JP6877469B2 - Fviiiおよびvwf因子を含むキメラタンパク質、ならびにそれらの使用 - Google Patents
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Description
本発明は、血友病の治療において用いられる組換え型第VIII因子に関する。
血友病は、凝固因子の欠如のために止血が達成されないがゆえに、出血が連続的に発生する疾病である。血液中の凝固因子は第I〜第XIIIで構成され、その中で血友病に関連する因子は第VIII、第IXおよび第XIである。血友病は、上記因子の遺伝的欠損により引き起こされる。欠損した凝固因子のタイプに応じて、血友病は、第VIII因子が欠損している血友病A、第IX因子が欠損している血友病B、および第XI因子が欠損している血友病Cに分類することができる。そして、血友病Aは、血友病の約80〜85%を占める。
技術的課題
本発明の目的は、体内での滞留時間を延長させることにより、週に1回以下の投与頻度で投与することができる改善されたFVIIIを提供することである。
一実施形態において、軽鎖および重鎖を含むヒト第VIII因子(FVIII)であって、その全長が完全に欠失しているかまたは部分的に欠失しているBドメインを含むヒトFVIIIと、少なくとも1つのvWFのD’D3ドメインとを含む、キメラタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、少なくとも2倍延長された半減期を有する。
本発明による、FVIIIおよびvWFドメインが連結しているキメラタンパク質、または、PEGによって修飾された形態のキメラタンパク質は、投与された場合に体内における大幅に延長された半減期を有し、それにより、週に2〜4回の従来の薬剤の投与頻度を、1週間に1回よりも減少させる。従って、血友病Aの治療薬としての当該キメラタンパク質は、患者の利便性の向上と治療費の削減につながる。
本発明は、FVIIIが内在性vWFタンパク質と複合体を形成するのを防止または阻害し、同時にFVIIIのLRP(低密度リポプロテイン受容体関連タンパク質)への結合を阻害してFVIIIタンパク質の半減期を延長するための技術を提供する。これは、LRPおよびプロテアーゼ依存性FVIII消失を遅らせることと同時にvWF依存性消失の減少をもたらし、半減期の延長をもたらす。
実施例1−1.scFVIII(一本鎖FVIII)の調製
一本鎖の形態で発現されるFVIIIの構築のために、フューリン切断部位、残基1648(完全長FVIIIアミノ酸配列を表す配列番号1のアミノ酸配列に基づく)を含むBドメインの一部が欠失したFVIIIを構築した。構築された各scFVIIIを、BドメインのN末端(配列番号1の741番目のアミノ酸残基)から数えて特定の長さのBドメインを含み、含まれるBドメインが、元々存在する糖鎖をそのまま含有するように構築し、該Bドメインに位置する782番目のイソロイシン残基を、部位特異的ペグ化のためにシステインで修飾した。
D’D3を含有する二量体の形態で発現されたFVIIIを構築するために、D’D3を含有する重鎖と、軽鎖とを、1つの細胞で、異なるベクターを用いて発現させた。D’D3を含有する重鎖は、実施例1−1で用いられるB3に対応するBドメインを含有し、軽鎖は、韓国特許番号第251286号に記載の軽鎖を発現するベクターを参照して産生した。
キメラFVIIIを、実施例1−1および1−2で調製した一本鎖FVIIIおよび二量体FVIIIに基づき、1つまたは2つのD’D3と融合させ、リンカーを、融合したD’D3のFVIIIへの有効な結合のために用いた。リンカーのために、FVIIIのBドメインの一部または[G4S]nを用いた。また、いくつかのキメラFVIIIは、上述の組成物に加えてFcを含有した(図2および図3、および表2)。
実施例1で構築したキメラFVIIIを細胞で発現し、発現を示す細胞を細胞培養培地で培養した。発現のために、実施例1で構築した発現ベクターを、Expi293F(商標) Expression System Kit(Thermofisher Co., Catalog Number A14635)を用いて、Expi293F(商標)細胞に導入および移入した。トランスフェクション法および培養は30mLスケールで以下のように行い、実際の培養液量はタンパク質の必要量に応じて調整した。トランスフェクトの24時間前に、Expi293培養培地を用いて、予想される必要量に従って、2.0×106細胞/mLでExpi293F(商標)細胞を継代培養した。トランスフェクト当日に、細胞の数および細胞生存率を測定し、細胞生存率が95%以上の場合にトランスフェクトを実施した。Expi293培養培地を125mLフラスコに加えて7.5×107細胞の量を得、25.5mLに調整した。実施例1で構築した発現ベクター30μgをOpti−MEMと混合して、全量1.5mLとした。トランスフェクション試薬80μlをOpti−MEMと混合して、全量1.5mLとし、室温で5分間インキュベートした。5分後に、トランスフェクション試薬を含有するOpti−MEMを、DNA含有Opti−MEMに加えて、その後穏やかに混合した。20分〜30分間、反応を室温で実行した。3mLのDNA:トランスフェクション試薬混合物を、予め調製した125mLフラスコのExpi293F(商標)細胞に滴下して(全量:28.5mL)、5%CO2振とう培養器中、37℃、125rpmでインキュベートした。16〜20時間後、それぞれ150μLおよび1.5mLの、エンハンサー1およびエンハンサー2をそこに加えて、細胞を、5%CO2振とう培養器中、34℃、125rpmでインキュベートした。培養2日目に、全ての細胞を遠心分離して既存の培養培地を完全に取り除き、全ての細胞を30mLの新しい培養培地に分注して、5%CO2振とう培養器中、34℃、125rpmでインキュベートした。導入3日目に、キメラFVIIIを発現した細胞を全て遠心分離し、培養液を回収した。培地の回収後に残っている細胞を、同じ容量の新しい培養培地に分注し、34℃で1日培養した。このプロセスを、培養5日目まで繰り返し、3日目、4日目、および5日目の培養液を回収し、システインを導入したキメラFVIIIの活性解析と精製を行った。上記と同様の方法により、CHO−DG44細胞においてFVIII発現を実施した。
実施例3−1.キメラFVIII発現レベルの測定
広く用いられているFVIII活性の2つの測定試験法は、一段階法による凝固法(one−stage clotting method)および発色法(chromogenic method)である。それらのうち、キメラFVIII発現レベルを、発色法で測定した。発色法は、発色物質の発色の程度に基づいてFVIII活性を測定する方法であり、FIXa、FX、トロンビン、カルシウム、リン脂質およびFVIIIサンプルを混合し、FXaによる切断時に発色する発色基質を、FVIIIサンプルにより活性化されたFXaの量を測定するためにそこに添加する。
