TW202323274A - 優化因子viii基因 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了密碼子優化的因子VIII序列，包含密碼子優化的因子VIII序列的載體和宿主細胞，由密碼子優化的因子VIII序列編碼的多肽，以及產生此類多肽的方法。

Description

優化因子VIII基因
本揭露提供了密碼子優化的因子VIII序列，包含密碼子優化的因子VIII序列的載體和宿主細胞，由密碼子優化的因子VIII序列編碼的多肽，以及產生此類多肽的方法。
向患者提供低成本重組FVIII蛋白的主要障礙是商業生產的高成本。FVIII蛋白在異源表現系統中表現差，比類似大小的蛋白低2至3個數量級。（Lynch等人, Hum. Gene. Ther.; 4:259–72 (1993)。FVIII的不良表現部分是由於在FVIII編碼序列中存在抑制FVIII表現的順式作用元件，如轉錄沈默元件（Hoeben等人, Blood85:2447-2454 (1995)）、基質附著樣序列（MAR）（Fallux等人, Mol. Cell. Biol.16:4264-4272 (1996)）和轉錄延伸抑制元件（Koeberl等人, Hum. Gene. Ther.; 6:469-479 (1995)）。
因此，本領域需要在異源系統中高效表現的FVIII序列。
公開了編碼具有FVIII活性的多肽的經密碼子優化的核酸分子。
在某些方面，本文公開了包含與SEQ ID NO: 9至少85%相同的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII（FVIII）活性的多肽。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 9至少90%相同。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 9至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 9至少50%相同。
本文還公開了包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII活性的多肽。
本文還公開了包含與SEQ ID NO: 9的核苷酸58-4824至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的核苷酸序列的分離的核酸分子。在一些實施例中，分離的核酸分子包含SEQ ID NO: 9的核苷酸58-4824。
在某些方面，本文公開了包含與SEQ ID NO: 33至少85%相同的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII（FVIII）活性的多肽。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 33至少90%相同。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 33至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 33至少50%相同。
在一些實施例中，本文公開的分離的核酸分子還包含編碼信號肽的核苷酸序列。在一些實施例中，編碼信號肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文公開的分離的核酸分子被密碼子優化為含有與SEQ ID NO: 32相比更少的CpG模體。在一些實施例中，本文公開的分離的核酸分子相對於SEQ ID NO: 32缺失一個或多個CpG模體。
在另一態樣，本文公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含與SEQ ID NO: 14至少90%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含與SEQ ID NO: 14至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 14至少50%相同。
本文還公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。
在另一態樣，本文公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少85%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少90%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 35至少50%相同。
本文還公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
在另一態樣，本文公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，所述基因匣包含：編碼FVIII蛋白的核苷酸序列，其包含與SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 33至少85%相同的核酸序列；控制所述核苷酸序列轉錄的啟動子，和轉錄終止序列。
在一些實施例中，啟動子是肝特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子是小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。在一些實施例中，啟動子是mTTR482啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 16的核苷酸序列。
在一些實施例中，轉錄終止序列是多腺苷酸化（polyA）序列。在一些實施例中，轉錄終止序列是牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號序列。在一些實施例中，轉錄終止序列包含SEQ ID NO: 19的核苷酸序列。
在一些實施例中，分離的核酸分子還包含增強子元件。在一些實施例中，增強子元件是A1MB2增強子元件。在一些實施例中，A1MB2增強子元件包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列。
在一些實施例中，分離的核酸分子還包含內含子序列。在一些實施例中，內含子序列是嵌合內含子、雜合內含子或合成內含子。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。
在一些實施例中，分離的核酸分子還包含轉錄後調節元件。在一些實施例中，轉錄後調節元件包含土撥鼠轉錄後調節元件（Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element，WPRE）。在一些實施例中，WPRE包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列。
在另一態樣，本文公開了分離的核酸分子，其包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣，位於基因匣兩側的第一反向末端重複序列（ITR）和第二ITR。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自病毒科細小病毒科的成員。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自人博卡病毒（HBoV1）、人紅病毒（B19）、鵝細小病毒（GPV）或其變體。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含與SEQ ID NO: 1、2或21-30至少約75%相同的多核苷酸序列。在一些實施例中，第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約75%相同的多核苷酸序列，並且第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約75%相同的多核苷酸序列。在一些實施例中，第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約50%相同的多核苷酸序列，並且第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約50%相同的多核苷酸序列。在一些實施例中，第一ITR包含SEQ ID NO: 1的多核苷酸序列，並且第二ITR包含SEQ ID NO: 2的多核苷酸序列。
在另一態樣，本文公開了包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣從5'至3'包含：包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列的A1MB2增強子元件，包含SEQ ID NO: 16的核苷酸序列的肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子（mTTR），包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列的嵌合內含子，編碼FVIII蛋白的核苷酸序列（其包含與SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 33至少85%相同的核酸序列）；土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE），其包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列；和包含SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號。
在另一態樣，本文公開了包含本文公開的核酸分子的載體。
在另一態樣，本文公開了包含本文公開的核酸分子的宿主細胞。本文還公開了由宿主細胞產生的多肽。在一些實施例中，宿主細胞是昆蟲細胞。
在另一態樣，本文公開了用於產生本文公開的核酸分子的桿狀病毒系統。在一些方面，核酸分子在昆蟲細胞中產生。
在另一態樣，本文公開了包含本文公開的核酸分子的醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含含有本文公開的核酸分子的載體。在一些實施例中，醫藥組合物還包含醫藥上可接受的賦形劑。
在另一態樣，本文公開了套組，其包含本文公開的核酸分子和用於向有需要的個體投予核酸分子的說明書。
在另一態樣，本文公開了產生具有FVIII活性的多肽的方法，其包括：在產生具有FVIII活性的多肽的條件下培養本文公開的宿主細胞，以及回收具有FVIII活性的多肽。
在另一態樣，本文公開了增加個體中具有FVIII活性的多肽的表現的方法，所述方法包括投予包含與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列的核酸分子。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
在另一態樣，本文公開了治療個體的出血病症的方法，所述方法包括投予包含與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列的核酸分子。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
在另一態樣，本文公開了治療個體的出血病症的方法，所述方法包括投予包含與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列的醫藥組合物。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
在另一態樣，本文公開了治療個體的血友病A的方法，所述方法包括投予包含與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列的醫藥組合物。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
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本揭露描述了編碼具有因子VIII（FVIII）活性的多肽的經密碼子優化的基因。本揭露涉及編碼具有因子VIII活性的多肽的經密碼子優化的核酸分子、包含優化的核酸分子的載體和宿主細胞、由優化的核酸分子編碼的多肽、以及產生此類多肽的方法。本揭露還涉及治療出血病症如血友病的方法，其包括向個體投予優化的因子VIII核酸序列、包含所述優化的核酸序列的載體或由所述優化的核酸序列編碼的多肽。
本揭露通過提供優化的FVIII序列來滿足本領域的重要需求，所述優化的FVIII序列展現出在宿主細胞中表現增加，在產生重組FVIII的方法中提高FVIII蛋白產率，以及當用於基因治療方法中時潛在地導致更大的治療功效。在某些實施例中，本揭露描述了包含與SEQ ID NO: 9的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列的分離的核酸分子。在某些實施例中，本揭露描述了包含與SEQ ID NO: 33的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列的分離的核酸分子。在某些實施例中，本揭露描述了包含與SEQ ID NO: 14的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列的分離的核酸分子。在某些實施例中，本揭露描述了包含與SEQ ID NO: 35的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列的分離的核酸分子。在一些實施例中，基因匣還包含編碼XTEN多肽的核苷酸序列。
為了提供對說明書和申請專利範圍的清晰理解，下文提供了以下定義。 定義
應注意，術語“一個/一種（a）”或“一個/一種（an）”實體是指一個/一種或多個/多種所述實體：例如，“一個核苷酸序列”應理解為代表一個或多個核苷酸序列。因此，術語“一個/一種（a）”（或“一個/一種（an）”）、“一個/一種或多個/多種”和“至少一個/一種”在本文中可互換使用。
術語“約”在本文中用於意指大約、大致、大概或在……左右。在術語“約”結合數字範圍使用時，其通過擴展所述數值上下的邊界來修飾所述範圍。通常，術語“約”在本文中用於向上或向下（較高或較低）以10%的差異修飾高於和低於所述值的數值。
出於本揭露的目的，術語“分離的”是指已經從其原始環境（其自然存在的環境）中移除的生物材料（細胞、多肽、多核苷酸或其片段、變體或衍生物）。例如，在植物或動物中以自然狀態存在的多核苷酸不是分離的，然而從其自然存在的相鄰核酸分離的同一多核苷酸被認為是“分離的”。不要求具體純化水平。出於本揭露的目的，重組產生的多肽和宿主細胞中表現的蛋白質被視為是分離的，已經通過任何適當的技術分離、分層或部分或基本上純化的天然或重組多肽亦是如此。
“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，並且是指呈單股形式或雙股螺旋的核糖核苷（腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”）或去氧核糖核苷（去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷或去氧胞苷；“DNA分子”）的磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯和硫代酸酯。雙股DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術語核酸分子、特別是DNA或RNA分子僅僅是指分子的一級和二級結構，並且不將其限制為任何特定三級形式。因此，這個術語包括尤其在線性或環狀DNA分子（例如，限制性片段）、質體、超螺旋化DNA和染色體中發現的雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子的結構時，在本文中可以根據常規習慣描述序列，僅沿DNA的非轉錄鏈（即，具有與mRNA同源的序列的鏈）以5’至3’方向給出序列。“重組DNA分子”是已經經歷分子生物學操縱的DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、合成DNA和半合成DNA。本揭露的“核酸組合物”包含如本文所述的一種或多種核酸。
如本文所用，“編碼區”或“編碼序列”是多核苷酸中由可轉譯成胺基酸的密碼子組成的部分。雖然“終止密碼子”（TAG、TGA或TAA）通常不轉譯成胺基酸，但是可以認為其是編碼區的一部分，但是任何側接序列（例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子等）不是編碼區的一部分。編碼區的邊界通常由5’末端的起始密碼子（編碼所得多肽的胺基末端）和3’末端的轉譯終止密碼子（編碼所得多肽的羧基末端）來決定。兩個或更多個編碼區可以存在於單一多核苷酸構築體中（例如，在單一載體上），或者存在於單獨的多核苷酸構築體中（例如，在單獨的（不同的）載體上）。然後，結果就是單一載體可以僅含有單個編碼區，或者包含兩個或更多個編碼區。
哺乳動物細胞分泌的某些蛋白質與分泌信號肽相關，一旦生長中的蛋白質鏈跨越糙面內質網的輸出已經起始，所述分泌信號肽便從成熟蛋白質被切割下來。一般熟習此項技術者知道，信號肽通常融合至多肽的N末端，並且從完整或“全長”多肽被切割下來以產生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些實施例中，天然信號肽或該序列的保留了指導多肽分泌的能力的功能衍生物與所述多肽可操作地締合。可替代地，可以使用異源哺乳動物信號肽（例如，人組織纖溶酶原啟動物（TPA）或小鼠ß-葡糖醛酸糖苷酶信號肽）或其功能衍生物。
術語“下游”是指核苷酸序列位於參考核苷酸序列的3’。在某些實施例中，下游核苷酸序列是指轉錄起點之後的序列。例如，基因的轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點的下游。
術語“上游”是指核苷酸序列位於參考核苷酸序列的5’。在某些實施例中，上游核苷酸序列是指位於編碼區或轉錄起點的5’側的序列。例如，大多數啟動子位於轉錄起始位點的上游。
如本文所用，術語“基因匣”是指能夠指導特定多核苷酸序列在適當宿主細胞中表現的DNA序列，其包含與目的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子。基因匣可以涵蓋位於編碼區上游（5’非編碼序列）、內部或下游（3’非編碼序列），且影響相關編碼區的轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯的核苷酸序列。如果意圖在真核細胞中表現編碼區，則多腺苷酸化信號和轉錄終止序列通常將位於編碼序列的3'。在一些實施例中，基因匣包含編碼基因產物的多核苷酸。在一些實施例中，基因匣包含編碼miRNA的多核苷酸。在一些實施例中，基因匣包含異源多核苷酸序列。編碼產物（例如，miRNA或基因產物（例如，多肽，如治療性蛋白質））的多核苷酸可以包括與一個或多個編碼區可操作地締合的啟動子和/或其他表現（例如，轉錄或轉譯）控制序列。在可操作締合中，以將基因產物的表現置於一個或多個調節區的影響或控制下的方式將基因產物（例如，多肽）的編碼區與所述一個或多個調節區締合。例如，如果啟動子功能的誘導引起編碼由編碼區所編碼的基因產物的mRNA的轉錄，並且如果啟動子與編碼區之間的連接的性質不干擾啟動子指導基因產物表現的能力或者不干擾DNA模板被轉錄的能力，則編碼區和啟動子“可操作地締合”。除了啟動子以外的其他表現控制序列（例如，增強子、操縱子、阻遏物和轉錄終止信號）也可以與編碼區可操作地締合以指導基因產物表現。
“表現控制序列”是指提供編碼序列在宿主細胞中的表現的調節核苷酸序列，如啟動子、增強子、終止子等。表現控制序列通常涵蓋有助於與其可操作地連接的編碼核酸的有效轉錄和轉譯的任何調節核苷酸序列。表現控制序列的非限制性例子包括啟動子、增強子、轉譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點或莖環結構。多種表現控制序列是熟習此項技術者已知的。這些包括而不限於在脊椎動物細胞中起作用的表現控制序列，如但不限於來自巨細胞病毒的啟動子和增強子片段（即時早期啟動子，與內含子A結合）、猿猴病毒40（早期啟動子）和反轉錄病毒（如勞斯肉瘤病毒）。其他表現控制序列包括衍生自脊椎動物基因的那些，如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔β珠蛋白，以及能夠控制真核細胞中基因表現的其他序列。另外的合適的表現控制序列包括組織特異性啟動子和增強子以及淋巴因子誘導型啟動子（例如可由干擾素或白細胞介素誘導的啟動子）。其他表現控制序列包括內含子序列、轉錄後調節元件和多腺苷酸化信號。在本揭露的其他地方討論了另外的例示性表現控制序列。
類似地，多種轉譯控制元件是一般熟習此項技術者已知的。這些轉譯控制元件包括但不限於核糖體結合位點、轉譯起始和終止密碼子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件（特別是內部核糖體進入位點，或IRES）。
如本文所用的術語“表現”是指多核苷酸產生基因產物（例如RNA或多肽）的過程。它包括而不限於將多核苷酸轉錄成信使RNA（mRNA）、轉移RNA（tRNA）、小髮夾RNA（shRNA）、小干擾RNA（siRNA）或任何其他RNA產物以及將mRNA轉譯為多肽。表現產生“基因產物”。如本文所用，基因產物可以是核酸，例如通過基因轉錄產生的信使RNA，或者是從轉錄物轉譯的多肽。本文描述的基因產物還包括經過轉錄後修飾（例如多腺苷酸化或剪接）的核酸，或經過轉譯後修飾（例如甲基化、糖基化、脂質的添加、與其他蛋白質亞基締合或蛋白水解切割）的多肽。如本文所用，術語“產量”是指通過基因表現產生的多肽的量。
“載體”是指用於將核酸選殖和/或轉移至宿主細胞中的任何媒劑。載體可以是複製子，另一核酸區段可以與其連接以實現所連接區段的複製。“複製子”是指在體內起自主複製單元的作用（即，能夠在其自身控制下複製）的任何基因元件（例如，質體、噬菌體、粘粒、染色體、病毒）。術語“載體”包括用於體外、離體或體內將核酸引入細胞中的病毒媒劑和非病毒媒劑。很多載體是本領域已知和使用的，包括例如質體、經修飾的真核病毒或經修飾的細菌病毒。通過將適當的多核苷酸片段連接到具有互補粘性末端的選擇載體中，可以實現將多核苷酸插入合適的載體中。
可以對載體進行工程化以編碼選擇性標記或報導子，其提供對已經摻入了載體的細胞的選擇或鑒定。選擇性標記或報導子的表現允許鑒定和/或選擇摻入了並表現含於載體上的其他編碼區的宿主細胞。本領域中已知並使用的選擇性標記基因的例子包括：提供針對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺磷除草劑、磺醯胺等的抗性的基因；和用作表型標記的基因，即花色苷調節基因、異戊烷基轉移酶基因等。本領域中已知並使用的報導子的例子包括：螢光素酶（Luc）、綠色螢光蛋白（GFP）、氯黴素乙醯轉移酶（CAT）、β-半乳糖苷酶（LacZ）、β-葡糖醛酸糖苷酶（Gus）等。還可以將選擇性標記視為報導子。
術語“選擇性標記”是指能夠基於標記基因的效應（即，對抗生素的抗性、對除草劑的抗性、比色標記、酶、螢光標記等）加以選擇的鑒定因子（通常是抗生素或化學抗性基因），其中所述效應用於跟蹤目的核酸的遺傳和/或鑒定已經遺傳目的核酸的細胞或生物體。本領域中已知並使用的選擇性標記基因的例子包括：提供針對胺苄青黴素、鏈黴素、健他黴素、康黴素、潮黴素、雙丙胺磷除草劑、磺醯胺等的抗性的基因；和用作表型標記的基因，即花色苷調節基因、異戊烷基轉移酶基因等。
術語“報導基因”是指編碼能夠基於報導基因的效應加以鑒定的鑒定因子的核酸，其中所述效應用於跟蹤目的核酸的遺傳性、鑒定已經遺傳目的核酸的細胞或生物體和/或測量基因表現誘導或轉錄。本領域中已知並使用的報導基因的例子包括：螢光素酶（Luc）、綠色螢光蛋白（GFP）、氯黴素乙醯轉移酶（CAT）、β-半乳糖苷酶（LacZ）、β-葡糖醛酸糖苷酶（Gus）等。也可以將選擇性標記基因視為報導基因。
“啟動子”與“啟動子序列”可互換使用並且是指能夠控制編碼序列或功能RNA的表現的DNA序列。通常，編碼序列位於啟動子序列的3'。啟動子可以整體衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界中發現的不同啟動子的不同元件構成，或者甚至包含合成DNA區段。熟習此項技術者應理解，不同的啟動子可以指導基因在不同組織或細胞類型中、或在不同發育階段、或回應不同環境或生理條件而表現。使基因在大多數細胞類型中在大多數時間表現的啟動子一般被稱為“構成型啟動子”。使基因在特定細胞類型中表現的啟動子一般被稱為“細胞特異性啟動子”或“組織特異性啟動子”。使基因在發育或細胞分化的特定階段表現的啟動子一般被稱為“發育特異性啟動子”或“細胞分化特異性啟動子”。在用誘導啟動子的試劑、生物分子、化學品、配體、光等暴露或處理細胞後被誘導並且使基因表現的啟動子一般被稱為“誘導型啟動子”或“可調型啟動子”。還認識到，由於在大多數情況下，尚未完全界定調節序列的確切邊界，所以不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。在本揭露的其他地方討論了另外的例示性啟動子。
啟動子序列通常在其3’末端以轉錄起始位點為界，並向上游（5’方向）延伸以包括以高於背景的可檢測水平起始轉錄所必需的最小數目的鹼基或元件。在啟動子序列內將發現轉錄起始位點（例如通過用核酸酶S1標示（mapping）方便地界定）以及負責RNA聚合酶的結合的蛋白質結合結構域（共有序列）。
術語“質體”是指染色體外元件，其通常攜帶不是細胞中心代謝的一部分的基因，並且通常是環狀雙股DNA分子的形式。此類元件可以是衍生自任何來源的單股或雙股DNA或RNA的線性、環狀或超螺旋化的自主複製序列、基因體整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中多個核苷酸序列已經接合或重組至獨特構築體中，所述構築體能夠將用於所選基因產物的啟動子片段和DNA序列以及適當的3'非轉譯序列引入細胞中。
可以使用的真核病毒載體包括但不限於腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒（例如，痘苗病毒載體）、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電脂質（細胞轉染劑）、DNA-蛋白質複合物和生物聚合物。
“選殖載體”是指“複製子”，其是單位長度的連續複製的核酸並且其包含複製起點，如質體、噬菌體或粘粒，另一核酸區段可以與所述複製子連接以實現所連接區段的複製。某些選殖載體能夠在一種細胞類型（例如，細菌）中複製，並在另一細胞類型（例如，真核細胞）中表現。選殖載體通常包含一個或多個可以用於選擇包含載體的細胞的序列和/或一個或多個用於插入目的核酸序列的多選殖位點。
術語“表現載體”是指設計為使得所插入核酸序列在插入宿主細胞中之後能夠表現的媒劑。將所插入核酸序列以如上所述的與調節區可操作地締合地放置。
通過本領域中熟知的方法將載體引入宿主細胞中，所述方法是例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂轉染（溶酶體融合）、使用基因槍或DNA載體轉運蛋白。
如本文所用，“培養”（“culture”，“to culture”和“culturing”）意指在體外條件下培育細胞，所述條件允許細胞生長或分裂或使細胞維持存活狀態。如本文所用，“培養的細胞”是指體外繁殖的細胞。
如本文所用，術語“多肽”旨在涵蓋單數“多肽”以及複數“多肽”，並且是指由通過醯胺鍵（也稱為肽鍵）線性連接的單體（胺基酸）構成的分子。術語“多肽”是指兩個或更多個胺基酸的任何一條或多條鏈，並且不涉及產物的具體長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質”、“胺基酸鏈”或用於指兩個或更多個胺基酸的一條或多條鏈的任何其他術語包括於“多肽”的定義內，並且術語“多肽”可以代替這些術語中的任一個術語或與其互換使用。術語“多肽”還意圖指多肽的表現後修飾的產物，所述修飾包括但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/阻斷基團衍生、蛋白質水解切割或通過非天然存在的胺基酸修飾。多肽可以從天然生物來源衍生或通過重組技術產生，但不一定是從指定的核酸序列轉譯。其能以任何方式產生，包括通過化學合成產生。
術語“胺基酸”包括丙胺酸（Ala或A）；精胺酸（Arg或R）；天門冬醯胺酸（Asn或N）；天門冬胺酸（Asp或D）；半胱胺酸（Cys或C）；麩醯胺酸（Gln或Q）；麩胺酸（Glu或E）；甘胺酸（Gly或G）；組胺酸（His或H）；異白胺酸（Ile或I）；白胺酸（Leu或L）；離胺酸（Lys或K）；甲硫胺酸（Met或M）；苯丙胺酸（Phe或F）；脯胺酸（Pro或P）；絲胺酸（Ser或S）；蘇胺酸（Thr或T）；色胺酸（Trp或W）；酪胺酸（Tyr或Y）；和擷胺酸（Val或V）。非傳統胺基酸也在本揭露的範圍內，並且包括正白胺酸、鳥胺酸、正擷胺酸、高絲胺酸和其他胺基酸殘基類似物，如Ellman等人 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)中所述的那些。為了產生這種非天然存在的胺基酸殘基，可使用Noren等人 Science 244:182 (1989)和Ellman等人, 同上的程式。簡單來說，這些程式涉及用非天然存在的胺基酸殘基化學啟動抑制劑tRNA，之後進行RNA的體外轉錄和轉譯。引入非傳統胺基酸也可以使用本領域中已知的肽化學來實現。如本文所用，術語“極性胺基酸”包括具有零個淨電荷，但是在其側鏈的不同部分具有非零部分電荷的胺基酸（例如，M、F、W、S、Y、N、Q、C）。這些胺基酸可以參與疏水相互作用和靜電相互作用。如本文所用，術語“帶電胺基酸”包括在其側鏈上具有非零淨電荷的胺基酸（例如，R、K、H、E、D）。這些胺基酸可以參與疏水相互作用和靜電相互作用。
本揭露還包括多肽的片段或變體及其任何組合。術語“片段”或“變體”在涉及本揭露的多肽結合結構域或結合分子時包括保留參考多肽的至少一些特性（例如，對FcRn結合結構域或Fc變體的FcRn結合親和力、對FVIII變體的凝結活性或對VWF片段的FVIII結合活性）的任何多肽。除了本文中其他地方討論的特定抗體片段以外，多肽片段包括蛋白質水解片段以及缺失片段，但是不包括天然存在的全長多肽（或成熟多肽）。本揭露的多肽結合結構域或結合分子的變體包括如上所述的片段，以及由於胺基酸取代、缺失或插入而具有改變的胺基酸序列的多肽。變體可以是天然存在的或非天然存在的。非天然存在的變體可以使用本領域中已知的誘變技術來產生。變體多肽可以包含保守或非保守胺基酸取代、缺失或添加。
