FR2802945A1

FR2802945A1 - Nouvelle metalloprotease matricielle mmp-25 homologue de la matrilysine

Info

Publication number: FR2802945A1
Application number: FR9916571A
Authority: FR
Inventors: De Coignac Amelie Benoit; Greg Elson; Jean Francois Gauchat
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1999-12-28
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2001-06-29

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle métalloprotéinase matricielle MMP-25 qui est exprimée dans les cellules tumorales. L'invention porte sur un procédé de criblage de composés susceptibles d'affecter l'activité de MMP-25, et sur l'utilisation desdits composés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, en particulier pour prévenir et/ ou empêcher la formation de métastases, la vascularisation des tumeurs et pour le traitement des maladies inflammatoires.

Description

La présente invention concerne une nouvelle métalloprotéinase matricielle MMP-25 qui est exprimée dans les cellules tumorales. L'invention porte sur un procédé de criblage de composés susceptibles d'affecter l'activité de MMP-25, et sur l'utilisation desdits composés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, en particulier pour prévenir et/ou empêcher la formation de métastases, la vascularisation des tumeurs et pour le traitement des maladies inflammatoires.

Les métalloprotéases matricielles (MMP) sont des endopeptidases capables de cliver de nombreux composants de la matrice extracellulaire Elles jouent un rôle primordial dans le remodelage des tissus pendant la morphogenèse, la cicatrisation, l'angiogénèse et l'apoptose (1) et ont été impliquées dans de nombreuses pathologies liées aux processus de dégradation ; l'arthrite rhumatoide, l'invasion tumorale, la formation de métastases et la rupture cardiaque après infarctus du myocarde (2;3) (4) Bien qu'elles révèlent différentes spécificités de substrats, les MMPs ont pu être regroupées de par leur séquence et structure primaire Elles peuvent être divisées en 4 sous familles : les collagénases, les gélatinases, les stromélysines et les MMPs de types membranaires (MT-MMPs). Toutefois certaines MMPs ne peuvent être classées dans une de ces sous-familles, c'est le cas par exemple de la métalloélastase de macrophage (MMP-12) (5), de la matrilysine (MMP-7) (6), de MMP-19 (7) et de l'énamalysine (8).

Les MMPs sont traduites sous une forme "zymogène" inactive qui nécessite le clivage d'un prodomaine pour s'activer. Ce prodomaine, localisé immédiatement après le peptide signal, contient une cystéine unique qui interagit avec l'ion Zn+ du domaine catalytique afin de maintenir la protéase sous forme inactive Dans le cas des MMPs activées intracellulairement, le prodomaine est séparé du domaine catalytique par un site de clivage "furine". Le domaine catalytique contient la séquence hautement conservée liant le zinc HEXGHXXGXXHS/T (SEQ ID N 3) ainsi que des sites liant le

calcium. Le domaine catalytique est séparé du domaine de type hémopexine-carboxyterminal par un "linker" riche en proline habituellement appelé "région charnière". Le domaine de type hémopexine contient 4 domaines répétitifs homologues à l'hémopexine et à la vitronectine. Bien que ce dernier domaine ne soit pas essentiel pour l'activité de la protéase, il semble toutefois fondamental pour la spécificité de substrat (voir revue (9). Certaines MMPs comprennent, en plus des domaines décrits ci-dessus, d'autres régions caractéristiques ; la sous-famille des gélatinases (MMP-2 et MMP-9) contient trois motifs répétés "fibronectine de type II", insérés dans le domaine catalytique, permettant d'augmenter l'affinité pour les substrats gélatines Dans la sousfamille des MT-MMPs, comprenant actuellement 5 membres, le domaine hémopexine se poursuit par une région hydrophobe transmembranaire et une région cytoplasmique (10) (11). Par contre, dans le cas de MMP-7 (la matrilysine), la plus courte MMP identifiée jusqu'à présent, le domaine hémopexine est absent (6) Il en est de même pour MMP-23 qui a récemment été clonée {Velasco, Pendas, et al 1999 ID 1995}.

Dans le cadre de la présente invention, une nouvelle MMP, désignée ci-après par MMP-25, a été isolée à partir d'ADNc f#tal et a été caractérisée L'ADNc isolé code pour une protéine de 260 acides aminés présentant tous les motifs caractéristiques de la famille des métalloprotéinases matricielles (MMP): les 24 acides aminés du peptide signal sont suivis par un pro-domaine et un domaine catalytique contenant une séquence spécifique liant le zinc HEIGHSLGLQHS (SEQ ID N 4). L'analyse de la séquence révèle que la protéine codée possède les mêmes domaines que MMP-7 et une absence caractéristique de domaine hémopexine, tout en étant plus homologue à MMP-12 (la métalloélastase de macrophage). Le profil d'expression de l'ARNm de MMP-25 a été analysé sur de nombreux tissus sains humains ainsi que sur des lignées cellulaires humaines. La protéinase a ensuite été exprimée dans des cellules de mammifères et la protéine recombinante utilisée pour une caractérisation préliminaire de son activité enzymatique La protéine recombinante MMP-25 révèle une activité protéolytique significative sur la gélatine et la )3-caséine

Description Ainsi, la présente invention concerne un acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie parmi le groupe de séquences suivantes a) la séquence SEQ ID No. 1 (MMP-25), b) un fragment d'au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence 15, 20,30 ou 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID No 1; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 52 %, de préférence 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95% ou 99% après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b), d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).

De préférence, l'invention se rapporte à un acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence SEQ ID No. 1, la séquence complémentaire ou de la séquence de l'ARN correspondant à la séquence SEQ ID No 1 ou encore à un acide nucléique codant pour un polypeptide MMP-25 de SEQ ID No 2 Ledit acide nucléique peut servir de sonde, d'amorce, d'oligonucléotide antisens ou de fragment fonctionnel de MMP-25 La SEQ ID N 1 est la séquence codante pour MMP-25 telle que représentée cidessous- 5'TTGGCATGCAGCTCGTCATCTTAAGAGTTACTATCTTCTTGCCCTGGTGTT TCGCCGTTCCAGTGCCCCCTGCTGCAGACCATAAAGGATGGGACTTTGTTG AGGGCTATTTCCATCAATTTTTCCTGACCAAGAAGGAGTCGCCACTCCTTA CCCAGGAGACACAAACACAGCTCCTGCAACAATTCCATCGGAATGGGACA GACCTACTTGACATACAGATGCATGCTCTGCTACACCAGCCCCACTGTGGG GTGCCTGATGGGTCCGACACCTCCATCTCGCCAGGAAGATGCAAGTGGAAT AAGCACACTCTAACTTACAGGATTATCAATTACCCACATGATATGAAGCCA TCCGCAGTGAAAGACAGTATATATAATGCAGTTTCCATCTGGAGCAATGTG ACCCCTTTGATATTCCAGCAAGTGCAGAATGGAGATGCAGACATCAAGGTT

TCTTTCTGGCAGTGGGCCCATGAAGATGGTTGGCCCTTTGATGGGCCAGGT GGTATCTTAGGCCATGCCTTTTTACCAAATTCTGGAAATCCTGGAGTTGTCC ATTTTGACAAGAATGAACACTGGTCAGCTTCAGACACTGGATATAATCTGT TCCTGGTTGCAACTCATGAGATTGGGCATTCTTTGGGCCTGCAGCACTCTG GGAATCAGAGCTCCATAATGTACCCCACTTACTGGTATCACGACCCTAGAA CCTTCCAGCTCAGTGCCGATGATATCCAAAGGATCCAGCATTTGTATGGAG AAAAATGTTCATCTGACATACCTTAATGTTAGCACAGAGGACTTATTCAAC CTGTCCTTTCAGGGAGTTTATTGGAGGATCAAAGAACTGAAAGCACTAGAG CAGCCTTGGGGACTGCTAGGATGAAGCCCTAAAGAATGCAACCTAGTCAG GTTAGCTGAACCGACACTCAAAACGCTACTGAGTCACAATAAAGATTGTTT TAAAAAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAA3' Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entendra désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin, ainsi que des produits de transcription desdits ADNs. Un nucléotide naturel d'acide nucléique se définit en ce que la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, et la thymine Un nucléotide peut être modifié au niveau des bases. On peut citer notamment l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, désoxyuridine, la dimétylamino-5- désoxyuridine, la diamino-2,6- purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié ou qui sont obtenues par synthèse Par " pourcentage d'identité " entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de

nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par " fenêtre de comparaison " pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr , Madison, WI) et (DNASIS,Version 2. 5 pour Windows ; Hitachi Software Engineering Co., Ltd, South San Francisco, CA, en utilisant les paramètres standards décrits dans le manuel du fabriquant).

