MXPA05006715A - Composiciones para el cuidado de las heridas. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona polipeptidos que puede inhibir la actividad de las metaloproteinasas de matriz. Tales polipeptidos son utiles para tratar las heridas, por ejemplo las heridas cronicas.

Description

COMPOSICIONES PARA EL CUIDADO DE LAS HERIDAS Campo de la Invención La presente invención generalmente se relaciona con el campo para curar heridas y a la reparación y mantenimiento de la piel saludable.

Antecedentes de la Invención Una razón principal porque las heridas crónicas no sanan es que una clase de proteinasas destruyen la cama de la herida recién formada (Vaalamo y otros, 1997; Weckroth y otros, 1996; DiColandrea y otros, 1998; Moses y otros, 1996). Estas metaloproteinasas de matriz (MMPs) son normalmente impedidas de destruir la cama de la herida mediante la acción de cuatro inhibidores de Tejido de Metaloproteinasa (TIMPsl-4) que forman complejos inhibitorios muy específicos con las metaloproteinasas de matriz (por ejemplo, Olson y otros, 1997; Taylor y otros, 1996; Howard y otros, 1991) . Esto es, cada inhibidor de tej ido de metaloproteinasa solamente inhibe un subjuego específico de metaloproteinasas de matriz. En las heridas crónicas la proporción de metaloproteinasas de matriz a los inhibidores de tejido de metaloproteinasa es superior, tal que la mayoría de las metaloproteinasas de matriz están sin inhibir (Vaalamo y otros, 1996; Saarrialho-Kere , 1998). De hecho, con los niveles de proteasa elevados, las moléculas de los inhibidores de tejido de metaloproteinasa mismas pueden estar hidrolizadas . No hay ninguna molécula inhibidora de tejido de metaloproteinasa que ocurra naturalmente que sencillamente inhiba todos tipos de metaloproteinasa de matriz.

Por lo tanto, los enfoques tradicionales son necesarios para optimizar la inhibición de metaloproteinasas de matriz y para mejorar el sanado de las heridas.

Síntesis de la Invención La invención proporciona polipéptidos que pueden inhibir las metaloproteinasas de matriz. Los ejemplos de los polipéptidos suministrados por la invención incluyen los polipéptidos que comprenden SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 21. También suministrados están los ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido de la invención, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que comprenden SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 21. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos aislados incluyen un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 6 y los ácidos nucleicos aislados que pueden hibridizarse bajo condiciones de hibridización estrictas a un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO : 6.

Los polipéptidos de la invención son útiles para tratar heridas, que incluyen las heridas crónicas. Por lo tanto, la invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de inhibidor de polipéptido que comprende SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 21 y un transportador farmacéuticamente aceptable. La composición puede, por ejemplo, ser suministrada en la forma de una loción, un gel o una crema. Alternativamente, las propiedades pueden ser suministradas en un vendaje para herida. Tal vendaje para herida puede incluir un polipéptido comprende SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 21 y un transportador farmacéuticamente aceptable.

La invención además proporciona un método para tratar una herida que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:20 ó SEQ ID NO: 21 a la herida.

Los inhibidores de polipéptidos de la invención pueden tener muchas propiedades útiles. Por ejemplo, estos inhibidores de polipéptidos pueden promover el curado de la herida, prevenir la cicatrización, mejorar el tono de la piel, o estimular el desarrollo de una piel sana, suave. Más aún, éstos son estables en el plasma o en el suero mamífero.

Los inhibidores de polipéptidos en las composiciones, los vendajes y los métodos de la invención pueden inhibir la actividad de proteinasa en cualquiera de la metaloproteinasa-1 de matriz, la metaloproteinasa-2 de matriz, la metaloproteinasa-3 de matriz, la metaloproteinasa-4 de matriz, la metaloproteinasa-5 de matriz, la metaloproteinasa-6 de matriz, la metaloproteinasa-7 de matriz, la metaloproteinasa-8 de matriz, y la metaloproteinasa-9 de matriz, la metaloproteinasa-10 de matriz, la metaloproteinasa-11 de matriz, la metaloproteinasa-12 de matriz, o la metaloproteinasa-13 de matriz. En algunas incorporaciones, el inhibidor de polipéptido puede inhibir más de una de estas metaloproteinasas de matriz .

Descripción de las Figuras La figura 1 proporciona una fotocopia de un 1.5% gel de agarosa que muestra el ADN de clones recombinantes . Las construcciones de vector de expresión de gen ligadas fueron transformadas en JM109, cultivadas en platos LB suplementados con ampicilina. Las colonias individuales fueron recogidas en medio líquido y el plásmido y fue purificado de estos cultivos mediante mini-prep.. Las hileras 3, 6, y 8 contenían ADN con un tamaño que corresponde a un plásmido que tiene un inserto SEQ ID NO: 6. Estos plásmidos fueron adicionalmente caracterizados mediante la asimilación de restricción (no mostrada) . El plásmido de la hilera 3 fue recogido para el análisis de expresión de proteína.

La figura 2 proporciona una fotocopia de una visualización molecular de un modelo minimizado de energía final para el polipéptido SEQ ID NO: 5. La figura 2A proporciona un modelo de espacio lleno de sólido CP que muestra la tridimensionalidad total de la proteína. Nótese que la extensión similar del inhibidor de tejido de metaloproteinasa-2 (superior izquierda de la molécula) que se eleva de la superficie aglomerante de la metaloproteinasa de matriz . La figura 2B proporciona la misma vista como en 2A, aunque solamente la exhibición ilustra los elementos estructurales secundarios de la proteína. Las estructuras de tira beta que forman el motivo de barril beta central están mostrados ligeramente grises, los rizos y los giros están en blanco, y la hélice alfa sencilla está mostrada en gris oscuro. La proteína está mostrada como un trazo a través de las posiciones de carbono alfa. Ambas ilustraciones fueron hechas usando Rasmol .

La figura 3 ilustra la purificación del polipéptido SEQ ID NO: 5 como valorado por el análisis de 12% SDS PAGE de la fusión del polipéptido de proteína aglomerante de maltosa (MBP)-SEQ ID NO : 5 y el polipéptido SEQ ID NO: 5 purificado. La expresión y la purificación de la proteína seguida del protocolo descrito en el Ejemplo 1. La Hilera 1, aproximadamente 5 µ de la fusión de polipéptido BP-SEQ ID NO: 5 (Fracción II); Hilera 2, aproximadamente 10 µg del polipéptido SEQ ID NO : 5 (Fracción IV) purificado. El gel fue visualizado con tinta coomassie.

La figura 4 proporciona una gráfica que sintetiza un análisis ELISA de anticuerpos policlonales (pAbs) elevados en contra del polipéptido SEQ ID NO: 5. Un µg de Fracción IV del polipéptido SEQ ID NO: 5 fue adsorbido a los pozos de una charola microtiter y reactivado con ya sea pAbs purificado (círculos llenos) o suero pre-inmune (círculos abiertos) en la dilución indicada. La visualización fue lograda usando un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra que fue etiquetado con Verde-488 Oregon. Una lectora de plato microtiter fluorescente Dynex utilizado con 485 nanómetros (excitación) y un juego de filtro de banda de 538 nanómetros. La fluorescencia versus el registro de la dilución del anticuerpo (o suero) está registrado en esta gráfica.

La figura 5 proporciona una gráfica que ilustra la hidrólisis enzimática del colágeno fluoresceinatado por la raetaloproteinasa-9 de matriz. El ensayo mide la liberación de fluoresceína del colágeno como una función de tiempo. El substrato fue mezclado con enzima a tiempos cero, y la destrucción del colágeno fue vigilada por 1200 segundos (línea gruesa) . En una reacción separada una cantidad igual del polipéptido SEQ ID NO: 5 fue agregado a una reacción de hidrólisis en curso a 200 segundos (la flecha en la gráfica) . La línea punteada abajo indica que después de un pequeño periodo de espera, se detuvo la destrucción del colágeno. La excitación de la longitud de onda a 490 nanómetros, la emisión de la longitud de onda a 520 nanómetros.

La figura 6 proporciona una gráfica que ilustra una titulación de la metaloproteinasa-9 de matriz con la proteína SEQ ID NO: 5. El ensayo de liberación de fluoresceína fue usado para determinar los parámetros cinéticos de la función del inhibidor. La cantidad estoiquiométrica indicada del polipéptido SEQ ID NO : 5 fue agregado a la metaloproteinasa-9 de matriz, y la mezcla fue incubaba a temperatura ambiente por 5 minutos . El colágeno fluoresceinatado y el amortiguador fueron agregados a la mezcla, y la liberación de fluoresceína fue vigilada como una función de tiempo. La excitación de la longitud de onda a 490 nanómetros, la emisión de longitud de onda a 520 nanómetros.

La figura 7 proporciona una gráfica de barras que ilustra las constantes inhibitorias del polipéptido SEQ ID NO: 5 determinados para varias metaloproteinasas de matriz. Los valores de velocidad instantáneos fueron extraídos de las curvas en la Figura 6, y fueron usados para calcular valores Kj como se describen en la sección de Procedimientos .

La figura 8 proporciona una fotocopia de una visualizacion molecular del polipéptido SEQ ID NO: 5. Un rastro de columna vertebral de carbono alfa (en gris claro) resalta la posición de las uniones de tres-disulfido (mostrado en gris oscuro) . Las dos uniones de disulfido superiores ayudan a mantener la geometría de la región de unión de metaloproteinasa de matriz, mientras que la unión de disulfido inferior cerrar el término carboxilo en una confirmación más rígida. También se mostrada en gris claro está la posición del triptofano sencillo .

La figura 9 proporciona una gráfica que ilustra la desnaturalización química del polipéptido SEQ ID NO: 5 nativo (círculos llenos) o reducido (círculos abiertos) . Graficado está la fracción de la población de proteína que está desdoblada como una función de la concentración de urea. El polipéptido SEQ ID NO: 5 fue reducido mediante incubar la proteína con 1 mM DTT antes de la adición de la urea. Los valores de emisión de fluorescencia fueron convertidos en fracción desdoblada como se describe en la sección Procedimientos .

La figura 10 proporciona una gráfica que ilustra la estabilidad del polipéptido SEQ ID NO: 5 en suero humano. Un miligramo de polipéptido SEQ ID NO: 5 Fracción IV fue agregado a 1 mL de suero humano de (círculos cerrados, línea inferior) , 1 mL de salino amortiguado con fosfato (círculos cerrados, línea superior), ó 0.2 miligramos de metaloproteinasa-9 de matriz y 1 mL de suero humano. Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente. En los tiempos sindicados una alícuota puede removida de las mezclas y fue congelada a menos 20°C hasta el final del período de 36 horas. Las alícuotas fueron entonces analizadas para el contenido de polipéptido SEQ ID NO: 5 mediante ELYSA usando pAbs anti polipéptido SEQ ID NO: 5 purificado. La visualización fue lograda usando un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra que fue etiquetado Verde Oregon-488. Una lectora de plato microtiter fluorescente Dynex fue utilizada con un juego de filtro de banda de 485 nanómetros (excitación) y 538 nanómetros (emisión) . La fluorescencia fue convertida a porcentaje de polipéptido SEQ ID NO: 5 que permanece mediante arbitrariamente ajustando el punto de tiempo cero a 100%.

La figura 11 proporciona una gráfica que ilustra la transición térmica de 50 µ? de polipéptido SEQ ID NO: 5 como es vigilado por la fluorescencia de triptofano intrínseco. El dato fue registrado y analizado como se describe en el Ejemplo 1. Es gratificada la fracción de la población de proteína que está sin doblar como una función de la temperatura.

La figura 12 proporciona una caracterización termodinámica del polipéptido SEQ ID NO : 5. La gráfica ilustra la estabilidad termodinámica del polipéptido SEQ ID NO y :5 y como una función de la temperatura como se determina por la fluorescencia de triptofano intrínseco. Incluido en la gráfica están los valores de energía libres determinados a 20 °C y a 30°C por la desnaturalización de la proteína en urea (ver también la Figura 9) . Los cálculos de energía libre fueron efectuados de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1.

La figura 13 también proporciona una caracterización termodinámica del polipéptido SEQ ID NO: 5. La gráfica es una gráfica van't Hoff del desdoblado térmico del polipéptido SEQ ID NO: 5 vigilado por la fluorescencia de triptofano intrínseco. Está graficado el logaritmo natural del equilibrio constante versus 1000/T, donde T es la temperatura absoluta.

La figura 14 proporciona una gráfica que ilustra un análisis de filtración de gel analítico del polipéptido SEQ ID NO: 5. 500 g de purificado el polipéptido SEQ ID NO: 5 en salino amortiguado con fosfato fue inyectado una columna BioSelect 125 SEC y cromatografiado en salino amortiguado con fosfato a una tasa de flujo de 0.5 mL por minuto. La absorbencia a 280 nanómetros versus el tiempo de levigación está graficado. Superimpuestos en la gráfica están los puntos de levigación para la mioglobina (12 kDa peso molecular) , BSA (55 kDa peso molecular) , y las posiciones de la columna del volumen (V0) y el volumen total (Vt) .

La figura 15 proporciona un modelo de un complejo molecular predicho entre la metaloproteinasa-9 de matriz (MMP-9) y el polipéptido SEQ y ID NO : 5. Las hileras coordinadas tridimensionales de metaloproteinasa-9 de matriz (gris oscuro) y el polipéptido SEQ ID NO: 5 (gris claro) fueron usados como se registró en el programa FTDOCK (Gabb y otros, 1997) . El modelo que resulta es el complejo más probable que se forma entre las dos proteínas. El FTDOCK evalúa ambas consideraciones geométricas y electrostáticas cuando se calculan las interacciones de acoplamiento . Ambos términos son combinados en una función de correlación Fourier robusta.

La figura 16 proporciona una gráfica que ilustra un análisis SPR de unión y de disasociación de metaloproteinasa-9 de matriz polipéptido SEQ ID NO: 5. Una superficie de lasca BiaCore CM-5 de reactivada con metaloproteinasa-9 de matriz a través de química de ligadura carboxilo-amina activada. El polipéptido SEQ ID NO : 5 purificado fue fluido sobre su superficie a una tasa de 10 µ?? por minuto. El isotérmico que une muestra un alto grado de afinidad (cero a 400 segundos) . A 400 segundos, el flujo fue reemplazado con amortiguador solamente a fin de observar la fase de disasociación.

La figura 17 proporciona una cromatografía que ilustra la formación de un complejo de polipéptido SEQ ID NO: 5 metaloproteinasa-9 de matriz mediante el análisis HPLC. 100 µg de polipéptido SEQ ID NO: 5 fue mezclado con 700 µg de metaloproteinasa-9 de matriz (aproximadamente 1 m de cada proteína) en salino amortiguado con fosfato, y la reacción fue intubada a temperatura ambiente por 30 minutos a fin de efectuar la unión. El material fue inyectado en una columna BioSelect 125 SEC y fue cromatografiado en salino amortiguado con fosfato a una tasa de flujo de 0.5 mL por minuto. Este rastro fue marcado como "complejo" en la figura. En una segunda reacción, la misma cantidad de polipéptido SEQ ID NO: 5 y de metaloproteinasa-9 de matriz fueron mezclados juntos y fueron inmediatamente inyectados en la columna SEC. Este rastro es marcado como "mezcla" en la figura.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona inhibidores de metaloproteinasas de matriz que son útiles para promover la curación de heridas. En general, los actuales inhibidores y composiciones promueven la curación de heridas, previenen la cicatrización, mejoran el tono de la piel y estimulan el desarrollo de una piel saludable, suave.

De acuerdo con la invención, un polipéptido con uso eficiente grado de identidad de secuencia de amino ácido a regiones de los cuatro inhibidores de tejido de metaloproteinasa (TIMPs-4) pueden formar complejo inhibitorio con una variedad de metaloproteinasas de matriz . La administración de tal polipéptido inhibe a la metaloproteinasas de matriz y disminuye la tasa de destrucción de matriz extracelular en las heridas. Por lo tanto, tal polipéptido inhibidor puede proporcionar una tasa más rápida para cura heridas .

La mayoría de las estrategias de inhibición previenen la actividad enzimática de las metaloproteinasas de matriz con pequeñas moléculas orgánicas. Estos compuestos a menudo son tóxicos anticuerpos y no son moléculas que ocurren naturalmente. El uso de polipéptidos naturales para inhibir las metaloproteinasas de matriz proporciona un alto logrado de control de proteinasa sin efectos laterales tóxicos. A diferencia de las estrategias de inhibición de molécula pequeña, los polipéptidos de la invención pueden ser usados para inhibir la activación simultáneamente de todas las clases de metaloproteinasa de matriz o individuales. Los polipéptidos pueden ser libremente introducidos en la piel, en el medio ambiente de la herida, o pueden ser combinados a, o suministrados por, una cubierta de piel o vendaje para herida.

La invención proporciona un alto grado de control sobre el nivel de actividad de proteinasa para curar heridas crónicas. Por ejemplo, como se requiere alguna cantidad de nivel de proteinasa durante la curación de heridas crónicas (Agren y otros, 1999) , uno de habilidad en el arte puede escoger solamente parcialmente inhibir la actividad de proteinasa. Mediante modular el tipo y la cantidad polipéptido inhibidor aplicado, puede ser controlado el grado de inhibición de metaloproteinasa de matriz.

Inhibidores de Polipéptidos De acuerdo con la presente invención, en los polipéptidos que tienen secuencias relacionadas con el Inhibidor de Tejido de MetaloProteinasa y son útiles para curar heridas y para promover el desarrollo de piel saludable. Como se proporciona aquí, el término polipéptido es usado sinónimamente con el término proteína. Los polipéptidos suministrados por la invención inhiben la actividad de muchos tipos de metaloproteinasas de matriz. Sin embargo, los inhibidores de polipéptidos son más pequeños y más estables que los polipéptidos inhibidores de tejido de metaloproteinasas que ocurren naturalmente. Más aún, la secuencia de los presentes inhibidores de polipéptidos pueden ser modulada para optimizar sus propiedades de unión, por ejemplo, la secuencia del polipéptido puede ser modulada a esa que inhibe un amplio espectro de metaloproteinasas o la secuencia puede ser cambiada para que solamente una o unas cuantas metaloproteinasas sean inhibidas .

