RO116198B1 - Oligopeptida si conjugat al acesteia, clivate selectiv de antigenul specific de prostata - Google Patents

Oligopeptida si conjugat al acesteia, clivate selectiv de antigenul specific de prostata Download PDF

Info

Publication number
RO116198B1
RO116198B1 RO96-02483A RO9602483A RO116198B1 RO 116198 B1 RO116198 B1 RO 116198B1 RO 9602483 A RO9602483 A RO 9602483A RO 116198 B1 RO116198 B1 RO 116198B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
ser
sequence
gin
tyr gin
asn lys
Prior art date
Application number
RO96-02483A
Other languages
English (en)
Inventor
Deborah Defeo-Jones
Dong-Mei Feng
Victor M Garsky
Raymond E Jones
Allen I Oliff
Original Assignee
Merck & Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/267,092 external-priority patent/US5599686A/en
Application filed by Merck & Co Inc filed Critical Merck & Co Inc
Publication of RO116198B1 publication Critical patent/RO116198B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Inventia se refera la o oligopeptida sub forma de fragment peptidic de Semenogelin I sau un fragment peptidic modificat de Semenogelin I si oligomeri ai acestor oligopeptide, recunoscute si clivate proteolitic de catre antigenul specific de prostataliber si oligomerii acestor oligopeptide, si la conjugatul acestei oligopeptide, utilizate in tratamentul cancerului de prostata.

Description

Invenția se referă la o oligopeptidă sub formă de fragment peptidic de
Semenogelin I sau un fragment peptidic modificat al acesteia sau oligomerii acestor i oligopeptide, recunoscute, și clivată proteolitic de către antigenul specific de prostată liber și la conjugatul acestei oligopeptide utilizate în tratamentul cancerului de prostată.
Este cunoscut din US 5391723 un conjugat de proteină, oligonucleotidă care conține o porțiune de nucleotidă mono sau dublu catenară, o porțiune de proteină și un linker de ester fosforamidic care leagă covalent porținea de oligonucleotidă și porțiunea de proteină.
Este, de asemenea, cunoscut din US 5349066 un conjugat format prin combinarea a cel puțin o moleculă ce conține o grupare liberă carbonil și cel puțin o moleculă ce conține o grupare sulfhidril cu cel puțin unul din mai mulți compuși aleși.
Se cunoaște, de asemenea, o metodă în care imunotestele se aplică pentru a măsura PSA liber, un complex inhibitor de proteinază PSA liber, iar complexul PSA este măsurat printr-un imunotest necompetitiv la care participă cel puțin 2 anticorpi monoclonali diferiți, PSA liner și complexul inhibitor PSA proteinază.
în anul 1994, cancerul glandei prostată era de așteptat să fie diagnosticat la 2OO □□□ de oameni în Statele Unite, iar 35 □□□ bărbați americani au murit de această boală (Garnick, M.B. (1994), “The Dilemmas of Prostate Cancer. Scientific American”, Aprilie, 72-81). Astfel, cancerul de prostată este caracterul malign diagnosticat cel mai frecvent (după cel al pielii) la bărbații din Statele Unite și a doua cauză de fond a deceselor legate de cancer (după cancerul de plămâni) în acest grup.
Antigenul specific de prostată (PSA) este o glicoproteină cu catenă simplă de 33 kDa, care este produsă aproape exclusiv de către epiteliul prostatei la om și se întâlnește la niveluri de Q,5 la 2,0 mg/ml în fluidul seminal uman (Nadji, M., Taber, S.Z., Castro, A.., et. al., (1981) Cancer 48: 1229; Papsidero, L. Kuriyama, M., Wang, M., et. al., (1981) JNCI 66:37; Qui, S. D. Young, C. Y. F., Bihartz, D. L. Et. Al. (1990), J. Urol. 144:1550; Wang, M.C., Valenzuela, L.A., Murphy, G.P., et. al., (1979). Invest.urol. 17:159). Unitatea carbohidrat singlet este atașată la restul de asparagină din poziția 45 și reprezintă 2 până la 3 kDa din masa moleculară totală. PSA este o protează cu specificitate asemenea chimotripsinei (Christensson, A., Laurell, C.S. Lilja, H. (1990) Eur. J. Biochem. 194: 755-763). S-a arătat că PSA este responsabil în principal pentru dizolvarea structurii gel formată la ejaculare prin proteoliza proteinelor principale în gelul care include sperma Semenogelin I și Semenogelin II, și fibronectină (Lilja, H. (1985). J.Clin.Invest. 76:1899; Lilja, H., Oldbring, J., Rannevik, G., et. al., (1987) J.Clin.Invest. 80:281; McGee, R.S., Herr, J.C. (1988). Biol. Reprod. 39:499). Proteoliza mediată PSA a proteinelor care formează gel generează câteva fragmente de Semenogelin I și Semenogelin II solubile și fragmente de fibronectină solubile cu lichefierea ejaculatului și eliberarea spermatozoizilor cu motilitate progresivă (Lilja, H., Laurell, C.B. (1984). Scand. J. Clin. Lab. Invest. 44:447; McGee, R.S., Herr, J.C. (1987). Biol. Reprod. 37:431). în plus, PSA poate degrada proCSîJtttic IGFBP-3 (factor de creștere asemenea insulinei care leagă proteina 3) care permite IGF să stimuleze specific creșterea celulelor secretoare de PSA (Cohen și colab., (1992) J. Clin. Endo. & Meta. 75: 1046/1053).
PSA complexat ia a/fa-antichimotripsină este forma moleculară dominantă a PSA din ser și poate constitui până la 95% din PSA din ser detectat (Christensson,
RO 116198 Bl
A., Bjdrk, Nilsoon, O., et. al. (1993). J.Urol. 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U (1991) Clin.Chem. 37: 1618-1625;Stenman, U.H., Leinoven, J., Alfthan, H., et. al., (1991), Cancer Res. 51: 222-226). Țesutul prostatic (normal, benign hiperplastic, sau țesut malign) este implicat în eliberarea predominantă a 5o formei mature, enzimatic activă a PSA, deoarece această formă este necesară pentru formarea complexului cu alfa 1-antichimotripsină (Mast, AE, Enghild, J.J.Pizzo, S.V., și colab., (1991), Biochemistry 30: 1723-1730; Perlmutter D.H., Glover, G-l. Rivetna, M. și colab., (1990). Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 3753-3757). Totuși, în micromediul înconjurător al celulelor care secretă PSA prostatic, se crede că PSA va 55 fi produs și secretat în forma lor matură activă enzimatic necomplexată la o moleculă inhibitoare. De asemenea, PSA formează complexe stabile cu alfa 2-macroglobulină, dar deoarece aceasta conduce la încapsularea PSA și pierderea completă a epitopilor PSA, semnificația in vivo a acestei formări complexe este neclară. O formă liberă, necomplexată a PSA constituie o fracție minimă a PSA seric (Christensson A., Bjork, 60 T., Nilsson, O., și colab., (1993). I. Urol. 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37: 1618-1625) Nivelul acestei forme a PSA seric este similară cu cea a PSA din fluidul seminal (Lilja, H, Cristensson, A., Dahlen, U (1991). Clin Chem 37:1618-1625) ( dar este încă necunoscut dacă forma liberă a
PSA seric poate fi un zimogen, o formă inactivă, clivată intern de PSA matur, sau PSA 65 care manifestă activitate enzimatică. Totuși, pare puțin probabil ca forma liberă de PSA seric să manifeste activitate enzimatică, deoarece există exces considerabil molar (100 la 1000 ori) atât de alfa 1-antichimotripsină nereacționată, cât și de alfa 2-macroglobulină în ser comparativ cu nivelurile detectate în ser ale formei libere de kDa a PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., și colab., (1993), J. Urol. 70 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37: 16181625).
Măsurători de ser al PSA sunt folosite pentru monitorizarea tratamentului adenocarcinomului de prostată (Duffy, M.S., (1989). Ann. Clin. Siochem. 26: 379387; Brawer, M.K. și Lange, P.H. (1989). Urol. Suppl. 5: 11-16; Hara, M. și 75 Kimura, N. (1989), J. Lab. Clin. Med. 113: 541-548), deși concentrații mai mari decât normale ale PSA seric s-au raportat în hiperplazia benignă prostatică și ca urmare a traumelor chirurgicale ale prostatei (Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37: 1618-1625). Metastazele prostatei sunt cunoscute, de asemenea, a secreta PSA reactiv imunologic, deoarece PSA ser este detectabil la 80 niveluri ridicate la pacienți prostatectomizați prezentând cancer generalizat metastatic de prostată (Ford, T.F., Butcher, D.N., Masters, R.W. și colab., (1985). Brit. J. Urology 57: 50-55). Deci, un compus citotoxic care ar putea fi activat prin activitatea proteolitică a PSA ar trebui să fie specific pentru celula prostatică, precum și specifică pentru metastazele de prostată care secretă PSA. 85
Prezenta invenție se referă la oligopeptide sub formă de fragmente peptidice de Semenogelin I sau de fragmente peptidice modificate al acestora în care câțiva sau toți aminoacizii din fragmentele peptidice au fost înlocuite cu alți aminoacizi, oligopeptidele amintite fiind recunoscute și clivate proteolitic de către antigenul specific de prostată liber și oligomerii acestor oligopeptide și la conjugatul acestei oligopeptide. 90 Oligopeptide sub formă de fragmente peptidice de Seminogelin sau fragmente modificate de Seminogelin, astfel încât să fie recunoscute și clivate proteolitic de către
RO 116198 Bl antigenul specific de prostată liber, conform invenției, are aminoacidul N-terminal sau aminoacidul C-terminal sau ambii modificați, cu condiția ca această oligopeptidă să nu fie Semenogelin I și Semenogelin II.
Conjugatul de oligopeptidă, conform invenției, are în componență o oligopeptidă așa cum este revendicată mai sus, atașată la un agent citotoxic printr-o legătură covalentă sau printr-un linker chimic.
Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:
-specificitate pentru celula prostatică;
-o creșterea a activității proteolitice a PSA .
Au fost identificate câteva puncte de clivare unde Semenogelin I este clivat proteolitic selectiv de PSA liber. Sunt descrise oligopeptide care cuprind secvențe aminoacide care sunt recunoscute și clivate proteolitic de antigenul liber specific de prostată (PSA). Astfel de oligopeptide sunt folosite în teste care pot determina activitatea protează PSA liberă in vitro și in vivo. Suplimentar, astfel de oligopeptide pot fi încorporate în agenți terapeutici care cuprind conjugații unor asfel de oligopeptide și agenți cunoscuți citotoxici și sunt folosiți în tratamentul cancerului de prostată.
Fraza oligomeri acestor oligopeptide”, cum s-a folosit mai înainte și în altă parte din descrierea detaliată a invenției, descrie oligomeri de la aproximativ 6 până la aproximativ 1OO resturi de aminoacizi ce includ în secvența lor de aminoacizi secvența specifică de aminoacizi descrisă și care, prin urmare, este clivată proteolitic în secvența de aminoacizi descrisă prin PSA liber. Astfel, de exemplu, oligomerul următor:
Gin Leu Asp Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr His Gin Ser Ser (SECVENȚA NR. 20) cuprinde secvența aminoacidă:
Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr (SECVENȚA NR. 10) și prin urmare va fi inclusă în prezenta invenție. S-a înțeles că astfel de oligomeri nu includ Semenogelin II.