Dans ce contexte, les séquences et les pourcentages d'identité peuvent également être obtenus en utilisant les ressources informatiques internet On peut citer les programmes Blast (WWW.ncbi.nlm.nih.gov) et le programme FastDB avec les paramètres suivants " Mismatch penalty 1.00 ; Penalty 1.00 ; Size Penalty 0.33 ; joining penalty 30. 0. Ces algorithmes sont présentés dans Current Methods in Sequencing and Synthesis Methods and Applications, pages 127-149,1988, Ala R Liss, Inc.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par " fenêtre de comparaison " dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux

séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 52%, de préférence 70%, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entendra désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 52%, de préférence 70%, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ ID No. 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 52%, de préférence 70%, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % d'identité après alignement entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.

L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15M NaCl + 0,015M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i e . 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille

définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) aux paragraphes 11 1 à Il.61 Parmi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 52%, de préférence 70%, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 %, après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de la séquence nucléique SEQ ID No. 1, ou de ses fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire des variations individuelles de la séquence nucléique SEQ ID No 1 Ces séquences mutées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie De préférence, la présente invention concerne les séquences nucléiques variantes dans lesquelles les mutations conduisent à une modification de la séquence d'acides aminés du polypeptide, ou de ses fragments, codé par la séquence normale de séquence SEQ ID No. 1.

Un second aspect de l'invention porte sur un polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique ayant au moins 52%, de préférence 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% d'identité après alignement optimal avec la SEQ ID N 2, ledit polypeptide étant impliqué dans le processus de dégradation de la matrice extracellulaire. De préférence, ledit polypeptide possède la séquence SEQ ID N 2.

La séquence SEQ ID N 2 suivante représente le polypeptide MMP-25 : MQLVILRVTIFLPWCFAVPVPPAADHKGWDFVEGYFHQFFLTKKESPLLTQET QTQLLQQFHRNGTDLLDMQMHALLHQPHCGVPDGSDTSISPGRCKWNKHTL TYRIINYPHDMKPSAVKDSIYNAVSIWSNVTPLIFQQVQNGDADIKVSFWQWA HEDGWPFDGPGGILGHAFLPNSGNPGVVHFDKNEHWSASDTGYNLFLVATHE IGHSLGLQHSGNQSSIMYPTYWYHDPRTFQLSADDIQRIQHLYGEKCSSDI Ce polypeptide se caractérise en ce que son substrat est notamment la gélatine et la sscaséine En ce sens, il est impliqué dans les processus de dégradation de la matrice

extracellulaire qui surviennent par exemple lors des métastases des tumeurs, de l'angiogénèse, et des maladies inflammatoires Un autre aspect de l'invention a trait à un vecteur comprenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus. Dans ce vecteur, ladite séquence peut être fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes et/ou peut comporter en outre un gène de sélection Ainsi, une cellule transformée par ledit vecteur est également visée. Parmi les cellules que l'on peut transformées, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire d'hamster chinois (CHO), mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en #uvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993).

Avantageusement, ledit vecteur peut exprimer un oligonucléotide capable d'inhiber l'expression de MMP-25.

L'invention se rapporte également à un anticorps capable de se lier spécifiquement à un polypeptide mentionné ci-dessus. Les anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Les anticorps polyclonaux sont obtenus en stimulant leur production dans un animal hôte approprié en injectant les polypeptides de l'invention éventuellement en association avec des adjuvants Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique Kohler & Milstein (Nature 1975, 256 . 52-55). Les techniques permettant la production d'anticorps sont bien connues par l'homme du métier, notamment à travers des ouvrages généraux tels que Roitt et al, Immunology second edition (1989) Churchill Livingstone, London On entend par anticorps dans le cadre de l'invention, un anticorps, ses dérivés et ses fragments, Dougall et al, In Tibtech 12 372-379 (Sept 1994) On peut citer notamment les fragments Fab, F (ab')2 etles Fv Ainsi, il est possible de procéder à la détection et/ou à la quantification d'un polypeptide selon l'invention un anticorps décrit ci-dessus A cet effet, il est utile de pouvoir disposer d'un kit de diagnostic comprenant ledit oligonucléotide ou ledit

anticorps éventuellement marqué soit avec un isotope radioactif soit avec un composé fluorescent ou autre.

Un aspect supplémentaire de l'invention concerne un procédé permettant l'amplification et/ou la détection d'un acide nucléique définie ci-dessus dans un échantillon caractérisé en ce qu'on utilise comme amorce et/ou sonde au moins un oligonucléotide comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence 15,20, 30 ou 50 nucléotides consécutifs d'une séquence indiquée ci-dessus ou d'une séquence capable de s'y hybrider.

Un tel procédé permet d'identifier une ou plusieurs mutations dans les régions codantes ou non codantes du gène MMP-25 et donc de diagnostiquer le potentiel invasif de tumeurs.

On entend par mutations des délétions, des insertions, des mutations ponctuelles qui peuvent aussi bien être dans les régions codantes et non codantes des gènes CTL (intron, promoteur, enhancer ou silencer). Ainsi, il est possible d'identifier des mutations affectant l'activité de la protéine MMP-25, l'épissage du gène et son niveau d'expression.

Une " sonde " se définie, dans le sens de l'invention, comme étant un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 12 à 100 nucléotides, notamment de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. Les sondes selon l'invention, qu'elle soient spécifiques ou non-spécifiques, peuvent être immobilisées, directement ou indirectement, sur un support solide ; on parle alors de " sonde de capture ". Par ailleurs, lesdites sondes peuvent porter un agent marqueur permettant leur détection ; on parle alors de " sonde de détection ".

Une " sonde de capture " est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support solide. Ces techniques sont notamment décrites dans la demande de brevet WO 92/10092. La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un

support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde) On peut citer également comme support solide, les puces à ADN, notamment les puces commercialisées par Affymetrix, Cis Bio International / LETI.

Une " sonde de détection " peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotitiques, et des ligands tels que la biotine Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 3 5 S, le 3H ou le 1251. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (réaction en chaîne à la polymérase) (Erlich, 1989 ; Innis et al., 1990, et Rolfs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4,683,202 Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorce les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention comme matrice, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions

d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. En règle général, selon la longueur des oligonucléotides utilisés, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 25 et 65 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 M. En ce qui concerne les sondes spécifiques, l'appariement peut s'effectuer à des températures supérieures à 50 C pour 1 à 2 mM MgCl2. La température d'hybridation d'un oligonucléotide étant calculée sur la base de 2 C par A ou T et de 4 C pour G ou C ; unoligonucléotide constitué par exemple d'une combinaison de 7 A et 5 C s'hybride à 34 C. Cette règle bien connue par l'homme du métier permet de calculer la température d'hybridation envisageable pour tous les oligonucléotides selon l'invention.