本発明で構築したキメラFVIIIを実施例4に従い精製した後、精製サンプルの発現パターンをウェスタンブロット解析により確認した。
キメラFVIIIの産生プロセスは、大きく5つのステップから成る。実施例2の培養に用いた培養液を用いて、精製を実施した。
キメラFVIIIの比活性を確認するために、キメラFVIII活性を発色法により測定し、キメラFVIIIタンパク質の量をBSAを標準物質として用いるBCA法により測定した。比活性を、活性測定の結果をタンパク質の量で割ることによって測定した。結果を表4に示す。
LRPまたはvWFに対するキメラFVIIIの結合親和性を、ELISA法により測定した。vWWF(HCVWF−0191、Haemtech、200μg/mL)またはLRP(#04−03、Biomac、260μg/mL)を96ウェルプレート上に1ウェルあたり100μLの量でコーティングし、室温で2時間静置させた。2時間インキュベートした後、PBSに0.1%Tween(登録商標)20を加えて作製した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。ブロッキングは、PBSに1%BSAを加えて作製したブロッキングバッファー200μLを各ウェルに加えた後、室温で1時間インキュベートすることにより実施した。1時間インキュベートした後、PBSに0.1%Tween(登録商標)20を加えて作製した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。ブロッキングバッファーを用いてFVIIIサンプルを適切な濃度に希釈し、1ウェルあたり100μLの量でウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。PBSに0.1%Tween(登録商標)20を添加した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。抗第VIII因子ビオチン(SAF8C−APBIO、Affinity Biologicals、100μg/mL)をブロッキングバッファーを用いて1/2000に希釈し、1ウェルあたり100μLの量でウェルに添加し、室温で1時間静置した。PBSに0.1%Tween(登録商標)20を添加して作製した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。
体内でのペグ化されたキメラFVIIIの半減期を測定するために、血友病Aマウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を行った。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)(コントロール)およびペグ化されたキメラFVIII(本実施例ではPEG−scFVIII/D’D3−120を使用)を125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。ADVATE(登録商標)投与群では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、PEG−scFVIII/D’D3−120投与群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、および72時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、PK血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびPEG−scFVIII/D’D3−120の力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。PKアッセイの結果(図9)、測定したAdvate(登録商標)の半減期は約7.86時間であり、PEG−scFVIII/D’D3−120の半減期は26.12時間であり、これはAdvate(登録商標)の3.3倍であった。PEG−scFVIII/D’D3−120の平均滞留時間(MRT)も、Advate(登録商標)と比較して3.6倍増加した。さらに、PEG−scFVIII/D’D3−120の消失率(CL)はAdvate(登録商標)と比較して約2倍減少し、曲線下面積(AUC)は約2倍増加した。
実施例7と同様に、血友病A型マウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を実施した。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)、コントロール、およびペグ化されたキメラFVIIIを125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、異なるサイズのPEGとコンジュゲートしたscFVIII/D’D3−120を用いて、PK試験を行った。ADVATE(登録商標)投与群(コントロール)では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、試験群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72、および96時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、PK血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびキメラFVIIIの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。
血友病Aマウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を実施した。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)、コントロール、およびペグ化されたキメラFVIIIを125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、PEG−scFVIII/D’D3−60およびFcと融合したscFVIII/D’D3−120にPEGをコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、PK試験を行った。ADVATE(登録商標)投与群(コントロール)では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、試験群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72、および96時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびキメラFVIIIの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。
