KR20220024628A - 혈우병 및 낮은 골 무기질 밀도를 치료하기 위한 재조합 인자 viii-fc - Google Patents

혈우병 및 낮은 골 무기질 밀도를 치료하기 위한 재조합 인자 viii-fc Download PDF

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카탈린 키스-토쓰
가우라브 마노하르 라자니
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바이오버라티브 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

응고 인자 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 사용한 혈우병 및 낮은 골 무기질 밀도(BMD)를 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 개시된다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 rFVIIIFc이다. 특정 실시형태에서, 치료될 대상체는 A형 혈우병을 갖는다.

Description

혈우병 및 낮은 골 무기질 밀도를 치료하기 위한 재조합 인자 VIII-FC
관련 출원
본 출원은 2019년 6월 19일자 출원된 미국 가출원 제62/863,831호 및 2020년 1월 31일자 출원된 미국 가출원 제62/968,785호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 둘 모두는 그들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2020년 6월 16일자 생성된 상기 ASCII의 카피명은 706564_SA9-503PC_ST25.txt이며, 46,080 바이트 크기이다.
혈우병은 응고 인자를 인코딩하는 유전자의 결함에 의해 야기되는 출혈 장애의 군이며, 10,000명의 남아 출생 중 1명 내지 2명에 이환된다. 문헌[Graw et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005)]. A형 혈우병은 기능적 내인성 응고 인자 VIII(FVIII)의 부재를 특징으로 한다. 중증 A형 혈우병을 갖는 환자는 불량하게 조절되는 외상성 출혈뿐 아니라 관절 내로의 자발적 출혈으로 고통받는다. 혈우병의 치료를 위한 현행의 진료 표준은 비대성 활막염 및 연골 분해(혈우병성 관절병증)를 야기할 수 있는 재발성 관절 출혈(혈관절증)을 포함하는 심각한 생명- 및 사지-위협 출혈을 예방하는 목적을 갖는 정맥내 인자 대체 요법이다. 문헌[Manco-Johnson et al, NEJM 357(6):535-4 (2007)]. 수십년에 걸쳐, 최적의 예방은 관절 출혈을 감소시키지만 이를 제거하지는 않는다. 문헌[Manco-Johnson at al, Blood 129(17):2368-2374 (2017)].
혈우병을 갖는 사람들은 일반 집단에 비하여 감소된 골 무기질 밀도(BMD) 및 골다공증의 위험이 더 높다. 문헌[Gerstner et al, Haemophilia, 15(2):559-65 (2009)]. 한 연구에 따르면, 혈우병 환자의 27%는 골다공증을 가지며, 43%는 낮은 골 밀도를 갖는다. 상기 문헌. 세계적인 BMD의 관찰의 증가에 의해, BMD가 대조군 사례보다 혈우병 환자에서 더 낮거나, 연령에 기초하여 일반 집단에서 예상되는 것보다 더 낮은 것이 나타난다. 이 연관성에도 불구하고, 혈우병 환자에서의 BMD 감소의 메커니즘은 현재 알려져 있지 않다.
혈우병 환자의 요추 및 고관절 BMD 둘 모두의 유의미한 감소는 아동기에 시작한다. 관절 출혈에 대하여 보호하고, 시간이 지남에 따른 BMD의 손실을 최소화시키는 혈우병 환자를 위한 개선된 치료 옵션이 필요하다.
특히, 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병 및 낮은 골 무기질 밀도(BMD)를 갖는 대상체의 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체를 선택하는 단계 및 치료적 유효량의, 재조합 인자 VIII(FVIII) 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 BMD의 감소를 저해한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 rFVIIIFc이다. 본 개시내용의 일부 양태는 A형 혈우병 및 낮은 골 무기질 밀도(BMD)를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 경증 A형 혈우병을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 중등도 A형 혈우병을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 중증 A형 혈우병을 갖는다.
일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질의 FVIII 부분은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질의 FVIII 부분은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 SEQ ID NO: 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 SEQ ID NO: 5와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 SEQ ID NO: 4와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 SEQ ID NO: 4와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5와 동일한 제1 폴리펩티드 쇄 및 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 4와 동일한 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 2개의 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된 제1 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 Fc 도메인의 힌지 영역 내의 2개의 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된 제1 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 에프모록토코그 알파(efmoroctocog alfa)이다. 일부 실시형태에서, 에프모록토코그 알파는 상표명 ELOCTA® 또는 ELOCTATE® 하에 시판되거나, 이의 바이오시밀러이다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 Fc 도메인의 힌지 영역 내의 2개의 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된 제1 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 제1 폴리펩티드 쇄는 Y346, Y718, Y719, Y723, Y770 및 Y786에 황화된 티로신, N41, N239, N916, N1224 및 N1515에 N-글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 5와 동일한 제1 폴리펩티드 쇄 및 N77에 N-글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 4와 동일한 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 (i) FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드, 및 (ii) 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 키메라 폴리펩티드의 FVIII 단백질의 약 1% 내지 약 40%는 단일-쇄 FVIII이며, 키메라 폴리펩티드의 FVIII 단백질의 약 60% 내지 약 99%는 가공된 FVIII이며, 단일-쇄 FVIII 단백질은 단일의 폴리펩티드 쇄 상에 FVIII 중쇄 및 FVIII 경쇄를 포함하며, 가공된 FVIII은 2개의 폴리펩티드 쇄 상에 FVIII 중쇄 및 FVIII 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 인간 세포에 의해 생성된 바 있다. 일부 실시형태에서, 인간 세포는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포이다. 일부 실시형태에서, 인간 세포는 HEK293F 세포이다.
일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 3일 내지 5일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 재조합 FVIII 단백질은 3일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 재조합 FVIII 단백질은 4일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 재조합 FVIII 단백질은 5일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 50세 이상이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 50세 미만이다.
일부 실시형태에서, 대상체에서의 BMD는 X-선에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 BMD는 듀얼(Dual) X-선 흡수계측법(DXA)에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 낮은 BMD를 갖는 대상체는 골감소증 및/또는 골다공증을 갖는다. 일부 실시형태에서, 낮은 BMD를 갖는 대상체는 골감소증을 갖는다. 일부 실시형태에서, 낮은 BMD를 갖는 대상체는 골다공증을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 BMD는 T-점수에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 대상체가 -1.0 미만의 T-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD를 갖는 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 대상체가 -1.0 내지 -2.4의 T-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD 및 골감소증을 갖는 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 대상체가 -2.5 이하의 T-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD 및 골다공증을 갖는 것으로 결정된다.
일부 실시형태에서, 대상체에서의 BMD는 Z-점수에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 대상체가 -2.0 미만의 Z-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD를 갖는 것으로 결정된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 골 형성, 골 흡수 및/또는 골 손실의 하나 이상의 바이오마커의 수준에 기초하여 낮은 BMD를 갖는 것으로 예측된다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 대상체의 말초 혈액 또는 소변으로부터 평가된다(예를 들어, 단백질의 수준 또는 양은 검정을 사용하여 측정된다). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커의 수준은 말초 혈액이거나 말초 혈액으로부터 유래된(예컨대 혈청 또는 혈장) 생물학적 시료에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 골 형성의 하나 이상의 바이오마커는 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 프로콜라겐 1형 N-말단 프로펩티드(P1NP), 프로콜라겐 1형 C-말단 프로펩티드(P1CP) 및/또는 오스테오칼신(osteocalcin)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 골 흡수의 하나 이상의 바이오마커는 혈청 중 총 알칼리성 포스파타제, 핵 인자 카파 B의 수용체 활성화인자(RANKL), 오스테오프로테게린(OPG), 타르타르산염-저항성 산 포스파타제(TRAP), 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 데옥시피리디놀린(DPD), 피리디놀린(PYD), 골 시알로단백질, 카텝신 K, 타르타르산염-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP5b), 기질 메탈로프로테이나제 9(MMP9) 및/또는 1형 콜라겐에 대한 C- 및 N-말단 교차-결합된 텔로펩티드(각각 CTX-1 및 NTX-1)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 비타민 D 결핍을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 Fc 부분이 없는 인자 VIII로 이전에 치료된 바 있다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병 및 증가된 골절 위험을 갖는 대상체의 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 혈우병 및 증가된 골절 위험을 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 골절의 위험을 감소시킨다. 본 개시내용의 일부 양태는 A형 혈우병 및 증가된 골절의 위험을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체에서의 골절의 위험은 골절 위험 평가 도구(FRAX)에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 골절의 위험은 낮은 BMD 위험 인자의 평가에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 낮은 BMD 위험 인자는 관절병증, 감소된 신체 활동, HIV 또는 HCV로의 감염, 비타민 D 결핍, 낮은 체질량지수(BMI) 및/또는 생식샘저하증을 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병 및 골절을 갖는 대상체의 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 혈우병 및 골절을 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 일부 양태는 A형 혈우병 및 골절을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 양태는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD) 손실률의 감소 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 낮은 BMD를 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및 치료적 유효량의, 응고 인자 및 Fc 도메인를 포함하는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하여, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD 손실률을 감소시키도록 하는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 일부 양태는 A형 혈우병을 갖는 대상체의 치료 및 대상체에서 BMD 손실률의 감소에 사용하기 위한 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 하기를 포함한다: (i) Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 A형 혈우병에 대한 치료를 받고 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 대상체가 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌고, 대상체가 낮은 BMD를 갖는 단계; (ii) Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료를 중단하고, 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 하기를 포함한다: (i) 비-인자 대체 단백질을 사용한 A형 혈우병에 대한 치료를 받고 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 대상체가 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌고, 대상체가 낮은 BMD를 갖는 단계; (ii) 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료를 중단하고, 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계.
본 개시내용의 특정 양태는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 대상체가 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 대상체에서의 골절 위험의 감소 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 대상체가 A형 혈우병 및 증가된 골절 위험을 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 골절의 위험을 감소시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD) 손실률의 감소 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 대상체가 A형 혈우병 및 BMD 손실을 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD 손실률을 감소시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖고 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질로 치료 중인 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료를 중단하는 단계 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 대상체가 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료 동안 낮은 BMD 및 적당한 혈액 응고를 갖는 것으로 확인되고, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖고 비-인자 대체 단백질로 치료 중인 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료를 중단하는 단계 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 대상체가 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료 동안 낮은 BMD 및 적당한 혈액 응고를 갖는 것으로 확인되고, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질을 사용하여 A형 혈우병과 연관된 출혈을 감소시키도록 이전에 치료된 바 있다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 Fc 도메인에 융합되지 않은 PEG화된 FVIII이다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 Fc 도메인에 융합되지 않은 단일-쇄 FVIII이다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 인간에서 이의 반감기를 연장시키는 모이어티를 포함하지 않는 재조합 FVIII이다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 혈액-유래 FVIII 또는 혈장-유래 FVIII이다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 다모크토코그 알파 페골(damoctocog alfa pegol), 투로크토코그 알파 페골(turoctocog alfa pegol), 투로크토코그 알파(turoctocog alfa), 로노크토코그 알파(lonoctocog alfa), 시모크토코그 알파(simoctocog alfa), 루리오크토코그 알파 페골(rurioctocog alfa pegol) 또는 옥토코그 알파(octocog alfa)이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 비-인자 대체 단백질을 사용하여 A형 혈우병과 연관된 출혈을 감소시키도록 이전에 치료된 바 있다.
일부 실시형태에서, 비-인자 대체 단백질은 에미시주맙(emicizumab)이다.
일부 실시형태에서, 에미시주맙은 에미시주맙-kxwh이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질 또는 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌다.
일부 실시형태에서, 대상체는 출혈이 검출되지 않은 골 부위 및/또는 관절에서 낮은 BMD를 갖는다.
상기 양태 및 실시형태의 각각에 따르면, 특정 실시형태에서, 대상체는 경증 A형 혈우병을 갖는다. 대안적으로, 상기 양태 및 실시형태의 각각에 따르면, 특정 실시형태에서, 대상체는 중등도 A형 혈우병을 갖는다. 대안적으로, 상기 양태 및 실시형태의 각각에 따르면, 특정 실시형태에서, 대상체는 중증 A형 혈우병을 갖는다.
도 1a 및 도 1b는 타르타르산염-저항성 산 포스파타제(TRAP) 염색에 의한 대식구 및 파골세포 형태, 파골세포 골 흡수 활성, 유전자 발현 프로파일링, 파골세포-특이적 유전자 및 항산화 경로-연관 유전자를 시험하기 위하여 단핵구-유래 세포 유형을 사용하는 실험적 시험관 내 모델의 개략도이다. 도 1a는 50 ng/ml의 M-CSF를 7일에 걸쳐 단독으로 투여함으로써 CD14+ 단핵구를 단핵구-유래 대식구로 분화하기 위한 프로토콜을 나타내는 개략도이다. 도 1b는 50 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을 7일에 걸쳐 투여함으로써 CD14+ 단핵구를 단핵구-유래 파골세포로 분화하기 위한 프로토콜을 나타내는 개략도이다.
도 2a 및 도 2b는 타르타르산염-저항성 산 포스파타제(TRAP) 염색을 시험하기 위하여 단핵구-유래 세포 유형을 사용하는 실험적 시험관 내 모델의 개략도이다. 도 2a는 50 ng/ml의 대식구 콜로니-자극 인자(M-CSF)를 7일에 걸쳐 단독으로 투여함으로써 단핵구-유래 대식구로 분화되고, TRAP 염색에 대하여 시험된 CD14+ 단핵구의 대조군을 나타내는 개략도이다. 도 2b는 50 ng/ml의 M-CSF 및 100 ng/ml의 RANKL을 7일에 걸쳐 투여함으로써 단핵구-유래 파골세포로 분화되고, 제0일에 비히클, IgG1(25nM), rFVIII(25nM) 또는 rFVIIIFc(25nM)로 처리된 CD14+ 단핵구의 시험군을 나타내는 개략도이다.
도 3a 내지 도 3e는 단핵구-유래 대식구(도 3a) 및 단핵구-유래 파골세포(도 3b 내지 도 3e)에서의 TRAP 염색의 시각적 표현이다. 도 3b는 비히클로 처리된 단핵구-유래 파골세포에서의 TRAP 염색의 시각적 표현이다. 도 3c는 IgG1로 단독으로 처리된 단핵구-유래 파골세포에서의 TRAP 염색의 시각적 표현이다. 도 3d는 재조합 인자 VIII(rFVIII)로 단독으로 처리된 단핵구-유래 파골세포에서의 TRAP 염색의 시각적 표현이다. 도 3e는 rFVIIIFc로 처리된 단핵구-유래 파골세포에서의 TRAP 염색의 시각적 표현이다.
도 4는 CD14+ 단핵구를 단핵구-유래 파골세포로의 분화 전 1일 동안 4가지 처리 중 하나로 처리한, 파골세포 형성을 결정하기 위한 휴약 실험의 개략도이다: 비히클 처리, 단독의 IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc. 세포를 제7일에 형태에 대하여 분석하였다.
도 5a 내지 도 5d는 분화 전 1일 동안 비히클(도 5a), IgG1(도 5b), rFVIII(도 5c) 또는 rFVIIIFc(도 5d)로 처리되는 경우 분화 후 7일째의 단핵구-유래 파골세포 형태의 시각적 표현이다.
도 6은 CD14+ 단핵구를 M-CSF 및 RANKL 및 4가지 처리 패러다임 중 하나를 사용하여 3일 동안 처리한 후에(비히클, IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc), 단핵구를 소 피질 골 슬라이스 상에 플레이팅하고, 추가 7일 내지 10일 동안 배양한 다음, 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색하여 골 흡수를 결정하는 골 흡수 실험의 개략도이다.
도 7a 내지 도 7d는 비히클(도 7a), 단독의 IgG1(도 7b), rFVIII(도 7c) 또는 rFVIIIFc(도 7d)를 사용하여 이전에 처리된 단핵구-유래 파골세포와 함께 배양된 골 슬라이스의 시각적 표현이다.
도 8은 CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클, 단독의 IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리하고, 7일 동안 M-CSF 및 RANKL의 첨가를 통해 단핵구-유래 파골세포로 분화시키고, 관심 유전자의 발현을 측정함으로써 단핵구-유래 파골세포에서 유전자 발현을 결정하기 위한 실험의 개략도이다.
도 9는 제0일에 비히클(흑색 막대), IgG1(진회색 막대), rFVIII(연회색 막대) 또는 rFVIIIFc(백색 막대)로 처리되고, 처리 후 7일째에 단핵구-유래 파골세포로 분화된 CD14+ 단핵구의 유전자 발현의 그래프 표현이다. 분화의 마커(RANK, NFATC1) 및 골 흡수 활성의 마커(CATK, TRAP, MMP9)를 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 의해 측정하고, 미처리 군에 대하여 정규화시켰다. ns = 유의미하지 않음; **** p<.005; n=6-10.
도 10은 CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클, 단독의 IgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리하고, 7일 동안 M-CSF 및 RANKL의 첨가를 통해 단핵구-유래 파골세포로 분화하고, 제7일에 효소 활성 및 관심 유전자의 발현을 측정함으로써 단핵구-유래 파골세포에서의 유전자 발현 및 효소 활성을 결정하기 위한 실험의 개략도이다.
도 11a 및 도 11b는 제0일에 비히클(흑색 막대), IgG1(진회색 막대), rFVIII(연회색 막대) 또는 rFVIIIFc(백색 막대)로 처리되고, 처리 후 7일째에 단핵구-유래 파골세포로 분화된 CD14+ 단핵구의 유전자 발현(도 11a) 및 효소 활성(도 11b)의 그래프 표현이다. 도 11a는 qPCR에 의해 측정되고 비히클 처리군에 대하여 정규화된 항산화 경로 연관 유전자(NQO1, GCLC)를 도시한 것이다. 도 11b는 측정되고 비히클-처리군에 대하여 정규화된 특정 NQO1 환원효소 활성을 도시한 것이다. ns = 유의미하지 않음; **** p<.005; n=10(도 11a); n=3(도 11b).
도 12는 CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클, 단독의 IgG1, rFVIII, rFVIIIFc 또는 rFVIIIFc-N297A로 처리하고, 7일 동안 M-CSF 및 RANKL의 첨가를 통해 단핵구-유래 파골세포로 분화하고, 파골세포 연관 유전자의 유전자 발현을 측정함으로써 파골세포에서 유전자 발현 및 효소 활성을 결정하기 위한 실험의 개략도이다.
도 13은 제0일에 비히클(흑색 막대), IgG1(진회색 막대), rFVIII(연회색 막대), rFVIIIFc(백색 막대) 또는 rFVIIIFc-N297A(사선 막대)로 처리되고, 처리 후 7일째에 단핵구-유래 파골세포로 분화된 CD14+ 단핵구의 유전자 발현의 그래프 표현이다. RANK, NFATC1, CATK 및 TRAP 수준을 qPCR에 의해 측정하였다. ns = 유의미하지 않음; **** p<.005; * p<.0.05; n=5.
도 14a 및 도 14b는 상이한 용량의 rFVIII + IgG1로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD14 및 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 일련의 밀도 플롯이다. 도 14a는 75 nM에서 7.5 nM의 감소하는 용량의 rFVIII + IgG1을 나타낸다. 도 14b는 4.2 nM에서 0 nM(비히클 대조군)의 감소하는 용량의 rFVIII + IgG1을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 상이한 용량의 rFVIIIFc로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD14 및 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 일련의 밀도 플롯이다. 도 15a는 75 nM에서 7.5 nM의 감소하는 용량의 rFVIIIFc를 나타낸다. 도 15b는 4.2 nM에서 0 nM(비히클 대조군)의 감소하는 용량의 rFVIIIFc를 나타낸다.
도 16은 상이한 용량의 rFVIII + IgG1(원이 있는 선) 또는 rFVIIIFc(사각형이 있는 선)로의 처리 후에 유세포측정에 의해 CD51/61고 세포로 특성화된 비히클 대조군에 비한 파골세포의 백분율의 그래프 표현이다.
도 17a 내지 도 17d는 비히클(도 17a), rFVIIIFc(도 17b), rFVIII + IgG1(도 7c) 또는 rFVIIIFc-N297A(도 17d)로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD16 및 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 일련의 밀도 플롯이다.
도 18a 내지 도 18d는 FcγR1 블로킹 항체의 항원-결합 단편(Fab)(도 18a 및 도 18b) 또는 FcγR1에 특이적으로 결합하지 않는 아이소타입 대조군 Fab(도 18c 및 도 18d)의 존재 하에 rFVIIIFc 또는 rFVIII로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD16 및 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 일련의 밀도 플롯이다.
도 19a 내지 도 19d는 FcγR2 블로킹 항체(도 19a 및 도 19b) 또는 FcγR2에 특이적으로 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체(도 19c 및 도 19d)의 존재 하에 rFVIIIFc 또는 rFVIII로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD16 및 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 일련의 밀도 플롯이다.
도 20a 내지 도 20d는 FcγR3 블로킹 항체(도 20a 및 도 20b) 또는 FcγR3에 특이적으로 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체(도 20c 및 도 20d)의 존재 하에 rFVIIIFc 또는 rFVIII로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD16 및 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 일련의 밀도 플롯이다.
도 21a 내지 도 21d는 비히클(도 21a), rFVIIIFc(도 21b), rFVIII + IgG1(도 21c) 또는 rFVIIIFc-N297A(도 21d)로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 도 17에 대응하는 일련의 히스토그램이다. y-축은 최대 계수(100%)의 백분율로서 규모화되고, 분석 소프트웨어 FlowJo에 의해 계산된 유동 이벤트를 나타낸다.
도 22a 내지 도 22d는 FcγR1 블로킹 항체의 항원-결합 단편(Fab)(도 22a 및 도 22b) 또는 FcγR1에 특이적으로 결합하지 않는 아이소타입 대조군 Fab(도 22c 및 도 22d)의 존재 하에 rFVIIIFc 또는 rFVIII로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 도 18에 대응하는 일련의 히스토그램이다. y-축은 최대 계수(100%)의 백분율로서 규모화되고, 분석 소프트웨어 FlowJo에 의해 계산된 유동 이벤트를 나타낸다.
도 23a 내지 도 23d는 FcγR2 블로킹 항체(도 23a 및 도 23b) 또는 FcγR2에 특이적으로 결합하지 않는 아이소타입 대조군 항체(도 23c 및 도 23d)의 존재 하에 rFVIIIFc 또는 rFVIII로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 도 19에 대응하는 일련의 히스토그램이다. y-축은 최대 계수(100%)의 백분율로서 규모화되고, 분석 소프트웨어 FlowJo에 의해 계산된 유동 이벤트를 나타낸다.
도 24a 내지 도 24d는 FcγR3 블로킹 항체(도 24a 및 도 24b) 또는 FcγR3에 특이적으로 결합하지 않는 아이소타입 대조군(도 24c 및 도 24d)의 존재 하에 rFVIIIFc 또는 rFVIII로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 도 20에 대응하는 일련의 밀도 플롯이다. y-축은 최대 계수(100%)의 백분율로서 규모화되고, 분석 소프트웨어 FlowJo에 의해 계산된 유동 이벤트를 나타낸다.
도 25a 내지 도 25j는 rFVIII(도 25a 내지 도 25e) 또는 rFVIIIFc(도 25f 내지 도 25j)의 존재 하의, FVIII의 A2 영역을 블로킹하는 항체(GMA8017; 도 25b 및 도 25g), FVIII의 A3 영역을 블로킹하는 항체(GMA8010; 도 25c 및 도 25h)의 존재 하의 또는 C2 영역을 블로킹하는 항체(GMA8006; 도 25d 및 도 25i; GMA8026; 도 25e 및 도 25j)의 존재 하의 단핵구 및 단핵구-유래 파골세포의 시각적 표현이다.
도 26의 a 내지 도 26의 e는 폰 빌레브란트 인자(VWF; 도 26의 c 내지 도 26의 e)의 존재 하에 또는 단독으로 rFVIII(도 26의 a) 또는 rFVIIIFc(도 26의 b)로 처리된 단핵구에서 형광-활성화된 유세포측정에 의해 획득되고 CD51/61의 표면 발현에 대하여 분석된 바와 같은 면역표현형을 나타내는 일련의 히스토그램이다. y-축은 최대 계수(100%)의 백분율로서 규모화되고, 분석 소프트웨어 FlowJo에 의해 계산된 유동 이벤트를 나타낸다.
본 개시내용은 낮은 골 무기질 밀도(BMD)를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용되는 방법에 관한 것이다. 일 양태에서, 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 개시된다. 본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체를 선택하는 단계 및 치료적 유효량의, 응고 인자 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 키메라 단백질을 사용한 A형 혈우병을 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 개시되며, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 BMD의 감소를 저해한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 FVIII 및 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 FVIII 및 Fc 영역으로 이루어진다. 다양한 실시형태에서, 키메라 단백질은 rFVIIIFc이다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 5th ed., 2013, Academic Press]; 및 문헌[Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, 2d. ed. (rev.), 2006, Oxford University Press]은 본 개시내용에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.
단수형 "하나"("a", "an") 및 "상기"("the")는 문맥에서 명백하게 다르게 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 용어 "하나", 및 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 용어 "하나"는 "단일"을 의미한다. 다른 양태에서, 용어 "하나"는 "둘 이상" 또는 "다수"를 포함한다. 추가로, 본원에 사용된 "및/또는"은 두 가지의 명시된 특징 또는 구성요소의 각각을 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 구체적으로 개시하는 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기의 양태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
명세서 및 청구범위에서 수치와 함께 사용되는 용어 "약"은 당업자에게 친숙하고 허용 가능한 정확도의 간격을 나타낸다. 일반적으로, 본원의 청구범위, 요약 및 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서, 이러한 정확도의 간격은 ± 10 %이다. 일부 실시형태에서, 특정한 언급된 수치와 관련하여 사용되는 경우, "약"은 값이 언급된 값으로부터 10% 이하로 달라질 수 있는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 특정한 언급된 수치와 관련하여 사용되는 경우, "약"은 값이 언급된 값으로부터 1% 이하로 달라질 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 사용되는 바와 같이, 표현 "약 100"은 99 및 101, 및 그 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함하는 실시형태를 개시한다.
단위, 접두어 및 기호는 이들의 국제단위계(Syst
Figure pct00001
me International de Unites; SI) 허용 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 열거되는 경우, 그 범위의 언급된 상한과 하한 사이의 각각의 사이의 정수 값, 및 이의 각각의 분수가 또한 이러한 값 사이의 각각의 하위범위와 함께 구체적으로 개시되는 것이 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 범위에 포함되거나 그 범위로부터 배제될 수 있고, 상한 또는 하한 중 어느 하나가 포함되거나, 상한 또는 하한 중 어느 것도 포함되지 않거나, 상한 또는 하한 둘 모두가 포함되는 각각의 범위가 본 개시내용에 또한 포함된다. 값이 명시적으로 언급되는 경우, 언급된 값과 거의 동일한 양 또는 수량인 값이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다는 것을 이해해야 한다. 조합이 개시된 경우, 그 조합의 요소의 각각의 하위조합이 또한 구체적으로 개시되고, 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이에 반해서, 상이한 요소 또는 요소의 군이 개별적으로 개시된 경우, 이의 조합이 또한 개시된다. 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로서 개시된 경우, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과의 임의의 조합으로 배제된 개시내용의 예가 또한 이로써 개시되고; 개시내용의 하나 초과의 요소가 이러한 배제를 가질 수 있고, 이러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합이 이로써 개시된다.
당업계에 알려져 있는 바와 같이, 두 폴리펩티드 간의 "서열 동일성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다. 본원에서 논의될 때, 임의의 특정 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드와 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 지의 여부는 당업계에 공지되어 있는 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, BESTFIT 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 유닉스용 버전 8)을 이용하여 결정될 수 있다. BESTFIT은 두 서열 간의 최적의 상동성 세그먼트를 찾기 위해 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘을 사용한다. 특정 서열이, 예를 들어, 본 개시내용에 따른 기준 서열과 95% 동일한 지의 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 물론, 동일성 백분율이 기준 폴리펩티드 서열의 전장에 대해 계산되고 기준 서열 내의 아미노산 총 수의 최대 5%의 상동성에서의 갭이 허용되도록 파라미터가 설정된다. 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 다른 비제한적인 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있으며, 이는 각각 문헌[Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)] 및 문헌[Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기술되어 있다. 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성 백분율을 결정하는 데 본원에 기술된 파라미터와 함께 BLAST 및 BLAST 2.0이 사용될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명 공학 정보 센터(NCBI: National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드와 함께 정렬되는 때, 일부 양의 값의 임계값 점수 T와 매치되거나, 이를 충족시키는 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 점수화 서열 쌍(HSP: high scoring sequence pair)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 점수 임계값으로 지칭된다(상기 문헌[Altschul et al.]). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 씨드(seed)로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라서 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 파라미터 M(매칭되는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(미스매칭되는 잔기에 대한 패널티 점수; 항상<0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 있어서, 점수화 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향으로의 워드 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 달성된 그의 최대값으로부터 양 X 만큼 떨어지거나; 누적 점수가 하나 이상의 음의 점수화 잔기 정렬의 누적으로 인하여 0 이하가 되거나; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달한 경우에는 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 특정 실시형태에서, NCBI BLASTN 또는 BLASTP 프로그램이 서열을 정렬하는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, BLASTN 또는 BLASTP 프로그램은 NCBI에 의해 사용되는 디폴트를 사용한다. 특정 실시형태에서, BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 28의 워드 길이(W); 10의 예상 임계값(E); 0으로 설정된 질의 범위에서의 최대 매치; 1, -2의 매치/미스매치 점수; 선형 갭 코스트; 사용된 낮은 복잡성 영역에 대한 필터; 및 오직 사용된 순람표에 대한 마스크를 사용한다. 특정 실시형태에서, BLASTP 프로그램(아미노산 서열의 경우)은 디폴트로서 3의 워드 길이(W); 10의 예상 임계값(E); 0으로 설정된 질의 범위에서의 최대 매치; BLOSUM62 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)] 참조); 갭 존재 코스트: 11 및 갭 연장 코스트: 1; 및 조건적 조성 점수 매트릭스 조정을 사용한다.
2. 키메라 단백질
"융합" 또는 "키메라" 폴리펩티드 또는 단백질은 그것이 천연에서 자연적으로 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 보통 개별 단백질에 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에 함께 놓일 수 있거나, 보통 동일한 단백질에 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드, 예를 들어, 인자 VIII 도메인과 Ig Fc 도메인의 융합에서의 새로운 배열로 위치될 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계에서 인코딩되는 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 키메라 폴리펩티드는 공유, 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 FVIII 단백질 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들어, 키메라 단백질은 Fc 이량체의 폴리펩티드 쇄 중 하나에 융합된 하나의 FVIII 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 Fc 이량체의 폴리펩티드 쇄 중 하나의 N-말단에 바로 융합된 하나의 FVIII 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, FVIII 단백질은 Fc 이량체에 융합된 유일한 단백질이다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 Fc 이량체의 폴리펩티드 쇄 중 하나의 C-말단에 바로 융합된 하나의 FVIII 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 개재 링커 서열 없이 인간 IgG1의 이량체 Fc 도메인의 하나의 폴리펩티드 쇄에 융합된 재조합 B-도메인 결실된 인간 FVIII(BDD-rFVIII)의 단일의 분자를 포함하거나 이로 이루어진다. 예를 들어, 미국 특허 제9,050,318호 및 제9,241,978호를 참조하며, 이는 이로써 이들 전체가 본원에 참조로 포함된다. 다양한 실시형태에서, 키메라 단백질은 rFVIIIFc이다. 다양한 실시형태에서, rFVIIIFc는 ELOCTA® 또는 ELOCTATE®로 지칭되는 rFVIIIFc이다. rFVIIIFc는 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2018/0360982 A1호 및 미국 특허 제9,050,318호 및 제9,241,978호에 상세히 개시되어 있으며, 이는 이로써 이들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 1665에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 FVIII 부분은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 키메라 폴리펩티드의 Fc 부분은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 FVIII 부분은 SEQ ID NO: 2와 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 키메라 폴리펩티드의 Fc 부분은 SEQ ID NO: 5와 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 제1 폴리펩티드 쇄는 FVIII 부분 및 제1 Fc 부분을 포함하며, 제2 폴리펩티드 쇄는 제2 Fc 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩티드는 제2 Fc 부분으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제1 Fc 부분은 제2 Fc 부분과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 FVIII 부분 및 Fc 부분을 포함하며, FVIII 부분은 Fc 부분의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 FVIII 부분 및 Fc 부분을 포함하며, FVIII 부분은 Fc 부분의 C-말단에 융합된다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 제1 폴리펩티드 쇄는 FVIII 부분 및 제1 Fc 부분을 포함하며, 제2 폴리펩티드 쇄는 제2 Fc 부분을 포함하며, 제1 Fc 부분 및 제2 Fc 부분은 공유 결합에 의해 서로 회합된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 Fc 부분의 힌지 영역 내의 2개의 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 제1 폴리펩티드 쇄는 FVIII 부분 및 제1 Fc 부분을 포함하며, 제2 폴리펩티드 쇄는 제2 Fc 부분을 포함하며, FVIII 부분은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 키메라 폴리펩티드의 Fc 부분은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 제2 Fc 부분은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 에프모로크토코그 알파이다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 SEQ ID NO: 4에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 SEQ ID NO: 4와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 VWF, 또는 이의 단편, 변이체 또는 돌연변이체를 포함하지 않는다.
포유동물 세포에 의해 분비되는 특정 단백질은 분비 신호 펩티드와 회합되며, 이는 일단 조면 소포체를 가로지르는 성장 중인 단백질 쇄의 유출이 개시되면, 성숙 단백질로부터 절단된다. 당업자는 신호 펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합되며, 보통 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩티드를 생성하는 것을 알고 있다. 특정 실시형태에서, 고유 신호 펩티드 또는 이 서열의 기능적 유도체는 그것과 작동 가능하게 회합된 폴리펩티드의 분비를 유도하는 능력을 보유한다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드, 예를 들어, 인간 조직 플라스미노겐 활성화인자(TPA) 또는 마우스 ß-글루쿠로니다제 신호 펩티드 또는 이의 기능적 유도체가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 포유동물 세포 또는 포유동물 세포들에 의해 생성된 바 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 인간 세포 또는 인간 세포들에 의해 생성된 바 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포에 의해 생성된 바 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "FVIII"로 본 출원에서 약칭되는 "인자 VIII"은 달리 명시되지 않는 한, 응고에서 정상적인 역할을 하는 기능적 FVIII 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 용어 FVIII는 기능적인 변이체 폴리펩티드를 포함한다. "FVIII 단백질"은 "FVIII 폴리펩티드" 또는 "FVIII"과 상호교환 가능하게 사용된다. FVIII 기능의 예는, 응고를 활성화하는 능력, 인자 IX에 대한 보조인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에 인자 IX와 테나제(tenase) 복합체를 형성하고, 이어서 인자 X를 활성화 형태인 Xa로 전환시키는 능력을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, FVIII 단백질은 인간, 비-인간 영장류, 돼지, 개, 랫트 또는 쥣과 FVIII 단백질일 수 있다. 특정 실시형태에서, FVIII 단백질은 인간 FVIII 단백질이다. 특정 실시형태에서, FVIII 단백질은 인간 FVIII 단백질로부터 유래된다. 인간 FVIII 단백질로부터 유래될 수 있는 FVIII 단백질의 비제한적인 예는 본원에 개시되며, FVIII B 도메인의 부분적인 또는 완전한 결실을 갖는 FVIII 단백질, 및 FVIII 단백질이 트롬빈에 의해 절단되지 않거나, 대응하는 야생형 FVIII 단백질에 비하여 감소된 트롬빈 절단을 갖도록 FVIII B 도메인 내에 돌연변이를 갖는 FVIII 단백질을 포함한다. 또한, 인간과 다른 종 유래의 FVIII 간의 비교에 의해, 기능에 필요할 것 같은 보존된 잔기가 확인된 바 있다(문헌[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)]; 미국 특허 제6,251,632호). 많은 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 형태와 같이 전장 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열은 알려져 있다. 다양한 FVIII 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 미국 공개 제2015/0158929 A1호, 제2014/0308280 A1호, 및 제2014/0370035 A1호, 및 국제 공개 제WO 2015/106052 A1호에 개시되어 있으며, 이의 각각은 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다. 다양한 실시형태에서, FVIII 단백질은 인간 FVIII 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. FVIII 폴리펩티드는 예를 들어, 전장 FVIII, N-말단에서 Met를 제한 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열을 제함), N-말단에 추가의 Met를 갖는 성숙 FVIII 및/또는 B 도메인의 완전한 또는 부분적인 결실을 갖는 FVIII을 포함한다. FVIII 변이체는 부분적인 결실이든, 또는 완전한 결실이든, B 도메인 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 키메라 단백질 또는 조성물의 FVIII은 B 도메인 결실된 FVIII을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 FVIII의 "B 도메인"은 내부 아미노산 서열 동일성 및 트롬빈에 의한 단백질 가수분해 절단의 부위, 예를 들어, 성숙 인간 FVIII의 잔기 Ser741-Arg1648에 의해 정의된, 당업계에 공지된 B 도메인과 동일하다. 다른 인간 FVIII 도메인은 성숙 인간 FVIII과 비교하여 성숙 FVIII의 하기의 아미노산 잔기에 의해 정의된다: A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; A3, 잔기 Ser1690-Ile2032; C1, 잔기 Arg2033-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. 어떠한 SEQ ID 번호도 언급하지 않고 본원에서 사용되는 서열 잔기 번호는 다르게 나타내지 않는 한, 신호 펩티드 서열(19개 아미노산)이 없는 FVIII 서열에 대응한다. FVIII 중쇄로도 알려져 있는 A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 나머지 서열인 잔기 Glu1649-Arg1689는 보통 FVIII 경쇄 활성화 펩티드 또는 간단히 FVIII 경쇄로 지칭된다. 예를 들어, 돼지, 마우스 및 개 FVIII에 대한, B 도메인을 포함하는 모든 도메인에 대한 경계의 위치는 또한 당업계에 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, FVIII의 B 도메인은 결실된다("B-도메인-결실된 FVIII" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 예는 REFACTO®(재조합 BDD FVIII)이다.
일부 실시형태에서, B-도메인-결실된 FVIII은 미국 특허 제6,316,226호, 제6,346,513호, 제7,041,635호, 제5,789,203호, 제6,060,447호, 제5,595,886호, 제6,228,620호, 제5,972,885호, 제6,048,720호, 제5,543,502호, 제5,610,278호, 제5,171,844호, 제5,112,950호, 제4,868,112호, 제6,458,563호 또는 국제 공개 제WO 2015106052 A1호(제PCT/US2015/010738호)에 개시된 완전한 또는 부분적인 결실을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, B-도메인-결실된 FVIII은 제WO 91/09122호에 개시된 바와 같이, B 도메인의 대부분의 결실을 갖지만, 일차 번역 생성물을 2개의 폴리펩티드 쇄로 생체 내에서 단백질 가수분해적으로 처리하는 데 필수적인 B 도메인의 아미노-말단 서열을 여전히 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 747 내지 1638의 결실, 즉, 사실상 B 도메인의 완전한 결실을 갖는 B-도메인-결실된 FVIII이 구축된다. 문헌[Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)]. B-도메인-결실된 인자 VIII은 또한 FVIII의 아미노산 771 내지 1666 또는 아미노산 868 내지 1562의 결실을 포함할 수 있다. 문헌[Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988)]. 특정 실시형태의 부분일 수 있는 추가의 B 도메인 결실은 하기를 포함한다: 아미노산 982 내지 1562 또는 760 내지 1639(문헌[Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942]), 797 내지 1562(문헌[Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347]), 741 내지 1646(Kaufman(PCT 공개 출원 제WO 87/04187호)), 747 내지 1560(문헌[Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564]), 741 내지 1648(Pasek(PCT 출원 제88/00831호)) 또는 816 내지 1598 또는 741 내지 1648(Lagner(문헌[Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25], EP 295597호))의 결실.
일부 실시형태에서, BDD FVIII은 전장 FVIII 서열의 아미노산 서열에 대응하는 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위, 예를 들어, 잔기 757, 784, 828, 900, 963, 또는 선택적으로는 943을 보유하는 B 도메인의 단편을 함유하는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. B-도메인 단편의 예는 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)], 문헌[Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008)] 및 문헌[Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)]에 개시된 바와 같은 B 도메인의 226개의 아미노산 또는 163개의 아미노산을 포함한다(즉, B 도메인의 처음 226개의 아미노산 또는 163개의 아미노산이 보유됨). 특정 실시형태에서, BDD FVIII은 BDD FVIII 단백질의 발현을 개선하기 위한 (Phe에서 Ser로의) 점 돌연변이를 잔기 309에서 추가로 포함한다. 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)]을 참조한다. 다양한 실시형태에서, BDD FVIII은, B 도메인의 일부를 함유하지만, 하나 이상의 퓨린 절단 부위(예를 들어, Arg 1313 및 Arg 1648)를 함유하지 않는 FVIII 폴리펩티드를 포함한다. 문헌[Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)]을 참조한다. 일부 실시형태에서, BDD FVIII은 성숙 전장 FVIII에 대응하는 아미노산 765 내지 1652의 결실을 함유하는 단일-쇄 FVIII(rVIII-단일쇄 및 AFSTYLA®로도 알려짐)을 포함한다. 미국 특허 제7,041,635호를 참조한다. 상기 결실의 각각은 임의의 FVIII 서열에서 이루어질 수 있다.
상당히 많은 기능적 FVIII 변이체가 당업계에 공지되어 있다. 또한, FVIII 내에 수백 개의 비기능적 돌연변이가 혈우병 환자에서 확인된 바 있으며, FVIII 기능에 대한 이들 돌연변이의 효과는 돌연변이의 성질에 기인한 것이기보다는 이들이 FVIII의 3-차원 구조 내에 존재하는 곳에 기인하는 것으로 결정된 바 있다(전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)]). 또한, 인간 및 다른 종으로부터의 FVIII 간의 비교에 의해 기능에 필요할 것 같은 보존된 잔기가 확인된 바 있다(각각이 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)]; 미국 특허 제6,251,632호).
인자 VIII 단백질은 "가공된" FVIII 또는 "단일-쇄" FVIII 중 어느 하나로서 활성 형태로 존재할 수 있다. 이러한 유형의 가공된 및 단일-쇄 형태는 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제2018/0360982 A1호에 논의된다.
일부 실시형태에서, 인자 VIII 활성을 갖는 키메라 폴리펩티드는 인자 VIII 단백질 및 제2 부분을 포함하며, 인자 VIII 단백질은 2개의 쇄, 즉, 중쇄를 포함하는 제1 쇄 및 경쇄를 포함하는 제2 쇄를 포함하는 가공된 인자 VIII이며, 상기 제1 쇄 및 상기 제2 쇄는 금속 결합에 의해 회합된다. 예를 들어, 키메라 폴리펩티드의 적어도 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%는 가공된 인자 VIII인 인자 VIII 부분을 포함하며, 키메라 폴리펩티드의 나머지는 비가공된 인자 VIII 부분(즉, 단일-쇄 FVIII)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 인자 VIII 활성을 갖는 키메라 폴리펩티드를 포함하며, 인자 VIII 부분은 단일-쇄 인자 VIII이다. 일부 실시형태에서, 단일-쇄 인자 VIII은 무손상 세포내 가공 부위를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 인자 VIII 부분의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%는 단일-쇄 인자 VIII이다. 또 다른 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%는 단일-쇄 인자 VIII인 인자 VIII 부분을 포함하며, 키메라 폴리펩티드의 나머지는 가공된 인자 VIII인 인자 VIII 부분을 포함한다. 또 다른 양태에서, 단일-쇄 FVIII(scFVIII)은 세포내 가공 부위를 함유하지 않는다. 예를 들어, scFVIII은 전장 인자 VIII에서 아르기닌 1645에 대응하는 아미노산 위치에서 치환 또는 돌연변이, 아르기닌 1648에 대응하는 아미노산 위치에서 치환 또는 돌연변이, 또는 아르기닌 1645 및 아르기닌 1648에 대응하는 아미노산 위치에서 치환 또는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아르기닌 1645에 대응하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산은 아르기닌 1648에 대응하는 아미노산 위치에서 치환된 아미노산과 상이한 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 치환 또는 돌연변이는 아르기닌에서 알라닌으로의 치환이다.
일부 실시형태에서, 단일-쇄 인자 VIII을 포함하는 키메라 폴리펩티드는 인자 VIII 활성을 발색 검정(chromogenic assay)에 의해 시험관 내에서 측정할 때, 2개의 Fc 부분, 및 2개의 Fc 부분 중 하나에 융합된 가공된 인자 VIII로 이루어진 키메라 폴리펩티드와 유사한 수준으로 인자 VIII 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일-쇄 인자 VIII을 포함하는 키메라 폴리펩티드는 생체 내에서 2개의 Fc 부분, 및 2개의 Fc 부분 중 하나에 융합된 가공된 인자 VIII로 이루어진 키메라 폴리펩티드와 유사한 인자 VIII 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일-쇄 인자 VIII을 포함하는 키메라 폴리펩티드는 2개의 Fc 부분, 및 2개의 Fc 부분 중 하나에 융합된 가공된 인자 VIII로 이루어진 키메라 폴리펩티드와 유사한 인자 Xa 생성률을 갖는다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에서의 단일-쇄 인자 VIII은 2개의 Fc 부분 및 가공된 인자 VIII로 이루어진 키메라 폴리펩티드에서의 가공된 인자 VIII과 유사한 수준으로 활성화된 단백질 C에 의해 불활성화된다. 특정 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에서의 단일-쇄 인자 VIII은 2개의 Fc 부분 및 가공된 인자 VIII로 이루어진 키메라 폴리펩티드에서의 가공된 인자 VIII과 유사한 인자 IXa 상호작용비를 갖는다. 일부 실시형태에서, 키메라 폴리펩티드에서의 단일-쇄 인자 VIII은 2개의 Fc 부분 및 가공된 인자 VIII로 이루어진 키메라 폴리펩티드에서의 가공된 인자 VIII과 유사한 수준으로 폰 빌레브란트 인자에 결합한다.
본 개시내용은 인자 VIII 활성을 갖는 키메라 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 폴리펩티드의 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%는 단일-쇄 인자 VIII인 인자 VIII 부분, 및 제2 부분을 포함하며, 상기 단일-쇄 인자 VIII은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 99% 동일하거나, 이와 동일하다. 일부 실시형태에서, 제2 부분은 Fc일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드를 포함하는 하이브리드의 형태로 존재하며, 상기 제2 폴리펩티드는 본질적으로 Fc로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 인자 VIII로 이루어진 폴리펩티드보다 적어도 1.5 내지 6배 더 긴, 1.5 내지 5배 더 긴, 1.5 내지 4배 더 긴, 1.5 내지 3배 더 긴 또는 1.5 내지 2배 더 긴 반감기를 갖는다.
3. 골 무기질 밀도
본원에 사용되는 바와 같이, "골 무기질 밀도" 또는 "BMD"는 특정 골 영역에서 측정된 골 무기질 함량으로서 정의된다. 골은 상대적으로 높은 턴오버를 갖는 동적 조직이다. 골 대사는 각각 조골세포 및 파골세포에 의해 매개되는 골 형성과 골 흡수 간의 평형을 특징으로 한다. 이들 골 리모델링 세포 간의 상호작용은 사이토카인, 성장 인자 및 기타 단백질에 의해 매개된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "골다공증"은 골의 밀도 및 질이 감소되는 널리 알려진 질병을 나타낸다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "골다공증"은 원발성 골다공증 및 속발성 골다공증 둘 모두를 포함하는 모든 형태의 골다공증을 포함한다. 골다공증은 BMD의 심각한 감소, 골절 및 추가의 병적상태에 대한 환자의 소인을 특징으로 한다. 골다공증은 몇몇의 인자에 의해, 가장 두드러지게는 연령, 성별 및 기타 질병의 존재에 의해 이환된다. 반응성 산소 종(ROS)은 또한 파골세포형 동안 세포내 신호전달에서 역할을 수행한다(문헌[Domazetovic et al, Clin Cases Miner Bone Metab 2017]). 비타민 D 결핍 또는 비타민 D 부족은 또한, 특정 혈우병 집단에서 낮은 BMD와 연관이 있다(문헌[Kempton et al, Haemophilia 2015, 21, 568-577]). 일부 실시형태에서, 골다공증은 원발성 골다공증이다. 특정 실시형태에서, 골다공증은 속발성 골다공증이다. 다양한 실시형태에서, 골다공증은 A형 혈우병과 연관이 있다. 일부 실시형태에서, 골다공증은 A형 혈우병의 결과이거나, 이의 결과인 것으로 의심된다.
골다공증은 면역계에 의해 능동적으로 매개되는 가장 흔한 염증성 골 손실 질환 중 하나이다(문헌[Srivastava RK et al, Front Immunol 2018]). 전사 인자 핵 인자 E2-관련 인자 2(NRF2)는 RANKL에 의해 능동적으로 저해되는 메커니즘인 항산화 효소 상향조절을 통해 파골세포형성을 음성적으로 조절한다(문헌[Kanzaki et al, J Biol Chem 2013]). 또한, NRF2-조절된 효소 헴 옥시게나제-1(HO-1)은 마우스에서 파골세포 형성을 저해하는 것으로 보인다(문헌[Florczyk-Soluch et al, Sci Reports 2018]).
특정 실시형태에서, 대상체는 비타민 D 결핍을 갖는다. 일부 실시형태에서, 20 나노그램/밀리리터 내지 50 ng/mL의 비타민 D 수준이 건강한 사람들에 대하여 적당한 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 12 ng/mL 미만의 비타민 D 수준은 일반적으로 비타민 D 결핍을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 비타민 D 결핍은 약 12 ng/mL 미만의 비타민 D 수준을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 대상체는 비타민 D 결핍을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 비타민 D 섭취 및/또는 수준은 고려되지 않고/거나 알려져 있지 않다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 비타민 D 수준은 알려져 있지 않다.
골 형성의 예시적인 바이오마커는 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 프로콜라겐 1 형 N-말단 프로펩티드(P1NP), 프로콜라겐 1형 C-말단 프로펩티드(P1CP) 및 오스테오칼신이다. 골 흡수의 예시적인 바이오마커에는 혈청 중 총 알칼리성 포스파타제, 핵 인자 카파 B의 수용체 활성화인자(RANKL), 오스테오프로테게린(OPG), 타르타르산염-저항성 산 포스파타제(TRAP), 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 데옥시피리디놀린(DPD), 피리디놀린(PYD), 골 시알로단백질, 카텝신 K, 타르타르산염-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP5b), 기질 메탈로프로테이나제 9(MMP9) 및 1형 콜라겐에 대한 C- 및 N-말단 교차-결합된 텔로펩티드(각각 CTX-1 및 NTX-1)가 있다. 골 형성 저해제의 예시적인 바이오마커는 Dickkopf-1(DDK-1)의 혈청 수준 및 스클레로스틴(sclerostin)의 혈청 수준이다(문헌[Rodriguez-Merchan and Valentino, Blood Rev 2019]; 문헌[Kuo and Chen, Biomarker Res 2017]).
다양한 실시형태에서, 골 형성, 골 흡수 및/또는 골 손실의 하나 이상의 바이오마커는 대상체의 말초 혈액으로부터 평가될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 골 형성, 골 흡수 및/또는 골 손실의 하나 이상의 바이오마커는 대상체의 소변으로부터 평가될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 골 형성, 골 흡수 및/또는 골 손실의 하나 이상의 바이오마커는 대상체의 말초 혈액 또는 소변의 시료로부터 평가될 수 있다.
말초 혈액으로부터 바이오마커 수준을 평가하는 것은 예를 들어, 몇몇의 상이한 임의의 검정을 사용하여 달성될 수 있다. 바이오마커 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있는 검정의 비제한적인 예는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 효소 면역검정, 방사성면역검정 및 화학발광 면역검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 분석기를 사용하여, 대상체 시료에서 바이오마커의 수준을 결정할 수도 있으며, 이에는 표준 테크니코(Technico) 오토(Auto)-분석기, 로슈(Roche) COBAS 인테그라(Integra) 800, 올림푸스(Olympus) AU 5200 분석기가 포함된다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 하이드록시프롤린이다. 일부 실시형태에서, 하이드록시프롤린은 말초 혈액으로부터 평가된다. 일부 실시형태에서, 하이드록시프롤린은 대상체의 소변으로부터 평가된다. 일부 실시형태에서, 하이드록시프롤린은 말초 혈액 또는 소변으로부터 평가되며, 베르그만(Bergman) 및 록슬레이(Loxley) 방법(문헌[Bergman and Loxley, Analytical Chemistry, 1963])에 의해 분석된다.
파골세포는 큰 다핵 세포이며, 골 흡수 활성, 즉, 골 조직을 분해하는 능력을 갖는 체 내의 유일한 세포이다. 파골세포는 단핵구를 포함하는 조혈 전구체로부터 유래되며, 이는 2가지 최소 분화 인자를 필요로 한다: RANKL(핵 인자 κB 리간드의 수용체 활성화인자) 및 M-CSF(대식구 콜로니-자극 인자)(문헌[Kanzaki H. et al, J Biol Chem 2013]). 단핵구는 받는 자극 인자에 따라 대식구, 수지상 세포 및 파골세포로 분화할 수 있는 전구 세포의 한 유형이다.
최근의 한 연구에 의해, Fc 도메인에 연결된 재조합 FVIII(rFVIIIFc)가 인간 단핵구-유래 대식구를 M2/Mox-유사 대식구 조절 표현형으로 편향시키며, 단독의 재조합 FVIII은 그렇지 않은 것으로 나타났다. 문헌[Kis-Toth et al, Blood Adv., 2(21): 2904-2916 (2018)]. 그러나, 혈우병에서의 BMD 손실의 메커니즘의 상세한 이해는 현재 알려져 있지 않다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 골절의 위험 증가를 갖는 대상체를 치료하기 위해 사용된다. 혈우병 환자는 건강한 개체에 비하여 골절되기 더 쉽다. 한 연구에서, 중증 혈우병 환자가 중등도 및 경증 혈우병 환자에 비하여 골절을 앓을 가능성이 44% 더 크다는 것이 관찰되었다. 문헌[Gay et al., Br J Haematology. 170:584-593 (2015)]. 일부 실시형태에서, 대상체는 중증 혈우병을 갖는다. 특정 실시형태에서, 대상체는 중등도 혈우병을 갖는다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 경증 혈우병을 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "골절 위험"은 알려져 있는 위험 인자에 기초한 골절의 가능성의 증가로서 정의된다. 알려져 있는 위험 인자에 기초한 골절 위험은 임상의 및/또는 표준화된 도구, 예컨대 FRAX 골절 위험 평가 도구에 의해 결정될 수 있다. BMD는 골절 위험에 대한 위험 인자로 간주될 수 있다. 일반적으로, BMD가 감소함에 따라 골절의 위험이 증가한다.
본원에 사용되는 바와 같이, FRAX는 셰필드(Sheffield) 대학에서 개발된 골절 위험 평가 도구를 나타낸다. 일반적으로, 문헌[Kanis, J. A., et al. Osteoporosis Int'l. 21.2: 407-413 (2010)]을 참조한다. FRAX는 고관절 또는 골다공증성 골절의 10년 확률을 계산한다. FRAX는 연령, 성별, 체중, 신장, 골절력, 고관절 골절 가족력, 흡연 상태, 글루코코르티코이드의 이용, 류마티스 관절염의 존재 또는 부재, 속발성 골다공증, 알코올 섭취 및 골 무기질 밀도에 기초하여 골절 위험을 계산한다. 1년 위험 골절은 10년 위험 골절의 산출량의 10%와 동일하다(즉, 60%의 10년 위험 골절은 6%의 1년 위험 골절과 동일할 것이다).
특정 실시형태에서, 혈우병 환자의 BMD는 출혈 이벤트 또는 골절을 포함하는 특정 이벤트 후에 결정된다. BMD는 예를 들어, 듀얼 X-선 흡수계측법(DXA) 또는 듀얼-에너지 X-선 흡수계측법(DEXA)에 의해 시험될 수 있다. BMD는 제곱 센티미터당 그램(g/cm2)으로서 측정될 수 있다. 집단에 걸쳐 BMD를 분석하기 위하여, BMD는 건강한 청소년에 대한 평균 "T-점수"와 비교할 수 있다. 이 T-점수는 표준 편차(SD)로 측정된, 환자와 동일한 성별의 건강한 평균 청소년의 군 간의 평균 BMD의 차이이다. 예를 들어, -1.0 이상(더 작은 음수)의 T-점수는 정상으로 간주될 수 있다. -1.0 미만(더 큰 음수)의 T-점수는 골감소증을 나타낼 수 있다. -2.5 미만의 T-점수는 골다공증을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. BMD 시험은 고관절 또는 요추에서 골 무기질 밀도를 측정할 수 있다. BMD 시험은 또한 아래팔, 팔목, 손가락 또는 발뒤꿈치에서 골 무기질 밀도를 측정할 수 있다. 또한, BMD는 평균 "Z-점수"와 비교될 수 있다. 이 Z-점수는 표준 편차로 측정된, 환자와 건강한, 연령- 및 성별-매치되는 대조군 간의 평균 BMD의 차이이다. Z-점수는 속발성 골다공증의 진단에 유용할 수 있다. -2.0 미만의 Z-점수는 낮은 골 무기질 밀도를 나타낼 수 있다. T-점수 및 Z-점수를 포함하는 골 덴시토메트리에 관한 추가의 상세사항에 대해서는, 문헌[Cummings et al., JAMA 288(15):1889-1897 (2002)]을 참조하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시형태에서, T-점수를 사용하여 적어도 20세인 대상체에서 BMD를 평가한다. 특정 실시형태에서, T-점수를 사용하여 적어도 30세인 대상체에서 BMD를 평가한다. 특정 실시형태에서, T-점수를 사용하여 적어도 40세인 대상체에서 BMD를 평가한다. 특정 실시형태에서, T-점수를 사용하여 적어도 50세인 대상체에서 BMD를 평가한다.
특정 실시형태에서, Z-점수를 사용하여, 30세 미만인 대상체에서 BMD를 평가한다. 특정 실시형태에서, Z-점수를 사용하여, 20세 미만인 대상체에서 BMD를 평가한다.
일부 실시형태에서, A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체는 청소년 평균의 1 내지 1.25 표준 편차 미만인 골 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체는 청소년 평균의 2.5 표준 편차 이상인 골 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 동일한 연령 및 성별의 대상체에 대한 평균 골 밀도 미만인 골 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 동일한 연령 및 성별의 대상체에 대한 평균 골 밀도보다 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 더 낮은 골 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 동일한 연령 및 성별의 대상체에 대한 평균 골 밀도보다 적어도 10% 더 낮은 골 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, BMD는 요추에서 측정된다. 일부 실시형태에서, BMD는 고관절에서 측정된다. 일부 실시형태에서, BMD는 팔에서 측정된다. 일부 실시형태에서, BMD는 다리에서 측정된다. 일부 실시형태에서, BMD는 무릎에서 측정된다. 일부 실시형태에서, BMD는 손목에서 측정된다. 일부 실시형태에서, BMD는 손가락에서 측정된다. 일부 실시형태에서, BMD는 발뒤꿈치에서 측정된다. 일부 실시형태에서, 낮은 BMD를 갖는 대상체는 A형 혈우병을 갖지 않는 대응하는 대상체(또는 대응하는 대상체의 집단)에 비하여 특정 부위에서 10% 또는 15% 더 낮은 BMD를 갖는다.
일부 실시형태에서, 대상체는 위험 인자를 사용하여 낮은 BMD를 갖는 것으로 확인될 수 있다. 낮은 BMD에 대한 위험 인자는 연령, 성별, 인종, 혈우병성 관절병증, 감소된 신체 활동, 만성 바이러스 감염(예를 들어, HIV 또는 HCV), 비타민 D 결핍, 낮은 체질량지수(BMI) 및/또는 생식샘저하증을 포함한다. 문헌[Kempton CL et al. Haemophilia 21(5):568-77 (2015)]을 참조한다. 다른 위험 인자는 해당 분야에 알려져 있는 바와 같은 현재의 허용되는 임상 지침 및 실무에 따라 평가될 수 있다.
대상체가 낮은 BMD를 갖는 것으로 결정되면, 본원에 개시된 방법을 사용하여 대상체에서 BMD의 감소를 저해하고/거나 대상체에서 BMD의 추가의 감소에 대하여 보호할 수 있다. 대상체가 또 다른 FVIII 대체 요법 또는 또 다른 A형 혈우병 치료법으로 현재 치료 중이면, 대상체에서 BMD의 감소를 저해하고/거나 시간이 지남에 따라 대상체에서 BMD의 추가의 감소에 대하여 보호하기 위하여, 본원에 개시된 방법으로의 치료 계획의 변경이 고려될 수 있다.
본원에 개시된 실시예에 상세화된 바와 같이, 인간 대식구로의 rFVIIIFc의 투여 치료는 시험관 내에서 단핵구-유래 파골세포 형성 및 기능을 효율적으로 저해하였다. 이 관찰은 rFVIIIFc를 사용한 대체 요법이 A형 혈우병 환자에서 골 건강에 대하여 잠재적인 면역조절 이익을 가질 수 있다는 것을 뒷받침한다. 정확한 메커니즘이 알려져 있지 않지만, 임의의 과학 이론에 의해 결부시키지 않고, rFVIIIFc는 혈우병 환자에서 면역 환경을 항산화, 관용원성 및 더 적은 골다공증 상태로 촉진시킴으로써 A형 혈우병 환자에서 BMD의 감소에 대하여 보호할 수 있다.
4. 혈우병
혈우병의 3개의 주요 형태는 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증), B형 혈우병(인자 IX 결핍증 또는 "크리스마스병") 및 C형 혈우병(인자 XI 결핍증, 경증 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애는, 예를 들어, 폰 빌레브란트 질병, 인자 XI 결핍증(PTA 결핍증), 인자 XII 결핍증, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII의 결핍증 또는 구조적 비정상, GPIb의 결함 또는 결핍증인 베르나르-술리에(Bernard-Soulier) 증후군을 포함한다. 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 대한 수용체인 GPIb는 결함이 있을 수 있고, 이는 일차 혈전 형성(1차 지혈)의 결여 및 출혈 경향의 증가, 및 글란즈만(Glanzman) 및 네겔리(Naegeli)의 혈소판무력증(글란즈만 혈소판무력증)으로 이어질 수 있다. 간부전(급성 및 만성 형태)에서, 간에 의한 응고 인자의 생성이 불충분하고; 이는 출혈 위험을 증가시킬 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 혈우병은 범주에 의해 등급화될 수 있다. 예를 들어, 이는 "경증", "중등도" 또는 "중증"으로 분류될 수 있다. A형 혈우병은 (정상에 비하여) 1% 이하("중증"), 2% 내지 5%("중등도") 및 6 내지 30%("경증")의 FVIII 혈장 수준에 의해 정의되는 3가지 중증도 등급을 갖는다. 문헌[White et al. Thromb. Haemost. 85:560 (2001)].
본원에 사용되는 바와 같은 "치료한다", "치료", "치료하는"은, 예를 들어, 질병 또는 질환의 중증도의 감소; 질병 과정의 지속기간의 감소; 질병 또는 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 개선; 질병 또는 질환을 반드시 치유하지 않고 질병 또는 질환을 갖는 대상체에 대한 유리한 효과의 제공; 또는 질병 또는 질환과 연관된 하나 이상의 증상의 예방을 나타낸다. 일 양태에서, 본원에 개시된 방법은 A형 혈우병을 갖는 대상체의 치료 방법이다. 특정 실시형태에서, 치료하는 것은 예를 들어, rFVIII 대체로 치료되는 대응하는 대상체에 비하여 대상체에서 출혈 에피소드의 가능성을 감소시키거나 예방하는 것 및 또한 대상체에서 BMD를 개선시키거나 BMD의 감소를 둔화시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 치료하는 것은 예를 들어, rFVIII 대체로 치료되는 대응하는 대상체에 비하여 대상체에서 출혈 에피소드의 위험을 감소시키는 것 및 또한 대상체에서 골절의 위험을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 치료하는 것은 예를 들어, rFVIII 대체로 치료되는 대응하는 대상체에 비하여 대상체에서 출혈 에피소드의 중증도를 감소시키는 것 및 또한 대상체에서 BMD를 개선시키거나 BMD의 감소를 둔화시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 치료하는 것은 예를 들어, rFVIII 대체로 치료되는 대응하는 대상체에 비하여 대상체에서 출혈 에피소드의 중증도를 감소시키는 것 및 또한 대상체에서 골절의 위험을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 예방적 치료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 대증적(on-demand) 치료를 포함한다.
A형 혈우병에 대한 몇몇의 치료 옵션이 현재 이용 가능하며, 이에는 종래의 FVIII 대체(예를 들어, ADVATE®/옥토코그 알파, AFSTYLA®/로노크토코그 알파 NUWIQ®/시모크토코그 알파) 및 연장된 반감기 FVIII 대체 요법(예를 들어, ELOCTATE®/에프모로크토코그 알파, ESPEROCT®/투로크토코그 알파 페골 및 ADYNOVATE®/루리오크토코그 알파 페골)이 포함한다. 기타 비-대체 요법, 예컨대 에미시주맙이 또한 현재 이용 가능하다. 검토를 위하여, 문헌[Peters & Harris, Nat Rev Drug Disc. (2018)]; 문헌[Weyand & Pipe, Blood, 133(5): 389-398 (2019)]을 참조한다. BMD 및 골다공증에 대한 옥토코그 알파, 로노크토코그 알파, 시모크토코그 알파, 투로크토코그 알파 및 루리오크토코그 알파 페골과 같은 치료의 영향은 알려져 있지 않다.
본원에 제공되는 데이터에 의해, rFVIIIFc를 사용한 치료가 시간이 지남에 따라 BMD 손실을 저해함으로써 A형 혈우병 환자에 추가의 골보호 이익을 제공할 수 있다는 것이 입증된 바 있다. 이들 골 건강 이익은 단독의 rFVIII로의 치료를 사용하여 관찰되지 않았으며, 이는 이들 이익이 아마도 키메라 단백질 상의 Fc 도메인의 존재로 인하여, rFVIIIFc에 특유한 것임을 뒷받침한다. 이와 같이, rFVIIIFc는 낮은 BMD, 골다공증 및/또는 증가된 골절 위험을 갖는 A형 혈우병 대상체를 위한 뛰어난 치료의 선택일 수 있다. 또한, BMD 감소가 진행성 질병이고, A형 혈우병을 갖는 대상체에서 어린 나이에 시작하기 때문에, rFVIIIFc는 낮은 BMD가 발생하거나 또는 낮은 BMD를 가질 위험이 있는 임의의 A형 혈우병 대상체를 위한 뛰어난 치료의 선택일 수 있다.
다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체는 rFVIIIFc 이외의 치료를 사용하여 적당한 응고를 갖지만, 낮은 BMD, 골다공증 및/또는 증가된 골절 위험을 갖는다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체는 rFVIII 및 반감기 연장 모이어티(예컨대 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 적당한 응고를 갖지만, 낮은 BMD, 골다공증 및/또는 증가된 골절 위험을 갖는다. 일부 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체는 rFVIII을 사용하여 적당한 응고를 갖지만, 낮은 BMD, 골다공증 및/또는 증가된 골절 위험을 갖는다. 특정 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체는 응고-촉진(pro-clotting) 이중특이적 항체(예를 들어, 인자 IX 및 인자 X에 결합하는 이중특이적 항체, 예컨대 에미시주맙 또는 에미시주맙-kxwh)를 사용하여 적당한 응고를 갖지만, 낮은 BMD, 골다공증 및/또는 증가된 골절 위험을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 골감소증을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 골다공증을 갖는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 증가된 골절 위험을 갖는다.
다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 용량 사이의 적어도 1%, 2%, 3%, 4% 또는 적어도 5%의 FVIII 활성이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용량 사이의 FVIII 활성은 용량 사이에 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 미만으로 떨어지지 않는다. 특정 실시형태에서, FVIII 활성은 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정을 사용하여 측정된다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 5회 이하의 출혈의 연간 출혈률(ABR)이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 4회 이하의 출혈의 ABR이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 3회 이하의 출혈의 ABR이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 2회 이하의 출혈의 ABR이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 1회 이하의 출혈의 ABR이다. 특정 실시형태에서, FVIII 활성은 발색 검정을 사용하여 측정된다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 5회 미만의 출혈의 연간 출혈률(ABR)이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 4회 미만의 출혈의 ABR이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 3회 미만의 출혈의 ABR이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 2회 미만의 출혈의 ABR이다. 다양한 실시형태에서, A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 적당한 응고는 1회 미만의 출혈의 ABR이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "예방적 치료"는 혈우병의 치료를 위한 요법의 시행을 나타내며, 여기서, 이러한 치료는 혈우병의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드, 예를 들어, 하나 이상의 자발적 출혈 에피소드 및/또는 관절 손상을 예방하거나 이의 중증도를 감소시키는 것으로 의도된다. 문헌[Jimenez-Yuste et al., Blood Transfus. 12(3):314-19 (2014)]을 참조한다. 이러한 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드의 중증도 및 관절 질병의 진행을 감소시키거나 예방시키기 위해, A형 혈우병 환자는 예방적 치료 요법의 부분으로서 응고 인자의 정기적 주입을 받을 수 있다. 이러한 예방적 치료는 1% 이상의 응고 인자 수준, 예를 들어, FVIII 수준을 갖는 혈우병 환자가 자발적 출혈 에피소드를 거의 경험하지 않으며, 중증 혈우병을 갖는 환자에 비해 더 소수의 혈우병-관련 동반질환을 가진다는 관찰이 기초가 된다. 예를 들어, 문헌[Coppola A. et al, Semin. Thromb. Hemost. 38(1): 79-94 (2012)]을 참조한다. 이들 혈우병 환자를 치료하는 건강 관리 종사자는 정기적 주입에 의해 인자 수준을 대략 1%로 유지하는 것이 출혈 에피소드 및 관절 손상을 비롯한 혈우병 증상의 위험을 잠재적으로 감소시킬 수 있었음을 추정하였다. 상기 문헌 참조. 후속 연구에서, 응고 인자를 사용한 예방적 치료를 받은 소아 혈우병 환자에서 이들 이점을 확인하였으며, 이는 중증 혈우병을 갖는 사람들을 위한 예방 치료를 목표가 되게 한다. 상기 문헌 참조.
"예방적" 치료는 또한 A형 혈우병의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드의 발생 또는 중증도를 제어하거나, 관리하거나, 예방하거나 감소시키기 위한, 대상체로의 본원에 기술된 조성물, 예를 들어, 키메라 폴리펩티드의 선제적 투여를 나타낼 수 있다. 응고 인자, 예를 들어, FVIII을 사용한 예방적 치료는 중증의 A형 혈우병을 갖는 대상체에 대한 치료 표준이다. 예를 들어, 문헌[Oldenburg, Blood 125:2038-44 (2015)]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 예방적 치료는 A형 혈우병의 하나 이상의 증상의 발생을 감소시키기 위해 본원에 개시된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 예방적 치료는 다회 용량의 투여를 포함할 수 있다. 예방적 치료에서 사용되는 다회 용량은 전형적으로 특정 투여 간격으로 투여된다. 특정 실시형태에서, 연간 출혈률은 10회 이하, 9회 이하, 8회 이하, 7회 이하, 6회 이하, 5회 이하, 4회 이하, 3회 이하, 2회 이하 또는 1회 이하로 감소될 수 있다. 특정 실시형태에서, 연간 출혈률은 10회 미만, 9회 미만, 8회 미만, 7회 미만, 6회 미만, 5회 미만, 4회 미만, 3회 미만, 2회 미만 또는 1회 미만으로 감소될 수 있다.
용어 "대증적 치료" 또는 "에피소드 치료"는 A형 혈우병의 증상, 예를 들어, 출혈 에피소드에 반응하여, 또는 출혈을 야기할 수 있는 활동 전에 키메라 분자의 "필요에 따른" 투여를 나타낸다. 일 양태에서, 대증적 치료는 출혈이 시작할 때, 예컨대 손상 후 또는 출혈이 예상될 때, 예컨대 수술 전에 대상체에게 제공될 수 있다. 일 양태에서, 대증적 치료는 접촉 스포츠와 같이 출혈의 위험을 증가시키는 활동 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대증적 치료는 단일 용량으로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 대증적 치료는 제1 용량에 이어서 하나 이상의 추가의 용량으로서 제공된다. 키메라 폴리펩티드가 대증적으로 투여될 때, 하나 이상의 추가의 용량은 제1 용량 후 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간, 적어도 약 108시간 또는 적어도 약 120시간에 투여될 수 있다. 그러나, 대증적 치료와 연관된 투여 간격은 예방적 치료를 위해 사용되는 투여 간격과 동일하지 않다는 것을 주목하여야 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "용량"은 대상체로의 조성물의 단일의 투여를 나타낸다. 단일 용량은 한꺼번에, 예를 들어, 볼루스로서 또는, 예를 들어, 정맥내 주입을 통해 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 용어 "다회 용량"은 1회 초과의 용량, 예를 들어, 1회 초과의 투여를 의미한다. 1가지 초과의 조성물의 동시-투여를 언급할 때, 조성물 A의 용량은 조성물 B의 용량과 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 조성물 A의 용량은 조성물 B의 용량 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물 A 및 조성물 B는 단일 제형으로 조합된다.
특정 실시형태에서, "용량"은 키메라 단백질의 치료적 유효량을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 용량은 rFVIIIFc의 치료적 유효량을 나타낸다. 특정 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 10 IU/Kg 내지 약 300 IU/kg이다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 20 IU/Kg 내지 약 300 IU/kg이다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 250 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 200 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 190 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 180 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 170 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 160 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 150 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 140 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 130 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 120 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 110 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 60 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 25 IU/kg 내지 약 65 IU/kg이다. 일 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg이다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 25 IU/kg 내지 약 65 IU/kg이다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 20 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 30 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 40 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 50 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 60 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 70 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 80 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 90 IU/kg 내지 약 100 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 90 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 80 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 70 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 60 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 50 IU/kg, 약 20 IU/kg 내지 약 40 IU/kg 또는 약 20 IU/kg 내지 약 30 IU/kg이다.
다른 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 10 IU/kg, 약 15 IU/kg, 약 20 IU/kg, 약 25 IU/kg, 약 30 IU/kg, 약 35 IU/kg, 약 40 IU/kg, 약 45 IU/kg, 약 50 IU/kg, 약 55 IU/kg, 약 60 IU/kg, 약 65 IU/kg, 약 70 IU/kg, 약 75 IU/kg, 약 80 IU/kg, 약 85 IU/kg, 약 90 IU/kg, 약 95 IU/kg, 약 100 IU/kg, 약 105 IU/kg, 약 110 IU/kg, 약 115 IU/kg, 약 120 IU/kg, 약 125 IU/kg, 약 130 IU/kg, 약 135 IU/kg, 약 140 IU/kg, 약 145 IU/kg, 약 150 IU/kg, 약 155 IU/kg, 약 160 IU/kg, 약 165 IU/kg, 약 170 IU/kg, 약 175 IU/kg, 약 180 IU/kg, 약 185 IU/kg, 약 190 IU/kg, 약 195 IU/kg, 약 200 IU/kg, 약 225 IU/kg, 약 250 IU/kg, 약 275 IU/kg 또는 약 300 IU/kg이다. 일 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 50 IU/kg이다. 또 다른 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 100 IU/kg이다. 또 다른 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 200 IU/kg이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "간격" 또는 "투여 간격"은 조성물 A의 제1 용량과 대상체에게 투여되는 동일한 조성물의 후속 용량 사이에 경과되는 시간의 양을 나타낸다. 투여 간격은 제1 용량과 제2 용량 사이에 경과되는 시간을 나타낼 수 있거나, 또는 투여 간격은 다회 용량 사이에 경과되는 시간의 양을 나타낼 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "투여 빈도"는 특정 투여 간격당 투여되는 용량의 수를 지칭한다. 예를 들어, 투여 빈도는 1주에 1회, 2주마다 1회 등으로서 기재될 수 있다. 따라서, 7일의 투여 간격은 또한 7일에 1회 또는 1주마다 1회, 또는 1주에 1회로서 기재될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 rFVIIIFc이며, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일 또는 약 24일의 투여 간격으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 약 25일, 약 26일, 약 27일, 약 28일, 약 29일, 약 30일, 약 45일 또는 약 60일의 투여 간격으로 인간에게 투여된다.
일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 약 1 내지 약 14일, 약 1 내지 약 13일, 약 1 내지 약 12일, 약 1 내지 약 11일, 약 1 내지 약 10일, 약 1 내지 약 9일, 약 1 내지 약 8일, 약 1 내지 약 7일, 약 1 내지 약 6일, 약 1 내지 약 5일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 2일, 약 2 내지 약 14일, 약 3 내지 약 14일, 약 4 내지 약 14일, 약 5 내지 약 14일, 약 6 내지 약 14일, 약 7 내지 약 14일, 약 8 내지 약 14일, 약 9 내지 약 14일, 약 10 내지 약 14일, 약 11 내지 약 14일, 약 12 내지 약 14일, 약 13 내지 약 14일 또는 약 5 내지 약 10일의 투여 간격으로 투여된다. 다른 실시형태에서, rFVIIIFc는 약 1 내지 약 21일, 약 1 내지 약 20일, 약 1 내지 약 19일, 약 1 내지 약 18일, 약 1 내지 약 17일, 약 1 내지 약 16일, 약 1 내지 약 15일, 약 1 내지 약 14일, 약 1 내지 약 13일, 약 1 내지 약 12일, 약 1 내지 약 11일, 약 1 내지 약 10일, 약 1 내지 약 9일, 약 1 내지 약 8일, 약 1 내지 약 7일, 약 1 내지 약 6일, 약 1 내지 약 5일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 2일, 약 2 내지 약 21일, 약 3 내지 약 21일, 약 4 내지 약 21일, 약 5 내지 약 21일, 약 6 내지 약 21일, 약 7 내지 약 21일, 약 8 내지 약 21일, 약 9 내지 약 21일, 약 10 내지 약 21일, 약 11 내지 약 21일, 약 12 내지 약 21일, 약 13 내지 약 21일, 약 14 내지 약 21일, 약 15 내지 약 21일, 약 16 내지 약 21일, 약 17 내지 약 21일, 약 18 내지 약 21일, 약 19 내지 약 21일, 약 20 내지 약 21일, 약 5 내지 약 10일, 약 10 내지 약 15일, 약 15 내지 약 20일의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 약 2 내지 약 6일의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc는 약 3 내지 약 5일의 투여 간격으로 투여된다.
다양한 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 25 내지 65 IU/kg(25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64 또는 65 IU/kg)이며, 투여 간격은 3일 내지 5일, 3일 내지 6일, 3일 내지 7일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일 이상마다 1회 또는 주마다 3회 또는 주마다 3회 이하이다. 일부 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 65 IU/kg이며, 투여 간격은 주마다 1회 또는 6일 내지 7일마다 1회이다. 용량은 이들이 필요한 한, 반복적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 적어도 10, 20, 28, 30, 40, 50, 52 또는 57주, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10년). 다양한 실시형태에서, rFVIIIFc의 치료적 유효량은 약 25 내지 65 IU/kg이며, 투여 간격은 3 내지 5일마다 1회이다.
5. 방법
방법
본 개시내용의 일 양태는 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체의 치료 방법이다. 당해 방법은 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체를 선택하는 단계 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 BMD의 감소를 저해한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG1이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질은 rFVIIIFc이다.
유사하게, 본 개시내용의 일 양태는 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 3 내지 5일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여된다.
특정 실시형태에서, 대상체에서 BMD는 듀얼 X-선 흡수계측법(DXA)에 의해 측정된다.
특정 실시형태에서, 대상체는 50세 이상이다.
특정 실시형태에서, 대상체는 50세 미만이다.
특정 실시형태에서, 대상체에서 BMD는 T-점수에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 대상체에서 BMD는 T-점수에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 50세 이상이며, 대상체에서 BMD는 T-점수에 의해 결정된다.
특정 실시형태에서, 대상체가 -1.0 미만의 T-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD를 갖는 것으로 결정된다. 특정 실시형태에서, 대상체가 -1.0 내지 -2.4의 T-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD 및 골감소증을 갖는 것으로 결정된다. 특정 실시형태에서, 대상체가 -2.5 이하의 T-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD 및 골다공증을 갖는 것으로 결정된다.
특정 실시형태에서, 대상체에서 BMD는 Z-점수에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 50세 미만이며, 대상체에서 BMD는 Z-점수에 의해 결정된다.
특정 실시형태에서, 대상체가 -2.0 미만의 Z-점수를 갖는다면, 대상체는 낮은 BMD를 갖는 것으로 결정된다.
특정 실시형태에서, 대상체는 골 형성, 골 흡수 및/또는 골 손실의 하나 이상의 마이오마커의 수준에 기초하여 낮은 BMD를 갖는 것으로 예측된다.
특정 실시형태에서, 바이오마커는 대상체의 말초 혈액 또는 소변으로부터 평가된다.
특정 실시형태에서, 골 형성의 하나 이상의 바이오마커는 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 프로콜라겐 1형 N-말단 프로펩티드(P1NP), 프로콜라겐 1형 C-말단 프로펩티드(P1CP), 오스테오칼신 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 골 흡수의 하나 이상의 바이오마커는 혈청 중 총 알칼리성 포스파타제, 핵 인자 카파 B의 수용체 활성화인자(RANKL), 오스테오프로테게린(OPG), 타르타르산염-저항성 산 포스파타제(TRAP), 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 데옥시피리디놀린(DPD), 피리디놀린(PYD), 골 시알로단백질, 카텝신 K, 타르타르산염-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP5b), 기질 메탈로프로테이나제 9(MMP9), 1형 콜라겐에 대한 C-말단 교차-결합된 텔로펩티드(CTX-1), 1형 콜라겐에 대한 N-말단 교차-결합된 텔로펩티드(NTX-1) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일 양태는 A형 혈우병 및 증가된 골절의 위험을 갖는 대상체의 치료 방법이다. 당해 방법은 (i) A형 혈우병 및 증가된 골절의 위험을 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및 (ii) 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 골절의 위험을 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 3 내지 5일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여된다.