D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. en 1989, la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al en 1990, la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al en 1991, la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al en 1990, la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al en 1983 et perfectionnée

notamment par Chu et al. en 1986 et Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996.

Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase reverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.

L'invention porte également sur un kit de diagnostic caractérisé en ce qu'il permet de mettre en #uvre le procédé décrit précédemment. Par exemple, le kit peut comprendre un anticorps explicité ci-dessus.

Dans un autre aspect de l'invention, il est possible de tester parmi différentes familles ou librairies de composés ceux qui affectent positivement ou négativement l'activité de MMP-25, c'est à dire les composés qui inhibent ou activent l'action de MMP-25 sur ses substrats, notamment qui inhibent ou activent l'activité protéolytique sur la gélatine et la P-caséine. Ces tests peuvent aisément être mis en #uvre par l'homme du métier par des expériences de routine. On peut noter que des composés peptidiques modifiés chimiquement reprenant la structure du substrat de MMP-25 représentent des inhibiteurs potentiels Ainsi, la présente invention porte sur un procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ou d'activer la dégradation de la matrice extracellulaire par MMP-25 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) fixation d'un complexe [colorant-substrat de MMP-25] sur un support solide, b) addition d'au moins un composé susceptible d'inhiber ou d'activer MMP-25, c) Incubation avec un polypeptide selon l'invention, d) Détection de la quantité du colorant libéré et sélection des composés présentant un effet inhibiteur ou activateur.

Le support solide est de préférence une plaque ELISA. Lorsqu'un composé inhibe la protéinase, le colorant demeure lié à la plaque ELISA et est détecté. Autrement, le colorant est éliminé lors du rinçage de la plaque Bien entendu, tout procédé équivalent permettant l'identification d'un inhibiteur ou d'un activateur de MMP-25 est visé par la présente invention. Par exemple, le procédé supra n'est pas limité à la gélatine et la P-caséine En effet, on peut identifier d'autres substrats de MMP-25 en mettant en #uvre la technique dite phage display assay Cette technique, qui consiste à utiliser un librairie de phages portant une séquence peptidique aléatoire est abondamment décrite dans la littérature, notamment dans Smith M.M, Shi L. and Navre M. (1995) Rapid identification of highly active and selective substrates for stromelysin and matrilysin using bacteriophage peptide display libraries J Biol Chem 270 (12) 6440- 6449 , et dans Matthews D. J. and Wells J A (1994) A survey of furin substrate specificity using phage display. Protein Sci 3(8) 1197-1205, incorporées dans la description par référence. Ainsi, il est possible de mettre en #uvre le procédé de criblage d'inhibiteurs ou d'activateurs avec d'autres substrats de MMP-25 On peut également effectuer un procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ou d'activer la dégradation de la matrice extracellulaire par MMP-25 consistant en une zymographie. Ce procédé est détaillée ci-après.

Parmi les composés susceptibles d'agir sur MMP-25, on peut notamment tester ceux qui ont déjà montré une activité agonistique ou antagonistique des protéinases, en particulier des matrilysines.

On peut en particulier s'intéresser à tester les composés décrits dans les documents suivants : EP0891329 COMPOSES PEPTIDYLES AYANT UNE ACTIVITE INHIBITRICE DES MMP ET DU TNF EP0874842 COMPOSES DE MERCAPTOALKYLPEPTIDYL POSSEDANT UN SUBSTITUANT IMIDAZOLE ET LEUR UTILISATION COMME INHIBITEURS DE

METALLOPROTEINASES MATRICIELLES (MMP) ET/OU DU FACTEUR DE NECROSE TUMORALE (TNF) EP0821671 DERIVES D'ACIDE HYDROXAMIQUE ARYLSUFONYLE EN TANT QU'INHIBITEURS DE MMP ET DE TNF EP0818443 MERCAPTOCETONES ET MERCAPTOALCOOLS, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEUR UTILISATION COMME INHIBITEURS DE METALLOPROTEINASES MATRICIELLES EP0757037 DERIVES D'ACIDE SULFONYLAMINO COMME INHIBITEURS DE METALLOPROTEINASE W09850351 NOUVEAUX DERIVES DE CYSTEINE, LEURS PROCEDES DE PRODUCTION ET PRODUITS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT W09839326 COMPOSES AROMATIQUES D'ACIDE SULFONYLE ALPHA-HYDROXY HYDROXAMIQUE W09839316 COMPOSES N-HYDROXY-4-SULFONYL-BUTANAMIDEW09839315 COMPOSES AROMATIQUES D'ACIDE SULFONYL ALPHA-CYCLOAMINO HYDROXAMIQUE W09839313 COMPOSES D'ACIDE HYDROXAMIQUE SULFONAMIDE THIOARYLE W09838163 N-HYDROXY-2-(ALKYL,ARYL OU HETEROARYL SULFANYL, SULFINYL OU SULFONYL) -ALKYL, ARYL OU HETEROARYLAMIDES SUBSTITUES EN POSITION 3, UTILISES COMME INHIBITEURS DES METALLOPROTEINASE MATRICIELLE W09827069 COMPOSES DE PIPERAZINE INHIBITEURS DE METALLOPROTEASE MATRICIELLE (MMP) OU DE TNF W09816514 ACIDES ORTHO-SULFONAMIDO-BICYCLIQUES-HETEROARYL HYDROXAMIQUES EN TANT QU'INHIBITEURS DES METALLOPROTEINASES MATRICIELLES ET DE TACE W09816506 ACIDES BETA-SULFONAMIDO HYDROXAMIQUES UTILISES COMME INHIBITEURS DE METALLOPROTEASES MATRICIELLES ET DE TACE W09812309 PROCEDE D'ACTIVATION ET D'INHIBITION DE SURFACE CELLULAIRE W09804287 UTILISATION D'INHIBITEURS DE PROTEINASE POUR LA PREVENTION OU LA REDUCTION DE LA RESORPTION OSSEUSE

W09803164 COMPOSES A BASE DE SULFONE DE THIOL SERVANT D'INHIBITEURS DES METALLOPROTEASES W09743247 INHIBITION DE METALLOPROTEASES MATRICIELLES PAR DES COMPOSES DE PHENETYLE SUBSTITUES W09747599 DERIVES DE SUCCINAMIDES UTILES EN TANT QU'INHIBITEURS DU TNF ET/OU DES MMP W09743245 INHIBITION DE METALLOPROTEASES MATRICIELLES PAR DES COMPOSES CONTENANT DE L'ACETYLENE W09743240 INHIBITION DE METALLOPROTEASES MATRICIELLES PAR DES ACIDES 2-(OMEGA-AROYLALKYL)-4-BIARYL-4-OXOBUTYRIQUES W09743239 INHIBITION DES METALLOPROTEASES MATRICIELLES PAR LES ACIDES BIARYLE OXOBUTYRIQUES SUBSTITUES Ainsi, l'invention vise l'utilisation d'un peptide selon l'invention pour identifier un inhibiteur de MMP-25 L'invention se rapporte également à un composé susceptible d'être obtenu à partir du procédé de criblage indiqué ci-dessus Ce composé peut inhiber ou activer l'activité de MMP-25. Avantageusement, l'invention vise donc l'utilisation d'un inhibiteur de MMP-25 pour le traitement du cancer et des maladies inflammatoires L'invention a également pour objet une composition comprenant ledit composé ou un vecteur décrit précédemment et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La composition selon l'invention peut comporter en outre des agents choisis parmi ceux couramment employés dans le traitement du cancer : - Les dérivés des glucocorticoïdes, - les agents alkylants tels que les moutardes à l'azote, par exemple la cyclophosphamide, - les complexes de Platine, par exemple la cisplatine, - les dérivés de l'éthylène-imine, de diméthane sulfonoxy-alkanes, - les dérivés de la pipérazine,

- les inhibiteurs des topoisomérases tels que les inhibiteurs de la topoisomérase 2, par exemple les anthracyclines, l'epipodophyllotoxine tel que l'étoposide, les inhibiteurs de la topoisomérase 1, par exemple les dérivés de la camptothecine, - les antimétabolites tels que les antifolates, par exemple le méthotrexate, les antipurines, par exemple la 6-mercaptopurine, les antipyrimidiques, par exemple la 5fluorouracile, - les antimitotiques tels que les vinca-alcaloides, les taxoides tel que le taxotere, - les cytolytiques divers tels que la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamide, l'asparaginase, la mitoguazone, la plicamycine.

