KR100251286B1 - 혈액응고 제 8인자의 중쇄와 경쇄, 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 세포주 및 그를 이용한재조합 혈액응고 제 8인자의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 중쇄 유전자를 포함한 발현벡터및 혈액응고 제 8인자의 경쇄 유전자를 포함한 발현벡터 뿐만 아니라, 발현된 혈액응고 제 8인자의 안정화와 발현양 증가에 영향을 주는 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)의 유전자를 포함한 발현벡터까지 한 세포주에 트랜스펙션(cotransfection)시켜, 활성을 가지는 혈액응고 제 8인자와 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현시키는 세포주 및 그를 이용하여 안정화된 재조합 혈액응고 제 8인자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포주 및 그를 이용한 재조합 혈액응고 제 8인자의 제조방법은 생체의 혈액응고 제 8인자에 존재하는 아미노산만으로 이루어진 혈액응고 제 8인자를 발현하므로 타 아미노산으로 인한 항원성 문제에 대한 염려가 없으며, 또한 혈액응고 제 8인자의 활성과 발현양 증가에 영향을 주는 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하므로, 무혈청 배지에서도 활성이 있는 혈액응고 제 8인자의 고발현을 이루어 생산단가를 크게 절감시킨다.

Description

혈액응고 제 8인자의 중쇄와 경쇄, 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 세포주 및 그를 이용한 재조합 혈액응고 제 8인자의 제조방법
본 발명은 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 중쇄와 경쇄, 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)를 동시에 발현하는 세포주 및 그를 이용한 재조합 혈액응고 제 8인자의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 혈액응고 제 8인자의 중쇄 유전자를 포함한 발현벡터 및 혈액응고 제 8인자의 경쇄 유전자를 포함한 발현벡터 뿐만 아니라, 발현된 혈액응고 제 8인자의 안정화와 발현양 증가에 영향을 주는 폰 빌리 브란트 인자의 유전자를 포함한 발현벡터까지 한 세포주에 트랜스펙션(cotransfection)시켜, 활성을 가지는 혈액응고 제 8인자와 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현시키는 세포주 및 그를 이용하여 안정화된 재조합 혈액응고 제 8인자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
혈액응고는 그 과정에 관여하는 여러 가지 단백들의 상호작용으로 이루어지며, 그 과정에 관여하는 어느 단백의 결핍은 피브린을 형성하기 위한 초기 자극단계의 진행을 방해하게 된다.
혈액응고 제 8인자 또한 혈액응고 과정에 관여하는 중요한 기능을 하는 단백질로서, 이 단백질은 혈액응고 과정의 중간 단계인 활성화된 혈액응고 제 9인자가 혈액응고 제 10인자를 활성화된 형태로 전환하는 단계에 관여하는 것으로 알려져 있다. 혈액응고 제 8인자는 이 과정에서 인지질 및 칼슘 이온의 존재하에서 보효소로서 작용을 한다. 즉, 혈액응고 제 8인자 자체로서의 활성을 가지고 있음은 아직까지 알려지지 않았으며, 혈액응고 제 9인자의 활성을 증가시키기 위해 필요로 한다고 알려져 있다. 혈액응고 과정에서 이 단계는 가장 결정적이다. 그 이유는 대부분의 혈우병은 혈액응고 제 8인자와 제 9인자의 기능저하에 의해 발생하기 때문이다. 또한, 혈우병 환자의 약 80% 정도는 혈액응고 제 8인자의 결핍이 원인이 되며, 이로써 혈소판 플러그(plug)를 안정화시키기 위해 필요한 충분한 피브린 형성이 이루어지지 않기 때문이다.
혈액응고 제 8인자와 제 9인자에 의한 혈우병이 대부분인 이유는 이들 단백질을 코딩하고 있는 유전자가 X-염색체에 연결(link)되어 있기 때문이다. 이런 이유로 혈액응고 제 8인자 및 제 9인자 유전자의 하나의 결핍 allete는 남자에게서 혈우병을 일으키는 반면, 다른 혈액응고에 관여하는 인자들은 상염색체에 연결되어 있거나, 일반적으로 두 개의 결핍 alletes가 되어야 혈우병을 일으키기 때문이다. 그러므로, 혈우병 A 및 혈우병 B는 대부분 일반적인 혈액응고 결핍증을 차지하여 남자에게 국한되어 일어나는 유전병이다. 혈우병 A의 치료는 다른 유전병에서와 마찬가지로 현재까지 근본적인 원인 치료가 이루어지지 못하고 있으므로, 환자는 일생동안 계속적으로 혈액응고 제 8인자 단백질을 공급받아야 하는 실정이다.
이들의 치료를 위해 초기에는 혈장 전체를 사용하였고, 이후에는 이 단백을 농축하여 사용하였으나, 인간 혈액응고 제 8인자를 얻기 위한 유일한 원은 인간의 혈장이므로, 불안정한 많은 양의 인혈장을 얻는데 문제가 생긴다. 또한, 혈액응고 제 8인자는 활성의 불안정성 때문에 농축을 위한 간단한 정제 과정 동안 불활성화되어, 활성이 있는 혈액응고 제 8인자의 회수율이 매우 낮으며, 나아가 제조된 산물은 순도가 매우 낮아 mg 단백질 당 0.5∼2 단위(unit) 정도의 비활성을 가지게 되며, 농축액의 순도는 대략 0.04% 정도로 알려져 있다. 또한, 매우 높은 불순물 수준은 단백질의 침전, 간염 바이러스 및 에이즈 바이러스 등의 감염 기회를 높인다는 문제를 야기시키게 된다. 이런 문제를 일으킬 수 있는 불순물은 혈장 유래 혈액응고 제 8인자의 활성이 불안정하고, 또 다수의 혈액 공급자의 혈장을 모아서 제조했기 때문이다. 다수의 혈장을 모아 만들 경우, 공혈자중 1명이 간염 바이러스에 감염되어도 그 로트(lot)는 간염 바이러스 감염의 기회를 완전히 배제할 수 없으며, 인 혈장 유래의 혈액응고 제 8인자의 대량 생산은 인체 혈액에 전적으로 의존해야 하기 때문에, 혈액의 대량 공급에 한계성을 가지고 있다.