De asemenea, s-a înțeles că prezenta invenție include oligomeri în care aminoacidul N-terminal, aminoacidul C-terminal sau ambii aminoacizi terminali sunt modificați. Astfel de modificări includ, dar nu se limitează la, acilarea grupării amino de la capătul N-terminal și formarea unei amide pentru a înlocui acidul carboxilic de la capătul C-terminal. Adiția unor astfel de grupări poate fi realizată în timpul sintezei în fază solidă a oligomerului, astfel, atașarea aminoacidului C-terminal la o rășină în fază solidă poate fi făcută cu ajutori unei amine, ceea ce conduce la o grupare amidică pe clivare acidă a oligomerului din rășină. Astfel, compușii următori sunt considerați oligomeri care conțin o secvență aminoacidă”, așa cum s-a folosit mai înainte și au semnificația de a fi ilustrativi, și nu limitativi:
Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr Glu - amidă (SECVENȚA NR. 11)
Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr Leu (SECVENȚA NR. 70)
Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 11)
Ac-Ala AsnLys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr Glu-amidă
RO 116198 Bl (SECVENȚA NR. 70) » Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ala Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 73] Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Lys Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 74) Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 75) Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser Gin Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 78) Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ala Lys Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 79) Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Thr Glu - amidă (SECVENȚA NR. 81) Ac-Ala Asn Lys Ser Tyr Gln/Ser Ser Thr Glu - amidă (SECVENȚA NR. 82) Ac-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gln/Ser Ala Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 84) Ac-Ala Asn Glu lle Tyr Gln/Ser Ala Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 85) Ac-Asn Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser - amidă (SECVENȚA NR. 16) Ac-Lys lle Ser Tyr Gln/Ser Ser - amidă (SECVENȚA NR. 86) Ac-Ser Tyr Gln/Ser Ser Thr Glu - amidă (SECVENȚA NR. 87) Ac-Ala Ser Tyr Gln/Ser Ser Thr Glu - amidă (SECVENȚA NR. 89) Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Tyr/Ser Ser Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 92) Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Tyr/Ser Ala Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 93) Ac=Ala Ser Tyr Gln/Ser Ser Leu-amidă (SECVENȚA NR. 94) Ac-Ala Asn Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr Glu-amidă (SECVENȚA NR. 95) Ac-Ala Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr Glu - amidă (SECVENȚA NR. 96) Ac-Ser Tyr Gln/Ser Ser Ser Thr Glu- amidă (SECVENȚA NR. 97) Ac-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gln/Ser Ala Ser Cys-amidă (SECVENȚA NR. 98)
Un specialist în domeniul chimiei peptidelor ar aprecia ușor că anumiți aminoacizi într-o oligopeptidă biologic activă pot fi înlocuiți prin alți aminoacizi omologi, izosterici și/sau izoelectronici, în care activitatea biologică a oligopeptidei originale s-a conservat în oligopeptidă modificată. Lista următoare de înlocuiri aminoacide este ilustrativă, dar nu limitativă:
140
145
150
155
160
165
170
175
180
RO 116198 Bl
Aminoacid oriainal Aminoacidizil de înlocuire
Ala Gly
Arg Lys, ornitină
Asn Gin
Asp Glu
Glu Asp
Gin Asn
Gly Ala
lle Val, Leu, Met, Nle
Leu lle, Val, Met, Nle
Lys Arg, ornitină
Met Leu, lle, Nle, Val
Ornitină Lys, Arg
Phe Tyr, Trp
Ser Thr
Thr Ser
Trp Phe, Tyr
Tyr Phe, Trp
Val Leu, lle, Met, Nle
Astfel, de exemplu, următoarele oligopeptide pot fi sintetizate prin tehnici bine cunoscute specialiștilor în domeniu și ar fi de așteptat să fie clivate proteolitic de PSA liber:
AsnArglIeSerTyrGIn/Ser AsnLysValSerTyrGIn/Ser AsnLysMetSerTyrGIn/SerSer AsnLysLeuSerTyrGIn/SerSer AsnLyslleThrTyrGIn/SerSerSer AsnLyslleSerPheGIn/SerSerSer AsnLyslleSerTrpGIn/SerSerSerThr AsnLyslleSerTyrAsn/SerSerSerThr AsnLyslleSerTyrGIn/ThrSerSerThr AsnLyslleSerTyrGIn/Ser GlnLyslleSerTyrGIn/SerSer AsnArgIleThrTyrGIn/SerSerSer AsnArglIeSerPheGIn/SerSerSerThr AsnArgIleSerTrpGIn/SerSerSerThr AsnArgIleSerTyrGIn/ThrSerSerThr AsnArglIeThrTyrGIn/ThrSerSerThr (SECVENȚA NR. 21) (SECVENȚA NR. 22) (SECVENȚA NR. 23) (SECVENȚA NR. 24) (SECVENȚA NR. 25) (SECVENȚA NR. 26) (SECVENȚA NR. 27) (SECVENȚA NR. 28) (SECVENȚA NR. 29) (SECVENȚA NR. 30) (SECVENȚA NR. 31] (SECVENȚA NR. 32) (SECVENȚA NR. 33) (SECVENȚA NR. 35) (SECVENȚA NR. 36) (SECVENȚA NR. 37)
RO 116198 Bl
225
AsnLysLeuSerTyrGIn/ThrSerSerThr GlnLysLeuSerTyrGIn/SerSerSerThr AsnArgLeuSerTyrGIn/ThrSerSerThr AsnLysValSerPheGIn/SerSerSerThr AsnArgValSerTrpGIn/SerSerSerThr GlnLysValSerTyrGIn/SerSerSerThr'GlnLyslleSerTyrGIn/ThrSerSerThr AsnLyslleSerTyrGIn/SerSerSerThr (SECVENȚA NR. 38) (SECVENȚA NR. 39) (SECVENȚA NR. 40) (SECVENȚA NR. 41) (SECVENȚA NR. 42) (SECVENȚA NR. 43) (SECVENȚA NR. 34) (SECVENȚA NR. 44)
230 în mod asemănător, următoarele oligopeptide pot fi sintetizate prin tehnici binecunoscute persoanelor calificate în domeniu și este de așteptat să fie clivate proteolitic de PSA liber:
235
GlyGluGInGlyValGInLysAspValSerGInSerSerlleTyr/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR. 45)
GlyGluAsnGlyLeuGInLysAspValSerGInSerSerlleTyr/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR. 47)
GlyGluAsnGlyValAsnLysAspValSerGInSerSerlleTyr/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR. 48)
GlyGluAsnGlyValGInArgAspValSerGInArgSerlleTyr/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR. 49)
GlyGluAsnGlyValGInLysAspValSerGInLysSerlleTyr/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR. 50)
GlyGluAsnGlyValGInLysAspLeuSerGInThrSerlleTyr/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR. 51)
GlyGluAsnGlyValLysAspValSerGInSerSerllePhe/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR. 52)
GlyGluAsnGlyValGInLysAspMetSerGInSerSerlleTyr/ThrGInThrGIu (SECVENȚA NR. 53)
GlyGluAsnGlyValGInLysAspValSerGInArgSerlleTyr/ThrGInThrGIu (SECVENȚA NR. 54)
GlyGluAsnGlyValGInLysAspValSerGInSerSerlleTyr/SerGInSerGIu (SECVENȚA NR. 55)
GlyGluAsnGlyValGInLysAspValSerGInArgSerlleTyr/SerAsnThrGIu (SECVENȚA NR. 56)
GlyLysAlalleSerSerGInTyr/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 57)
GlyArgGIylleSerSerGInTyr/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 59)
GlyLysGlylleThrSerGInTyr/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 60)
GlyLysGlylleSerThrGInTyr/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 61)
GlyLysGlylleSerSerAsnTyr/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 62)
240
245
250
255
260
265
RO 116198 Bl
AlaLysGlylleSerSerGInTyr/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 63) GlyLysGlylleSerSerGInPhe/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 64) GlyLysGlylleSerSerGInTyr/ThrAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 65) GlyLysGlylleSerSerGInTyr/SerAsnSerGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR. 58) GlyLysGlylleSerSerGInTyr/SerAsnThrAspGluArgLeu (SECVENȚA NR. 46) și cele asemenea.
Includerea simbolului “/’într-o secvență aminoacidă indică punctul din secvență unde oligopeptida este clivată proteolitic de PSA liber.
Oligopeptida poate fi folosită într-o metodă pentru testarea activității proteolitice a PSA liber într-o compoziție. Acesta este un aspect important al invenției, prin faptul că un astfel de sistem de testare asigură posibilitatea de a măsura cantitativ nivelul de PSA liber prezent în anumite fluide fiziologice și țesuturi. Un asemenea test asigură nu numai posibilitatea de a urmări izolarea și purificarea PSA liber, dar este și un fundament pentru un test de screening pentru inhibitorii activității proteolitice a PSA liber. Metoda de testare cuprinde în general simpla determinăre a capacității unei compoziții, suspectate de a conține PSA liber activ enzimatic, de a cliva proteolitic oligopeptida.
în mod tipic, protocolul de testare se realizează folosind una din peptidele descrise mai sus aici. Totuși, poate fi găsit un avantaj particular în construcția unui test în care oligopeptida conținând situl de clivaj marcat astfel încât se poate măsura apariția unui astfel de marcaj, de exemplu, un marcaj radioactiv, atât în oligopeptida nemarcată, cât și în porțiunea oligopeptidei care rămâne după clivare, care conține marcajul.
Invenția se referă, suplimentar, la o metodă pentru identificarea compușilor (care vor fi denumiți în continuare compuși candidați) care vor inhiba activitatea proteolitică a PSA liber. Se presupune că această tehnică de screening se va dovedi folositoare în identificarea generală a oricărui compus candidat care va servi în scop inhibitor, oricum compusul candidat are o structură proteică sau peptidil.
□ligopeptidele pot fi folosite într-o metodă pentru determinarea capacității unei substanțe test de a inhiba activitatea proteolitică a PSA liber care cuprinde:
punerea în recție a unui substrat, în care substratul cuprinde o secvență de aminoacizi care este recunoscută și clivată selectiv proteolitic prin antigen specific prostatic liber, cu antigen specific prostatic liber în prezența unui substanțe test; și detectarea dacă substratul a fost clivat, în care capacitatea substanței test de a inhiba activitatea proteolitică a antigenului specific prostatic este indicată printr-o scădere în clivarea substratului, comparativ cu clivarea substratului în absența substanței test.
Testul de screening al candidatului este chiar simplu de realizat și organizat și este în relație în multe privințe cu testul discutat mai sus pentru determinarea activității proteolitice. Astfel, după obținerea unei preparări relativ pure de PSA liber, se va dori să se amestece simplu o substanță test cu preparatul proteolitic, de
RO 116198 Bl
320 preferință în condiții care ar permite PSA să-și realizeze funcția de clivare, numai că se include substanța inhibitoare. Astfel, de exemplu, se va dori în mod tipic să se includă în amestec o cantitate dintr-o oligopeptidă cunoscută, având un sit de clivaj specific PSA, cum ar fi aceste oligopeptide descrise înainte. în acest mod, se poate măsura capacitatea substanței test pentru a reduce clivarea oligopeptidei relativ în prezența substanței test.
Se poate face măsurarea sau determinarea diferită a activității PSA liber în absența substanței test adăugate față de activitatea în prezența substanței test, în scopul de a evalua capacitatea relativă de inhibare a substanței test.