“保守胺基酸取代”是用具有類似側鏈的胺基酸殘基替代胺基酸殘基的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如天門冬胺酸、麩胺酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、非極性的側鏈（例如丙胺酸、擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、β-分支側鏈（例如蘇胺酸、擷胺酸、異白胺酸）、以及芳香族側鏈（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。因此，如果多肽中的胺基酸被來自相同側鏈家族的另一種胺基酸替代，則將取代視為保守的。在另一個實施例中，胺基酸串可以用結構上類似但側鏈家族成員的順序和/或組成不同的串來保守地替代。
如本領域中已知的術語“同一性百分比”是兩個或更多個多肽序列或者兩個或更多個多核苷酸序列之間的關係，如通過比較序列所確定。在本領域中，根據具體情況，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之間的序列關聯性程度，如通過此類序列的串之間的匹配所確定。“同一性”可以通過已知方法容易地計算，所述已知方法包括但不限於： Computational Molecular Biology(Lesk, A. M.編) Oxford University Press, 紐約 (1988)； Biocomputing: Informatics and Genome Projects(Smith, D. W.編) Academic Press, 紐約 (1993)； Computer Analysis of Sequence Data, Part I(Griffin, A. M.和Griffin, H. G.編) Humana Press, New Jersey (1994)； Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje, G.編) Academic Press (1987)；以及 Sequence Analysis Primer(Gribskov, M.和Devereux, J.編) Stockton Press, 紐約 (1991)。確定同一性的優選方法設計為給出所測試序列之間的最佳匹配。確定同一性的方法被編纂於可公開獲得的電腦程式中。序列比對和同一性百分比計算可以使用序列分析軟體來進行，所述序列分析軟體是例如LASERGENE生物資訊學計算套件的Megalign程式（DNASTAR Inc.，威斯康辛州麥迪森市）、GCG程式套件（Wisconsin Package 9.0版，Genetics Computer Group（GCG），威斯康辛州麥迪森市）、BLASTP、BLASTN、BLASTX（Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403 (1990)）和DNASTAR（DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. 威斯康辛州麥迪森市 53715 美國）。在本申請的上下文中將理解，如果使用序列分析軟體進行分析，除非另外指定，否則分析結果將基於所參考程式的“預設值”。如本文所用的“預設值”將意指在首次初始化時最初用軟體載入的任一組值或參數。出於確定本揭露的優化的BDD FVIII序列與參考序列之間的同一性百分比的目的，僅使用參考序列中對應於本揭露的優化的BDD FVIII序列中的核苷酸的核苷酸來計算同一性百分比。例如，在比較含有B結構域的全長FVIII核苷酸序列與本揭露的優化的B結構域缺失（BDD）FVIII核苷酸序列時，將使用包括A1、A2、A3、C1和C2結構域的比對部分來計算同一性百分比。全長FVIII序列的編碼B結構域的部分（其將在比對中產生大的“空位”）中的核苷酸將不會被計為錯配。另外，在確定本揭露的優化的BDD FVIII序列或其指定部分（例如，SEQ ID NO: 14的核苷酸2183-4474和4924-7006）與參考序列之間的同一性百分比時，將通過比對、用匹配核苷酸數除以如本文所述的優化的BDD-FVIII序列或其指定部分的完整序列中的核苷酸總數來計算同一性百分比。
如本文所用，術語“插入位點”是指FVIII多肽或其片段、變體或衍生物中的如下位置，其緊鄰可以插入異源部分的位置的上游。“插入位點”被指定為一個編號，所述編號對應於成熟天然FVIII（SEQ ID NO: 20）中插入位點對應的胺基酸的編號，其緊鄰插入位置的N末端。例如，短語“a3在對應於SEQ ID NO: 24的胺基酸1656的插入位點包含異源部分”指示，異源部分位於對應於SEQ ID NO: 20的胺基酸1656和胺基酸1657的兩個胺基酸之間。
如本文所用，短語“緊鄰胺基酸的下游”是指與胺基酸的末端羧基緊緊相鄰的位置。類似地，短語“緊鄰胺基酸上游”是指緊鄰胺基酸的末端胺基的位置。
如本文所用，術語“插入”（“inserted”、“is inserted”、“inserted into”）或語法上相關的術語是指重組FVIII多肽中相對於天然成熟人FVIII（SEQ ID NO: 20）中類似位置而言的異源部分的位置。
如本文所用，術語“半衰期”是指特定多肽在體內的生物半衰期。半衰期可以表示為投予於個體的量的一半被從動物的循環和/或其他組織中清除所需的時間。在將給定多肽的清除曲線構築為時間的函數時，所述曲線通常是雙相的，具有快速的α相和較長的β相。α相通常代表所投予的Fc多肽在血管內與血管外空間之間的平衡，並且部分取決於多肽的大小。β相通常代表多肽在血管內空間中的分解代謝。在一些實施例中，FVIII和包含FVIII的嵌合蛋白是單相的，並且因此不具有α相，而是只具有單一β相。因此，在某些實施例中，如本文所用的術語半衰期是指多肽在β相中的半衰期。
如本文所用，術語“連接”是指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別與第二胺基酸序列或核苷酸序列共價或非共價接合。第一胺基酸或核苷酸序列可以與第二胺基酸或核苷酸序列直接接合或並置，或者可替代地，間插序列可以將第一序列共價接合至第二序列。術語“連接”不僅意指第一胺基酸序列與第二胺基酸序列在C末端或N末端融合，還包括將完整的第一胺基酸序列（或第二胺基酸序列）插入第二胺基酸序列（或分別地，第一胺基酸序列）中的任兩個胺基酸之間。在一個實施例中，第一胺基酸序列可以通過肽鍵或連接子連接至第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可以通過磷酸二酯鍵或連接子連接至第二核苷酸序列。連接子可以是肽或多肽（對於多肽鏈）或者核苷酸或核苷酸鏈（對於核苷酸鏈）或者任何化學部分（對於多肽和多核苷酸鏈二者）。術語“連接”還通過連字號（-）來指示。
如本文所用，術語“與……締合”是指在第一胺基酸鏈與第二胺基酸鏈之間形成的共價或非共價鍵。在一個實施例中，術語“與……締合”是指共價、非肽鍵或非共價鍵。這種締合可以用冒號表示，即（:）。在另一個實施例中，它指除肽鍵外的共價鍵。例如，胺基酸半胱胺酸包含硫醇基，其可與第二個半胱胺酸殘基上的硫醇基形成二硫鍵或二硫橋。在大多數天然存在的IgG分子中，CH1區域和CL區域通過二硫鍵締合，並且這兩條重鏈通過在對應於使用Kabat編號系統的239和242的位置（位置226或229，EU編號系統）處的兩個二硫鍵締合。共價鍵的例子包括但不限於肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、σ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、抓氫鍵、彎曲鍵、偶極鍵、回饋π鍵、雙鍵、三鍵、四鍵、五鍵、六鍵、共軛、超共軛、芳香、哈普托數或反鍵。非共價鍵的非限制性例子包括離子鍵（例如陽離子-π鍵或鹽鍵）、金屬鍵、氫鍵（例如二氫鍵、分子氫配合物、低勢壘氫鍵或對稱氫鍵）、范德華力、倫敦分散力、機械鍵、鹵鍵、親金作用、嵌入、堆積、熵力或化學極性。
如本文所用，“止血”意指停止或減慢出血（bleeding）或出血症（hemorrhage）；或者停止或減慢血液流經血管或身體部分。
如本文所用，“止血病症”意指遺傳上的遺傳性或獲得性病症，特徵在於由於形成纖維蛋白凝塊的能力受損或無能，傾向於自發地或由於創傷而出血。此類病症的例子包括血友病。三種主要形式是血友病A（因子VIII缺乏）、血友病B（因子IX缺乏或“克雷司馬斯病”）和血友病C（因子XI缺乏，輕度出血傾向）。其他止血病症包括例如血管性血友病(von Willebrand disease)、因子XI缺乏（PTA缺乏）、因子XII缺乏、纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或結構異常、GPIb缺陷或缺乏的巨血小板綜合症(Bernard-Soulier syndrome)。vWF受體GPIb可能有缺陷並導致缺少初級凝塊形成（初級止血）和增加的出血傾向、以及Glanzman和Naegeli的血小板功能不全（格蘭茲曼血小板功能不全）。在肝功能衰竭（急性和慢性形式）中，肝臟的凝結因子產生不足；這可能增加出血風險。
可以預防性地使用本揭露的分離的核酸分子、分離的多肽或包含分離核酸分子的載體。如本文所用，術語“預防性治療”是指在出血發作之前投予分子。在一個實施例中，需要通用止血劑的個體正在進行或即將進行手術。可以將本揭露的多核苷酸、多肽或載體作為預防藥在手術之前或之後投予。可以將本揭露的多核苷酸、多肽或載體在手術期間或之後投予以控制急性出血發作。手術可以包括但不限於肝移植、肝切除、牙科手術或幹細胞移植。
本揭露的分離的核酸分子、分離的多肽或載體也用於按需治療。術語“按需治療”是指響應出血發作的症狀或者在可能引起出血的活動之前投予分離的核酸分子、分離的多肽或載體。在一個方面中，可以在出血開始時（如在損傷後）或在預期要出血時（如在手術前），將按需治療給予個體。在另一個方面，可以在增加出血風險的活動（如接觸運動）之前給予按需治療。
如本文所用，術語“急性出血”是指無論任何潛在原因的出血發作。例如，個體可能患有創傷、尿毒癥、遺傳性出血病症（例如，因子VII缺乏）、血小板病症或由於產生針對凝血因子的抗體而產生的抗性。
如本文所用，“治療”（“Treat”、“treatment”、“treating”）是指，例如，疾病或病症嚴重程度的降低；病程持續時間的縮短；與疾病或病症有關的一種或多種症狀的改善；為患有疾病或病症的個體提供有益的效果而不一定治癒所述疾病或病症或與疾病或病症相關的一種或多種症狀的預防。在一個實施例中，術語“治療”（“treating”或“treatment”）意指通過投予本揭露的分離的核酸分子、分離的多肽或載體，將個體中的FVIII谷值水平維持在至少約1 IU/dL、2 IU/dL、3 IU/dL、4 IU/dL、5 IU/dL、6 IU/dL、7 IU/dL、8 IU/dL、9 IU/dL、10 IU/dL、11 IU/dL、12 IU/dL、13 IU/dL、14 IU/dL、15 IU/dL、16 IU /dL、17 IU/dL、18 IU/dL、19 IU/dL或20 IU/dL。在另一個實施例中，治療（treating或treatment）意指將FVIII谷值水平維持在約1 IU/dL與約20 IU/dL之間、約2 IU/dL與約20 IU/dL之間、約3 IU/dL與約20 IU/dL之間、約4 IU/dL與約20 IU/dL之間、約5 IU/dL與約20 IU/dL之間、約6 IU/dL與約20 IU/dL之間、約7 IU/dL與約20 IU/dL之間、約8 IU/dL與約20 IU/dL之間、約9 IU/dL與約20 IU/dL之間、或約10 IU/dL與約20 IU/dL之間。疾病或病症的治療（treatment或treating）還可以包括將個體的FVIII活性維持在相當於非血友病個體中FVIII活性的至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的水平。治療所需的最低谷水平可以通過一種或多種已知方法來測量，並且可以針對每個個人加以調節（增加或減小）。
如本文所用，“投予”意指經由醫藥上可接受的途徑將本揭露的醫藥上可接受的編碼因子VIII的核酸分子、因子VIII多肽或包含編碼因子VIII的核酸分子的載體給予個體。投予途徑可以是靜脈內的，例如靜脈內注射和靜脈內輸注。另外的投予途徑包括例如皮下、肌內、口服、經鼻和經肺投予。核酸分子、多肽和載體可以作為包含至少一種賦形劑的醫藥組合物的一部分來投予。
如本文所用，短語“有需要的個體”包括將受益於本揭露的核酸分子、多肽或載體的投予例如以改善止血的個體（如哺乳動物個體）。在一個實施例中，個體包括但不限於患有血友病的個體。在另一個實施例中，個體包括但不限於已發展FVIII抑制劑並因此需要旁路療法的個體。個體可以是成年人或未成年人（例如，小於12歲）。
如本文所用，術語“凝血因子”是指天然存在的或重組產生的分子或其類似物，其預防或縮短個體的出血發作的持續時間。換句話說，其意指具有促凝血活性（即，負責將纖維蛋白原轉型為不溶性纖維蛋白的網狀物，從而引起血液凝結或凝血）的分子。“可啟動的凝血因子”是呈無活性形式（例如，呈其酶原形式）的凝血因子，其能夠被轉型為活性形式。
如本文所用的“凝血活性”意指參與生化反應級聯的能力，所述級聯以終止纖維蛋白凝塊和/或降低出血症或出血發作的嚴重程度、持續時間或頻率。
如本文所用，術語“異源的”或“外源的”是指此類分子通常在給定背景下（例如，在細胞中或在多肽中）未發現。例如，可以將外源或異源分子引入細胞中並且僅在例如通過轉染或其他形式的基因工程化操縱細胞之後存在，或者異源胺基酸序列可以存在於其天然不存在的蛋白質中。
如本文所用，術語“異源核苷酸序列”是指不與給定多核苷酸序列一起天然存在的核苷酸序列。在一個實施例中，異源核苷酸序列編碼能夠延長FVIII的半衰期的多肽。在另一個實施例中，異源核苷酸序列編碼增加FVIII的流體動力學半徑的多肽。在其他實施例中，異源核苷酸序列編碼改善FVIII的一種或多種藥物動力學特性但不顯著影響其生物學活性或功能（例如，其促凝血活性）的多肽。在一些實施例中，FVIII通過連接子與異源核苷酸序列編碼的多肽連接或相連。
“參考核苷酸序列”在本文中用作與本揭露的核苷酸序列的比較時，是與本揭露的核苷酸序列基本上相同的多核苷酸序列，但是對應於FVIII序列的部分未經優化。在一些實施例中，本文公開的核酸分子的參考核苷酸序列是SEQ ID NO: 32。
如本文所用，關於核苷酸序列的術語“優化”是指編碼多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列已經突變以增強所述多核苷酸序列的特性。在一些實施例中，進行優化以增加轉錄水平、增加轉譯水平、增加穩態mRNA水平、增加或減少調節蛋白（如通用轉錄因子）的結合、增加或減少剪接或增加多核苷酸序列產生的多肽的產量。可以對多核苷酸序列進行以使其優化的變化的例子包括密碼子優化、G/C含量優化、去除重複序列、去除富含AT的元件、去除隱蔽剪接位點、去除阻遏轉錄或轉譯的順式作用元件、添加或去除多聚T或多聚A序列、在轉錄起始位點周圍添加增強轉錄的序列（如Kozak共有序列）、去除可以形成莖環結構的序列、去除去穩定序列、去除CpG模體及其兩個或更多個組合。 多核苷酸序列
本揭露的某些方面旨在克服AAV載體用於基因療法的缺陷。具體地，本揭露的一些方面涉及包含例如編碼治療性蛋白質和/或miRNA的基因匣的核酸分子。在一些實施例中，基因匣編碼治療性蛋白質。在一些實施例中，治療性蛋白質包含凝血因子。在一些實施例中，基因匣編碼miRNA。在一些實施例中，核酸分子還包含至少一個非編碼區。在某些實施例中，至少一個非編碼區包含啟動子序列、內含子、調節元件、3'UTR多聚(A)序列或其任何組合。在一些實施例中，調節元件是轉錄後調節元件。
在一個實施例中，基因匣是單股核酸。在另一個實施例中，基因匣是雙股核酸。在另一個實施例中，基因匣是封閉末端雙股核酸（ceDNA）。
在一些實施例中，基因匣包含編碼FVIII多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列經密碼子優化。在一些實施例中，基因匣包含由mTTR啟動子驅動、編碼密碼子優化的FVIII的核苷酸序列和合成內含子。在一些實施例中，基因匣包含國際申請號PCT/US2017/015879中揭露的核苷酸序列，將所述申請通過引用以其整體併入。在一些實施例中，基因匣是如PCT/US2017/015879中所述的“hFVIIIco6XTEN”基因匣。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 32。
在一些實施例中，基因匣包含經密碼子優化的cDNA，其編碼與XTEN 144肽融合的B結構域缺失（BDD）的經密碼子優化的人因子VIII（BDDcoFVIII）。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 14所示的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣具有SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣包含SEQ ID NO: 35所示的核苷酸序列。在一些實施例中，基因匣還包含編碼XTEN多肽的核苷酸序列。
在一些實施例中，基因匣包含由mTTR啟動子驅動、編碼密碼子優化的FVIII的核苷酸序列和合成內含子。在一些實施例中，基因匣還包含土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）。在一些實施例中，基因匣還包含牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號。
在一些實施例中，本揭露涉及編碼具有FVIII活性的多肽的經密碼子優化的核酸分子。在一些實施例中，多核苷酸編碼全長FVIII多肽。在其他實施例中，核酸分子編碼B結構域缺失的（BDD）FVIII多肽，其中FVIII的B結構域的全部或一部分缺失。在一個特定實施例中，核酸分子編碼包含與SEQ ID NO: 10具有至少約80%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列同一性的胺基酸序列的多肽或其片段。
在一些實施例中，本揭露的核酸分子編碼包含信號肽的FVIII多肽或其片段。在其他實施例中，核酸分子編碼缺少信號肽的FVIII多肽。在一些實施例中，所述信號肽包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列。
除非另外指定，否則如本文所用的“具有FVIII活性的多肽”是指在凝血中具有正常作用的功能性FVIII多肽。術語具有FVIII活性的多肽包括它的在凝血途徑中保留全長野生型因子VIII功能的功能片段、變體、類似物或衍生物。“具有FVIII活性的多肽”可與FVIII蛋白、FVIII多肽或FVIII互換使用。FVIII功能的例子包括但不限於啟動凝結的能力、作為因子IX的輔因子作用的能力或在Ca 2+和磷脂存在下與因子IX形成因子Ⅹ酶（tenase）複合物的能力，其接著將因子X轉型為啟動形式Xa。在一個實施例中，具有FVIII活性的多肽包含兩條多肽鏈，第一條鏈具有FVIII重鏈，第二條鏈具有FVIII輕鏈。在另一個實施例中，具有FVIII活性的多肽是單股FVIII。單股FVIII可在對應於成熟人FVIII序列（SEQ ID NO: 20）的胺基酸殘基1645和/或1648處含有一個或多個突變或取代。參見國際申請號PCT/US2012/045784，通過引用以其整體併入本文。FVIII蛋白可以是人、豬、犬類、大鼠或鼠類FVIII蛋白。另外，來自人和其他物種的FVIII之間的比較已經鑒定出可能為功能所需的保守殘基。參見例如，Cameron等人(1998) Thromb. Haemost. 79:317-22；和美國專利號6,251,632。
多種測試可用於評估多肽的FVIII活性：啟動部分促凝血酶原激酶時間（aPTT）測試、生色測定、ROTEM ®測定、凝血酶原時間（PT）測試（也用於確定INR）、纖維蛋白原測試（通常通過克勞斯法進行）、血小板計數、血小板功能測試（通常通過PFA-100進行）、TCT、出血時間、混合測試（如果將患者的血漿與正常血漿混合，是否矯正異常）、凝結因子測定、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試（例如，因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A）、稀釋魯塞爾蝰蛇毒時間（dRVVT）、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記法（TEG或Sonoclot）、凝血彈性測量法（TEM ®，例如ROTEM ®）或優球蛋白溶解時間（ELT）。
aPTT測試是測量“固有”（也稱為接觸啟動途徑）和常見凝結途徑二者的功效的性能指示物。這個測試一般用於測量市售重組凝血因子（例如，FVIII或FIX）的凝血活性。其與測量外在途徑的凝血酶原時間（PT）結合使用。
ROTEM ®分析提供關於止血的整體動力學的資訊：凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性和溶解。凝血彈性測量法中的不同參數依賴於血漿凝結系統的活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響這些相互作用的許多因素。這個分析可以提供次級止血的全面見解。
如本文所用，FVIII的“B結構域”與本領域中已知的B結構域相同，所述B結構域是通過全長人FVIII（SEQ ID NO: 20）的內部胺基酸序列同一性和凝血酶的蛋白質水解切割位點（例如，殘基Ser741-Arg1648）來定義。其他人FVIII結構域是通過以下胺基酸殘基來定義：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Ile2032；C1，殘基Arg2033-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。其餘序列（殘基Glu1649-Arg1689）通常稱為FVIII輕鏈啟動肽。豬、小鼠和犬類FVIII的所有結構域（包括B結構域）的邊界的位置也是本領域中已知的。BDD FVIII的例子是REFACTO®重組BDD FVIII（Wyeth Pharmaceuticals, Inc.）。
“B結構域缺失的FVIII”可以具有以下文獻中揭露的完全或部分缺失：美國專利號6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563，其中每一個通過引用以其整體併入本文。B結構域缺失的FVIII的其他例子揭露於以下中：Hoeben R.C.,等人 (1990) J. Biol. Chem.265 (13): 7318-7323；Meulien等人(1988), Protein Eng.2(4): 301-6；Toole等人 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5939-5942；Eaton,等人 (1986) Biochemistry 25:8343-8347；（Sarver,等人 (1987)  DNA 6:553-564；歐洲專利號295597；和國際公開號WO 91/09122、WO 88/00831和WO 87/04187，其中每一個通過引用以其整體併入本文。可以在任何FVIII序列中產生前述每一種缺失。 密碼子優化
在一個實施例中，本揭露提供了包含編碼具有FVIII活性的多肽的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核酸序列已被密碼子優化。在另一個實施例中，編碼具有FVIII活性的多肽並經受密碼子優化的起始核酸序列是SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，編碼具有FVIII活性的多肽的序列經密碼子優化以用於人表現。在其他實施例中，編碼具有FVIII活性的多肽的序列經密碼子優化以用於鼠表現。
術語“密碼子優化”當提及用於轉型各種宿主的核酸分子的基因或編碼區時，是指改變核酸分子的基因或編碼區中的密碼子以反映宿主生物體的典型密碼子使用而不改變DNA編碼的多肽。這種優化包括用一個或多個在該生物體的基因中更頻繁使用的密碼子替代至少一個、或多於一個、或顯著數量的密碼子。
包含編碼任何多肽鏈的胺基酸的密碼子的核苷酸序列的偏差允許編碼所述基因的序列的變化。由於每個密碼子由3個核苷酸組成，並且構成DNA的核苷酸限於四個特定鹼基，所以存在64種可能的核苷酸組合，其中61種編碼胺基酸（其餘3種密碼子編碼終止轉譯的信號）。因此，許多胺基酸由多於一種密碼子指定。例如，胺基酸丙胺酸和脯胺酸由四種三聯體編碼，絲胺酸和精胺酸由六種三聯體編碼，而色胺酸和甲硫胺酸僅由一種三聯體編碼。這種簡併性允許DNA鹼基組成在寬範圍內變化而不改變DNA編碼的蛋白質的胺基酸序列。
許多生物體顯示出使用特定密碼子來編碼在生長的肽鏈中插入特定胺基酸的偏倚。密碼子偏好或密碼子偏倚（生物體之間密碼子使用的差異）由遺傳密碼的簡併性提供，並且在許多生物體中得到充分證明。密碼子偏倚通常與信使RNA（mRNA）的轉譯效率相關，其轉而又被認為尤其取決於被轉譯的密碼子的特性和特定轉移RNA（tRNA）分子的可用性。所選擇的tRNA在細胞中的優勢通常是肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，基於密碼子優化，可以針對在給定生物中的最佳基因表現來定制基因。
鑒於可用於多種動物、植物和微生物物種的大量基因序列，已計算出密碼子使用的相對頻率。密碼子使用表可例如在www.kazusa.or.jp/codon/（2012年6月18日訪問）處獲得的“密碼子使用資料庫”獲得。參見Nakamura, Y.,等人 Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)。
以優化的頻率隨機分配密碼子來編碼給定的多肽序列可以通過計算每個胺基酸的密碼子頻率，然後將密碼子隨機分配給多肽序列來人工完成。另外，可以使用各種演算法和電腦軟體程式來計算最佳序列。
在其他實施例中，通過去除一個或多個CpG模體和/或甲基化至少一個CpG模體來進一步優化本文公開的核酸分子。如本文所用，“CpG模體”是指含有通過磷酸鍵與鳥苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列。術語“CpG模體”包括甲基化和非甲基化CpG二核苷酸。非甲基化CpG模體在細菌和病毒來源的核酸（例如，質體DNA）中是常見的，但在脊椎動物DNA中被抑制並大部分甲基化。因此，非甲基化CpG模體刺激哺乳動物宿主產生快速炎症反應。Klinman,等人 (1996). PNAS 93:2879-2883。在Yew, N. S.,等人 (2002). Mol Ther. 5(6):731-738和國際申請號PCT/US2001/010309中描述了CpG去除的例示性方法。在一些實施例中，本文公開的核酸分子已被修飾為含有更少的CpG模體（即“CpG減少”或“CpG缺失”）。在一個實施例中，位於所選胺基酸的密碼子三聯體內的CpG模體被改變為缺少CpG模體的相同胺基酸的密碼子三聯體。在一些實施例中，本文公開的核酸分子已被優化以降低先天免疫反應。
在一些實施例中，本文公開了包含與SEQ ID NO: 9具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。
在一些實施例中，本文公開了包含與SEQ ID NO: 33具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。
在一些實施例中，本文公開了包含與SEQ ID NO: 14具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。
在一些實施例中，本文公開了包含與SEQ ID NO: 35具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的核苷酸序列的核酸分子。 異源核苷酸序列
在一些實施例中，本揭露的分離的核酸分子還包含異源核苷酸序列。在一些實施例中，本揭露的分離的核酸分子還包含至少一個異源核苷酸序列。異源核苷酸序列可以在5'端、3'端與本揭露的優化的BDD-FVIII核苷酸序列連接，或插入優化的BDD-FVIII核苷酸序列的中間。因此，在一些實施例中，由異源核苷酸序列編碼的異源胺基酸序列與由核苷酸序列編碼的FVIII胺基酸序列的N末端或C末端連接，或插入FVIII胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源胺基酸序列可以在一個或多個插入位點插入兩個胺基酸之間。在一些實施例中，異源胺基酸序列可以在以下中揭露的任何位點插入本揭露的核酸分子編碼的FVIII多肽內：國際公開號WO 2013/123457 A1、WO 2015/106052 A1或美國公開號2015/0158929 A1，其中每一個通過引用以其整體併入。
在一些實施例中，將由異源核苷酸序列編碼的異源胺基酸序列插入B結構域或其片段內。在一些實施例中，將異源胺基酸序列插入FVIII內，緊接對應於野生型成熟人FVIII（SEQ ID NO: 20）的胺基酸745的胺基酸的下游。在一個特定實施例中，FVIII包含對應於野生型成熟人FVIII（SEQ ID NO: 20）的胺基酸746-1637的缺失，並且由異源核苷酸序列編碼的異源胺基酸序列緊接對應於野生型成熟人FVIII（SEQ ID NO: 20）的胺基酸745下游插入。本文提及的FVIII的插入位點表示為對應於野生型成熟人FVIII（SEQ ID NO: 20）的胺基酸位置的胺基酸位置。
在一些實施例中，異源部分是具有非結構化或結構化特徵的肽或多肽，其與摻入本揭露的蛋白質中時體內半衰期的延長相關。非限制性例子包括白蛋白、白蛋白片段、免疫球蛋白的Fc片段、人絨毛膜促性腺激素的β亞基的C末端肽（CTP）、HAP序列、XTEN序列、轉鐵蛋白或其片段、PAS多肽、聚甘胺酸連接子、聚絲胺酸連接子、白蛋白結合部分或者這些多肽的任何片段、衍生物、變體或組合。在一個特定實施例中，異源胺基酸序列是免疫球蛋白恒定區或其部分、轉鐵蛋白、白蛋白或PAS序列。在其他相關方面中，異源部分可以包括非多肽部分的附著位點（例如，半胱胺酸胺基酸），例如聚乙二醇（PEG）、羥乙基澱粉（HES）、聚唾液酸或者這些元件的任何衍生物、變體或組合。在一些方面中，異源部分包含半胱胺酸胺基酸，其用作非多肽部分的附著位點，例如聚乙二醇（PEG）、羥乙基澱粉（HES）、聚唾液酸或者這些元件的任何衍生物、變體或組合。
在某些實施例中，異源部分改善FVIII蛋白質的一種或多種藥物動力學特性但不顯著影響其生物學活性或功能。在一些實施例中，異源部分增加本揭露的FVIII蛋白質的體內和/或體外半衰期。FVIII蛋白質的體內半衰期可以通過熟習此項技術者已知的任何方法來確定，例如活性測定（例如，生色測定或一步式凝血aPTT測定）、ELISA、ROTEM TM等。