이러한 제반 문제를 극복하기 위하여, 유전공학적 방법에 기초한 혈액응고 제 8인자의 합성이 시도되어, 생물학적으로 활성이 높고 안정한 상태의 재조합 혈액응고 제 8인자를 생산할 필요가 있다. 이에, 유전공학적인 방법에 의해 재조합 혈액응고 제 8인자를 생산하기 위한 여러 연구가 진행되어 왔다. 먼저, 혈액응고 제 8인자의 A, B 및 C-도메인 모두를 포함하는 전체 유전자를 발현시키는 연구가 먼저 시도되었다(참조: J. Biol. Chem., 263:6352(1988)). 그러나, 이 방법은 혈액응고 제 8인자의 발현양이 매우 적어, 산업상 이용에 부적합하다는 문제점을 가지고 있었다.
혈액응고 제 8인자의 발현양을 향상시키기 위한 다른 방법이 모색되었는데, 그 중의 하나가 혈액응고 제 8인자의 활성에 혈액응고 제 8인자의 일부분이 불필요하다는 보고가 알려지면서, B-도메인 부분을 제거한 돌연변이체 유전자를 이용하여 발현양을 높이고자 하는 연구가 시도되어 왔다(참조: Eur. J. Biochem., 232:9-17(1995)). 이 연구는 발현양을 높이는 문제는 어느 정도 해결하였지만, B-도메인을 제거하고 A-와 C-도메인을 직접 연결하였기 때문에, 이들 연결부위에 본래의 혈액응고 제 8인자에는 존재하지 않는 아미노산이 포함되어 있어, 정확한 위치에의 스플라이싱(splicing)이 일어나지 않는 경우도 생기게 되고, 이 다른 아미노산의 존재가 항원성을 유도할 수 있다는 문제점을 가지게 되었다.
또한, 혈액응고 제 8인자의 재조합 생산시, 생산 단가를 낮추는 것이 필수적이며, 이를 위해서 배지내에 혈장을 첨가하지 않는 무혈청의 배지 사용이 필수적이다. 그러나, 혈액응고 제 8인자는 혈장내에 존재하는 인자들에 의하여 그의 활성 및 발현양이 크게 좌우되기 때문에, 혈장의 제거시 혈액응고 제 8인자의 발현양 및 활성이 크게 감소한다는 문제가 생기게 된다. 혈장내에 혈액응고 제 8인자를 안정화시키는 것으로 주로 알려진 것이 폰 빌리 브란트 인자이며, 이를 무혈청의 배지에 첨가함으로서 감소된 혈액응고 제 8인자의 발현양 및 활성이 크게 증가하는 것으로 보고되고 있다(참조: Mol. Cell Biol., 9:1233(1989)). 그러나, 폰 빌리 브란트 인자 역시 혈액 유래의 단백이며, 이를 배지내에 첨가하기엔 고가이라는 점에서 한계점이 있었다.
결국, 재조합 방법에 의한 혈액응고 제 8인자의 생산시, 본래 혈액응고 제 8인자에 존재하지 않는 아미노산으로 인한 항원성 문제와 낮은 발현양을 극복함과 동시에, 무혈청의 배지에서 발현양 및 활성을 감소시키지 않는 새로운 생산방법이 당업계에서 절실하게 요구되었다.
이에, 본 발명자들은 전술한 당업계의 요구를 충족시킬 수 있는 재조합 혈액응고 제 8인자의 제조방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 발현량을 높일 목적으로 B-도메인이 제거된 혈액응고 제 8인자의 유전자를 사용하되, A-도메인(중쇄)과 C-도메인(경쇄)을 직접 연결시키는 대신 서로 다른 발현벡터에 도입하여 발현시킴으로서, 발현된 두 개의 도메인이 배지내로 분비된 후 서로 연결되어 활성을 가지는 혈액응고 제 8인자를 형성하고자 하였으며, 이는 두 도메인의 연결을 위해 다른 아미노산을 첨가하지 않았으므로, 이로서 생기는 항원성 문제도 극복하게 된다. 또한, 발현된 혈액응고 제 8인자의 안정화를 위해, 폰 빌리 브란트 인자를 첨가해주는 대신 동일 세포주에서 폰 빌리 브란트 인자까지 재조합 방법으로 생산함으로써, 무혈청 배지에서 전기 세포주를 배양하여 재조합 혈액응고 제 8인자의 생산단가를 크게 절감시킨다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터, 혈액응고 제 8인자의 경쇄 발현벡터, 및 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터 모두로 트랜스펙션되어, 활성을 가지는 혈액응고 제 8인자와 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현시키는 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 세포주를 이용하여 안정화된 재조합 혈액응고 제 8인자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a 내지 1b는 혈액응고 제 8인자의 중쇄를 암호화하는 유전자 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2a 내지 2b는 혈액응고 제 8인자의 경쇄를 암호화하는 유전자 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터인 pCMVFviii-A의 구축과정 을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 4는 혈액응고 제 8인자의 경쇄 발현벡터인 pCMVFviii-C의 구축과정 을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 5a 내지 5b는 폰 빌리 브란트 인자를 암호화하는 유전자 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 6은 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터인 pCMV-vWF의 구축과정을 도 식적으로 나타낸 그림이다.