Prezenta invenție se referă, de asemenea, la noi compoziții anticanceroase folosite pentru tratamentul cancerului de prostată. Astfel de compoziții cuprind oligopeptide ale prezentei invenții legate covalent direct sau prin intermediul unui linker chimic la un agent citotoxic. O astfel de combinație a unei oligopeptide și agent citotoxic poate fi numită un conjugat. în mod ideal, activitatea citotoxică a agentului citotoxic este mult redusă sau absentă când oligopeptidă care conține situl de clivare proteolitică PSA este legată direct sau prin intermediul unui linker chimic la agentul citotoxic și este intactă. De asemenea, în mod ideal, activitatea citotoxică a agentului citotoxic crește semnificativ sau revine la activitatea agentului citotoxic nemodificat după clivarea proteolitică a oligopeptidei atașate la situl de clivaj. Deși nu este necesar pentru practicarea acestui aspect al invenției, realizarea cea mai preferată a acestui aspect al invenției este un conjugat în care oligopeptidă, și linkerul chimic, dacă este prezent, sunt detașați de agentul citotoxic prin activitate proteolitică a PSA liber și oricare alte enzime proteolitice native prezente în țesutul apropiat, prin urmare eliberând agentul citotoxic nemodificat în mediul înconjurător fiziologic la locul clivajului proteolitic.
Se înțelege că oligopeptidă prezentei invenții care este conjugată la agentul citotoxic, fie printr-o legătură covalentă directă, fie printr-un linker chimic, nu este necesar să fie oligopeptidă care are recunoașterea cea mai mare de către PSA liber și este clivată proteolitic cel mai rapid prin PSA liber. Astfel, oligopeptidă care este selectată pentru încorporarea într-o astfel de compoziție anticancer va fi aleasă atât pentru clivarea sa proteolitică selectivă de către PSA liber, cât și pentru activitatea citotoxică a conjugatului agent citotoxic-rest proteolitic (sau, în ceea ce~se crede a fi o situație ideală, agentul citotoxic nemodificat] care rezultă dintr-un astfel de clivaj.
Deoarece conjugații invenției pot fi utilizați pentru modificarea unui răspuns biologic dat, agentul citotoxic nu este construit ca limitându-se la agenți terapeutici chimici clasici. De exemplu, agentul citotoxic poate fi o proteină sau oligopeptidă posedând o activitate biologică dorită. Astfel de proteine pot include, de exemplu, o toxină, cum ar fi abrina, ricin A, exotoxina de la Pseudomonas sau toxina difterică; o proteină, cum ar fi factorul necrozei tumorale, a/fa-interferon, beta-interferon, factorul de creștere a nervului, factorul de creștere derivat de la trombocitul, activator tisular al plasminogenului; sau, modificatori de răspuns biologic, cum ar fi, de exemplu, limfokine, interleukina-1 (IL-T'], interleukina-2 (“IL-2”), interleukina-S (“IL-6”], factor de stimulare a coloniei de granulocit-macrofag (“GM-CSF”), factor de stimulare a coloniei de macrofage granulocite (“G-CSF”], sau alți factori de creștere.
Agenții citotoxici preferați includ, în general, agenți de alchilare, agenți antiproliferativi, agenți de legarea ai tubulinei și alții asemenea.
325
330
335
340
345
350
355
360
RO 116198 Bl
Clase preferate de agenți citotoxici includ, de exemplu, medicamente din familia antraciclinei, medicamente din grupul alcaloizilor de Vinca, mitomicine, bleomicine, nucleozide citotoxice, familia pteridine de medicamente, dinene și podofilotoxine. Membrii acestor clase folosiți în mod special includ, de exemplu, doxorubicina, *carminomicina, daurorubicina, aminopterina, metotrexat, metopterin, diclormetrotrexat, mitomicină C, porfiromicină, 5-fluororacil, 6-mercaptopurină, citozin arabinozidă, podofilotoxină sau derivați de podofilotoxină, cum ar fi, etopozidă sau fosfat de etopozidă, melfalan, viblastină, vincristină, leurozidină, vindezină, leurozină și altele. Alți agenți citotoxic utili includ estramustina, cisplatina și ciclofosfamida. Un specialist în domeniu poate face modificări chimice la compusul dorit, cu scopul de a face reacțiile compusului acesta mai potrivite scopurilor de preparare a conjugatelor invenției.
Un grup foarte preferat de agenți citotoxici pentru prezenta invenție include medicamente cu următoarea formulă:
Grupul metotrexat cu formula (1):
COR9
I conhchch2ch2co2h în care R12 este amino sau hidroxil;
R7 este hidrogen sau metil;
Ra este hidrogen, fluor, clor, brom sau iod;
R9 este hidroxi sau o grupare care completează o sare a acidului carboxilic.
Grupul mitomicin cu formula (2):
în care R1Q este hidrogen sau metil.
Grupul bleomicină cu formula (3):
(3)
RO 116198 Bl în care R11 este hidroxi, amino, CȚ-Cg alchilamino, cf/fCȚ-Cg alchiljamino, C4-C6 polimetilen amino·.
+
-NHCHaCHgCHaS-CH- ;sau ch3
410
-NHCHaCHgCHgCHgNH-CNHg-iCHa
Melfalan cu formula (4):
415
N(CH2CH2CI)2 (4)
6-mercaptopurina cu formula (5):
420
(5)
O citozin arabinozida cu formula (6):
430
435 (6)
Podofilitoxine cu formula (7):
440 în care R13 este hidrogen sau metil; R14 este metil sau tienil;
sau o sare de fosfat a acestora.
50
RO 116198 Bl
Medicamentele din grupul alcaloizilor de Vinca cu formula (8):
în care R15 este H, CH3, sau CHO; când R17 și R18 sunt luați singuri;
R18 este H, și unul dintre R16 și R17 este etil și celălalt este H sau OH; când R17 și R18 sunt luați împreună cu carbonii la care ei sunt atașați, ei formează un inel oxiranic în care R1S este etil;
R19 este hidrogen, (Cq-CgalchilJ-CO sau (Cq-CțgalchilJ-CO clorosubstituit.
Difluoronucleozide cu formula (9):
în care R22 este hidrogen, metil, fluor, clor sau iod;
R23 este -OH sau -NH2;
R24 este hidrogen, brom, clor sau iod;
sau
Antibioticele din grupul antraciclinelor cu formula (10):
(10)
RO 116198 Bl în care R1 este -CH3, -CH2OH, -CH20C0(CH2)3CH3, sau CH20C0CH(0C2H5)2;
R3 este -0CH3, -OH sau -H;
R4 este -NH2, -NHC0CF3, 4-morfolinil, 3-ciano-4-morfolinil, 1-piperidinil, 4metoxi-1- piperidinil, benzilamină, dibenzilamină, cianometilamină, sau 1-ciano-2metoxietil amină;
R5 este -OH-OTHP sau -H;
R6 este -OH sau -H, cu condiția ca R6 nu este -OH când R5 este -OH sau -OTHP
Estramustină (11)
500 (CICH2CH2)2NCOO
(11)
505
510
Ciclofosfamidă (12) zN(CH2CH2CI)2 (
515
Medicamentele optime sunt agenții antibiotici antracilinici cu formula (10), descriși anterior. Un specialist în domeniu înțelege că această formulă structurală include compuși care sunt medicamente, sau sunt derivați de medicamente care au primit în domeniu diferite nume generice sau obișnuit. Tabelul 1, care urmează, 520 reprezintă un număr de medicamente antraciclinice și numele lor generic sau obișnuit și care sunt preferați în mod special pentru folosire în prezenta invenție.
Tabelul 1
Compus Ri b3 04 05 Be
daunorubicină3 ch3 och3 nh2 OH H
doxorubicinăb ch2oh och3 nh2 OH H
detorubicină CH20C0CH(0C2H5)2 och3 nh2 OH H
carminomicină ch3 OH nh2 OH H
idarubicină ch3 H nh2 OH H
epirubicină ch2oh och3 nh2 OH OH
esorubicină ch2oh och3 nh2 H H
THP ch2oh och3 nh2 OTHP H
AD-32 CH20C0(CH2)3CH3 OCHg NHCOCFg OH H
a, ,daunomicin este un nume alternativ pentru daunorubicină b, ,adriamicin” este un nume alternativ pentru doxorubicină
RO 116198 Bl
Dintre compușii arătați în tabelul 1, medicamentul preferat este doxorubicină.
Doxorubicină (de asemenea prezentat aici ca “DOX”) este acea antraciclină cu formula (10) în care R1 este -CH2OH, R3 este -OCH2 R4 este NH2, R5 este -OH și R6 este -H.
Oligopeptidele, subunitățile de peptidă și derivații de peptidă (de asemenea denumiți ,,peptide”) ale prezentei invenții pot fi sintetizate din aminoacizii lor constituenți prin tehnici convenționale de sinteză a peptidei, de preferat prin tehnologie în fază solidă. Apoi, peptidele s-au purificat prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în faza inversă (HPLC).
Metode standard ale sintezei peptidei sunt descrise, de exemplu, în următoarele lucrări: Schroeder și colab., ,,The Peptides”, voi. I, Academic Press 1965; Bodansky și colab., „Peptide Synthesis”, Interscience Publishers, 1966; McOmie (ed.) ,,Proiective Groupe in Organic Chemistry”, Plenum Press, 1973; Barany și colab., ,,The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology” 2 Capitol 1, Academic Press, 1980 și Stewart și colab., ,.Solid Phase Peptide Synthesis”. Ediția a doua, Pierce Chemical Company, 1984. Expun erile acestor lucrări sunt încorporate aici ca referință.
Conjugatele prezentei invenții care cuprind oligopeptida conținând situl de clivare PSA și un agent citotoxic pot fi sintetizate în mod similar prin tehnici bine cunoscute în domeniul chimiei medicale. De exemplu, o grupare de amină liberă de pe agentul citotoxic poate fi atașată covalent la oligopeptida la capătul carboxi terminal, astfel încât se formează o legătură amidică. în mod similar, o legătură amidică poate fi formată prin cuplarea covalentă a unei grupări de amină a oligopeptidei și o grupare carboxil a agentului citotoxic. Pentru aceste scopuri poate fi utilizat un reactiv, cum ar fi o combinație de hexafluorofosfat de 2-(1 H-benzotriazol-l-il]-l, 3,3-tetrametiluronium (cunoscut ca HBTU) și hidrat de l-hidroxibenzotriazol (cunoscut ca HOBT), diciclohexilcarbodiimida (DCC), N-etil-N-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), difenilfosforilazidă (DPPA), hexafluorofosfat de benzotriazol-l-il-oxi-tr/s-(dimetilamino) fosfonium (DOP) și alții asemenea.
în plus, conjugatul prezentat poate fi format printr-o legătură non-peptidil între situl de clivare a PSA și un agent citotoxic. De exemplu, agentul citotoxic poate fi atașat covalent la capătul carboxi terminal al oligopeptidei prin intermediul unei grupări hidroxil de pe agentul citotoxic, formând astfel o legătură ester. Pentru acest scop poate fi folosit un reactiv, cum ar fi o combinație de HBTU și HOBT, o combinație de BOP și imidazol, o combinație de DCC și DMAP și altele asemenea. De asemenea, acidul carboxilic poate fi activat prin formarea esterului nitrofenil sau alții asemenea și au reacționat în prezență de DBU (1,8-diazabiciclo (5,4,0) undec-7-enă).