Por ejemplo, un inhibidor de tejido de metaloproteinasa-1 humana pueda tener la siguiente secuencia de amino ácido (SEQ ID N0:1) . 1 MAPFEPLASG ILLLLWLIAP SRACTCVPPH PQTAFCNSDL 41 VIRAKFVGTP EWQTTLYQR YEIKMTKMYK GFQALGDAAD 81 IRFVYTPAME SVCGYFHRSH NRSEEFLIAG KLQDGLLHIT 121 TCSFVAPWNS LSLAQRRGFT KTYTVGCEEC TVFPCLSIPC 161 KLQSGTHCLW TDQLLQGSEK GFQSRHLACL PREPGLCTWQ 201 SLRSQIA Ver Docherty y otros, Secuencia de inhibidor de tejido humano de metaloproteinasas y su identidad a la actividad y eritroide de potencialización, Naturaleza 318 (6041) , 66-69 (1985) .

Un inhibidor de tejido de metaloproteinasa-2 humano puede tener la siguiente secuencia de amino ácido (SEQ ID NO : 2 ) . 1 MGAAARTLRL ALGLLLLATL LRPADACSCS PVHPQQAFCN 41 ADWIRAKAV SEKEVDSGND IYGNPIKRIQ YEIKQIKMFK 81 GPEKDIEFIY TAPSSAVCGV SLDVGGKKEY LIAGKAEGDG 121 KMHITLCDFI VPWDTLSTTQ KKSLNHRYQ GCEC ITRCP 161 MIPCYISSPD ECLWMD VTE KWINGHQAKF FACIKRSDGS 201 CAWYRGAAPP KQEFLDIEDP Ver Stetler-Stevenson y otros, inhibidor de tejido de metaloproteinasa (TIMP-2) . Un nuevo miembro de la familia inhibidor de metaloproteinasa, Biol . Chem. (29), 17374-17378 (1989) .

Un inhibidor de tejido de metaloproteinasa-3 puede tener la siguiente secuencia de amino ácido (SEQ ID NO: 3) . 1 MTPWLGLIVL LGSWSLGDWG AEACTCSPSH PQDAFCNSDI 41 VIRAKWGKK LVKEGPFGTL VYTIKQMK Y RGFTKMPHVQ 81 YIHTEASESL CGLKLEVNKY QYLLTGRVYD GK YTGLCNF 121 VERWDQLTLS QRKGLNYRYH LGCNC IKSC YYLPCFVTSK 161 NECLWTD LS NFGYPGYQS HYACIRQKGG YCSWYRGWAP 201 PDKSIINATD P Ver Wick y otros, Un miembro nuevo de la familia de gen de inhibidor de tejido humano de metaloproteinasa (TIMP) es regulado durante la progresión Gl, estimulación mitogenética, diferenciación, y senescencia, J. Biol . Chem. 269 (29) , 18953-18960 (1994) .

Un inhibidor de tejido de metaloproteinasa-4 puede tener la siguiente secuencia de amino ácido (SEQ ID NO: 4) . 1 MPGSPRPAPS WVLLLRLLAL LRPPGLGEAC SCAPAHPQQH 41 ICHSALVIRA KISSEKWPA SADPADTEKM LRYEIKQIK 81 FKGFEKVKDV QYIYTPSDSS LCGVKLEANS QKQYLLTGQV 121 LSDG VFIHL CNYIEPWEDL SLVQRESLNH HYHLNCGCQI 161 TTCYTVPCTI SAPNECLWTD LLERKLYGY QAQHYVC KH 201 VDGTCSWYRG HLPLRKEFVD IVQP Ver Greene y otros, Clonación molecular y caracterización de inhibidor de tejido humano de metaloproteinasa 4, J. Biol . Chem. 271 (48), 30375-30380 (1996) .

Los inhibidores de polipéptidos de la invención tienen secuencias relacionadas a tales inhibidores de tejido de metaloproteinasas . Sin embargo, los actuales polipéptidos son más cortos y más estables que estos inhibidores de tejido de metaloproteinasas. En particular, los actuales inhibidores de polipéptidos tienen alrededor de menos de 100 amino ácidos que los naturalmente disponibles inhibidores de tejido de metaloproteinasas. Por lo tanto, éstos son más simples, más baratos y más fáciles para hacer. Más significativamente, los inhibidores actuales tienen una topología de barril beta altamente estabilizada que los que han sido incrementados mediante la incorporación de residuos de cisteína adicional . Esta topología proporciona un inhibidor que es resistente a la desnaturalización y a la acción de proteasa.

Los actuales inhibidores de polipéptidos pueden inhibir la actividad de muchos tipos de metaloproteinasas de matriz. Los actuales polipéptidos también pueden prevenir la activación de metaloproteinasas de matriz de proenzima, así como inhibir la actividad enzimática de metaloproteinasas de matriz maduras. Por ejemplo, los polipéptidos que contienen secuencias están más conservadas en una variedad de inhibidores de tejido de metaloproteinasas y pueden ser usados para proporcionar inhibidores que son generalmente efectivos en contra de una variedad de metaloproteinasas de matriz. Sin embargo, los polipéptidos que contienen secuencias están menos conservados en contra de varios tipos de inhibidores de tejido de metaloproteinasas y, por ejemplo, secuencias únicas a un inhibidor ' de tejido de metaloproteinasa específico, puede ser usado para proporcionar inhibidores que son específicos para metaloproteinasas de matriz individuales .

Por lo tanto, los polipéptidos consecuencias relacionadas a cualquier inhibidor de tejido de metaloproteinasa están contemplados por la invención como inhibidores de metaloproteinasas de matriz, así como los polipéptidos variantes que tienen uno o más amino ácidos substituidos para los amino ácidos que están naturalmente presentes en el inhibidor de tejido de metaloproteinasa. También están contempladas las mezclas de polipéptidos con diferentes secuencias. En general, las secuencias de polipéptidos, las variantes de polipéptidos y las mezclas de polipéptidos son formuladas y usadas en una manera que optimizan la curación de la herida, la regeneración de la piel, y la prevención de cicatrización o generación de piel saludable. Por lo tanto, la composición y las formulaciones de los actuales polipéptidos pueden ser variadas para que niveles menores o superiores de inhibición sean logrados siempre y cuando se promueva la curación.

Puede variar el tamaño de un inhibidor de polipéptido. En general, un polipéptido de solamente alrededor de cinco amino ácidos puede ser muy pequeño para proporcionar la inhibición óptima. Sin embargo, los polipéptidos de más de alrededor de ocho a nueve amino ácidos son suficientemente grandes para proporcionar inhibición. Por lo tanto, aun cuando la longitud total no es crítica, los polipéptidos más grandes de ocho amino ácidos a menudo son empleados en la invención. Otros polipéptidos empleados en la invención son más grandes de nueve de amino ácidos. Todavía otros polipéptidos empleados en la invención son más grandes de diez amino ácidos. Más aún, los polipéptidos que son m s grandes de alrededor de quince amino ácidos también son usados en la invención.

No hay un límite superior particular en el tamaño del polipéptido. Sin embargo, los polipéptidos más grandes pueden ser más estables que los péptidos más cortos . Los inhibidores de polipéptidos de la invención son generalmente más cortos de alrededor de cuatrocientos amino ácidos. Muchos inhibidores de polipéptidos usados en la invención son más cortos de alrededor de trescientos amino ácidos . Otros inhibidores de polipéptidos usados en la invención son más cortos de alrededor de doscientos amino ácidos. También pueden ser usados los polipéptidos más cortos de alrededor de ciento cincuenta amino ácidos. Similarmente , los polipéptidos más cortos de alrededor de ciento veinte amino ácidos también son usados en la invención.

Un polipéptido suministrado por la invención tiene SEQ ID NO: 5, como sigue. 1 MCSCSPVHPQ QAFSNAD I RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP 41 IKRIQYEIKQ IK FKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG 81 GKKEYCIAGK AEGDGK HIT LCDFICP A la expresión en un E. coli, el polipéptido SEQ ID NO: 5 puede ser adherido en su N-terminus para que le falte la metionina N-terminal. Tal polipéptido puede tener SEQ ID NO: 20, como sigue. 1 CSCSPVHPQ QAFSNADWI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP 41 IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD IEFIYTAPSS AVCGVSLDVG 81 GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPW Los inhibidores de polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 muestran excelentes propiedades inhibitorias hacia la metaloproteinasa-9 de matriz, así como son otras metaloproteinasas de matriz. Los inhibidores de polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 emplean varias propiedades fundamentales y deseables. Primero, estas propiedades son fácilmente purificadas en una forma que está completamente doblada y soluble. Mediante cambiar la expresión vector, es posible producir estas proteínas en sistemas no bacteriales, tales como un bacculovirus , o líneas de células de mamífero. Segundo, estas proteínas son extremadamente estables y de larga vida . Esta propiedad de está relacionada con la topología de barril beta que es mantenida y mejorada mediante la adición de residuos de cisteína que pueden formar uniones de disulfido estabilizadoras . Tal estabilidad es una consideración importante para una molécula que deberá de ser introducida en un medio ambiente de herida. Tercero, los inhibidores de polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 son buenos, inhibidores de metaloproteinasa de matriz de amplio rango. Estos forman complejos estoiquiométricos y de larga vida. Cuarto, estos inhibidores de polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 son inmunogenéticos para que los anticuerpos pueden ser fácilmente elevados en contra de ellos . Estos anticuerpos son útiles para rastrear la(s) proteína (s) durante experimentos in situ. Quinto, los inhibidores de polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 contienen un número de amino ácidos aromáticos (un triptofano y cuatro tirosinas) . Tales amino ácidos aromáticos hacen al polipéptido SEQ ID N0:5/SEQ ID NO -.20 receptivo a un anfitrión de experimentos de fluorescencia intrínsecos, que alivia la necesidad de modificar la proteína con fluoroforos extrínsecos.

Los métodos de modelación molecular fueron empleados a fin de diseñar el inhibidor de polipéptido SEQ ID NO: 5. La proteína fue construida mediante alinear las secuencias de amino ácido de las cuatro moléculas de inhibidores de tejido de metaloproteinasas a fin de definir las regiones de identidad de amino ácidos superiores . La secuencia SEQ ID NO: 5 por lo tanto constituye un consenso de la secuencia de amino ácido derivada de la secuencia de estudios de alineación. Un análisis de la región de contacto en el modelo tridimensional publicado de una estructura de metaloproteinasa de matriz inhibidora de tejido de metaloproteinasa permitido para la remoción de un dominio de proteína de aproximadamente 100 amino ácidos que no estar involucrado en la interacción de unión. Una unión de disulfido fue introducida en el inhibidor de proteína sintético a fin de estabilizar los nuevos términos de carboxilo.

Los polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 fueron producidos en buen rendimiento en E. coli y fueron purificados hasta la homogeneidad (Hodges y otros, 1998; Liu y otros, 1997) . Un esquema de purificación de fusión de proteína que une la maltosa fue ampliado para que los polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 homogéneos puedan ser preparados de extracto crudo en cuestión de días. Sin embargo, el aislamiento de los polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 no es dependiente en el uso del esquema de ejecución de proteina que une la maltosa. Deberá de ser deseado, que los ácidos nucleicos que codifican al polipéptido SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 20 ó cualquier otro polipéptido de la invención pueda ser clonado en cualquier expresión de vector que esté disponible.

Un ácido nucleico que codifica los polipéptidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 20 fue construido en aproximadamente tres semanas de una serie de oligonucleótidos cortos que usan una combinación de hibridización y de síntesis enzimática. La secuencia de gen de longitud completa fue direccionalmente clonada en un vector de expresión de proteína y la secuencia fue verificada mediante secuenciar el ADN. El diseño al nivel nucleótido ayudo en experimentos de clonación mediante incorporar sitios de endonucleasa de restricción en la secuencia, y también ayudo a maximizar la expresión de proteína mediante emplear una desviación de codón E. coli.

Un ácido nucleico que codifica los polipéptidos SEQ ID N0:5 y SEQ ID N0:20 es, por ejemplo, el SEQ ID NO : 6 , proporcionado abajo. 1 ATGTGCAGCT GCAGCCCGGT GCATCCGCAG CAGGCGTTTA 41 GCAACGCGGA TGTGGTGATT CGCGCGAAAG CGGTGAGCGA 81 AAAAGAAGTC GATAGCGGCA ACGATATTTA TGGCAACCCG 121 ATTAAACGCA TTCAGTATGA AATTAAACAG ATTAAAATGT 161 TTAAAGGCCC GGAAAAAGAT ATTGAATTTA TTTATACCGC 201 GCCGAGCAGC GCGGTGTGCG GCGTGAGCCT GGATGTGGGC 241 GGCAAAAAAG AATATTGCAT TGCGGGCAAA GCGGAAGGCG 281 ATGGCAAAAT GCATATTACC CTGTGCGATT TTATTTGCCC 321 GTGGTAGAAG CTTATAGAC La invención también proporciona ácidos nucleicos que son similares a SEQ ID NO: 6. En particular, la invención proporciona ácidos nucleicos que pueden hibridizarse bajo condiciones estrictas a un ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 6. Las "condiciones de hibridización estrictas" y las "condiciones de lavado de hibridización estrictas" en el contexto de la hibridización del ácido nucleico son algo de pendientes de secuencia, y pueden diferir dependiendo en las condiciones del medio ambiente del ácido nucleico. Por ejemplo, las secuencias más largas tienden a hibridizarse específicamente a temperaturas superiores. Una guia extensa a la hibridización de los ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología de Hibridización Molecular con Investigaciones en Ácido Nucleico, página 1, capítulo 2, "Vista Somera de los Principios de Hibridización y la Estrategia de los Ensayos de Investigación de Ácidos Nucleicos" Elsevier, Nueva York (1993) . Ver también, J. Sambrook y otros. Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, páginas 9.31 a 9.58 (1989); J. Sambrook y otros, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, (3ra. edición 2001) .

Generalmente, la hibridización altamente estrictas y las condiciones de lavado son seleccionadas para ser de alrededor de inferiores a 5°C que el punto de fundición térmico (Tm) para la secuencia de doble tira específica a una resistencia iónica definida y pH. Por ejemplo, bajo las "condiciones altamente estrictas" o las "condiciones de hibridización altamente estrictas" un ácido nucleico podrá ibridizarse ha su complemento a un grado detectablemente superior que las otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente) . Mediante controlar la severidad a la hibridización y/o las condiciones de lavado de los ácidos nucleicos que son 100% complementarios pueden ser identificados .

Alternativamente, las condiciones estrictas pueden ser ajustadas para permitir algo de desigualdad en las secuencias para que los grados inferiores de similitud sean detectados (la sonda heteróloga) . Típicamente, las condiciones estrictas podrán ser aquéllas en las cuales la concentración de sal es menor de alrededor de 1.5 Na ion, típicamente alrededor de 0.01 a concentración de M Na ion (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos alrededor de 30 °C para los ácidos nucleicos cortos (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos alrededor de 60°C para ensayos largos (por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos) . Las condiciones estrictas también pueden ser logradas con la adición de agentes desestabilizadores tales como la formamxda.

Las condiciones estrictas inferiores de ejemplo incluyen la hibridización con una solución amortiguador de 30 a 35% de formamida, 1 M o NaCl, 1% SDS (sulfato de dodecilo de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl y 0.3 M citrato de trisodio) a 50 a 55°C. Las condiciones estrictas moderadas de ejemplo incluyen la hibridización en 40 a 45% de formamida, 1.0 M NaCl, 1% SDS a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones estrictas superiores de ejemplo incluyen la hibridización en 50% de formamida, 1 M NaCl, 1% SDS a 37°C, y un lavado en IX SSC a 60°C a 65°C.

El grado de identidad de secuencia o complementarios de los híbridos obtenidos durante la hibridización es típicamente una función de los lavados de hibridización previos, los factores críticos son la resistencia iónica y la temperatura de la solución de lavado final. El tipo y la longitud de los ácidos nucleicos que se hibridizan también afecta si la hibridización podrá ocurrir y si cualesquier híbridos de formados podrán ser estables bajo un juego dado de condiciones de hibridización y de lavado. Para los híbridos de ADN-ADN, el punto de fundición térmico puede ser aproximado de la ecuación de einkoth y Wahl Anal. Biochem. 138:267-284 (1984) : Tm 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41(%GC) - 0.61(% forma) - 500/L donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y de nucleótidos citosina en el ADN, % forma es el porcentaje de formamida en la solución de hibridización, y L es la longitud de híbrido en pares base. El punto de fundición térmico es la temperatura (resistencia iónica definida y pH) a la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibridiza a un ensayo perfectamente acoplado.

Condiciones muy estrictas son seleccionadas para ser iguales al punto de fundición térmico.

Un ejemplo de condiciones de hibridización estrictas para la hibridización de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una mancha Sureña o Norteña es de 50% de formamida con 1 miligramo de heparina a 42 °C, con la hibridización llevada a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones altamente estrictas es 0.1 5 M NaCl a 72 "C por alrededor de 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado estrictas es un lavado 0.2x SSC a 65 °C por 15 minutos (ver también, Sambrook, abajo) . A menudo, un lavado altamente estricto es precedido por un lavado estricto inferior para remover el signo de sonda de fondo. Un ejemplo de exigencia medio para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos es lx SSC a 45 °C 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado de exigencia inferior para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40°C por quien se minuto. Para sondas cortas (por ejemplo, alrededor de 10 a 50 nucleótidos) , las condiciones estrictas típicamente involucran concentraciones de sal de menos de alrededor de 1.0 M Na ión, típicamente alrededor de una concentración de 0.01 a 1.0 M Na ión (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3, y la temperatura es típicamente alrededor de 30°C.

Las condiciones estrictas también pueden ser logradas con la adición de agentes desestabilizadores tal como la formamida. En general, una señal a proporción de ruido de 2x (o superior) que esa observada para una sonda no relacionada en la sonda de hibridización particular indica la detección de una hibridización específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridizan una con la otra bajo condiciones estrictas son todavía substancialmente idénticas si las proteínas que estos codifican son sustancialmente' idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico es creado usando una degeneración de codón máxima permitida por el código genético .

Inhibidores de Polipéptidos Derivados y Variantes Los polipéptidos que tienen cualquiera de SEQ ID NO: 1-5 ó 20 están contemplados como inhibidores de polipéptidos de la invención. Sin embargo, los derivados y las variantes de polipéptido de los polipéptidos que tienen cualquiera de SEQ ID N0:l-5 ó 20 también son útiles como inhibidores de polipéptidos. Tales derivados y variantes de polipéptidos pueden tener uno o más substituciones de amino ácido, supresiones, inserciones u otras modificaciones siempre y cuando el derivado o la variante de polipéptido puedan inhibir una metaloproteinasa de matriz.