도 7은 배양시간에 따른 혈액응고 제 8인자의 활성을 나타낸 그래프이 다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 안정화된 재조합 인간 혈액응고 제 8인자의 무혈청 배지에서의 고발현을 위하여, 우선 인간 혈액응고 제 8인자의 A-도메인(중쇄) 유전자를 포함하며 그를 발현시킬 수 있는 벡터 및 C-도메인(경쇄) 유전자를 포함하며 그를 발현시킬 수 있는 벡터를 제조하고, 아울러 폰 빌리 브란트 인자의 유전자를 포함하며 그를 발현시킬 수 있는 벡터를 제조한다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터는 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자가 도입된 pRC-CMV(Invitrogen, USA)의 Not I, Apa I 제한효소 인식부위에 인간 혈액응고 제 8인자의 중쇄 유전자를 도입시킨 벡터 pCMVFviii-A이다. 혈액응고 제 8인자의 경쇄 발현벡터는 DHFR 유전자를 포함하고 있지 않는 플라스미드 pRC-CMV(Invitrogen, USA)의 Hind Ⅲ, Not I 제한효소 인식부위에 인간 혈액응고 제 8인자의 신호서열(signal sequence)과 경쇄 유전자가 연결된 유전자를 도입시킨 벡터 pCMVFviii-C이다. 또한, 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터는 DHFR 유전자가 도입된 pCMV-Zeo 벡터(Invitrogen, USA)의 Hind Ⅲ, Not I 제한효소 인식부위에 인간 폰 빌리 브란트 유전자를 도입시킨 벡터 pCMV-vWF이다.
전술한 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터 및 경쇄 발현벡터들을 DHFR 유전자가 결실된 동물세포주, 바람직하게는 CHO(Chinese Hamster Ovary, DG44) 세포주에 동시에 트랜스펙션시킨 후, 다시 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터로 트랜스펙션시키고, MTX(methotrexate)를 이용한 DHFR 유전자의 증폭에 기초한 방법으로 혈액응고 제 8인자의 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자와, 폰 빌리 브란트 인자의 유전자를 증폭시켜, 적절하게 증폭된 세포주를 선별한다.
이렇게 선별된 세포주를 혈청의 존재 유무에 따른 배양배지에서 배양하여, 발현된 혈액응고 제 8인자의 활성을 조사한 결과, 혈액응고 제 8인자의 생산시 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현시키는 세포주는 혈액응고 제 8인자 활성의 혈청에 대한 의존성이 낮아지므로, 무혈청 배지를 사용한 대량 생산시 바람직하여, 매우 경제적으로 혈액응고 제 8인자를 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:혈액응고 제 8인자 유전자의 증폭 및 클로닝
혈액응고 제 8인자의 신호서열, A1 및 A2 도메인을 포함하는 1∼2280 염기쌍의 중쇄 유전자와, A3, C1 및 C2 도메인을 암호화하는 4768∼7059 염기쌍을 포함하는 경쇄 유전자를 증폭하기 위하여, 사람 간장의 전 RNA(total RNA)로부터 cDNA를 합성한 후 이를 주형 DNA로 하는 RT-PCR(reverse transcriptase)을 다음과 같이 실시하였다.
cDNA를 합성하기 위한 프라이밍 방법으로는 올리고(dT) 프라이밍 방법을 사용하였으며, cDNA 합성은 1차 사슬 cDNA 합성 키트(Clontech, USA)를 사용하였다. 즉, 1ug의 사람 간장의 전 RNA를 에펜돌프 튜브에 넣고 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 증류수를 넣어 12.5ul가 되게 부피를 조절한 후, 1.0ul(20pmol)의 올리고(dT) 프라이머를 첨가하여 70℃에서 2분간 가열하고 얼음에 방치하였다. 이 반응액에 완충용액 4ul, dNTP 1ul, RNase 저해제 1ul 및 역전사효소 1ul를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시켰으며, 이 반응액을 RT-PCR 반응에서 주형 DNA로 사용하였다.
합성된 cDNA로부터 PCR에 의한 방법으로 신호서열, A1 및 A2 도메인을 포함하는 2280 염기쌍의 중쇄 유전자를 증폭하기 위하여, 다음과 같은 프라이머 쌍을 합성하였다:
5'-센스 프라이머: 5'-ATAAGAATGCGGCCGCCCACCATGGAAATAGAGCTCTCCACCTGC-3'; 3'-안티센스 프라이머: 5'-GCTCTAGATCAGCTTCTTGGTTCAATGGCATTGTT-3'.
이들 프라이머는 이후 실험의 클로닝 과정을 용이하게 하기 위하여 각각 제한효소 Not I 및 Xba I의 인식부위를 부가하여 합성하였으며, 3'-안티센스 프라이머에는 종결 코돈을 도입하였다.
아울러, A3, C1 및 C2 도메인과 B-도메인의 일부를 포함하는 2231bp의 경쇄 유전자를 증폭하기 위하여, 다음과 같은 프라이머 쌍을 합성하였다:
5'-센스 프라이머: 5'-CGGGATCCTCTTGCTTGGGATAACCAC-3';
3'-안티센스 프라이머: 5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAGTAGAGGTCCTGTGCCTCGCA-3'. 이들 프라이머에도 각각 제한효소 BamH I과 Not I의 인식부위를 부가하여 합성함으로써 이후 클로닝 실험의 용이함을 도모하였다.