Conjugatul prezent poate fi format de asemenea prin atașarea oligopeptidei la agentul citotoxic prin intermediul unei unități linker. Astfel de unități linker includ, de exemplu, un diradical biscarbonil alchil, prin care o grupare de amină de pe agentul citotoxic este conectată cu o unitate linker pentru a forma o legătură amidică și capătul amino terminal al oligopeptidei este conectat cu celălalt capăt al unității linker, formând de asemenea o legătură de amidă. Alte astfel de unități linker care sunt stabile în mediul fiziologic când nu este prezent PSA liber, dar sunt clivabile prin PSA la situl de clivare proteolitică. în plus, unități linker pot fi utilizate astfel încât, prin clivarea la sitului de clivare proteolitic PSA, rămân atașate la agentul citotoxic, dar nu scade semnificativ activitatea citotoxică a unui astfel de derivat de agent citotoxic postclivare, când se compară cu un agent citotoxic nemodificat.
RO 116198 Bl
585
Un specialist în domeniu înțelege că în sinteza compușilor invenției poate fi necesară protejarea sau blocarea unor variate funcții reactive de pe compușii de plecare și intermediari, în timp ce o reacție dorită este realizată pe alte porțiuni ale moleculei. După ce reacțiile dorite sunt complete, sau la orice moment dorit, în mod normal astfel de grupări de protejare vor fi îndepărtate prin mijloace, de exemplu, hidrolitice sau hidrogenolitice. Astfel de etape de protecție și de deprotecție sunt convenționale în chimia organică. Un specialist în domeniu se referă la Proiective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed., Plenum Press, NY, NY (1973); și, Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, ed., John Wiley & Sons, NY, NY (1981) pentru prezentarea grupărilor protectoare care pot fi folosite în prepararea compușilor prezentei invenții.
Numai ca exemplu, grupări amino-protectoare folosite pot include, de exemplu, grupări Cq-Cqg alcanoil, cum ar fi formil, acetil, dicloroacetil, propionil, hexanoil, 3, 3dietilhexanoil, γ-clorobutil și altele asemenea; grupări (3.,-(3.,(-, alcoxicarbonil și C5-C15 ariloxicarbonil, cum ar fi terț-butoxicarbonil, benziloxicarbonil, aliloxicarbonil, 4nitrobenziloxicarbonil, fluorenilmetiloxicar-bonil și cinamoiloxicarbonil; haloȚCq-CqJaloxicarbonil, cum ar fi 2, 2, 2,-tricloretoxicarbonil; și gruparea Cq-Cqg arilalchil și alchenil, cum ar fi benzii, fenetil, alil, tritil și altele asemenea. Alte grupări aminoprotectoare folosite de obicei sunt cele în forma enaminelor preparate cu β-cetoesteri, cum ar fi metil sau etil acetoacetat.
Grupări carboxi-protectoare folosite pot include, de exemplu, grupări Cq-CqQ alchil, cum ar fi metil, terț-butil, decil; halo-Cq-CqQ alchil, cum ar fi 2,2,2-tricloetil și 2iodetil C5-C15 arilalchil, cum ar fi benzii, 4-metoxibenzil, 4-nitrobenzil, trifenilmetil, difenilmetil; Cq-C10 alcanoiloximetil, cum ar fi acetoximetil, propionoximetil și altele asemenea; și grupări, cum ar fi fenacil, 4-halo-fenacil, alil, dimetilalil, tri-{C^C3 alchil] silii, cum ar fi trimetilsilil, β-ρ-toluensulfeniletil, β-ρ-nitrofenil-trioetil, 2, 4, 6-trimetilbenzil, β-metiltioetil, ftalimidometil, 2, 4-dinitrofenilsulfenil, 2-nitrobenzhidril și grupări corespunzătoare.
Similar, grupări de protecție hidroxi pot include, de exemplu, gruparea formil, gruparea cloracetil, gruparea benzii, gruparea benzhidril, gruparea tritil, gruparea 4nitrobenzil, gruparea trimetilsilil, gruparea fenacil, gruparea terț-butil, gruparea metoximetil, gruparea tetrahidropiranil și altele asemenea.
Cu privire la realizarea preferată a unei oligopeptide combinate cu doxorubicină de tipul antibiotic antraciclinic, următoarele scheme de reacție ilustrează sinteza conjugărilor prezentei invenții:
590
595
600
605
610
615
RO 116198 Bl
SCHEMA DE REACȚIE I
OH
SCHEMA DE REACȚIE II
OH
RO 116198 Bl
SCHEMA DE REACȚIE III
675
680
685
690
SCHEMA DE REACȚIE IV
o J/,__________
H2NHN | oljgopeptida
700
705
OH
710
RO 116198 Bl
SCHEMA DE REACȚIE V
715
720
725
730 HS- o 11 k Ar—--—1 l | oligopeptidâ | o H
735
Schema de reacție VI ilustrează prepararea conjugaților oligopeptidelor prezentei invenții și agentul citotoxic de tip alcaloid de Vinca numit vinblastină. Este ilistrată atașarea capătului N-terminal al oligopeptidei la vinblastină (S. P. Kandukuri 740 et. al., J. Med. Chem. 28:1079-1088 (1995)). Totuși, conjugarea oligopeptidei la alte poziții și grupări funcționale ale vinblastinei și la capătului C-terminal al oligipeptidei este de așteptat, de asemenea, să asigure compuși utilizați în tratamentul cancerului de prostată.
Este, de asemenea, înțeles că pot fi preparate conjugate în care capătul N-ter74 5 minai al oligopeptidei din prezenta invenție este atașat covalent la un agent citotoxic, cum ar fi vinblastină, în timp ce capătului C-terminal este în mod simultan atașat la alt agent citotoxic, care poate fi același sau diferit, cum ar fi doxorubicina. Un astfel de conjugat policitotoxic poate oferi avantaje față de un conjugat care conține numai un agent citotoxic.
RO 116198 Bl
750
SCHEMA DE REACȚIE VI
OH
CO2CH3 vlnblastină
760
765
770
SCHEMA DE REACȚIE VI
OH
con3
775
780
785
CONH - oligopeptidă - C - NH2
RO 116198 Bl
Conjugatul oligopeptidă-agent citotoxic al prezentei invenții, în care ca agent citotoxic este preferată doxorubicina, poate fi descris prin formula generală de mai
în care:
oligopeptida este o oligopeptidă care este recunoscută specific prin antigen liber specific de prostată (PSA] și este capabilă să fie clivată proteolitic prin activitatea enzimatică a antigenului liber specific de prostată;
XL este absent sau este un aminoacid ales dintre:
a] fenilalanina,
b] leucina,
c] valina,
d] izoleucina,
e] (2-naftil)alanina,
f] ciclohexilalanina,
g] difenilalanina,
h] norvalina și
j) norleucina;
R este hidrogen sau -(C=C]R1; și
R1 este Cq-Cg-alchil sau arii.
într-o realizare preferată a conjugatului oligopeptidă-agent citotoxic, oligopeptida este un oligomer care cuprinde o secvență aminoacidă aleasă dintre:
a] AnsLyslleSerTyrGIn/Ser (SECVENȚA NR: 13),
b] LyslleSerTyrGIn/Ser (SECVENȚA NR: 14],
c] GlyGluAsnGlyValGInLysAspValSerGInXaaSerlIeTyr/SerGInThrGIu (SECVENȚA NR: 15],
d] GlyLysGlylleSerSerGInTyr/SerAsnThrGIuGluArgLeu (SECVENȚA NR: 2],
e] AsnLyslleSerTyrTyr/Ser (SECVENȚA NR: 127],
f] AsnLysAlaSerTyrGIn/Ser (SECVENȚA NR: 128],
g] SerTyrGIn/SerSer (SECVENȚA NR: 129]
Șl
h] hArgTyrGIn/SerSer în care Xaa este un aminoacid selectat dintre:
(SECVENȚA NR:141);
leucină, izoleucină, norleucină și valină; și
R este acetil, pivaloil sau benzoil.
RO 116198 Bl
Compușii următori sunt exemple specifice ale conjugatului oligopeptidă-agent citotoxic al invenției de față:
835 în care X este:
840
II
H2N-Asnl_yslleSerTyrGlnSer-C-C845
II
H2N -AsnLyslleSerTyrGInSerSer-C-C0
II H 2N -Asn LyslleSerTyrGI nSerSer Ser-C-CII
H2N -AsnLyslleSerTyrGInSerSerSerThr-C'C' 0 II
H2N -AsnLyslleSerTyrGInSerSerSerThrGIu-C-C0
II
H2N -AlaAsnLyslleSerTyrGInSerSerSerThrGIu-C-C0
II ACHN-AlaAsnLyslleSerTyrGInSerSerSerThr-C-CII
ACHN-AlaAsnLyslleSerTyrGInSerSerSerThrLeu-C'C·
II ACHN-AlaAsnLysAlaSerTyrGInSerAlaSerThrLeu-C-O0
II ACHN-AlaAsnLysAlaSerTyrGInSerAlaSerLeu-C-C0
II ACHN-AlaAsnLysAlaSerTyrGInSerSerSerLeu-C -C0
II ACHN-AlaAsnLysAlaSerTyrGInSerSerLeu-C-CII ACHN-SerTyrGInSerSerSerLeu-C “C0
II ACHN-hArgTyrGInSerSerSerLeu-C -C0
II ACHN-LysTyrGInSerSerSerLeu-C -C0
II
ACHN-LysTyrGInSerSerNIe-C-C(SECVENȚA NR: 13), (SECVENȚA NR: 16), (SECVENȚA NR: 17), (SECVENȚA NR: 10), (SECVENȚA NR: 3), (SECVENȚA NR: 11), (SECVENȚA NR: 117), (SECVENȚA NR: 70), (SECVENȚA NR: 118), (SECVENȚA NR: 119), (SECVENȚA NR: 120), (SECVENȚA NR: 121), (SECVENȚA NR: 144), (SECVENȚA NR: 145), (SECVENȚA NR: 124), (SECV IO NR: 146],
850
855
860
865
870
875
Agenți peptidil terapeutici, cum ar fi conjugații de față oligopeptidă-agent citotoxic, au gruparea amino terminală a oricărui substituent oligopeptidă protejat cu
RO 116198 Bl o grupare de protecție potrivită, cum ar fi acetil, benzoil și altele asemenea. Astfel de protecție a grupării amino reduce sau elimină degradarea enzimatică a agenților peptidil terapeutici prin acțiunea peptidazei amino exogene care este prezentă în plasma de sânge a animalelor cu sânge cald.
