Ser Ser Ala Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Lys Glu Tyr Cys Ile Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly Lys Met
                85                  90                  95
His Ile Thr Leu Cys Asp Phe Ile Cys Pro Trp
            100                 105
<210>21
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽抑制剂
<220>
<221>SITE
<222>7，12，16，18-20，22，24-25，30，36，41，44，48，51，61，64，67，71-72，75，77，79，87-88，91，99，101，105
<223>Xaa＝丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸
<220>
<221>SITE
<222>17，27，29，31，35，47，58，60，62，78，84，92，94，103
<223>Xaa＝天冬氨酸或谷氨酸
<220>
<221>SITE
<222>3，5，14，26，32，66，69，70，76，100
<223>Xaa＝丝氨酸或苏氨酸
<220>
<221>SITE
<222>21，23，28，42-43，49，52，55，59，82-83，90，96
<223>Xaa＝赖氨酸或精氨酸
<220>
<221>SITE
<222>33，38，56，74，80，81，89，93，95
<223>Xaa＝甘氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(1)...(1)
<223>Xaa＝甲硫氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(53)...(53)
<223>Xaa＝甲硫氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(97)...(97)
<223>Xaa＝甲硫氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(2)...(2)
<223>Xaa＝半胱氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(4)...(4)
<223>Xaa＝半胱氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(73)...(73)
<223>Xaa＝半胱氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(86)...(86)
<223>Xaa＝半胱氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(102)...(102)
<223>Xaa＝半胱氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(106)...(106)
<223>Xaa＝半胱氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(8)...(8)
<223>Xaa＝组氨酸
<220>
221>SITE
<222>(98)...(98)
<223>Xaa＝组氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(9)...(9)
<223>Xaa＝脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(40)...(40)
<223>Xaa＝脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(57)...(57)
<223>Xaa＝脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(68)...(68)
<223>Xaa＝脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(107)...(107)
<223>Xaa＝脯氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(10)...(10)
<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(11)...(11)
<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(15)...(15)
<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(34)...(34)
<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(39)...(39)
<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(45)...(45)
<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(50)...(50)
<223>Xaa＝天冬酰胺或谷氨酰胺
<220>
<221>SITE
<222>(13)...(13)
<223>Xaa＝苯丙氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(54)...(54)
<223>Xaa＝苯丙氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(63)...(63)
<223>Xaa＝苯丙氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(104)...(104)
<223>Xaa＝苯丙氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(37)...(37)
<223>Xaa＝酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(46)...(46)
<223>Xaa＝酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(65)...(65)
<223>Xaa＝酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(85)...(85)
<223>Xaa＝酪氨酸
<220>
<221>SITE
<222>(108)...(108)
<223>Xaa＝酪氨酸
<400>21
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
        35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
    50                  55                  60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
                85                  90                  95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
            100                 105

Claims (48)

1.一种分离的核酸，其编码包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20的多肽。
2.权利要求1的分离的核酸，其中所述的核酸包含SEQ ID NO：6。
3.一种分离的核酸，其在严格杂交条件下能与包含SEQ ID NO：6的核酸杂交。
4.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20。
5.权利要求4的分离的多肽，其中所述的多肽能抑制基质金属蛋白酶活性。
6.权利要求4的分离的多肽，其中所述的多肽在哺乳动物血清或血浆中是稳定的。
7.权利要求4的分离的多肽，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
8.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21，具有β桶构象而且能与基质金属蛋白酶结合。
9.权利要求8的分离的多肽，其中所述的多肽能抑制基质金属蛋白酶活性。
10.权利要求8的分离多肽，其中所述的多肽在哺乳动物血清或血浆中是稳定的。
11.权利要求8的分离多肽，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
12.一种组合物，其包含治疗有效量的含有SEQ ID NO：5或SEQID NO：20的多肽抑制剂与药学上可接受的载体。
13.权利要求12的组合物，其中所述的多肽抑制剂能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中任何一种的蛋白酶活性。
14.权利要求12的组合物，其中所述的多肽抑制剂能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中的超过一种。
15.权利要求12的组合物，其中所述的多肽抑制剂具有β桶构象。
16.权利要求12的组合物，其中所述的多肽在哺乳动物血清中是稳定的。
17.权利要求12的组合物，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
18.权利要求12的组合物，其中所述的组合物包含洗剂、凝胶或乳膏。
19.一种组合物，其含有治疗有效量的包含SEQ ID NO：7或SEQID NO：21的多肽抑制剂与药学上可接受的载体，其中所述的多肽抑制剂能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中任何一种的蛋白酶活性。
20.权利要求19的组合物，其中所述的多肽抑制剂能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中的超过一种。
21.权利要求19的组合物，其中所述的多肽抑制剂具有β桶构象。
22.权利要求19的组合物，其中所述的多肽抑制剂在哺乳动物血清中是稳定的。
23.权利要求19的组合物，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
24.权利要求19的组合物，其中所述的组合物包含洗剂、凝胶或乳膏。
25.一种伤口敷料，其含有包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20的多肽与药学上可接受的载体。
26.权利要求25的伤口敷料，其中所述的多肽能抑制剂基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶中任何一种的蛋白酶活性。
27.权利要求25的伤口敷料，其中所述的多肽能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中的超过一种。
28.权利要求25的伤口敷料，其中所述的多肽具有β桶构象。
29.权利要求25的伤口敷料，其中所述的多肽在哺乳动物血清中是稳定的。
30.权利要求25的伤口敷料，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
31.权利要求25的伤口敷料，其中所述的药学上可接受的载体是绷带。
32.一种伤口敷料，其含有包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21的多肽与药学上可接受的载体，其中所述的多肽抑制剂能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶中任何一种的蛋白酶活性。
33.权利要求32的伤口敷料，其中所述的多肽抑制剂能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中的超过一种。
34.权利要求32的伤口敷料，其中所述的多肽抑制剂具有β桶构象。
35.权利要求32的伤口敷料，其中所述的多肽抑制剂在哺乳动物血清中是稳定的。
36.权利要求32的伤口敷料，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
37.权利要求32的伤口敷料，其中所述的药学上可接受的载体为绷带。
38.一种治疗伤口的方法，其包括对伤口施用治疗有效量的包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20的多肽。
39.权利要求38的方法，其中所述的多肽能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶中任何一种的蛋白酶活性。
40.权利要求38的方法，其中所述的多肽能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中的超过一种。
41.权利要求38的方法，其中所述的多肽具有β桶构象。
42.权利要求38的方法，其中所述的多肽在哺乳动物血清中是稳定的。
43.权利要求38的方法，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
44.一种治疗伤口的方法，其包括对伤口施用治疗有效量的包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21的多肽，其中所述的多肽能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶中任何一种的蛋白酶活性。
45.权利要求44的方法，其中所述的多肽能抑制基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-3、基质金属蛋白酶-4、基质金属蛋白酶-5、基质金属蛋白酶-6、基质金属蛋白酶-7、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-10、基质金属蛋白酶-11、基质金属蛋白酶-12或基质金属蛋白酶-13中的超过一种。
46.权利要求44的方法，其中所述的多肽具有β桶构象。
47.权利要求44的方法，其中所述的多肽在哺乳动物血清中是稳定的。
48.权利要求44的方法，其中基本上所有的多肽在4M尿素中都保持以β桶构象折叠。
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