Ces agents antinéoplastiques sont décrits dans Actualité Pharmaceutiques n 302 (Oct
1992) pages 38 à 39 et 41 à 43 incorporées dans la description par référence On peut également choisir les radiations gamma utilisées en radiothérapie, l'étoposide, la doxorubicine, la dexamethasone, la céramide telle que la ceramide C8, la lonidamine Certains desdits agents anticancéreux, sont plus particulièrement décrits dans US 5,260,327 qui concerne l'utilisation de la lonidamine pour traiter les métastases, dans JO 5017353 qui porte l'utilisation de la lonidamine en association avec d'autres agents anticancéreux, et dans EP 291151, qui décrit l'utilisation des dérivés de la phlorizine. Ces documents sont incorporés dans la description par référence.

Il est également possible d'associer le composé selon l'invention avec un composé connu pour induire une hypoxie des tumeurs, notamment les inhibiteurs de l'angiogénèse. On peut notamment citer l'endostatine et l'angiostatine décrites par J Folkman, les thrombospondine-1 et-2 (TSP-1, -2) Locopo et al (1998) , les facteurs IFN gamma, TNFalpha, et IL-1 alpha , Maier et al (1999), U-995, un inhibiteur dérivé du cartilage de requin, Sheu et al (1998). Ces publications, la revue sur les inhibiteurs naturels, Paper et al (1998), et la revue générale sur les différents inhibiteurs connus, Harris et al (1998) sont incorporées par référence dans la description

L'invention se rapporte également à une composition comprenant un polypeptide ou un anticorps tel que décrit ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Un autre aspect de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un composé ou d'un vecteur décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament. Avantageusement, l'invention a trait à l'utilisation d'un inhibiteur ou d'un activateur de MMP-25 pour la fabrication d'un médicament. Le médicament est notamment destiné au traitement du cancer, en particulier pour prévenir et/ou empêcher la formation de métastases, pour inhiber l'angiogénèse, notamment pour prévenir et/ou détruire la vascularisation des tumeurs, et/ou pour le traitement des maladies inflammatoires, notamment pour le traitement de l'arthrite et des rhumatismes En outre, l'invention a pour objet l'utilisation d'un composé sélectionné parmi la 1,10 phénanthroline et ses dérivés pour inhiber MMP-25 in vitro ou in vivo et pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des cancer dans lesquels les cellules tumorales expriment MMP-25.

Ces indications comprennent aussi les récents développements des thérapies axées sur les MMP qui sont revues dans WO 98/40475 page 2 ligne 7 à page 3 ligne 34, incorporé dans la description par référence.

Ainsi, l'invention se rapporte à l'identification d'un ADNc codant pour une nouvelle MMP nommée MMP-25 dans la banque de donnée EST et cloné à partir d'ADNc foetal. Cette nouvelle MMP partage avec la matrilysine/MMP-7 une organisation présentant les 2 domaines minimum nécessaire à l'activité métalloprotéase. De par sa séquence primaire, elle se rapproche d'avantage de la métalloélastase de macrophage/MMP-12. L'activité protéase de MMP-25 recombinante a pu être démontrée sur la gélatine et la caséine. Cette MMP-25 est susceptible de cliver un grand nombre de substrats comme il a été observé pour MMP-7 (pour revue voir (25)) dû à l'absence de domaine hémopexine, domaine qui semble être impliqué dans la reconnaissance du substrat pour d'autres MMPs L'étude du profil d'expression de MMP-25 par Northern blot révèle un profil très restreint, le transcrit étant indétectable

dans tous les tissus adultes normaux testés. Une très forte expression est détectée dans le tissus placentaire issu du foetus ainsi que dans deux lignées transformées dérivées du rein ou de cellules B. L'ARNm de MMP-25 est aussi détecté dans des lignées cellulaires monocytiques, de rhabdomyosarcomeset de mélanomes Dès lors, cette expression apparaît être le reflet d'une réactivation des gènes du à la transformation des cellules Le fait que MMP-25 soit seulement exprimé dans les tissus foetaux normaux suggère qu'elle est réactivée dans certaines cellules tumorales puisque la carcinogenèse est connue pour corréler avec la réactivation de nombreux gènes foetaux Par exemple, MMP-7 est exprimée dans de nombreuses tumeurs comme les tumeurs du colon (27), du sein (30), de la prostate (31), de l'estomac (32), et du poumon (33). Contrairement aux autres MMPs impliquées dans les processus d'infiltration des tumeurs et de formation de métastases, MMP-7 semble être directement produite par les cellules cancéreuses et non pas principalement par les cellules stromales environnantes. L'implication de ce type de MMP dans l'invasion des tumeurs et la formation de métastases est confirmée par des expériences sur des souris déficientes en matrilysine, avec des oligonucléotides ou des ADNc anti-sens (34), (35), (36). Ainsi, MMP-25 ouvre une nouvelle voie pour le traitement et/ou la prévention des métastases.

Pour la suite de la description, on se référera aux légendes des figures présentées ciaprès.

Légendes Figure 1 : Prédiction de la séquence en acides aminés (A) et structure des différents domaines de MMP-25 (B).

A- Le peptide signal (acides aminés Ml à A24) est en caractères gras, suivis du prodomaine en italique (acides aminés D25 à D89) et du domaine catalytique. La région du "cystéine switch" (P80 - D86) ainsi que la région liant le zinc du domaine catalytique (H208 - H218) sont encadrées Les sites potentiels de glycosylation sont soulignés

B- MMP-25 possède la même organisation structurale que MMP-7 (matrilysine), avec un domaine NH2-terminal formant la proenzyme (domaine I) contenant le "cysteine switch", un domaine catalytique avec des histidines organisées de manière à lier une molécule de zinc au niveau du site actif (domaine II) Figure 2 : avec le programme CLUSTAL de la séquence prédite en acides aminés de MMP-25 avec les MMP-3,-12, -13 et-7 humaine.

Les résidus encadrés sont conservés.

Figure 3 : de l'expression de l'ARNm de MMP-25 dans différents tissus humain (A) et lignées cellulaires (B).

Des aliquots de 2 g d'ARN polyA+ isolés à partir des tissus humain et lignées indiqués furent analysés par Northern blot, avec une sonde spécifique marquée au [32P] (panneaux du haut); les positions du marqueur de poids moléculaire sont indiquées sur la gauche Les filtres ont ensuite été hybridés avec la GAPDH humaine (panneaux du bas).

Figure 4 : de MMP-25 dans les cellules COS par Western blot (A) et zymographies (B, C, D).