Conjugatele oligopeptidă-agent citotoxic ale invenției sunt administrate la pacienți sub forma unei compoziții farmaceutice care cuprinde un conjugat de formula (I) și un purtător acceptabil farmaceutic, excipient sau diluant al acestora, acceptabile farmaceutic. Așa cum s-a folosit, “acceptabil farmaceutic” se referă la acei agenți care sunt folosiți în tratamentul sau diagnosticarea unui animal cu sânge cald, incluzând, de exemplu, un om, cabalina, porcină, bovină, murină, canină, felină sau alt mamifer, precum și un avian sau alt animal cu sânge cald. Modul preferat de administrare este parenteral, în special pe cale intravenoasă, intramusculară, subcutanată, intraperitoneală sau intralimfatic. Astfel de formulări pot fi preparate folosind purtători, diluanți sau excipienți familiari unui om cu pregătire în domeniu. Vezi, de exemplu, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16thed., 1980, Mack Publishing Company, editat de către Osol et al. Astfel de compoziții pot include proteine, cum ar fi proteine serice, de exemplu albumina serică umană, tampoane sau substanțe care tamponează, cum ar fi fosfați, alte seruri, sau electroliți, și altele. Diluanți potriviți includ, de exemplu, apă sterilă, soluție salină izotonică, dextroză apoasă diluată, un alcool polihidric sau amestecuri de astfel de alcooli, de exemplu, glicerina, propilenglicol, polietilenglicol și altele asemenea. Compozițiile pot conține conservanți, cum ar fi alcool fenetil, metil și propil parabeni, timerosal și altele asemenea. Dacă se dorește, compoziția poate include aproximativ 0,05 până la aproximativ 0,20 procente în greutate dintr-un antioxodant, cum ar fi astabisulfit de sodiu sau bisulfit de sodiu. Pentru administrare intravenoasă, compoziția preferată va fi preparată astfel încât cantitatea administrată la pacient va fi de la aproximativ 0,01 g până la aproxomativ 1 g de conjugat. De preferat, cantitatea administrată va fi în domeniul de la aproximativ 0,2 g până la aproximativ 1 g de conjugat. Conjugatele invenției sunt eficiente după un domeniu total de dozaj care depinde de factori cum ar fi starea de boală pentru a fi tratată sau efectul biologic pentru a fi modificat, modul în care conjugatul este administrat, vârsta, greutatea și condiția pacientului, precum și alți factori, pentru a fi determinați prin tratamentul medical. Astfel, cantitatea administrată la orice pacient dat trebuie să fie determinată pe o bază individuală.
Un specialist în domeniu va aprecia că, deși reactivii specifici și condițiile de reacție sunt subliniate în exemplele următoare, modificarea care poate fi făcută are semnificația de a fi cuprinsă de către spiritul și scopul invenției. Preparările următoare și exemplele, așadar, au asigurat ilustrarea suplimentară a invenției și nu o limitare.
în continuare se prezintă 8 exemple de realizare în conformitate cu cele 7 fig., care reprezintă:
-fig. 1a și 1b: secvența aminoacidă a semenogelinei I: Secvența primară de aminoacid a semenogelinei I este ilustrată. (SECV ID NR: 1). Sunt arătate siturile de clivaj proteolitic PSA (cs) (numerotate în ordinea afinității relative a sitului față de hidroliza PSA) și fragmentele de proteină sunt numerotate în continuare plecând de la terminusurile amino;
-fig.2: afinitatea de clivaj a oligopeptidelor sintetice:
S-a preparat un set serie de oligopeptide sintetice și oligopeptidele s-au digerat cu
RO 116198 Bl
PSA liber enzimatic activ pentru timpi diferiți. Rezultatele sunt arătate în tabelul 2. ND = nedeterminat. S-a folosit codul dintr-o singură literă pentru aminoacizi; A = Ala, E = Glu, G = Gly, H = His, I = lle, K = Lys, L = Leu, N = Asn, Q = Gin, R = Arg, S = Ser, T = Thr, Y = Tyr;
-fig.3a și 3b: afinitatea de clivare a oligopeptidelor sintetice: s-au preparat oligopeptide sintetice și oligopeptidele s-au digerat cu PSA liber enzimatic activ pentru patru (4) ore. Procentul oligopeptidei care s-a clivat în această perioadă de timp este prezentat în listă. Rezultatele sunt arătate în tabelul 4;
-fig.4: datele citotoxicității conjugatelor oligopeptidă neactivabilă-doxorubicină: Datele figurii prezintă comparativ citotoxicitatea doxorubicinei și un conjugat al doxorubicinei legat covalent la o oligopeptidă (compus 12d), care nu conține situl de clivaj proteolitic PSA liber. IC50 pentru doxorubicină este 0,3 UM, în timp ce oligopeptidă acetilată doxorubicină modificată are un IC50 care a fost redus prin mai mult de 300 de ori. Acest conjugat nu are continuare HPLC detectabilă cu doxorubicină nemodificată. Oligopeptida singură nu are activitate de distrugere celulară detectabilă;
-fig.5: afinitatea de clivare a oligopeptidelor în conjugare cu doxorubicină prin PSA liberă in vitro;
-fig.6: afinitatea de clivare a oligopeptidelor în conjurare cu doxorubicină în mediul celular condiționat:
Pentru patru [4] ore au reacționat conjugate oligopeptide-doxorubicină, mediu de cultură care a fost menționat prin expunere la celule LNCAP (care sunt cunoscute a secreta PSA liber) sau celule DUPRO (care nu secretă PSA liber). Procentul conjugatului care este clivat enzimatic în oligopeptidă în această perioadă de timp este listat. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 6;
-fig.7: datele citotoxicității ale conjugatelor oligopeptidă clivabilă-doxorubicină: Datele din tabelul 7 arată citotoxicitatea (ca IC50) conjugatelor doxorubicinei legată covalent la o oligopeptidă care conține un sit de clivaj proteolitic PSA împotriva unei linii celulare de cancer care este cunoscută a selecta PSA liber. Arătată de asemenea pentru conjugate selectate este citotoxicitatea conjugatului față de o linie celulară (DUPRO) care nu secretă PSA liber.
S-au preparat conjugate oligopeptide-doxorubicină și conjugatele s-au digerat cu PSA liber enzimatic activ pentru 4 h. Procentul conjugatului care este clivat enzimatic în oligopeptidă în această perioadă de timp este prezentat în listă. Rezultatele sunt arătate în tabelul 5.
Exemplul 1. Identificarea sitului de pe Semenogelin de clivare mediate prin PSA
Lichefierea gelului seminal prin fragmentarea proteolitică a Semenogelin I (Lilja, H., Laurell, C.S., (1984) Scand.J.CIin. Lab. Invest. 44. 447-452). Se crede că fragmentarea proteolitică a Semenogelin este datorată în principal activității proteolitice a antigenului specific de prostată (Lilje, H., (1985) J.CIin.lnvest.76. 1899-1903). Utilizând secvența publicată a Semenogelin I (Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A., (1989) J. of Biol. Chem. 264, 1894-1900) (Figura 1) noi am desemnat primeri de reacție polimerazică în lanț pentru a clona cADN de Semenogelin dintr-o feșncă de cADN prostatic disponibilă (Clontech, Palo Alto, CA). cADN-ul de Semenogelin purificat se plasează în vectorul de expresie bacterian pTAC (Linemeyer, D.L., Kelly L. J., Minke, J.G., Gimenez-Gallego, G., De Saldo, J. și Thomas, K.A., (1987) Bio/Technology 5, 960-985). cADN-ul Semenogelin se desemnează astfel încât un
930
935
940
945
950
955
960
965
970
RO 116198 Bl epitop tubulină este plasat la capătul carboxi al proteinei Semenogelin. Proteina Semenogelin exprimată bacterian se purifică pe o coloană anticorp antitubulină. Proteina Semenogelin I purificată se amestecă cu antigenul specific de prostată preparat comercial (PSA) (York Biologicals Internațional, Stony Brook, NY) într-un raport molar 1OO la 1 (Semenogelin l/PSA) în Tris 12 mM pH 8,0, NaCI 25 mM, CaCI2 0,5 mM și s-a incubat pentru timpi diferiți. Digestul se fracționează prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă și se transferă prin electroforeză la hârtie de filtru ProBlott (Applied Biosystems, Inc., Foster Citz, CA)în tampon CAPS (Matsudaira, P., (1987), J. Biol. Chem. 252, 10035-10038). Hârtia de filtru ProBlott s-a colorat cu albastru Coomasie pentru a identifica noile fragmente de proteină Semenogelin I generate prin PSA. Noile fragmente s-au răzuit de pe filtru cu un scalpel și se supun determinării de secvență. După ce fragmentele proteolitice se identifică prin digestie la timp variabil, se realizează o reacție de digestie 10 min. Afinitatea PSA pentru 5 situri de clivare potențiale în semenogelin I se determină ca fiind următoarele: situsul 349/350 > situsul 375/376 > situsul 289/290 = situsul 315/316 > situsul 159/160. Afinitățile relative se derivă din intensitatea de culoare albastru comasie a fiecărui fragment peptidic generat prin PSA. Aceste intensități au rapoarte aproximative de 3:1:0,6:0, 3.
Exemplul 2. Prepararea oligopeptidelor care cuprind situsul de clivare mediată PSA □ligopeptidele se prepară prin sinteză în fază-solidă, folosind un protocol de cuplare dublă pentru introducerea aminoacizilor pe sintetizatorul automat de peptidă Applied Siosystems model 430A. Deprotejarea și îndepărtarea oligopeptidei din suportul rășină se realizează prin tratare cu acid fluorhidric lichid. Oligopeptidele au fost purificate prin cromatografie preparativă în lichid la presiune ridicată pe coloane de silica C18 în fază invensă folosind un gradient 10% de acid trifluoracetic apos/ acetonitril. Identitatea și omogenitatea oligopeptidelor se confirmă prin analiza compoziției aminoacide, cromatografie în lichid la presiune ridicată și analiza spectroscopică de masă cu bombardament de atomi rapizi. Oligopeptidele care s-au preparat prin această metodă sunt ilustrate în fig. 2.
Exemplul 3. Determinarea recunoașterii oligopeptidelor de către PSA liber
Oligopeptidele preparate cum s-a descris în exemplul 2 se dizolvă individual în tampon de digestie PSA (tr/s(hidroximetil) aminometan 12 mM pH 8,0, NaCI 25 mM, CaCI2 0,5 mM) și soluția se adăugă la PSA la un raport molar de 100 la 1. Reacția se stopează după timpi de reacție diferiți prin adiția de acid trifluoracetic (TFA) la un final 1% (volum/volum). Reacția stopată s-a analizat prin HPLC pe o coloană C18 în fază inversă, folosind un gradient de TFA 0,1% apos/acetonitril. Rezultatele determinărilor sunt arătate în fig.2. Alte oligopeptide preparate, cum se descrie în exemplul 2, se testează în același test în care reacția se stopează la 4 h. Aceste rezultate ale determinării sunt arătate în fig.3. îndepărtarea unui rest asparagină de la capătul amino terminal al oligopeptidei are ca urmare o scădere semnificativă a hidrolizei peptidei mediată PSA, în timp ce prezența restului acid glutamic la capătul carboxil al peptidei pare să nu fie esențial pentru recunoașterea de către PSA.
Exemplul 4. Prepararea conjugatelor oligopeptidă neclivabilă-doxorubicină
Derivații doxorubicinei prezentați în tabelul 3 se prepară folosind reacția generală următoare: La un amestec de doxorubicină (Sigma) și peptidă corespunRO 116198 Bl zătoare (preparată prin sinteză în fază solidă sau disponibilă comercial (Sigma)) în DMSO se adăugă HBTU și HOBT, împreună cu diizopropiletilamină și amestecul de reacție se agită peste noapte. Amestecul de reacție brut se purifică direct prin HPLC preparativă pe o coloană C-18 în fază inversă, folosind un gradient acid trifluoracetic (TPA) 0,1 % în acetonitril/TFA 0,1 % în apă.