Los residuos de amino ácidos de los polipeptxdos aislados pueden ser L-amino ácidos genéticamente codificados, L-amino ácidos no genéticamente codificados que ocurren naturalmente, D-enantiómeros o L-amino ácidos sintéticos de cualquiera de los anteriores . Las anotaciones de amino ácido usadas aqui para los veinte L-amino ácidos genéticamente codificados y los comunes amino ácidos no codificados son convencionales y están mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1 Amino Acido Símbolo De Una Letra Abreviación Común Alamina A Ala Arginina R Arg Aspargina N Asn Acido aspártico D Asp Cisteína C Cys Glutamina Q Gln Acido glutámico E GlU Glicina G Gly Histidina H His Isoleucina I lie Leucina L Leu Lisina K Lys Metionina M Met Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofano W Trp Tirosina Y Tyr valina V Val ß-Alaniña Bala Ácido 2, 3-diaminopropionico Dpr Ácido a-aminoisobutirico Aib N-metilglicina (sarcosina) MeGly Ornitina Orn Citrullina Cit t-Butilalanina t-BuA t-Butilglicina t-BuG N-metilisoleucina Melle Fenilglicina Phg Ciclohexilalanina Cha Norleucina Nle Naftilalanina Nal Piridilalanina 3-Benzotienilo alanina 4-Clorofenilalanina Phe (4-C1) 2-Fluorofenilalanina Phe (2-F) 3-Fluorofenilalanina Phe(3-F) 4-fluorofenilalanina Phe (4-F) Penicillamina Pen Ácido 1, 2, 3, -tetrahidro- Tic isoguinolina-3-carboxilico ß-2-tien.ilalanina Thi Sulfoxido metionina MSO Homoarginina Harg N-acetil lisina AcLys Ácido 2,4-diamino butírico Dbu p-Aminofenilalanina Phe(pNH2) N . metilvalina MeVal Homocisteina CISS Homoserina Hser Ácido e-amino hexanoico Aha Ácido d-amino valérico Ava Acido 2, 3-diaminobutirico Dab Los polipéptidos que están abarcados dentro del alcance de la invención pueden tener uno o más amino ácidos substituidos con un amino ácido de propiedades químicas y/o físicas similares, siempre y cuando éstos polipéptidos derivados o variantes retengan la habilidad para inhibir la actividad de una metaloproteinasa de matriz, estimular el crecimiento celular de los fibroblastos o los queratinocitos, o estimular la migración celular de los fibroblastos.

Los amino ácidos que son sustituibles uno para el otro generalmente residen con clases o subclases similares. Como es conocido por uno de habilidad en el arte, los amino ácidos pueden ser colocados en tres clases principales: amino ácidos hidrofílicos , amino ácidos hidrofóbicos y amino ácidos similares a la cisteína, dependiendo principalmente en las características de la cadena lateral del amino ácido. Estas clases principales pueden ser adicionalmente divididas en subclases. Los amino ácidos hidrofílicos incluyen los amino ácidos que tienen cadenas laterales acídicas, básicas o polares y los amino ácidos hidrofóbicos incluyen los amino ácidos que tienen cadenas laterales aromáticas o apolares . Los amino ácidos apolares pueden ser adicionalmente subdivididos para incluir, entre otros, los amino ácidos alifáticos. Las definiciones de las clases de amino ácidos son usadas aquí como sigue : El "amino ácido hidrofóbico" se refiere a un amino ácido que tiene una cadena lateral que no está cargada en pH fisiológico y que es repelida por una solución acuosa. Los ejemplos de amino ácido hidrofóbico genéticamente codificados incluyen el lie, el Leu y el Val. Los ejemplo de amino ácidos hidrofóbicos genéticamente codificados incluyen el t-BuA.

El "amino ácido aromático" se refiere a un amino ácido hidrofóbico que tiene una cadena lateral que contiene por lo menos un anillo que tiene un sistema p-electrón conjugado (grupo aromático) . El grupo aromático puede ser adicionalmente sustituido con grupos substituyentes tales como los grupos de alquilo, de alquenilo, de alquinilo, de hidroxilo, de sulfónilo, de nitro y de amino, así como otros. Los ejemplos de amino ácidos aromáticos genéticamente modificados incluyen la fenilalanina, la tirosina y el triptofano. Los amino ácidos aromáticos no genéticamente codificados comúnmente encontrados incluyen la fenilglicina, la 2-naftilalanina, la ß-2-tienilalanina, el ácido 1 , 2 , 3 , 4-tetrahidroisoquinolina-3 -carboxilico, la 4-clorofenilalanina, la 2-fluorofenilalanina, la 3-fluorofenilalanina y la 4-fluorofenilalanina .

El "amino ácido apolar" se refiere a un amino ácido hidrofóbico que tiene una cadena lateral que está generalmente sin carga en pH fisiológico y que no es polar. Los ejemplos de amino ácidos apolares genéticamente codificados incluyen la glicina, la prolina y la metionina. Los ejemplos de amino ácidos apolares no codificados incluyen el Cha.

El "amino ácido alifático" se refiere a un amino ácido apolar que tiene una cadena recta saturada o sin saturar, ramificada la cadena lateral de hidrocarburo cíclico. Los ejemplos de amino ácidos alifáticos genéticamente codificados incluyen Ala, Leu, Val e lie. Los ejemplos de amino ácidos alifáticos no codificados incluyen Nle.

El "amino ácido hidrofílico" se refiere a un amino ácido que tiene una cadena lateral que es atraída por una solución acuosa. Los ejemplos de amino ácidos hidrofílieos genéticamente codificados incluyen Ser y Lys . Los ejemplos de amino ácidos hidrofílicos no codificados incluyen Cit y hCys .

El "amino ácido acídico" se refiere a un amino ácido hidrofílico que tiene un valor pK de cadena lateral de menos de 7. Los amino ácidos acídicos típicamente tienen cadenas laterales negativamente cargadas en pH fisiológico debido a la pérdida de un ion de hidrógeno. Los ejemplos de amino ácidos acídicos genéticamente codificados incluyen el ácido aspártico (aspartato) y el ácido glutámico (glutamato) .

El "amino ácido básico" se refiere a un amino ácido hidrofilico que tiene un valor pK de cadena lateral de superior de 7. Los amino ácidos básicos típicamente tienen cadenas laterales positivamente cargadas en pH fisiológico debido a la asociación con el ión de hidronio. Los ejemplos de amino ácidos básicos genéticamente codificados incluyen la arginina, la lisina y la histidina. Los ejemplos de amino ácidos básicos no genéticamente codificados incluyen los amino ácidos no cíclicos de ornitina, el ácido 2 , 3-diaminopropiónico, el ácido 2 , 4-diaminobutirico y la homoarginina .

El "amino ácido polar" se refiere a un amino ácido hidrofilico que tiene una cadena lateral que no está cargada en pH fisiológico, pero el cual tiene una unión en la cual un par de electrones compartidos en común por dos átomos es mantenido más cercanamente por uno de los átomos. Los ejemplos de amino ácidos polares genéticamente codificados incluyen la aspargina y la glutamina. Los ejemplos de amino ácidos polares no genéticamente codificados incluyen la citrullina, la lisina N-acetilo y el sulfóxido de metionina.

El "amino ácido similar a la cisterna" y se refiere a un amino ácido que tiene una cadena lateral capaz de formar un eslabón covalente con una cadena lateral de otro residuo de amino ácido, tal como un eslabón de disulfido. Típicamente, los amino ácido similares a la cisteína generalmente tienen una cadena lateral que contiene por lo menos un grupo de tiol (SH) . Los ejemplos de amino ácidos similares a la cisteína genéticamente codificados incluyen la cisteína. Los ejemplos de amino ácidos similares a la cisteína no genéticamente codificados incluyen la homocisteína y la penicilamina.

Como podrá ser apreciado por aquellos que tienen habilidad en el arte, las clasificaciones anteriores no son absolutas . Varios amino ácidos exhiben más de una propiedad característica, y pueden por tanto estar incluidos en más de una categoría. Por ejemplo, la tirosina tiene ambos un anillo aromático y un grupo de hidroxilo polar. Por lo tanto, la tirosina tiene propiedades duales y puede estar incluida en ambas categorías aromática y polar. Similarmente, en adición a ser capaz de formar eslabones de disulfido, la cisteína también tiene carácter apolar. Por lo tanto, aun cuando no estrictamente clasificado como un amino ácido apolar o hidrofóbico, en muchas instancias la cisteína puede ser usadas para conferir hidrofobicidad a un polipéptido.

Ciertos amino ácidos comúnmente encontrados que no están genéticamente codificados y que pueden estar presentes, o su substituidos para un amino ácido, en el polipéptido y los polipéptidos análogos de la invención incluyen, pero no están limitados a, la ß-alanina (b-Ala) y otros omega-amino ácidos tales como el ácido 3-aminopropiónico (Dap) , el ácido 2 , 3-diaminopropionico (Dpr) , el ácido 4-aminobutírico y así sucesivamente; el. ácido oc-aminoisobutirico (Aib) ; el ácido e-aminohexanóico (Ana) ; el ácido d-aminovalérico (Ava) ; la metilglicina ( eGly) ; la ornitina (Orn) ; la citrullina (Cit) ; la t-butilalanina (t-BuA) ; la N-metilisoleucina (Melle) ; la fenilglicina (Phg) ; la ciclohexilalanina (Cha) ; la norleucina (Nle) ; la 2-naftilalanina (2-Nal) ; la 4-clorofenilalanina (Phe (4-C1) ) ; la 2-fluorofenilalanina (Phe (2-F) ) ; la 3 -fluorofenilalanina (Phe (3-F) ) ; la 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)); la penicilamina (Pen) ; el ácido 1, 2 , 3 , 4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilico (Tic) ; la ß-2-tienilalanina (Thi) ; el sulfóxido de metionina (MSO) ; la homoarginina (hArg) ; la lisina N-acetilo (AcLys) ; el ácido 2 , 3-diaminobutirico (Dab) ; el ácido 2 , 3-diaminobutirico (Dbu) ; la p-aminofenilalanina (Phe(pNH2)); la N-metil valina (MeVal) ; la homocisteína (hCys) y la homoserina (hSer) . Estos amino ácidos también caen en las categorías anteriormente definidas .

Las clasificaciones de los amino ácidos genéticamente codificados y no codificados descritos anteriormente están sintetizados en la Tabla 2, abajo. Deberá de ser entendido que la Tabla 2 es para propósitos ilustrativos solamente y no implica ser una lista exhaustiva de residuos de amino ácidos que puedan comprender los polipéptidos y los polipéptidos análogos descritos aquí. Otros residuos de amino ácidos que son útiles para hacer los polipéptidos y los polipéptidos análogos descritos aquí se pueden encontrar, por ejemplo, en Fasman, 1989, CRC Manual Práctico de Bioquímica y Biología Molecular, CRC Press, Inc., y las referencias citadas en el mismo. Los amino ácidos y no específicamente mencionados aquí pueden ser convenientemente clasificados en las categorías anteriormente descritas en la base del comportamiento conocido y/o sus características químicas y/o propiedades físicas como comparados con amino ácidos específicamente identificados .

Tabla 2 Los polipéptidos de la invención pueden tener cualquier amino ácido substituido por cualquier amino ácido similarmente clasificado para crear un polipéptido derivado o variante, siempre y cuando el polipéptido variante o derivado retenga una habilidad para inhibir la actividad de una metaloproteinasa de matriz.

Por lo tanto, para optimizar las propiedades estructurales y de unión de los actuales inhibidores de polipéptidos , puede ser generada una secuencia de amino ácido de longitud completa que es un promedio aproximado de las cuatro conocidas secuencias de inhibidores de tejido de metaloproteinasas . Esto puede ser hecho, por ejemplo, mediante efectuar una alineación a manera de par robusto de las secuencias de amino ácido de los inhibidores de tejido de metaloproteinasa que usan el programa CLUSTAL (Higgins y otros, 1992) . Una secuencia de consenso fue construida que usa este tipo de alineación. Para los amino ácidos no conservados en la región de contacto, las substituciones pueden ser hechas que preservan el carácter hidrofóbico de la vecindad, pero que niega las interacciones de lado de cadena - lado de cadena específicas .

Los amino ácidos involucrados en la unión pueden ser identificados y distinguidos de aquellos involucrados en mantener la topología de barril beta estable . Las substituciones de amino ácidos conservadoras pueden ser hechas entre los amino ácidos que están involucrados en mantener la topología de barril beta estable. Los cambios de amino ácido, menos conservadores, o aún no conservadores pueden ser hechos entre los amino ácidos involucrados en unirse a las metaloproteinasas .

Amino ácidos adicionales pueden ser removidos o agregados al dominio de terminal-C del inhibidor de polipéptido. A través del análisis de las dos estructuras complejas inhibidor de tejido de metaloproteinasa/metaloproteinasa de matriz, fue evidente que solamente la región inhibidora de tej ido de metaloproteinasa terminal-N hizo contacto significativo con el dominio catalítico de la metaloproteinasa de matriz. Esto fue confirmado más tarde mediante acoplar el modelo de proteína final con la metaloproteinasa-9 de matriz.

Tales manipulaciones reducen la longitud total de la proteína SEQ ID NO: 5 del usual tamaño del inhibidor de tejido de metaloproteinasa de alrededor de 225 de amino ácidos hasta alrededor de 108 amino ácidos. A fin de estabilizar el nuevo terminus-C de la proteína, dos reemplazos de amino ácidos adicionales fueron hechos en los polipéptidos SEQ ID NO: 5 y 20: Leu85 y VallOl fueron cambiados a cisterna. Los estudios estructurales muestran que estos dos residuos normalmente estaban dentro 3 A° uno del otro, y pueden formar una unión de disulfido si se altera a cisterna. En esta manera la última región de rizo del polipéptido inhibidor de esta encerrado en su lugar. En adición un residuo de cisterna en posición 13 fue cambiada a serina. Por lo tanto todos los residuos de cisterna (6) en los polipéptidos SEQ ID NO : 5 y 20 participaron en la formación de unión de disulfido.

El manipulaciones similares pueden ser efectuadas para modular la estabilidad o las propiedades de unión de los polipéptidos SEQ ID NO : 5 y 20 de. Por ejemplo, para adicionalmente mejorar la estabilidad de los actuales inhibidores de polipéptidos, puede ser construido un modelo de homología de un inhibidor de polipéptido optimizado. La secuencia de amino ácido del inhibidor SEQ ID NO: 5 y 20 puede ser tratado en el rastro de carbono alfa de cualquiera de los disponibles inhibidores de tejido de metaloprotexnasas que usan los programas ProMod y Swiss odel (Peitsch, 1996; Peitsch y otros, 1996) . Este modelo puede ser sometido a la minimización de energía usando un campo de fuerza GROMOS 96, con varias rondas de optimización de geometría de mecánica molecular que usan el campo de fuerza SYBYL (Clark y otros, 1989) . El modelo minimizado/optimizado final puede entonces ser analizado por interacciones de cadena lateral erróneas y geometría de torsión. Aun cuando tales estudios tan sido efectuados para generar un modelo tridimensional optimizado que comprende la secuencia SEQ ID N0:5, estos aditivos fueron efectuados por comparación con inhibidores de tejido de metaloproteinasa (ver Ejemplos) . Análisis adicionales por comparación de otros inhibidores de tejido de metaloprotexnasas pueden ceder inhibiciones de polipéptidos consecuencias variantes y derivadas que tienen estabilidad alterada y propiedades de unión.

La secuencia de amino ácido final puede entonces ser trasladada de regreso y los codones de nucleotidos pueden ser específicamente seleccionados para reflejar el uso de codón óptimo del organismo en el cual el inhibidor de polipéptido deberá de expresarse, por ejemplo, en E. coli humano, o sistemas de expresión de célula de insectos . Estas manipulaciones podrán maximizar la expresión de proteína.

El polipéptido SEQ ID NO : 5 es de 108 amino ácidos en longitud y el polipéptido SEQ ID NO: 20 es de 107 amino ácidos en longitud. Uno de habilidad en el arte puede escoger hacer una serie de supresiones terminales de carboxilo que pueden ser hechas para hacer un polipéptido más corto. Mientras se emplea este enfoque, uno de habilidad en el arte puede escoger retener un residuo de cisteina cerca del terminus-C. Por ejemplo, el CyslOl dentro del polipéptido SEQ ID NO: 5 está participando en una interacción de unión de disulfido importante. Por lo tanto, las supresiones terminal-C de solamente siete amino ácidos puede ser efectuada en el polipéptido SEQ ID NO: 5 ó 20 para generar un polipéptido inhibidor más pequeño pero funcional. Alternativamente, una cisteina puede ser agregadas al terminus-C de un inhibidor de polipéptido truncado si más de siete amino ácidos son suprimidos .

La región de rizo flexible del polipéptido SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 20 también puede ser modificada en ciertas incorporaciones, por ejemplo, mediante suprimir las partes de la región entre Val25 y Glu25. Tales mutaciones suprimidas podrán reservar la interfase de unión principal, pero pueden remover algo de la especificidad de unión hacia moléculas similares del inhibidor de tejido de metaloproteinasa-2.

En una incorporación, los inhibidores del polipéptido de la invención incluyen cualquiera de los polipéptidos que tienen SEQ ID NO: 7.

Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5~Xaa6~Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xaall-Xaal2~ Xaal3-¾al4-Xaal5-Xaal6-Xaal7-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-¾a31~Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-¾a42 -¾a43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50-Xaa51-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Xaa55-Xaa56-Xaa57-Xaa58-Xaa59-XaaS0-Xaa61-Xaa62-Xaa63-Xaa64-¾a65-¾a66-Xaa67-Xaa68-Xaa69-Xaa70-Xaa71-Xaa72-Xaa73 -Xaa74-Xaa75-Xaa76-Xaa77-Xaa78-Xaa79-Xaa80-Xaa81-XaaB2~Xaa83-Xaa84-Xaa85-Xaa86~Xaa87~Xaa88-Xaa89-Xaa90-Xaa91-Xaa92-Xaa93-Xaa94-Xaa95-Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaal00-Xaal01-Xaal02-Xaal03-Xaal04-Xaal05-Xaal06-Xaal07-Xaal08 en donde : Xaal , Xaa6, Xaa9, Xaa33, Xaa38, Xaa40, Xaa53, XaaS6, Xaa57, Xaa74, Xaaso , Xaaei , Xaa89, aa93, Xaai97 , y aaiD7 separadamente son cada uno un amino ácido apolar; aa2 , aa4 , aa73 , aase , Xaaio2 Y Xaaioe separadamente son cada uno un amino ácido similar a la cisteína? Xaa3 , Xaa5, XaalO, Xaall, Xaal4, ¾al5, Xaa26, Xaa32 , Xaa34 , Xaa37 , Xaa39, Xaa45, Xaa46, Xaa50, Xaa65, Xaa66, Xaa69, Xaa70, Xaa76, Xaa85, Y XaalOO separadamente son cada uno un amino ácido polar; Xaa7, Xaal2 , XaalS, Xaal8, Xaal9, Xaa20 , Xaa22 , Xaa24, Xaa25, Xaa30, Xaa3S, Xaa41, Xaa44, Xaa48, Xaa51, Xaa61, XaaS4, Xaa67, Xaa71, Xaa72, Xaa7S, Xaa77, Xaa79, aas?, aass, Xaasi, aa99, Xaaioi Y Xaaios separadamente son cada uno un amino ácido alifático; Xaa8, Xaa21 , Xaa23, Xaa28, Xaa42, Xaa43, Xaa49, Xaa52, Xaa55, Xaa59, Xaa82, Xaa83, aa9o, Xaa96, Y xaa98 separadamente son cada uno un amino ácido básico; Xaai3, aa5 , Xaa63, Y Xaaio separadamente son cada uno un amino ácido aromático; Xaal7, Xaa27, Xaa29, Xaa31, Xaa35, Xaa 7, Xaa58, Xaa60, XaaS2, aa78, aa8 , Xaa92, aa94, Y Xaaio3 separadamente son cada uno un amino ácido acidico; y Xaaios es triptofano; y en donde el polipéptido tiene una conformación de barril beta que es capaz de inhibir la actividad de una metaloproteinasa de matriz.

En algunas incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO : y 7 tiene cisterna en vez de amino ácidos similares a la cisterna en las posiciones Xaa2 , Xaa4; Xaa73, Xaa86, Xaal02 , Y XaalO6 - En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen metionina en la posición Xaai- Alternativamente, el Xaai amino está ausente debido al .procesamiento que ocurre naturalmente dentro de la célula y que es usada para expresar el inhibidor de polipéptido. Los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 también pueden tener metionina en cualquiera de las posiciones Xaa53, Ó Xaa97- En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen serina o treonina en cualquiera de las posiciones Xaa3, aas, aai , aa2s, Xaa32, Xaae6, Xaa69, Xaa70, Xaa7S, Y XaalO0 · En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen alanina, valina, isoleucinano leucina en cualquiera de las posiciones Xaa7, Xaal2 , XaalS, XaalS, Xaal9, Xaa20 , Xaa22 , Xaa24 , Xaa25, Xaa30, Xaa36, Xaa41, Xaa44 , Xaa48, Xaa51, Xaa61, Xaa6 , Xaa67, Xaa71, Xaa72, Xaa75, Xaa77, Xaa79, Xaa87, Xaa88, Xaa91, Xaa99, XaalOl, O XaalOS · En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen histidina en cualquiera de las posiciones Xaa8 , ó Xaa98 ¦ En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen prolina en cualquiera de las posiciones Xaa6, Xaa9, aa4o, Xaa57, aaee , ó Xaaio7 · En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen aspargina o glutamina en cualquiera de las posiciones Xaaio, ¾aii, ¾ais, xaa34, Xaa39, Xaa45, 0 ¾a50 · En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen fenilalanina en cualquiera de las posiciones Xaai3, aa54, aa63, ó Xaal 04 .

En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen ácido aspártico o ácido glutámico en cualquiera de las posiciones Xaal7, Xaa27, Xaa29, Xaa31 , Xaa35, Xaa47, Xaa58, Xaa60, Xaa62 , Xaa78 , Xaa84 , Xaa92, Xaa94, O Xaai03 · En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen lisina o arginina en cualquiera de las posiciones Xaa2i » aa23 , aa28 , aa42 , Xaa43, Xaa49, Xaa52, Xaa55, Xaa59, Xaa82, Xaa83 , XaaSO , ° ¾ 9S · En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen tirosina en cualquiera las posiciones Xaa37 , Xaa4s, Xaaes , ó XaaB 5 .

En otras incorporaciones, los polipéptidos deseables que caen dentro de SEQ ID NO: 7 tienen glicina en Cualquiera de las posiciones Xaa33 , Xaa38, Xaa56, Xaa74, XaaSO, XaaSl, ¾a89, Xaa93, O Xaa95 · Por lo tanto, en una incorporación, al los polipéptidos de la invención que tienen SEQ ID NO: 21 Xaal-Xaa2-Xaa3 -Xaa4 -Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8 -Xaa9-Xaal0-Xaall-Xaal2- ¾al3-Xaal4-¾al5-Xaal6-Xaal7-Xaal8-Xaal9-¾a20-¾a21-Xaa22-¾a23- ¾a24-¾.a25-Xa 26-¾a27-^aa28-Xaa29~Xaa30-¾a31-¾a32 -¾ia33-¾a34- Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 - ¾a4S-Xaa47-Xaa48-¾a49-Xaa50~Xaa51~Xaa52-Xaa53--Xaa54-Xaa55-Xaa5S- ¾a57-¾a58-Xaa59-¾a60-Xaa61-Xaae2-X a63-¾aS4-¾a65-¾a66-¾a67- XaaS8-XaaS9-Xaa70-Xaa71-Xaa72-Xaa73-Xaa74-Xaa75-Xaa7e-Xaa77-Xaa78- ¾a79-¾a80-Xaa81-Xaa82-Xaa83-Xaa8 -¾a85-Xaa86-¾a87-¾a88-¾a89- Xaa90-Xaa91-Xaa92-Xaa93-XaaS4-Xaa95-Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaal00- ¾aa01-¾al02-Xaal03-Xaal04-Xaal05-¾al06-Xaal07-Xaal08 en donde : Xaai , a 53, Y ¾a97 son separadamente cada uno metionina; ¾a2, ¾a4, ¾a73, ¾a86 , Xaaio2, y Xaaios son separadamente cada uno cisteína; Xaa3, Xaa5, Xaal4, Xaa26, Xaa32, XaaSS, Xaa69, Xaa70, Xaa76, Y Xaaioo son separadamente cada uno serina o treonin ; Xaa7, Xaal2, Xaal6, XaalB, Xaal9, Xaa20, Xaa22, Xaa24, Xaa25, Xaa30, Xaa3S, Xaa41, Xaa44, Xaa48, Xaa51, Xaa61, Xaa64, Xaa67, Xaa71, Xaa72, Xaa75, Xaa77, Xaa79, Xaa87, Xaa88, Xaa91, Xaa99, XaalOl, Y XaalOS SOI1 Separadamente Cad uno alanina, valina, isoleucina o leucina; Xaas, y aa98 son separadamente cada uno histidina; Xaae, aa9, Xaa o, Xaas?, aa6s, Y Xaaio? son separadamente cada uno prolina; XaalO, Xaall, Xaal5, Xaa34, Xaa39, Xaa45, Y Xaa50 separadamente cada uno aspargina o glutamina; aais, aa5 , aa63, Y aaio4 son separadamente cada uno fenilalanina; Xaal7, Xaa27, Xaa29, Xaa31, Xaa3S, Xaa47, Xaa58, XaaSO, XaaS2, aa78, aa84, aa92, aa94, Y aaio3 son separadamente cada uno ácido aspártico o ácido glutámico; Xaa21, Xaa23, Xaa28, Xaa42, Xaa43 , Xaa49, Xaa52, Xaa55, Xaa59, aas2, aas3, aago, Y Xaase son separadamente cada uno lisina o arginina; Xaa37, Xaa 6, aa6s, Y ¾a85 son separadamente cada uno tirosina; Xaa33, Xaa38, Xaa56, Xaa74, Xaa80, XaaSl, Xaa93, y aa95 son separadamente cada uno glicina; Xaaios es triptofano; y en donde el polipéptido tiene una conformación de barril beta y es capaz de inhibir la actividad de una metaloproteinasa de matriz .

Los inhibidores de polipéptidos deseables de la invención tienen una conformación de barril beta. Como es usado aquí una conformación de barril beta significa que el núcleo del polipéptido comprende estructuras secundarias de tira beta que se doblan en la estructura terciaria similar al barril. El barril beta es estabilizado mediante la unión de hidrógeno y de intra-tira y las interacciones de empacado hidrofóbicas internas. Un barril beta es una estructura terciaria reconocida conocida por aquellos con habilidad en el arte de estructura de proteína y de función.

En la presente invención, la conformación del barril beta fundamental es adicionalmente estabilizada mediante construir uniones de disulfido que ayudan mantener la topología total del polipéptido doblado. Por ejemplo, un polipéptido que tiene SEQ ID NO : 5 ó SEQ ID NO: 20 puede doblarse en una conformación de barril beta de seis tiras con tres uniones de disulfido que entrecruzan las tiras de péptido beta separadas . Los amino ácidos involucrados en las metaloproteinasas de matriz que unen están exhibidas en la superficie de la estructura similar al barril.

La conformación de polipéptidos puede ser determinada por cualquier procedimiento disponible para uno de habilidad en el arte. Por ejemplo, la conformación puede ser determinada por cristalografía de rayos X o mediante el moldeado por computadora. Por ejemplo, el moldeado por computadora puede ser efectuado usando programas tales como los programas Swiss PDB Viewer (Grux y Peitsch, 1997) y Rasmol (Sayle y Milner-White, 1995) . El trabajo de moldeado puede ser efectuado en cualquier computadora disponible con suficiente velocidad y RAM. Por ejemplo, mucho el trabajo de moldeo por computadora suministrado aquí fue efectuado en una Compaq PC que corre Windows 95, asi como una estación de trabajo Silicon Graphics, Inc. Octane UNIX. Adicionalmente, un paquete molecular en Cerius2 de Molecular Simulations, Inc. fue utilizado en la estación de trabajo Octane UNIX.

Por comparación, los archivos de estructuras tridimensionales de las metaloproteinasas de matriz (MMPs) seleccionadas pueden ser descargadas del Banco de Datos de Proteína como sigue (nombre del archivo, referencia) : MMP-1 (1FBL, Li y otros, 1995) , ?-2 (1GEN, Libson, y otros, 1995) , M P-8 (1JA0, 1JAN, Grams , y otros, 1995; Reinemer y otros, 1994) , MMP-9 (1MMQ, Browner y otros, 1995) , complejo TIMP-2/MT-1 MP (1BUV, Fernandez-Catalán y otros, 1998), TIMP-2 (1BR9, Tuuttila y otros, 1998) , y complejo ????-1/??? (1UEA, Gomis-Ruth y otros, 1997; Huang y otros, 1996; Becker y otros, 1995) . Los archivos pueden ser usados para analizar comparar la estructura tridimensional de los inhibidores de polipéptidos con proteínas inhibidoras de tejido de metaloproteinasas que ocurren naturalmente, y pueden facilitar la identificación de los amino ácidos responsables para las interacciones y unión específicas con diferentes metaloproteinasas de matriz .

La habilidad de un polipéptido para inhibir la actividad de metaloproteinasa de matriz puede ser evaluada mediante cualquier procedimiento disponible a uno de habilidad en el arte . Muchos procedimientos de evaluación diferentes están disponibles para evaluar si o no un agente puede actuar como un inhibidor de actividad proteinasa. Por ejemplo, un substrato de proteína que puede ser usado que genera una señal detectable cuando se adhieren por la proteinasa. En algunas incorporaciones, la actividad de una metaloproteinasa de matriz en la presencia y ausencia de un inhibidor de prueba es evaluada mediante observar la hidrólisis enzimática del substrato de proteína fluoresceinatado, por ejemplo, como una función de tiempo. Un ejemplo de tal substrato de proteína fluoresceinatado es el colágeno fluoresceinatado disponible de Molecular Probes, Inc.. Tal substrato de proteína fluoresceinatado puede ser incubado con una metaloproteinasa de matriz seleccionada o una mezcla de metaloproteinasas de matriz seleccionadas. La adherencia del substrato de proteína fluoresceinatado es detectada mediante observar un incremento en la absorbencia sobre el tiempo. Cantidades que varían de substrato y/o de inhibidor (es) de polipéptido de prueba puede ser usado en la mezcla de ensayos para asegurar que efectos de concentración existen, y que cantidades de inhibidor son óptimas para inhibir las metaloproteinasas de matriz.

Las secuencias de los actuales polipéptidos pueden por lo tanto ser alterados para modular la afinidad del inhibidor de polipéptido diferentes metaloproteinasas de matriz. Porque algo de actividad de proteinasa es requerida (aun en heridas crónicas) a fin de modular la reorganización de' matriz, extracelular (Agren 1999) , en ciertas incorporaciones puede ser deseable construir un inhibidor que no inhiba las metaloproteinasas de matriz con un K± extremadamente inferior. Por ejemplo, los valores de ¾ de los actuales polipéptidos pueden variar desde 1 µ hasta alrededor de 1 m . Tal polipéptido puede tener la habilidad de permitir algo de actividad de metaloproteinasa de matriz (debido a un ¾. relativamente superior) .

La constante inhibitoria (Ki) de un inhibidor de polipéptido ([I]) puede ser determinada usando los procedimientos proporcionados por Segel (1993) por medio del uso de gráficas Dixon (l/v vs.[I]), tal que: inclinación = Km / (Vmax Ki [S]) (1) en donde Km es la constante de Michaelis, Vmax es la velocidad máxima de reacción, y [S] es la concentración del substrato. El grado y el tiempo de actividad inhibitoria y en la herida crónica también puede ser controlada mediante modular la dosis de inhibidor y el tiempo de aplicación.

La toxicidad de los inhibidores de polipéptido de la invención se espera que sea bajo. Sin embargo, si surgen preocupaciones, la toxicidad celular puede ser evaluada mediante agregar varias cantidad de un polipéptido a fibroblastos o queratinocitos en cultivo. El crecimiento y la integridad celular de estas células pueden ser vigilados para evaluar si un inhibidor de polipéptido seleccionado tiene cualesquier efectos negativos .

La tasa de curación de un inhibidor de polipéptidos seleccionado puede ser evaluada mediante introducir el polipéptido seleccionado en una herida y medir si la tasa de curación es alterada por la presencia de polipéptido. Por ejemplo, puede ser determinada la tasa de curación de la herida en la presencia y la ausencia de un polipéptido. Aun cuando cualquier herida puede ser usada, es preferido un modelo de herida con propiedades predecibles. Por ejemplo, dos modelos de heridas crónicas en animales existen que pueden ser usados. La primera es un modelo de oreja de conejo isquémico, mientras que el segundo es un modelo de rata diabético inducido.

Modificaciones de Polipéptido La invención también contempla modificar los inhibidores de polipéptidos para estabilizarlos, para facilitar su admisión y si absorción y para mejorar cualesquier otra característica propiedad de los polipéptidos que conocida a uno de habilidad en el arte. Por ejemplo, los inhibidores de polipéptidos pueden ser cambios, cíclicos en los inhibidores de polipéptido que pueden ser neutralizados, y los polipéptidos pueden estar enlazados a otras mitades químicas .

La variedad de reacciones entre las dos cadenas con grupos funcionales apropiados para formar tales enlaces dentro del polipéptido o a otras mitades, así como las condiciones de reacción apropiadas para formar tales enlaces, podrá ser evidente para aquellos con habilidad en el arte. Las condiciones de reacción deseadas son suficientemente apacibles para así no degradar o de otra manera dañar el polipéptido. Los grupos apropiados para proteger las varias funcionalidades como son necesarias son muy conocidas en el arte (ver, por ejemplo, Greene & Wuts, 1991, 2da. ed., John iley & Sons, Nueva York), como lo son varios esquemas de reacción para preparar tales moléculas protegidas.

En una incorporación las cargas en los extremos terminal-N y terminal-C son efectivamente removidos. Esto puede ser hecho mediante cualquier método disponible a uno de habilidad en el arte, por ejemplo, mediante acetilanizar el N-terminus y amidatinar el terminus-C.

Los métodos para preparar y modificar los polipéptidos en una variedad de formas son muy conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Spatola, 1983, Vega Data 1(3) para una revisión general); Spatola, 1983, "Modificaciones de Columna Vertebral de Péptido" En: Química y Bioquímica de Péptidos Amino Ácidos y Proteínas (Weinstein, ed.), arcel Dekker, Nueva York, pag. 267 (repaso general) ; orley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1:463-468; Hudson y otros, 1979, Int. J. Prot . Res. 14:177-185 (--C¾ NH--, ~-CH2 C¾--); Spatola y otros, 1986, Life Sci. 38:1243-1249 (--C¾ --S) ; Hann, 1982, J. Chem. Soc . Perkin Trans . I. 1:307-314 (--CH = CH--, cis y trans) ; Almquist y otros, 1980, J. ed. Chem. 23:1392-1398 (~-C0 CH2) ; Jennings-White y otros, Tetrahedron. Lett. 23:2533 (--C0 CH2--); Solicitud de Patente Europea EP 45665 (1982) CA:97:39405 (--CH(OH) C¾--) ; Holladay y otros, 1983, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (- -C (OH) CH2--) ; y Hruby, 1982, Life Sci . 31:189-199 (--CH2 --S--) .

Composiciones para Sanar Heridas Los polipéptidos de la invención pueden ser usados para sanar heridas y son particularmente benéficos para sanar heridas crónicas. Los polipéptidos individuales, las variantes de polipéptidos, los derivados de polipéptidos y las mezclas de los mismos (por ejemplo aquellos con diferentes secuencias) pueden ser combinados en una formulación para promover el sanado de la herida y prevenir o tratar problemas de la piel. La curación óptima y la regeneración de la piel pueden requerir algo de actividad de metaloproteinasa de matriz. Por lo tanto, las composiciones y las formulaciones de la presente invención no necesariamente promueven la inhibición máxima de las metaloproteinasas de matriz. En vez de eso, la actividad de la formulación inhibitoria del polipéptido es variada como se necesite para optimizar el sanado y promover el desarrollo de la piel saludable. Niveles superiores o inferiores de inhibición pueden ser logrados mediante variar el tipo, el contenido y la cantidad de polipéptidos inhibitorios para que el sanado y el desarrollo de la piel saludable es promovido .