A- Les cellules sont transfectées avec une construction ADNc de MMP-25 suivies du tag C-myc. Des aliquots de protéine purifiées par chromatographie d'affinité furent analysés. Les lysats de cellules transfectées (puits 1-4) et de surnageants concentrés (puits 5-8) furent traités sur un gel SDS-PAGE et Western blot avec un anticorps anti tag C-myc couplé à la HRP. Puits 1,5: cellules COS transfectées avec l'ADNc codant pour un contrôle négatif; puits 2,6: cellules COS transfectées avec l'ADNc codant pour un contrôle négatif, stimulées par le PMA, puits 3,7 cellules COS transfectées avec l'ADNc codant pour MMP-25; puits 4,8. cellules COS transfectées avec l'ADNc codant pour MMP-25 stimulées par le PMA.

B-C-D- Analyse par zymographie, sur des gels contenant de la caséine (B) ou de la gélatine (C) de la protéine MMP-25 précipitée par chromatographie d'immunoaffinité

Puits 1: cellules COS transfectées avec l'ADNc codant pour un contrôle négatif. Puits 2 : cellules COS transfectées avec l'ADNc codant pour MMP-25. (D) inhibition de l'activité caséinolytique de MMP-25 (puits 1) par 50 mM EDTA (puits 2) ou 2 mM 1,10 phénantroline (puits 3).

Exemple 1 : Isolation et caractérisation de MMP-25 Matériel et Méthodes: Criblage de la base de données EST.

La base de donnée EST (http://www.ncbi nlm.nih gov/) a été criblée en utilisant un motif protéique conservé du domaine catalytique dans la requête Les ESTs comprenant une séquence codant pour ce motif ont été identifiés, sélectionnés et comparés avec les séquences de MMP déposées dans la base de donnée Swissprot (http: //www ncbi.nlm.nih gov/). De manière inattendue, un EST (Acc#AI743415) de 593 paires de bases codant pour une nouvelle MMP a été identifié L'ADNc correspondant a été appelé MMP-25.

Clonage de l'ADNc de MMP-25.

Deux amorces de PCR conçus sur la base de la séquence de l'EST AI743415 ont été utilisés pour amplifier un fragment de 593 paires de bases de MMP-25 à partir d'ADNc de foetus humain (Source de l'ADNc humain- Clontech, Palo Alto, CA). Le fragment d'ADNc de MMP-25 amplifié a été cloné dans le vecteur TA pCR2 1 (Invitrogen, Leeck, the Netherland) et analysé par séqençage La séquence nucléotidique de MMP-25 a servi comme point de départ pour la conception d'amorces pour le clonage du reste de la séquence codante de MMP-25 par PCR ancrée. Pour le clonage de la partie 5' de l'ADNc, l'amplification par PCR a été menée avec l'amorce MMPZ2 : 5'- TGGATATCATCGGCACTGAG -3' (SEQ ID N 5), dont la séquence à été définie à partir de la séquence de l'EST AI743415, et l'amorce spécifique pour l'ancre API (Kit "Marathon", Clontech) La même approche a été utilisée pour le clonage de la région 3' de MMP-25 La réaction de PCR a été réalisée

avec les amorces MMPZ1 : 5'- AAGATGGTTGGCCCTTTGATGG -3' (SEQ ID N 6) et API. Les fragment d'ADNc amplifiés ont été clonés dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen). La région codante de l'ADNc de MMP-25 a ensuite été amplifiée par PCR en utilisant un kit "High Fidelity cDNA PCR" (Boehringer) avec les amorces MMPZ11 . 5'-TTGGCATGCAGCTCGTCATC-3' (SEQ ID N 7) et MMPZ16. 5'CGGTTCAGCTAACCTGACTA-3' (SEQ ID N 8) Le produit d'amplification de 930 paires de bases a été cloné dans le vecteur pCR2 1 L'ADNc de MMP-25 a ensuite été recloné dans le vecteur d'expression pcDNA3 1-MYC-HIS (Invitrogen) pour la transfection transitoire dans les cellules COS-I Résultats : Un motif conservé du domaine catalytique de la famille des MMP a été recherché dans la banque de donnée EST à l'aide du logiciel TBLATNT. Le résultat de cette recherche a été criblé pour la présence de longues régions codantes dans les différentes phases de lectures (ORFs). Les ORFs avec des homologies pour les MMPs ont été comparées avec les séquences de protéines déposées dans la base de données Swissprot à l'aide du logiciel BLASTP La séquence en acides aminés de l'EST AI743415 avait une forte homologie avec la métalloélastase de macrophage (MMP-12) humaine Différents ADNc humains (cerveau, moelle osseuse, foetus, ganglions lymphatiques) on été criblées par transcription reverse et PCR (RT-PCR), en utilisant des amorces spécifiques, pour l'expression de l'ARNm codant pour la nouvelle MMP dont une partie de la séquence est contenue dans l'EST AI743415 Un fragment d'ADNc avec une séquence identique à celle de cet EST a été amplifié en utilisant de l'ADNc foetal comme source de ADNc.

Pour cloner la région codante complète de l'ARNm de la nouvelle métalloprotéinase, nous avons choisi une approche basée sur la PCR ancrée en utilisant comme substrat de la réaction de l'ADNc foetal lié à un adaptateur Grâce à cette technique, une région de 400 paires de bases de l'ADNc située en amont de la zone couverte par l'EST AI743415 a été obtenue. Ce fragment comprend un codon d'initiation AUG putatif précédé par une séquence consensus Kozac La séquence de l'EST AI743415

comprend un codon STOP ainsi qu'une queue poly A. Afin d'identifier d'éventuels variants alternatifs de l'ARNm de cette nouvelle MMP, une PCR ancrée en 3' a été réalisée mais tous les ADNc isolés étaient identiques à L'EST AI743415. En utilisant l'information obtenue par le séquençage des produits de PCR ancrée, la région codante complète de l'ADNc de la nouvelle MMP a été clonée par transcription reverse et PCR. L'ADNc obtenu de 950 paires de bases code pour un précurseur de protéinase de 260 acides aminés (poids moléculaire prédit 29 kDa Fig. 1A et 1B) possédant la même structure que la MMP-7 (matrilysine) La méthionine codée par le codon d'initiation est suivie d'un peptide signal putatif comprenant 24 résidus hydrophobes comme chez les autres membres de la famille MMP, suggérant que cette nouvelle MMP est ciblée dans le réticulum endoplasmique (Fig. lA). Le peptide signal est suivi d'un prodomaine contenant une cystéine unique (à la position 91), qui, chez les autres MMP a comme rôle d'inactiver le proenzyme en liant le zinc du domaine catalytique (" cysteine switch ") Il est intéressant de noter que la séquence hautement conservée PRCGVPD est remplacée dans MMP-25 par PHCGVPD Toutefois il semble peu probable que cette mutation ai un effet quelconque sur la fonction de la protéine puisque les deux acides aminés sont basiques et chargés positivement. Le domaine catalytique de 171 acides aminés comprend le motif liant le zinc HEIGHSLGLQHS qui est très conservé, ainsi qu'une méthionine située sept résidus en aval de ce motif, présente chez toutes les MMPs. Il a été proposé que cette méthionine joue un rôle essentiel dans la structure du site actif de cette famille d'enzymes (18). Tout comme MMP-7, MMP-25 n'a pas de domaine hémopexine, elle représente donc la deuxième MMP de forme courte clonée jusqu'à maintenant (Fig 1A et 1B) Cette comparaison de structure primaire suggère que la phase de lecture ouverte de l'ADNc cloné code pour un nouveau membre de la famille MMP que nous avons nommé MMP-25.