在其他實施例中，異源部分增加本揭露的FVIII蛋白或其片段（例如，在FVIII蛋白的蛋白質水解切割後包含異源部分的片段）的穩定性。如本文所用，術語“穩定性”是指本領域公認的回應環境條件（例如，升高或降低的溫度）維持FVIII蛋白質的一種或多種物理特性的量度。在某些方面中，物理特性可以是維持FVIII蛋白質的共價結構（例如，不存在蛋白質水解切割、不期望的氧化或脫醯胺作用）。在其他方面中，物理特性還可以是處於正確折疊狀態的FVIII蛋白質的存在（例如，不存在可溶性或不溶性聚集體或沈澱物）。在一態樣中，FVIII蛋白質的穩定性是通過測定FVIII蛋白質的生物物理特性來測量，例如熱穩定性、pH解折疊譜、糖基化的穩定去除、溶解度、生化功能（例如，結合至蛋白質、受體或配體的能力）等和/或其組合。在另一個方面中，生化功能是通過相互作用的結合親和性來證實。在一個方面中，蛋白質穩定性的量度是熱穩定性，即對熱激發的抗性。穩定性可以使用本領域中已知的方法來測量，如HPLC（高效液相層析）、SEC（尺寸排阻層析）、DLS（動態光散射）等。測量熱穩定性的方法包括但不限於差式掃描量熱法（DSC）、差式掃描螢光測定法（DSF）、圓二色性（CD）和熱激發測定。
在一些實施例中，異源部分包含一個或多個XTEN序列、其片段、變體或衍生物。如本文所用，“XTEN序列”是指延伸長度的多肽，其具有非天然存在的基本上不重複的序列，其主要由小親水胺基酸構成，並且所述序列在生理條件下具有較低程度的或不具有二級或三級結構。作為異源部分，XTEN可以用作半衰期延長部分。另外，XTEN可以提供所需特性，包括但不限於增強的藥物動力學參數和溶解度特徵。可通過引入XTEN序列而賦予的其他有利特性包括增強的構型可撓性、增強的水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體的低結合或增加的流體動力學（或斯托克斯）半徑。
XTEN可以有不同的長度用於插入或連接至FVIII。在一些實施例中，可用於本揭露的XTEN序列是具有大於約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸殘基的肽或多肽。在某些實施例中，XTEN是具有大於約20至約3000個胺基酸殘基、大於30至約2500個殘基、大於40至約2000個殘基、大於50至約1500個殘基、大於60至約1000個殘基、大於70至約900個殘基、大於80至約800個殘基、大於90至約700個殘基、大於100至約600個殘基、大於110至約500個殘基或大於120至約400個殘基的肽或多肽。在一個特定實施例中，XTEN包含長度長於42個胺基酸並且短於144個胺基酸的胺基酸序列。
本揭露的XTEN序列可包含一個或多個具有5至14個（例如9至14個）胺基酸殘基的序列模體或與所述序列模體至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，其中所述模體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：選自甘胺酸（G）、丙胺酸（A）、絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）、麩胺酸（E）和脯胺酸（P）的4-6種類型的胺基酸（例如，5種胺基酸）。參見US 2010-0239554 A1。
可以用作本揭露的嵌合蛋白質中的異源部分的XTEN序列的例子揭露於例如以下中：美國專利公開號2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1、或國際專利公開號WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1或WO 2011028344 A2，其中每一個通過引用以其整體併入。
一個或多個XTEN序列可以插入由核苷酸序列編碼的胺基酸序列的C末端或N末端處，或者插入由核苷酸序列編碼的胺基酸序列中的兩個胺基酸之間。例如，XTEN可以在一個或多個插入位點插入兩個胺基酸之間。可允許XTEN插入的FVIII內的位點的例子可在例如國際公開號WO 2013/123457 A1或美國公開號2015/0158929 A1中找到，這些文獻通過引用以其整體併入本文。
在某些實施例中，異源部分是肽連接子。
如本文所用，術語“肽連接子”或“連接子部分”是指連接多肽鏈的線性胺基酸序列中的兩個結構域的肽或多肽序列（例如，合成肽或多肽序列）。
在一些實施例中，編碼肽連接子的異源核苷酸序列可插入本揭露的優化的FVIII多核苷酸序列與編碼例如上述一種異源部分（如白蛋白）的異源核苷酸序列之間。肽連接子可以向嵌合多肽分子提供撓性。連接子通常不被切割，但是可能需要這種切割。在一個實施例中，在加工期間不去除這些連接子。
可以存在於本揭露的嵌合蛋白中的一種類型的連接子是蛋白酶可切割的連接子，其包含切割位點（即，蛋白酶切割位點基質，例如因子XIa、Xa或凝血酶切割位點）並且可以在切割位點的N末端或C末端或兩側上包括其他連接子。這些可切割連接子在摻入本揭露的構築體中時產生具有異源切割位點的嵌合分子。
在一個實施例中，由本揭露的核酸分子編碼的FVIII多肽包含兩個或更多個Fc結構域或部分，藉由cscFc連接子連接以形成包含於單條多肽鏈中的Fc區。cscFc連接子側接有至少一個細胞內加工位點，即由細胞內酶切割的位點。多肽在所述至少一個細胞內加工位點的切割產生包含至少兩條多肽鏈的多肽。
其他肽連接子可以任選地用於本揭露的構築體中，例如以將FVIII蛋白連接至Fc區。可以結合本揭露使用的一些例示性連接子包括例如更詳細地描述於下文中的包含GlySer胺基酸的多肽。
在一個實施例中，肽連接子是合成的，即非天然存在的。在一個實施例中，肽連接子包括包含如下胺基酸序列的肽（或多肽）（其可以是或可以不是天然存在的），所述胺基酸序列將第一線性胺基酸序列與在自然界中並非與其天然地連接或遺傳融合的第二線性胺基酸序列連接或遺傳融合。例如，在一個實施例中，肽連接子可以包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修飾形式（例如，包含突變，如添加、取代或缺失）。在另一個實施例中，肽連接子可以包含非天然存在的胺基酸。在另一個實施例中，肽連接子可以包含存在於在自然界中不存在的線性序列中的天然存在的胺基酸。在仍另一個實施例中，肽連接子可以包含天然存在的多肽序列。
在另一個實施例中，肽連接子包含gly-ser連接子或由所述gly-ser連接子組成。如本文所用，術語“gly-ser連接子”是指由甘胺酸和絲胺酸殘基組成的肽。在某些實施例中，所述gly-ser連接子可以插入肽連接子的兩個其他序列之間。在其他實施例中，gly-ser連接子連接於肽連接子的另一序列的一個或兩個末端。在又其他實施例中，兩個或更多個gly-ser連接子串聯摻入肽連接子中。在一個實施例中，本揭露的肽連接子包含上鉸鏈區的至少一部分（例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子）、中鉸鏈區的至少一部分（例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子）和一系列gly/ser胺基酸殘基。
本揭露的肽連接子的長度為至少一個胺基酸並且可以具有變化的長度。在一個實施例中，本揭露的肽連接子的長度為約1至約50個胺基酸。如在此上下文中所用，術語“約”指示+/-兩個胺基酸殘基。由於連接子長度必須是正整數，長度為約1至約50個胺基酸的長度意指長度為1-3至48-52個胺基酸的長度。在另一個實施例中，本揭露的肽連接子的長度為約10至約20個胺基酸。在另一個實施例中，本揭露的肽連接子的長度為約15至約50個胺基酸。在另一個實施例中，本揭露的肽連接子的長度為約20至約45個胺基酸。在另一個實施例中，本揭露的肽連接子的長度為約15至約35或約20至約30個胺基酸。在另一個實施例中，本揭露的肽連接子的長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000或2000個胺基酸。在一個實施例中，本揭露的肽連接子的長度為20或30個胺基酸。
在一些實施例中，肽連接子可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個胺基酸。在其他實施例中，肽連接子可以包含至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1,000個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子可以包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000個胺基酸。肽連接子可以包含1-5個胺基酸、1-10個胺基酸、1-20個胺基酸、10-50個胺基酸、50-100個胺基酸、100-200個胺基酸、200-300個胺基酸、300-400個胺基酸、400-500個胺基酸、500-600個胺基酸、600-700個胺基酸、700-800個胺基酸、800-900個胺基酸或900-1000個胺基酸。
可以使用本領域中已知的技術將肽連接子引入多肽序列中。可以通過DNA序列分析來確認修飾。可以使用質體DNA轉型宿主細胞用於穩定產生所產生的多肽。 表現控制序列
在一些實施例中，本揭露的核酸分子或載體還包含至少一個表現控制序列。例如，本揭露的分離的核酸分子可以與至少一個表現控制序列可操作地連接。例如，表現控制序列可以是啟動子序列或啟動子-增強子組合。
構成型哺乳動物啟動子包括但不限於以下基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HPRT）、腺苷脫胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子和其他構成型啟動子。在真核細胞中組成性地發揮作用的例示性病毒啟動子包括例如來自以下病毒的啟動子：巨細胞病毒（CMV）、猿猴病毒（例如，SV40）、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒（HIV）、勞斯肉瘤病毒、巨細胞病毒、莫洛尼白血病病毒的長末端重複（LTR）和其他反轉錄病毒、以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。其他構成型啟動子是一般熟習此項技術者已知的。可用作本揭露的基因表現序列的啟動子還包括誘導型啟動子。誘導型啟動子是在誘導劑的存在下表現。例如，在某些金屬離子的存在下誘導金屬硫蛋白啟動子以促進轉錄和轉譯。其他誘導型啟動子是一般熟習此項技術者已知的。
在一個實施例中，本揭露包括轉基因在組織特異性啟動子和/或增強子控制下的表現。在另一個實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在肝細胞中的表現。在某些實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在肝細胞、竇狀細胞和/或內皮細胞中的表現。在一個特定實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在內皮細胞中的表現。在某些實施例中，啟動子或其他表現控制序列選擇性地增強轉基因在以下中的表現：肌肉細胞、中樞神經系統、眼睛、肝臟、心臟或其任何組合。肝特異性啟動子的例子包括但不限於小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子（mTTR）、天然人因子VIII啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、人白蛋白最小啟動子和小鼠白蛋白啟動子。在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含mTTR啟動子。mTTR啟動子描述於Costa等人 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:4697中。FVIII啟動子描述於Figueiredo和Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838中。在一些實施例中，啟動子選自肝特異性啟動子（例如，α1-抗胰蛋白酶（AAT））、肌肉特異性啟動子（例如，肌肉肌酸激酶（MCK）、肌球蛋白重鏈α（αMHC）、肌紅蛋白（MB）和結蛋白（DES））、合成啟動子（例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK和tMCK）或其任何組合。
在一些實施例中，轉基因表現靶向肝臟。在某些實施例中，轉基因表現靶向肝細胞。在其他實施例中，轉基因表現靶向內皮細胞。在一個特定實施例中，轉基因表現靶向天然表現內源FVIII的任何組織。在一些實施例中，轉基因表現靶向中樞神經系統。在某些實施例中，轉基因表現靶向神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向傳入神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向傳出神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向中間神經元。在一些實施例中，轉基因表現靶向神經膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向星形膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向少突膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向小神經膠質細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向室管膜細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向許旺細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向衛星細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向肌肉組織。在一些實施例中，轉基因表現靶向平滑肌。在一些實施例中，轉基因表現靶向心肌。在一些實施例中，轉基因表現靶向骨骼肌。在一些實施例中，轉基因表現靶向眼睛。在一些實施例中，轉基因表現靶向感光細胞。在一些實施例中，轉基因表現靶向視網膜神經節細胞。
可用於本文公開的核酸分子的其他啟動子包括小鼠甲狀腺素轉運蛋白啟動子（mTTR）、天然人因子VIII啟動子、人α-1-抗胰蛋白酶啟動子（hAAT）、人白蛋白最小啟動子、小鼠白蛋白啟動子、三重四脯胺酸（TTP，也稱為ZFP36）啟動子、CASI啟動子、CAG啟動子、巨細胞病毒（CMV）啟動子、α1-抗胰蛋白酶（AAT）啟動子、肌肉肌酸激酶（MCK）啟動子、肌球蛋白重鏈α（αMHC）啟動子、肌紅蛋白（MB）啟動子、結蛋白（DES）啟動子、SPc5-12啟動子、2R5Sc5-12啟動子、dMCK啟動子、和tMCK啟動子、磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子或其任何組合。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含甲狀腺素轉運蛋白（TTR）啟動子。在一些實施例中，啟動子是小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。mTTR啟動子的非限制性例子包括mTTR202啟動子、mTTR202opt啟動子和mTTR482啟動子，如美國公開號US2019/0048362中揭露，其通過引用以其整體併入。在一些實施例中，啟動子是肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。在一些實施例中，啟動子是肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子mTTR482。mTTR482啟動子的例子描述於Kyostio-Moore等人 (2016) Mol Ther Methods Clin Dev. 3:16006，和Nambiar B.等人 (2017) Hum Gene Ther Methods, 28(1):23-28中。在一些實施例中，啟動子是包含SEQ ID NO: 16的核酸序列的肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。
可以使用一種或多種增強子元件進一步增強表現水平以實現治療功效。一種或多種增強子可以單獨提供，或與一種或多種啟動子元件一起提供。通常，表現控制序列包含多個增強子元件和組織特異性啟動子。在一個實施例中，增強子包含一個或多個複製的α-1-微球蛋白/雙庫尼茨抑制劑（bikunin）增強子（Rouet等人 (1992) J. Biol. Chem. 267:20765-20773；Rouet等人 (1995), Nucleic Acids Res. 23:395-404；Rouet等人 (1998) Biochem. J. 334:577-584；Ill等人 (1997) Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30）。在一些實施例中，增強子衍生自肝特異性轉錄因子結合位點，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和Enh1，包括HNF1、（有義）-HNF3、（有義）-HNF4、（反義）-HNF1、（反義）-HNF6、（有義）-EBP、（反義）-HNF4（反義）。
在一些實施例中，增強子元件包含一個或兩個修飾的凝血酶原增強子（pPrT2）、一個或兩個α1-微雙庫尼茨抑制劑（microbikunin）增強子（A1MB2）、修飾的小鼠白蛋白增強子（mEalb）、乙型肝炎病毒增強子II（HE11）或CRM8增強子。在一些實施例中，A1MB2增強子是國際申請號PCT/US2019/055917中揭露的增強子。在一些實施例中，增強子元件是A1MB2。在一些實施例中，增強子元件包括AIMB2增強子序列的多個複製。在一些實施例中，A1MB2增強子定位於編碼FVIII多肽的核酸序列的5'。在一些實施例中，A1MB2增強子定位於啟動子序列如mTTR啟動子的5'。在一些實施例中，增強子元件是包含SEQ ID NO: 15的核酸序列的A1MB2增強子。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含內含子或內含子序列。在一些實施例中，內含子序列是天然存在的內含子序列。在一些實施例中，內含子序列是合成序列。在一些實施例中，內含子序列衍生自天然存在的內含子序列。在一些實施例中，內含子序列是雜合合成內含子或嵌合內含子。在一些實施例中，內含子序列是嵌合內含子，所述嵌合內含子由雞β-肌動蛋白/兔β-珠蛋白內含子組成並且已經修飾以消除現有五個ATG序列，從而減少錯誤轉譯起始。在某些實施例中，內含子序列包含SV40小T內含子。在一些實施例中，內含子序列定位於編碼FVIII多肽的核酸序列的5'。在一些實施例中，嵌合內含子定位於啟動子序列如mTTR啟動子的5'。在一些實施例中，嵌合內含子包含SEQ ID NO: 17的核酸序列。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含轉錄後調節元件。在某些實施例中，調節元件包含突變的土撥鼠肝炎病毒調節元件（WPRE）。WPRE被認為增強病毒載體遞送的轉基因的表現。WPRE的例子描述於Zufferey等人 (1999) J Virol., 73(4):2886-2892；Loeb等人 (1999) Hum Gene Ther. 10(14):2295-2305中。在一些實施例中，WPRE定位於編碼FVIII多肽的核酸序列的3'。在一些實施例中，WPRE包含SEQ ID NO: 18的核酸序列。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含轉錄終止子。在一些實施例中，轉錄終止子是多腺苷酸化（poly(A)）序列。轉錄終止子的非限制性例子包括衍生自牛生長激素多腺苷酸化信號（BGHpA）、猿猴病毒40多腺苷酸化信號（SV40pA）或合成多腺苷酸化信號的那些。在一個實施例中，3'UTR多聚(A)尾包含肌動蛋白多聚(A)位點。在一個實施例中，3'UTR多聚(A)尾包含血紅蛋白多聚(A)位點。在一些實施例中，轉錄終止子是BGHpA。Woychik等人(1984) PNAS 81:3944-3948描述了BGHpA轉錄終止子的例子。在一些實施例中，轉錄終止子定位於對編碼FVIII多肽的核酸序列進行編碼的基因匣的3'端。在一些實施例中，轉錄終止子是包含SEQ ID NO: 19的核酸序列的BGHpA。
在一些實施例中，文中公開的核酸分子包含一個或多個DNA核靶向序列（DTS）。DTS促進含有此類序列的DNA分子易位至核中。在某些實施例中，DTS包含SV40增強子序列。在某些實施例中，DTS包含c-Myc增強子序列。在一些實施例中，核酸分子包含位於第一ITR與第二ITR之間的DTS。在一些實施例中，核酸分子包含位於第一ITR的3'和轉基因（例如FVIII蛋白）的5'的DTS。在一些實施例中，核酸分子包含位於核酸分子上轉基因3'和第二ITR 5'的DTS。
在一些實施例中，本文公開的核酸分子包含鐸(toll)樣受體9（TLR9）抑制序列。例示性TLR9抑制序列描述於例如Trieu等人 (2006) Crit Rev Immunol. 26(6):527-44；Ashman等人 Int’l Immunology 23(3): 203-14中。 反向末端重複（ ITR ）序列
本揭露的某些方面涉及一種核酸分子，其包含第一ITR（例如，5' ITR）和第二ITR（例如，3' ITR）。通常，ITR參與細小病毒（例如，AAV）從原核質體進行DNA複製和拯救或切除（Samulski等人, 1983, 1987；Senapathy等人, 1984；Gottlieb和Muzyczka, 1988）。另外，ITR似乎是AAV原病毒整合和將AAV DNA包裝至病毒粒子中所需的最小序列（McLaughlin等人, 1988；Samulski等人, 1989）。這些元件是細小病毒基因體的有效操縱必需的。假設對於ITR功能不可或缺的最小定義元件是Rep結合位點和末端解離位點加允許髮夾形成的可變回文序列。回文核苷酸區域通常作為DNA複製的起點以及作為病毒的包裝信號以順式一起作用。ITR中的互補序列在DNA複製期間折疊成髮夾結構。在一些實施例中，ITR折疊成髮夾T形結構。在其他實施例中，ITR折疊成非T形髮夾結構，例如折疊成U形髮夾結構。資料表明，AAV ITR的T形髮夾結構可以抑制兩側為ITR的轉基因的表現。參見例如，Zhou等人 (2017) Scientific Reports 7:5432。通過利用不形成T形髮夾結構的ITR，可以避免這種形式的抑制。因此，在某些方面中，與包含形成T形髮夾的AAV ITR的多核苷酸相比，包含非AAV ITR的多核苷酸具有改善的轉基因表現。
如本文所用，“反向末端重複序列”（或“ITR”）是指位於單股核酸序列的5'端或3'端的核酸子序列，其包含一組核苷酸（初始序列），之後下游是其反向互補體，即回文序列。初始序列與反向互補體之間的插入核苷酸序列可以具有任何長度，包括零。在一個實施例中，可用於本揭露的ITR包含一個或多個“回文序列”。ITR可以具有任何數目的功能。在一些實施例中，本文所述的ITR形成髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成T形髮夾結構。在一些實施例中，ITR形成非T形髮夾結構，例如U形髮夾結構。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的長期存活。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的永久存活（例如，持續細胞的整個壽命）。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的穩定性。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的保留。在一些實施例中，ITR促進核酸分子在細胞的細胞核中的持久性。在一些實施例中，ITR抑制或防止核酸分子在細胞的細胞核中的降解。
因此，如本文所用的“ITR”可以折疊回於自身並形成雙股區段。例如，在折疊形成雙螺旋時，序列GATCXXXXGATC包含GATC的初始序列及其互補體（3'CTAG5'）。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的連續回文序列（例如，GATCGATC）。在一些實施例中，ITR包含初始序列與反向互補體之間的中斷的回文序列（例如，GATCXXXXGATC）。在一些實施例中，連續或中斷的回文序列的互補部分彼此相互作用以形成“髮夾環”結構。如本文所用，在單股核苷酸分子上的至少兩個互補序列鹼基配對形成雙股部分時，產生“髮夾環”結構。在一些實施例中，僅ITR的一部分形成髮夾環。在其他實施例中，整個ITR形成髮夾環。
在本揭露中，至少一個ITR是非腺病毒相關病毒（非AAV）的ITR。在某些實施例中，ITR是病毒科細小病毒科的非AAV成員的ITR。在一些實施例中，ITR是依賴病毒屬（ Dependovirus）或紅病毒屬（ Erythrovirus）的非AAV成員的ITR。
在一些實施例中，ITR是來自以下的非AAV基因體的ITR：博卡病毒屬、依賴病毒屬、紅病毒屬、阿留申病毒屬、細小病毒屬、濃核病毒屬、重複病毒屬、康特拉病毒屬、禽細小病毒屬、反芻類細小病毒屬、原細小病毒屬、四型細小病毒屬、雙義濃核病毒屬、短濃核病毒屬、肝胰濃核病毒屬、對蝦濃核病毒屬及其任何組合。在某些實施例中，ITR衍生自人博卡病毒（HBoV1）。在某些實施例中，ITR衍生自紅病毒屬細小病毒B19（人病毒）。在一些實施例中，ITR衍生自依賴細小病毒。在一個實施例中，依賴細小病毒是依賴病毒屬鵝細小病毒（GPV）株。在一個具體實施例中，GPV株被減弱，例如GPV株82-0321V。在另一個具體的實施例中，GPV株是致病性的，例如GPV株B。在一些實施例中，ITR是鵝細小病毒（GPV）或番鴨細小病毒（MDPV）的ITR。
在一些實施例中，ITR是紅病毒屬細小病毒B19（也稱為細小病毒B19-在本文中也稱為“B19”、靈長類動物紅細小病毒1、B19病毒和紅病毒）的ITR。在一些實施例中，ITR是人博卡病毒（HBoV1）的ITR。
在某些實施例中，兩個ITR中的一個ITR是AAV的ITR。在其他實施例中，構築體中兩個ITR中的一個ITR是選自以下的AAV血清型的ITR：血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及其任何組合。在一個特定實施例中，ITR衍生自AAV血清型2，例如AAV血清型2的ITR。
在本揭露的某些方面中，核酸分子包含兩個ITR，5' ITR和3' ITR，其中5' ITR位於核酸分子的5'末端，並且3' ITR位於核酸分子的3'末端。核酸分子的第一ITR和第二ITR可以衍生自相同基因體（例如，衍生自相同病毒的基因體），或衍生自不同基因體（例如，衍生自兩種或更多種不同病毒基因體的基因體（也稱為“雜合”ITR））。在一些實施例中，第一ITR衍生自B19而第二ITR衍生自GPV。在一些實施例中，第一ITR衍生自GPV而第二ITR衍生自B19。
在某些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含衍生自人博卡病毒（HBoV1）的ITR的全部或一部分，或由所述ITR的全部或一部分組成。在某些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含衍生自HBoV1的ITR的全部或一部分，或由所述ITR的全部或一部分組成。在一些實施例中，第二ITR是第一ITR的反向互補體。在一些實施例中，第一ITR是第二ITR的反向互補體。在一些實施例中，衍生自HBoV1的第一ITR和/或第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含與SEQ ID NO: 1、2、21-30中所示的核苷酸序列至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%相同的核苷酸序列或由其組成，其中第一ITR和/或第二ITR保留衍生其的野生型ITR的功能特性。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自野生型HBoV1 ITR。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自野生型B19 ITR。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR衍生自野生型GPV ITR。
在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR包含與SEQ ID NO: 1、2、21-30中所示的核苷酸序列至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%相同的核苷酸序列或由其組成，其中第一ITR和/或第二ITR能夠形成髮夾結構。在某些實施例中，髮夾結構不包含T形髮夾。
對於熟習此項技術者將理解，本文所述的任何第一ITR序列可以與本文所述的任何第二ITR序列匹配。在一些實施例中，本文所述的第一ITR序列是5'ITR序列。在一些實施例中，本文所述的第二ITR序列是3'ITR序列。在一些實施例中，本文所述的第二ITR序列是5'ITR序列。在一些實施例中，本文所述的第一ITR序列是3'ITR序列。熟習此項技術者將能夠確定關於基因匣的架構的第一和第二ITR的合適的取向。
在另一個特定實施例中，ITR是經基因工程化以在其5'和3'端包括並非衍生自AAV基因體的ITR的合成序列。在另一個特定實施例中，ITR是經基因工程化以在其5'和3'端包括衍生自一個或多個非AAV基因體的ITR的合成序列。存在於本發明的核酸分子中的兩個ITR可以是相同或不同的非AAV基因體。具體地，ITR可以衍生自相同的非AAV基因體。在一個具體實施例中，存在於本發明的核酸分子中的這兩個ITR是相同的，並且特別地可以是AAV2 ITR。
在一些實施例中，ITR序列包含一個或多個回文序列。本文所公開的ITR的回文序列包括但不限於天然回文序列（即，在自然界中發現的序列）、合成序列（即，未在自然界中發現的序列）（如偽回文序列）及其組合或經修飾形式。
在一些實施例中，ITR形成髮夾環結構。在一個實施例中，第一ITR形成髮夾結構。在另一個實施例中，第二ITR形成髮夾結構。仍然在另一個實施例中，第一ITR和第二ITR二者都形成髮夾結構。在一些實施例中，第一ITR和/或第二ITR不形成T形髮夾結構。在某些實施例中，第一ITR和/或第二ITR形成非T形髮夾結構。在一些實施例中，非T形髮夾結構包含U形髮夾結構。