특정 실시형태에서, 대상체에서 골절의 위험은 골절 위험 평가 도구(FRAX)에 의해 결정된다.
특정 실시형태에서, 대상체에서의 골절의 위험은 낮은 BMD 위험 인자의 평가에 의해 결정된다. 특정 실시형태에서, 낮은 BMD 위험 인자는 관절병증, 감소된 신체 활동, HIV 또는 HCV로의 감염, 비타민 D 결핍, 낮은 체질량지수(BMI), 생식샘저하증 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 일 양태는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD) 손실률의 감소 방법이다. 당해 방법은 (i) 낮은 BMD를 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및 (ii) 치료적 유효량의, 응고 인자 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 BMD 손실률이 감소되게 한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 3 내지 5일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여된다.
본 개시내용의 일 양태는 A형 혈우병 및 골절을 갖는 대상체의 치료 방법이다. 당해 방법은 혈우병 및 골절을 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 1과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 2와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 단백질은 SEQ ID NO: 5와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 상기 양태 및 실시형태의 각각에 따르면, 일부 실시형태에서, 대상체는 경증 A형 혈우병을 갖는다.
본 개시내용의 상기 양태 및 실시형태의 각각에 따르면, 일부 실시형태에서, 대상체는 중등도 A형 혈우병을 갖는다.
본 개시내용의 상기 양태 및 실시형태의 각각에 따르면, 일부 실시형태에서, 대상체는 중증 A형 혈우병을 갖는다.
본 개시내용의 상기 양태 및 실시형태의 각각에 따르면, 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 (i) Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용하여 A형 혈우병에 대한 치료를 받고 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 대상체가 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌고, 대상체가 낮은 BMD를 갖는 단계; 및 (ii) Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료를 중단하고, 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 (i) 비-인자 대체 단백질을 사용한 A형 혈우병에 대한 치료를 받고 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 대상체가 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌고, 대상체가 낮은 BMD를 갖는 단계; 및 (ii) 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료를 중단하고, 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계로서, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 특정 양태는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 대상체는 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여가 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료한다.
본 개시내용의 특정 양태는 대상체에서의 골절 위험의 감소 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 대상체는 A형 혈우병 및 증가된 골절의 위험을 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 골절의 위험을 감소시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료한다.
본 개시내용의 특정 양태는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD) 손실률의 감소 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 대상체는 A형 혈우병 및 BMD 손실을 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 BMD 손실률을 감소시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료한다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖고 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질로 치료 중인 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료를 중단하는 단계 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 대상체는 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질로의 치료 동안 낮은 BMD 및 적당한 혈액 응고를 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료한다.
본 개시내용의 특정 양태는 A형 혈우병을 갖고 비-인자 대체 단백질로 치료 중인 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료를 중단하는 단계 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 대상체는 비-인자 대체 단백질로의 치료 동안 낮은 BMD 및 적당한 혈액 응고를 갖는 것으로 확인되었고, 키메라 단백질의 투여는 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질을 사용하여 A형 혈우병과 연관된 출혈을 감소시키도록 이전에 치료된 바 있다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 Fc 도메인에 융합되지 않은 PEG화된 FVIII이다. Fc 부분이 없는 PEG화된 인자 VIII 분자의 예에는 ADYNOVATE®, ESPEROCT® 및 JIVI®가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 Fc 도메인에 융합되지 않은 단일-쇄 FVIII이다. Fc 부분이 없는 단일-쇄 인자 VIII 분자의 예에는 AFSTYLA®가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 인간에서 그의 반감기를 연장시키는 모이어티를 포함하지 않는 재조합 FVIII이다. 인간에서 반감기를 연장시키는 모이어티를 포함하지 않는 인자 VIII 분자의 예에는 ADVATE®, XYNTHA®, NOVOEIGHT® 및 KOVALTRY®가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 혈액-유래 FVIII 또는 혈장-유래 FVIII이다.
일부 실시형태에서, Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질은 다모크토코그 알파 페골, 투로크토코그 알파 페골, 투로크토코그 알파, 로노크토코그 알파, 시모크토코그 알파, 루리오크토코그 알파 페골 또는 옥토코그 알파이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 비-인자 대체 단백질을 사용하여 A형 혈우병과 연관된 출혈을 감소시키도록 이전에 치료된 바 있다.
일부 실시형태에서, 비-인자 대체 단백질은 에미시주맙이다.
일부 실시형태에서, 에미시주맙은 에미시주맙-kxwh이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질 또는 비-인자 대체 단백질로의 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌다.
일부 실시형태에서, 대상체는 출혈이 검출되지 않은 골 부위 및/또는 관절에서 낮은 BMD를 갖는다.
6. 제형
본원에 사용되는 바와 같이, "투여하다" 또는 "투여하는"은 본원에 기술된 조성물, 예를 들어, 키메라 단백질을 대상체에게 전달하는 것을 나타낸다. 조성물, 예를 들어, 키메라 단백질은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 특히, 조성물은 정맥내로, 피하로, 근육내로, 피내로 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어, 경구로, 설하로, 협측으로, 비강으로, 직장으로, 질내로 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 정맥내로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 투여는 피하로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 투여는 자가-투여이다. 일부 실시형태에서, 부모는 조성물을 자녀에게 투여한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 건강 관리 종사자, 예컨대 의사, 의무병 또는 간호사에 의해 대상체에게 투여된다.
본원에 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 피내, 혈관내(예를 들어, 정맥내), 근육내, 척추, 두개내, 척수강내, 안구내, 안구주위, 안와내, 활막내 및 복강내 주사 또는 주입, 및 임의의 유사한 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 조성물은 또한, 예를 들어, 현탁액, 에멀션, 지속 방출 제형, 크림, 겔 또는 분말일 수 있다. 조성물은 종래의 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세리드를 사용하여 좌제로서 제형화될 수 있다.
일 예에서, 약제학적 제형은 액체 제형, 예를 들어, 완충, 등장성, 수성 용액이다. 일 예에서, 약제학적 조성물은 생리학적인 또는 생리학적에 근접한 pH를 갖는다. 일 예에서, 수성 제형은 생리학적 또는 생리학적에 근접한 삼투압농도 및 염도를 갖는다. 일 예에서, 수성 제형은 염화나트륨 및/또는 아세트산나트륨을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 FVIII 및 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 하기를 포함하는 약제학적 조성물로 제형화된다: (a) 키메라 폴리펩티드; (b) 수크로스, 트레할로스, 라피노스, 아르기닌 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 안정화제; (c) 염화나트륨(NaCl); (d) L-히스티딘; (e) 염화칼슘; 및 (f) 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하기를 포함한다: (a) 50 IU/ml 내지 2500 IU/ml의 키메라 폴리펩티드; (b) 10 mg/ml 내지 25 mg/ml의 수크로스; (c) 8.8 mg/ml 내지 14.6 mg/ml의 염화나트륨(NaCl); (d) 0.75 mg/ml 내지 2.25 mg/ml의 L-히스티딘; (e) 0.75 mg/ml 내지 1.5 mg/ml의 염화칼슘 이수화물; 및 (f) 0.08 mg/ml 내지 0.25 mg/ml의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80. 일부 예에서, 본 개시내용의 방법에서 사용되는 약제학적 조성물은 동결건조된다.
본 개시내용은 또한, 약제학적 키트의 구성성분을 제공한다. 이러한 키트는 하나 이상의 용기 및 선택적인 부속물(attachment)을 포함한다. 본원에 제공되는 바와 같은 키트는 이를 필요로 하는 대상체로의 유효량의 키메라 단백질(예를 들어, rFVIIIFc)의 투여를 용이하게 한다. 특정 실시형태에서, 키트는 정맥내 주입을 통한 키메라 단백질(예를 들어, rFVIIIFc)의 투여를 용이하게 한다. 특정 실시형태에서, 키트는 정맥내 주입을 통한 키메라 단백질(예를 들어, rFVIIIFc)의 자가-투여를 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 약제학적 키트를 제공한다: 동결건조된 분말 또는 케익(cake)을 포함하는 제1 용기로서, 분말 또는 케익이 (i) 키메라 단백질(예를 들어, rFVIIIFc), (ii) 수크로스(및/또는 트레할로스, 라피노스 또는 아르기닌); (iii) NaCl; (iv) L-히스티딘; (v) 염화칼슘 이수화물; 및 (vi) 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 제1 용기; 및 제1 용기의 동결건조된 분말과 조합될 희석제, 예를 들어, 주사용 멸균수를 포함하는 제2 용기. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 요망되는 특성을 갖는 약 3 ml의 키메라 단백질(예를 들어, rFVIIIFc) 제형을 생성하도록 충분한 희석제가 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 용기는 제1 용기로의 희석제의 첨가, 제1 용기의 내용물의 재구성 및 주사기 내로의 재전달을 허용하도록 플런저와 회합된 사전-충전된 주사기이다. 일부 실시형태에서, 키트는 주사기를 제1 용기에 부착시키기 위한 어댑터를 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 제형의 정맥내 주입을 가능하게 하기 위하여 재구성된 FVIII 폴리펩티드(예를 들어, rFVIIIFc) 제형을 함유하는 주사기에 부착시킬 니들(needle) 및 주입 튜빙(infusion tubing)을 추가로 제공한다.
일부 실시형태에서, 키메라 단백질(예를 들어, rFVIIIFc)은 약 200 IU 내지 약 6000 IU, 예를 들어, 약 250 IU, 약 500 IU, 약 750 IU, 약 1000 IU, 약 1500 IU, 약 2000 IU, 약 3000 IU, 약 4000 IU, 약 5000 IU 또는 약 6000 IU의 총량으로 제공된다.
본원에서 사용되는 응고 인자 또는 키메라 단백질에서의 FVIII 부분은 FVIII 활성을 갖는다. FVIII 활성은 당업계의 임의의 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 응고 시스템의 기능을 평가하기 위해 하기의 다수의 시험이 이용 가능하다: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time: aPTT) 시험, 발색 검정, ROTEM 검정, 프로트롬빈 시간(PT) 시험(INR 결정에도 사용됨), (종종 클라우스 방법(Clauss method)에 의한) 피브리노겐 검사, 혈소판 계수, (종종 PFA-100에 의한) 혈소판 기능 검사, TCT, 출혈 시간, 혼합 시험(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합되면 비정상이 교정되는지 여부), 응고 인자 검정, 항인지질 항체, D-이량체, 유전학적 시험(예를 들어, 인자 V 라이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀 사독 시간(dilute Russell's viper venom time: dRVVT), 기타 혈소판 기능 시험, 혈전탄성묘사도(thromboelastography; TEG 또는 소노클롯(Sonoclot)), 혈전탄성측정(thromboelastometry: TEM®, 예를 들어, ROTEM®) 또는 유글로불린 용해 시간(euglobulin lysis time: ELT).
aPTT 시험은 "고유" 응고 경로(접촉 활성화 경로로도 지칭됨)와 공통 응고 경로 둘 다의 효능을 측정하는 성능 지표이다. 이 시험은 상업적으로 이용 가능한 재조합 응고 인자, 예를 들어, FVIII의 응고 활성을 측정하는 데 흔히 사용된다. 이는 외부 경로를 측정하는 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 사용된다.
ROTEM 분석은 지혈의 전체 역학에 대한 정보를 제공한다: 응고 시간, 응괴 형성, 응괴 안정성 및 용해. 혈전탄성측정에서의 상이한 파라미터는 혈장 응고 시스템, 혈소판 기능, 섬유소 용해, 또는 이들 상호작용에 영향을 미치는 많은 인자의 활성에 좌우된다. 이 검정은 2차 지혈의 완전한 시야를 제공할 수 있다.
발색성 검정 메커니즘은, 활성화된 FVIII가 활성화된 인자 IX, 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에 인자 X의 인자 Xa로의 전환을 가속화시키는 혈액 응고 캐스케이드의 원리에 기반한다. 인자 Xa의 활성은 인자 Xa에 특이적인 p-니트로아닐리드(pNA) 기질의 가수분해에 의해 평가된다. 405 nM에서 측정된 p-니트로아닐린의 초기 방출 속도는 인자 Xa 활성에 정비례하므로, 시료에서의 FVIII 활성에 정비례한다.
발색성 검정은 국제 혈전 지혈 학회(International Society on Thrombosis and Hemostatsis; ISTH)의 과학 및 표준화 위원회(Scientific and Standardization Committee; SSC)의 FVIII 및 인자 IX 소위원회(FVIII and Factor IX Subcommittee)에 의해 권고된다. 1994년 이래로, 발색성 검정은 FVIII 농축물 효능을 할당하기 위한 유럽 약전의 기준 방법이기도 하다. 따라서, 일 실시형태에서, FVIII을 포함하는 키메라 단백질은 성숙 FVIII 또는 BDD FVIII을 포함하는 키메라 단백질과 유사한 FVIII 활성을 가진다(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®).
특정 실시형태에서, 유효량 또는 유효 용량은 단일 용량으로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 유효량 또는 유효 용량은 하루에 2회 이상의 용량으로 투여된다.
지금까지 본 개시내용을 상세하게 기술하였지만, 단지 예시의 목적으로 본 원에 포함되고 본 개시내용을 한정하도록 의도되지 않는 하기의 실시예를 참조함으로써 본 개시내용을 보다 명확하게 이해할 것이다. 본원에 언급된 모든 특허, 간행물 및 논문은 본원에 참조에 의해 분명히 그리고 구체적으로 포함된다.
실시예
본 개시내용은 특히 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물, 화합물, 키트 및 방법을 제공하며, 임의의 특정 과학 이론에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1: 재조합 인자 VIII Fc 융합 단백질(rFVIIIFc)은 시험관 내에서 염증성 파골세포 형성을 음성적으로 조절한다
중증 A형 혈우병(HemA) 환자에서 관찰되는 골 무기밀 밀도의 감소는, FVIII 활성의 부재 및 관련 출혈 에피소드가 골 항상성에 엄청난 효과를 갖는다는 것을 뒷받침한다.
임의의 과학 이론에 결부시키지 않고, 이들 환자에서의 염증-촉진 환경이 관절염-관련 골다공증의 사례에서 보고된 이벤트와 유사하게, 악화된 단핵구/대식구-유래 파골세포형성 및 이후의 골 미란(bone erosion)에 기여할 수 있다는 것을 가정하였다. 단핵구-유래 파골세포형성에 대한 rFVIIIFc에 비한 rFVIII 처리의 영향을 조사하여, rFVIIIFc가 항산화 NRF2 경로를 상향조절함으로써 염증-촉진 파골세포 형성을 저해하는지 여부를 결정하였다.
이 가설을 시험하기 위하여, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 유래의 인간 단핵구를 단리하고, 미처리하여 또는 hIgG1, rFVIII 또는 rFVIIIFc의 존재 하에 rhM-CSF 및 rhRANKL과 함께 배양하여, 파골세포 형성을 달성하였다. 처리에 의해 촉발되는 유전자 발현 변경을 Q-PCR에 의해 측정하였다. 파골세포 표현형에 이어서 타르타르산염-저항성 산 포스파타제(TRAP) 염색 및 다핵화 관찰을 행하였다. 처리된 파골세포의 기능을 골 흡수 검정을 사용하여 시험하였다.
전체 RNA를 RNeasy 미니(Mini) 키트(퀴아젠(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 대식구로부터 단리하고, 슈퍼스크립트(SuperScript) III 빌로(Vilo) 키트(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 역전사시켰다. 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검정을 써모 피셔 사이언티픽사의 택맨(Taqman) 유전자 발현 검정을 사용하여 수행하고, 7500 패스트(Fast) 기기 상에서 수행하였다. 비교 사이클 역치 방법을 사용하여 내인성 대조군 유전자 36B4에 비하여 전사물을 정량화하였다.
인간 단핵구-유래 대식구를 건강한 인간 공여자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 단리된 CD14+ 단핵구로부터 생성하였다.