Une comparaison de séquence avec chacun des membres de la famille des MMP a été effectuée. Cette comparaison indique que MMP-25 présente une forte homologie pour la métalloélastase de macrophage (MMP-12, Fig 2), bien que de par sa structure elle se rapproche davantage de la matrilysine MMP-7. Lorsque la comparaison est effectuée sur le domaine catalytique uniquement, MMP-25 est 54% identique à la

métalloélastase de macrophage et 51% identique à la stromélysine 1 humaine (MMP- 3) Tout comme la matrilysine, MMP-25 ne peut pas être classée dans l'un des quatre groupes de la famille des MMPs puisqu'elle ne possède pas tous les domaines caractéristiques de ce groupe. Trois acides aminés situés proches du domaine liant le zinc (Tyr-214, Asp-235, Gly-237 suivant la numérotation de la MMP-1) ont été décrits comme fondamentaux pour l'activité collagénase (19) et sont absent des stromélysines Ces trois acides aminés ne se retrouvent pas dans la séquence de MMP-25. Cette différence indique qu'il est improbable que MMP-25 soit une collagénase De même, en raison de l'absence d'un domaine répété de type fibronectine-II caractéristiques aux gélatinases ou encore du domaine hydrophobe situé en C terminal du domaine catalytique des stromélysines, rend improbable que MMP-25 appartienne à l'un de ces 2 sous groupes Les domaines catalytiques des MMPs sont connus comme liant deux molécules de zinc. En accord avec Soler et col. (20), Browner et col. (21) ont montré que la matrilysine lie quatre ions métallique : ion Zinc dit "catalytique", un ion zinc dit "structural" et deux ions calcium. L'ion zinc "catalytique" est complexé aux histidines de la séquence consensus HEXGHXXGXXH (SEQ ID N 9). Becker et collaborateurs (22) ont montrés que pour MMP-3, le zinc "structural" interagit avec les chaînes secondaires des résidus Asp 153, His 151, His 166 et His 179. Une situation similaire peut être postulé pour MMP-25 de par la présence des acides aminés His 165, His 181, Asp 182 et His 194 suggérant que MMP-25 a aussi la capacité de lier deux molécules de zinc Pour MMP-3, il a été proposé que ce deuxième zinc soit critique pour maintenir la protéase dans une forme active, en maintenant le premier site de liaison du calcium (His 151à His 166) à l'écart du site actif et en aidant l'organisation de la poche du site actif pour la liaison au substrat (23) Finalement, MMP-25 comprend 2 sites de N-glycosylation localisés aux positions 64-67 (NGTD) et 221-224 (NQSS) Parmi les membres de la famille des MMPs caractérisés jusqu'à maintenant, MMP-25, tout comme la matrilysine, sont uniques de par le fait que leur gène code pour les domaines minimum nécessaire à l'activité de ces protéases.

Exemple 2 : Distribution tissulaire.

Matériel et Méthodes: Source des cellules et conditions de culture.

Les lignées HEK 293, COS1, RPMI 8226, RPMI 8866, HT29, Raji, THP-I, HEP-2, MCF-7 et Caco-2 ont été obtenues de l'American Type Culture Collection (ATCC ; Manassas, VA) et cultivées selon les instructions de l'ATCC La lignée HMC-1 nous a été généreusement donnée par le Dr J Butterfield (Mayo clinic, Rochester, MN) Cette lignée a été cultivée dans du milieu DMEMF12 additionné de sérum de veau foetal 10 % (FCS). La lignée KYM-1 nous a été généreusement donnée par le Pr. A Meager (National Institute for Biological Standarts and Control; South Mimms, UKEN6) et a été cultivée dans du milieu RPMI additionné de 10 % FCS. La source et les conditions de culture des lignées U266, Jijoye, HFB 1 et du clone de cellules T JF7 ont été décrites précédemment (12) ; (13). Les clones de mélanome invasifs TIC3 et non invasifs IC8 nous ont été obligeamment données par le Dr. D. Schmitt (INSERM, U346, Lyon, FR.). Elles ont étés cultivées en monocouche dans du milieu McCoy 5A (GIBCO) additionné de 10% de FCS.

Analyse par Northern blot.

Pour l'analyse de l'expression du transcrit MMP-25 dans les tissus humains, un fragment de 940 paires de bases de l'ADNc de MMP-25 a été marqué par "random priming" (14) en incorporant du [a-32P]-dCTP (220 TBq/mmol, Amersham France SA, Les Ulis, France). Ce fragment radiomarqué a été utilisé comme sonde pour les essais Northern blot avec les ARNs de tissus humains ( membranes "Human 12-lane Multiple Tissue Northern blot" et "Human Immune System Blot II", Clontech). Les hybridations, effectuées dans la solution "ExpressHyb" (Clontech), et les lavages, ont étés conduits selon les instructions de Clonetech. Pour l'analyse de l'expression de

l'ARN codant pour MMP-25 dans les lignées cellulaires, l'ARN polyA+ a été isolé par la procédure au thiocyanate de guanidium-trifluoroacétate de césium et chromatographie sur sépharose oligo-dT (15). Des aliquots d'ARN poly A+ (2 g) ont été séparés par éléctrophorèse sur gel agarose 1%, 6% formaldehyde, électotransférés sur membrane Nylon+ et fixé aux UV (16) . Les conditions d'hybridation et de lavage des essais Northern blot étaient identiques à celles décrites précédemment . La sonde de ADNc de G3PDH humaine (Clonetech) a été radiomarquées et utilisée pour les expériences de Northern blot comme décrit ci-dessus pour MMP-25.

Résultats L'expression de l'ARNm de MMP-25 a été analysé par Northern blot sur de l'ARN poly A+ isolé à partir de différents tissus humain (fig 3A) Un transcript de 1 0 kb est détecté uniquement dans le placenta Le placenta est un tissus subissant de nombreux remodelage. Il est formé de cellules endothéliales, de cellules stromales mesenchymiales de type fibroblastiques et de cellules de Hofbauer d'origine macrophagique Il est intéressant de noter que MMP-12, à qui MMP-25 est homologue, a été initialement détecté dans le placenta uniquement, puis ultérieurement localisé dans les macrophages et dans les cellules stromales (24) Dans le cas de MMP-7, un profil d'expression très restreint à aussi été observé l'ARNm de MMP-7 à été détecté par Northern blot dans l'endomètre et la prostate uniquement (pour revue voir (25)).

La grossesse chez la femme est associée à une croissance extensive et un remodelage de l'utérus et du placenta, le remaniement des ces tissus à des stades spécifiques de la grossesse implique l'activité de dégradation de nombreuses MMPs telles les MTMMPs, MMP-1, -2,-3, -7 and-9. MMP-7 est connue pour être impliquée dans le processus d'activation de MMPs latentes (26), (27) L'expression de MMP-25 dans le placenta uniquement et son analogie structurale avec MMP-7 suggère que cette MMP pourrait aussi intervenir pendant la grossesse et participer aux remaniements qui y sont associés en dégradant directement ou indirectement les composants de la matrice extracellulaire ou en activant d'autres MMPs.

L'analyse de l'expression tissulaire de MMP-25 a été complétée par l'étude de l'expression de l'ARNm de MMP-25 dans différentes lignées cellulaires humaines (Fig
3B). Les transcripts de MMP-25 ont été détectés dans la lignée de rein transformées par un adénovirus 293 et dans la lignée de lymphome B HFB La production de MMP-7 par des cellules de rein a déjà été démontrée (28) ; (29). Il reste à déterminer si l'expression dans les cellules 293 reflète la production de MMP-25 dans des cellules de rein normal ou est le résultat de la transformation par l'adénovirus Une détection plus faible de l'ARNm de MMP-25 a aussi été observé dans les lignées de mélanomes TIC3 et IC8, dans la lignée de rhabdomyosarcome KYM-1 et dans la lignée monocytique THP-1 Exemple 3: Expression de MMP-25 dans les cellules COS-1 transfectées de manière transitoire.