이들 각각의 유전자 단편을 증폭하기 위하여, PCR 시스템(expand long template PCR system, Invitrogen, USA)을 사용하였으며, PCR 반응중의 어닐링 온도는 비특이적 산물을 감소시키기 위하여 65℃에서 실시하였다. PCR 반응후 그 일부 반응액을 전기영동하여 목적하는 유전자들이 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과, 중쇄의 경우 2280bp, 그리고 경쇄의 경우 2313bp 크기의 PCR 산물을 확인할 수 있었으며, 이들 유전자가 사람 간장의 전 RNA로 부터 RT-PCR에 의해 증폭되었음을 확인하였다.
RT-PCR로 증폭시킨 혈액응고 제 8인자의 유전자 단편들은 TA 클로닝 키트(Invitrogen, USA)를 사용하여 서브클로닝하였다. 각 유전자와 TA 클로닝 벡터를 포함하는 연결용 반응액을 제조한 후, 16℃에서 20시간 반응하여 전기 유전자와 벡터를 연결시켰으며, 이를 대장균 DH5a 균주에 도입하였고, 이 형질변이주에서 플라스미드를 분리하여 확인함으로써, 중쇄 및 경쇄 유전자가 도입된 TA 클로닝 벡터로 형질 전환된 대장균 균주를 선별하였다.
실시예 2: 혈액응고 제 8인자 유전자의 DNA 염기서열 분석
실시예 1에서 서브클로닝된 유전자의 염기서열 분석을 위하여, 약 200개의 염기쌍 간격으로 프라이머를 합성하였고, 이를 OPC 컬럼(Perkin Elmer, USA)을 이용하여 정제하였다. 또한, 염기서열 분석에 요구되는 순수한 DNA는 스핀(spin) 컬럼(Qiagen, USA)을 이용하여 분리하였다. 이렇게 분리된 DNA는 시퀘나제(sequenase) 버젼 2.0 키트(Amersham, USA)을 이용하여 유전자 염기서열 분석을 하였다. 가능한 한 프라이머에서부터 근접한 거리의 염기서열부터 알기 위하여, 라벨링 믹스(labling mix)를 1:10으로 희석하여 실온이 아닌 얼음상에서 반응시켰다.
상기와 같이 분석한 혈액응고 제 8인자 중쇄 및 경쇄의 염기서열은 각각 제 도 1a 내지 도 2b에 그로부터 번역되는 아미노산 서열과 함께 나타내었다.
실시예 3: 혈액응고 제 8인자의 중쇄 및 경쇄 발현벡터의 제조
혈액응고 제 8인자의 중쇄를 발현시키기 위한 발현벡터는 도 3에서와 같이 다음의 과정에 따라 실시하였다. TA 클로닝 벡터에 도입되어 있는 중쇄유전자(참조: 실시예 1)를 제한효소 Not I과 Xba I으로 절단하고 아가로스 젤 전기영동하여 분리 및 회수하였고, 이 유전자를 플라스미드 pRC-CMV-dhfr 벡터(Invitrogen, USA)의 cmv 프로모터와 종결인자 사이에 위치하는 다클로닝부위 중 Not I과 Xba I 인식부위 사이에 삽입하였다. 그런 다음, 이 재조합 플라스미드로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시킨 후, 형질 변이주에서 플라스미드를 분리하여 목적하는 발현벡터인 pCMVFⅷ-A를 제조하였다.
한편, 혈액응고 제 8인자의 경쇄를 중쇄와 분리해서 발현시키고, 또 세포내로 분비시키기 위해서는 신호서열을 경쇄 5'앞에 연결시켜야 한다. 이를 위해서, 먼저 혈액응고 제 8인자의 신호서열을 PCR 반응에 의하여 제조하고자 다음과 같은 프라이머 쌍을 합성하였다. 즉, 5'-센스 프라이머는 5'-CCCAAGCTTCCACCATGGAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTT-3'이며, 발현벡터에의 도입을 용이하게 하기 위하여 Hind Ⅲ 인식 부위를 도입하였다. 3'-안티센스 프라이머는 5'-CGGGATCCGTGGCACTAAAGCAGAATCGCAAAAGGCACAGAAAGAAGCAGGT -3'이며, 경쇄의 5'-말단과 연결시키기 위하여 제한효소 BamH I의 인식 부위를 도입하였다.
이들 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 실시함으로써 신호서열을 증폭하였으며, 이를 제한효소 Hind Ⅲ와 BamH I으로 절단하여 경쇄와 연결시킬 신호서열 유전자를 준비하였다.
혈액응고 제 8인자의 경쇄 유전자는 경쇄 유전자를 포함하는 TA 클로닝 벡터(참조: 실시예 1)를 제한효소 BamH I과 Not I으로 절단하고, 아가로스 젤 전기영동함으로써 2.3Kb 크기의 유전자로서 분리 및 회수하였다.
상기에서 준비한 신호서열 및 경쇄 유전자를 플라스미드 pRC-CMV 벡터(Invitrogen, USA)의 cmv 프로모터와 종결인자 사이에 위치하는 다클로닝부위 중 Hind III와 Not I 인식부위 사이에 삽입하였다. 그런 다음, 이 재조합 플라스미드로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시킨 후, 형질 변이주에서 플라스미드를 분리하여 목적하는 발현벡터인 pCMVFⅷ-C를 제조하였다. 이와 같은 혈액응고 제 8인자의 경쇄 발현벡터의 구축과정은 도 4에 나타내었다.