在一些實施例中，本文所述的核酸分子中的ITR可以是轉錄啟動的ITR。轉錄啟動的ITR可以包含已經通過包括至少一個轉錄活性元件而被轉錄啟動的野生型ITR的全部或一部分。多種類型的轉錄活性元件適用於此脈絡。在一些實施例中，轉錄活性元件是構成型轉錄活性元件。構成型轉錄活性元件提供持續水平的基因轉錄，並且在需要持續表現轉基因時是優選的。在其他實施例中，轉錄活性元件是誘導型轉錄活性元件。誘導型轉錄活性元件通常在誘導物（或誘導條件）不存在下展現低活性，並且在誘導物存在下（或切換至誘導條件）上調。當僅在某些時間或在某些位置需要表現時或當需要使用誘導劑逐步增加表現水平時，誘導型轉錄活性元件可能是優選的。轉錄活性元件也可以具有組織特異性；也就是說，其僅在某些組織或細胞類型中展現活性。
可以以多種方式將轉錄活性元件摻入ITR中。在一些實施例中，將轉錄活性元件摻入ITR的任何部分的5′或ITR的任何部分的3′。在其他實施例中，轉錄啟動的ITR的轉錄活性元件位於兩個ITR序列之間。如果轉錄活性元件包含兩個或更多個必須被間隔開的元件，則那些元件可以與ITR的部分交替。在一些實施例中，ITR的髮夾結構缺失並用轉錄元件的反向重複來替代。這後一種排列將產生類比結構中的缺失部分的髮夾。多個串聯轉錄活性元件也可以存在於轉錄啟動的ITR中，並且這些元件可以相鄰或間隔開。另外，可以將蛋白質結合位點（例如，Rep結合位點）引入轉錄啟動的ITR的轉錄活性元件中。轉錄活性元件可以包含使得能夠通過RNA聚合酶受控轉錄DNA以形成RNA的任何序列，並且可以包含例如如下文所定義的轉錄活性元件。
轉錄啟動的ITR向具有相對受限的核苷酸序列長度的核酸分子提供轉錄啟動和ITR功能二者，這有效地使可以攜帶並從核酸分子表現的轉基因的長度最大化。將轉錄活性元件摻入ITR中可以以多種方式來完成。對ITR序列和轉錄活性元件的序列需求的比較可以提供對編碼ITR內的元件的方式的瞭解。例如，可以通過在複製轉錄活性元件的功能元件的ITR序列中引入特定變化將轉錄活性添加至ITR。本領域中存在多種技術可有效添加、缺失和/或改變特定位點的具體核苷酸序列（參見例如，Deng和Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88）。產生轉錄啟動的ITR的另一方式涉及在ITR中的所需位置引入限制位點。另外，可以使用本領域中已知的方法將多個轉錄活性元件摻入轉錄啟動的ITR中。
通過說明的方式，可以通過包括一個或多個諸如以下的轉錄活性元件來產生轉錄啟動的ITR：TATA盒、GC盒、CCAAT盒、Sp1位點、Inr區、CRE（cAMP調節元件）位點、ATF-1/CRE位點、APBβ盒、APBα盒、CArG盒、CCAC盒或如本領域中已知參與轉錄的任何其他元件。 載體系統
本揭露的一些實施例涉及包含編碼本文所述的具有FVIII活性的多肽的一個或多個經密碼子優化的核酸分子的載體，包含所述載體的宿主細胞，和使用所述載體治療出血病症的方法。本揭露通過提供包含優化的FVIII序列的載體滿足了本領域的重要需求，所述優化的FVIII序列在個體中展現出增加的表現並且當用於基因治療方法中時潛在地導致更大的治療功效。
用於本揭露的適合的載體包括表現載體、病毒載體和質體載體。在一個實施例中，載體是病毒載體。
如本文所用，表現載體是指任何核酸構築體，其含有用於插入的編碼序列的轉錄和轉譯的必需元件，或者在RNA病毒載體的情況下，當引入時合適的宿主細胞時用於複製和轉譯的必需元件。表現載體可包括質體、噬菌粒、病毒及其衍生物。
本揭露的表現載體將包括編碼本文所述的BDD FVIII蛋白的優化多核苷酸。在一個實施例中，BDD FVIII蛋白的優化編碼序列與表現控制序列可操作地連接。如本文所用，當兩個核酸序列以允許每個組分核酸序列保留其功能的方式共價連接時，它們為可操作地連接。當編碼序列和基因表現控制序列以將編碼序列的表現或轉錄和/或轉譯置於基因表現控制序列的影響或控制之下的方式共價連接時，它們被認為是可操作地連接。如果5'基因表現序列中啟動子的誘導導致編碼序列的轉錄並且如果兩個DNA序列之間的連接的性質不 (1) 導致移碼突變的引入，(2) 干擾啟動子區域指導編碼序列轉錄的能力，或 (3) 干擾相應RNA轉錄物轉譯成蛋白質的能力，則兩個DNA序列被認為是可操作地連接。因此，如果基因表現序列能夠實現編碼核酸序列的轉錄，使得得到的轉錄物被轉譯成期望的蛋白質或多肽，則基因表現序列可操作地連接到編碼核酸序列。
病毒載體包括但不限於來自以下病毒的核酸序列：反轉錄病毒，如莫洛尼鼠白血病病毒、哈威鼠肉瘤病毒、鼠乳腺腫瘤病毒和勞斯肉瘤病毒；慢病毒；腺病毒；腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；EB病毒；乳頭瘤病毒；皰疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰質炎病毒；和RNA病毒如反轉錄病毒。可以容易地使用本領域熟知的其他載體。某些病毒載體基於非致細胞病變真核病毒，其中非必需基因已被目的基因替代。在一個實施例中，病毒是腺相關病毒、雙股DNA病毒。腺相關病毒可被工程化為複製缺陷型並能夠感染多種細胞類型和物種。
根據本揭露，可以使用衍生自幾乎任何血清型的一種或多種不同AAV載體序列。特定AAV載體序列的選擇將由已知參數如目的向性、所需的載體產量等指導。通常，AAV血清型在胺基酸和核酸水平上具有有顯著同源性的基因體序列，提供相關的一組遺傳功能，產生相關的病毒粒子，並類似地複製和組裝。對於各種AAV血清型的基因體序列和基因體相似性的概述，參見例如GenBank登錄號U89790；GenBank登錄號J01901；GenBank登錄號AF043303；GenBank登錄號AF085716；Chlorini等人 (1997) J. Vir. 71: 6823-33；Srivastava等人 (1983) J. Vir. 45:555-64；Chlorini等人 (1999) J. Vir. 73:1309-1319；Rutledge等人 (1998), J. Vir. 72:309-319；或Wu等人 (2000) J. Vir. 74: 8635-47。AAV血清型1、2、3、4和5是用於本揭露的上下文中的AAV核苷酸序列的說明性來源。AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通過例如衣殼改組技術和AAV衣殼文庫獲得的或從新設計、開發或進化的ITR獲得的新開發的AAV樣顆粒也適用於某些公開應用。參見Dalkara等人 (2013), Sci. Transl. Med. 5(189): 189ra76；Kotterman MA (2014) Nat. Rev. Genet. 15(7):455。
其他載體包括質體載體。質體載體已在本領域中廣泛描述並且為熟習此項技術者所熟知。參見，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。在最近幾年中，已經發現質體載體對於向細胞體內遞送基因是特別有利的，因為它們不能在宿主基因體內複製和整合到宿主基因體中。然而，這些具有與宿主細胞相容的啟動子的質體可以從可操作地編碼在質體內的基因表現肽。可從商業供應商獲得的一些常用質體包括pBR322、pUC18、pUC19、各種pcDNA質體、pRC/CMV、各種pCMV質體、pSV40和pBlueScript。特定質體的其他例子包括pcDNA3.1，目錄號V79020；pcDNA3.1/hygro，目錄號V87020；pcDNA4/myc-His，目錄號V86320；和pBudCE4.1，目錄號V53220，均來自Invitrogen（加利福尼亞州卡爾斯巴德）。其他質體是一般熟習此項技術者熟知的。另外，可以使用標準分子生物學技術定制設計質體以去除和/或添加特定DNA片段。
在某些實施例中，有用的是在載體內包括一個或多個miRNA靶序列，其例如與優化的FVIII轉基因可操作地連接。載體中包括的多於一個複製的miRNA靶序列可以增加系統的有效性。例如，表現多於一種轉基因的載體可以具有在多於一個可以相同或不同的miRNA靶序列控制下的轉基因。miRNA靶序列可以是串聯的，但是也包括其他排列。含有miRNA靶序列的轉基因表現匣也能以反義取向插入載體內。miRNA靶序列的例子描述於以下中：WO 2007/000668、WO 2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471，將這些文獻通過引用以其整體併入本文。然而，在某些其他實施例中，載體將不包括任何miRNA靶序列。是否要包括miRNA靶序列（以及數量）的選擇將依據已知參數（如計畫的組織靶標、所需的表現水平等）來指導。 宿主細胞
本揭露還提供了一種包含本揭露的核酸分子或載體的宿主細胞。如本文所用，術語“轉型”應在廣義上使用，是指將DNA引入受體宿主細胞中，這改變了基因型並因此導致受體細胞的變化。
“宿主細胞”是指已經用使用重組DNA技術構築並且編碼至少一種異源基因的載體轉型的細胞。本揭露的宿主細胞優選地具有哺乳動物來源；最優選地具有人或小鼠來源。相信熟習此項技術者有能力優先地確定最適合於其目的的特定宿主細胞株。例示性宿主細胞株包括但不限於CHO、DG44和DUXB11（中國倉鼠卵巢系，DHFR-）、HELA（人宮頸癌）、CVI（猴腎系）、COS（具有SV40 T抗原的CVI的衍生物）、R1610（中國倉鼠成纖維細胞）、BALBC/3T3（小鼠成纖維細胞）、HAK（倉鼠腎系）、SP2/O（小鼠骨髓瘤）、P3x63-Ag3.653（小鼠骨髓瘤）、BFA-1c1BPT（牛內皮細胞）、RAJI（人淋巴細胞）、PER.C6 ®、NS0、CAP、BHK21和HEK 293（人腎）。在一個特定實施例中，宿主細胞選自：CHO細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、PER.C6 ®細胞、NS0細胞和CAP細胞。宿主細胞株典型地可從商業服務、美國組織培養物保藏中心（American Tissue Culture Collection）或公開的文獻中獲得。
將本揭露的分離的核酸分子或載體引入宿主細胞中可以通過熟習此項技術者熟知的多種技術來完成。這些技術包括但不限於轉染（包括電泳和電穿孔）、原生質體融合、磷酸鈣沈澱、與包膜DNA的細胞融合、顯微注射和完整病毒感染。參見Ridgway, A. A. G. " Mammalian Expression Vectors" 第24.2章, 第470-472頁 Vectors, Rodriguez和Denhardt編(Butterworths, Boston, Mass. 1988)。可以經由電穿孔將質體引入宿主中。使轉型的細胞在適合於產生輕鏈和重鏈的條件下生長，並且測定重鏈和/或輕鏈蛋白質合成。例示性測定技術包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）或螢光啟動細胞分選儀分析（FACS）、免疫組織化學等。
使包含本揭露的分離的核酸分子或載體的宿主細胞在適當生長培養基中生長。如本文所用，術語“適當生長培養基”是指含有細胞生長所需的營養物的培養基。細胞生長所需的營養素可以包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素、礦物質和生長因子。任選地，培養基可以含有一種或多種選擇因子。任選地，培養基可以含有小牛血清或胎牛血清（FCS）。在一個實施例中，培養基基本上不含IgG。生長培養基通常將例如通過藥物選擇或必需營養素的缺乏來選擇含有DNA構築體的細胞，所述營養素通過DNA構築體上或與DNA構築體共轉染的選擇性標記來補充。所培養的哺乳動物細胞通常在市售的含血清或無血清培養基（例如，MEM、DMEM、DMEM/F12）中生長。在一個實施例中，培養基是CDoptiCHO（Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德）。在另一個實施例中，培養基是CD17（Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德）。適合於所用特定細胞株的培養基的選擇在一般熟習此項技術者的水平內。
在一些實施例中，適用於本發明的宿主細胞是昆蟲來源的。在一些實施例中，合適的昆蟲宿主細胞包括例如從草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）（Sf）分離的細胞株或從粉紋夜蛾（richoplusia ni）（Tni）分離的細胞株。熟習此項技術者將能夠容易地確定任何Sf或Tni細胞株的適用性。例示性昆蟲宿主細胞包括而不限於Sf9細胞、Sf21細胞、和High Five™細胞。例示性昆蟲宿主細胞還包括而不限於不受外來病毒污染的任何Sf或Tni細胞株，例如Sf-彈狀病毒（rhabdovirus）陰性（Sf-RVN）和Tn-野田村病毒（nodavirus）陰性（Tn-NVN）細胞。其他適合的宿主昆蟲細胞是熟習此項技術者已知的。在一個特定實施例中，昆蟲宿主細胞是Sf9細胞。
本揭露的多個方面提供了一種選殖本文所述的核酸分子的方法，所述方法包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，並且將所得載體引入合適的細菌宿主菌株中。如本領域中已知，核酸的複雜二級結構（例如，長回文區）可能不穩定並且難以在細菌宿主菌株中選殖。例如，本揭露的包含第一ITR和第二ITR（例如，非AAV細小病毒ITR，例如HBoV1 ITR）的核酸分子可能難以使用常規方法來選殖。長DNA回文序列抑制DNA複製並且在大腸桿菌（ E. coli）、芽孢桿菌屬（ Bacillus）、鏈球菌屬（ Streptococcus）、鏈黴菌屬（ Streptomyces）、釀酒酵母（ S. cerevisiae） 、小鼠和人的基因體中不穩定。這些效應是由於通過鏈內鹼基配對形成髮夾或十字形結構所致。在大腸桿菌中，在SbcC或SbcD突變體中可以顯著克服對DNA複製的抑制。SbcD是核酸酶亞基，並且SbcC是SbcCD複合物的ATP酶亞基。大腸桿菌SbcCD複合物是負責防止長回文序列複製的外切核酸酶複合物。SbcCD複合物是具有ATP依賴性雙股DNA外切核酸酶活性和ATP非依賴性單股DNA內切核酸酶活性的核複合物。SbcCD可以識別DNA回文序列並通過攻擊所產生的髮夾結構來瓦解複製叉。
在某些實施例中，合適的細菌宿主菌株不能拆分十字形DNA結構。在某些實施例中，合適的細菌宿主菌株包含SbcCD複合物中的破壞。在一些實施例中，SbcCD複合物中的破壞包含SbcC基因和/或SbcD基因中的基因破壞。在某些實施例中，SbcCD複合物中的破壞包含SbcC基因中的基因破壞。包含SbcC基因中的基因破壞的各種細菌宿主菌株是本領域中已知的。例如而不限於，細菌宿主菌株PMC103包含基因型 sbcC 、 recD 、 mcrA 、 ΔmcrBCF；細菌宿主菌株PMC107包含基因型 recBC 、 recJ 、 sbcBC 、 mcrA 、 ΔmcrBCF；並且細菌宿主菌株SURE包含基因型 recB 、 recJ 、 sbcC 、 mcrA 、 ΔmcrBCF 、 umuC 、 uvrC。因此，在一些實施例中，選殖本文所述的核酸分子的方法包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，並且將所得載體引入宿主菌株PMC103、PMC107或SURE中。在某些實施例中，選殖本文所述的核酸分子的方法包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，並且將所得載體引入宿主菌株PMC103中。
合適的載體是本領域中已知的並且描述於本文中的其他地方。在某些實施例中，用於本揭露的選殖方法中的合適的載體是低複製載體。在某些實施例中，用於本揭露的選殖方法中的合適的載體是pBR322。
因此，本揭露提供了選殖核酸分子的方法，其包括將能夠形成複雜二級結構的核酸分子插入合適的載體中，和將所得載體引入包含SbcCD複合物中的破壞的細菌宿主菌株中，其中核酸分子包含第一反向末端重複序列（ITR）和第二ITR，其中第一ITR和/或第二ITR包含與SEQ ID NO. 12-23中所示的核苷酸序列至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%相同的核苷酸序列或其功能衍生物。 多肽的產生
本揭露還提供了由本揭露的核酸分子編碼的多肽。在其他實施例中，本揭露的多肽由包含本揭露的分離的核酸分子的載體編碼。在又其他實施例中，本揭露的多肽由包含本揭露的分離的核酸分子的宿主細胞產生。
在其他實施例中，本揭露還提供了產生具有FVIII活性的多肽的方法，其包括：在產生具有FVIII活性的多肽的條件下培養本揭露的宿主細胞，以及回收具有FVIII活性的多肽。在一些實施例中，具有FVIII活性的多肽的表現相對於在相同條件下培養但包含含有SEQ ID NO: 32的參考核苷酸序列（親本FVIII核苷酸序列）的宿主細胞而言增加。
在其他實施例中，本揭露提供了增加具有FVIII活性的多肽的表現的方法，其包括在由核酸分子表現具有FVIII活性的多肽的條件下培養本揭露的宿主細胞，其中具有FVIII活性的多肽的表現相對於在相同條件下培養但包含含有SEQ ID NO: 32的參考核酸分子的宿主細胞而言增加。
在其他實施例中，本揭露提供了提高具有FVIII活性的多肽的產量的方法，其包括在由核酸分子產生具有FVIII活性的多肽的條件下培養宿主細胞，其中具有FVIII活性的多肽的產量相對於在相同條件下培養但包含含有SEQ ID NO: 32的參考核酸序列的宿主細胞而言增加。
多種方法可用於從本揭露的優化的核酸分子重組產生FVIII蛋白。所需序列的多核苷酸可通過從頭固相DNA合成或通過PCR誘變早期製備的多核苷酸來產生。寡核苷酸介導的誘變是製備核苷酸序列中的取代、插入、缺失或改變（例如，改變密碼子）的一種方法。例如，通過將編碼所需突變的寡核苷酸與單股DNA模板雜交來改變起始DNA。雜交後，DNA聚合酶用於合成整合了寡核苷酸引物的模板的完整第二互補鏈。在一個實施例中，基因工程例如基於引物的PCR誘變足以摻入本文所定義的改變以產生本揭露的多核苷酸。
對於重組蛋白生產，將本揭露的編碼FVIII蛋白的優化的多核苷酸序列插入適當的表現媒劑中，即含有所插入編碼序列的轉錄和轉譯所必需的元件的載體，或在RNA病毒載體的情況下為含有複製和轉譯所必需的元件的載體。
將本揭露的多核苷酸序列插入載體的適當閱讀框中。然後將表現載體轉染到將表現多肽的合適靶細胞中。本領域已知的轉染技術包括但不限於磷酸鈣沈澱（Wigler等人 1978, Cell14 : 725）和電穿孔（Neumann等人 1982, EMBO, J.1 : 841）。多種宿主表現載體系統可用於在真核細胞中表現本文所述的FVIII蛋白。在一個實施例中，真核細胞是動物細胞，包括哺乳動物細胞（例如HEK293細胞、PER.C6 ®、CHO、BHK、Cos、HeLa細胞）。本揭露的多核苷酸序列還可編碼允許FVIII蛋白分泌的信號序列。熟習此項技術者將理解，當FVIII蛋白被轉譯時，信號序列被細胞裂解以形成成熟蛋白。本領域已知各種信號序列，例如天然因子VII信號序列、天然因子IX信號序列和小鼠Igk輕鏈信號序列。可替代地，當不包括信號序列時，可通過裂解細胞回收FVIII蛋白。
本揭露的FVIII蛋白可以在轉基因動物（如齧齒類動物、山羊、綿羊、豬或牛）體內合成。術語“轉基因動物”是指已經將外來基因摻入基因體中的非人動物。因為這個基因是在種系組織中存在，其從親代傳遞給後代。將外源基因引入單細胞胚胎中（Brinster等人 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4438）。產生轉基因動物的方法是本領域已知的，包括產生免疫球蛋白分子的轉基因（Wagner等人 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376；McKnight等人 1983, Cell 34 : 335；Brinster等人 1983, Nature 306: 332；Ritchie等人 1984, Nature 312: 517；Baldassarre等人 2003, Theriogenology 59 : 831；Robl等人 2003, Theriogenology 59: 107；Malassagne等人 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267）。
表現載體可以編碼允許容易純化或鑒定重組產生的蛋白質的標籤。例子包括但不限於載體pUR278（Ruther等人 1983, EMBO J. 2: 1791），其中本文所述的FVIII蛋白編碼序列可以與lacZ編碼區同框連接到載體中，從而產生雜合蛋白；pGEX載體可用於表現具有谷胱甘肽S-轉移酶（GST）標籤的蛋白質。這些蛋白質通常是可溶的，並且可以通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，隨後在游離谷胱甘肽的存在下洗脫而容易地從細胞中純化。載體包括切割位點（例如，PreCission Protease（Pharmacia，新澤西州皮派克）），以便在純化後容易除去標籤。
出於本揭露的目的，可以使用許多表現載體系統。這些表現載體典型地可作為附加體或作為宿主染色體DNA的組成部分在宿主生物中複製。表現載體可包括表現控制序列，包括但不限於啟動子（例如天然關聯的或異源啟動子）、增強子、信號序列、剪接信號、增強子元件和轉錄終止序列。優選地，表現控制序列是能夠轉型或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統。表現載體還可以利用衍生自動物病毒的DNA元件，所述動物病毒如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒（RSV、MMTV或MOMLV）、巨細胞病毒（CMV）或SV40病毒。其他涉及具有內部核糖體結合位點的多順反子系統的使用。
一般來說，表現載體含有選擇標記（例如胺苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性或新黴素抗性）以允許檢測用所需DNA序列轉型的那些細胞（參見例如，Itakura等人, 美國專利4,704,362）。可以通過引入一種或多種標記來選擇已將DNA整合至其染色體中的細胞，所述一種或多種標記允許選擇經轉染的宿主細胞。所述標記可以提供對營養缺陷型宿主的原營養、殺生物劑抗性（例如抗生素）或對重金屬如銅的抗性。選擇性標記基因可以直接與待表現的DNA序列連接，或者通過共轉型引入同一細胞中。
可用於表現優化的FVIII序列的載體的例子是NEOSPLA（美國專利號6,159,730）。此載體含有巨細胞病毒啟動子/增強子、小鼠β珠蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素多腺苷酸化序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1和外顯子2、二氫葉酸還原酶基因和前導序列。已發現此載體在摻入可變區和恒定區基因、細胞中轉染、隨後在含有G418的培養基中選擇和甲胺蝶呤擴增後，會導致非常高水平的抗體表現。在美國專利號5,736,137和5,658,570中也傳授了載體系統，這些文獻各自通過引用以其整體併入本文。此系統提供高表現水平，例如＞ 30 pg/細胞/天。其他例示性載體系統揭露於例如美國專利號6,413,777中。
在其他實施例中，可使用多順反子構築體表現本揭露的多肽。在這些表現系統中，可以從單個多順反子構築體產生多個目的基因產物，如多聚體結合蛋白的多個多肽。這些系統有利地使用內部核糖體進入位點（IRES）以在真核宿主細胞中提供相對較高水平的多肽。在美國專利號6,193,980中揭露了相容的IRES序列，該專利也併入本文。
更一般地，一旦製備了編碼多肽的載體或DNA序列，就可以將表現載體引入適當的宿主細胞中。也就是說，所述宿主細胞可被轉型。如上所述，可以通過熟習此項技術者熟知的各種技術來實現將質體引入宿主細胞中。轉型的細胞在適於產生FVIII多肽的條件下生長，並進行FVIII多肽合成測定。例示性測定技術包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（RIA）或螢光啟動細胞分選儀分析（FACS）、免疫組織化學等。
在描述用於從重組宿主分離多肽的過程時，術語“細胞”和“細胞培養物”可互換使用以表示多肽來源，除非另有明確說明。換言之，從“細胞”中回收多肽可以意指從離心沈澱的全細胞，或從含有培養基和懸浮細胞二者的細胞培養物中回收。
用於蛋白質表現的宿主細胞株優選是哺乳動物來源的；最優選是人或小鼠來源的，因為本揭露的分離的核酸已被優化用於在人細胞中表現。上文已經描述了例示性宿主細胞株。在產生具有FVIII活性的多肽的方法的一個實施例中，所述宿主細胞是HEK293細胞。在產生具有FVIII活性的多肽的方法的另一個實施例中，所述宿主細胞是CHO細胞。
編碼本揭露的多肽的基因也可以在非哺乳動物細胞（如細菌或酵母或植物細胞）中表現。在這一方面，應當理解，也可以轉型多種單細胞非哺乳動物微生物如細菌；即那些能夠在培養或發酵中生長的那些微生物。易於轉型的細菌包括以下的成員：腸桿菌科，如大腸桿菌（Escherichia coli）或沙門氏菌屬（Salmonella）的菌株；芽孢桿菌科，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；肺炎球菌屬（Pneumococcus）；鏈球菌屬（Streptococcus）和流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）。還應理解，當在細菌中表現時，多肽典型地會成為內含體的一部分。必須分離、純化多肽，然後將其組裝成功能性分子。
可替代地，可將本揭露的優化的核苷酸序列摻入轉基因中以引入轉基因動物的基因體中並隨後在轉基因動物的乳汁中表現（參見，例如Deboer等人, US 5,741,957，Rosen, US 5,304,489，和Meade等人, US 5,849,992）。合適的轉基因包括與來自乳腺特異性基因的啟動子和增強子可操作連接的多肽的編碼序列（如酪蛋白或β乳球蛋白）。
體外生產允許按比例放大以得到大量的所希望的多肽。在組織培養條件下用於哺乳動物細胞培養的技術是本領域已知的並且包括同質懸浮培養（例如在氣升式反應器或連續攪拌反應器中），或在瓊脂糖上微珠或陶瓷盒上的固定化或包埋的細胞培養（例如在中空纖維、微膠囊中）。如果必要和/或需要，可以通過常規層析方法純化多肽溶液，例如凝膠過濾，離子交換層析，DEAE-纖維素層析或（免疫）親和層析，例如，在合成鉸鏈區多肽的優選生物合成後或在本文所述的HIC層析步驟之前或之後。親和標籤序列（例如His(6)標籤）可任選地附接或包含在多肽序列內以促進下游純化。
一旦表現後，所述FVIII蛋白可以根據本領域的標準程式純化，包括硫酸銨沈澱、親和柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等（一般參見Scopes，Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982))）。對於藥物用途，至少約90%至95%均一性的基本上純的蛋白質是優選的，98%至99%或更高均一性是最優選的。 醫藥組合物
含有本揭露的分離的核酸分子、核酸分子編碼的具有FVIII活性的多肽、載體或宿主細胞的組合物可以含有合適的醫藥上可接受的載劑。例如，所述組合物可以含有有助於將活性化合物加工成設計用於遞送至作用位點的製劑的賦形劑和/或助劑。
醫藥組合物可以被配製用於通過推注注射的腸胃外投予（即靜脈內、皮下或肌內）。注射用配製品能以單位劑型存在，例如在添加有防腐劑的安瓿中或多劑量容器中。組合物可以採取諸如於油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液等形式，並且含有諸如助懸劑、穩定劑和/或分散劑等配製劑。可替代地，活性成分可以呈粉末形式，用於用合適的媒劑（例如，無熱原水）來構造。
適合於腸胃外投予的配製品還包括呈水溶性形式（例如，水溶性鹽）的活性化合物的水溶液。另外，可以投予作為適當油性注射懸浮液的活性化合物的懸浮液。合適的親脂溶劑或媒劑包括脂肪油（例如，芝麻油）或合成脂肪酸酯（例如，油酸乙酯或甘油三酯）。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和葡聚糖。任選地，懸浮液還可以含有穩定劑。脂質體還可以用於包封本揭露的分子，用於遞送至細胞或間質空間中。例示性醫藥上可接受的載劑是生理上相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些實施例中，組合物包含等滲劑，例如糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇）或氯化鈉。在其他實施例中，組合物包含增強活性成分的貯存期限或有效性的醫藥上可接受的物質（如潤濕劑）或少量輔助物質（如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液）。
本揭露的組合物可以呈多種形式，包括例如液體（例如，可注射和可輸注的溶液）、分散液、懸浮液、半固體和固體劑型。優選形式取決於投予方式和治療應用。
組合物可以配製為溶液、微乳液、分散液、脂質體或其他適合於高藥物濃度的有序結構。無菌可注射溶液可以通過以下方式製備：將活性成分以所需量摻入視需要具有上文所列舉成分中的一種或組合的適當溶劑中，之後過濾滅菌。通常，分散液是通過以下方式來製備：將活性成分摻入無菌媒劑中，所述無菌媒劑含有基礎分散介質和來自上文所列舉的那些成分的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，這些方法從先前無菌過濾的溶液產生活性成分和任何其他所需成分的粉末。可以例如通過以下方式維持溶液的適當流動性：通過使用諸如卵磷脂等包衣，在分散液的情況下通過維持所需細微性，以及通過使用表面活性劑。可注射組合物的延長吸收可以通過以下方式來實現：在組合物中包括延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鹽和明膠。
活性成分可以用受控釋放配製品或裝置來配製。此類配製品和裝置的例子包括植入物、經皮貼劑和微囊化遞送系統。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。製備此類配製品和裝置的方法是本領域已知的。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., 紐約, 1978。
可注射長效配製品可以通過以下方式來製備：形成藥物於生物可降解聚合物（如聚丙交酯-聚乙交酯）中的微囊化基質。根據藥物與聚合物的比率以及所採用聚合物的性質，可以控制藥物釋放速率。其他例示性生物可降解聚合物是聚原酸酯和聚酐。可注射長效配製品還可以通過將藥物捕集於脂質體或微乳液中來製備。
可以將補充性活性化合物摻入組合物中。在一個實施例中，用另一凝血因子或其變體、片段、類似物或衍生物配製本揭露的嵌合蛋白。例如，凝血因子包括但不限於因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纖維蛋白原、血管性血友病因子或重組可溶性組織因子（rsTF）或前述任一種的啟動形式。止血劑之凝血因子還可以包括抗纖維蛋白溶解藥，例如ε-胺基己酸、胺甲環酸。