Matériels et méthodes Transfection transitoire.

Les cellules COS-I ont été transfectées avec les plasmides MMP25-pcDNA3.1-MYCHIS à l'aide du réactif FuGENETM 6 (Boerhinger Mannheim) en suivant les recommandations du fabricant.

Marquage des cellules par immunofluorescence.

Pour détecter l'expression de MMP-25 dans les cellules COS-I, les cultures ont été fixées 72h après transfection avec du PBS contenant 4% de paraformaldehyde pendant 15 minutes à 22 C, lavées deux fois dans du PBS et incubées pendant 20 minutes avec un anticorps monoclonal spécifique, dirigé contre le tag C-myc dilué à 10 g/ml (Roche Molecular Biochemicals) dans du PBS contenant 0.1% de saponine Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS additionné de 0. 01% de saponine et incubées comme décrit ci-dessus avec un anticorps secondaire de chèvre anti-IgG de souris conjugué au FITC (Silenus Laboratories, Hawthorn, Australie) dilué 1/200 dans du PBS avec 0 1% de saponine. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS

0.01% de saponine. La fluorescence a été analysée avec un microscope confocal Zeiss LSM 510 (Carl ZEISS, Gottingen, Allemagne).

Analyse par Western Blot.

Les cellules COS et leurs milieux de culture on été récoltés 72h après transfection. La PMA (10 nM), quand elle a été utilisée, a été rajoutée 48h après transfection Les surnageants ont été centrifugés à haute vitesse afin d'éliminer les débris cellulaires puis concentrés (Cellule de concentration AMICON ; d'exclusion de IOkDa) Les cellules ont été lavées deux fois dans du tampon phosphate salin (PBS) et lysées dans du tampon RIPA (150 mM NaCl, 1% NP40,0,5% DOC, 0,1% SDS, 50 mM Tris pH 8). Les lysats cellulaires et les surnageants ont été incubés une première fois avec de la protéine G-Sepharose seule (Amersham-Pharmacia Biotech, Suède). Ils ont ensuite été incubés avec l'anticorps anti-C-myc (10 g/ml) pendant une heure à 4 C. La protéine G-Sepharose a été ajoutée pour une incubation de 16h Les protéines immunonoprécipitées des cellules et des milieux de cultures ont été lavées deux fois dans les milieux RIPA et diluées 1 :1 dans du tampon échantillon Tris-glycine-SDS contenant 750 mM 2-ss-Mercapthoethanol. Les échantillons ont été chauffés à 95 C pendant 5 minutes. Les protéines ont été séparées par éléctrophorèse sur gel SDSpolyacrylamide 10% et électrotransférées sur membranes nitrocellulose (17) Les membrane ont été bloquées pendant 16h à 4 C dans 20 mM Tris, 154 mM NaCl, 0,1% Tween-20 contenant 5% de lait écrémé. Elles ont ensuite été incubées 2h avec le même tampon contenant de l'anticorps anti-C-myc tag couplé a la péroxydase, diluée 1/1000 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne). L'anticorps lié a été détecté par chimioluminescence (ECL, Amersham France, SA) Résultats Deux produits majeurs ayant un poids moléculaire proche de 30 kDa sont détecté aussi bien dans le milieu de culture que dans les cellules transfectées (fig 4A) Ces produits peuvent refléter des différences de glycosylation de la protéine dû à la présence de 2 sites putatifs de N-glycosylation sur la séquence primaire de MMP-25. MMP-25 a pu être immunoprécipitée à partir des surnageants des cellules transfectées (fig 4A lignes

7 et 8), en raison de la présence d'un peptide signal, confirmant que MMP-25 est sécrétée.

Exemple 4 : Activité protéasique de MMP-25.

Matériels et méthodes Zymographies sur gel contenant de la caséine ou de la gélatine.

Des aliquots de la protéine immunoprécipitée (300 ng) ont été incubés pendant 20 min à 37 C dans du tampon échantillon contenant du SDS (Biorad) en absence d'agent réducteur puis soumis à une éléctrophorèse sur gel polyacrylamide contenant de la gélatine (gel 10% acrylamide) ou de la caséine (gel 12% acrylamide). Après l'électrophorèse, les gels ont été lavés dans du Triton X100 à 2. 5% pendant une heure à température ambiante puis incubés toute la nuit dans du tampon de développement (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 200 mMNaCl, 2 mM CaCl2, 0. 02% Brij 35) Ils ont ensuite été colorés dans du bleu de Coomassie à 0. 5%. L'activité gélatinolytique ou caséinolytique a été détectée comme des bandes claires sur un fond uniformément bleu Résultats Plusieurs bandes révélant une activité protéase peuvent être visualisées aux alentours de 29 kDa au niveau du puits contenant les protéines immunoprécipitées à partir des cellules transfectées avec MMP-25 (Fig. 4B et 4C). Ces bandes révélant une activité protéase ne sont pas visualisées dans les fractions isolées à partir des transfections "mock" (Fig. 4b et 4C ligne 1) indiquant que cela reflète bien l'activité gélatinolytique et caséinolytique de MMP-25. L'observation de plusieurs bandes d'activité en zymographie peut refléter les variations de glycosilation et/ou le clivage partiel du prodomaine de MMP-25. Une bande plus faible est détectable aux alentours de 19 kDa (fig 4B) correspondant, d'après la séquence primaire, au domaine catalytique (fig IB) Cette bande à 19 kDa semble donc due à l'enzyme activée par clivage de son prodomaine lors de la purification (élution du complexe immunoprécipité par les

détergents) ou à l'autoactivation de la protéine. Les mêmes bandes sont observées quand les protéines sont immunoprécipitées à partir du milieu de culture des cellules, toutefois, le signal est moins intense.

Le signal protéolytique étant plus intense quand la caséine est utilisée en tant que substrat, c'est sur ce substrat que l'inhibition par des chelateurs d'ions tel que l'EDTA ou encore la phénantroline a été testé. Une inhibition partielle par l'EDTA est observée tandis que l'activité protéasique est abolie par la phénantroline. Ces résultats indiquent que l'activité observée par zymographie est due à la présence de la protéine recombinante MMP-25.

REFERENCES
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LISTE DE SÉQUENCES <110> Pierre Fabre Médicament <120> Nouvelle métalloprotéase matricielle MMP-25 homologue à la matrilysine.

<130> D18604 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.2 <210> 1 <211> 994 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> MMP-25 <400> 1 ttggcatgca gctcgtcatc ttaagagtta ctatcttctt gccctggtgt ttcgccgttc 60 cagtgccccc tgctgcagac cataaaggat gggactttgt tgagggctat ttccatcaat 120 ttttcctgac caagaaggag tcgccactcc ttacccagga gacacaaaca cagctcctgc 180 aacaattcca tcggaatggg acagacctac ttgacataca gatgcatgct ctgctacacc 240 agccccactg tggggtgcct gatgggtccg acacctccat ctcgccagga agatgcaagt 300 ggaataagca cactctaact tacaggatta tcaattaccc acatgatatg aagccatccg 360 cagtgaaaga cagtatatat aatgcagttt ccatctggag caatgtgacc cctttgatat 420 tccagcaagt gcagaatgga gatgcagaca tcaaggtttc tttctggcag tgggcccatg 480 aagatggttg gccctttgat gggccaggtg gtatcttagg ccatgccttt ttaccaaatt 540 ctggaaatcc tggagttgtc cattttgaca agaatgaaca ctggtcagct tcagacactg 600 gatataatct gttcctggtt gcaactcatg agattgggca ttctttgggc ctgcagcact 660 ctgggaatca gagctccata atgtacccca cttactggta tcacgaccct agaaccttcc 720 agctcagtgc cgatgatatc caaaggatcc agcatttgta tggagaaaaa tgttcatctg 780 acatacctta atgttagcac agaggactta ttcaacctgt cctttcaggg agtttattgg 840 aggatcaaag aactgaaagc actagagcag ccttggggac tgctaggatg aagccctaaa 900 gaatgcaacc tagtcaggtt agctgaaccg acactcaaaa cgctactgag tcacaataaa 960 gattgtttta aaaagtaaaa aaaaaaaaaa aaaa 994 <210> 2 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MMP-25 <400> 2 Met Gln Leu Val Ile Leu Arg Val Thr Ile Phe Leu Pro Trp Cys Phe
1 5 10 15 Ala Val Pro Val Pro Pro Ala Ala Asp His Lys Gly Trp Asp Phe Val
20 25 30 Glu Gly Tyr Phe His Gln Phe Phe Leu Thr Lys Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45 Leu Thr Gln Glu Thr Gln Thr Gln Leu Leu Gln Gln Phe His Arg Asn
50 55 60