실시예 4: 폰 빌리 브란트 인자의 유전자 염기서열 분석
폰 빌리 브란트 인자(vWF)의 유전자는 pMT2-vWF 벡터(ATCC 67122)를 제한효소 EcoR I으로 절단하여 약 8kb의 vWF 유전자로서 얻었으며, 그의 염기서열 분석을 위하여, 약 200개의 염기쌍 간격으로 프라이머를 합성하였고, 이를 OPC(Perkin Elmer, USA)을 이용하여 정제하였다. 또한, 염기서열 분석에 요구되는 순수한 DNA는 스핀(spin) 컬럼(Qiagen, USA)을 이용하여 분리하였다. 이렇게 분리된 DNA는 시퀘나제(sequenase) 버젼 2.0 키트(Amersham, USA)을 이용하여 유전자 염기서열 분석을 하였다.
상기와 같이 분석한 폰 빌리 브란트 인자의 염기서열은 도 5a 내지 도 5e에 그로부터 번역되는 아미노산 서열과 함께 나타내었다.
실시예 5: 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터의 제조
폰 빌리 브란트 인자를 발현시키기 위한 발현벡터는 도 6에서와 같이 다음의 과정에 따라 실시하였다. 폰 빌리 브란트 인자(vWF)의 유전자가 도입되어 있는 pMT2-vWF 벡터를 제한효소 EcoR I으로 절단하여 8.5kb의 vWF 유전자를 얻었으며, 이를 벡터 pC-DNA1(Invitrogen, USA)의 EcoR I 위치에 도입하여 pCDNA-vWF 벡터를 제조하였다.
그런 다음, 전기 벡터 pCDNA-vWF를 제한효소 Hind Ⅲ 및 Not I으로 절단하여 폰 빌리 브란트 인자의 유전자를 얻었으며, 그를 벡터 pCMV-Zeo-dhfr(Invitrogen, USA)의 Hind Ⅲ와 Not I 인식부위 사이에 삽입시켜 발현벡터 pCMV-vWF를 제조하였다. 그런 다음, 이 재조합 플라스미드로 대장균 DH5a 세포를 형질전환시킨 후, 형질 변이주에서 플라스미드를 분리하여 목적하는 발현벡터인 pCMV-vWF를 제조하였다.
실시예 6: 혈액응고 제 8인자를 생산하는 세포주의 선별
유전자 도입 하루 전에, dhfr 유전가 결실된 CHO(DG44)세포를 T-25 플라스크에 5 x 105개 농도로 계대하여, 10% 우태아 혈청이 포함된 DG44배지(Gibco 11900)에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포 콘플루언시(confluency)가 30∼50% 정도이며 균질하게 분포되어 있는지 확인하고, 리포펙틴 키트(lipofectin kit, Gibco, USA)를 이용하여 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-A 및 경쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-C 5ug씩을 세포내에 동시에 도입하였다. 유전자 도입 후, 37℃, 5% CO2조건에서 6시간 배양한 다음, 배지를 제거하고 새로운 배양용 배지 5ml을 교체하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 96웰 플레이트의 웰당 3 x 103개의 세포가 들어가도록 계대하였다. 발현벡터가 도입된 세포주를 선별하기 위하여, 10% 우태아 혈청이 포함된 α-MEM(Gibco 11900) 배지에 항생제 제네티신(geneticin)을 최종 550ug/ml가 되도록 첨가하고, 그 배지에서 2∼3일 간격으로 배지 교환하면서 배양하였다. 배양 후 7∼14일 사이에 96웰 플레이트의 각 웰에 콜로니가 형성되었으며, 이를 계대 배양하여 각각 2개의 96웰 플레이트로 나눈 후, 한 개는 배양 상청을 준비하여 엘라이자 방법으로 배양 상청에 발현된 혈액응고 제 8인자의 발현양을 조사하고, 다른 한 개는 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide: Thiazolyl blue) 분석을 실시하여 우수한 세포주를 선별하였다.
이와 같이 선별된 생산성이 비교적 높은 세포주에서 혈액응고 제 8인자의 중쇄 및 경쇄 유전자를 증폭시키기 위한 방법으로, MTX(methotrexate)를 이용한 dhfr 유전자의 증폭에 기초한 방법을 사용하였다. 먼저, 10% 우태아 혈청이 포함된 a-MEM 배지에 최종 20nM이 되게 MTX를 첨가한 후, 3일 간격으로 배지를 교환하면서 콜로니 형성을 유도하였다. 이 농도의 MTX에 적응되어 성장 속도를 회복한 세포주의 생산성을 상술한 방법에 의해 조사하여, 혈액응고 제 8인자의 생산성이 증가하는 세포주를 선별하였고, 이를 다시 MTX 농도를 80nM, 320nM, 1uM로 점차적으로 증가시키면서 20nM때와 동일한 방법으로 농도 증가에 따른 생산성의 증가를 나타내는 세포를 선별하였다. 최종적으로 제한 희석(limiting dilution)방법을 사용하여 계대배양하면서 단일세포 수준에서의 세포 생산성을 조사하여, 혈액응고 제 8인자를 생산하는 세포주 A30을 선별하였다.
이렇게 선별된 세포주 A30이 발현하는 혈액응고 제 8인자는 혈액응고 제 8인자 결핍의 혈장을 응고시킬 수 있는 활성 및 활성화된 혈액응고 제 9인자 복합체 반응의 보효소로서의 활성을 가지고 있음을 확인하였으며, 이 세포주의 생산성은 하기 표 1에 나타내었다.