Para promover el desarrollo de la piel saludable y/o tratar heridas, los polipéptidos de la invención son introducidos en la piel en cualquier manera escogida por uno de habilidad en el arte. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser formulados en una composición terapéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de polipéptidos y un transportador farmacéutico. Tal composición puede ser introducida en la piel o en la herida como una crema, rociado, espuma, gel o en cualquier otra forma o formulación. En otra incorporación, los polipéptidos de la invención pueden ser formulados en un vendaje o recubrimiento para la piel que contiene y una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más polipéptidos impregnados en, covalentemente acoplados o de otra manera asociados con un material de vendaj e o de recubrimiento . En una incorporación, el vendaje o el recubrimiento para la piel permiten la liberación del inhibidor de polipéptido. La liberación del inhibidor de polipéptido puede ser en una manera sin controlar o controlada. Por lo tanto, los recubrimientos para la piel o los vendajes para las heridas de la invención pueden proporcionar una lenta y a tiempo liberación del inhibidor de polipéptido en una herida. Los recubrimientos para la piel y los materiales de vendajes pueden ser de cualquier material usado en el arte que incluyen las vendas, la gasa, la envoltura estéril, el hidrogel, el hidrocoloíde y los materiales similares.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la invención es una cantidad de polipéptido que inhibe una metaloproteinasa de matriz a un grado necesario para promover el desarrollo de la piel saludable y/o la curación de la herida. Por ejemplo, cuando está presente en una composición farmacéutica terapéutica, la cantidad de polipeptidos de la invención puede ser en el rango de alrededor de 0.001% hasta alrededor de 35% por peso de la composición. Los polipéptidos pueden formar alrededor de 0.5% hasta alrededor de 20% por peso de la composición. Alternativamente, los polipéptidos forman alrededor de 1.0% hasta alrededor de 10% por peso de la composición. La cantidad de terapéuticamente efectiva de inhibidor de polipéptidos necesariamente varía con la ruta de administración. Por ejemplo, una cantidad terapéutica entre 30 y 112,000 µg por kilogramo de peso corporal puede ser efectiva para la administración intravenosa. Sin embargo, la cantidad de el inhibidor de polipéptidos requerida para el desarrollo de la piel saludable o tratamiento de heridas podrá variar no solamente con la ruta de administración, pero también la naturaleza de la condición que es tratada y la edad y la condición del paciente y podrá ser ultimadamente a la discreción del clínico o del doctor que lo atiende.

La dosis y el método de administración pueden variar dependiendo en la ubicación de la piel o el tejido a ser tratado y/o a la severidad de la herida. Las dosis útiles de los polipéptidos y los conjugados de polipéptidos puede ser determinada mediante correlacionar su actividad in vitro, y la actividad in vivo en modelos animales descritos aquí. El compuesto puede convenientemente ser administrado en forma de dosis unitaria; por ejemplo, que contiene alrededor de 0.001 µg hasta alrededor de 10 miligramos, convenientemente alrededor de 0.01 µg hasta alrededor de 5 miligramos, más convenientemente, alrededor de 0.10 g hasta alrededor de 1 miligramo, y aun más convenientemente alrededor de 1.0 µg hasta 500 µg de polipéptido por forma de dosis unitaria. La dosis deseada puede ser presentada en una dosis sencilla, como dosis divididas, o como una infusión continua. La dosis deseada y también puede ser administrada a intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. Uno de habilidad en el arte puede fácilmente preparar y administrar una formulación efectiva de información disponible que usa las enseñanzas proporcionadas aquí .

Los inhibidores de polipéptidos de la invención pueden ser formulados como composiciones farmacéuticas y administrados a un anfitrión mamífero, tal como un paciente humano en una variedad de formas de dosis adaptadas a la ruta escogida de administración, por ejemplo, oralmente o parenteralmente , mediante el rutas intravenosas, intramusculares, tópicas o subcutáneas.

Por lo tanto, los inhibidores de polipéptidos pueden ser sistemáticamente administrados, por ejemplo, de manera intravenosa o de manera intraperitoneal mediante infusión o inyección. Las soluciones del inhibidor de polipéptidos pueden ser preparadas en agua, opcionalmente mezcladas con un surfactante no tóxico. Las dispersiones también pueden ser preparadas en glicerol, en glicoles de polietileno líquidos, en triacetina, y en mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y de uso, estas preparaciones contienen un preservativo para prevenir el crecimiento de microorganismos .

Las formas de dosis farmacéuticas apropiadas para la inyección o la infusión o la aplicación tópica pueden incluir soluciones acuosas estériles o dispersiones o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo que están adaptados para la preparación extemporánea de las dispersiones o soluciones infusibles o inyectables estériles, opcionalmente encapsuladas en liposomas . En todos los casos, la forma de dosis última debe de ser estéril, fluida y estable bajo las condiciones de fabricación y de almacenamiento. El vehículo o el transportador líquidos puede ser un solvente o medio de dispersión líquido que comprende, por e emplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, glicol de propileno, glicoles de polietileno líquido, y los similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos, y las mezclas apropiadas de los mismos. La adecuada fluidez puede ser mantenida, por ejemplo, mediante la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones o mediante el uso de surfactantes . La prevención de la acción de los microorganismos puede ser originada mediante varios agentes antibacteriales y antif ngicidas, por ejemplo, los parabenos, el clorobutanol, el fenol, el ácido sórbico, la timerosal, y los similares. En algunos casos, uno de habilidad en el arte puede escoger incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, amortiguadores o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser originada por el uso en las composiciones de los agentes que retardan la absorción, por ejemplo, el monoestearato de aluminio y la gelatina.

Las soluciones inyectables estériles son preparadas mediante incorporar el polipéptido o el conjugado de polipéptido en la cantidad requerida en el solvente apropiado, varios de los otros ingredientes anteriormente enumerados, como se requieren, seguido por la esterilización de filtro. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen el secado con vacío y las técnicas de secado congelado, las cuales rinden un polvo del ingrediente activo además de cualquier ingrediente desafiado adicional presente en las previas soluciones estériles filtradas.

En algunas instancias, los inhibidores de polipéptidos también pueden ser administrados oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un transportador comible asimilable.

Estos pueden estar encerrados en cápsulas de gelatina de coraza suave o dura, pueden ser comprimidos en tabletas, o pueden estar incorporados directamente con la comida de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica oral, el inhibidor de polipéptido puede ser combinado con uno o más excipientes y usados en la forma de tabletas no digeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elixir, suspensiones, jarabes, obleas, y los similares. Tales composiciones y preparaciones deberán de contener por lo menos 0.1% por peso de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y de las preparaciones puede, por supuesto, ser variado y puede convenientemente ser de entre alrededor de 2 hasta alrededor de 60% del peso de una forma de dosis unitaria dada. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que podrá obtenerse un nivel de dosis efectivo.

Las tabletas, las pastillas, las pildoras, las cápsulas, y los similares también pueden contener lo siguiente: aglutinantes tales como la goma de tragacanto, la acacia, el almidón de maíz o la gelatina; los excipientes tales como el fosfato de dicalcio; un agente desintegrador tal como el almidón de maíz, el almidón de papá, el ácido algínico y los similares; un lubricante tal como el estearato de magnesio; un agente endulzante tal como la sucrosa, la fructuosa, la lactosa o el aspartame o un agente anabolizante tal como la hierbabuena, el aceite de piróla, o el sabor cereza pueden ser agregados . Cuando la forma de la dosis de unitaria es una cápsula, ésta puede contener, en adición a los materiales de la anterior tipo, un transportador líquido, tal como un aceite vegetal o un glicol de polietileno. Varios otros materiales pueden estar presentes como revestimientos o de otra manera de. modifican la forma física de la forma de la dosis unitarias sólida. Por ejemplo, las tabletas, las pildoras, o las cápsulas pueden estar revestidas con gelatina, cera, goma o azúcar y los similares. Un jarabe o un elixir puede contener el compuesto químico, sucrosa o fructuosa como un agente endulzante, el metilo y los propilparabenos como preservativos, un tinte y saborizantes tal como el sabor cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en preparar una forma de dosis unitaria deberá de ser farmacéuticamente aceptable y substancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Adicionalmente, el inhibidor- de polipéptido puede estar incorporado en dispositivos y preparaciones de liberación sostenida .

Los transportadores sólidos útiles incluyen los sólidos finamente divididos tales como el talco, la arcilla, la celulosa microcristalin , el sílice, el aluminio y los similares . Los transportadores líquidos útiles incluyen el agua, los alcoholes o los glicoles o las mezclas de agua-alcohol/glicol , en los cuales los compuestos actuales pueden estar disueltos o dispersos en niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de surfactantes no tóxicos . Los adyuvantes tales como las fragancias y los agentes antimicrobiales adicionales y pueden ser agregados para optimizar las propiedades para un uso dado .

Los espesantes tales como los polímeros sintéticos, los ácidos grasos, las sales de ácido graso y los esteres, los alcoholes grasos, las celulosas modificadas o los materiales minerales modificados también pueden ser empleados con transportadores líquidos para formar pastas que se esparcen, geles, ungüentos, jabones, y los similares, para la aplicación directamente a la piel del usuario.

En general, los polipéptidos de la invención son administrados tópicamente para el tratamiento de heridas y para promover el desarrollo de la piel saludable. Los polipéptidos activos pueden ser administrados tópicamente mediante cualesquiera medios ya sea directamente o indirectamente al tejido seleccionado como rociadores, espumas, polvos, cremas, gelatinas, pastas, supositorios o suspensiones. El término pasta usado en este documento deberá de ser tomado para incluir las cremas y otras composiciones que se esparcen viscosas como son a menudo aplicadas directamente a la piel o esparcidas en una venda o vendajes. Los polipéptidos de la invención pueden estar covalentemente acoplados, establemente adsorbidos o de otra manera aplicados a un recubrimiento para la piel o material de vendaje para la herida. Para facilitar la curación después de la cirugía, los polipéptidos activos de la invención pueden ser directamente aplicados a los tejidos objetivo o a los dispositivos prostéticos a los dispositivos de implantes de liberación sostenida. Las composiciones pueden ser administradas mediante aerosoles, como una espuma o como una llovizna, con o sin otros agentes, directamente a la piel o a la herida.

Los polipéptidos pueden ser administrados en una formulación que puede incluir una emulsión de polipéptido en una cera, aceite, un emulsificador, agua, y/o un material substancialmente insoluble en agua que forma un gel en la presencia de agua. La formulación proporciona las propiedades deseables de una emulsión, en que se esparce y tiene una consistencia cremosa de una emulsión, aun así no se descompone cuando es sometido a procedimientos de esterilización, por ejemplo la esterilización con vapor, porque el gel estabiliza la emulsión. También exhibe mejores propiedades de retención al agua que un gel convencional porque el agua es mantenida ambas en la emulsión y en el gel .

La formulación también puede contener un humectante para reducir la presión de vapor parcial de la agua en la crema o loción para reducir la tasa en la cual la crema y la loción se secan. Los humectantes apropiados son admisibles en agua a una gran extensión y son generalmente apropiados para la aplicación a la piel. Los polioles son especialmente apropiados para el propósito y los polioles apropiados pueden incluir de glicol de monopropileno y o glicerina (glicerol) . El poliol puede estar presente en proporciones de 20 a 50% (por peso) de la formulación total; alternativamente el rango es de 30 a 40%. Esta proporción relativamente superior de poliol también asegura que si la pasta se secara a cualquier grado, la pasta que resulta permanece suave y flexible porque la glicerina puede actuar como un plastificador del polímero. Cuando la pasta en aplicada a una venda, por ejemplo, por lo tanto puede ser todavía fácilmente removida de la piel cuando la pasta ha perdido agua sin la necesidad de cortar la venda. El poliol también tiene la ventaja de funcionar para prevenir la proliferación de bacteria en la pasta cuando está en contacto con la piel o la herida, y particularmente las heridas infectadas .

La formulación puede incluir otros ingredientes tales como los agentes antibacteriales, los agentes antifungicidas, de los agentes anti-inflamatorios, y los similares. Otros ingredientes también pueden encontrarse apropiados para la incorporación en la formulación.

Un ejemplo de una cera de la emulsión es el monoestearato de glicerilo, una combinación de monoestearato de glicerilo y el estearato de polietilenglicol 100 que está comercialmente disponible como CITHROL GMS/AS/?? de Croda Universal Ltd.. La combinación proporciona ambos una cera y un emulsificador (estearato de polietilenglicol 100) que es especialmente compatible con la cera, para formar una emulsión en agua. Un segundo emulsificador puede estar incluido en la formulación para incrementar la estabilidad de la emulsión, por ejemplo, un estearato de polietilenglicol 20, tal como el CITH OL 10MS que suministrado por Croda Universal Ltd.. La concentración total de emulsificador en la crema normalmente deberá de ser en el rango de desde 3 a 15%. Donde dos emulsificadores son usados, uno puede estar presente en una concentración superior que el otro.

El material insoluble en agua forma un gel con el agua de la formulación. El material es por lo tanto hidrofílico pero no se disuelve en agua en ninguna en extensión superior. El material puede ser un material polimérico, por ejemplo, un polímero no soluble en agua que absorbe agua. Sin embargo, los materiales no polimétricos que forman geles con aguja y que son estables a temperaturas elevadas también pueden ser usados, por ejemplo las arcillas tales como el caolín o la bentonita. Algunos polímeros usados en la invención son polímeros súper absorbentes tales como aquellos descritos en WO-92/16245 y que comprenden derivados de celulosa hidrofílica que han sido parcialmente entrelazados para formar una estructura tridimensional. Los derivados de celulosa entrelazados apropiados incluyen aquellos de las celulosas de alquilo inferiores de hidroxilo, en donde el grupo de alquilo contiene de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo la celulosa de hidroxiletilo o la hidroxipropilcelulosa, o las celulosas de carboxilo por ejemplo la celulosa de hidroxiletilo de carboximetilo o la metilcelulosa de carboxilo. Un ejemplo de un polímero que puede ser usado en la invención es un polímero de metilcelulosa de carboxilo de sodio parcialmente entrelazado suministrado como AKUCELL X181 por Akzo Chemicals B.V.. Este polímero es un polímero súper absorbente en que también absorbe por lo menos 10 veces su propio peso de agua. La estructura entrelazada del polímero evita que se disuelva en agua pero el agua es fácilmente absorbida en y mantenida dentro de la estructura tridimensional del polímero para formar un gel . El agua se pierde menos rápido de tal gel que de una solución y esto es ventajoso en disminuir o prevenir el secado de la formulación en crema. El contenido de polímero de la formulación es normalmente menos de 10%, por ejemplo, el contenido de polímero puede estar en el rango desde alrededor de 0.5 hasta alrededor de 5.0% por peso, o desde alrededor de 1.0% hasta alrededor de 2% por peso.

La formulación puede ser esterilizada y los componentes de la formulación deberán de ser seleccionados, mediante variar el contenido de polímero, para proporcionar las propiedades de flujo deseadas del producto terminado. Esto es, si el producto a ser esterilizado, y entonces la formulación deberá de ser escogida para dar un producto de viscosidad/elasticidad relativamente superior antes de la esterilización. Si ciertos componentes de la formulación no deberán de ser esterilizados, la formulación puede ser estilizada antes de la adición de esos componentes, o cada componente puede ser separadamente estilizado. La formulación puede entonces ser hecha mediante mezclar cada uno de los ingredientes esterilizados bajo condiciones estériles. Cuando los componentes son separadamente esterilizados y entonces mezclados juntos, el contenido de polímero puede ser ajustado para dar un producto que tiene las propiedades de flujo deseadas del producto terminado. El contenido de emulsión determina las propiedades de manejo y la sensación de la formulación, el contenido de emulsión superior lleva a una sensación cremosa y esparcido mejorado.

La formulación puede ser empacada en tubos, tinas u otras formas apropiadas de contenedores para almacenamiento o puede ser esparcida en un substrato y entonces subsecuentemente empacada. Los substratos apropiados incluyen los vendajes, que incluyen los vendajes de película, y las vendas.

Los siguientes ejemplos tienen la intención de ilustrar pero no la de limitar la invención.

Ejemplo 1; Procedimientos Este ejemplo proporciona los materiales y los métodos empleados para varios experimentos .

Procedimientos de Biología Molecular: Las condiciones de crecimiento bacterial y el cultivo fueron efectuados como se describe por iller (1972) . A menos que se note de otra manera todos los procedimientos efectuados en este estudio fueron de acuerdo con Maniatis y otros (1982) o Sambrook y otros (1989) o Sambrook y otros (2001) ; que incluyen, la electroforesis de gel de agarosa, y las digestiones de endonucleasa de restricción. La polimerasa de ADN Vent usada en todas las reacciones PCR fue adquirida de New England Biolabs y fue usada con el» amortiguador suministrado. El secuenciado de ADN (Sanger y otros, 1977) fue efectuado usando un secuenciador automático de Applied Biosystems, Inc., y fue efectuado por Genosys, Inc.. Los oligonucleótidos de ADN fueron sintetizados por Genosys, Inc.. La concentración de proteína fue determinada de acuerdo con el método de Bradford (1976) usando albúmina de suero bovino (BSA) como una norma o espectrofotométricamente usando un coeficiente de absorción molar calculado de 11, 300 M"1 cm"1. Los experimentos de filtración de gel analíticos fueron afectados de acuerdo con Siegel y Monty (1966) usando una columna SEC-125 BioSelect de 7 x 250 milímetros de BioRad, Inc.. Todas las tiras bacteriales fueron adquiridas de la New England Biolabs, Inc.. Los geles de proteína SDS PAGE fueron hechos, ocurridos, y procesados como por Laemmli (1970) . Los reactivos químicos y las resinas de cromatografía fueron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri), excepto donde específicamente se anota.

Moldeo Molecular: El moldeo molecular utilizó los programas de visualización, Swiss PDB Viewer (Guex y Peitsch, 1997) y Rasmol (Sayle y Miller-White , 1995) . El trabajo de modelo fue efectuado en una PC Compaq que corre Windows 95, así como una estación de trabajo Octane UNIX de Silicon Graphics, Inc.. Adicionalmente, el paquete molecular Cerius2 de Molecular Simulations, Inc. fue utilizado en la Octane. Los archivos de estructuras tridimensionales de las metaloproteinasas de matriz (MMPs) seleccionadas del Banco de Datos de Proteína como sigue (nombre del archivo, referencia) : MMP-1 (1FBL, Li y otros, 1995), MMP-2 (1GEN, Libson, y Otros, 1995), MMP-8 (1JA0, 1JAN, Grams, y otros, 1995; Reinemer y otros, 1994) , MMP-9 (1MMQ, Browner y otros, 1995) , complejo TI P-2/MT-1 MMP (1BUV, Fernandez-Catalán y otros, 1998), TIMP-2 (1BR9, Tuuttila y otros, 1998) , y complejo TIMP-l/MMP (1UEA, Gomis-Ruth y otros, 1997; Huang y otros, 1996; Becker y otros, 1995) . Estos archivos fueron usados para analizar la estructura tridimensional de las proteínas, la naturaleza química de los amino ácidos en varias posiciones y la identificación de los amino ácidos variantes y conservados en la interfase de contacto metaloproteinasa de matriz-inhibidor de tejido de metaloproteinasa. Esta información fue utilizada para diseñar los inhibidores de la invención que puedan unir cualesquier enzimas de metaloproteinasa de matriz.

El primer paso fue la de comenzar una secuencia de amino ácido de longitud completa que fue de un promedio de las cuatro secuencias de inhibidor de tejido de metaloproteinasa conocidos . Una alineación a manera de par robusto para las cuatro secuencias de amino ácido de inhibidores de tejido de metaloproteinasa fue calculada usando el programa CLUSTAL (Higgins y otros, 1992). Una secuencia de consenso fue entonces construida basada en esta alineación. Para los amino ácidos no conservados en la región de contacto, las instituciones fueron hechas que preservaron el carácter hidrofóbico de la vecindad, pero eso negó las interacciones de cadena lateral-cadena lateral específicas. A través de este ejercicio, se obtuvo una interfase de unión de consenso. Una parte larga de rizo de flexible de inhibidor de tejido de metaloproteinasa-2 , que no es evidente en el inhibidor de tejido de metaloproteinasa-1 , fue construida en el inhibidor polipéptido con varios cambios de secuencia de amino ácido.

El segundo paso fue remover el dominio terminal-C de la molécula inhibidora de consenso. A través del análisis de las dos estructuras complejas de inhibidor de tejido de metaloproteinasa/metaloproteinasa de matriz, fue determinado que solamente la región inhibidora de tejido de metaloproteinasa terminal-N quiso contacto significativo con el dominio catalítico de la metaloproteinasa de matriz. Esto fue confirmado más tarde mediante acoplar el modelo de proteína final con la metaloproteinasa-9 de matiz. Esta manipulación tan bien redujo la longitud total de la proteína de 225 amino ácidos a 108 amino ácidos. A fin de estabilizar el nuevo terminus-C de la proteína, dos reemplazos de amino ácidos adicionales fueron hechos: Leu85 y VallOl fueron cambiados a cisteína. Estos dos residuos fueron observados para estar dentro de 3 uno del otro. Por lo tanto, las substitución con cisteína y posiblemente podrá permitir la formación de una unión del disulfido. En esta manera la última región de rizo de la proteína podrá estar encerrada en su lugar. En adición al residuo de cisteína en posición 13 fue cambiada a serina. Por lo tanto seis residuos de cisteína estaban disponibles en el inhibidor de proteína final para participar en la formación de unión de disulfido.

El tercer paso implico construir un modelo de homología el nuevo inhibidor de proteína. La secuencia 108 de amino ácido final del inhibidor fue hilada en el rastro de carbono alfa del inhibidor de tejido de metaloproteinasa-9 usando los programas ProMod y Swiss odel (Peitsch, 1996; Peitsch y otros, 1996). Este modelo fue entonces sometido a minimización de energía usando un campo de fuerza GROMOS 96, y varias rondas de optimización de geometría mecánica molecular usando el campo de fuerza SYBYL (Clarck y otros, 1989) . El modelo final minimizado/optimizado fue entonces analizado por erróneas interacciones de cadena lateral y de geometría de torsión.

El inhibidor de polipéptído finalizado derivado de tal moldeo tridimensional tuvo SEQ ID NO : 5 y fue designado DST. Este acrónimo es corto para Delta (la proteína final tiene el dominio inhibidor de tejido de metaloproteinasa terminal-C suprimido) Sintético (está basado en el moldeo estructural y de homología) TIMP (porque está basado en estructuras TI P1-2) .

Clonación, Construcción, y Diseño del Gen: La secuencia de amino ácido SEQ ID NO : 5 final fue trasladada de regreso usando el código genético normal. La selección del codón se basó en la desviación de E. coli, que significa que el codón final seleccionado para un amino ácido particular fue el codón más frecuentemente usado para ese amino ácido en E. coli. El gen estructural del longitud final fue de 327 bp. A fin de construir la secuencia de gen, diez oligonucleótidos de tira sencilla que abarcaron la región codificada fueron sintetizados por Genosys, Inc.. Los oligonucleótidos fueron de 70 nucleótidos en longitud. Cada oligonucleótido fue complementario a otro oligonucleótido, tal que cuando se hibridizan con su compañero de unión, el fragmento que resulta contenía una región dúplex central de 50 pares base y estaba flanqueado de en cada extremo por una región de 10 nucleótidos sencillos en tira. Las secuencias de oligonucleótidos empleadas están mostradas en la Tabla 3.

Tabla 3 : oligonucleótido para la construcción del ácido nucleico inhibitorio ATGTGCAGCT GCAGCCCGGT GCATCCGCAG CAGGCGTTTA GCAACGCGGA TGTGGTGATT CGCGCGAAAG-3 ' (SEQ ID NO : 8 ) CGGTGAGCGA AAAAGAAGTC GATAGCGGCA ACGATATTTA TGGCAACCCG ATTAAACGCA TTCAGTATGA-3 ' (SEQ ID NO: 9) AATTAAACAG ATTAAAATGT TTAAAGGCCC GGAAAAAGAT ATTGAATTTA TTTATACCGC GCCGAGCAGC-3 ' (SEQ ID NO: 10) GCGGTGTGCG GCGTGAGCCT GGATGTGGGC GGCAAAAAAG AATATTGCAT TGCGGGCAAA GCGGAAGGCG-3 ' (SEQ ID NO: 11) ATGGCAAAAT GCATATTACC CTGTGCGATT TTATTTGCCC GTGGTAGAAG CTTATAGAC-3 ' (SEQ ID NO: 12) TCGCTCACCG CTTTCGCGCG AATCACCACA TCCGCGTTGC TAAACGCCTG CTGCGGATGC ACCGGGCTGC AGCTGCACAT-3 ' (SEQ ID NO: 13) CTGTTTAATT TCATACTGAA TGCGTTTAAT CGGGTTGCCA TAAATATCGT TGCCGCTATC GACTTCTTTT-31 (SEQ ID NO: 14) CGCACACCGC GCTGCTCGGC GCGGTATAAA TAAATTCAAT ATCTTTTTCC GGGCCTTTAA ACATTTTAAT-31 (SEQ ID NO: 15) 9: ATTTTGCCAT CGCCTTCCGC TTTGCCCGCA ATGCAATATT CTTTTTTGCC GCCCACATCC AGGCTCACGC-3 ' (SEQ ID N0:16) 10 : GTCTATAAGC TTCTACCACG GGCAAATAAA ATCGCACAGG GTAATATGC- 3 ' (SEQ ID NO : 17 ) 11 :ATGTGCAGCTGCAGCCCGGT-3 ' (SEQ ID NO : 18 ) 12 : GTCTATAAGC TTCTACCACG-3 ' (SEQ ID NO: 19) La construcción del ácido nucleico inhibidor (SEQ ID fue hecha en tres pasos separados .

Primero, 5 µg de cada oligonucleótido y su compañero unidor complementario (para cinco reacciones separadas) fueron mezcladas juntas en 10 mM Tris-HCI (pH 7.2), 10 mM NaCl en un volumen final de 10 µ]... El oligonucleótido específico usado en las mezclas de hibridización fueron (ver Tabla 3) : (1 y 6) , (2 y 7) , (3 y 8), (4 y 9) , y (5 y 10) . La mezcla fue calentada en un baño de agua a 95°C por 10 minutos. El calor fuese apagado, y el baño de agua completo se le permitió enfriarse a temperatura ambiente por un periodo de cinco horas.

Segundo, las alícuotas (10 µL) de cada una de las cinco reacciones "lentas frías" fueron mezcladas juntas (volumen final 50 µL) . El tubo fue calentado a 45 °C por 10 minutos y entonces fue colocado en un baño de hielo. La ligasa de ADN T4 y el amortiguador (New England BioLabs) fueron agregados al tubo, y la reacción (volumen final 60 µ???) fue incubada a 16 °C por 20 horas.

Tercero, el ácido nucleico el longitud completa que tiene SEQ ID NO: 6 fue seleccionado de la mezcla de los fragmentos que usan dos detonadores PCR (Tabla 3, 11 y 12) que eran complementarios a los extremos finales 51 y 31 del gen estructural. Este paso asegura que solamente los ácidos nucleicos de longitud completa podrán ser amplificados . En adición local detonador de amplificación 3 ' contenido en el sitio Hind III para facilitar la clonación. La reacción de PCR fue efectuada usando 1 µ?_? de la mezcla de ligadura de escrita en el párrafo anterior. Las condiciones de PCR enviadas fueron como sigue: 95°C, 1 minuto; 49°C, 1 minuto; 72°C, 30 segundos. Treinta ciclos de este programa fueron efectuados en un dispositivo Techne Progene PCR. Una incubación de extensión de 72 °C de diez minutos fue efectuada después del último ciclo PCR. El producto de reacción PCR fue verificado por electroforesis de gel de agarosa ADN.

El producto de reacción PCR fue purificado por medio de un juego de limpieza Promega ADN Wizard PCR. Antes de la clonación, el fragmento de ADN fue tratado con polimerasa ADN T4 de ATP a fin de asegurar los extremos dúplex completos .

Esta reacción fue efectuada de acuerdo con las instrucciones de New England Biolabs, Inc.. El ADN fue envuelto purificar usando el juego de limpieza Promega ADN Wizard PCR. Entonces el ADN fue digerido con Hind III y fue purificado mediante precipitación de etanol . El ADN final fue vuelto a suspender en un volumen pequeño de 10 mM Tris-HCI (pH 8.0, 1 mM de ácido etilediamina tetraacético .

El vector de clonación, pMAL-c2 (New England Biolabs) , fue digerido con Xmn I y Hind III, y fue purificado usando el juego de limpieza Promega ADN. Esta digestión produjo un vector lineal que contenía un extremo romo 3 ' y un extremo 51 Hind III que era compatible con el extremo romo 51 y el extremo 31 Hind III del fragmento de ADN. Esta combinación aseguró la clonación en armazón, direccional del fragmento SEQ ID NO: 6 de ADN. El lector y el fragmento SEQ ID NO: 6 de ADN fueron mezclados en aproximadamente una proporción molar 1:10 y fueron liberados juntos en la presencia de ligasa ADN T4 a 16 °C por 20 horas (volumen de reacción total fue de 20 µ?.) . El componente de bacteria JM109 fue transformado con 5 µ??? de la reacción de ligadura. Después del crecimiento en LB con 60 µg/mL de platos de agar de ampicilina, colonias sencillas fueron seleccionadas, y el plásmido y purificado de las colonias mediante el procedimiento miniprep de usa un juego de aislamiento de ADN miniprep Promega. Los plásmidos aislados fueron evaluados mediante la electroforesis de gel de agarosa de ADN, la digestión de endonucleasa de restricción, y finalmente mediante secuenciar el ADN. La construcción del pl smido que codificó el polipéptido SEQ ID NO: 5 fue designado pDSTe .

Purificación del inhibidor de proteína: La estrategia de expresión utilizó la polimerasa ANR T4 sobre el sistema de expresión de New England Biolabs, Inc.. El vector usado para la expresión de proteína fue pMAL, el cual contiene la secuencia de gen para la corriente arriba de proteína de unión de maltosa de un sitio de clonación múltiple. El ácido nucleico SEQ ID NO: 6 fue insertado en este sitio de clonación múltiple. Un 1% de innoculum de células TB-1 que contiene el vector de expresión SEQ ID NO : 6 fueron desarrollados a 3 °C en caldo Luria suplementado con 1% de glucosa y 60 µg/mL de ampicilina. El IPTG fue agregado a una concentración final de 0.5 mM cuando las células han alcanzado un valor A595 de 0.8 (en aproximadamente 3 horas de post-inoculación) . El crecimiento de las células continuó por 5 horas adicionales antes de la recolección. Típicamente, 5 gramos de células fueron obtenidos por litro.

Las células fueron hechas pelotillas mediante centrífuga a 10,000 X gramo por diez minutos y vueltas a suspender en un volumen de 10 mM Tris-HCI, pH 8.0. Las células fueron retorcidas como anteriormente se hizo y fueron congeladas por lo menos 2 horas a -70 °C. La pelotillas congelada fue vuelta suspender en dos volúmenes de amortiguador de extracción de proteína E. coli BPER. La mezcla fue incubada a 30 °C por 20 minutos con mezclado ocasional. El extracto que resultó fue clarificado mediante centrífuga a 12,000 X gramo por 20 minutos, y el supernadante fue dializado en contra de 20 mM Tris-HCI (pH 7.4), 200 m NaCl, 1 m 1 de ácido etilendiamina tetraacético (Amortiguador I) . El material dializado fue diluido a una concentración final de 2.5 miligramo por mililitro con Amortiguador I, y fue designado como Fracción I. Todos los subsecuentes pasos de cromatografía fueron efectuados a temperatura ambiente .

La Fracción I fue aplicada a 10 centímetros x 7.6 ce2 columna de resina amilosa que previamente había sido equilibrado con un Amortiguador I. La columna fue entonces extensivamente lavada con Amortiguador I (usualmente 10 volúmenes de columna) para remover el material no unido. La proteína de fusión unida fue extraída de la columna mediante la aplicación de Amortiguador I, 10 mM maltosa. Un volumen de extracción típico fue de alrededor de 2 volúmenes de columna. Las fracciones fueron evaluadas espectrofotométricamente por contenido de proteínas, y las fracciones que contienen proteína fueron sumergidas. Este material fue designado como Fracción II. La concentración de proteína fue ajustada a 1 miligramo por mililitro por medio de Centricon (Amicon, Inc.) .

La Fracción II fue mezclada con proteasa del Factor Xa a una estoiquiometría de 100:1 (reacciones típicas contenían 50 miligramos de proteína de fusión y 0.5 miligramos de Factor Xa) . Las reacciones de desdoblamiento precedieron a la temperatura ambiente por 24 horas . La extensión del desdoblamiento fue vigilada mediante el análisis SOS PAGE de las alícuotas removidas en varios puntos de tiempo durante la reacción. La mezcla final fue dializada versus 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 25 mM NaCl, 3 mM ácido etilendiamina tetraacético y fue designado como Fracción III.

La Fracción III fue aplicada a una columna de intercambio de ión Mono Q (6 centímetros X 7.6 ce2) que habían sido equilibrados en 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 25 mM NaCl (Amortiguador II) . La columna fue corrida como sigue: Amortiguador II, 30 mLs; Amortiguador II con un gradiente lineal de 25 mM a 500 mM NaCl, 40 mLs. La proteína que une de maltosa extraída de la columna en 125 mM NaCl, el inhibidor de proteína homogéneo extraído en 250 mM NaCl, y la proteasa extraída del Factor Xa en 400 mM NaCl. Las Fracciones que contienen el inhibidor de proteína fueron sumergidas . El material fue dializado en contra del Amortiguador II, concentrado a 10 miligramos por mililitro, y fue designado como Fracción IV. La proteína fue almacenada en alícuotas a -20 °C. Todos los subsecuentes experimentos fueron efectuados con la proteína de la Fracción IV, a menos que específicamente se anote. La proteína SEQ ID NO : 5 purificada fue designada DST.

Inhibición de las Metaloproteznasas de Matriz: El ensayo empleado midió la hidrólisis enzimática del colágeno fluoresceinatado por la metaloproteinasa-9 de matriz u otras metaloproteinasas de matriz como una función de tiempo. El colágeno fluoresceinatado a una concentración de 5 µ? fue agregado al amortiguador de reacción (50 m Tris-HCI (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 nM CaCl2, 0.1 mM NaN3) y fue colocado en una probeta de fluorímetro de cuarzo Spectrosil . La metaloproteinasa de matriz a una concentración de 0.1 µ? fue mezclada con cantidades que varían de inhibidor de polipéptido (SEQ ID NO: a 5 ó SEQ ID NO:20) e incubada a 25°C por 10 minutos a fin de efectuar la unión. La mezcla de proteína fue agregada al substrato de colágeno, y mezclada. La intensidad de la emisión de fluorescencia a 520 nanómetros fue medida como una función de tiempo que usa una longitud de onda de excitación de 495 nanómetros en un fluorímetro Shimadzu RF5301. El ensayo de la liberación de fluoresceína fue usado para determinar la constante inhibitoria (¾.) del inhibidor de metaloproteinasa de matriz a base de proteína ([I]) de acuerdo con Segel (1993) mediante usar gráficas Dixon (l/v vs . I) , donde : inclinación = Km / (Vmax ¾. [S]) (1) donde Km es la constante Michaelis, Vmax es la reacción de velocidad máxima, y [S] es la concentración de substrato.

Producción de Anticuerpos Policlonales: El antisuero policlonal fue producido por Genosys, Inc.. Los anticuerpos policlonales (pAb) dirigido en contra del polipéptido SEQ ID NO: 5 fueron inducidos mediante la inyección subcutánea de polipéptido SEQ ID NO: 5 homogéneo (300 µg) en un homogenato 1:1 con adyuvante completo Freund en conejos hembras New Zealand White. Tres inyecciones subsecuentes de antigeno (200 µg) con adyuvante completo fue -efectuado en intervalos semanales. Una semana después de la última inspección, los conejos fueron sangrados por medio de una cánula para oreja. El plasma claro fue recolectado mediante centrífuga a 14,000 X gramo y almacenado a -20 °C hasta su uso.