Gly Thr Asp Leu Leu Asp Met Gln Met His Ala Leu Leu His Gln Pro
65 70 75 80 His Cys Gly Val Pro Asp Gly Ser Asp Thr Ser Ile Ser Pro Gly Arg
85 90 95 Cys Lys Trp Asn Lys His Thr Leu Thr Tyr Arg Ile Ile Asn Tyr Pro
100 105 110 His Asp Met Lys Pro Ser Ala Val Lys Asp Ser Ile Tyr Asn Ala Val
115 120 125 Ser Ile Trp Ser Asn Val Thr Pro Leu Ile Phe Gln Gln Val Gln Asn
130 135 140 Gly Asp Ala Asp Ile Lys Val Ser Phe Trp Gln Trp Ala His Glu Asp 145 150 155 160 Gly Trp Pro Phe Asp Gly Pro Gly Gly Ile Leu Gly His Ala Phe Leu
165 170 175 Pro Asn Ser Gly Asn Pro Gly Val Val His Phe Asp Lys Asn Glu His
180 185 190 Trp Ser Ala Ser Asp Thr Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Val Ala Thr His
195 200 205 Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Gln His Ser Gly Asn Gln Ser Ser
210 215 220 Ile Met Tyr Pro Thr Tyr Trp Tyr His Asp Pro Arg Thr Phe Gln Leu 225 230 235 240 Ser Ala Asp Asp Ile Gln Arg Ile Gln His Leu Tyr Gly Glu Lys Cys
245 250 255 Ser Ser Asp Ile
260 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Séquence artificielle <220> <223> Séquence consensus.

<220> <221> VARIANT <222> (12) <223> Xaa=Ser ou Xaa=Thr.

<400> 3 His Glu Xaa Gly His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa His Xaa
1 5 10

<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Séquence artificielle <220> <223> Séquence conservée.

<400> 4
His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Gln His Ser
1 5 10 <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce MMPZ2.

<400> 5 tggatatcat cggcactgag 20 <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce MMPZ1.

<400> 6 aagatggttg gccctttgat gg 22 <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce MMPZ11.

<400> 7 ttggcatgca gctcgtcatc 20 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Séquence artificielle <220> <223> Amorce MMPZ16.

<400> 8 cggttcagct aacctgacta 20

<210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Séquence artificielle <220> <223> Séquence consensus.

<400> 9 His Glu Xaa Gly His Xaa Xaa Gly Xaa Xaa His 1 5 10

Claims

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie parmi le groupe de séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID No. 1 (MMP-25) ; b) un fragment d'au moins 12 nucléotides consécutifs, de préférence 15,20, 30 ou 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 52 %, de préférence 60 %, 70 %, 80 %, 90%, 95% ou 99% après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b); d) la séquence complémentaire ou la séquence de l'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).

2. Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence SEQ ID No. 1, la séquence complémentaire ou de la séquence de l'ARN correspondant à la séquence SEQ ID No. 1.

3. Acide nucléique codant pour un polypeptide MMP-25 de SEQ ID No. 2.

4. Acide nucléique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une sonde, d'une amorce, d'un oligonucléotide antisens ou d'un fragment fonctionnel de MMP- 25.

5. Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique ayant au moins 52%, de préférence 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N 2, ledit polypeptide étant impliqué dans le processus de dégradation de la matrice extracellulaire.

6. Polypeptide selon la revendication 5 de séquence SEQ ID N 2.

7. Polypeptide selon l'une des revendications 5 et 6 caractérisé en ce que son substrat est notamment la gélatine et la p-caséine.

8. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il est impliqué dans les processus de dégradation de la matrice extracellulaire lors des métastases des tumeurs, de l'angiogénèse, et des maladies inflammatoires 9. Vecteur comprenant une séquence selon l'une des revendications 1 à 4.

10. Vecteur selon la revendication 9 caractérisé en ce que ladite séquence est fusionnée à un promoteur efficace dans les cellules eucaryotes et/ou procaryotes.

11. Vecteur selon l'une des revendications 9 et 10 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un gène de sélection.

12. Cellule transformée par un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11.

13. Anticorps capable de se lier spécifiquement à un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 8.

14. Procédé permettant l'amplification et/ou la détection d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4 dans un échantillon caractérisé en ce qu'on utilise comme amorce et/ou sonde au moins un oligonucléotide comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 4 ou d'une séquence capable de s'y hybrider.

15 Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il permet d'identifier une ou plusieurs mutations dans les régions codantes ou non codantes du gène MMP-25 et de diagnostiquer le potentiel invasif de tumeurs.

16. Kit de diagnostic caractérisé en ce qu'il permet de mettre en #uvre le procédé selon l'une des revendications 14 et 15.

17. Kit de diagnostic caractérisé en ce qu'il contient un anticorps selon la revendication 13.

18. Procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ou d'activer la dégradation de la matrice extracellulaire par MMP-25 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) fixation d'un complexe [colorant-substrat de MMP-25] sur un support solide, b) addition d'au moins un composé susceptible d'inhiber ou d'activer MMP-25, c) Incubation avec un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 8, d) Détection de la quantité du colorant libéré et sélection des composés présentant un effet inhibiteur ou activateur.

19. Procédé de criblage de composés susceptibles d'inhiber ou d'activer la dégradation de la matrice extracellulaire par MMP-25 consistant en une zymographie 20 Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que le support solide est une plaque ELISA.

21 Procédé selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisé en ce que le substrat est la gélatine ou la (3-caséine.

22 Composé susceptible d'être obtenu à partir du procédé selon l'une des revendications 18 à 21 23 Composé selon la revendication 22 caractérisé en ce qu'il inhibe l'activité de MMP-25.

24. Composition comprenant un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 8 ou un anticorps selon la revendication 13 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable

25. Composition comprenant un composé selon l'une des revendications 22 à 23 ou un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

26 Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 22 à 23 ou d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11pour la fabrication d'un médicament.

27. Utilisation d'un inhibiteur ou d'un activateur de MMP-25 pour la fabrication d'un médicament.

28. Utilisation selon l'unes des revendications 26 ou 27 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer, notamment pour prévenir et/ou empêcher la formation de métastases.

29. Utilisation selon la revendication 26 ou 27 pour la fabrication d'un médicament pour inhiber l'angiogénèse, notamment pour prévenir et/ou détruire la vascularisation des tumeurs.

30. Utilisation selon la revendication 26 ou 27 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des maladies inflammatoires, notamment pour le traitement de l'arthrite et des rhumatismes.