A30 세포주에서의 혈액응고 제 8인자의 생산성
MTX의 농도(uM) 생산성(U/ml/day)
0.00.020.080.321.0 0.0090.050.250.822.07
상기 표 1에서 보듯이, 세포주 A30에 의한 혈액응고 제 8인자의 생산성은 MTX 농도 증가에 따른 적응 결과 약 200배 정도의 활성 증가를 나타내어, 혈액응고 제 8인자의 중쇄 및 경쇄 유전자가 안정하게 증폭됨을 알 수 있었다.
한편, 혈액응고 제 8인자의 안정화에 기여하는 폰 빌리 브란트 인자의 필요성을 알아보기 위하여, 무혈청 배지와 2.5ug/ml의 폰 빌리 브란트 인자가 포함된 무혈청 배지를 사용하여 세포주 A30을 배양하고, 그 배양액중의 혈액 응고 제 8인자의 활성을 조사하였다. 무혈청 배지에서의 활성은 0.2u/ml이었고, 폰 빌리 브란트 인자를 첨가한 배지에서는 1.4u/ml로, 10% 혈청을 첨가한 배지의 활성인 1.9u/ml에 근접할 정도로 활성이 증가하였다. 이 결과로부터, 혈액응고 제 8인자의 생산시 폰 빌리 브란트 인자를 공급해 줄 수 있는 방법이 필요함을 알 수 있었다.
실시예 7: 혈액응고 제 8인자 및 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 생산하는 세포주의 선별
혈액응고 제 8인자의 발현시 안정화에 기여하는 폰 빌리 브란트 인자와 함께 발현하면, 무혈청 배지에서의 재조합 세포주 배양시 안정화에 따른 혈액응고 제 8인자의 활성이 증가하므로, 한 세포주에서 두가지 단백질을 함께 발현하는 세포주를 선별하고자 하였다. 이 세포주를 선별하기 위한 방법중, 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-A, 경쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-C 및 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터 pCMV-vWF, 이들 3가지를 한 세포주에 동시에 트랜스펙션시키는 방법을 시도하였다.
즉, 리포펙틴 방법으로 각각 5ug의 벡터 3가지를 도입하여, 목적하는 발현벡터가 모두 들어간 세포주를 얻고자 하였다. 이를 위하여, 형질전환된 세포중 항생제 제네티신과 제오신(zeocin)을 포함하는 배지에서 성장하는 세포를 선별하고자 하였다. 그 결과, 3가지 발현벡터가 모두 도입된 세포주를 얻는 효율이 매우 떨어졌으며, 또한 MTX에 의한 증폭시 3가지 유전자가 모두 안정적으로 증폭되는 세포를 선별하지 못하였다.
그러므로, 두 가지 단백질을 동시에 발현하는 세포주를 선별하는 효율을 높이기 위해서, 실시예 6에서 선별된 혈액응고 제 8인자를 생산하는 세포주에, 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터 pCMV-vWF를 다시 도입하여, 혈액응고 제 8인자 및 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 세포주를 선별하고자 하였다. 1uM MTX에 적응되어 있는 세포주에 도입시, MTX에 의한 vWF 유전자의 증폭 효과를 얻을 수 없으므로, MTX 초기 농도인 20nM에 적응된 후 동결 보관되어 있는 혈액응고 제 8인자를 생산하는 세포주(A30)를 트랜스펙션에 사용하였다. 이 세포주는 1uM MTX 농도에 이르기까지 안정하게 혈액응고 제 8인자의 발현이 증폭되었으므로, vWF 도입시 두 단백질을 동시에 발현하는 세포주를 선별할 확률이 높일 수 있으리라 생각되어진다.
유전자 도입 하루 전에, 20nM MTX에 적응되어 있는 세포주 A30을 T-25 플라스크에 5 x 105개 농도로 계대하여, 10% 우태아 혈청 및 20nM MTX(최종 농도)가 포함된 a-MEM 배지(Gibco 11900)에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포 콘플루언시(confluency)가 30∼50% 정도이며 균질하게 분포되어 있는지 확인하고, 리포펙틴 키트(lipofectin kit, Gibco, USA)를 이용하여 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터 pCMV-vWF 5ug을 세포내에 도입하였다.
유전자 도입 후, 37℃, 5% CO2조건에서 6시간 배양한 다음, 배지를 제거하고 새로운 배양용 배지 5ml을 교체하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 96웰 플레이트의 웰당 3 x 103개의 세포가 들어가도록 계대하였다.
발현벡터 pCMV-vWF가 도입된 세포주를 선별하기 위하여, 10% 우태아 혈청이 포함된 α-MEM(Gibco 11900) 배지에 항생제 제오신을 최종 250ug/ml이 되게 첨가하고, 그 배지에서 2∼3일 간격으로 배지 교환하면서 배양하였다. 배양 후 10일 경에, 제오신에 저항성을 나타내는 콜로니가 96웰 플레이트의 각 웰에 형성되어 성장하기 시작하였다. 이를 계대 배양하여 각각 2개의 96웰 플레이트로 나눈 후, 한 개는 배양 상청을 준비하여 엘라이자 방법으로 배양 상청에 발현된 폰 빌리 브란트 인자의 발현양을 조사하고, 다른 한 개는 MTT 분석을 실시하여 우수한 세포주를 선별하였다. 이들 세포주는 약 200∼500ng/ml의 폰 빌리 브란트 인자를 발현함을 알 수 있었다.