Purificación de los Anticuerpos Policlonales: Los anticuerpos policlonales fueron purificados a homogeneidad mediante cromatografía de afinidad en DEAE Affi-gel Azul. Un juego de aislamiento de anticuerpo policlonal de conejo de BioRad Labs, Inc. fue el empleado de acuerdo con las instrucciones suministradas, con varias modificaciones menores. El protocolo es como sigue: El suero de conejo claro (5 mLs) fueron pasados sobre una columna de desalación Econo-Pac 10DG. Los anticuerpos policlonales fueron extraídos de la columna usando el amortiguador que corre suministrado (0.02 M Tris HCI (pH 8.0), 0.028 M NaCl), y fueron recolectados como una fracción sencilla. En esta etapa la concentración de proteína fue determinada usando el ensayo Bradford. La muestra completa de suero (usualmente 25 mLs) fue pasada sobre la columna en lotes de 5 mL. Entre lotes la columna fue lavada con 40 mL de amortiguador que corre (dos volúmenes de columna) . Las muestras sin sal finales de las corridas de columna individuales fueron sumergidas . Esta muestra sumergidas fue aplicada a la columna de DEAE Affi-gel Azul como una carga sencilla, la columna fue lavada con 5 volúmenes de columna de amortiguador que corre (50 mLs) , y la fracción de anticuerpo policlonal fue el extraídas de la columna mediante la aplicación de 5 volúmenes de columna de amortiguador de extracción (0.025 M Tris HCI (pH 8.0), 0.025 M NaCl) . El material extraído fue recolectado cómo fracciones de 5 Mi. La pureza de la fracción IgC fue estimada mediante SDS PAGE . Las reacciones apropiadas fueron sumergidas, concentradas a 2 miligramos por mililitro por la presión de filtración, y fueron almacenadas a -70 °C hasta que se necesitaron. La columna DEAE Affi-gel Azul fue regenerada mediante lavar la columna con 2 M NaCl, 1.5 M de tiocianato de sodio en amortiguador que corre (diez volúmenes de columna) , seguido por volver a equilibrar el amortiguador que corre. La tasa de flujo para todos los pasos de cromatografía de fueron mantenidos a 1.0 mL por minuto.

Análisis ELISA: Los análisis ELISA fueron efectuados usando los métodos descritos por Kaiser y Pollard, (1993) o por Quirk y otros (1996) . Un µg de polipéptido SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 20 purificado fue absorbido a la superficie de un plato de microtiter de pozo 96 (Immulon 2, Dynatech Labs) . Los pozos fueron bloqueados, salino amortiguado con fosfatado (PBS) suplementado con 10% de BSA. Los anticuerpos policlonales en amortiguador que bloquea fueron agregados en varias diluciones y se les permitió reaccionar con el inhibidor de polipéptido unido a temperatura ambiente por una hora. Luego de tres lavadas en salino amortiguado con fosfato, la visualización fue lograda por medio de un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra que está conjugado con peroxidasa de rábano (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). El anticuerpo secundario fue agregado a una dilución de 1:2000 en amortiguador que bloquea y fue incubado a temperatura ambiente por una hora. Después de tres lavadas en salino amortiguado con fosfato, el desarrollo del color es logrado mediante agregar una solución que contiene 50 mM de citrato de sodio, 50 mM de ácido cítrico, 1 miligramo por mL de o-fenilenediamina, y 0.006% de H202- Después del desarrollo de color apropiado (típicamente 5 a 10 minutos de incubación a temperatura ambiente) 50 de 2 M de ácido sulfúrico fueron agregados para detener la reacción y estabilizar el producto. La absorbencia fue medida a 490 nanómetros usando una lectora de plato ELISA automático (Molecular Dynamics, Inc.). Alternativamente, anticuerpos secundario anti-conejo de cabra fluoresceinatado (Molecular Probes, Inc.) fue utilizado por la ELISA. Para estos ensayos, una lectora de plato de microtiter fluorescente Dynex, Inc. fue empleada con 485 nanómetros (excitación) y un juego de filtro de banda de 510 nanómetros (emisión) .

Fluorescencia de Triptofano Intrínseco: Desnaturalización química Las mediciones de estabilidad del inhibidor de proteína fueron efectuados mediante medir la proteína que se desdobla en la presencia de urea por medio de la fluorescencia de triptofano intrínseco (Lakowicz, 1983) en un fluorímetro Shimadzu RF5301. Las longitudes de onda de excitación y de emisión fueron de 295 nanómetros y de 340 nanómetros respectivamente . Ambas ranuras de monocrómetro de excitación y de emisión fueron ajustadas a 1.5 nanómetros. La proteína (20 µ?) fue mezclada con cantidades que aumentan de urea (en el rango de concentración de cero a 6.8 M) , y las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente por diez horas para asegurar que el equilibrio que se desdobla había sido logrado. La fluorescencia fue convertida en valores de energía libre de acuerdo con la relación (Pace y otros, 1989) : AG = -RT In [(yt - yA) / {y± - yu)] (2) donde yf y yu son los valores de fluorescencia relativo un para completamente doblar y completamente desdoblar el polipéptido SEQ ID NO: 5 respectivamente, es la fluorescencia relativa de los intermedios desdoblados, T es la temperatura absoluta, y es la constante de gas. La regresión lineal y la extrapolación de la relación ?T versus urea fue empleada para determinar el valor de energía libre en la ausencia de desnaturalizante (AGH2o) · Similarmente, la proteína desdoblada de fracción (Fu) fue calculada de los datos de fluorescencia de acuerdo con la relación (Pace y otros, 1989) : F = (yf - Vi) / (yf - yu) (3) Desnaturalización Térmica.

La florescencia de triptofan intrínseco de polipéptido SEQ ID NO: 5 homogéneo en 25 mM de Tris-HCl (pH 8.5), 50 mM de NaCl se midió en un fluorímetro Shimadzu RF5301 (longitud de onda de excitación 295 nm, longitud de onda de emisión 340 nm) . La temperatura fue controlada a través de un instrumento de laboratorio de fluorímetro de cuarzo sellado con cubierta de agua y agitado conectado a un baño de agua digital que fue exacto a +/- 0.1°C de gas de nitrógeno seco que fue drenado a través del compartimiento de muestra continuamente para controlar la condensación. Los cambios de temperatura se hicieron a una tasa de 0.2°C por minuto. La muestra se dejó incubar a la temperatura por 5 minutos antes de leer la florescencia a fin de asegurar que el sistema había llegado al equilibrio térmico. Los valores de florescencia determinados de los experimentos térmicos fueron normalizados usando la ecuación (3) dada arriba. Los valores Fu calculados fueron convertidos en la constante de equilibrio (KD) usando la siguiente ecuación (4) : KD = (1-FU)/FU (4) Mediante el colocar en KD=0, la siguiente ecuación Hoff (5) puede ser utilizada para calcular los valores de la temperatura de transición (Tm) y la entalpia correspondiente a la temperatura de transición (AHm) (Arnold y Ulbrich-Hofmann, 1997) : d(In KD)/d(l/T) = ??/R (5) Si AG se pone a cero en la ecuación Gibbs, entonces la entropía a la temperatura de transición (ASm) puede ser calculada como sigue ASra= AEm/Tm (6) Los valores de energía libre para la región de temperatura de transición fueron calculados de la siguiente ecuación: AG=-RT In KD (7) Estos valores de energía libre fueron substituidos en la ecuación Gibbs-Helmholtz (8) a fin de computar la capacidad de calor.

AG=AHm(l-T/Tra) - ACp[(Tm-T)+T In (T/TB) ] (8) Finalmente la temperatura de estabilidad máxima (Traax) fue calculada de acuerdo a la siguiente ecuación (9) : Tmax=Tm exp [-AHm/ACpTj ( 9 ) Resonancia de Plasmón de superficie: El dispositivo de resonancia de plasmón de superficie BiaCore-X de BiaCore, Inc., (SPR) fue utilizado para medir la interacción entre el polipéptido SEQ ID NO: 5 (también llamado la proteína DST) y la matriz de metal proteinasa-9 ( MP-9) . Para estos experimentos fue activado un chip sensor de carboximetil dextran (CM-5, Lofas y otros, 1993) con 50 mM de N-hidroxisuccinamida, 0.2 M de N-etilo- '- (dimetilaminopropilo) -carbodiimida a una tasa de flujo de ??µ?? por minuto por 10 minutos. El polipéptido SEQ ID NO : 5 a una concentración de 75 ng/µ?, acoplado a la superficie activada a una tasa de flujo de 10 µ?. por minuto por 10 minutos. La superficie final fue inactivada mediante el seguir 1 M de etanolamina-HCl' a una tasa de 10 µ?? por minuto por cinco minutos sobre la superficie del sensor. El P-9 fue fluido sobre la superficie del sensor a una tasa de 20 µL por minuto, y a concentraciones que variaron de desde 1 a 100 nM. Los isotermos aglutinantes fueron evaluados mediante el ajustar simultáneamente las constantes de tasa delantera (Ka) y de reversa (kd) a: d [DST~MMP-9] /dt= (Ka [DST] [MMP-9] )- (Kd [DST~MMP-9] ) (10) (Karlsson y Falt, 1997) en donde [DST) , [MMP-9] , y [DST-MMP-9] son las concentraciones del polipéptido SEQ ID NO: 5 (DST) libre MMP-9, y el complejo respectivamente. La constante de afinidad de equilibrio (KA) en entonces definida como sigue: KA=ka/kd (11) La ecuación 10 es adecuadamente expresada en términos de la señal SPR (Morton y otros 1995) como: dR/dt=Ka CRmax- (KaC+Ka)R (12) En donde R es la señal SPR (en unidades de respuesta, RU) en el tiempo t, Rmax es la capacidad de aglutinamiento M P-9 máxima en RU, y C es la concentración de polipéptido SEQ ID NO: 5. El análisis cinético (0' Shannessy y otros 1993) se llevo a cabo usando Origin de Microcal, Inc.

Ejemplo 2: Propiedades de inhibidor de polipéptido.

Clonación molecular El análisis de visualización molecular de matriz metaloproteinasa (MMP) y estructuras tridimensionales MMP-TIMP proporcionaron información estructural para el diseño del polipéptido SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácido final de la proteína SEQ ID NO: 5 puede aglutinar una variedad de moléculas de matriz de metaloproteinasa. El ácido nucleico SEQ ID NO: 6 que codifica el polipéptido SEQ ID NO: 5 emplea el codón a través de E. Coli a fin de maximizar la expresión.

La construcción de la secuencia SEQ ID NO. 6 de 327 nucleótidos requirió una serie de oligonucleótidos cortos, debido a que es actualmente muy difícil de construir ácidos nucleicos que están sobre 100 bases en longitud. Además, es difícil el hibridizar eficientemente las moléculas de ácido nucleico más largas . Por tanto la construcción se llevó a cabo usando una serie de pasos de hibridización. Cuando se mezclaron juntos en cantidades equimolares, los oligonucleótidos individuales (SEQ ID NO: 8-19 fueron convertidos eficientemente en moléculas dúplex por un paso de hibridización de "enfriamiento lento" . La reducción lenta de la temperatura desde 95°C sobre un periodo de horas favoreció a la formación de dúplex cortos .

Los fragmentos resultantes contuvieron una región encordada doble central de 50 a 60 pares de base que fue flanqueada por unos términos de entrenzado único de 10 nucleótidos. Estos "extremos pegajosos" fueron usados para impulsar el conjunto del ácido nucleico de longitud completa, de nuevo mediante hibridización. El ácido nucleico de longitud completa fue formada mediante el calentar una mezcla equimolar de las moléculas de dúplex a 45 °C por 10 minutos. Este paso interrumpió cualquier estructuras dúplex parcialmente formadas y constituidas por asociación de los términos, pero no interrumpirá las regiones dúplex centrales completamente formadas . El material calentado fue "enfriado rápidamente" mediante el colocar el tubo de reacción sobre hielo. Este paso de hibridización favoreció la hibridización de regiones cortas de ADN (por ejemplo los extremos pegajosos de 10 bases) . El cierre de la columna de fosfodiéster de el fragmento ADN de 327 bp fue llevado a cabo por el uso de la enzima T4 ADN ligasa.

El ácido nucleico de longitud completa fue seleccionado de la mezcla resultante de fragmentos por la amplificación PCR. Este paso fue más eficiente que el purificar el ácido nucleico de longitud completa de geles agarosa. Este paso también resulto en una gran cantidad de material para pasos de clonación subsecuentes . Los extremos del ácido nucleico SEQ ID NO: 6 fueron preparados por clonación mediante el hacer un extremo romo usando polxmerosa T4 DNA y usando Hind III sobre el otro extremo para generar un extremo compatible Hind III. Esto resulto en una molécula ADN que puede ser eficiente y direccionalmente clonada en vectores de expresión de proteína.

La figura 1 muestra los resultados de esta clonación. Tres de nueve colonias examinadas contuvieron un vector con el inserto correcto (SEQ ID NO: 6) . La validez del inserto fue confirmada por la secuencia ADN; varios clones tuvieron una secuencia que corresponde a SEQ ID NO: 6.

Propiedades físicas del polipéptido SEQ ID NO: 5 La proteína de polipéptido SEQ ID NO: 5 es de 108 aminoácidos de longitud y tiene un peso molecular total de 108 kDa. Un modelo tridimensional del polipéptido SEQ ID NO: 5 fue preparado mediante el ensartar la secuencia SEQ ID NO: 5 sobre la columna de carbón alfa tridimensional de TIMP-2 usando el programa SwissModel . El resultado de ensartado óptimo fue convertido en una estructura tridimensional que incluyó las posiciones de cadena lateral de aminoácidos usando el programa ProMod. Este modelo inicial fue sometido a una ronda de templado simulado a fin de minimizar los choques de cadena lateral. Varias rondas de optimización de geometría de nivel SYBYL pusieron todos los ángulos dihedrales y torsiones en una geometría apropiada. Una ronda final de minimización de energía usando un parámetro GROMOS96 puesto, sin el campo de reacción fue empleado. Estos resultados están mostrados en la tabla 4. El modelo final tuvo una energía global de -3534 kJ/mol y se muestra en la figura 2. Todos los residuos de aminoácidos están dentro de un espacio Ramachandran (datos no mostrados) y no hay choques estéricos .

Tabla 4 : Los resultados de minimización de energía GROMOS96 para el modelo de homología (solo los parámetros principales del campo de fuerza están mostrados) Parámetro Energía (kJ/mol) Uniones 66 Ángulos 541 Torsiones 667 Improperios 103 No unido -3027 Electrostático -1884 Restricciones 0 Total: -3534 Varias propiedades del polipéptido SEQ ID NO: 5 están mostradas en la tabla 5.

Tabla 5 : Propiedades misceláneas del polipéptido SEQ ID NO. 5: Longitud (aminoácidos) .- 108 Peso molecular 11.8 Punto isoeléctricos 6.5 Hidrofóbico (%) 39.8 Hidrofílico (%) 33.3 Básico (%) 13.9 Acídico (%) 13.0 Estoques radio (Á) : 22 Coeficiente fricción 1.2 Hélice Alfa (%) 9 Cepa Beta (%) 62 Circuito/colí (%) 29 Triptofan (#) 1 Tirosina (#) 4 El Triptofan diseñado único ayudo mucho en los experimentos de florescencia intrínseca (vea abajo) . La proteína fue designada como un polipéptido único que forma un barril beta de seis líneas (figura 2) . La región superior de la molécula forma una estructura plana molecularmente que es mantenida junta en parte por la formación de dos enlaces de disulfuro, entre los residuos Cys2-Cys73 y Cys4-Cysl02. (Figura 2). Esta región forma la base del dominio de aglutinamiento . Esta área esta flanqueada por un TIMP-2 tipo brazo formada por los residuos de extensión de región de circuito flexible Ser31 a Lys41. El circuito es establecido para la estructura principal por una serie de enlaces de hidrogeno. El circuito flexible puede actuar como un dominio de reconocimiento TIMP y las simulaciones dinámicas moleculares ( datos no mostrados) indican que este es altamente móvil, con las deflexiones que exceden de 4Á. Las dimensiones moleculares de polipéptido SEQ NO: 5 son aproximadamente de 21 x 18 x 25 Á (volumen molecular total de 9455 Á3 área de superficie accesible de solvente total de 9867 Á2) .

Expresión en E. coli La secuencia de aminoácido del extremo amino terminal del polipéptido SEQ ID NO. 5 purificado revelo que la N-metionina terminal es removida en E. coli como una modificación pos-de traslación. Tal remoción de la N-metionina terminal da un polipéptido con la siguiente secuencia (SEQ. ID NO . 20) CSCSPVRPQ QAFSNADWI RAKAVSEKEV DSGNDIYGNP IKRIQYEIKQ IKMFKGPEKD lEFIYTAPSS AVCGVSLDVG GKKEYCIAGK AEGDGKMHIT LCDFICPW La purificación del polipéptido SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO: 20 de E. coli resulto en aproximadamente 5 mg de proteína por litro de cultivo inducido. El régimen de purificación delineado en la tabla 6 tomo aproximadamente tres días para completarse. El polipéptido SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 20 es sobreproducido por aproximadamente 27 veces en E. coli. Aún cuando en el curso del ensayo de purificación, el polipéptido SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 20 fue visualizado solamente por el análisis SDS PAGE también fue útil para definir una unidad de actividad. Este cálculo ayuda a evaluar el rendimiento de polipéptido SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 20 y ayuda a cuantificar la actividad.

El esquema de purificación es ayudado por el hecho de que la proteína SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO : 20 está aislada de las bacterias como una fusión de proteína de aglutinamiento maltosa (MBP) . Dado que la proteína de aglutinamiento maltosa tiene una alta solubilidad y afinidad para la amilosa, es consecuente el expresar y purificar la proteína. La preparación del extracto bacterial crudo es eficientemente logrado por lisis química de la bacteria seguido por el despeje de lisado a través de centrifugación. La proteína de fusión fue por tanto purificada a la homogeneidad en un paso único (figura 3, línea 1). El tratamiento de este complejo con el factor Xa, de proteasa como resulto en una división completa del producto de fusión en aproximadamente doce horas. No hubo una proteólisis detectable de de la proteína SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO : 20. El paso de cromatografía final usando el intercambio MonoQ ion eficientemente separo MBP, el polipéptido SEQ ID NO: 5 (SEQ ID NO: 20), y el factor Xa. La figura 3 (línea 2) mostró la preparación final de el polipéptido homogéneo SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 20 después de la ilusión de la columna de MonoQ.

Tabla 6: purificación de polipéptido SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 20.

El material de inicio fue 5g de E. Coli de Post inducción.

Fracción Paso Concentración Proteína Total Acto especifico a Purificación (mg/mL) (mg) (unidades/mg) (n-veces) I. Extracto crudo 30 125 327 1 II . Resina amilosa 1.0 25.0 4123 13 III. División factor Xa 1.1 25.0 8322 25 IV. Mono Q 10 5.2 8747 27 Una unidad del polipéptido SEQ ID NO: 5 definido en la concentración de proteína (en /xg/ml) que requiere para inhibir MMP-9 por 50% en el ensayo estándar.

Producción de anticuerpo El antisuero policlonado fue preparado en contra del polipéptido SEQ ID NO: 5 en conejos. Un estanque de anticuerpos purificados fue obtenido que detectó fácilmente el polipéptido SEQ ID NO: 5 purificado en reacciones ELISA (figura 4) . Estos anticuerpos pueden ser usados para detectar y seguir el polipéptido SEQ ID NO : 5 cuando este es introducido en ambientes de herida crónica. El estanque de anticuerpo rutinariamente detecta el polipéptido SEQ ID NO: 5 usando diluciones de aproximadamente de 1:5,000.