1020
1025
1030
Compus R MS (ion inițial)
12a Ala-H 615
12b Ala-N-Ac 657
12c Ala-Ala-Ala-N-Ac 799,5
12d Ala-Ser-Ala-Gly-Thr-Pro-Gly-Ala-N-Ac 1199
1035
Exemplul 5. Determinarea PSA enzimatic activ din celule LNCaP
Activitatea enzimatică se demonstrează prin incubarea mediului fără ser LNCaP (concentrat de aproximativ 200 de ori) cu proteină recombinantă Semenogelin I. Aproximativ 0,5 pg de PSA reactiv imunologic în mediu condiționat concentrat (determinat prin HYBRIDTECH (Tandem E) elisa) se amestecă cu aproximativ 3 pg de Senemogelin I recombinant și s-a incubat pentru 4h la 37 °C. La sfârșitul incubării, amestecul digest se analizează prin proceduri Western Blot. Rezultatele arată că PSA purificat din semen și PSA din mediul condiționat LNCaP generează hărți proteolitice identice ale proteinei Semenogelin I recombinat. Astfel, celulele LNCaP produc PSA enzimatic activ. LNCaP este tumorigenic la șoareci fără păr și produce niveluri detectabile ale PSA circulant.
Exemplul 6. Prepararea conjugatelor oligopeptidă clivabilă-doxorubicin
Derivații doxorubicinei în care o oligopeptidă care este clivată proteolotic prin PSA liber este atașată covalent la amina de la gruparea zaharidică a doxorubicinei se prepară folosind următoarea reacție generală: La un amestec de doxorubicin (Sigma) și peptidă corespunzătoare (preparată prin sinteza în fază solidă cum s-a descris în exemplul 2) în DMSO, se adăugă HBTU și HOBT împreună cu diizopropiletilamină și amestecul de reacție se agită peste noapte. Amestecul de reacție brut se purifică direct prin HPLC preparativă pe o coloană C-18 în fază inversă, utilizând un gradient de acid trifluoracetic 0,1% (TFA) în acetonitril/TFA 0,1% în apă. Când grupările de amină reactive sunt prezente în peptidă, o astfel de funcționalitate se protejează tipic ca aduct fluorenilmetiloxicarbonil, care se îndepărtează prin tratament cu o amină secundară, cum ar fi piperidina și altele, asemenea ulterior conjugării cu doxorubicin.
1040
1045
1050
1055
1060
RO 116198 Bl
Conjugatele prezentate au o structură cu formula generală:
și pot fi reprezentate prin fraza “Ac-peptidă-DOX(3’J”. Conjugatele preparate prin această metodă sunt listate în tabelul 5 din fig.5.
Exemplul 7. Determinarea recunoașterii conjugatelor oligopeptidă-doxorubicin prin PSA liberă
Conjugatele preparate așa cum s-a descris în exemplul 7 se dizolvă individual în tampon de digestie PSA (tr/s(hidroximetil)-aminometan 12mM pH 8,0,NaCI 25 mM, CaCI2 Q,5 mM) și soluția se adăugă la PSA la o rată molară de 1OO la 1. Reacția se stopează după timpi diferiți de reacție, prin adiția de acid trifluoracetic (TFA) la un final 1% (volum/volum). Reacția stopată se analizează prin HPLC pe o coloană CI8 fazăinversă folosind un gradient TFA 1% apos/acetonitril. Rezultatele determinării sunt arătate în tabelul 5 din fig.5.
Exemplul 8. Determinarea clivării conjugatelor oligopeptidă-doxorubicină în mediu de celule condiționat
Mediul de celule condiționat MEM a fără ser [minus roșu fenol) se colectează trei zile după adiția mediului la linii celulare, fie LNCap fie Dupro (preparat cum s-a descris în J. Urology, 145:915-919 (1991)). Mediul se concentrează de 20 de ori folosind un concentrator Amicon® Centriprep™ cu o separare 10 OOO greutate moleculară. Mediul condiționat LNCap conținea proteina PSA liberă la o concentrație, în medie, de aproximativ 100 ng/ml, cum s-a determinat prin kit de imunodetecție Tandom®-E PSA. Nu a fost detectat PSA liber în mediul condiționat de celule Dupro.
Porții de 100 pl mediu condiționat concentrat se amestecă cu 35 pg dintr-un conjugat oligopeptidă-doxorubicin, cum se descrie în exemplul 6, și amestecul se incubează la 37°C pentru 0,4 și 24 h puncte de timp. Reacțiile se stopează prin adiție de ZnCI2 (la o concentrație finală 0,01 M) și se analizează prin HPLC pe o coloană CI8 fază-inversă folosind un gradient TFA 0,1% apos/acetonitril, pentru a determina procentul conjugatului peptidă-agent citotoxic care a fost digerat. Rezultatele determinării sunt arătate în tabelul 6 din fig.6.
Testul A. Testarea in vitro a citotoxicității derivaților peptidil ai doxorubicinei
Citotoxicitățile conjugatelor oligopeptidă neclivabilă-doxorubicin, preparate cum s-a descris în exemplu) 4, față de o linie de celule care este cunoscută a fi ucise prin doxorubicină nemodificată, s-au testat cu un test Alamar Slue. în mod specific, culturile de celule tumorale LNCaP de prostată, care sunt un izolat de adenocarcinom metastatic de prostată umană dintr-o biopsie cu acea a unui nodul limfatic (LNCaP.
FGC: American Type Culture Collection, ATCC CRL 1740), sau celule DuPRO în plăci cu 96 godeuri, s-au diluat cu mediu care conține concentrații variate dintr-un conjugat
RO 116198 Bl
1110
Asn Lys Ala Ser Tyr Gin / Ser Ser Tyr Gin / Ser Ser Lys Tyr Gin / Ser Ser dat (volum final godeu placă de 2OO pi). Celulele s-au incubat pentru 3 zile la 37 °C și apoi 20 pl de Alamar Blue s-a adăugat la godeul test. Celulele s-au incubat suplimentar și plăcile testate s-au citit într-un cititor EL-310 ELISA la două lungimi de undă 570 și 600 nm la 4 și 7h după adiție de Alamar Blue. Viabilitatea relativă în procente la concentrația variată a conjugatului testat s-a calculat apoi față de culturile de control (neconjugate]. De asemenea, s-au testat citotoxicitățile doxorubicinei nemodificate și oligopeptidei nemodificate. Fig.3 arată citotoxicitatea în date pentru un compus reprezentativ (Compus 12d).
Testul B. Test in vitro a citotoxicității derivaților peptidil ai doxorubicinei
Citotoxicitățile conjugatelor oligopeptidă-doxorubicină clivabile, preparate cum s-a descris în exemplul 6, față de o linie a celulelor care sunt cunoscute a fi distruse de către doxorubicin nemodificat, s-a testat cu un test Alamar Blue, cum s-a descris în testul A. în mod specific, culturile celulare ale celulelor LNCap ale tumorii de prostată sau celulelor DuPRO în plăci cu 96 godeuri s-au diluat cu mediu conținând concentrații diferite dintr-un conjugat dat (volum final godeu pe placă de 200 μΙ). Celulele s-au incubat pentru 3 zile la 37°C, 20 μΙ de Alamar Blue se adaugă la godeul test. Celulele s-au incubat suplimentar și plăcile de test s-au citit pe un cititor EL-310 ELISA la două lungimi de undă 570 și 600 nm la 4 și 7h după adăugare de Alamar Blue. Viabilitatea relativă în procente la concentrația variabilă a conjugatului testat s-a calculat apoi față de culturile control (neconjugate). Citotoxicitățile conjugatelor s-au comparat de asemenea la citotoxicitatea doxorubicinei nemodificate și oligopeptidei nemodificate testate în același test. Rezultatele acestui test sunt arătate în tabelul 7 din fig.7.

Claims (17)

  1. Revendicări
    1 .Oligopeptide sub formă de fragment peptidic de Semenogelin I sau un fragment peptidic modificat de Semenogelin I, în care câțiva sau toți aminoacizii din fragmentul peptidic au fost înlocuiți cu alți aminoacizi, oligopeptidele amintite fiind recunoscute și clivate proteolitic de către antigenul specific de prostată liber și oligomerii acestor oligopeptide, caracterizate prin aceea că, aminoacidul N-terminal sau aminoacidul C-terminal sau ambii sunt modificați, cu condiția ca această oligopeptidă să nu fie Semenogelin I și Semenogelin II.
  2. 2. Oligopeptide, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că, cuprind următoarele secvențe de aminoacizi:
    Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser (SECVENȚA NR: 13);
    Lys lle Ser Tyr Gin / Ser (SECVENȚA NR: 14);
    Gly Glu Asn Gly Val Gin Lys Asp Val Ser Gin Xaa Ser lle Tyr / Ser Gin Thr Glu (SECVENȚA NR: 15); Gly Lys Gly lle Ser Ser Gin Tyr / Ser Asn Thr Glu Glu Arg Leu (SECVENȚA NR: 2); Asn Lys lle Ser Tyr Tyr / Ser (SECVENȚA NR: 127); (SECVENȚA NR: 128); (SECVENȚA NR: 129); (SECVENȚA NR: 140);
    1115
    1120
    1130
    1135
    1140
    1145
    1150
    RO 116198 Bl sau hArg Tyr Gin / Ser Ser (SECVENȚA NR; 141);
    în care hArg este homoarginină, iar Xaa este orice aminoacid natural.