선별된 폰 빌리 브란트 인자를 생산하는 세포주 중 혈액응고 제 8인자도 계속 생산하는 세포주를 선별하기 위하여, 응고활성 분석(coagulation activity assay)으로 혈액응고 제 8인자의 활성을 조사하였으며, 이들 중 두가지 단백을 모두 생산하면서 그들의 생산성이 높은 세포주를 선별하였다. 폰 빌리 브란트 인자를 발현하는 세포주 중, 대부분은 혈액응고 제 8인자를 발현하고 있었으며, 혈액응고 제 8인자의 생산성은 0.2∼1u/ml로 폰 빌리 브란트 인자가 도입되지 않은 세포주 A30에 비해, 최고 20배 정도 높은 생산성을 나타내는 세포주를 선별할 수 있었다.
도입된 목적하는 유전자를 증폭시키기 위한 방법으로 MTX에 기초한 방법을 사용하였다. 먼저, 전기한 동일 배지에 최종 80nM이 되게 MTX를 첨가한 후, 3일 간격으로 배지를 교환하면서 콜로니 형성을 유도하였다. 이 농도의 MTX에 적응되어 성장 속도를 회복한 세포주의 생산성을 상술한 방법에 의해 조사하여, 두 단백의 생산성이 증가하는 세포주를 선별하였고, 이를 다시 MTX 농도를 320nM, 1uM로 점차적으로 증가시키면서 80nM때와 동일한 방법으로 농도 증가에 따른 생산성의 증가를 나타내는 세포를 선별하였다. 최종적으로 제한 희석(limiting dilution)방법을 사용하여 계대배양하면서 단일세포 수준에서의 세포 생산성을 조사하여, 혈액응고 제 8인자 및 폰 빌리 브란트 인자를 생산하는 세포주 V88을 선별하였다. 이 세포주의 혈액응고 제 8인자의 생산성은 하기 표 2에 나타내었다.
V88 세포주에서의 혈액응고 제 8인자의 생산성
MTX의 농도(uM) 생산성(U/ml/day)
0.020.080.321.0 0.31.23.074.97
이와 같이 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-A, 경쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-C 및 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터 pCMV-vWF 모두를 포함하고 있는 상기 세포주 V88은 V88로 명명되어 1998년 1월 6일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0421BP로 기탁하였다.
실시예 8: A30 및 V88 세포주의 혈액응고 제 8인자의 발현 및 안정화에 미치 는 우태아 혈청의 영향
혈액응고 제 8인자의 발현 및 활성은 혈청의 존재 유무에 따라 현저하게 증가되거나 감소되는 영향을 받는다. 혈액응고 제 8인자 생산 세포주인 A30 세포주 및 혈액응고 제 8인자 및 폰 빌리 브란트 인자 동시 발현 세포주인 V88 세포주에서, 혈청의 존재 유무에 따른 혈액응고 제 8인자의 활성을 조사하였다. T-25 플라스크에 5 x 105개의 세포를 계대하여 하루 배양하고, 무혈청 배지에 각각 다른 농도의 혈청을 첨가한 배지로 교환한 다음, 24시간 후에 두 세포주에서 발현된 혈액응고 제 8인자의 활성을 조사하였다(참조: 표 3).
혈액응고 제 8인자의 생산 및 활성에 미치는 혈청의 영향
배지 혈액응고 제 8인자의 생산성(mU/ml/day)
세포주 A30 세포주 V88
무혈청 배지 + 20% 우태아 혈청무혈청 배지 + 10% 우태아 혈청무혈청 배지 + 5% 우태아 혈청무혈청 배지 + 2.5% 우태아 혈청무혈청 배지 + 1.25% 우태아 혈청무혈청 배지 + 0.06% 우태아 혈청무혈청 배지 312019251020400250200189 5120501249004500400034003015
상기 표 3에서 보듯이, 혈액응고 제 8인자만 생산하는 세포주인 A30에서 혈액응고 제 8인자의 활성은 혈청 농도가 감소함에 따라 그 활성이 크게 감소하는 경향을 보였으며, 혈청을 첨가하지 않은 배지에서의 활성은 10% 혈청 첨가시 보다 약 10배 이상 감소하는 것으로 보아, 이 세포주에서는 혈액응고 제 8인자의 생산시 혈청에 대한 의존도가 높음을 알 수 있었다. 반면, 혈액응고 제 8인자와 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 세포주인 V88은 혈청 농도에 따른 활성 변화가 A30 세포주에 비해 크지 않음을 알 수 있으며, 또한 무혈청 배지에서의 생산성도 A30 세포주에 비해 약 15배 이상 증가함을 알 수 있었다. 따라서, 혈액응고 제 8인자의 생산시 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현시키는 세포주를 이용하는 것이 혈청에 대한 의존성이 낮아지므로, 무혈청 배지를 사용한 대량 생산시 바람직함을 알 수 있었다.
실시예 9: 배양시간에 따른 혈액응고 제 8인자의 활성
세포주 V88에서 혈액응고 제 8인자와 폰 빌리 브란트 인자의 동시 발현시, 배양시간에 따른 혈액응고 제 8인자의 활성을 조사하기 위하여, 혈액응고 제 8인자만을 발현하는 세포주 A30과 비교하여 배양시간에 따른 활성 변화를 조사하였다.
즉, T-25 플라스크에 5 x 105개의 A30 및 V88 세포주를 계대하여 하루 배양한 후, 무혈청 배지 및 무혈청 배지에 10% 우태아 혈청을 첨가한 배지 5ml로 교환하고, 배지 교환 3일 동안 24시간 간격으로 각 플라스크 배양액의 혈액응고 제 8인자의 활성을 조사하였다(참조: 도 7).