血友病Aマウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を実施した。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)、コントロール、およびペグ化されたキメラFVIIIを125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、PEG−scFVIII/D’D3−300およびFVIIIが二量体形態のD’D3にC末端で融合しているscFVIII/D’D3−120にPEGをコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、PK試験を行った。ADVATE(登録商標)投与群(コントロール)では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、試験群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72、および96時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、PK血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびキメラFVIIIの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。
血友病Aマウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を実施した。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)、コントロール、およびペグ化されたキメラFVIIIを125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、EG−scFVIII/D’D3−60、PEG−scFVIII/D’D3−120およびPEG−scFVIII/D’D3−300を用いて、PK試験を行った。ADVATE(登録商標)投与群(コントロール)では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、試験群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72、および96時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびキメラFVIIIの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。
血友病Aマウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を実施した。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)、コントロール、およびペグ化されたキメラFVIIIを125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、PEG−scFVIII/D’D3−120、PEG−scFVIII/D’D3−120−TH1、およびPEG−scFVIII/D’3−120−TH2を用いて、PK試験を行った。ADVATE(登録商標)投与群(コントロール)では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、試験群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72、および96時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびキメラFVIIIの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。
血友病Aマウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を実施した。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)、コントロール、およびペグ化されたキメラFVIIIを125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、様々なPEGをscFVIII/D’D3−120−TH1にコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、PK試験を行った。ADVATE(登録商標)投与群(コントロール)では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、試験群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72、および96時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびキメラFVIIIの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。
ペグ化されたキメラFVIIIのトロンビン生成プロファイルを調べるために、トロンビン生成アッセイを行った。Fluoroskan Ascent(商標)FLマイクロプレート蛍光光度計およびルミノメーター(5210460、Thermofisher)装置を37℃に予熱し、機器のラインを37℃に予熱した蒸留水(DW)で洗浄した。FVIII欠損血漿(OTXW17、Siemens)、検量用試料(TS20.00、Thrombinoscope)、およびPPP−low−reagent(TS31.00、Thrombinoscope)を、室温で15分以上放置して温めた後、1mLの37℃に予熱した蒸留水(DW)で溶解した。サンプルを、予め調製したFVIII血漿を用いて、適切な濃度に希釈した。FluCa−Kit(TS50.00、Thrombinoscope)中のFluoバッファーを、37℃に温めることによって調製した。調製した試料をそれぞれ80μLずつFluoroskan装置のプレートに加え、40μLのFluo基質を、37℃に温めたFluoバッファーの入った1つのバイアルに入れた。調製したFlu−Caを該機器に入れた後、予めプログラムしたソフトウェアを用いて1ウェルあたり20μLになるようにFlu−Caを分注し、トロンビン生成を進めた。
キメラFVIIIの有効性を調べるために、血友病A型マウス(HAマウス)の尾切断モデルを用いて急性有効性試験を行った。野生型マウス(WT)については、Orient Bioによって提供された体重19〜25gの雄C57BL/6マウスを使用した。HAマウスについては、Green Crossによって提供された体重19〜25gの雄のマウスを選択して使用した。試験当日、15mLコニカルチューブ(マウス1匹あたり1つ)に生理食塩水を14mLまで充填した後、生理食塩水の温度を37℃で維持するためにチューブを加熱したウォーターバス中で保管し、投与前のマウスの体重を測定した。ペントバルビタールナトリウムを60mg/kgの用量で腹腔内(IP)投与して麻酔した後、0.9%の生理食塩水(ネガティブコントロール)、またはAdvate(登録商標)(ポジティブコントロール)およびペグ化されたキメラFVIIIを、頸静脈に、一用量5mL/kgの容量で、100IU/kgの用量を投与した。5分後に、HAマウスの尾を尾の端から4mmの位置で切断し、尾を生理食塩水バッファーに30分間入れて採血した。30分間採取した血液サンプルを1500gで5分間遠心分離して上清を除去した後、10mLピペットを用いて三次蒸留水(tertiary distilled water)10mLをコニカルチューブに添加し、血液をボルテックスを用いて完全に溶血させた。失血量(blood loss)を測定するために、溶血させたサンプルをヘモグロビンアッセイキット(MAK115−1KT、Sigma−Aldrich)を用いて解析した。
血友病Aマウスモデル(HAマウス)を用いたPK試験を実施した。HAマウスとして8週齢のマウス(20±2g)を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした(n=3/時点)。続いて、Advate(登録商標)、コントロール、およびペグ化されたキメラFVIIIを125IU/kgの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、CHO細胞で発現されたscFVIII/D’D3−120−TH1に様々なPEGをコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、PK試験を行った。ADVATE(登録商標)投与群(コントロール)では、投与後0、0.083、2、6、9、16、22、および30時間で、また、試験群では、投与後0、0.083、2、6、16、30、40、48、64、72、および96時間で、血液を200μlサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤(クエン酸ナトリウム3.2%バッファー)と1:9の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Advate(登録商標)およびキメラFVIIIの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをWinNonLinソフトウェア(バージョン6.4)の非コンパートメント(NCA)モデルを用いて計算した。
Claims (13)
- (a)A1−A2−B−A3−C1−C2ドメインを含む変異ヒト第VIII因子(FVIII)であって、変異が、配列番号1の野生型ヒトFVIIIに関して、(i)A1−A2−B−A3−C1−C2ドメインのB領域における部分的な欠失および(ii)配列番号1の782位におけるシステインでの置換を含む変異ヒトFVIII;
(b)少なくとも1つのvWF(フォン・ウィルブランド因子)D’D3ドメインであって、該vWF D’D3ドメインは、配列番号2の742位から1248位までの連続したアミノ酸の配列からなる;および
(c)(a)変異ヒトFVIIIおよび(b)vWF D’D3ドメインを連結するリンカー、
を含むキメラタンパク質であって、
A1−A2−B−A3−C1−C2ドメインのB領域は、配列番号1の741から902および1654から1689の連続したアミノ酸残基の配列からなり、
リンカーが酵素切断部位を有するものであり、
(a)変異ヒトFVIIIが、配列番号1の位置782のシステインで親水性ポリマーにコンジュゲートされており、
親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)であり、PEGが、アクリロイル、スルホンまたはマレイミド基を介して配列番号1の位置782のシステインに連結しており、
PEGが平均分子量20kDa以上を有し、
キメラタンパク質が一本鎖の形態を有し、
キメラタンパク質がFcを含まない、
キメラタンパク質。 - 野生型FVIIIと比較して、少なくとも2倍延長された半減期を有する、請求項1に記載のキメラタンパク質。
- (a)変異FVIIIが、配列番号1の配列に基づくアミノ酸残基754、781、788、789、825、897、491、495、498および1806からなる群から選択される少なくとも1つがシステインで置換されている、請求項1に記載のキメラタンパク質。
- PEGが平均分子量40kDaまたは60kDaを有する、請求項1に記載のキメラタンパク質。
- (c)リンカーの酵素切断部位が、トロンビン、FVIIa、FXa、またはFXIaにより切断され得る配列である;および
(c)リンカーが、[G4S]n(式中、nは0、または1〜100の整数である)のアミノ酸配列をさらに含む、
請求項1に記載のキメラタンパク質。 - トロンビンにより切断され得るアミノ酸配列が、DFLAEGGGVR(配列番号36)、TTKIKPR(配列番号37)、またはLVPRGS(配列番号38)であり;FVIIaにより切断され得るアミノ酸配列が、ASKPQGRIVGG(配列番号39)であり;FXaにより切断され得るアミノ酸配列が、IDGR(配列番号40)またはIEGR(配列番号41)であり;FXIaにより切断され得る配列が、SKLTRAETVF(配列番号42)である、請求項5に記載のキメラタンパク質。
- nが4、6、8、10、16、21、22または58である、請求項6に記載のキメラタンパク質。
- 一本鎖ポリペプチドの形態を有するキメラタンパク質が、配列番号6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、もしくは19により表されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のキメラタンパク質。
- 請求項8に記載のキメラタンパク質をコードする核酸分子。
- 配列番号48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、または64で表される、請求項9に記載の核酸分子。
- 請求項9または10に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項11に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項9または10に記載の核酸分子、請求項11に記載のベクター、または、請求項12に記載の細胞、および薬理的に許容される担体を含む、血友病Aを治療するための医薬組成物。
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