  3. 3. Oligopeptide, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizate prin aceea că, cuprind următoarele secvențe de aminoacizi:
    Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser
    Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ala
    Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser
    Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser
    Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu
    Gly Glu Asn Gly Val Gin Lys Asp Val Ser Gin Arg Ser lle Tyr / Ser Gin Thr Glu (SECVENȚA NR: 4);
    Gly Glu Asn Gly Val Gin Lys Asp Val Ser Gin Ser Ser lle Tyr / Ser Gin Thr Glu (SECVENȚA NR: 5); (SECVENȚA NR: 131); (SECVENȚA NR: 132); (SECVENȚA NR: 133); (SECVENȚA NR: 134); (SECVENȚA NR: 142); (SECVENȚA NR: 143);
    (SECVENȚA NR; 16); (SECVENȚA NR: 130);
    (SECVENȚA NR: 17);
    (SECVENȚA NR: 18);
    (SECVENȚA NR: 19);
    Ala Asn Lys lle Ser Tyr Tyr / Ser Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin / Ser Ser Tyr Gin / Ser Ser Thr Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Lys Tyr Gin / Ser Ser Ser hArg Tyr Gin / Ser Ser Ser sau
    Ser Tyr Gin / Ser Ser Leu (SECVENȚA NR:
  4. 4. Oligopeptide, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizate prin aceea că, cuprind următoarele secvențe de aminoacizi: Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu
    Gly Glu Asn Gly Val Gin Lys Asp Val Ser Gin Arg Ser lle Tyr / Ser Gin Thr Glu (SECVENȚA NR: 4);
    (SECVENȚA NR: 137); (SECVENȚA NR: 138); (SECVENȚA NR; 139);
    (SECVENȚA NR: 10); (SECVENȚA NR: 136);
    (SECVENȚA NR: 3);
    (SECVENȚA NR: 11);
    Ala Asn Lys lle Ser Tyr Tyr / Ser Ser Ala Asn Lys lle Ser Tyr Tyn / Ser Ala Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin / Ser Ala sau
    Ala Ser Tyr Gin / Ser Ser Leu (SECVENȚA NR: 94);
    (SECVENȚA NR: 21); (SECVENȚA NR: 22); (SECVENȚA NR: 23);
  5. 5.Oligopeptide, conform revendicărilor 1 și 2, caracterizate prin aceea că, cuprind următoarea secvență de aminoacizi:
    Gly Arg Lys Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu Glu Arg Arg Leu His Tyr
    Gly Glu Asn Gly (SECV ID NR: 6);
  6. 6.Oligopeptide, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că, cuprind următoarele secvențe de aminoacizi:
    Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser
    Asn Lys Val Ser Tyr Gin / Ser
    Asn Lys Met Ser Tyr Gin / Ser Ser
    RO 116198 Bl
    Asn Lys Leu Ser Tyr Gin / Ser Ser
    Asn Lys lle Thr Tyr Gin / Ser Ser Ser
    Asn Lys lle Ser Phe Gin / Ser Ser Ser
    Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr
    Asn Lys Leu Ser Tyr Asn / Ser Ser Ser Thr
    Asn Lys Leu Ser Tyr Gin / Thr Ser Ser Thr (SECVENȚA NR: 24]; (SECVENȚA NR: 25); (SECVENȚA NR: 26); (SECVENȚA NR: 27); (SECVENȚA NR: 28); (SECVENȚA NR: 29);
    1200
    1205
  7. 7.0ligopeptide, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că, cuprind următoarele secvențe de aminoacizi: Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Gin Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Asn Arg lle Thr Tyr Gin / Ser Ser Ser Asn Arg lle Ser Phe Gin / Ser Ser Ser Thr Asn Arg lle Ser Trp Gin / Ser Ser Ser Thr Asn Arg lle Ser Tyr Gin / Thr Ser Ser Thr Asn Lys lle Thr Tyr Gin / Thr Ser Ser Thr Asn Lys Leu Ser Tyr Gin / Thr Ser Ser Thr Gin Lys Leu Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Asn Arg Leu Ser Tyr Gin / Thr Ser Ser Thr Asn Lys Val Ser Phe Gin / Ser Ser Ser Thr Asn Arg Val Ser Trp Gin / Ser Ser Ser Thr Gin Lys Val Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Gin Lys lle Ser Tyr Gin / Thr Ser Ser Thr (SECVENȚA NR: 30); (SECVENȚA NR: 31); (SECVENȚA NR: 32); (SECVENȚA NR: 33); (SECVENȚA NR: 35); (SECVENȚA NR: 36); (SECVENȚA NR: 37); (SECVENȚA NR: 38); (SECVENȚA NR: 39); (SECVENȚA NR: 40); (SECVENȚA NR: 41); (SECVENȚA NR: 42); (SECVENȚA NR: 43); (SECVENȚA NR: 34);
    1210
    1215
    1220 sau
    Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr (SECVENȚA NR: 44);
  8. 8.Oligopeptide, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că, cuprind următoarele secvențe de aminoacizi:
    1225
    Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu-amidă Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Leu Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu-amidă Ac-Ala Asn Lys lle Ser TyrGIn/Ser Ser Ser Thr Leu-amidă Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ala Ser Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Lys Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Thr Glu-amidă Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser Gin Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ala Lys Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Thr Glu-amidă Ac-Ala Asn Lys Ser Tyr Gin / Ser Ser Thr Glu-amidă Ac-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin / Ser Ala Ser Thr Glu-amidă Ac-Ala Asn Glu lle Ser Tyr Gin / Ser Ala Ser Thr Glu-amidă Ac-Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser-amidă
    Ac-Lys lle Ser Tyr Gin / Ser Ser-amidă
    Ac-Ser Tyr Gin / Ser Ser Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Ser Tyr Gin / Ser Ser Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Tyr / Ser Ser Ser Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Tyr / Ser Ala Ser Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Ser Tyr Gin / Ser Ser Leu-amidă (SECVENȚA NR: 11); (SECVENȚA NR: 70); (SECVENȚA NR: 11); (SECVENȚA NR: 70);
    (SECVENȚA NR: 73);
    (SECVENȚA NR: 74);
    (SECVENȚA NR: 75);
    (SECVENȚA NR: 78); (SECVENȚA NR: 79); (SECVENȚA NR: 81); (SECVENȚA NR: 82);
    (SECVENȚA NR: 84);
    (SECVENȚA NR: 85); (SECVENȚA NR: 16); (SECVENȚA NR: 86); (SECVENȚA NR: 87);
    (SECVENȚA NR: 89); (SECVENȚA NR: 92); (SECVENȚA NR: 93); (SECVENȚA NR: 94);
    1230
    1235
    1240
    1245
    RO 116198 Bl
    Ac-Ala Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu-amidă
    Ac-Ala Asn Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu-amidă
    Ac-Ser Tyr Gin / Ser Ser Ser Thr Glu-amidă {SECVENȚA NR: 95);
    (SECVENȚA NR: 96);
    (SECVENȚA NR: 97);
    sau
    Ac-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin / Ser Ala Ser Cys-amidă (SECVENȚA NR: 98);
  9. 9. Oligopeptide, conform revendicărilor 1..8, caracterizate prin aceea că, se utilizează la determinarea activității proteolitice a antigenului liber specific al prostatei într-o probă, prin reacția unei oligopeptide definite în revendicările 1..8 cu proba, și detectarea dacă oligopeptida a fost clivată, prin analizarea amestecului oligopeptidăprobă prin cromatografie în lichid de înaltă performanță.
  10. 10. Oligopeptide, conform revendicărilor 1..8, caracterizate prin aceea că, se utilizează la identificarea compușilor care inhibă activitatea proteolitică a antigenului specific al prostatei într-o probă, prin reacția unei oligopeptide definite în revendicările 1 ..8 cu un antigen specific de prostată liber, în prezența unei substanțe test în care capacitatea substanței test de a inhiba activitatea proteolitică a antigenului specific de prostată este indicat prin creșterea clivajului substratului comparativ cu ceea ce s-a comparat la clivajul substratului în absența substanței test, și detectarea dacă oligopeptida a fost clivată, prin analizarea amestecului de reacție prin cromatografie în lichid de înaltă performanță.
  11. 11. Conjugat de oligopeptida, caracterizat prin aceea că, are în componență o oligopeptida definită în revendicările 1..8 atașată la un agent citotoxic printr-o legătură covalentă sau un linker chimic.
  12. 12. Conjugat de oligopeptidă, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că, agentul citotoxic este dintr-o clasă de agenți citotoxic selectată dintre următoarele clase: familia de medicamente a antraciclinei, medicamente tip alcaloizi din Vinca, mitomicine, bleomicină, nucleozide citotoxice, familia pteridine de medicamente diinene, estramustine, ciclofosfamida, podofilotoxine.
  13. 13. Conjugat de oligopeptidă, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că, agentul citotoxic este selectat dintre: doxorubicină, carminomicină, daunorumicină, aminopterină, metopterină, metotrepsin, dicloro-metotrexat, mitomicină C, porfiromicină, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurină, citozin arabinozidă, podofilotoxină, etoposidă, etoposidă fosfat, vinblastină, vincristină, leurosidină, vindesină, estramustină, cisplantină, ciclofosfamidă, leurosină.
  14. 14. Conjugat de oligopeptidă, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că, agentul citotoxic este selectat dintre doxorubicin și vinblastină sau un derivat citotoxic al acestora.
  15. 15. Conjugat de oligopeptidă, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că, prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale:
    RO 116198 Bl în care :
    oligopeptida este o oligopeptidă definită în revendicările 1 ..8,
    XL este absent sau este un aminoacid ales dintre: fenilalanină, leucină, valină, izoleucină, (2-naftil)alanină, ciclohexilalanină, difenilalanină, norvalină, norleucină, R este hidrogen sau -(C=O]R1; și
    R1 este C^Cg-alchil sau arii.
  16. 16.Conjugat de oligopeptidă, conform revendicărilor 11 și 15, caracterizat prin aceea că, oligopeptida este un oligomer care conține o secvență de aminoacizi selectată dintre:
    1295
    1300
    a) Asn Lys lle Ser Tyr Gin / Ser (SECVENȚA NR: 13]
    b) Lys lle Ser Tyr Gin / Ser (SECVENȚA NR: 14]
    c) Gly Glu Asn Gly Val Gin Lys Asp Val Ser Gin Xaa Ser lle Tyr / Ser Gin Thr Glu (SECVENȚA NR: 15]
    d) Gly Lys Gly lle Ser Ser Gin Tyr / Ser Asn Thr Glu Glu Arg Leu
    1305 (SECVENȚA NR: 2)
    e) Asn Lys lle Ser Tyr Tyr / Ser (SECVENȚA NR:127)
    f) Asn Lys Ala Ser Tyr Gin / Ser (SECVENȚA NR:128)
    g) Ser Tyr Gln/Ser Ser SECVENȚA NR:129)
    h) hArg Tyr Gin / Ser Ser (SECVENȚA NR:141) în care hArg este homoarginină și Xaa este un aminoacid natural;
    Xl este absent sau este un aminoacid, ales dintre: leucină, izoleucină, valin,
    R este acetil, pivaloil sau benzoil.
  17. 17.Conjugat de oligopeptidă, conform revendicării 11, caracterizat prin aceea că, prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale:
    1310
    1315
    1320
    1325 în care:
    (SECVENȚA NR: 13) (SECVENȚA NR: 16) (SECVENȚA NR; 17)
    1330 (SECVENȚA NR: 10)
    1335
    RO 116198 Bl
    H2N-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin Ser Ser Ser Thr Glu-C_£_ p
    AcHN-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin Ser Ser Ser Thr-C _β_
    O
    AcHN-Ala Asn Lys lle Ser Tyr Gin Ser Ser Ser Thr Leu-C _q_
    AcHN-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin Ser Ala Ser Thr Leu-C-G0
    AcHN-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin Ser Ala Ser Leu-C _q_
    AcHN-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin Ser Ser Ser Leu-C
    II AcHN-Ala Asn Lys Ala Ser Tyr Gin Ser Ser Leu-C -Ο0
    AcHN-Ser Tyr Gin Ser Ser Ser Leu-C _Q_
    II AcHN-hArg Tyr Gin Ser Ser Ser Leu-C -Q.
    AcHN-Lys Tyr Gin Ser Ser Ser Leu-C _q.
    AcHN-Lys Tyr Gin Ser Ser Ile-C _Q-
    (SECVENȚA N R: 3) (SECVENȚA NR : 11) (SECVENȚA NR: 117) (SECVENȚA NR : 70) (SECVENȚA NR: 118) (SECVENȚA NR: 119) (SECVENȚA NR: 120) (SECVENȚA NR: 121) (SECVENȚA NR: 144) (SECVENȚA NR: 145) (SECVENȚA NR: 124) (SECVENȚA NR: 146) 11, caracterizat prin
    Ι 8. Conjugat de oligopeptidă, conform revendicării aceea că, prezintă structura chimică corespunzătoare formulei generale:
    în care oligopeptida este oricare dintre oligopeptidele definite în revendicările 1...8.