도 7에서 보듯이, 혈액응고 제 8인자만을 발현하는 세포주 A30은 무혈청 및 10% 우태아 혈청이 포함된 배지에서 24시간 배양시, 각각 최대 1.9u/ml 및 0.2u/ml의 활성을 나타내었으며, 그 이후로는 활성이 점차 감소하였다. 반면, 폰 빌리 브란트 인자도 동시에 발현하는 세포주 V88의 경우, 24시간 배양이후에도 3일째까지 안정하게 활성이 축적되었으며, 10% 우태아 혈청이 포함된 배지에서는 3일째 30u/ml 그리고 무혈청 배지에서는 3일째 9.5 u/ml의 활성을 나타내었다.
실시예 10: 혈액응고 제 8인자 및 폰 빌리 브란트 인자의 웨스턴 블롯
세포주 V88을 무혈청 배지에서 2일간 배양한 후 배양액 내에 발현된 혈액응고 제 8인자 및 폰 빌리 브란트 인자의 단백질을 웨스턴 블롯으로 확인하고자 하였다. 우선, 10% SDS-PAGE을 이용하여 배양액 40ul를 전기영동하였고, 이를 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후, 5% 스킴 밀크(skim milk) 용액으로 처리하였다. 이 막에 흡착된 혈액응고 제 8인자를 확인하기 위하여, HRP(horse radish peroxidase)가 결합되어 있는 다클론항체, 및 알칼라인 포스파타제가 결합되어 있는 경쇄-특이적인 단일클론항체를 사용하였고, 각 효소의 기질 용액을 첨가하여 발색시킴으로서, 혈액응고 제 8인자를 확인하고자 하였다. 상기 웨스턴 불롯팅 결과, 다클론항체를 사용하였을 경우, 분자량 90,000의 중쇄 및 80,000의 경쇄를 확인할 수 있었다. 또한, 경쇄에 특이적인 단일클론항체를 사용하였을 경우, 분자량 80,000의 밴드를 확인할 수 있었는 바, 이로써 V88 세포주 배양액내의 발현된 혈액응고 제 8인자를 확인하였다.
폰 빌리 브란트 인자의 경우, 동일한 방법으로 10% SDS-PAGE하고 니트로셀룰로스 막으로 옮긴 후, 폰 빌리 브란트인자에 특이적인 항체를 이용하여 발색을 실시하였다. 그 결과, 분자량 약 200,000 이상되는 위치에서 pro-vWF 및 성숙 vWF 밴드를 확인하였다.
이상의 결과로부터, 세포주 V88은 혈액응고 제 8인자 및 이를 안정화시키는 폰 빌리 브란트 인자를 생산함을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 혈액응고 제 8인자의 중쇄 발현벡터, 혈액응고 제 8인자의 경쇄 발현벡터, 폰 빌리 브란트 인자의 발현벡터3가지 모두로 트랜스펙션되어, 혈액응고 제 8인자와 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 본 발명의 세포주 및 그를 이용한 재조합 혈액응고 제 8인자의 제조방법은 생체의 혈액응고 제 8인자에 존재하는 아미노산만으로 이루어진 혈액응고 제 8인자를 발현하므로 타 아미노산으로 인한 항원성 문제에 대한 염려가 없으며, 또한 혈액응고 제 8인자의 활성과 발현양 증가에 영향을 주는 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하므로, 무혈청 배지에서도 활성이 있는 혈액응고 제 8인자의 고발현을 이루어 생산단가를 크게 절감시킨다.

Claims (4)

  1. 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 중쇄 발현벡터, 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 경쇄 발현벡터, 및 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)의 발현벡터로 트랜스펙션(cotransfection)되어, 혈액응고 제 8인자의 중쇄와 경쇄, 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 동물세포주.
  2. 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 중쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-A, 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 경쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-C, 및 폰 빌리 브란트인자(von Willebrand factor)의 발현벡터 pCMV-vWF로 트랜스펙션(cotransfection)되어, 혈액응고 제 8인자의 중쇄와 경쇄, 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주 V88(KCTC 0421BP).
  3. 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 중쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-A 및 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 경쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-C로 동시에 트랜스펙션(cotransfection)되어, 혈액응고 제 8인자의 중쇄와 경쇄를 동시에 발현하는CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주 A30.
  4. (i) 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 중쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-A 및 인간 혈액응고 제 8인자(Factor Ⅷ)의 경쇄 발현벡터 pCMVFⅷ-C로 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주를 동시에 트랜스펙션(cotransfection)시켜, 혈액응고 제 8인자의 중쇄와 경쇄를 동시에 발현하는 재조합 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주 A30을 제조하는 단계;
    (ii) 전기 재조합 CHO 세포주 A30을 폰 빌리 브란트 인자(von Willebrand factor)의 발현벡터 pCMV-vWF로 다시 트랜스펙션시켜, 혈액응고 제 8인자의 중쇄와 경쇄, 폰 빌리 브란트 인자를 동시에 발현하는 재조합 CHO 세포주 V88(KCTC 0421BP)을 제조하는 단계;
    (iii) 전기 재조합 CHO 세포주 A30 또는 재조합 CHO 세포주 V88(KCTC 0421BP)을 MTX(methotrexate)로 적응시켜 목적 유전자를 증폭시키는 단계; 및,
    (iv) 전기 MTX(methotrexate)로 적응된 재조합 CHO 세포주 A30 또는 재 조합 CHO 세포주 V88(KCTC 0421BP)을 무혈청의 배지 혹은 혈청이 포함된 배지에서 배양하여, 인간 혈액응고 제 8인자를 수득하는 단계를 포함하는
    재조합 혈액응고 제 8인자의 제조방법.
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