可以調節劑量方案以提供最佳所需反應。例如，可以投予單次推注，可以隨時間投予若干次分開劑量，或者可以如治療情況的緊迫性所示的成比例地減少或增加劑量。有利的是以劑量單位形式配製腸胃外組合物，以便於投予和劑量均勻。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., 賓夕法尼亞州伊斯頓 1980)。
除了活性化合物以外，液體劑型還可以含有惰性成分，如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯。
合適的醫藥載劑的非限制性例子也描述於E. W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑的一些例子包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。組合物還可以含有pH緩衝試劑以及潤濕劑或乳化劑。
對於口服投予，醫藥組合物可以採取通過常規手段製備的片劑或膠囊的形式。還可以將組合物製備為液體，例如糖漿或懸浮液。液體可以包括助懸劑（例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪）、乳化劑（卵磷脂或阿拉伯膠）、非水性媒劑（例如，扁桃仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油）和防腐劑（例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸）。製劑還可以包括調味劑、著色劑和甜味劑。可替代地，組合物可以作為乾產品存在，用於用水或另一種合適的媒劑來構造。
對於經頰投予，組合物可以採取根據常規方案的片劑或錠劑的形式。
對於通過吸入投予，根據本揭露使用的化合物便捷地以含有或不含賦形劑的霧化氣溶膠的形式或以氣溶膠噴霧劑的形式從任選地具有推進劑的加壓包或霧化器遞送，所述推進劑是例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供遞送計量量的閥來確定。例如用於吸入器或吹入器中的明膠的膠囊和藥筒可以配製含有化合物與諸如乳糖或澱粉等合適的粉末基質的粉末混合物。
醫藥組合物還可以被配製用於作為例如含有常規栓劑基質（如可可脂或其他甘油酯）的栓劑或保留灌腸劑經直腸投予。
在一個實施例中，醫藥組合物包含具有因子VIII活性的多肽、編碼所述具有因子VIII活性的多肽的經優化的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或包含所述載體的宿主細胞和醫藥上可接受的載劑。在一些實施例中，組合物是通過選自以下的途徑來投予：局部投予、眼內投予、腸胃外投予、鞘內投予、硬膜下投予和口服投予。腸胃外投予可以是靜脈內或皮下投予。 治療方法
在一些方面中，本揭露涉及治療有需要的個體的疾病或病症的方法，其包括投予本文所公開的核酸分子、載體、多肽或醫藥組合物。
在一些實施例中，本揭露涉及治療出血病症的方法。在一些實施例中，本揭露涉及治療血友病A的方法。
分離的核酸分子、載體或多肽可以用以下方式投予：靜脈內、皮下、肌內或通過任何粘膜表面，例如口服、舌下、經頰、舌下、經鼻、經直腸、經陰道或通過經肺途徑。也可將分離的核酸分子、載體或多肽通過神經內、眼內和鞘內投予。可以將凝血因子蛋白植入或連接生物聚合物固相支持物，從而允許將嵌合蛋白緩慢釋放至所需部位。
在一個實施例中，分離的核酸分子、載體或多肽的投予途徑是腸胃外的。如本文所用的術語腸胃外包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸或陰道投予。在一些實施例中，將分離的核酸分子、載體或多肽靜脈內投予。雖然所有這些投予形式都明確地考慮在本揭露的範圍內，但是投予形式可以是注射用溶液，特別是用於靜脈內或動脈內注射或滴注。
用於治療病症的本揭露的組合物的有效劑量根據許多不同因素而變化，所述因素包括投予方式、靶位點、患者的生理狀態、患者是人還是動物、投予的其他藥物以及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者是人，但是也可以治療非人哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。治療劑量可以使用熟習此項技術者已知的常規方法逐步調整，以優化安全性和功效。
本揭露的核酸分子、載體或多肽可以任選地與在需要治療（例如，預防性或治療性）的病症或病況的治療中有效的其他藥劑組合投予。
如本文所用，與輔助療法結合或組合的本揭露的分離的核酸分子、載體或多肽的投予意指依序、同時、同延、並行、伴隨或同期投予或應用所述療法和所公開的多肽。熟習此項技術者將理解，可以定時投予或施加組合的治療性方案的各種組分以增強治療的總體有效性。基於所選輔助療法和本說明書的傳授內容，技術人員（例如，醫師）在不進行過度實驗的情況下便能夠容易地辨別有效的組合治療方案。
應進一步瞭解，本揭露的分離的核酸分子、載體或多肽可以與一種或多種藥劑結合或組合使用（例如，以提供組合治療方案）。可以與本揭露的多肽或多核苷酸組合的例示性藥劑包括代表用於所治療的特定病症的當前護理標準的藥劑。此類藥劑在本質上可以是化學的或生物的。術語“生物劑（biologic）”或“生物劑（biologic agent）”是指預期用作治療劑的從活的生物體和/或其產物製備的任何醫藥活性劑。
要與本揭露的多核苷酸或多肽組合使用的藥劑的量可以隨個體變化，或者可以根據本領域的知識來投予。參見例如，Bruce A Chabner等人, Antineoplastic Agents,Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287（Joel G. Hardman等人編, 第9版 1996）。在另一個實施例中，投予符合護理標準的量的這種藥劑。
在一個實施例中，本文還公開了一種套組，所述套組包含本文公開的核酸分子以及向有需要的個體投予所述核酸分子的說明書。在另一個實施例中，本文公開了一種用於產生本文所提供的核酸分子的桿狀病毒系統。所述核酸分子是在昆蟲細胞中產生。在另一個實施例中，提供了一種針對表現構築體的奈米顆粒遞送系統。表現構築體包含本文公開的核酸分子。 基因療法
在一些實施例中，本文公開的核酸分子用於基因療法。本文公開的優化的FVIII核酸分子可用於需要表現FVIII的任何情境。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 33的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
例如，已經探索出體基因療法作為血友病A的可能治療。基因療法是血友病的特別有吸引力的治療，因為其可能在載體的單次投予後通過連續內源性產生FVIII來治癒疾病。血友病A非常適合於基因替代方法，因為其臨床表現可完全歸因於缺少以微小量（200 ng/ml）在血漿中循環的單一基因產物（FVIII）。
在一態樣，本文所述的核酸分子可用於AAV基因療法。AAV能夠感染許多哺乳動物細胞。參見例如，Tratschin等人 (1985) Mol. Cell Biol. 5:3251-3260和Grimm等人 (1999) Hum. Gene Ther. 10:2445-2450。rAAV載體攜帶編碼目的基因或其片段的核酸序列，其處於指導基因產物在細胞中表現的調節序列的控制下。在一些實施例中，將rAAV與載劑和適於投予的其他組分一起配製。
在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於慢病毒基因療法。慢病毒是RNA病毒，其中病毒基因體是RNA。當宿主細胞被慢病毒感染時，基因體RNA被反轉錄成DNA中間體，所述中間體被非常有效地整合到所感染細胞的染色體DNA中。在一些實施例中，將慢病毒與載劑和適於投予的其他組分一起配製。在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於腺病毒療法。腺病毒用於基因療法的綜述可參見例如Wold等人 (2013) Curr Gene Ther. 13(6):421-33)。在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於非病毒基因療法。
本揭露的優化的FVIII蛋白可以在哺乳動物（例如，人患者）體內產生，使用基因治療方法對於選自以下群組的出血疾病或病症的治療將是治療上有益的：出血凝結病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、出血症、出血至肌肉中、口腔出血症、創傷、頭部創傷、胃腸出血、顱內出血、腹內出血、胸腔內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血、腹膜後間隙出血和髂腰肌鞘出血。在一個實施例中，出血疾病或病症是血友病。在另一個實施例中，所述出血性疾病或病症是血友病A。這涉及投予與合適的表現控制序列可操作地連接的經優化的FVIII編碼核酸。在某些實施例中，這些序列被摻入病毒載體中。用於此類基因療法的合適病毒載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、EB病毒載體、乳多空病毒載體、痘苗病毒載體、單純皰疹病毒載體和腺相關病毒（AAV）載體。所述病毒載體可以是複製缺陷型病毒載體。在其他實施例中，腺病毒載體在其E1基因或E3基因中有缺失。在其他實施例中，所述序列被摻入熟習此項技術者已知的非病毒載體中。
在另一態樣，本文公開的方法提供了用於靶向特異性改變活生物體的遺傳信息（例如基因體）的技術。如本文所用，術語“改變”或“遺傳信息的改變”是指細胞基因體的任何改變。在治療遺傳病症的上下文中，改變可包括但不限於插入、缺失和/或校正。
在一些方面，改變還可以包括基因嵌入、剔除或減弱。如本文所用，術語“嵌入”是指將DNA序列或其片段添加到基因體中。這種待嵌入的DNA序列可以包括一個或多個完整的基因，可以包括與前述的基因或任何部分或片段關聯的調節序列。例如，可以將編碼野生型蛋白質的cDNA插入攜帶突變基因的細胞的基因體中。嵌入策略不需要替換全部或部分缺陷基因。在一些情況下，嵌入策略可進一步涉及用所提供的序列取代現有序列，例如用野生型複製取代突變等位基因。術語“剔除”是指消除基因或基因的表現。例如，可以通過缺失或添加核苷酸序列從而導致閱讀框破壞來剔除基因。作為另一個例子，可以通過用不相關序列替代基因的一部分來剔除基因。如本文所用的術語“減弱”是指減少基因或其一種或多種基因產物的表現。作為基因減弱的結果，可以減弱蛋白質活性或功能，或者可以降低或消除蛋白質水平。
在一些實施例中，本文公開的核酸序列用於基因體編輯。基因體編輯通常是指優選以精確或預先確定的方式修飾基因體的核苷酸序列的過程。本文所述的基因體編輯方法的例子包括使用定點核酸酶在基因體中的精確靶位置切割去氧核糖核酸（DNA），從而在基因體中的特定位置產生單股或雙股DNA斷裂的方法。如Cox等人 (2015). Nature Medicine 21(2): 121-31中最近所綜述的，這樣的斷裂可以並定期地通過天然的內源性細胞過程如同源定向修復（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）來修復。這兩個主要的DNA修復過程由一系列替代途徑組成。NHEJ直接連接由雙股斷裂導致的DNA末端，有時會丟失或添加核苷酸序列，這可能會破壞或增強基因表現。HDR利用同源序列或供體序列作為模板，用於在斷裂點插入限定的DNA序列。同源序列可以在內源性基因體中，如姐妹染色單體。可替代地，供體可以是外源核酸，如質體、單股寡核苷酸、雙股寡核苷酸、雙股體寡核苷酸或病毒，其具有與核酸酶切割的基因座高度同源的區域，但還可以含有額外的序列或序列變化，包括可以摻入切割的靶基因座中的缺失。第三種修復機制可以是微同源介導的末端連接（MMEJ），也稱為“替代NHEJ”，其中遺傳結局與NHEJ類似，因為在切割位點可發生小的缺失和插入。MMEJ可以利用DNA斷裂位點兩側的幾個鹼基對的同源序列來驅動更有利的DNA末端連接修復結局，並且最近的報導進一步闡明了該過程的分子機制，參見例如Cho和Greenberg (2015). Nature 518, 174-76。在一些情況下，可以基於對DNA斷裂位點處的潛在微同源性的分析來預測可能的修復結局。
這些基因體編輯機制中的每一種都可用於產生所需的基因體改變。基因體編輯過程中的一個步驟可以是在預期突變位點附近的靶基因座中產生一個或兩個DNA斷裂，後者作為雙股斷裂或作為兩個單股斷裂。這可以通過使用定點多肽，如CRISPR內切核酸酶系統等來實現。
在另一態樣，本文所述的核酸分子可用於脂質奈米顆粒（LNP）介導的FVIII ceDNA遞送。由陽離子脂質與其他脂質組分如中性脂質、膽固醇、PEG、PEG化脂質和寡核苷酸形成的脂質奈米顆粒已用於阻斷血漿中核酸的降解並促進細胞對寡核苷酸的攝取。此類脂質奈米顆粒可用於將本文所述的核酸分子遞送給個體。
本揭露提供了增加個體中具有FVIII活性的多肽的表現的方法，其包括向有需要的個體投予本揭露的分離的核酸分子，其中所述多肽的表現相對於包含SEQ ID NO: 32的參考核酸分子而言增加。本揭露還提供了增加個體中具有FVIII活性的多肽的表現的方法，其包括向有需要的個體投予本揭露的載體，其中所述多肽的表現相對於包含參考核酸分子的載體增加。
本文所述的所有各個方面、實施例和選擇都能以任何和所有變化組合。
本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都通過引用併入本文，併入程度就像每個單獨的出版物、專利或專利申請被具體地且單獨地指出以通過引用併入一樣。
已經一般性地描述了本揭露，通過參考本文所提供的實例可以獲得進一步的理解。這些實例僅用於說明的目的，而不旨在是限制性的。 實例 實例 1 ：經修飾的 FVIIIXTEN 表現匣
假設轉基因表現水平可以通過針對靶宿主對編碼序列進行密碼子優化來提高。如美國公開號20190185543中所述，在先前的研究中使用V1.0 FVIIIco6XTEN表現匣（SEQ ID NO: 32）（ 圖 1）證明了更高的FVIII表現水平。然而，為了進一步改善靶標特異性並降低免疫原性，將FVIIIXTEN表現匣進行密碼子優化，其中缺失了CpG模體，以降低針對編碼具有細小病毒ITR的FVIIIXTEN表現匣的DNA載體產生的先天免疫反應。在該研究中，修飾的V2.0 FVIIIXTEN表現匣包含與XTEN 144肽融合的編碼B結構域缺失的人因子VIII的經密碼子優化的cDNA（BDDcoFVIII）（FVIIIXTEN），其在肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子（mTTR482）和增強子元件（A1MB2）、雜合合成內含子（嵌合內含子）、土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）和牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號的調節下（SEQ ID NO: 14）（ 圖 1）。修飾的V2.0 FVIIIXTEN表現匣的體內功能已經用單股（ss）或封閉末端（ce）DNA形式的不同細小病毒ITR通過在hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠中經由流體動力學尾靜脈注射進行全身遞送來證明。 實例 2 ：單股 FVIIIXTEN （ ssFVIIIXTEN ） DNA
經修飾的FVIIIXTEN在體內顯示出顯著更高水平的活性
假設在ITR區域內形成的髮夾驅動了轉基因的更高水平的長期持久表現。為了驗證經修飾的FVIIIXTEN表現匣在體內的功能，在hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠中測試包含V1.0或V2.0人FVIIIXTEN與預先形成的紅病毒B19 ITR的單股DNA（ssDNA）。這些小鼠含有人 FVIII-R593C轉基因，所述轉基因被設計為具有鼠類白蛋白（ Alb）啟動子，所述啟動子驅動含有在輕度血友病A患者中經常觀察到的突變的改變的人凝結因子VIII（FVIII）cDNA的表現。這些小鼠還攜帶 FVIII基因的剔除並且缺乏內源性FVIII蛋白質。這些雙突變小鼠耐受人FVIII注射，並且沒有FVIII活性。它們在用人FVIII處理後產生非常少的抑制性抗體並且缺乏FVIII反應性T細胞或B細胞。hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠進一步描述於Bril, 等人 (2006) Thromb. Haemost. 95(2): 341-7中。
通過在95ºC使MscI消化的雙股DNA片段產物（FVIII表現匣和質體骨架）變性（變性），然後在4ºC冷卻（複性）以允許回文ITR序列折疊來產生具有預先形成的B19 ITR的ssFVIIIXTEN（ 圖 2）。然後將ssFVIIIXTEN以800 μg/kg hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠經由流體動力學尾靜脈注射進行全身注射。以指定的間隔持續5.5個月從注射的小鼠收集血漿樣品，並且根據製造商的說明通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定測量FVIII活性。
對於V1.0和V2.0 ssFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 3中。結果顯示，與V1.0 ssFVIIIXTEN相比，V2.0注射佇列的FVIII活性顯著改善。然而，直到第56天觀察到FVIII表現的初始下降，但隨後在第168天之前水平穩定，表明來自注射動物肝臟的兩側為細小病毒ITR的V2.0 ssFVIIIXTEN的持續表現。因此，這些結果驗證了經修飾的FVIIIXTEN的功能性，與體內V1.0相比具有FVIII活性的長期持續表現。
人博卡病毒（HBoV1）ITR顯示體內FVIII表現的超生理水平
為了確定ITR對轉基因表現的穩定性和長期持久性的影響，用人博卡病毒（HBoV1）、人紅病毒B19、鵝細小病毒（GPV）或它們的變體ITR在體內測試FVIIIXTEN的改進形式。基於病毒基因體在其各自宿主中的長期持久性所需的熱穩定性和ITR特異性元件來工程化這些ITR。在先前的美國專利申請號63/069,114中描述了所測試的ITR變體和所預測的二級結構。使用金門組裝（Golden Gate Assembly）將單個變體ITR選殖到合成的FVIIIXTEN表現構築體中，並通過在Genewiz測序設施上通過測序驗證。然後如上所述將序列驗證的構築體用於產生ssFVIIIXTEN（ssDNA），然後以200、800或1600 μg/kg經由流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠中。以指定的間隔持續5.5個月從注射的小鼠收集血漿樣品，並且根據製造商的說明通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定測量FVIII活性。
對於V2.0 ssFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 4中。結果示出了儘管在不同水平下，但在所有測試的細小病毒ITR中的長期持久的FVIIIXTEN表現。與其他細小病毒ITR相比，測試的所有GPV ITR的變體或雜合物示出了FVIIIXTEN表現水平持續下降。相比之下，HBoV1和B19 ITR示出了FVIIIXTEN初始下降直至第56天並且然後至第168天穩定，這表明體內FVIIIXTEN轉基因的ITR依賴性持久性。與GPV ITR不同，B19和HBoV1 ITR均顯示顯著更高的FVIII表現水平，與測試的變體無關，表明FVIIIXTEN轉基因在體內的ITR依賴性穩定性。
在測試的不同細小病毒ITR中，HBoV1 ITR在hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠中顯示出占正常FVIII活性的顯著更高水平（＞ 1000%）。（ 圖 4）。這些結果驗證了具有不同細小病毒ITR的經修飾的FVIIIXTEN表現的功能，並且證明了ITR依賴性穩定性以及體內轉基因表現的持久性。 實例 3 ：封閉末端 FVIIIXTEN （ ceFVIIIXTEN ） DNA
雖然ssFVIIIXTEN（ssDNA）在體內表現經修飾的FVIIIXTEN表現匣方面是有效的，仍存在與有待用作非病毒基因療法載體的ssDNA相關的若干限制。其中一個是由於用於產生質體DNA的原核宿主（大腸桿菌）引起的內毒素污染水平，所述質體DNA還含有在大腸桿菌中選擇和擴增所需的外來序列，如抗生素抗性基因和原核複製起點。為了解決這些挑戰和局限，開發了一種基於真核細胞的系統，以產生處於包含具有細小病毒ITR的FVIIIXTEN表現匣的封閉端DNA（ceDNA）形式的DNA治療性藥物物質。ceDNA的遺傳構成類似於重組AAV載體DNA，但是構型不同。
為了產生這種DNA載體，利用桿狀病毒昆蟲細胞系統，所述系統廣泛用於生物製劑製造並且是FDA批准的用於重組流感疫苗製造的唯一平臺。在桿狀病毒系統中採用三種不同的ceDNA產生方法，如美國專利申請號63/069,073中所述。與起始材料（SM）相比，編碼具有AAV2或HBoV1 ITR的經修飾FVIIIXTEN的例示性純化ceDNA示於 圖 5A中。
為了驗證從ceDNA表現的經修飾的FVIIIXTEN的功能性，將純化的ceFVIIIXTEN以0.3 μg、1.0 μg或2.0 μg/小鼠（其分別相當於12 μg、40 μg和80 μg/kg）通過流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠中。以指定的間隔收集來自注射的小鼠的血漿樣品，並且通過生色測定測量FVIII活性，如上所述。
對於ceFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 5B中。結果顯示在HemA小鼠中的劑量依賴性反應，在注射後直至第56天，在最高測試劑量下觀察到FVIII表現的超生理水平（＞ 500%正常值）。有趣的是，當對小鼠注射1600 μg/kg的ssFVIIIXTEN時實現類似的表現水平，其比ceFVIIIXTEN劑量（80 μg/kg）高至少20倍（ 圖 4）。該資料表明與ssDNA形式相比，ceDNA提供更高水平的FVIII表現。因此，這些研究驗證了從ssDNA或ceDNA表現的經修飾的FVIIIXTEN的功能性，並確認了密碼子優化連同使用優化的ITR可以產生功能性轉基因並改善其長期持久性。 實例 4 ：經修飾的 FVIIIXTEN 表現匣
V2.0 FVIIIXTEN表現匣含有mTTR啟動子和增強子元件（參見 圖 1）。然而，該啟動子是小鼠肝特異性的，並且沒有被充分研究或表徵為確定在大動物模型或人患者中具有肝特異性。因此，在該研究中，通過用V2.0表現匣中的人肝特異性α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子（SEQ ID NO: 36）替代mTTR啟動子和增強子元件來產生V3.0 FVIIIXTEN表現匣（SEQ ID NO: 35）（ 圖 1）。 實例 5 ： FVIIIXTEN HBoV1 mTTR 與 A1AT ssDNA 體內功效
為了在體內驗證mTTR相對於A1AT啟動子的功能性，包含經密碼子優化的人FVIIIXTEN（ssFVIIIXTEN）與預先形成的HBoV1 ITR的單股DNA（ssDNA），產生 圖 6A中所描繪的構築體。通過在95ºC使PmlI消化的雙股DNA（dsDNA）片段產物（mTTR或A1AT FVIII表現匣和質體骨架）變性，然後在4ºC冷卻以允許回文ITR序列折疊來產生具有預先形成的HBoV1 ITR的ssFVIIIXTEN。將所得ssFVIIIXTEN通過0.8%至1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠分析顯示ssFVIIIXTEN的dsDNA大小的一半，表明有效的髮夾形成（ 圖 6B）。
將ssFVIIIXTEN以10 μg/小鼠經由流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中。以7天的間隔從注射小鼠中收集血漿樣品5.5個月。根據製造商的說明書，通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定來測量血漿FVIII活性。
對於ssFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 6C中。這些結果顯示，直至注射後第21天，FVIII表現水平相當，表明hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠動物模型中mTTR或A1AT啟動子表現的FVIIIXTEN水平沒有顯著差異。 實例 6 ： FVIIIXTEN AAV2 全長相對於截短的 ceDNA 的體內功效
已知腺相關病毒（AAV）載體通過ITR-ITR多聯化產生不同複製形式的病毒基因體（例如單體、二聚體或多聚體）。我們先前觀察到包含兩側為AAV2 WT ITR的V2.0密碼子優化的FVIIIXTEN（ceFVIIIXTEN）的封閉末端DNA（ceDNA）載體在桿狀病毒系統中產生截短種類的ceFVIIIXTEN以及單體和多聚體形式的載體基因體。參見例如，國際申請號PCT/US21/47218）
在本研究中，為了進一步研究截短種類的ceFVIIIXTEN的特性，我們通過連續洗脫電泳純化全長和截短種類的ceFVIIIXTEN，如國際申請號PCT/US21/47218中所述。通過瓊脂糖凝膠電泳測定ceFVIIIXTEN的兩種種類的純度，並且結果顯示對應於全長（8.3 kb）和截短（6.0 kb）種類的ceFVIIIXTEN大小的主要條帶（ 圖 7A）。
為了進一步驗證ceFVIIIXTEN的兩種種類的核苷酸序列，我們使用MiSeq Illumina序列分析儀對純化的ceFVIIIXTEN材料進行下一代序列（NGS）分析。 圖 7B所示的NGS結果顯示，全長ceFVIIIXTEN序列讀段的覆蓋率＞80%（上部小圖），截短的ceFVIIIXTEN種類的覆蓋率＞75%（下部小圖），其中一些雜質來自宿主細胞和/或桿狀病毒基因體。對NGS資料的進一步分析揭示，截短的ceFVIIIXTEN讀段缺失嵌合內含子區域的大部分，同時保留ceFVIIIXTEN的5'端的ITR序列（ 圖 7B，下部小圖）。
為了進一步驗證截短種類的ceFVIIIXTEN的功能性，將純化的全長或截短種類的ceFVIIIXTEN以40或80 μg/kg經由流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中。以7天的間隔從注射小鼠中收集血漿樣品，並根據製造商的說明書，通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定來測量血漿FVIII活性。對於ceFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 7C中。
結果顯示全長ceFVIIIXTEN注射佇列中FVIII表現的超生理水平。然而，用截短的ceFVIIIXTEN注射的動物直至注射後第21天在所測試的兩個劑量下顯示出低2倍的FVIII表現（ 圖 7C）。該資料進一步支援嵌合內含子促成體內V2.0密碼子優化的FVIIIXTEN的表現水平的提高（ 圖 7C）。 實例 7 ： FVIIIXTEN 封閉末端 DNA （ ceFVIIIXTEN ）體內功效
在該研究中，我們研究了編碼經修飾的FVIIIXTEN且兩側為AAV2或HBoV1 ITR的ceDNA的體內功效。如前所述，使用AAV2或HBoV1 ITR在桿狀病毒系統中產生ceFVIIIXTEN DNA（參見例如國際申請號PCT/US21/47218）。瓊脂糖凝膠用於分析每個ceDNA的純度，並與起始材料（SM）進行比較，如 圖 8A所示。
將純化的ceFVIIIXTEN以1.0 μg/小鼠或2.0 μg/小鼠（分別相當於40 μg/kg或80 μg/kg）經由流體動力學尾靜脈注射全身注射到hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中。以一定間隔收集來自注射小鼠的血漿樣品，並通過生色測定測量FVIII活性，如上所述。
對於ceFVIIIXTEN注射的動物，歸一化為占正常值百分比的血漿FVIII活性示於 圖 8B中。
結果顯示，兩側為AAV2或HBoV1 ITR的ceDNA載體的FVIII表現水平是可比的。如先前所見，FVIII在治療動物中的表現水平在第256天之前逐漸下降，表明載體在肝細胞中隨時間損失。這些研究驗證了從包含AAV2或HBoV1 ITR的ceDNA載體表現的經修飾的V2.0 FVIIIXTEN的功能性和長期持久性。
具體實施例的前述描述將如此充分地揭示本揭露的一般性質，其他人可以通過應用本領域技術範圍內的知識，在無需過度實驗並且不偏離本揭露總體概念的情況下容易地修改和/或調整此類具體實施例用於各種應用。因此，基於本文給出的傳授內容和指導，此類調整和修改旨在包含在所公開的實施例的等效方案的含義和範圍內。應理解，本文中的措辭或術語是出於描述而非限制的目的，因此本說明書的術語或措辭將由熟習此項技術者根據傳授內容和指導來解釋。
考慮到本文公開的說明書和實踐，本揭露的其他實施例對於熟習此項技術者而言是清楚的。所述說明書和實例旨在僅被視為例示性的，所附申請專利範圍指示了本揭露的真實範圍和精神。
本文引用的所有專利和出版物通過引用以其整體併入本文。 序列 表 1. 其他核苷酸和胺基酸序列
SEQ ID NO / 描述 核苷酸或胺基酸序列
SEQ ID NO. 1: HBoV1 5’ ITR GTGGTTGTACAGACGCCATCTTGGAATCCAATATGTCTGCCGGCTCAGTCATGCCTGCGCTGCGCGCAGCGCGCTGCGCGCGCGCATGATCTAATCGCCGGCAGACATATTGGATTCCAAGATGGCGTCTGTACAACCAC
SEQ ID NO.2: HBoV1 3’ ITR TTGCTTATGCAATCGCGAAACTCTATATCTTTTAATGTGTTGTTGTTGTACATGCGCCATCTTAGTTTTATATCAGCTGGCGCCTTAGTTATATAACATGCATGTTATATAACTAAGGCGCCAGCTGATATAAAACTAAGATGGCGCATGTACAACAACAACACATTAAAAGATATAGAGTTTCGCGATTGCATAAGCAA
SEQ ID NO.3: HBoV1-5’ITR- mTTR482-內含子- coBDDFVIIIXTEN (V2.0)-WPRE-bGHPolyA- HBoV1-3’ITR GTATACCTGCAGGCTAGCCACGTGTTGTTGTTGTACATGCGCCATCTTAGTTTTATATCAGCTGGCGCCTTAGTTATATAACATGCATGTTATATAACTAAGGCGCCAGCTGATATAAAACTAAGATGGCGCATGTACAACAACAACACATTAAAAGATATAGAGTTTCGCGATTGCAAGCTTGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGGAATTCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTACTCGAGGCCACCATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGA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SEQ ID NO.4: Sf密碼子優化HBoV1 NS1 GCGGCCGCGGATCCGCCACCATGGCATTCAATCCGCCCGTAATACGCGCATTTTCACAACCCGCCTTTACGTATGTCTTTAAGTTTCCGTACCCTCAATGGAAAGAGAAAGAGTGGCTACTGCACGCGTTGCTTGCCCACGGCACCGAGCAGTCCATGATTCAATTACGTAACTGTGCCCCACACCCGGACGAGGATATTATCCGGGACGATCTTCTAATAAGTTTGGAAGATAGGCATTTCGGGGCGGTCCTGTGTAAAGCGGTATACATGGCTACTACCACGTTGATGTCTCACAAGCAACGCAATATGTTCCCAAGGTGCGACATAATCGTTCAGTCAGAGTTAGGTGAAAAAAATTTACATTGTCATATTATCGTTGGAGGCGAAGGCCTATCAAAGAGAAACGCTAAGAGCTCTTGCGCTCAGTTTTACGGACTTATATTAGCAGAAATTATCCAGCGCTGTAAGAGTTTACTAGCCACCCGTCCGTTTGAGCCGGAAGAAGCGGATATATTTCATACGTTGAAGAAAGCGGAGCGCGAGGCCTGGGGTGGAGTTACTGGCGGTAACATGCAAATCTTACAATACAGGGACCGTCGGGGTGACCTGCATGCACAGACTGTTGATCCCCTCAGATTCTTCAAAAATTATTTGTTACCGAAGAACCGATGCATAAGTAGTTACAGCAAACCTGATGTCTGTACTAGCCCTGATAACTGGTTCATTCTGGCCGAAAAAACGTACTCGCATACACTTATCAATGGATTGCCGCTTCCCGAGCACTATCGAAAAAACTATCATGCCACCCTGGATAATGAAGTTATACCTGGACCACAGACTATGGCGTATGGAGGGAGAGGCCCTTGGGAACATTTACCCGAGGTGGGTGACCAGAGGCTTGCCGCAAGTTCCGTGAGCACTACGTATAAGCCAAACAAGAAGGAGAAGCTAATGCTCAACCTCCTCGACAAGTGTAAGGAGTTGAATCTTCTAGTTTATGAGGATCTTGTAGCGAACTGCCCAGAGCTGCTGCTCATGCTAGAAGGCCAACCTGGAGGTGCTCGACTCATCGAGCAAGTACTAGGAATGCATCACATCAATGTATGCTCGAATTTCACCGCGCTAACGTACCTCTTCCATCTGCATCCGGTGACATCGCTGGATAGTGACAACAAAGCGTTACAGCTTTTACTAATTCAAGGGTACAACCCCCTGGCAGTGGGGCATGCTCTCTGTTGTGTGTTAAACAAACAATTTGGTAAACAGAACACAGTCTGTTTTTACGGGCCAGCATCTACTGGGAAAACAAATATGGCAAAAGCGATTGTGCAGGGAATCCGGCTATATGGCTGCGTCAACCATCTTAACAAGGGTTTTGTTTTCAATGATTGTCGACAACGCCTCGTAGTCTGGTGGGAGGAATGCCTAATGCACCAGGACTGGGTGGAGCCAGCAAAGTGTATTCTTGGCGGGACCGAATGTCGTATCGACGTCAAGCACAGAGATTCTGTCCTATTGACACAAACGCCTGTAATAATTTCGACTAATCACGACATTTACGCCGTCGTGGGAGGGAATTCGGTGTCTCACGTTCACGCTGCGCCTCTCAAAGAACGGGTTATTCAGCTGAATTTTATGAAACAACTCCCCCAAACTTTTGGTGAGATAACCGCCACAGAAATCGCTGCTCTGCTACAGTGGTGCTTTAATGAATATGACTGCACCCTGACAGGTTTCAAACAGAAGTGGAATTTGGACAAGATACCTAACTCATTCCCGTTGGGGGTATTGTGCCCAACACATTCCCAAGATTTCACACTTCACGAAAATGGGTATTGCACGGACTGCGGGGGCTACCTTCCCCACTCCGCTGATAATTCAATGTATACCGATCGGGCTAGCGAAACATCCACCGGCGACATAACGCCCTCCAAATGATTCGAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGAGGCATGCGGTACC
SEQ ID NO.5: 外側引物 GTGGACGTGAAAGAAACC
SEQ ID NO.6: 內側引物 GGTCATAGCTGTTTCCTGTG
SEQ ID NO.7: hr5.ie1.neo.p10PAS ATTAAGCTTCCGCGTAAAACACAATCAAGTATGAGTCATAAGCTGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAACCGAACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAACGCACGATCAGTGGATGATGTCATTTGTTTTTCAAATCGAGATGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGTGTAACGCACGATCGATTGATGAGTCATTTGTTTTGCAATATGATATCATACAATATGACTCATTTGTTTTTCAAAACCGAACTTGATTTACGGGTAGAATTCTACTTGTAAAGCACAATCAAAAAGATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTGAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAAAACACAATCAAGAAATGATGTCATTTGTTATAAAAATAAAAGCTGATGTCATGTTTTGCACATGGCTCATAACTAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGCGCGTCGATGTCTTTGTGATGCGCGCGACATTTTTGTAGGTTATTGATAAAATGAACGGATACGTTGCCCGACATTATCATTAAATCCTTGGCGTAGAATTTGTCGGGTCCATTGTCCGTGTGCGCTAGCATGCCCGTAACGGACCTCGTACTTTTGGCTTCAAAGGTTTTGCGCACAGACAAAATGTGCCACACTTGCAGCTCTGCATGTGTGCGCGTTACCACAAATCCCAACGGCGCAGTGTACTTGTTGTATGCAAATAAATCTCGATAAAGGCGCGGCGCGCGAATGCAGCTGATCACGTACGCTCCTCGTGTTCCGTTCAAGGACGGTGTTATCGACCTCAGATTAATGTTTATCGGCCGACTGTTTTCGTATCCGCTCACCAAACGCGTTTTTGCATTAACATTGTATGTCGGCGGATGTTCTATATCTAATTTGAATAAATAAACGATAACCGCGTTGGTTTTAGAGGGCATAATAAAAGAAATATTGTTATCGTGTTCGCCATTAGGGCAGTATAAATTGACGTTCATGTTGGATATTGTTTCAGTTGCAAGTTGACACTGGCGGCGACAAGATCGTGAACAACCAAGTGACGCGGCCGCATTTGTAAAAAAAAAATAAATAAAAATGATCGAGCAGGACGGCCTGCACGCTGGTTCTCCAGCTGCTTGGGTCGAGCGTCTGTTCGGTTACGACTGGGCTCAGCAGACCATCGGTTGCTCCGACGCTGCTGTGTTCCGTCTGTCCGCTCAGGGTCGTCCCGTGCTGTTCGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCTCTGAACGAGCTGCAGGACGAGGCTGCTCGTCTGTCCTGGCTGGCTACCACTGGTGTCCCTTGCGCTGCTGTCCTGGACGTGGTCACTGAGGCTGGTCGTGACTGGCTGCTGCTGGGAGAAGTGCCTGGACAGGACCTGCTGTCCAGCCACCTGGCTCCAGCTGAGAAGGTGTCCATCATGGCTGACGCTATGCGTCGTCTGCACACCCTGGACCCTGCTACCTGCCCCTTCGACCACCAAGCTAAGCACCGTATCGAGCGTGCTCGTACCCGTATGGAAGCTGGCCTGGTGGACCAGGACGACCTGGACGAAGAACACCAGGGACTGGCCCCTGCTGAGCTGTTCGCTCGTCTGAAGGCTCGTATGCCCGACGGCGAGGACCTGGTGGTTACTCACGGCGACGCTTGCCTGCCCAACATCATGGTCGAGAACGGTCGTTTCTCCGGTTTCATCGACTGCGGTCGTCTGGGTGTCGCTGACCGTTACCAGGATATCGCTCTGGCTACCCGTGATATCGCTGAGGAACTGGGTGGCGAGTGGGCTGACAGATTCCTGGTGCTGTACGGTATCGCTGCTCCCGACTCCCAGCGTATCGCTTTCTACCGTCTGCTGGACGAGTTCTTCTAAGCCCCTTGTAAACGCCACAATTGTGTTTGTTGCAAATAAACCCATGATTATTTGATTAAAATTGTTGTTTTCTTTGTTCATAGACAATAGTGTGTTTTGCCTAAACGGGTACC
SEQ ID NO.8: hr5.ie1.eGFP.p10PAS ATTAAGCTTCCGCGTAAAACACAATCAAGTATGAGTCATAAGCTGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAACCGAACTGGCTTTACGAGTAGAATTCTACTTGTAACGCACGATCAGTGGATGATGTCATTTGTTTTTCAAATCGAGATGATGTCATGTTTTGCACACGGCTCATAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGTGTAACGCACGATCGATTGATGAGTCATTTGTTTTGCAATATGATATCATACAATATGACTCATTTGTTTTTCAAAACCGAACTTGATTTACGGGTAGAATTCTACTTGTAAAGCACAATCAAAAAGATGATGTCATTTGTTTTTCAAAACTGAACTCGCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGTAAAACACAATCAAGAAATGATGTCATTTGTTATAAAAATAAAAGCTGATGTCATGTTTTGCACATGGCTCATAACTAAACTCGCTTTACGGGTAGAATTCTACGCGCGTCGATGTCTTTGTGATGCGCGCGACATTTTTGTAGGTTATTGATAAAATGAACGGATACGTTGCCCGACATTATCATTAAATCCTTGGCGTAGAATTTGTCGGGTCCATTGTCCGTGTGCGCTAGCATGCCCGTAACGGACCTCGTACTTTTGGCTTCAAAGGTTTTGCGCACAGACAAAATGTGCCACACTTGCAGCTCTGCATGTGTGCGCGTTACCACAAATCCCAACGGCGCAGTGTACTTGTTGTATGCAAATAAATCTCGATAAAGGCGCGGCGCGCGAATGCAGCTGATCACGTACGCTCCTCGTGTTCCGTTCAAGGACGGTGTTATCGACCTCAGATTAATGTTTATCGGCCGACTGTTTTCGTATCCGCTCACCAAACGCGTTTTTGCATTAACATTGTATGTCGGCGGATGTTCTATATCTAATTTGAATAAATAAACGATAACCGCGTTGGTTTTAGAGGGCATAATAAAAGAAATATTGTTATCGTGTTCGCCATTAGGGCAGTATAAATTGACGTTCATGTTGGATATTGTTTCAGTTGCAAGTTGACACTGGCGGCGACAAGATCGTGAACAACCAAGTGACGCGGCCGCATTTGTAAAAAAAAAATAAATAAAAATGGTGTCCAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGTGTCGTGCCCATCCTGGTCGAACTGGACGGCGACGTGAACGGTCACAAGTTCTCCGTGTCTGGCGAAGGCGAGGGCGACGCTACCTACGGAAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCTTGGCCTACCCTGGTCACCACTCTGACCTACGGTGTCCAGTGCTTCTCCCGTTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGATTTCTTCAAGTCCGCTATGCCCGAGGGTTACGTGCAAGAGCGTACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGTGCTGAAGTGAAGTTCGAAGGCGACACCCTCGTGAACCGTATCGAGCTGAAGGGTATCGACTTCAAGGAAGATGGAAACATCCTGGGCCACAAGCTCGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTGTACATCATGGCCGACAAGCAAAAGAACGGCATCAAAGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGTTCCGTGCAGCTGGCTGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGTCCTGTGCTGCTGCCTGACAACCACTACCTGTCCACCCAGTCCGCTCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGTGACCACATGGTGCTGCTCGAGTTCGTGACCGCTGCTGGTATCACCCTGGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGCCCCTTGTAAACGCCACAATTGTGTTTGTTGCAAATAAACCCATGATTATTTGATTAAAATTGTTGTTTTCTTTGTTCATAGACAATAGTGTGTTTTGCCTAAACGGGTACC
SEQ ID NO: 9 編碼 coBDDFVIIIXTEN (V2.0)的核苷酸序列 ATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGAGCGCCACTCCGGAATCGGGCCCAGGAAGCCCTGCCGGATCCCCGACCAGCACCGAGGAGGGAAGCCCCGCCGGGTCACCGACTTCCACTGAGGAGGGAGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAA
SEQ ID NO: 10 coBDDFVIIIXTEN (V2.0)的胺基酸序列 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNGAPTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGASSPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO: 11 coBDDFVIIIXTEN (V2.0)的信號肽 MQIELSTCFFLCLLRFCFS
SEQ ID NO: 12 BDD成熟人FVIII的胺基酸序列 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO: 13 編碼BDD成熟人FVIII的核苷酸序列 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTAC
SEQ ID NO: 14 V2.0 表現匣 mTTR482-內含子- coBDDFVIIIXTEN (V2.0)-WPRE-bGHPolyA GGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGGAATTCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTACTCGAGGCCACCATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGAGCGCCACTCCGGAATCGGGCCCAGGAAGCCCTGCCGGATCCCCGACCAGCACCGAGGAGGGAAGCCCCGCCGGGTCACCGACTTCCACTGAGGAGGGAGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAAGCGGCCGCTCATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTGCCTAGGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAAGACCATGGGCGCGCCAGGCCTGTCGACGCCCGGGCGGTACCGCGATCGCTCGCGACGCATAAAG
SEQ ID NO: 15 A1MB2增強子 GGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACC
SEQ ID NO: 16 mTTR啟動子 GATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAG
SEQ ID NO: 17 嵌合內含子 TCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTA
SEQ ID NO: 18 WPRE TCATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTG
SEQ ID NO: 19 bGHpA CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA
SEQ ID NO: 20 野生型人成熟FVIII蛋白的胺基酸序列 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
SEQ ID NO: 21 B19 WT 5’ CCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAAGATGGCGGACAATTACGTCATTTCCTGTGACGTCATTTCCTGTGACGTCACTTCCGGTGGGCGGGACTTCCGGAATTAGGGTTGGCTCTGGGCCAGCTTGCTTGGGGTTGCCTTGACACTAAGACAAGCGGCGCGCCGCTTGATCTTAGTGGCACGTCAACCCCAAGCGCTGGCCCAGAGCCAACCCTAATTCCGGAAGTCCCGCCCACCGGAAGTGACGTCACAGGAAATGACGTCACAGGAAATGACGTAATTGTCCGCCATCTTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGGTGTCTTCTTTTAAATTTT
SEQ ID NO: 22 B19 WT 3’ AAAATTTAAAAGAAGACACCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAAGATGGCGGACAATTACGTCATTTCCTGTGACGTCATTTCCTGTGACGTCACTTCCGGTGGGCGGGACTTCCGGAATTAGGGTTGGCTCTGGGCCAGCGCTTGGGGTTGACGTGCCACTAAGATCAAGCGGCGCGCCGCTTGTCTTAGTGTCAAGGCAACCCCAAGCAAGCTGGCCCAGAGCCAACCCTAATTCCGGAAGTCCCGCCCACCGGAAGTGACGTCACAGGAAATGACGTCACAGGAAATGACGTAATTGTCCGCCATCTTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGG
SEQ ID NO: 23 5’_B19_最小 CCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAGCGCGCCGCTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGGTGTCTTCTTTTAAATTTT
SEQ ID NO: 24 3’_B19_最小 AAAATTTAAAAGAAGACACCAAATCAGATGCCGCCGGTCGCCGCCGGTAGGCGGGACTTCCGGTACAGCGGCGCGCTGTACCGGAAGTCCCGCCTACCGGCGGCGACCGGCGGCATCTGATTTGG
SEQ ID NO: 25 5’_GPV_最小 CTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACGTTCGTTCGCATGCGAACGAACGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAGACTCAAGGACAAGAGGATATTTTGCGCGCCAGGAAGTG
SEQ ID NO: 26 3’_GPV_最小 CACTTCCTGGCGCGCAAAATATCCTCTTGTCCTTGAGTCTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACGTTCGTTCGCATGCGAACGAACGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAG
SEQ ID NO: 27 5’_GPV_Δ186 CTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGCATGCGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAGACTCAAGGACAAGAGGATATTTTGCGCGCCAGGAAGTG
SEQ ID NO: 28 3’_GPV_Δ186 CACTTCCTGGCGCGCAAAATATCCTCTTGTCCTTGAGTCTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGCATGCGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAG
SEQ ID NO: 29 5’_GPV_Δ120 CTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCCGGTCACGTGCTTCCTGTCACGTGTTTCCGGTCGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGCATGCTCACGTGACCGGAAACACGTGACAGGAAGCACGTGACCGGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAGACTCAAGGACAAGAGGATATTTTGCGCGCCAGGAAGTG
SEQ ID NO: 30 3’_GPV_Δ120 CACTTCCTGGCGCGCAAAATATCCTCTTGTCCTTGAGTCTCATTGGAGGGTTCGTTCGTTCGAACCAGCCAATCAGGGGAGGGGGAAGTGACGCAAGTTCCGGTCACATGCTTCCGGTGACGCACATCCGGTGACGTAGTTCCGGTCACGTGCTTCCTGTCACGTGTTTCCGGTCACGTGAGCATGCCTGTCTATCGCCTACCCATCCCTGTCTGAGATCAAGGGCGTGATCGTGCACAGACTGGAGAGCGTGTCCTATAATATCGGCTCTCAGGAGTGGAGCACCACAGTGCCCAGATACGTGGCCACCCAGGGCTATCTGATCTCCAACTTCGACGGCATGCGACCGGAAACACGTGACAGGAAGCACGTGACCGGAACTACGTCACCGGATGTGCGTCACCGGAAGCATGTGACCGGAACTTGCGTCACTTCCCCCTCCCCTGATTGGCTGGTTCGAACGAACGAACCCTCCAATGAG
SEQ ID NO: 31 野生型人FVIII的核酸序列 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCCCAGAATTCAAGACACCCTAGCACTAGGCAAAAGCAATTTAATGCCACCACAATTCCAGAAAATGACATAGAGAAGACTGACCCTTGGTTTGCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAAATGTCTCCTCTAGTGATTTGTTGATGCTCTTGCGACAGAGTCCTACTCCACATGGGCTATCCTTATCTGATCTCCAAGAAGCCAAATATGAGACTTTTTCTGATGATCCATCACCTGGAGCAATAGACAGTAATAACAGCCTGTCTGAAATGACACACTTCAGGCCACAGCTCCATCACAGTGGGGACATGGTATTTACCCCTGAGTCAGGCCTCCAATTAAGATTAAATGAGAAACTGGGGACAACTGCAGCAACAGAGTTGAAGAAACTTGATTTCAAAGTTTCTAGTACATCAAATAATCTGATTTCAACAATTCCATCAGACAATTTGGCAGCAGGTACTGATAATACAAGTTCCTTAGGACCCCCAAGTATGCCAGTTCATTATGATAGTCAATTAGATACCACTCTATTTGGCAAAAAGTCATCTCCCCTTACTGAGTCTGGTGGACCTCTGAGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTTAGAATCAGGTTTAATGAATAGCCAAGAAAGTTCATGGGGAAAAAATGTATCGTCAACAGAGAGTGGTAGGTTATTTAAAGGGAAAAGAGCTCATGGACCTGCTTTGTTGACTAAAGATAATGCCTTATTCAAAGTTAGCATCTCTTTGTTAAAGACAAACAAAACTTCCAATAATTCAGCAACTAATAGAAAGACTCACATTGATGGCCCATCATTATTAATTGAGAATAGTCCATCAGTCTGGCAAAATATATTAGAAAGTGACACTGAGTTTAAAAAAGTGACACCTTTGATTCATGACAGAATGCTTATGGACAAAAATGCTACAGCTTTGAGGCTAAATCATATGTCAAATAAAACTACTTCATCAAAAAACATGGAAATGGTCCAACAGAAAAAAGAGGGCCCCATTCCACCAGATGCACAAAATCCAGATATGTCGTTCTTTAAGATGCTATTCTTGCCAGAATCAGCAAGGTGGATACAAAGGACTCATGGAAAGAACTCTCTGAACTCTGGGCAAGGCCCCAGTCCAAAGCAATTAGTATCCTTAGGACCAGAAAAATCTGTGGAAGGTCAGAATTTCTTGTCTGAGAAAAACAAAGTGGTAGTAGGAAAGGGTGAATTTACAAAGGACGTAGGACTCAAAGAGATGGTTTTTCCAAGCAGCAGAAACCTATTTCTTACTAACTTGGATAATTTACATGAAAATAATACACACAATCAAGAAAAAAAAATTCAGGAAGAAATAGAAAAGAAGGAAACATTAATCCAAGAGAATGTAGTTTTGCCTCAGATACATACAGTGACTGGCACTAAGAATTTCATGAAGAACCTTTTCTTACTGAGCACTAGGCAAAATGTAGAAGGTTCATATGACGGGGCATATGCTCCAGTACTTCAAGATTTTAGGTCATTAAATGATTCAACAAATAGAACAAAGAAACACACAGCTCATTTCTCAAAAAAAGGGGAGGAAGAAAACTTGGAAGGCTTGGGAAATCAAACCAAGCAAATTGTAGAGAAATATGCATGCACCACAAGGATATCTCCTAATACAAGCCAGCAGAATTTTGTCACGCAACGTAGTAAGAGAGCTTTGAAACAATTCAGACTCCCACTAGAAGAAACAGAACTTGAAAAAAGGATAATTGTGGATGACACCTCAACCCAGTGGTCCAAAAACATGAAACATTTGACCCCGAGCACCCTCACACAGATAGACTACAATGAGAAGGAGAAAGGGGCCATTACTCAGTCTCCCTTATCAGATTGCCTTACGAGGAGTCATAGCATCCCTCAAGCAAATAGATCTCCATTACCCATTGCAAAGGTATCATCATTTCCATCTATTAGACCTATATATCTGACCAGGGTCCTATTCCAAGACAACTCTTCTCATCTTCCAGCAGCATCTTATAGAAAGAAAGATTCTGGGGTCCAAGAAAGCAGTCATTTCTTACAAGGAGCCAAAAAAAATAACCTTTCTTTAGCCATTCTAACCTTGGAGATGACTGGTGATCAAAGAGAGGTTGGCTCCCTGGGGACAAGTGCCACAAATTCAGTCACATACAAGAAAGTTGAGAACACTGTTCTCCCGAAACCAGACTTGCCCAAAACATCTGGCAAAGTTGAATTGCTTCCAAAAGTTCACATTTATCAGAAGGACCTATTCCCTACGGAAACTAGCAATGGGTCTCCTGGCCATCTGGATCTCGTGGAAGGGAGCCTTCTTCAGGGAACAGAGGGAGCGATTAAGTGGAATGAAGCAAACAGACCTGGAAAAGTTCCCTTTCTGAGAGTAGCAACAGAAAGCTCTGCAAAGACTCCCTCCAAGCTATTGGATCCTCTTGCTTGGGATAACCACTATGGTACTCAGATACCAAAAGAAGAGTGGAAATCCCAAGAGAAGTCACCAGAAAAAACAGCTTTTAAGAAAAAGGATACCATTTTGTCCCTGAACGCTTGTGAAAGCAATCATGCAATAGCAGCAATAAATGAGGGACAAAATAAGCCCGAAATAGAAGTCACCTGGGCAAAGCAAGGTAGGACTGAAAGGCTGTGCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTAC
SEQ ID NO: 32 編碼 BDD-co6FVIII (V1.0)的核苷酸序列 (無XTEN) GCCACTCGCCGGTACTACCTTGGAGCCGTGGAGCTTTCATGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAACTCCCCGTGGATGCCAGATTCCCCCCCCGCGTGCCAAAGTCCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTCTTTGTCGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATCGCCAAGCCGCGCCCACCTTGGATGGGCCTCCTGGGACCGACCATTCAAGCTGAAGTGTACGACACCGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCGTCCCACCCCGTGTCCCTGCATGCGGTCGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCCGAAGGAGCTGAGTACGACGACCAGACTAGCCAGCGGGAAAAGGAGGACGATAAAGTGTTCCCGGGCGGCTCGCATACTTACGTGTGGCAAGTCCTGAAGGAAAACGGACCTATGGCATCCGATCCTCTGTGCCTGACTTACTCCTACCTTTCCCATGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGGCTGATTGGTGCACTTCTCGTGTGCCGCGAAGGTTCGCTCGCTAAGGAAAAGACCCAGACCCTCCATAAGTTCATCCTTTTGTTCGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCATGGCATTCCGAAACTAAGAACTCGCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCCTCAGCCCGCGCCTGGCCTAAAATGCATACAGTCAACGGATACGTGAATCGGTCACTGCCCGGGCTCATCGGTTGTCACAGAAAGTCCGTGTACTGGCACGTCATCGGCATGGGCACTACGCCTGAAGTGCACTCCATCTTCCTGGAAGGGCACACCTTCCTCGTGCGCAACCACCGCCAGGCCTCTCTGGAAATCTCCCCGATTACCTTTCTGACCGCCCAGACTCTGCTCATGGACCTGGGGCAGTTCCTTCTCTTCTGCCACATCTCCAGCCATCAGCACGACGGAATGGAGGCCTACGTGAAGGTGGACTCATGCCCGGAAGAACCTCAGTTGCGGATGAAGAACAACGAGGAGGCCGAGGACTATGACGACGATTTGACTGACTCCGAGATGGACGTCGTGCGGTTCGATGACGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATTCGCAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAAACCTGGGTGCACTACATCGCGGCCGAGGAAGAAGATTGGGACTACGCCCCGTTGGTGCTGGCACCCGATGACCGGTCGTACAAGTCCCAGTATCTGAACAATGGTCCGCAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGCGGTTCATGGCGTACACTGACGAAACGTTTAAGACCCGGGAGGCCATTCAACATGAGAGCGGCATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAGGTCGGCGATACCCTGCTCATCATCTTCAAAAACCAGGCCTCCCGGCCTTACAACATCTACCCTCACGGAATCACCGACGTGCGGCCACTCTACTCGCGGCGCCTGCCGAAGGGCGTCAAGCACCTGAAAGACTTCCCTATCCTGCCGGGCGAAATCTTCAAGTATAAGTGGACCGTCACCGTGGAGGACGGGCCCACCAAGAGCGATCCTAGGTGTCTGACTCGGTACTACTCCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCATCGGGACTCATTGGACCGCTGCTGATCTGCTACAAAGAGTCGGTGGATCAACGCGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCCGTGTTTGATGAAAACAGATCCTGGTACCTCACTGAAAACATCCAGAGGTTCCTCCCAAACCCCGCAGGAGTGCAACTGGAGGACCCTGAGTTTCAGGCCTCGAATATCATGCACTCGATTAACGGTTACGTGTTCGACTCGCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTCCATGAAGTCGCTTACTGGTACATTCTGTCCATCGGCGCCCAGACTGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGTTACACCTTTAAGCACAAGATGGTGTACGAAGATACCCTGACCCTGTTCCCTTTCTCCGGCGAAACGGTGTTCATGTCGATGGAGAACCCGGGTCTGTGGATTCTGGGATGCCACAACAGCGACTTTCGGAACCGCGGAATGACTGCCCTGCTGAAGGTGTCCTCATGCGACAAGAACACCGGAGACTACTACGAGGACTCCTACGAGGATATCTCAGCCTACCTCCTGTCCAAGAACAACGCGATCGAGCCGCGCAGCTTCAGCCAGAACCCGCCTGTGCTGAAGAGGCACCAGCGAGAAATTACCCGGACCACCCTCCAATCGGATCAGGAGGAAATCGACTACGACGACACCATCTCGGTGGAAATGAAGAAGGAAGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAAAATCAGTCCCCTCGCTCATTCCAAAAGAAAACTAGACACTACTTTATCGCCGCGGTGGAAAGACTGTGGGACTATGGAATGTCATCCAGCCCTCACGTCCTTCGGAACCGGGCCCAGAGCGGATCGGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAGTTCACCGACGGCAGCTTCACCCAGCCGCTGTACCGGGGAGAACTGAACGAACACCTGGGCCTGCTCGGTCCCTACATCCGCGCGGAAGTGGAGGATAACATCATGGTGACCTTCCGTAACCAAGCATCCAGACCTTACTCCTTCTATTCCTCCCTGATCTCATACGAGGAGGACCAGCGCCAAGGCGCCGAGCCCCGCAAGAACTTCGTCAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTCCAACACCATATGGCCCCGACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGACGTGGACCTTGAGAAGGATGTCCATTCCGGCCTGATCGGGCCGCTGCTCGTGTGTCACACCAACACCCTGAACCCAGCGCATGGACGCCAGGTCACCGTCCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTCACCATTTTTGACGAAACTAAGTCCTGGTACTTCACCGAGAATATGGAGCGAAACTGTAGAGCGCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCGACTTTCAAGGAGAACTATAGATTCCACGCCATCAACGGGTACATCATGGATACTCTGCCGGGGCTGGTCATGGCCCAGGATCAGAGGATTCGGTGGTACTTGCTGTCAATGGGATCGAACGAAAACATTCACTCCATTCACTTCTCCGGTCACGTGTTCACTGTGCGCAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCGCTGTACAATCTGTACCCCGGGGTGTTCGAAACTGTGGAGATGCTGCCGTCCAAGGCCGGCATCTGGAGAGTGGAGTGCCTGATCGGAGAGCACCTCCACGCGGGGATGTCCACCCTCTTCCTGGTGTACTCGAATAAGTGCCAGACCCCGCTGGGCATGGCCTCGGGCCACATCAGAGACTTCCAGATCACAGCAAGCGGACAATACGGCCAATGGGCGCCGAAGCTGGCCCGCTTGCACTACTCCGGATCGATCAACGCATGGTCCACCAAGGAACCGTTCTCGTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCTATGATTATCCACGGAATTAAGACCCAGGGCGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCCCTGTACATCTCGCAATTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGGAAGAAGTGGCAGACTTACAGGGGAAACTCCACCGGCACCCTGATGGTCTTTTTCGGCAACGTGGATTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCACCGATCATAGCCAGATATATTAGGCTCCACCCCACTCACTACTCAATCCGCTCAACTCTTCGGATGGAACTCATGGGGTGCGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCGTTGGGGATGGAATCAAAGGCTATTAGCGACGCCCAGATCACCGCGAGCTCCTACTTCACTAACATGTTCGCCACCTGGAGCCCCTCCAAGGCCAGGCTGCACTTGCAGGGACGGTCAAATGCCTGGCGGCCGCAAGTGAACAATCCGAAGGAATGGCTTCAAGTGGATTTCCAAAAGACCATGAAAGTGACCGGAGTCACCACCCAGGGAGTGAAGTCCCTTCTGACCTCGATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATTAGCAGCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAGGTCAAGGTGTTCCAGGGGAACCAGGACTCGTTCACACCCGTGGTGAACTCCCTGGACCCCCCACTGCTGACGCGGTACTTGAGGATTCATCCTCAGTCCTGGGTCCATCAGATTGCATTGCGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
SEQ ID NO: 33 編碼 coBDDFVIII的核苷酸序列 (V2.0) (無XTEN) GCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAA
SEQ ID NO: 34 V1.0 表現匣 TTP-內含子- BDDFVIIIco6XTEN (V1.0)-WPRE-bGHPolyA ATGCAGATTGAGCTGTCCACTTGTTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGCTTCTGTTTCTCCGCCACTCGCCGGTACTACCTTGGAGCCGTGGAGCTTTCATGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAACTCCCCGTGGATGCCAGATTCCCCCCCCGCGTGCCAAAGTCCTTCCCCTTTAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACCCTCTTTGTCGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATCGCCAAGCCGCGCCCACCTTGGATGGGCCTCCTGGGACCGACCATTCAAGCTGAAGTGTACGACACCGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCGTCCCACCCCGTGTCCCTGCATGCGGTCGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCCGAAGGAGCTGAGTACGACGACCAGACTAGCCAGCGGGAAAAGGAGGACGATAAAGTGTTCCCGGGCGGCTCGCATACTTACGTGTGGCAAGTCCTGAAGGAAAACGGACCTATGGCATCCGATCCTCTGTGCCTGACTTACTCCTACCTTTCCCATGTGGACCTCGTGAAGGACCTGAACAGCGGGCTGATTGGTGCACTTCTCGTGTGCCGCGAAGGTTCGCTCGCTAAGGAAAAGACCCAGACCCTCCATAAGTTCATCCTTTTGTTCGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCATGGCATTCCGAAACTAAGAACTCGCTGATGCAGGACCGGGATGCCGCCTCAGCCCGCGCCTGGCCTAAAATGCATACAGTCAACGGATACGTGAATCGGTCACTGCCCGGGCTCATCGGTTGTCACAGAAAGTCCGTGTACTGGCACGTCATCGGCATGGGCACTACGCCTGAAGTGCACTCCATCTTCCTGGAAGGGCACACCTTCCTCGTGCGCAACCACCGCCAGGCCTCTCTGGAAATCTCCCCGATTACCTTTCTGACCGCCCAGACTCTGCTCATGGACCTGGGGCAGTTCCTTCTCTTCTGCCACATCTCCAGCCATCAGCACGACGGAATGGAGGCCTACGTGAAGGTGGACTCATGCCCGGAAGAACCTCAGTTGCGGATGAAGAACAACGAGGAGGCCGAGGACTATGACGACGATTTGACTGACTCCGAGATGGACGTCGTGCGGTTCGATGACGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATTCGCAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAAACCTGGGTGCACTACATCGCGGCCGAGGAAGAAGATTGGGACTACGCCCCGTTGGTGCTGGCACCCGATGACCGGTCGTACAAGTCCCAGTATCTGAACAATGGTCCGCAGCGGATTGGCAGAAAGTACAAGAAAGTGCGGTTCATGGCGTACACTGACGAAACGTTTAAGACCCGGGAGGCCATTCAACATGAGAGCGGCATTCTGGGACCACTGCTGTACGGAGAGGTCGGCGATACCCTGCTCATCATCTTCAAAAACCAGGCCTCCCGGCCTTACAACATCTACCCTCACGGAATCACCGACGTGCGGCCACTCTACTCGCGGCGCCTGCCGAAGGGCGTCAAGCACCTGAAAGACTTCCCTATCCTGCCGGGCGAAATCTTCAAGTATAAGTGGACCGTCACCGTGGAGGACGGGCCCACCAAGAGCGATCCTAGGTGTCTGACTCGGTACTACTCCAGCTTCGTGAACATGGAACGGGACCTGGCATCGGGACTCATTGGACCGCTGCTGATCTGCTACAAAGAGTCGGTGGATCAACGCGGCAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCCGTGTTTGATGAAAACAGATCCTGGTACCTCACTGAAAACATCCAGAGGTTCCTCCCAAACCCCGCAGGAGTGCAACTGGAGGACCCTGAGTTTCAGGCCTCGAATATCATGCACTCGATTAACGGTTACGTGTTCGACTCGCTGCAACTGAGCGTGTGCCTCCATGAAGTCGCTTACTGGTACATTCTGTCCATCGGCGCCCAGACTGACTTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGTTACACCTTTAAGCACAAGATGGTGTACGAAGATACCCTGACCCTGTTCCCTTTCTCCGGCGAAACGGTGTTCATGTCGATGGAGAACCCGGGTCTGTGGATTCTGGGATGCCACAACAGCGACTTTCGGAACCGCGGAATGACTGCCCTGCTGAAGGTGTCCTCATGCGACAAGAACACCGGAGACTACTACGAGGACTCCTACGAGGATATCTCAGCCTACCTCCTGTCCAAGAACAACGCGATCGAGCCGCGCAGCTTCAGCCAGAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGCACAAGTGAGTCTGCAACTCCCGAGTCCGGACCTGGCTCCGAGCCTGCCACTAGCGGCTCCGAGACTCCGGGAACTTCCGAGAGCGCTACACCAGAAAGCGGACCCGGAACCAGTACCGAACCTAGCGAGGGCTCTGCTCCGGGCAGCCCAGCCGGCTCTCCTACATCCACGGAGGAGGGCACTTCCGAATCCGCCACCCCGGAGTCAGGGCCAGGATCTGAACCCGCTACCTCAGGCAGTGAGACGCCAGGAACGAGCGAGTCCGCTACACCGGAGAGTGGGCCAGGGAGCCCTGCTGGATCTCCTACGTCCACTGAGGAAGGGTCACCAGCGGGCTCGCCCACCAGCACTGAAGAAGGTGCCTCGAGCCCGCCTGTGCTGAAGAGGCACCAGCGAGAAATTACCCGGACCACCCTCCAATCGGATCAGGAGGAAATCGACTACGACGACACCATCTCGGTGGAAATGAAGAAGGAAGATTTCGATATCTACGACGAGGACGAAAATCAGTCCCCTCGCTCATTCCAAAAGAAAACTAGACACTACTTTATCGCCGCGGTGGAAAGACTGTGGGACTATGGAATGTCATCCAGCCCTCACGTCCTTCGGAACCGGGCCCAGAGCGGATCGGTGCCTCAGTTCAAGAAAGTGGTGTTCCAGGAGTTCACCGACGGCAGCTTCACCCAGCCGCTGTACCGGGGAGAACTGAACGAACACCTGGGCCTGCTCGGTCCCTACATCCGCGCGGAAGTGGAGGATAACATCATGGTGACCTTCCGTAACCAAGCATCCAGACCTTACTCCTTCTATTCCTCCCTGATCTCATACGAGGAGGACCAGCGCCAAGGCGCCGAGCCCCGCAAGAACTTCGTCAAGCCCAACGAGACTAAGACCTACTTCTGGAAGGTCCAACACCATATGGCCCCGACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCCGACGTGGACCTTGAGAAGGATGTCCATTCCGGCCTGATCGGGCCGCTGCTCGTGTGTCACACCAACACCCTGAACCCAGCGCATGGACGCCAGGTCACCGTCCAGGAGTTTGCTCTGTTCTTCACCATTTTTGACGAAACTAAGTCCTGGTACTTCACCGAGAATATGGAGCGAAACTGTAGAGCGCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCGACTTTCAAGGAGAACTATAGATTCCACGCCATCAACGGGTACATCATGGATACTCTGCCGGGGCTGGTCATGGCCCAGGATCAGAGGATTCGGTGGTACTTGCTGTCAATGGGATCGAACGAAAACATTCACTCCATTCACTTCTCCGGTCACGTGTTCACTGTGCGCAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCGCTGTACAATCTGTACCCCGGGGTGTTCGAAACTGTGGAGATGCTGCCGTCCAAGGCCGGCATCTGGAGAGTGGAGTGCCTGATCGGAGAGCACCTCCACGCGGGGATGTCCACCCTCTTCCTGGTGTACTCGAATAAGTGCCAGACCCCGCTGGGCATGGCCTCGGGCCACATCAGAGACTTCCAGATCACAGCAAGCGGACAATACGGCCAATGGGCGCCGAAGCTGGCCCGCTTGCACTACTCCGGATCGATCAACGCATGGTCCACCAAGGAACCGTTCTCGTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCTATGATTATCCACGGAATTAAGACCCAGGGCGCCAGGCAGAAGTTCTCCTCCCTGTACATCTCGCAATTCATCATCATGTACAGCCTGGACGGGAAGAAGTGGCAGACTTACAGGGGAAACTCCACCGGCACCCTGATGGTCTTTTTCGGCAACGTGGATTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCACCGATCATAGCCAGATATATTAGGCTCCACCCCACTCACTACTCAATCCGCTCAACTCTTCGGATGGAACTCATGGGGTGCGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCGTTGGGGATGGAATCAAAGGCTATTAGCGACGCCCAGATCACCGCGAGCTCCTACTTCACTAACATGTTCGCCACCTGGAGCCCCTCCAAGGCCAGGCTGCACTTGCAGGGACGGTCAAATGCCTGGCGGCCGCAAGTGAACAATCCGAAGGAATGGCTTCAAGTGGATTTCCAAAAGACCATGAAAGTGACCGGAGTCACCACCCAGGGAGTGAAGTCCCTTCTGACCTCGATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATTAGCAGCAGCCAGGACGGGCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAGGTCAAGGTGTTCCAGGGGAACCAGGACTCGTTCACACCCGTGGTGAACTCCCTGGACCCCCCACTGCTGACGCGGTACTTGAGGATTCATCCTCAGTCCTGGGTCCATCAGATTGCATTGCGAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACCTGTACTGA
SEQ ID NO: 35 V3.0 表現匣 人密碼子優化A1AT-內含子-BDDFVIIIXTEN-WPRE-bGHPolyA ATCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGAACTAGCCACTAGCCTGAGGCTGGTCAAAATTGAACCTCCTCCTGCTCTGAGCAGCCTGGGGGGCAGACTAAGCAGAGGGCTGTGCAGACCCACATAAAGAGCCTACTGTGTGCCAGGCACTTCACCCGAGGCACTTCACAAGCATGCTTGGGAATGAAACTTCCAACTCTTTGGGATGCAGGTGAAACAGTTCCTGGTTCAGAGAGGTGAAGCGGCCTGCCTGAGGCAGCACAGCTCTTCTTTACAGATGTGCTTCCCCACCTCTACCCTGTCTCACGGCCCCCCATGCCAGCCTGACGGTTGTGTCTGCCTCAGTCATGCTCCATTTTTCCATCGGGACCATCAAGAGGGTGTTTGTGTCTAAGGCTGACTGGGTAACTTTGGATGAGCGGTCTCTCCGCTCTGAGCCTGTTTCCTCATCTGTCAAATGGGCTCTAACCCACTCTGATCTCCCAGGGCGGCAGTAAGTCTTCAGCATCAGGCATTTTGGGGTGACTCAGTAAATGGTAGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGGAATTCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTACTCGAGGCCACCATGCAGATTGAACTGTCCACTTGCTTCTTCCTGTGCCTCCTGCGGTTTTGCTTCTCGGCCACCCGCCGGTATTACTTAGGTGCTGTGGAACTGAGCTGGGACTACATGCAGTCCGACCTGGGAGAACTGCCGGTGGACGCGAGATTCCCACCTAGAGTCCCGAAGTCCTTCCCATTCAACACCTCCGTGGTCTACAAAAAGACCCTGTTCGTGGAGTTCACTGACCACCTTTTCAATATTGCCAAGCCGCGCCCCCCCTGGATGGGCCTGCTTGGTCCTACGATCCAAGCAGAGGTCTACGACACCGTGGTCATCACACTGAAGAACATGGCCTCACACCCCGTGTCGCTGCATGCTGTGGGAGTGTCCTACTGGAAGGCCTCAGAGGGTGCCGAATATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAAAAGGAGGATGACAAAGTGTTCCCGGGTGGCAGCCACACTTACGTGTGGCAAGTGCTGAAGGAAAACGGGCCTATGGCGTCGGACCCCCTATGCCTGACCTACTCCTACCTGTCCCATGTGGACCTTGTGAAGGATCTCAACTCGGGACTGATCGGCGCCCTCTTGGTGTGCAGAGAAGGCAGCCTGGCGAAGGAAAAGACTCAGACCCTGCACAAGTTCATTCTGTTGTTTGCTGTGTTCGATGAAGGAAAGTCCTGGCACTCAGAAACCAAGAACTCGCTGATGCAGGATAGAGATGCGGCCTCGGCCAGAGCCTGGCCTAAAATGCACACCGTCAACGGATATGTGAACAGGTCGCTCCCTGGCCTCATCGGCTGCCACAGAAAGTCCGTGTATTGGCATGTGATCGGCATGGGTACTACTCCGGAAGTGCATAGTATCTTTCTGGAGGGCCATACCTTCTTGGTGCGCAACCACAGACAGGCCTCGCTGGAAATCTCGCCTATCACTTTCTTGACTGCGCAGACCCTCCTTATGGACCTTGGACAGTTCCTGCTGTTCTGTCACATCAGCTCCCATCAGCATGATGGGATGGAGGCCTATGTCAAAGTGGACTCCTGCCCTGAGGAGCCACAGCTCCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCGGAGGATTACGACGACGACCTGACTGACAGCGAAATGGACGTCGTGCGATTCGATGACGACAACAGCCCGTCCTTCATCCAAATTAGATCAGTGGCGAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCCGCCGAGGAAGAGGACTGGGACTACGCGCCGCTGGTGCTGGCGCCAGACGACAGGAGCTACAAGTCCCAGTACCTCAACAACGGGCCGCAGCGCATTGGCAGGAAGTACAAGAAAGTCCGCTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACGAGGGAAGCCATCCAGCACGAGTCAGGCATCCTGGGACCGCTCCTTTACGGCGAAGTCGGGGATACCCTGCTCATCATTTTCAAGAACCAGGCATCGCGGCCCTACAACATCTACCCTCACGGGATCACAGACGTGCGCCCGCTCTACTCCCGCCGGCTGCCCAAGGGAGTGAAGCACCTGAAGGATTTTCCCATCCTGCCGGGAGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACTGTGGAAGATGGCCCTACCAAGTCGGACCCTCGCTGTCTGACCCGGTACTATTCCTCGTTTGTGAACATGGAGCGCGACCTGGCCTCGGGGCTGATTGGTCCGCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCCGTGGACCAGCGCGGGAACCAGATCATGTCCGACAAGCGCAACGTGATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAAAACAGATCGTGGTACTTGACTGAGAATATCCAGCGGTTCCTGCCCAACCCAGCGGGAGTGCAACTGGAGGACCCGGAGTTCCAGGCCTCAAACATTATGCACTCTATCAACGGCTATGTGTTCGACTCGCTCCAACTGAGCGTGTGCCTGCATGAAGTGGCATACTGGTACATTCTGTCCATCGGAGCCCAGACCGACTTCCTGTCCGTGTTCTTCTCCGGATACACCTTCAAGCATAAGATGGTGTACGAGGACACTCTGACCCTCTTCCCATTTTCCGGAGAAACTGTGTTCATGTCAATGGAAAACCCGGGCTTGTGGATTCTGGGTTGCCATAACTCGGACTTCCGGAATAGAGGGATGACCGCCCTGCTGAAAGTGTCCAGCTGTGACAAGAATACCGGCGATTACTACGAGGACAGCTATGAGGACATCTCCGCTTATCTGCTGTCCAAGAACAACGCCATTGAACCCAGGTCCTTCTCCCAAAACGGTGCACCGACCTCCGAAAGCGCCACCCCAGAGTCAGGACCTGGCTCGGAACCGGCTACCTCGGGCTCAGAGACACCGGGGACTTCCGAGTCCGCAACCCCCGAGAGTGGACCCGGATCCGAACCAGCAACCTCAGGATCAGAAACCCCGGGAACTTCGGAATCCGCCACTCCCGAGTCGGGACCAGGCACCTCCACTGAGCCTTCCGAGGGAAGCGCCCCCGGATCCCCTGCTGGATCCCCTACCAGCACTGAAGAAGGCACCTCAGAATCCGCGACCCCTGAGTCCGGCCCTGGAAGCGAACCCGCCACCTCCGGTTCCGAAACCCCTGGGACTAGCGAGAGCGCCACTCCGGAATCGGGCCCAGGAAGCCCTGCCGGATCCCCGACCAGCACCGAGGAGGGAAGCCCCGCCGGGTCACCGACTTCCACTGAGGAGGGAGCCTCATCCCCCCCCGTGCTGAAGCGGCATCAAAGAGAGATCACCAGGACCACTCTCCAGTCCGATCAGGAAGAAATTGACTACGACGATACTATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTCGACATCTACGATGAGGATGAGAACCAGTCCCCTCGGAGCTTTCAGAAGAAAACCCGCCACTACTTCATCGCTGCCGTGGAGCGGCTGTGGGATTACGGGATGTCCAGCTCACCGCATGTGCTGCGGAATAGAGCGCAGTCAGGATCGGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTCGTGTTCCAAGAGTTCACCGACGGGTCCTTCACTCAACCCCTGTACCGGGGCGAACTCAACGAACACCTGGGACTGCTTGGGCCGTATATCAGGGCAGAAGTGGAAGATAACATCATGGTCACCTTCCGCAACCAGGCCTCCCGGCCGTACAGCTTCTACTCTTCACTGATCTCCTACGAGGAAGATCAGCGGCAGGGAGCCGAGCCCCGGAAGAACTTCGTCAAGCCTAACGAAACTAAGACCTACTTTTGGAAGGTCCAGCATCACATGGCCCCGACCAAAGACGAGTTCGACTGTAAAGCCTGGGCCTACTTCTCCGATGTGGACCTGGAGAAGGACGTGCACTCGGGACTCATTGGCCCGCTCCTTGTGTGCCATACTAATACCCTGAACCCTGCTCACGGTCGCCAAGTCACAGTGCAGGAGTTCGCCCTCTTCTTCACCATCTTCGATGAAACAAAGTCCTGGTACTTTACTGAGAACATGGAACGCAATTGCAGGGCACCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTCAAGGAAAACTACCGGTTTCATGCCATTAACGGCTACATAATGGACACGTTGCCAGGACTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGAATCCGGTGGTATCTGCTCTCCATGGGCTCCAACGAAAACATTCACAGCATTCATTTTTCCGGCCATGTGTTCACCGTCCGGAAGAAGGAAGAGTACAAGATGGCTCTGTACAACCTCTACCCTGGAGTGTTCGAGACTGTGGAAATGCTGCCTAGCAAGGCCGGCATTTGGAGAGTGGAATGCCTGATCGGAGAGCATTTGCACGCCGGAATGTCCACCCTGTTTCTTGTGTACTCCAACAAGTGCCAGACCCCGCTGGGAATGGCCTCAGGTCATATTAGGGATTTCCAGATCACTGCTTCGGGGCAGTACGGGCAGTGGGCACCTAAGTTGGCCCGGCTGCACTACTCTGGCTCCATCAATGCCTGGTCCACCAAGGAACCCTTCTCCTGGATTAAGGTGGACCTCCTGGCCCCAATGATTATTCACGGTATTAAGACCCAGGGTGCCCGACAGAAGTTCTCCTCACTCTACATCTCGCAATTCATCATAATGTACAGCCTGGATGGGAAGAAGTGGCAGACCTACCGGGGAAACTCCACTGGAACGCTCATGGTGTTTTTCGGCAACGTGGACTCCTCCGGCATTAAGCACAACATCTTCAACCCTCCGATCATTGCTCGGTACATCCGGCTGCACCCAACTCACTACAGCATCCGGTCCACCCTGCGGATGGAACTGATGGGTTGTGACCTGAACTCCTGCTCCATGCCCCTTGGGATGGAATCCAAGGCCATTAGCGATGCACAGATCACCGCCTCTTCATACTTCACCAACATGTTCGCGACCTGGTCCCCGTCGAAGGCCCGCCTGCACCTCCAAGGTCGCTCCAATGCGTGGCGGCCTCAAGTGAACAACCCCAAGGAGTGGCTCCAGGTCGACTTCCAAAAGACCATGAAGGTCACCGGAGTGACCACCCAGGGCGTGAAGTCCCTGCTGACCTCTATGTACGTTAAGGAGTTCCTCATCTCCTCAAGCCAAGACGGACATCAGTGGACCCTGTTCTTCCAAAACGGAAAAGTCAAAGTATTCCAGGGCAACCAGGACTCCTTCACCCCTGTGGTCAACAGCCTGGACCCCCCATTGCTGACCCGCTACCTCCGCATCCACCCCCAAAGCTGGGTCCACCAGATCGCACTGCGCATGGAGGTCCTTGGATGCGAAGCCCAAGATCTGTACTAAGCGGCCGCTCATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCTGCCTAGGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAAGACCATGGGCGCGCCAGGCCTGTCGACGCCCGGGCGGTACCGCGATCGCTCGCGACGCATAAAG
SEQ ID NO: 36 人肝特異性α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子 ATCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGAACTAGCCACTAGCCTGAGGCTGGTCAAAATTGAACCTCCTCCTGCTCTGAGCAGCCTGGGGGGCAGACTAAGCAGAGGGCTGTGCAGACCCACATAAAGAGCCTACTGTGTGCCAGGCACTTCACCCGAGGCACTTCACAAGCATGCTTGGGAATGAAACTTCCAACTCTTTGGGATGCAGGTGAAACAGTTCCTGGTTCAGAGAGGTGAAGCGGCCTGCCTGAGGCAGCACAGCTCTTCTTTACAGATGTGCTTCCCCACCTCTACCCTGTCTCACGGCCCCCCATGCCAGCCTGACGGTTGTGTCTGCCTCAGTCATGCTCCATTTTTCCATCGGGACCATCAAGAGGGTGTTTGTGTCTAAGGCTGACTGGGTAACTTTGGATGAGCGGTCTCTCCGCTCTGAGCCTGTTTCCTCATCTGTCAAATGGGCTCTAACCCACTCTGATCTCCCAGGGCGGCAGTAAGTCTTCAGCATCAGGCATTTTGGGGTGACTCAGTAAATGGTAGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAG
圖 1示出了根據本發明實施例的人FVIIIXTEN表現構築體的示意性線性圖譜。V1.0匣包含與XTEN 144肽融合的編碼B結構域缺失的人因子VIII的經密碼子優化的cDNA選殖#6（BDD-FVIIIco6）（FVIIIco6XTEN），其在三重四脯胺酸（TTP）啟動子、內含子、土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）和牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號的調節下（參見美國公開號20190185543）。V2.0匣（SEQ ID NO: 14）包含與XTEN 144肽融合的編碼B結構域缺失（BDD）的經密碼子優化的人因子VIII（BDDcoFVIII）且進一步去除了CpG模體的經密碼子優化的cDNA（FVIIIXTEN），其在肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子（mTTR482）和增強子元件（A1MB2）、雜合合成內含子（嵌合內含子）、土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）和牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號的調節下。V3.0匣（SEQ ID NO: 35）包含與XTEN 144肽融合的編碼B結構域缺失（BDD）的經密碼子優化的人因子VIII（Co-BDD-FVIII）且進一步去除了CpG模體的經密碼子優化的cDNA（FVIIIXTEN），其在肝特異性α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子、雜合合成內含子（嵌合內含子）、土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）和牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號的調節下。FVIIIXTEN表現匣兩側為細小病毒ITR。
圖 2示出了用於ssDNA產生的方法的示意圖，其中用識別ITR相關序列並產生平端DNA的限制酶消化兩側為細小病毒ITR的FVIIIXTEN表現匣，並在95ºC下加熱變性（變性）消化的雙股DNA產物（FVIII表現匣和質體骨架），隨後在4ºC下冷卻（複性）以允許回文ITR序列折疊。產生的ssFVIIIXTEN（ssDNA）用於通過流體動力學尾靜脈注射全身遞送到HemA小鼠中。
圖 3示出了通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定測量的血漿FVIII活性水平的圖示。以不同的間隔從hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠收集血液樣品，所述小鼠經由流體動力學尾靜脈注射被全身注射800 μg/kg兩側為B19 ITR的單股V1.0或V2.0 ssFVIIIXTEN（ssDNA）。誤差條表示標準差。
圖 4示出了通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定測量的血漿FVIII活性水平的圖示。以不同的間隔從hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠收集血漿樣品，所述小鼠經由流體動力學尾靜脈注射被全身注射200、800或1600 µg/kg如所指示的兩側為人博卡病毒（HBoV1）、人紅病毒（B19）、鵝細小病毒（GPV）或它們的變體ITR或它們的組合的單股V2.0 ssFVIIIXTEN（ssDNA）。還測試了兩個雜合ITR組（5’B19-3’GPV和5’GPV-3’B19）。誤差條表示標準差。ITR序列及它們的變體描述於先前的美國專利申請號63/069,114中。
圖 5A- 圖 5B表示從桿狀病毒系統獲得的純化的ceFVIIIXTEN（ceDNA）及其體內功效。 圖 5A示出了如美國專利申請號63/069,073中所述從連續洗脫電泳獲得的具有AAV2或HBoV1 ITR的純化的ceFVIIIXTEN（ceDNA）的瓊脂糖凝膠電泳圖像。示出了與起始材料（SM）相比的純度，其中箭頭指示對應於FVIIIXTEN ceDNA載體（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶。 圖 5B示出了通過Chromogenix Coatest® SP因子VIII生色測定測量的血漿FVIII活性水平的圖示。以不同間隔收集來自hFVIIIR593C +/+/HemA小鼠的血漿樣品，所述小鼠經由流體動力學尾靜脈注射被全身注射80、40或12 µg/kg的如所指示的兩側為AAV2或HBoV1 ITR的ceFVIIIXTEN（ceDNA）。誤差條表示標準差。ITR序列及它們的變體描述於先前的美國專利申請號63/069,073中。
圖 6A- 圖 6C示出了肝特異性mTTR和人A1AT啟動子驅動FVIIIXTEN在HBoV1 ITR構築體中表現的測試。 圖 6A示出了兩側為HBoV1 WT ITR的具有肝特異性mTTR（SEQ ID NO: 3）或A1AT啟動子的FVIIIXTEN表現匣的示意圖。 圖 6B是如所述通過限制酶消化產生的單股DNA（ssDNA）FVIIIXTEN HBoV1的瓊脂糖凝膠電泳圖像。 圖 6C示出了在用圖6A中所示的mTTR或A1AT啟動子構築體注射的小鼠中歸一化為占正常值百分比的FVIII表現水平。誤差條表示標準差。
圖 7A- 圖 7C示出了從桿狀病毒系統獲得的純化的ceFVIIIXTEN AAV2（ceDNA）種類的研究結果。 圖 7A描繪瓊脂糖凝膠電泳圖像，其示出了從連續洗脫電泳獲得的具有AAV2 WT ITR的純化ceFVIIIXTEN（ceDNA）的全長（8.3 kb）和截短（6.0 kb）種類。 圖 7B示出了具有AAV2 WT ITR的全長8.3 kb ceFVIIIXTEN（上部小圖）和截短的6.0 kb ceFVIIIXTEN（下部小圖）的下一代序列（NGS）分析。 圖 7C示出了在以80或40 μg/kg注射全長或截短的ceFVIIIXTEN AAV2構築體的小鼠中歸一化為占正常值百分比的FVIII表現水平。誤差條表示標準差。
圖 8A- 圖 8B表示從桿狀病毒系統獲得的純化的ceFVIIIXTEN（ceDNA）及其體內功效。 圖 8A示出了如美國專利申請號63/069,073中所述從連續洗脫電泳獲得的具有AAV2或HBoV1 ITR的純化的ceFVIIIXTEN（ceDNA）的瓊脂糖凝膠電泳圖像。示出了與起始材料（SM）相比的純度，其中箭頭指示對應於FVIIIXTEN ceDNA載體（ceDNA）、桿狀病毒DNA（vDNA）和Sf9細胞基因體DNA（gDNA）的大小的DNA條帶。 圖 8B示出了用80或40 μg/kg如所指示的兩側為AAV2或HBoV1 ITR的ceFVIIIXTEN（ceDNA）注射的小鼠中歸一化為占正常值百分比的FVIII表現水平。誤差條表示標準差。
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Claims (60)

  1. 一種包含與SEQ ID NO: 9至少85%相同的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII（FVIII）活性的多肽。
  2. 如請求項1所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 9至少90%相同。
  3. 如請求項1所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 9至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。
  4. 一種包含SEQ ID NO: 9的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII活性的多肽。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 9的核苷酸58-4824至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的核苷酸序列。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO: 9的核苷酸58-4824。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列還包含編碼信號肽的核酸序列。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列還包含編碼包含SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的信號肽的核酸序列。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列被密碼子優化為含有相對於SEQ ID NO: 32而言更少的CpG模體。
  10. 一種包含與SEQ ID NO: 33至少85%相同的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII（FVIII）活性的多肽。
  11. 如請求項10所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 33至少90%相同。
  12. 如請求項10所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列與SEQ ID NO: 33至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。
  13. 一種包含SEQ ID NO: 33的核苷酸序列的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼具有因子VIII活性的多肽。
  14. 一種包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列。
  15. 如請求項14所述的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 14至少90%相同的核苷酸序列。
  16. 如請求項14所述的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 14至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的核苷酸序列。
  17. 一種包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含SEQ ID NO: 14的核苷酸序列。
  18. 一種包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少85%相同的核苷酸序列。
  19. 如請求項18所述的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少90%相同的核苷酸序列。
  20. 如請求項18所述的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含與SEQ ID NO: 35至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的核苷酸序列。
  21. 一種包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列。
  22. 一種包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，所述基因匣包含： (a)   包含與SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 33至少85%相同的核酸序列的編碼FVIII蛋白的核苷酸序列； (b)   控制所述核苷酸序列轉錄的啟動子，和 (c)   轉錄終止序列。
  23. 如請求項22所述的分離的核酸分子，其中所述啟動子是肝特異性啟動子。
  24. 如請求項22-23中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述啟動子是小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子。
  25. 如請求項22-24中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述啟動子是mTTR482啟動子。
  26. 如請求項22-25中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述啟動子包含SEQ ID NO: 16的核苷酸序列。
  27. 如請求項23所述的分離的核酸分子，其中所述啟動子是人α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子。
  28. 如請求項23所述的分離的核酸分子，其中所述啟動子包含SEQ ID NO: 36的核苷酸序列。
  29. 如請求項18-28中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述轉錄終止序列是多腺苷酸化（polyA）序列。
  30. 如請求項18-23中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述轉錄終止序列是牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號序列。
  31. 如請求項18-24中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述轉錄終止序列包含SEQ ID NO: 19的核苷酸序列。
  32. 如請求項18-25中任一項所述的分離的核酸分子，其還包含增強子元件。
  33. 如請求項26所述的分離的核酸分子，其中所述增強子元件是A1MB2增強子元件。
  34. 如請求項26或27所述的分離的核酸分子，其中所述A1MB2增強子元件包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列。
  35. 如請求項14-24中任一項所述的分離的核酸分子，其還包含內含子序列。
  36. 如請求項25所述的分離的核酸分子，其中所述內含子序列是嵌合內含子、雜合內含子或合成內含子。
  37. 如請求項25或26所述的分離的核酸分子，其中所述內含子序列包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列。
  38. 如請求項18-31中任一項所述的分離的核酸分子，其還包含轉錄後調節元件。
  39. 如請求項32所述的分離的核酸分子，其中所述轉錄後調節元件包含土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）。
  40. 如請求項33所述的分離的核酸分子，其中所述WPRE包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列。
  41. 如請求項18-34中任一項所述的分離的核酸分子，其還包含位於所述基因匣兩側的第一反向末端重複序列（ITR）和第二ITR。
  42. 如請求項35所述的分離的核酸分子，其中所述第一ITR和/或所述第二ITR衍生自病毒科細小病毒科的成員。
  43. 如請求項35或36中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述第一ITR和/或所述第二ITR衍生自人博卡病毒（HBoV1）、人紅病毒（B19）、鵝細小病毒（GPV）、其變體、或其組合。
  44. 如請求項37所述的分離的核酸分子，其中所述第一ITR和/或所述第二ITR包含與SEQ ID NO: 1、2或21-30至少約75%相同的多核苷酸序列。
  45. 如請求項35-38中任一項所述的分離的核酸分子，其中所述第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約75%相同的多核苷酸序列，並且所述第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約75%相同的多核苷酸序列。
  46. 一種包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣從5'至3'包含： (a)   包含SEQ ID NO: 15的核苷酸序列的A1MB2增強子元件， (b)   包含SEQ ID NO: 16的核苷酸序列的肝特異性修飾小鼠甲狀腺素轉運蛋白（mTTR）啟動子， (c)   包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列的嵌合內含子， (d)   包含與SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 33至少85%相同的核酸序列的編碼FVIII蛋白的核苷酸序列； (e)   包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）；和 (f)    包含SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號。
  47. 一種包含表現因子VIII（FVIII）多肽的基因匣的分離的核酸分子，其中所述基因匣從5'至3'包含： (a)   包含SEQ ID NO: 36的核苷酸序列的人α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）啟動子， (b)   包含SEQ ID NO: 17的核苷酸序列的嵌合內含子， (c)   包含與SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 33至少85%相同的核酸序列的編碼FVIII蛋白的核苷酸序列； (d)   包含SEQ ID NO: 18的核苷酸序列的土撥鼠轉錄後調節元件（WPRE）；和 (e)   包含SEQ ID NO: 19的核苷酸序列的牛生長激素多腺苷酸化（bGHpA）信號。
  48. 如請求項46或47所述的分離的核酸分子，其還包含位於所述基因匣兩側的第一ITR和第二ITR，其中所述第一ITR包含與SEQ ID NO: 1至少約75%相同的多核苷酸序列，並且所述第二ITR包含與SEQ ID NO: 2至少約75%相同的多核苷酸序列。
  49. 一種載體，其包含如請求項1-48中任一項所述的核酸分子。
  50. 一種宿主細胞，其包含如請求項1-48中任一項所述的核酸分子或如請求項42所述的載體。
  51. 一種由如請求項50所述的宿主細胞產生的多肽。
  52. 一種用於產生如請求項1-48中任一項所述的核酸分子的桿狀病毒系統，其中所述核酸分子是在昆蟲細胞中產生。
  53. 一種產生具有FVIII活性的多肽的方法，其包括：在產生具有FVIII活性的多肽的條件下培養如請求項50所述的宿主細胞，以及回收所述具有FVIII活性的多肽。
  54. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1-48中任一項所述的核酸分子。
  55. 一種醫藥組合物，其包含如請求項49所述的載體和醫藥上可接受的賦形劑。
  56. 一種套組，其包含如請求項1-48中任一項所述的核酸分子和用於將所述核酸分子投予於有需要的個體的說明書。
  57. 一種增加個體中具有FVIII活性的多肽的表現的方法，所述方法包括投予包含與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列的核酸分子。
  58. 一種治療個體的出血病症的方法，所述方法包括投予包含與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 14至少85%相同的核苷酸序列的核酸分子。
  59. 一種治療個體的出血病症的方法，所述方法包括投予如請求項54或55所述的醫藥組合物。
  60. 如請求項58或59所述的方法，其中所述出血病症是血友病A。
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