Inhibición de matriz metaloproteinasa .

El polipéptido SEQ ID NO : 5 efectivamente inhibió la hidrólisis del colágeno fluoroeceinado por MMP-9. Cuando la proteína fue agregada a una reacción enzimática que se estaba llevando a cabo (figura 5) , 98% de hidrólisis de colágeno cesó dentro de un periodo de trazo de 45 segundos . La titulación de MMP-9 con cantidades en aumento del polipéptido SEQ ID NO: 5 (figura 6) resultó en una perdida de actividad hidrolítica MMP-9 en una concentración dependiente de la manera. Estos datos indicaron que la reacción de inhibición es estoiquiométrica, una observación que fue además confirmada en experimentos posteriores (vea abajo) .

Usando los datos cinéticos mostrados en la figura 6, fue posible obtener constantes inhibitorias (¾) para un anfitrión de enzimas MMP. Las velocidades instantáneas desde los esquemas de florescencia de contra de tiempo fueron usados para construir los esquemas Dixon lineales, desde los cuales fue posible el resolver para K¡. directamente. Este análisis presume que el polipéptido SEQ ID NO: 5 funciona a través de un mecanismo inhibidor de competitividad.

La figura 7 ilustra los valores de polipéptido ¾ SEQ ID NO: 5 para cinco enzimas MMP. Todas las enzimas fueron efectivamente inhibidas en el rango nanomolar.

Sorprendentemente, el polipéptido SEQ ID NO: 5 tuvo un valor K± más bajo para MMP-1 que lo que lo hizo el MMP-9 (doce en contra de 16 nM. Sin embargo, los valores K± bajos obtenidos para todas las matrices de metaloproteínasas probadas indicaron que el polipéptido SEQ ID NO. 5 es capaz de evitar la actividad enzimática de todas las formas MMP principales que se encuentran en las heridas crónicas.

Estabilidad del inhibidor La figura 8 proporciona un modelo estructural de la columna de polipéptido del polipéptido SEQ ID NO: 5 y de cadenas laterales de aminoácidos seleccionadas . Esta figura ilustra dos características importantes del polipéptido SEQ ID NO: 5. El primero es la posición de los tres enlaces de disulfuro que contribuyen a la estabilidad de la molécula (Vea abajo) . El segundo es la posición de la molécula triptofan única que es utilizada como la base para todos los experimentos de fluorescencia intrínsecos.

El polipéptido SEQ ID NO: 5 se desenvuelve en una manera altamente cooperativa. El desenvolvimiento de equilibro vigilado por la fluorescencia de Triptofan intrínseca proporciono una disminución de 60% global en la emisión de intensidad de fluorescencia y un cambio de 10 nm en la emisión pico máxima a longitudes de onda más largas (datos no mostrados) .

El espectro de emisión de intensidad de fluorescencia fue convertido en la fracción de proteína desdoblada como se describió en el ejemplo 1. La figura 1 mostró que el punto medio en la curva de desenvolvimiento para el polipéptido SEQ ID NO: 5 nativo ocurrió a una concentración de 4.95 M de urea. La transición de desdoblado comienza a 4.4 M de urea y fue completada a una concentración desnaturalizante de 5.4 M de urea. La existencia de un pico único en el primer esquema derivado de estos datos (no mostrados) soporto la hipótesis de que la proteína desnaturaliza como un proceso de dos estados altamente cooperativo.

La conversión de la curva de desdoblado en energía libre en contra de la concentración del esquema de urea (vea Ejemplo 1) y la extrapolación a través de la regresión lineal a la energía libre en la ausencia de urea indicó que el inhibidor de polipéptido tiene una energía libre nativa de 7.4 kcal mol"1. Cuando el inhibidor de polipéptido fue reducido con ditiotreitol antes de los experimentos de desnaturalización, hubo una pérdida significante de estabilidad. La transición de desdoblado que comenzó a 2.4 M de urea y fue completada a una concentración de desnaturalizante de 4.4 M de urea con un punto medio de transición de 2.75 de urea. El proceso de desdoblado fue aún un proceso altamente cooperativo de dos estados.

El polipéptido SEQ ID NO: 5 reducido tuvo una energía libre nativa de 4.3 kcal mol"1. Por tanto las tres uniones de disulfuro en la proteína de polipéptido SEQ ID NO: 5 contribuye en aproximadamente a 3.1 kcal mol"1 de energía de estabilización.

La proteína SEQ ID NO : 5 fue de vida prolongada en el suero humano. La incubación del polipéptido SEQ ID NO: 5 polipéptido en el suero humano se llevó a cabo para estimular la exposición del polipéptido a los tipos de fluidos presentes en una herida crónica. La incubación del polipéptido SEQ ID NO: 5 con plasma humano a la temperatura ambiente sobre el curso de 36 horas resultó en sólo una pérdida de 9 por ciento de polipéptido SEQ ID NO: 5 (Figura 10) . Si el polipéptido SEQ ID NO: 5 es pre-unido a una cantidad estoiquiométrica de P-9, entonces sólo 4 por ciento del material fue perdido sobre el curso de las mismas 36 horas. Una reacción de control, en donde el polipéptido SEQ ID NO: 5 fue incubado en PBS, resultó en 100 por ciento del material permaneciendo después de 36 horas de incubación. La estabilidad del polipéptido SEQ ID NO: 5 fue además indicada por los estudios de desnaturalización química. Sin embargo, la estabilidad de suero indicó que el polipéptido SEQ ID NO: 5 puede ser intensivo para la degradación proteasa. La estabilidad y la resistencia proteasa son importantes en un ambiente de herida crónica.

La transición de desdoblado térmico del polipéptido SEQ ID NO : 5 fue vigilada por la fluorescencia triptofan intrínseca. La curva de transición térmica está presentada en la Figura 11. La fluorescencia de triptofan intrínseca del polipéptido SEQ ID NO : 5 mostró poca variación entre 25 y 60 grados Centígrados, consistente con la confirmación nativa termoasentable a' temperaturas abajo del punto de transición térmica. A temperaturas más allá de 60 grados Centígrados, el polipéptido SEQ ID NO: 5 se desdobló en una manera altamente cooperativa. Las transiciones estructurales inducidas térmicamente fueron completamente revertidas a tasas de calentamiento/enfriamiento llevada a cabo en éste estudio (datos no mostrados) . El comportamiento de derretido del polipéptido SEQ ID NO: 5 fue un proceso entalpico más bien que un proceso entrópico. Los procesos de estabilidad termodinámica están presentados en la Tabla 7.

Tabla 7 : Parámetros de Estabilidad Termodinámica Parámetro Valor Quxmico: AGnat (kcal mol"1) 7.42 AGre(i (kcal mol"1) 4.32 ??T (kcal mol"1) 3.10 mnat (cal mol^M"1) 3084 nired (cal mol^M"1) 3112 urea1/2nat (M) 4.95 ureai/2red (M) 2.75 Térmico : Tm(°C) 71.5 AHm (kcal mol"1) 100 ASm (cal mol^K"1) 250 AG7i.5oc(kcal mol"1) 1.32 AG30oc (kcal mol"1) 6.71 max (°C) 37.8 ACP (kcal mol^K"1) 2.84 La estabilidad del polipéptido SEQ ID NO: 5 como una función de temperatura fue determinada usando la función Gibas-Helmholtz (eq 7) , y se presentó como AG en contra de temperatura en la Figura 12. Los valores AG determinados a temperaturas más bajas por desnaturalización química en la presencia de urea son incluidos por comparación. Éstos estudios de desnaturalización química de temperatura más baja fueron también ensayados por fluorescencia trxptofan intrínseca (vea la Figura 9) . Las diferencias de estabilidad persistieron sobre el rango de temperatura completo medido en éste estudio.

Un esquema van't Hoff, el cual ilustra las constantes de equilibrio (KD) determinadas por fluorescencia triptofan intrínsecas se proporcionaron en la Figura 13. La temperatura calculó la estabilidad máxima de 37.8 grados Centígrados fue ideal para un polipéptido que va a ser introducido en las heridas o en otros ambientes fisiológicos .

Interacciones de Proteína-Proteína El comportamiento cromatográfico del polipéptido SEQ ID NO: 5 sobre la columna de exclusión BioSelect de 125 gel fue consistente con la proteína monomérica esperada. Los resultados de un experimento de filtración de gel analítico están mostrados en la Figura 14. En éste experimento, la proteína SEQ ID NO: 5 elutó de la columna ligeramente más tarde que un estándar de mioglobina (12 kDa) . El perfil de elusión fue consistente con el polipéptido SEQ ID NO: 5 que es una proteína monomérica con un peso molecular de aproximadamente 11.8 kDa.

El radio de Stokes calculado fue de 22 Á. Éste valor es un buen convenio con las dimensiones del modelo atómico. El perfil de elusión sugirió que la proteína es primariamente simétrica en naturaleza debido a que el coeficiente de fricción fue de 1.2 sin embargo, un coeficiente friccional de 1.2 indica que el polipéptido SEQ ID NO: 5 tiene un carácter esferoide ligeramente oblongo, el cual puede indicar que la región de circuito juega una parte en determinar las propiedades hidrodinámicas de la proteína.

Función compleja entre el polipéptido SEQ ID NO: 5 y MMP-9 fue determinada en tres experimentos separados.

En el primer experimento, los expedientes coordinados atómicos para ambas moléculas fueron usados como entrada en el programa FTDOCK (Gabb y otros, 1977) . El programa calculó las superficies moleculares para ambas moléculas, entonces éste mantuvo una molécula fija mientras que llevó a cabo una rotación de cuerpo rígido de la segunda molécula alrededor de la primera. Para cada orientación una calificación de ajustes calculada que toma ambas consideraciones geométrica y electrostática en consideración. Finalmente una serie de las mejores estructuras de orientación fue proporcionada para la inspección. La asociación molecular más probable entre estas dos moléculas está mostrada en la Figura 15. Noté que el polipéptido SEQ ID NO: 5 hace un contacto significante con la matriz de metaloproteinasa a lo largo de una región de aglutinamiento propuesta. Además, la región de circuito flexible del polipéptido SED ID NO: 5 también tiene contactos específicos con la matriz de metaloproteinasa. La estructura determinada por el complejo enterrado a aproximadamente 300 Á2 de la secuencia ID NO: 5 de polipéptido de área de superficie.

En el segundo experimento, la asociación molecular entre el polipéptido SEQ ID NO: 5 y la matriz de metaloproteinasa-9 ( MP-9) fue medida directamente usando la técnica de resonancia de plasmón de superficie. Para éste experimento, MMP-9 fue acoplado a la superficie de un chip sensor de dextran carboximetilatado . Una solución del polipéptido SEQ ID NO: 5 en PBS fue permitido para fluir libremente sobre la superficie unida-MMP-9. La Figura 16 muestra el aglutina iento isotérmico para ésta interacción. La curva puede ajustar a un modelo de asociación-disasociación en donde las constantes de tasa delantera (ka) y de reversa (kd) fueron ajustadas simultáneamente. Tal ajuste resultó en un valor ka de 2 x 105 M^s"1, y en valor kd de 1.3 x ÍO'V1. Esto resultó en una constante de afinidad de equilibrio (KA) de 1.5 x 108?_1.

En el tercer experimento, la filtración de gel analítico fue utilizada para visualizar los complejos MMP-9-polipéptidos SEQ ID NO: 5 preformados . Las cantidades estoiquiométricas de ambas proteínas (IMm) fueron mezcladas juntas y se dejaron incubar a la temperatura ambiente. Después de 30 minutos, la reacción completa fue inyectada sobre una columna de filtración de gel BioSelect 125. La mezcla elutó desde ésta columna como especies de peso molecular único de 80 kDa de peso molecular aparente (Figura 17) . Estos datos indican que el polipéptido SEQ ID NO: 5 aglutina a MMP-9 en una estoiquiometría de 1:1. Como un experimento de control, las dos proteínas fueron mezcladas juntas e inyectadas inmediatamente en la columna a fin de mostrar las posiciones de elusión de proteína individuales. Como puede verse en la Figura 17, hay una cantidad detectable de complejo formado bajo éstas condiciones.

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Todas las publicaciones y patentes son incorporadas aquí por réferencia como si se hubieran incorporado individualmente . La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos pero deberá entenderse que muchas variaciones y modificaciones pueden hacerse mientras que se permanece dentro del espíritu y alcance de la invención definida por las reivindicaciones.

Claims (48)

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptxdo que comprende la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 20.

2. El ácido nucleico aislado tal y como se reivindica en la cláusula 1 caracterizado porque, el ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 6.

3. Un ácido nucleico aislado que puede hibridizar bajo condiciones de hibridación astringentes a un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 6.

. Un polipéptxdo aislado que comprende SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:20.

5. El polipéptxdo aislado tal y como se reivindica en la cláusula 4 caracterizado porque, el polipéptxdo inhibe la actividad de metaloproteinasa de matriz .

6. El polipéptxdo aislado tal y como se reivindica en la cláusula 4 caracterizado porque, el polipéptido es estable en el plasma o suero de mamífero.

7. El polipéptido aislado tal y como se reivindica en la cláusula 4 caracterizado porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una confirmación de barril beta mientras que está en urea 4M.

8. Un polipéptido aislado que comprende SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 21 que tiene una conformación de barril beta y que puede aglutinar a una metaloproteinasa de matriz.

9. El polipéptido aislado tal y como se reivindica en la cláusula 8 caracterizado porque, el polipéptido inhibe la actividad de metaloproteinasa de matriz.

10. El polipéptido aislado tal y como se reivindica en la cláusula 8 caracterizado porque, el polipéptido es estable en suero o plasma de mamífero.

11. El polipéptido aislado tal y como se reivindica en la cláusula 8 caracterizado porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una conformación de barril beta mientras que está en urea 4M.

12. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de inhibidor de polipéptido que comprende SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 20 y un portador farmacéuticamente aceptable .

13. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizada porque, el inhibidor de polipéptido puede inhibir la actividad de proteinasa de una cualquiera de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa- de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz y metaloproteinasa de matriz-9, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa de matriz-12 o metaloproteinasa-13 de matriz.

14. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizada porque, el inhibidor de polipéptido puede inhibir más de una de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa de matriz-13.

15. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizada porque, el inhibidor de polipéptido tiene una conformación de barril beta .

16. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizada porque, el polipéptido es estable en el suero de mamíferos.

17. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizada porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una conformación de barril beta mientras que está en la urea 4M.

18. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 12 caracterizada porque, la composición comprende una loción, gel o crema.

19. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de polipéptido que comprende SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 21 y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el inhibidor de polipéptido puede inhibir la actividad de proteinasa de una cualquiera de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa-13 de matriz.

20. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 19 caracterizada porque, el inhibidor de polipéptido puede inhibir más de uno de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa-13 de matriz.

21. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 19 caracterizada porque, el inhibidor de polipéptido tiene una conformación de barril beta.

22. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 19 caracterizada porque, el inhibidor de polipéptido es estable en un suero de mamífero .

23. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 19 caracterizada porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una conformación de barril beta mientras que está en urea 4M.

24. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 19 caracterizada porque, la composición comprende una loción, un gel o una crema.

25. Un vendaje para heridas que comprende un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:20 y un portador farmacéuticamente aceptable.

26. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 25 caracterizado porque, el polipéptido puede inhibir la actividad de proteinasa de una cualquiera de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa de matriz.

27. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 25 caracterizado porque, el polipéptido puede inhibir más de uno de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa-13 de matriz .

28. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 25 caracterizado porque, el polipéptido tiene una conformación de barril beta.

29. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 25 caracterizado porque, el polipéptido es estable en un suero de mamífero. '

30. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 25 caracterizado porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una conformación de barril beta mientras que está en urea 4M.

31. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 25 caracterizado porque, el portador farmacéuticamente aceptable es un vendaje.

32. Un vendaje para heridas que comprende un polipéptido que incluye la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO:21 y un portador farmacéuticamente aceptable en donde el inhibidor de polipéptido puede inhibir la actividad de proteinasa de uno cualquiera de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa de matriz.

33. El vendaje para herida tal y como se reivindica en la cláusula 32 caracterizado porque, el inhibidor de polipéptido puede inhibir más de uno de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa-13 de matriz .

34. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 32 caracterizado porque, el inhibidor de polipéptido tiene una conformación de barril beta.

35. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 32 caracterizado porque, el inhibidor de polipéptido es estable en un suero de mamífero.

36. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 32 caracterizado porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una conformación de barril beta mientras que está en urea 4 .

37. El vendaje para heridas tal y como se reivindica en la cláusula 32 caracterizado porque, el portador farmacéuticamente aceptable es un vendaje.

38. Un método para tratar una herida que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 20 a la herida .

39. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38 caracterizado porque, el polipéptido puede inhibir la actividad de proteinasa de uno cualquiera de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa de matriz.

40. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38 caracterizado porque, el polipéptido puede inhibir más de uno de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa-13 de matriz.

41. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38 caracterizado porque, el polipeptido tiene una conformación de barril beta .

42. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38 caracterizado porque, el polipéptido es estable en suero de mamífero.

43. El método tal y como se reivindica en la cláusula 38 caracterizado porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una conformación de barril beta mientras que está en urea 4M.

44. Un método para tratar una herida que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 21 a la herida en donde el polipéptido puede inhibir la actividad de proteinasa de uno cualquiera de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa de matriz.

45. El método tal y como se reivindica en la cláusula 44 caracterizado porque, el polipéptido puede inhibir más de uno de metaloproteinasa-1 de matriz, metaloproteinasa-2 de matriz, metaloproteinasa-3 de matriz, metaloproteinasa-4 de matriz, metaloproteinasa-5 de matriz, metaloproteinasa-6 de matriz, metaloproteinasa-7 de matriz, metaloproteinasa-8 de matriz, y metaloproteinasa-9 de matriz, metaloproteinasa-10 de matriz, metaloproteinasa-11 de matriz, metaloproteinasa-12 de matriz o metaloproteinasa-13 de matriz.

46. El método tal y como se reivindica en la cláusula 44 caracterizado porque, el polipéptido tiene una conformación de barril beta.

47. El método tal y como se reivindica en la cláusula 44 caracterizado porque, el polipéptido es estable en suero de mamífero.

48. El método tal y como se reivindica en la cláusula 44 caracterizado porque, esencialmente todo el polipéptido permanece doblado en una conformación de barril beta mientras que está en urea 4M.