정제된 CD14+ 단핵구를 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI 1640 글루타맥스(Glutamax) 배지(써모 피셔 사이언티픽)에 플레이팅하였다. 단핵구를 다르게 기술되지 않는 한, 7일의 배양 기간 동안 인간 IgG1, B-도메인 결실된 rFVIII, rFVIIIFc(각각 25 nM) 또는 비히클(PBS)로 처리하였다. 처리 농도를 예비 실험에서 결정하였다. 돌연변이 형태의 rFVIIIFc 분자, FcγR에 결합할 수 없는 rFVIIIFc N297A도 또한 일부 실험에서 사용하여, Fc 부분의 영향을 결정하였다. 문헌[Krishnamoorthy S, et al. Cell Immunol. 2016; 301:30-39]. 연구의 설계의 개략도는 도 1에 나타나 있다.
결과
CD14+ 단핵구를 단독의 M-CSF의 존재 하에 7일 동안 배양하거나, 제0일에 4개의 처리군 중 하나로 처리하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양하였다(도 2). 이어서, 각각의 처리군의 세포를 TRAP 염색에 의해 형태학적 특징에 대하여 관찰하였다(도 3). RANKL 없이 처리된 대조군 세포는 독특한 대식구 형태를 나타내었다(도 3a). 비히클(도 3b), 단독의 IgG1(도 3c) 또는 단독의 rFVIII(도 3d)로 처리되고 M-CSF 및 RANKL과 함께 배양된 세포는 파골세포에 특유한 큰, 다핵화된 세포체를 나타내었다. rFVIIIFc로 처리된 세포(도 3e)는 작게 남아 있었으며, 단일의 핵을 함유하였고, 이는 rFVIIIFc 처리가 다핵화된 파골세포의 형성을 저해하였음을 나타낸다.
파골세포형성에 대한 처리 시기의 영향을 시험하기 위하여, CD14+ 단핵구를 제-1일에 4가지 처리 중 하나로 처리하였다. 24시간 동안의 처리 후에, 배양 배지를 제거하고, 세포를 원심분리하고, DPBS로 1회 세척하고, M-CSF 및 RANKL을 함유하는 배양 배지 중에 재현탁화시키고, 재플레이팅하였다(도 4). 제-1일에 비히클(도 5a), 단독의 IgG1(도 5b) 또는 단독의 rFVIII(도 5c)로 처리하고, 제0일에 세척하고, M-CSF 및 RANKL과 함께 배양하고, TRAP 염색에 의해 시험한 CD14+ 단핵구는 파골세포 형태에 특유한 큰 다핵 세포로 분화하였다. rFVIIIFc(도 5d)로 유사하게 처리하고, TRAP 염색에 의해 시험한 CD14+ 단핵구는 특징적인 큰 다핵 세포가 거의 관찰되지 않았기 때문에, 파골세포로 분화하지 않았으며, 이는 오직 1일 동안의 단핵구의 rFVIIIFc 처리가 7일 분화 후에 시험관 내에서 파골세포의 형성을 실질적으로 저해하였음을 나타낸다. rFVIIIFc만이 혈액 순환에서 단핵구와 상호작용할 것으로 예상되기 때문에, 이는 FVIII 및 단핵구의 혈액 순환 특성 둘 모두와 생리학적으로 관련이 있다. rFVIIIFc 처리는 완전히 분화된 단핵구-유래 파골세포에서 검출 가능한 영향을 보이지 않았다(데이터 미도시).
요약
단핵구-유래 파골세포 발생은 rFVIIIFc의 존재 하에 유의미하게 손상되었다. 형태 관찰에 따르면, 오직 1일 동안의 rFVIIIFc로의 단핵구의 처리는 파골세포의 형성을 저해하는 데 충분하였다.
실시예 2: rFVIIIFc는 시험관 내에서 파골세포의 골 흡수 활성을 저해한다
rFVIIIFc가 파골세포 형성을 저해할 수 있었기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 파골세포의 골 흡수 활성에 대한 rFVIIIFc의 영향을 시험하였다. CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클, 단독의 IgG1, 단독의 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 3일 동안 배양하였다. 제3일에, 단핵구를 소 피질 골 슬라이스 상에 재플레이팅하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 내지 10일 동안 동시-배양하였다. 7일 내지 10일 동시배양 기간 후에, 단핵구-유래 세포를 제거하고, 골 슬라이스를 톨루이딘 블루 염색에 의해 시험하였다(도 6). 비히클(도 7a), IgG1(도 7b) 또는 rFVIII(도 7c) 처리된 단핵구와 동시-배양한 골 슬라이스는 명백한 골 흡수를 나타내었으며(도 7a, 도 7b, 도 7c; 원형 영역), 이는 이 처리 푸울(pool)로부터 유래된 파골세포가 여전히 골을 활발히 분해할 수 있었음을 나타낸다. rFVIIIFc 처리된 단핵구와 동시-배양된 골 슬라이스(도 7d)는 3가지 대조군과 비교하여 현저히 더 적은 골 흡수를 나타내었으며(도 7d, 원형 영역), 이는 제0일의 단핵구의 rFVIIIFc 처리가 7일 내지 10일의 분화 후에 세포의 골 흡수 활성을 실질적으로 저해한다는 것을 뒷받침한다.
요약
파골세포 분화 인자(M-CSF 및 RANKL)와 함께 배양된 단핵구의 rFVIIIFc 처리는 처리된 세포의 골 흡수 활성의 감소를 야기한다.
실시예 3: 파골세포형성에서 유전자 발현 및 기능에 대한 rFVIIIFc의 영향
본 발명자들은 다음으로 감소된 파골세포 활성 및 rFVIIIFc의 형태가 파골세포 관련 유전자의 감소와 상응하는지 여부를 조사하였다. CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클, 단독의 IgG1, 단독의 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 수거하고, RNA 추출하고, 유전자 발현 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 정량화하였다(도 8). 이어서, 파골세포-연관 유전자를 비히클 처리(도 9, 흑색 막대), IgG1 처리(도 9, 진회색 막대), rFVIII 처리(도 9, 연회색 막대) 및 rFVIIIFc 처리(도 9, 백색 막대) 세포에서 측정하고, 비리클 처리군의 발현 수준에 대해 정규화시켰다. 파골세포 분화(도 9, RANK, NFATC1) 및 골 흡수 활성(도 9, CATK, TRAP, MMP9)의 마커를 분석하였다. 분석된 임의의 유전자에 있어서 비히클, IgG1 또는 rFVIII 처리군 간에는 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 다른 처리군과 비교하여 파골세포 분화(RANK, NFATC1) 및 활성(CATK, TRAP, MMP9)의 마커 둘 모두에서 rFVIIIFc 처리된 세포에 대하여 유전자 발현의 유의미한 감소가 관찰되었다. 도 9, 백색 막대를 참조한다.
본 발명자들은 다음으로 상기 기술된 4개의 처리군에서 파골세포형성 동안 NRF2-관련 유전자의 반응을 조사하였다. NRF2는 파골세포형성 동안 하향조절되는 항산화 경로를 조절하는 데 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(문헌[Kanzaki J Biol Chem]). NRF2는 동결보호 효소, 예컨대 GCLC 및 NQO1의 발현을 제어한다. CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클, 단독의 IgG1, 단독의 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고, RNA 추출하고, 유전자 발현 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 정량화하였다(도 10). NRF2-제어된 유전자 NQO1 및 GCLC의 발현은 비히클 처리된 세포(도 11a, 흑색 막대)와 비교하여 단독의 IgG1(도 11a, 진회색 막대) 또는 단독의 rFVIII(도 11a, 연회색 막대)로 처리된 단핵구에서 유의미하게 변경되지 않았다. 그러나, rFVIIIFc로 처리된 단핵구는 비히클 처리군과 비교하여 NQO1 및 GCLC 둘 모두의 발현의 유의미한 증가를 나타내었다. 도 11a, 백색 막대를 참조한다.
본 발명자들은 다음으로 비히클(도 11b, 흑색 막대), 단독의 IgG1(도 11b, 진회색 막대), 단독의 rFVIII(도 11b, 연회색 막대) 또는 rFVIIIFc 처리된(도 11b, 백색 막대) 단핵구에서 NQO1 환원효소 활성을 조사하였다. 비히클 처리군과 비교하여, 단독의 IgG1 또는 rFVIII 중 어느 것도 특정 NQO1 활성의 유의미한 증가를 나타내지 않았다(도 11b). 그러나, 특정 NQO1 활성은 rFVIIIFc 처리된 세포에서 유의미하게 증가하였으며, 이는 이 중요한 경로의 조절이 파골세포형성의 rFVIIIFc 매개된 저해에서 역할을 수행할 수 있다는 것을 나타낸다.
요약
rFVIIIFc-처리된 세포의 유전자 및 단백질 발현은 항산화 NRF2 경로의 상향조절, 및 파골세포-특이적 마커, 및 파골세포 형성 및 골 흡수에서 역할을 갖는 것으로 알려져 있는 유전자의 하향조절을 보였다. 역으로, 미처리, 단독의 IgG1 또는 rFVIII-처리된 세포와 비교하여 rFVIIIFc-처리된 파골세포에서 동결보호 효소(NQO1, GCLC)의 증가가 관찰되었다.
실시예 4: 파골세포형성의 저해에서의 rFVIIIFc의 Fc 부분의 역할
본 발명자들은 다음으로 파골세포형성의 저해에서의 rFVIIIFc의 Fc 부분의 역할을 조사하였다. CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클, 단독의 IgG1, 단독의 rFVIII, rFVIIIFc 및 rFVIIIFc-N297A(FcγR에 결합할 수 없음)로 처리하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 수거하고, RNA 추출하고, 유전자 발현 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 정량화하였다(도 12). 파골세포 분화(RANK, NFATC1) 및 활성(CATK, TRAP)의 마커를 측정하고, 비히클 처리군(도 13, 흑색 막대)에 대해 정규화시켰다. 단독의 IgG1(도 13, 진회색 막대) 또는 단독의 rFVIII(도 13, 연회색 막대)로 처리된 세포 중 어느 것도 비히클 처리군과 비교하여 유전자 발현의 임의의 유의미한 변화를 나타내지 않았다. rFVIIIFc 처리된 세포(도 13, 백색 막대)는 모든 파골세포 관련 마커의 유의미한 감소를 나타내었다. 이 감소는 FcγR 결합이 rFVIIIFc-N297A 처리군(도 13, 사선 막대)에서 폐지된 경우에는 관찰되지 않았다.
요약
단핵구-유래 파골세포 형성 및 파골세포-특이적 유전자 발현에 대한 rFVIIIFc의 저해 효과는 Fc 도메인 및 FcγR 상호작용을 필요로 한다.
실시예 5: rFVIIIFc로 처리된 단핵구의 용량 의존적 분화
본 발명자들은 MCSF/RANKL-분화된 단핵구의 면역표현형에 대한 rFVIIIFc의 투여량의 영향을 조사하였다. CD14+ 단핵구를 제0일에 소정의 용량(75 nM, 42 nM, 24 nM, 13 nM, 7.5 nM, 4.2 nM, 2.4 nM, 1.3 nM, 0.7 nM 또는 0 nM)의 rFVIII + IgG1(도 14a 내지 도 14b) 또는 rFVIIIFc(도 15a 내지 도 15b)로 처리하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고, 형광 모노클로널 항체로 염색하고, 유세포측정기에 의해 획득하였다. 세포를 CD14(단핵구/대식구 마커) 및 CD51/61(파골세포 마커), 및 다른 단핵구/대식구 마커 CD16, CD32, CD64, CD163, CD33, CD35, CD44, CD11b 및 CD172ab에 대한 형광 항체를 사용하여 염색하였다. 파골세포는 CD14의 저발현과 함께 CD51/61 고 세포로서 특성화된다.
요약
0.7nM의 rFVIII + IgG1로 처리된 세포의 61.9% 또는 비히클로 처리된 세포의 58.6%에 비하여(도 14b), 75nM 용량의 rFVIII + IgG1로 처리된 세포의 51.6%가 파골세포(CD51/61고/CD14저; 도 14a)로 분화되었기 때문에, rFVIII + IgG1로의 처리는 파골세포 형성의 저해에 대하여 오직 최소의 영향만을 나타내었다. 역으로, rFVIIIFc로의 처리는 파골세포 형성의 실질적인 저해를 나타내었다. 오직 0.7 nM의 rFVIIIFc로 처리된 세포의 62.6% 또는 비히클로 처리된 세포의 58.5%에 비하여(도 15b), 오직 75 nM rFVIIIFc로 처리된 세포의 1.44%만이 파골세포로 분화하였다(도 15a). 또한, 더 높은 용량의 rFVIIIFc 처리는 처리된 세포 간에 독특한(CD51/61음성CD14저) 면역표현형을 보였다. 비히클 대조군에 대하여 정규화되는 경우 rFVIIIFc로 처리된 세포에 대한 파골세포 형성의 저해 영향에 대하여 7.49 nM의 평균 IC50(± 0.66 nM, n = 3)이 관찰되었다(도 16).
실시예 6: 파골세포형성의 Fcγ 수용체 매개된 저해
본 발명자들은 다음으로 rFVIIIFc로 처리된 단핵구로부터 파골세포형성의 저해에서의 Fcγ 수용체의 역할을 조사하였다. 제1 실험에서, CD14+ 단핵구를 제0일에 비히클(도 17a, 도 21a), rFVIIIFc(도 17b, 도 21b), rFVIII + IgG1(도 17c, 도 21c) 또는 rFVIIIFc-N297A(도 17d, 도 21d; FcγR에 결합할 수 없음)로 처리하고, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고, 형광 모노클로널 항체로 염색하고, 유세포측정기에 의해 획득하였다. 세포를 CD16(단핵구/대식구 마커) 및 CD51/61(파골세포 마커)에 대한 형광 항체를 사용하여 염색하였다. 제2 실험에서, 제0일에, CD14+ 단핵구를 먼저 FcγR1(항-CD64 항체 Fab, 도 18), FcγR2(항-CD32 항체, 도 19) 또는 FcγR3(항-CD16 항체, 도 20)에 대한 블로킹 항체 또는 각각의 대응하는 아이소타입 대조군 항체로 처리한 다음, rFVIIIFc 또는 rFVIII로 처리한 다음, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 세포를 수거하고, 형광 모노클로널 항체로 염색하고, 유세포측정기에 의해 획득하였다. 세포를 CD16(단핵구/대식구 마커) 및 CD51/61(파골세포 마커)에 대한 형광 항체를 사용하여 염색하였다.
요약
비히클 처리된 세포(도 17a; 37.4% 도 21a) 및 rFVIII + IgG1로 처리된 세포(도 17c; 39.6% 도 21c) 둘 모두의 39.5%가 CD51/61고 파골세포로서 특성화된 한편, rFVIIIFc로 처리된 세포(도 17b; 5.57% 도 21b)의 오직 5.54%만이 CD51/61고 파골세포로서 특성화되었다. N297의 돌연변이(rFVIIIFc-N297A)에 의한 Fc 도메인과 Fcγ 수용체 간의 상호작용의 제거는 파골세포 형성의 부분적인 구제를 초래하였다(도 17d, 도 21d).
rFVIII, 및 FcγR1 상호작용을 블로킹하기 위한 항체 Fab(항-CD64 항체, 도 18a; 47.1% 도 22a)로 처리된 세포의 47.2%가 파골세포로서 특성화되었으며, 이는 rFVIIIFc 및 항-CD64 항체 Fab로 처리된 세포(도 18b; 3.02% 도 22b)의 2.73%와 비교된다. 이 패턴은 Fab 대조군 항체로 처리된 세포(rFVIII + 대조군, 도 18c, 도 22c; rFVIIIFc + 대조군, 도 18d, 도 22d)에서 지속되었다. 이 패턴은 파골세포 형성의 rFVIIIFc 저해가 단독의 FcγR1과의 상호작용을 통해 매개될 것 같지 않음을 나타낸다.
rFVIII, 및 FcγR2 상호작용을 블로킹하기 위한 항체(항-CD32 항체, 도 19a; 39.1% 도 23a)로 처리된 세포의 39.2%가 파골세포로서 특성화되었으며, 이는 rFVIIIFc 및 항-CD32 항체로 처리된 세포(도 19b 및 도 23b)의 17.0%와 비교된다. 이 파골세포 형성의 구제는 아이소타입 대조군(rFVIII + 대조군, 도 19c 및 도 23c; rFVIIIFc + 대조군, 도 19d 및 도 23d)의 처리로 제거되었다. FcγR2와의 상호작용 후에 이 부분적인 구제가 블로킹되며, 이는 파골세포 형성의 저해가 FcγR2와의 rFVIIIFc 상호작용에 의해 제어될 것 같다는 것을 나타낸다.
rFVIII, 및 FcγR3 상호작용을 블로킹하기 위한 항체(항-CD16 항체, 도 20a; 24.8% 도 24a)로 처리된 세포의 24.9%가 파골세포로서 특성화되었으며, 이는 rFVIIIFc 및 항-CD16 항체로 처리된 세포(도 20b; 4.03% 도 24a)의 4.11%와 비교된다. 세포를 아이소타입 대조군 항체(rFVIII + 대조군, 도 20c 및 도 24c; rFVIIIFc + 대조군, 도 20d 및 도 24d)로 처리하는 경우 이 패턴이 지속되었다. 임의의 과학 이론에 결부시키지 않고, 이 패턴은 파골세포 형성의 rFVIIIFc 저해가 단독의 FcγR3과의 상호작용을 통해 매개될 것 같지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 파골세포형성의 Fcγ 수용체 매개된 저해에서의 FVIII 경쇄의 역할
본 발명자들은 rFVIIIFc로 처리된 단핵구로부터의 파골세포형성의 저해에서 FVIII의 C1 및 C2 도메인의 역할을 조사하였다. CD14+ 단핵구를 제0일에 rFVIII(도 25a) 또는 FVIII의 A2 도메인(GMA8017, 도 25b), FVIII의 A3 도메인(GMA8010, 도 25c) 또는 FVIII의 C2 도메인(GMA8006; 도 25d; GMA8026, 도 25e)을 표적화하는 모노클로널 항체를 각각 단독으로 처리한 다음, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양한 다음, 파골세포형성에 대하여 가시화시켰다. CD14+ 단핵구를 또한, 제0일에 rFVIIIFc(도 25f)로, 또는 FVIII의 A2 도메인(GMA8017, 도 25g), FVIII의 A3 도메인(GMA8010, 도 25h) 또는 FVIII의 C2 도메인(GMA8006; 도 25i; GMA8026, 도 25j)을 표적화하는 모노클로널 항체의 각각의 존재 하의 rFVIIIFc로 처리한 다음, M-CSF 및 RANKL의 존재 하에 7일 동안 배양한 다음, 파골세포형성에 대하여 가시화시켰다. rFVIII 또는 단독의 항체(도 25a 내지 도 25e)로 처리된 단핵구는 7일 동안의 배양 후에 특징적인 파골세포 형태를 나타내었다. 단핵구를 rFVIIIFc로 처리하는 경우(도 25f), 이전 실시예에서 논의된 바와 같이 파골세포 형태의 발생이 제7일에 효과적으로 저해되었다. FVIII의 A2 도메인(도 25g) 또는 FVIII의 A3 도메인(도 25h)을 블로킹하는 항체의 존재 하에 rFVIIIFc 처리된 단핵구는 또한, 파골세포 형태의 발생을 효과적으로 저해하였다. 그러나, 파골세포형성의 rFVIIIFc-의존적 저해는 FVIII의 C2 도메인을 표적화하는 항체의 존재 하에 역전된다(도 25i, 25j). rFVIIIFc 및 C2 표적화 항체로 동시에 처리된 단핵구(도 25i, 25j)는 7일의 배양 후에 대조군의 형태와 유사한 특징적인 파골세포 형태를 나타내었다.
본 발명자들은 또한 폰 빌레브란트 인자(VWF)에 결합하는 경우 rFVIII 또는 rFVIIIFc로 처리된 단핵구에서의 파골세포형성을 조사하였다. CD14+ 단핵구를 제0일에 단독의 VWF로 처리하는 경우, 세포의 72.3%가 M-CSF 및 RANKL의 존재 하의 7일의 배양 후에 파골세포로서 특성화되었다. CD14+ 단핵구를 제0일에 VWF의 존재 하에(도 26의 b) 또는 VWF의 부재 하에(도 26의 c) rFVIII로 처리하는 경우, 대다수의 세포(69.6% 및 73.3%)가 M-CSF 및 RANKL과 함께 한 배양에서 7일 후에 유사하게 파골세포로서 특성화되었다. 종합하여, 본 발명자들은 rFVIII 처리에서 첨가되는 VWF의 영향이 존재하지 않았음을 확인하였다. CD14+ 단핵구를 제0일에 단독의 rFVIIIFc로 처리하는 경우, 훨씬 더 적은 분율(14.2%)의 세포(도 26의 e)가 제7일에 파골세포로서 특성화되었으며, 이는 이전에 논의된 파골세포형성의 저해와 일치하는 것이다. 그러나, 이 저해는 세포를 rFVIIIFc 및 VWF 둘 모두로 처리하는 경우에 증가된 분율(45.7%)의 세포가 파골세포로서 특성화되었기 때문에 부분적으로 역전되었다.
실시예 8: 파골세포형성의 저해에서의 rFVIIIFc의 Fc 부분의 역할의 요약
파골세포형성의 저해에서 rFVIIIFc의 Fc 부분의 역할을 연구하기 위하여, 일차 인간 혈액 단핵구를 다양한 농도의 rFVIIIFc 또는 rFVIII에 더하여 인간 IgG로 처리한 다음, 파골세포 분화를 위하여 시험관 내에서 배양한다. 다발성 골수종 계통 마커를 사용하여 면역표현형을 분석하고, 분화된 단핵구와 파골세포를 구별하였다. 단핵구와의 rFVIIIFc 상호작용을 매개하는 데에서의 Fc 또는 FVIII 도메인의 관여를 각각의 유형의 FcγR을 블로킹하는 항체 또는 항-FVIII 항체 및 다양한 FVIII 도메인에 결합하는 폰 빌레브란트 인자(VWF)를 사용하여 조사하였다.
임의의 과학 이론에 결부시키지 않고, 결과는 rFVIIIFc-처리된 단핵구로부터 분화된 세포가 표현형이 파골세포와는 별개의 것이었으며, 대부분 단핵구를 유지하는 것을 나타내었다. 이 표현형을 조절하는 rFVIIIFc와 단핵구 사이의 상호작용에 있어서, Fc 도메인은 세포 표면 상의 FcγR2와 가장 효과적으로 결합하였으며; VWF-복합체화된 rFVIIIFc의 면역-조절 효과의 손실에 의해서도 입증된 바와 같이 FVIII의 C1 및 C2 도메인은 단핵구와의 상호작용에 필요한 것으로 맵핑되었다.
임의의 과학 이론에 결부시키지 않고, 이들 데이터는 단핵구와 상호작용하는 rFVIIIFc에 대하여 "이중-접점(dual-touchpoints)" 모델을 제시한다. FVIII 부분은 C1 및 C2 도메인을 통해 단핵구와 상호작용함과 동시에 Fc 도메인은 주로 동일한 세포 상의 FcγR2에 결합하여, 이후에 파골세포로의 단핵구 분화력을 감소시킨다. 따라서, rFVIIIFc는 환자에서 관절 골 미란 및 골량 손실을 감소시킬 수 있는 rFVIII와는 다른 생물학적 활성을 가질 수 있다.
서열
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Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING HEMOPHILIA AND LOW BONE MINERAL DENSITY <130> 706564: SA9-503PC <150> US 62/863,831 <151> 2019-06-19 <150> US 62/968,785 <151> 2020-01-31 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1665 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp 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Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 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Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His 740 745 750 Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile 755 760 765 Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp 770 775 780 Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys 785 790 795 800 Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly 805 810 815 Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser 820 825 830 Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser 835 840 845 Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 850 855 860 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr 865 870 875 880 Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile 885 890 895 Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe 900 905 910 Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His 915 920 925 Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe 930 935 940 Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro 945 950 955 960 Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln 965 970 975 Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr 980 985 990 Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro 995 1000 1005 Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1010 1015 1020 Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu 1025 1030 1035 Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met 1040 1045 1050 Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val 1055 1060 1065 Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 1070 1075 1080 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys 1085 1090 1095 Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His 1100 1105 1110 Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln 1115 1120 1125 Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile 1130 1135 1140 Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg 1145 1150 1155 Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro 1160 1165 1170 Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His 1175 1180 1185 Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1190 1195 1200 Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 1205 1210 1215 Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe 1220 1225 1230 Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro 1235 1240 1245 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1250 1255 1260 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn 1265 1270 1275 Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp 1280 1285 1290 Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr 1295 1300 1305 Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn 1310 1315 1320 Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val 1325 1330 1335 Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly 1340 1345 1350 Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile 1355 1360 1365 Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn 1370 1375 1380 Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro 1385 1390 1395 Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg 1400 1405 1410 Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu 1415 1420 1425 Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr 1430 1435 1440 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1445 1450 1455 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1460 1465 1470 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 1475 1480 1485 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 1490 1495 1500 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 1505 1510 1515 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 1520 1525 1530 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 1535 1540 1545 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 1550 1555 1560 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 1565 1570 1575 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 1580 1585 1590 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 1595 1600 1605 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 1610 1615 1620 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 1625 1630 1635 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 1640 1645 1650 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1655 1660

Claims (56)

  1. A형 혈우병 및 낮은 골 무기질 밀도(BMD)를 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법이
    (i) A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및
    (ii) 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며;
    상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD의 감소를 저해하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 SEQ ID NO: 4에 따른 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 SEQ ID NO: 5에 따른 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 SEQ ID NO: 4에 따른 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 쇄가 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 쇄가 Fc 도메인의 힌지 영역 내의 2개의 이황화 결합을 통해 상기 제2 폴리펩티드 쇄에 공유 결합된 방법.
  11. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 에프모로크토코그 알파(efmoroctocog alfa)인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 인간 세포에 의해 생성된 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 인간 세포가 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 3일 내지 5일마다 25 내지 65 IU/kg의 용량으로 투여되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인이 인간 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 도메인인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 BMD가 듀얼(Dual) X-선 흡수계측법(DXA)에 의해 측정되는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 50세 이상인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 BMD가 T-점수에 의해 결정되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 대상체가 -1.0 미만의 T-점수를 갖는다면, 상기 대상체가 낮은 BMD를 갖는 것으로 결정되는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 대상체가 -1.0 내지 -2.4의 T-점수를 갖는다면, 상기 대상체가 낮은 BMD 및 골감소증을 갖는 것으로 결정되는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 대상체가 -2.5 미만의 T-점수를 갖는다면, 상기 대상체가 낮은 BMD 및 골다공증을 갖는 것으로 결정되는 방법.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 50세 미만인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 대상체에서 BMD가 Z-점수에 의해 결정되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 -2.0 미만의 Z-점수를 갖는다면, 상기 대상체가 낮은 BMD를 갖는 것으로 결정되는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 골 형성, 골 흡수 및/또는 골 손실의 하나 이상의 바이오마커의 수준에 기초하여 낮은 BMD를 갖는 것으로 예측되는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 바이오마커가 대상체의 말초 혈액 또는 소변으로부터 평가되는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 골 형성의 하나 이상의 바이오마커가 골-특이적 알칼리성 포스파타제, 프로콜라겐 1형 N-말단 프로펩티드(P1NP), 프로콜라겐 1형 C-말단 프로펩티드(P1CP) 및/또는 오스테오칼신을 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 골 흡수의 하나 이상의 바이오마커가 혈청 중 총 알칼리성 포스파타제, 핵 인자 카파 B의 수용체 활성화인자(RANKL), 오스테오프로테게린(OPG), 타르타르산염-저항성 산 포스파타제(TRAP), 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 데옥시피리디놀린(DPD), 피리디놀린(PYD), 골 시알로단백질, 카텝신 K, 타르타르산염-저항성 산 포스파타제 5b(TRAP5b), 기질 메탈로프로테이나제 9(MMP9), 및/또는 1형 콜라겐에 대한 C- 및/또는 N-말단 교차-결합된 텔로펩티드(CTX-1 및 NTX-1)를 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 비타민 D 결핍을 갖지 않는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 Fc 부분이 없는 인자 VIII로 이전에 치료된 방법.
  31. A형 혈우병 및 증가된 골절의 위험을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법이
    (i) A형 혈우병 및 증가된 골절의 위험을 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및
    (ii) 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며;
    상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 골절의 위험을 감소시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 대상체에서 골절의 위험이 골절 위험 평가 도구(FRAX)에 의해 결정되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 대상체에서 골절의 위험이 낮은 BMD 위험 인자의 평가에 의해 결정되는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 낮은 BMD 위험 인자가 관절병증, 감소된 신체 활동, HIV 또는 HCV로의 감염, 비타민 D 결핍, 낮은 체질량지수(BMI) 및/또는 생식샘저하증을 포함하는 방법.
  35. 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD) 손실률의 감소 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 낮은 BMD를 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및
    (ii) 치료적 유효량의, 응고 인자 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하여, 상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD 손실률을 감소시키도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 경증 A형 혈우병을 갖는 방법.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 중등도 A형 혈우병을 갖는 방법.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 중증 A형 혈우병을 갖는 방법.
  39. A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법으로서, 상기 방법이
    (i) Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 A형 혈우병에 대한 치료를 받고 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 상기 대상체가 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌고, 상기 대상체가 낮은 BMD를 갖는 단계; 및
    (ii) Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료를 중단하고, 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
  40. A형 혈우병을 갖는 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 비-인자 대체 단백질을 사용한 A형 혈우병에 대한 치료를 받고 있는 대상체를 확인하는 단계로서, 상기 대상체가 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌고, 상기 대상체가 낮은 BMD를 갖는 단계; 및
    (ii) 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료를 중단하고, 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
  41. 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 A형 혈우병 및 낮은 BMD를 갖는 것으로 확인되었고, 상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
  42. 대상체에서의 골절 위험의 감소 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 A형 혈우병 및 증가된 골절 위험을 갖는 것으로 확인되었고, 상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 골절의 위험을 감소시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
  43. 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD) 손실률의 감소 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법으로서, 상기 방법이 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 A형 혈우병 및 BMD 손실을 갖는 것으로 확인되었고, 상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD 손실률을 감소시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
  44. A형 혈우병을 갖고 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질로 치료 중인 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법으로서, 상기 방법이 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료를 중단하는 단계, 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 Fc 부분이 없는 FVIII 단백질을 사용한 치료 동안 낮은 BMD 및 적당한 혈액 응고를 갖는 것으로 확인되었고, 상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
  45. A형 혈우병을 갖고 비-인자 대체 단백질로 치료 중인 대상체에서의 골 무기질 밀도(BMD)의 증가 및 출혈 에피소드의 예방적 치료 방법으로서, 상기 방법이 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료를 중단하는 단계 및 치료적 유효량의, 재조합 FVIII 단백질 및 Fc 도메인을 포함하는 키메라 단백질(rFVIIIFc)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료 동안 낮은 BMD 및 적당한 혈액 응고를 갖는 것으로 확인되었고, 상기 키메라 단백질의 투여가 상기 대상체에서 BMD를 증가시키고, 출혈 에피소드를 예방적으로 치료하는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질을 사용하여 A형 혈우병과 연관된 출혈을 감소시키도록 이전에 치료된 방법.
  47. 제39항, 제44항 또는 제46항에 있어서, 상기 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질이 Fc 도메인에 융합되지 않은 PEG화된 FVIII인 방법.
  48. 제39항, 제44항 또는 제46항에 있어서, 상기 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질이 Fc 도메인에 융합되지 않은 단일-쇄 FVIII인 방법.
  49. 제39항, 제44항 또는 제46항에 있어서, 상기 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질이 인간에서 이의 반감기를 연장시키는 모이어티를 포함하지 않는 재조합 FVIII인 방법.
  50. 제39항, 제44항 또는 제46항에 있어서, 상기 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질이 혈액-유래 FVIII 또는 혈장-유래 FVIII인 방법.
  51. 제39항, 제44항 또는 제46항에 있어서, 상기 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질이 다모크토코그 알파 페골(damoctocog alfa pegol), 투로크토코그 알파 페골(turoctocog alfa pegol), 투로크토코그 알파(turoctocog alfa), 로노크토코그 알파(lonoctocog alfa), 시모크토코그 알파(simoctocog alfa), 루리오크토코그 알파 페골(rurioctocog alfa pegol) 또는 옥토코그 알파(octocog alfa)인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 비-인자 대체 단백질을 사용하여 A형 혈우병과 연관된 출혈을 감소시키도록 이전에 치료된 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 비-인자 대체 단백질이 에미시주맙(emicizumab)인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 에미시주맙이 에미시주맙-kxwh인 방법.
  55. 제30항 및 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 Fc 부분이 없는 인자 VIII 단백질 또는 비-인자 대체 단백질을 사용한 치료 동안 적당한 혈액 응고를 가졌던 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 출혈이 검출되지 않은 골 부위 및/또는 관절에서 낮은 BMD를 갖는 방법.
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