    Președintele comisiei de examinare: biochim. Cretu Adina
RO96-02483A 1994-06-28 1995-06-07 Oligopeptida si conjugat al acesteia, clivate selectiv de antigenul specific de prostata RO116198B1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/267,092 US5599686A (en) 1994-06-28 1994-06-28 Peptides
US40483395A 1995-03-15 1995-03-15
PCT/US1995/008156 WO1996000503A1 (en) 1994-06-28 1995-06-07 Novel peptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO116198B1 true RO116198B1 (ro) 2000-11-30

Family

ID=26952210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO96-02483A RO116198B1 (ro) 1994-06-28 1995-06-07 Oligopeptida si conjugat al acesteia, clivate selectiv de antigenul specific de prostata

Country Status (27)

Country Link
US (1) US6143864A (ro)
EP (1) EP0771209B1 (ro)
JP (1) JPH10502619A (ro)
KR (1) KR100379351B1 (ro)
CN (1) CN1156964A (ro)
AT (1) ATE223224T1 (ro)
AU (1) AU689934B2 (ro)
BG (1) BG63453B1 (ro)
BR (1) BR9508151A (ro)
CA (1) CA2192957A1 (ro)
CZ (1) CZ381096A3 (ro)
DE (1) DE69528064T2 (ro)
DK (1) DK0771209T3 (ro)
ES (1) ES2182908T3 (ro)
FI (1) FI965225A (ro)
HK (1) HK1009038A1 (ro)
HU (1) HU220877B1 (ro)
MX (1) MX9700043A (ro)
NO (1) NO965592L (ro)
NZ (1) NZ290239A (ro)
PL (1) PL186341B1 (ro)
PT (1) PT771209E (ro)
RO (1) RO116198B1 (ro)
RU (1) RU2162855C2 (ro)
SK (1) SK164096A3 (ro)
UA (1) UA55371C2 (ro)
WO (1) WO1996000503A1 (ro)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5502037A (en) * 1993-07-09 1996-03-26 Neuromed Technologies, Inc. Pro-cytotoxic drug conjugates for anticancer therapy
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
DK0769967T3 (da) * 1994-08-19 2008-03-31 Wallone Region Konjugater der omfatter et antitumormiddel, og anvendelse heraf
WO1997014416A1 (en) * 1995-10-18 1997-04-24 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US5952294A (en) * 1996-07-31 1999-09-14 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptidyl prodrugs and methods of making and using the same
US5998362A (en) * 1996-09-12 1999-12-07 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US6177404B1 (en) 1996-10-15 2001-01-23 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
HRP970566A2 (en) * 1996-10-30 1998-08-31 Jones Deborah Defeo Conjugates useful in the treatment of prostate canser
US5948750A (en) * 1996-10-30 1999-09-07 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
DE69729389D1 (de) * 1996-11-06 2004-07-08 Nasa Protease-aktivierbare pseudomonas exotoxin-a-ähnliche proproteine
AU7582298A (en) 1997-05-19 1998-12-11 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Tissue specific prodrug
US6504014B1 (en) 1997-05-19 2003-01-07 The John Hopkins University Tissue specific prodrug
US6545131B1 (en) 1997-05-19 2003-04-08 The Johns Hopkins University Tissue specific prodrug
US6391305B1 (en) * 1997-09-10 2002-05-21 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
KR100580137B1 (ko) * 1997-12-02 2006-05-16 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드 전립선 암 치료에 유용한 접합체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1069906A1 (en) * 1998-03-05 2001-01-24 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostrate cancer
US6174858B1 (en) 1998-11-17 2001-01-16 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US7425541B2 (en) 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
US6649587B1 (en) 1999-04-30 2003-11-18 Slil Biomedical Corporation Polyamine analog conjugates and quinone conjugates as therapies for cancers and prostate diseases
US6482943B1 (en) 1999-04-30 2002-11-19 Slil Biomedical Corporation Quinones as disease therapies
AU4678300A (en) * 1999-04-30 2000-11-17 Slil Biomedical Corporation Novel polyamine analog conjugates and quinone conjugates as therapies for cancers and prostate diseases
DE60032784T2 (de) * 1999-10-07 2007-11-08 Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont Markerproteine für prostatakrebs
GB9924759D0 (en) 1999-10-19 1999-12-22 Merck Sharp & Dohme Process for preparing peptide intermediates
PL360826A1 (en) 2000-03-15 2004-09-20 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Peptidase-cleavable, targeted antineoplastic drugs and their therapeutic use
AU2001266853B2 (en) 2000-06-14 2005-02-17 Medarex, Inc. Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue
EP1219634A1 (en) * 2000-12-27 2002-07-03 Bayer Aktiengesellschaft Cytostatic-glycoconjugates having specifically cleavable peptidic linking units
WO2002081630A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of semenogelin in the diagnosis, prognosis and treatment of cancer
DK1567641T3 (da) * 2001-08-24 2012-08-27 Uvic Industry Partnerships Inc Proaerolysin indeholdende proteaseaktiveringssekvenser og fremgangsmåder til anvendelse til behandling af prostatacancer.
WO2003046180A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Genset S.A. Human cdnas and proteins and uses thereof
US7108976B2 (en) * 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
CA2503730C (en) * 2002-10-31 2011-10-18 Metabasis Therapeutics, Inc. Cytarabine monophosphate prodrugs
WO2005041981A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Kurume University Combination therapy of peptide vaccination and estramustine treatment
DE602006020867D1 (de) 2005-06-14 2011-05-05 Protox Therapeutics Inc Verfahren zur behandlung oder prävention gutartiger prostatahyperplasie unter verwendung modifizierter porenbildender proteine
JP5278873B2 (ja) * 2008-05-14 2013-09-04 国立大学法人九州工業大学 癌診断用試薬
US9046529B2 (en) 2009-04-10 2015-06-02 The Regents Of The University Of California Prostatitis-associated antigens and methods of use thereof
KR20110069618A (ko) * 2009-12-17 2011-06-23 주식회사 셀앤바이오 전립선암 진단용 키트 및 진단방법
CN106061984A (zh) 2014-02-13 2016-10-26 配体药物公司 前药化合物及其用途
EP3164136A4 (en) 2014-07-02 2018-04-04 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Prodrug compounds and uses therof
CA3087932A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Acetal compounds and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4296105A (en) * 1978-08-03 1981-10-20 Institut International De Pathologie Cellulaire Et Moleculaire Derivatives of doxorubicine, their preparation and use
US4277466A (en) * 1978-08-29 1981-07-07 Institut International De Pathologie Cellulaire Et Moleculaire Complexes of DNA and esters derived from daunorubicine, their preparation and use
US4446122A (en) * 1979-12-28 1984-05-01 Research Corporation Purified human prostate antigen
OA06421A (fr) * 1980-06-10 1981-09-30 Omnium Chimique Sa Procédé de préparation de dérivés N-(vinblastinoyl-23) d'acides aminés et de peptides.
HUT34212A (en) * 1983-04-29 1985-02-28 Omnichem Sa Process for the production of new vindblastin conjugates
FR2546163B1 (fr) * 1983-05-16 1987-10-09 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives acyles hydrosolubles de peptides ou d'amino-acides, leur preparation et leur application
EP0126344A2 (en) * 1983-05-20 1984-11-28 Abbott Laboratories Tripeptide esters of therapeutic agents
FR2583983B1 (fr) * 1985-06-07 1988-05-27 Centre Nat Rech Scient Nouvelles prodrogues macromoleculaires hydrosolubles, leur preparation et leur utilisation comme medicaments notamment antitumoraux et antiparasitaires
EP0232693A3 (fr) * 1985-12-16 1988-04-06 La Region Wallonne Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2626882B1 (fr) * 1988-02-08 1991-11-08 Ire Celltarg Sa Conjugues de derives de vinca comportant une chaine detergente en position c-3
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5220001A (en) * 1989-10-25 1993-06-15 Zaidan Hojim Biseibutsu Dong-A Pharm Co. Anthracycline glycoside derivatives
US5137877B1 (en) * 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
SE9002480D0 (sv) * 1990-07-23 1990-07-23 Hans Lilja Assay of free and complexed prostate-specific antigen
FR2678274A1 (fr) * 1991-06-25 1992-12-31 Medgenix Group Sa N-leucyl epirubicine application a titre de medicament antitumoral et procede de preparation.
US5288612A (en) * 1991-07-03 1994-02-22 The Scripps Research Institute Assay methods for detecting serum proteases, particularly activated protein C
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
DE4233152A1 (de) * 1992-10-02 1994-04-07 Behringwerke Ag Antikörper-Enzym-Konjugate zur Prodrug-Aktivierung
JPH08502889A (ja) * 1992-10-29 1996-04-02 トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ 前立腺癌の微小転移を検出する方法
AU6364094A (en) * 1993-03-12 1994-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Anthracyclines with unusually high activity against cells resistant to doxorubicin and its analogs
EP0804593A1 (en) * 1994-05-10 1997-11-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Recombinant hk2 polypeptide
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
US5599686A (en) * 1994-06-28 1997-02-04 Merck & Co., Inc. Peptides
DK0769967T3 (da) * 1994-08-19 2008-03-31 Wallone Region Konjugater der omfatter et antitumormiddel, og anvendelse heraf
AUPM769394A0 (en) * 1994-08-25 1994-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Assay for the detection of proteases

Also Published As

Publication number Publication date
EP0771209A4 (en) 2000-04-26
PT771209E (pt) 2002-12-31
JPH10502619A (ja) 1998-03-10
US6143864A (en) 2000-11-07
HU9603564D0 (en) 1997-02-28
NO965592D0 (no) 1996-12-27
NO965592L (no) 1997-02-28
KR970703780A (ko) 1997-08-09
ATE223224T1 (de) 2002-09-15
ES2182908T3 (es) 2003-03-16
WO1996000503A1 (en) 1996-01-11
AU689934B2 (en) 1998-04-09
BG63453B1 (bg) 2002-02-28
AU3092295A (en) 1996-01-25
PL317872A1 (en) 1997-04-28
MX9700043A (es) 1997-04-30
EP0771209A2 (en) 1997-05-07
NZ290239A (en) 1998-11-25
DE69528064D1 (de) 2002-10-10
HK1009038A1 (en) 1999-07-02
KR100379351B1 (ko) 2003-10-30
FI965225A (fi) 1997-02-26
HUT76350A (en) 1997-08-28
CA2192957A1 (en) 1996-01-11
BR9508151A (pt) 1999-03-30
RU2162855C2 (ru) 2001-02-10
SK164096A3 (en) 1997-06-04
FI965225A0 (fi) 1996-12-27
EP0771209B1 (en) 2002-09-04
UA55371C2 (uk) 2003-04-15
DK0771209T3 (da) 2002-10-07
DE69528064T2 (de) 2003-08-07
CZ381096A3 (en) 1997-04-16
CN1156964A (zh) 1997-08-13
PL186341B1 (pl) 2003-12-31
HU220877B1 (en) 2002-06-29
BG101077A (en) 1998-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO116198B1 (ro) Oligopeptida si conjugat al acesteia, clivate selectiv de antigenul specific de prostata
US5866679A (en) Peptides
US5599686A (en) Peptides
US6177404B1 (en) Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US5948750A (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US6391305B1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU715632B2 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU726434B2 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US5998362A (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US20070021350A1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU708475B2 (en) Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US20030232760A1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US20070129309A1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US20020115596A1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US20050119166A1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU714288B2 (en) Novel peptides
MXPA00005434A (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
CA2234763A1 (en) Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia