JPH10502619A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）により認識され且つ選択的に分解切断されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドタンパクが記載されている。生体外及び生体内において遊離ＰＳＡプロテアーゼ活性を測定するのに有用な、前記オリゴペプチドを含むアッセイも記載されている。前記オリゴペプチドと公知の細胞毒性物質を含む複合体を含む治療用薬剤も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ペプチド 発明の背景 １９９４年に米国で前立腺癌と診断された男子は２００，０００人と推定され 、３８，０００人の米国人男子が同疾患で死亡すると予想される（Ｇａｒｎｉｃ ｋ，Ｍ．Ｂ．（１９９４）．Ｔｈｅ Ｄｉｌｅｍｍａｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａ ｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ａｐｒｉｌ： ７２−８１）。このように、前立腺癌は米国男子で（皮膚癌を除いて）最も高頻 度に診断される悪性癌であり、米国男子では（肺癌に次いで）癌関連死亡原因の 第２位に挙げられている。 前立腺特異抗原（ＰＳＡ）はほとんどヒト前立腺上皮のみによって産生される １本鎖３３ｋＤａ糖タンパク質であり、ヒト精液中に０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌ の濃度で存在する（Ｎａｄｊｉ，Ｍ．，Ｔａｂｅｒ，Ｓ．Ｚ．，Ｃａｓｔｒｏ， Ａ．ら（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ ４８：１２２９；Ｐａｐｓｉｄｅｒｏ，Ｌ． ，Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．ら（１９８１）．ＪＮＣＩ ６６： ３７；Ｑｕｉ，Ｓ．Ｄ．， Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｆ．，Ｂｉｈａｒｔｚ，Ｄ．Ｌ．ら（１９９０），Ｊ． Ｕｒｏｌ．１４４：１５５０；Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｃ．，Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｌ ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｐ．ら（１９７９）．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｕｒｏｌ．１ ７：１５９）。単一の炭水化物単位がアスパラギン残基番号４５に結合しており 、合計分子量のうちの２〜３ｋＤａを占める。ＰＳＡはキモトリプシン様特異性 をもつプロテアーゼである（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｌａｕｒｅｌｌ ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｉｌｊａ，Ｈ．（１９９０）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１ ９４：７５５−７６３）。ＰＳＡは精子取込みゲル中の主要タンパク質であるセ メノジェリンＩ及びセメノジェリンII、並びにフィブロネクチンのタンパク分解 により射精で形成されるゲル構造の溶解に主に関与することが報告されている（ Ｌｉｌｊａ，Ｈ．（１９８５）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：１８９９ ；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｏｌｄｂｒｉｎｇ，Ｊ．，Ｒａｎｎｅｖｉｋ，Ｇ．ら（１ ９８７）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０：２８１；ＭｃＧｅｅ，Ｒ．Ｓ． ，Ｈｅｒｒ，Ｊ．Ｃ．（１９８８）．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．３９：４９９） 。ゲル形成タンパク質のＰＳＡに媒介されるタ ンパク分解は数個の可溶性セメノジェリンＩ及びセメノジェリンIIフラグメント と可溶性フィブロネクチンフラグメントを生成すると共に、射精液の液化と前進 運動性精子の放出をもたらす（Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｌａｕｒｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．（ １９８４）．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４４：４４７ ；ＭｃＧｅｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｅｒｒ，Ｊ．Ｃ．（１９８７）．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ ｒｏｄ．３７：４３１）。更に、ＰＳＡはＩＧＦＢＰ−３（インスリン様成長因 子結合タンパク質３）をタンパク分解し、ＩＧＦにＰＳＡ分泌細胞の成長を特異 的に刺激させるらしい（Ｃｏｈｅｎら，（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ． ＆ Ｍｅｔａ．７５：１０４６−１０５３）。 α１−アンチキモトリプシンに結合したＰＳＡは血清ＰＳＡの主要な分子形態 であり、検出される血清ＰＳＡの９５％までを占め得る（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓ ｏｎ，Ａ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｔ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｏ．ら（１９９３）．Ｊ．Ｕ ｒｏｌ．１５０：１００−１０５；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏ ｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ．（１９９１）．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６ １８−１６２５；Ｓｔｅｎ ｍａｎ，Ｕ．Ｈ．，Ｌｅｉｎｏｖｅｎ，Ｊ．，Ａｌｆｔｈａｎ，Ｈ．ら（１９９ １）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２２−２２６）。α１−アンチキモトリ プシンとの複合体形成にはＰＳＡの成熟酵素活性形態が必要であるので、前立腺 組織（正常、良性過形成、又は悪性組織）は主にこの形態のＰＳＡを放出するの に関与している（Ｍａｓｔ，Ａ．Ｅ．，Ｅｎｇｈｉｌｄ，Ｊ．Ｊ．，Ｐｉｚｚｏ ，Ｓ．Ｖ．ら（１９９１）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１７２３−１７ ３０；Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｇ．Ｉ．，Ｒｉｖｅｔ ｎａ，Ｍ．ら（１９９０）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３７５３−３７５７）。従って、前立腺ＰＳＡ分泌細胞の微環境でＰＳＡ はプロセシングを受け、阻害分子に結合していない成熟酵素活性形態で分泌され ると考えられる。ＰＳＡはα２−マクログロブリンとも安定な複合体を形成する が、その結果、ＰＳＡは封入され、ＰＳＡエピトープが完全に失われるので、こ の複合体形成の生体内意義は不明である。ＰＳＡの遊離非結合形態は血清ＰＳＡ の副次的フラクションを構成する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｂｊｏｒ ｋ，Ｔ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｏ．ら（１９９３）． Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１００−１０５；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎ ｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ．（１９９１）．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７ ：１６１８−１６２５）。血清ＰＳＡのこの形態の寸法は精液中のＰＳＡの寸法 に似ている（Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅ ｎ，Ｕ．（１９９１）．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５）が、 血清ＰＳＡの遊離形態がチモーゲンであるのか、成熟ＰＳＡの内部開裂不活性形 態であるのか、酵素活性を発現するＰＳＡであるのかはまだ分かっていない。し かし、ＰＳＡの遊離３３ｋＤａ形態の血清中検出濃度に比較して血清中の未反応 α１−アンチキモトリプシン及びα２−マクログロブリンはいずれも著しく（１ ００〜１０００倍）モル過剰であるので、血清ＰＳＡの遊離形態が酵素活性を発 現するとは思われない（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｔ．， Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｏ．，ら（１９９３）．Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１００−１０ ５；Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ，Ｕ． （１９９１）．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５）。 ＰＳＡの血清測定は前立腺癌治療をモニターするのに有用である（Ｄｕｆｆｙ ，Ｍ．Ｓ．（１９８９）．Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：３７９− ３８７；Ｂｒａｗｅｒ，Ｍ．Ｋ．とＬａｎｇｅ，Ｐ．Ｈ．（１９８９）．Ｕｒｏ ｌ．Ｓｕｐｐｌ．５：１１−１６；Ｈａｒａ，Ｍ．とＫｉｍｕｒａ，Ｈ．（１９ ８９）．Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１３：５４１−５４８）が、ＰＳＡ の上記正常血清濃度は良性前立腺過形成中や前立腺の外科的外傷後にも報告され ている（Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｄａｈｌｅｎ， Ｕ．（１９９１）．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８−１６２５）。血清Ｐ ＳＡは広範な転移性前立腺癌を示す前立腺摘出患者で高レベルで検出できるので 、前立腺転移が免疫反応性ＰＳＡを分泌することも知られている（Ｆｏｒｄ，Ｔ ．Ｆ．，Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｄ．Ｎ．，Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｒ．Ｗ．ら（１９８５） ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ ５７：５０−５５）。従って、ＰＳＡのタン パク分解活性により活性化され得る細胞毒性化合物は、前立腺細胞特異的である と共に、ＰＳＡ分泌前立腺転移にも特異的である筈である。 従って、本発明の目的は活性遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ） により選択的に酵素により切断される新規オリゴペプチドを提供することである 。 更に、本発明の目的は前記新規オリゴペプチドを利用した酵素活性ＰＳＡの定 量アッセイを提供することである。 本発明の更に別の目的は、細胞毒性物質と共に前記新規オリゴペプチドを含む 、前立腺癌の治療に有用な新規抗癌性組成物を提供することである。 本発明の別の目的は、新規抗癌性組成物を投与することからなる前立腺癌の治 療方法を提供することである。発明の要約 セメノジェリンＩが遊離ＰＳＡにより選択的にタンパク分解切断される数個の 切断点が同定された。本発明は、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）により認識され 且つタンパク分解切断されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドに関する。前記 オリゴペプチドは、生体外及び生体内で遊離ＰＳＡプロテアーゼ活性を測定する ことが可能なアッセイで有用である。更に、前記オリゴペプチドは該オリゴペプ チドと公知細胞毒性物質の複合体を含み且つ前立腺癌の治療に有用な治療薬に配 合することができる。図面の簡単な説明 図１ａ及び１ｂ．セメノジェリンＩの一次アミノ酸配列： セメノジェリンＩの一次アミノ酸配列を示す（配列番号１）。ＰＳＡタンパク分 解切断部位（ＣＳ）を示し（ＰＳＡ加水分解に向かって部位の相対親和性の順に 番号を付ける）、タンパク質フラグメントはアミノ末端から出発して順に番号を 付ける。 図２．合成オリゴペプチドの切断親和性： 合成オリゴペプチドのネスト組を調製し、オリゴペプチドを酵素活性遊離ＰＳＡ で時間を変えて消化した。結果を表２に示す。 ＮＤ＝測定せず。アミノ酸の１文字表記を使用する。Ａ＝Ａｌａ，Ｅ＝Ｇｌｕ， Ｇ＝Ｇｌｙ，Ｈ＝Ｈｉｓ，Ｉ＝Ｉｌｅ，Ｋ＝Ｌｙｓ，Ｌ＝Ｌｅｕ，Ｎ＝Ａｓｎ， Ｑ＝Ｇｌｎ，Ｒ＝Ａｒｇ，Ｓ＝Ｓｅｒ，Ｔ＝Ｔｈｒ，Ｙ＝Ｔｙｒ。 図３ａ及び３ｂ．合成オリゴペプチドの切断親和性： 合成オリゴペプチドを調製し、オリゴペプチドを酵素活性遊離ＰＳＡで４時間消 化した。この間に切断されるオリゴペプチドの百分率を示す。結果を表４に示す 。 図４．非切断性オリゴペプチド−ドキソルビシン複合体の細胞毒性データ： 本図のデータはドキソルビシンと、遊離ＰＳＡタンパク分解切断部位を含まない オリゴペプチド（化合物１２ｄ）に共有結合したドキソルビシンの複合体の比較 細胞毒性を示す。ドキソルビシンのＩＣ₅₀は０．３μＭであり、アセチル化オリ ゴペプチド修飾ドキソルビシンのＩＣ₅₀は３００倍以上も低下していた。この複 合体には、ＨＰＬＣで検出可能な非修飾ドキソルビシンが混在していなかった。 オリゴペプチド単独では細胞死滅活性は検出できなかった。 図５．ドキソルビシンに結合したオリゴペプチドの遊離ＰＳＡによる生体外切断 親和性： オリゴペプチド−ドキソルビシン複合体を調製し、複合体を酵素活性遊離ＰＳＡ で４時間消化した。この間にオリゴペプチドで酵素切断される複合体の百分率を 示す。結果を表５に示す。 図６．細胞条件付け培地におけるドキソルビシンに結合したオリゴペプチドの切 断親和性： （遊離ＰＳＡを分泌するとして知られている）ＬＮＣａＰ又は（遊離ＰＳＡを分 泌しない）ＤｕＰＲＯ細胞に暴露することにより条件付けしておいた細胞培地と オリゴペプチド−ドキソルビシン複合体を４時間反応させた。この間にオリゴペ プチドで 酵素切断される複合体の百分率を示す。結果を表６に示す。 図７：切断可能なオリゴペプチド−ドキソルビシン複合体の細胞毒性データ： 表７のデータは遊離ＰＳＡを分泌するとして知られている癌細胞系に対する遊離 ＰＳＡタンパク分解切断部位を含むオリゴペプチドに共有結合したドキソルビシ ンの複合体の細胞毒性を（ＩＣ₅₀として）示す。選択複合体については、遊離Ｐ ＳＡを分泌しない細胞系（ＤｕＰＲＯ）に対する複合体の細胞毒性も示す。発明の詳細な説明 本発明は、遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）により特異的に認識され且つ遊離前 立腺特異抗原の酵素活性によりタンパク分解切断され得る新規オリゴペプチドに 関する。前記オリゴペプチドは下記アミノ酸配列： （式中、ｈＡｒｇはホモアルギニンであり、Ｘａａは任意の天然アミノ酸である ）から選択されるアミノ酸配列を含むオリゴマーを含む。 本発明の１態様において、オリゴペプチドは下記アミノ酸配列： から選択されるアミノ酸配列を含むオリゴマーを含む。 本発明のより好適な態様において、オリゴペプチドは下記アミノ酸配列： から選択されるアミノ酸配列を含むオリゴマーを含む。 本発明の別の態様において、オリゴペプチドは下記アミノ酸配列： から選択されるアミノ酸配列を含むオリゴマーを含む。 上記及び発明の詳細な説明中の他の箇所で使用する「アミノ酸配列を含むオリ ゴマー」なる記載は、そのアミノ酸配列中に指定アミノ酸配列を含み、従って、 指定アミノ酸配列内で遊離ＰＳＡによりタンパク分解切断される約６〜約１００ アミノ酸残基のオリゴマーを表す。例えば下記オリゴマー： はアミノ酸配列： を含み、従って、本発明に該当する。このようなオリゴマーは セメノジェリンＩ及びセメノジェリンIIを含まないとみなす。 更に、本発明はＮ末端アミノ酸又はＣ末端アミノ酸又は両方の末端アミノ酸が 修飾されているオリゴマーを含むともみなす。このような修飾の非限定的な例と しては、Ｎ末端のアミノ基のアシル化や、Ｃ末端のカルボン酸に置換するアミド の形成が挙げられる。このような部分の付加はオリゴマーの固相合成中に実施す ることができ、例えば、アミンを介してＣ末端アミノ酸を固相樹脂に結合し、オ リゴマーを樹脂から酸で切断するとアミド部分が得られる。例えば下記化合物が 上記「アミノ酸配列を含むオリゴマー」の非限定的な例であるとみなされる。 元のオリゴペプチドの生物学的活性が修飾後のオリゴペプチドで保存される限 り、生物学的に活性なオリゴペプチド中の所定のアミノ酸を他の同族、等電及び ／又は等電子アミノ酸に置換してもよいことは、ペプチド化学技術に通常の知識 を有する者であれば容易に理解されよう。アミノ酸置換の非限定的な例を以下に 挙げる。元のアミノ酸 置換アミノ酸 Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌｇ Ｌｙｓ，オルニチン Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｎｌｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｎｌｅ Ｌｙｓ Ａｒｇ，オルニチン Ｍｅｔ Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｎｌｅ，Ｖａｌ オルニチン Ｌｙｓ，Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｙｒ，Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｐｈｅ，Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ，Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ，Ｉｌｉ，Ｍｅｔ，Ｎｌｅ 従って、例えば下記オリゴペプチドを当業者に周知の技術により合成すること ができ、遊離ＰＳＡによりタンパク分解切断されると予想される： 同様に、下記オリゴペプチドも当業者に周知の技術により合成することができ 、遊離ＰＳＡによりタンパク分解切断されると予想される： アミノ酸配列中の挿入記号「｜」は、オリゴペプチドが遊離ＰＳＡによりタン パク分解切断される該当配列中の点を示す。 本発明は更に、組成物中のタンパク分解遊離ＰＳＡ活性の定量方法にも関する 。このようなアッセイシステムは所定の体液 及び組織中に存在する遊離ＰＳＡの量を定量できるので、本発明の重要な側面で ある。このようなアッセイは遊離ＰＳＡの単離及び精製を追跡できるのみならず 、遊離ＰＳＡのタンパク分解活性の阻害剤のスクリーニングアッセイにも応用で きる。アッセイ方法は一般に、単に酵素活性遊離ＰＳＡを含む疑いのある組成物 がオリゴペプチドをタンパク分解切断する能力を測定するものである。 典型的には、アッセイプロトコルは上記オリゴペプチドの１種を使用して実施 される。他方、切断部位を含むオリゴペプチドを標識し、未切断オリゴペプチド と切断後に残存する標識を含むオリゴペプチドの部分との両者でこのような標識 （例えば放射性標識）の出現を測定できるようにアッセイを構成しても特定の効 果が得られる。 本発明は更に、遊離ＰＳＡのタンパク分解活性を阻害する化合物（以下、候補 化合物と呼ぶ）の同定方法にも関する。このスクリーニング法は、候補化合物が タンパク構造であるかペプチド構造であるかに関係なく、阻害目的等の機能をも つ任意の候補化合物の一般同定に有用であると考えられる。 従って、本発明は試験物質が遊離ＰＳＡのタンパク分解活性 を阻害する能力の測定方法にも関し、該方法は、 （ａ）遊離前立腺特異抗原により認識され且つ選択的にタンパク分解切断される アミノ酸配列を含む基質を試験物質の存在下で遊離前立腺特異抗原と反応させる 段階と、 （ｂ）試験物質の不在下の基質の切断に比較した基質の切断の減少により、試験 物質が前立腺特異抗原のタンパク分解活性を阻害する能力を測定することにより 、基質が切断されたか否かを検出する段階とを含む。 候補スクリーニングアッセイは極めて簡単に設定及び実施することができ、上 記タンパク分解活性測定アッセイと多くの点で関連している。例えば、遊離ＰＳ Ａの比較的精製された調製物を得た後は、好ましくは阻害物質を含む以外はＰＳ Ａに切断機能を発揮させることが可能な条件下で試験物質をタンパク分解調製物 と単に混合することが望ましい。例えば、典型的には上記オリゴペプチド等のよ うにＰＳＡ特異的切断部位をもつ公知オリゴペプチドを所定量混合物に加えるこ とが望ましい。こうして、試験物質が試験物質の存在下でオリゴペプチドの切断 を相対的に減少させる能力を測定することができる。 従って、試験物質の相対阻害能を評価するためには、付加試 験物質の不在下の遊離ＰＳＡの活性を試験物質の存在下の活性と比較して測定又 は他の方法で調べることが望ましい。 本発明は更に、前立腺癌の治療に有用な新規抗癌組成物に関する。該組成物は 、直接又は化学的リンカーを介して細胞毒性物質と共有結合した本発明のオリゴ ペプチドを含む。オリゴペプチドと細胞毒性物質のこのような組み合わせを複合 体と呼ぶことができる。理想的には、ＰＳＡタンパク分解切断部位を含むオリゴ ペプチドが直接又は化学的リンカーを介して細胞毒性物質に結合しており且つ無 傷であるとき、細胞毒性物質の細胞毒性活性は著しく低いか又はゼロである。同 じく理想的には、結合オリゴペプチドが切断部位でタンパク分解切断されると、 細胞毒性物質の細胞毒性活性は著しく増加するか又は未修飾細胞毒性物質の活性 に戻る。本発明のこの側面を実施するのに必須ではないが、本発明のこの側面の 最適態様は、オリゴペプチドと任意に存在する化学的リンカーが遊離ＰＳＡ又は 組織近傍に存在する任意の他の天然タンパク分解酵素のタンパク分解活性により 細胞毒性物質から分離され、未修飾細胞毒性物質をタンパク分解切断部位の生理 的環境に放出するような複合体である。 直接共有結合を介するか又は化学的リンカーを介するかに拘わらず細胞毒性物 質に結合した本発明のオリゴペプチドは、遊離ＰＳＡにより最も顕著に認識され 、遊離ＰＳＡにより最も容易にタンパク分解切断されるオリゴペプチドである必 要はないとみなされる。即ち、このような抗癌組成物に配合するのに選択される オリゴペプチドは、遊離ＰＳＡによるその選択的タンパク分解切断と、このよう な切断に起因する細胞毒性物質−タンパク分解残基複合体（又は理想的状況と思 われる場合には未修飾細胞毒性物質）の細胞毒性活性の両面から選択される。 本発明の複合体は所与の生物学的応答を修飾するために使用することができる ので、細胞毒性物質は慣用化学的治療物質に制限されない。例えば、細胞毒性物 質は所望の生物学的活性をもつタンパク質又はポリペプチドであり得る。このよ うなタンパク質としては、例えば毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモ ナス外毒素又はジフテリア毒素）、タンパク質（例えば腫瘍壊死因子、α−イン ターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組 織プラスミノーゲンアクチベーター）、又は生物応答調節剤（例えばリンホカイ ン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキ ン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マク ロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（ 「Ｇ−ＣＳＦ」、又は他の成長因子）が挙げられる。 好適細胞毒性物質としては一般に、アルキル化剤、抗増殖剤、チューブリン結 合剤等が挙げられる。細胞毒性物質の好適類としては、例えばアントラサイクリ ンファミリーの薬剤、ビンカ薬剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性 ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬剤、ジイネン及びポドフィロトキシン が挙げられる。これらの類のうちで特に有用なものとしては、例えばドキソルビ シン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート 、メトプテリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマ イシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド 、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体（例えばエトポシド又はリ ン酸エトポシド）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ルーロシ ジン、ビンデンン、ルーロシン等が挙げられる。他の有用な細胞毒性物質として は、エストラムスチン、シスプラチン及びシクロホスフ ァミドが挙げられる。当業者は、所望の化合物を化学的に修飾して該化合物の反 応を本発明の複合体の製造目的に好適にすることができよう。 本発明に非常に好適な細胞毒性物質の群としては、下式の薬剤が挙げられる。式（１）のメトトレキセート群 （式中、Ｒ¹²はアミノ又はヒドロキシであり、Ｒ⁷は水素又はメチルであり、Ｒ⁸ は水素、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードであり、Ｒ⁹はヒドロキシ又はカ ルボン酸の塩を補う部分である）；式（２）のマイトマイシン群 （式中、Ｒ¹⁰は水素又はメチルである）；式（３）のブレオマイシン群 ［式中、Ｒ¹¹はヒドロキシ、アミノ、Ｃ₁−Ｃ₃アルキルアミノ、ジ（Ｃ₁−Ｃ₃ア ルキル）アミノ、Ｃ₄−Ｃ₆ポリメチレンアミノ、 である］；式（４）のメルファラン 式（５）の６−メルカプトプリン 式（６）のシトシンアラビノシド 式（７）のポドフィロトキシン （式中、Ｒ¹³は水素又はメチルであり、Ｒ¹⁴はメチル又はチエニルである）又は そのリン酸塩；式（８）のビンカアルカロイド群薬剤 ［式中、Ｒ¹⁷及びＲ¹⁸が単独であるとき、Ｒ¹⁵はＨ、ＣＨ₃又はＣＨＯであり、 Ｒ¹⁷及びＲ¹⁸が一緒になってこれに結合した炭素と共にオキシランを形成すると き、Ｒ¹⁸はＨであり、Ｒ¹⁶及びＲ¹⁷の一方はエチルであり且つ他方はＨ又はＯＨ であり、その場合、Ｒ¹⁶はエチルであり、Ｒ¹⁹は水素、（Ｃ₁−Ｃ₃アルキル）− ＣＯ、又はクロロ置換（Ｃ₁−Ｃ₃アルキル）−ＣＯである］；式（９）のジフルオロヌクレオシド （式中、Ｒ²¹は式： の１種の塩基であり、ここでＲ²²は水素、メチル、ブロモ、フルオロ、クロロ又 はヨードであり、Ｒ²³は−ＯＨ又は−ＮＨ₂であり、Ｒ²⁴は水素、ブロモ、クロ ロ又はヨードである）；式（１０）のアントラサイクリン系抗生物質 ［式中、Ｒ¹は−ＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＣＯ（ＣＨ₂）₃ＣＨ₃、又は− ＣＨ₂ＯＣＯＣＨ（ＯＣ₂Ｈ₅）₂であり、Ｒ³は−ＯＣＨ₃、−ＯＨ又は−Ｈであり 、Ｒ⁴は−ＮＨ₂、−ＮＨＣＯＣＦ₃、４−モルホリニル、３−シアノ−４−モル ホリニル、１−ピペリジニル、４−メトキシ−１−ピペリジニル、ベンジルアミ ン、ジベンジルアミン、シアノメチルアミン、又は１−シアノ−２−メトキシエ チルアミンであり、Ｒ⁵は−ＯＨ、−ＯＴＨＰ又は−Ｈであり、Ｒ⁶は−ＯＨ又は −Ｈであり、但し、Ｒ⁵が−ＯＨ又は−ＯＴＨＰであるとき、Ｒ⁶は−ＯＨ以外の ものである］；エストラムスチン（１１） シクロホスファミド（１２） 最適薬剤は上記式（１０）のアントラサイクリン系抗生物質薬剤である。この 構造式が当該技術分野で種々の属名又は慣用名で呼称されている薬剤又は薬剤誘 導体である化合物を含むことは当業者に理解されよう。下表１は、本発明で使用 するのに特に好適な多数のアントラサイクリン系薬剤とその属名又は慣用名を示 す。 表１に示す化合物のうちで最適な薬剤はドキソルビシンである。ドキソルビシ ン（本明細書中では「ＤＯＸ」とも呼ぶ）は、Ｒ₁が−ＣＨ₂ＯＨであり、Ｒ₃が −ＯＣＨ₃であり、Ｒ₄が−ＮＨ₂であり、Ｒ₅が−ＯＨであり、Ｒ₆が−Ｈである 式（１０）のアントラサイクリンである。 本発明のオリゴペプチド、ペプチドサブユニット及びペプチド誘導体（「ペプ チド類」とも呼ぶ）は、慣用ペプチド合成法、好ましくは固相技術によりその成 分アミノ酸から合成することができる。その後、ペプチドを逆相高性能液体クロ マトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製する。 標準ペプチド合成法は例えば次の文献に開示されている。Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ら，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｖｏｌ．Ｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ １９６５；Ｂｏｄａｎｓｋｙら，“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９６６；ＭｃＯｍｉｅ （編）“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ”，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３；Ｂａｒａｎｙら，“Ｔ ｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏ ｌｏｇｙ”２，第１章，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８０；及びＳｔｅ ｗａｒｔら，“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ”，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４。こ れらの文献の教示は参考資料として本明細書の一部に加える。 ＰＳＡ切断部位を含むオリゴペプチドと細胞毒性物質を含む本発明の複合体は 、医療化学分野で周知の技術により合成することもできる。例えば、細胞毒性物 質上の遊離アミン部分をオリゴペプチドのカルボキシル末端に共有結合してアミ ド結合を形成すればよい。また、オリゴペプチドのアミン部分と細胞毒性物質の カルボキシル部分を共有結合することによりアミド結合を形成してもよい。これ らの目的には、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，３，３−テ トラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵとして知られる） と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴとして知られる）の組み 合わせ、ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３− ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジフェニルホスホリルア ジド（ＤＰＰＡ）、ベンゾトリアゾール１−イルオキシトリス（ジメチ ルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）等の反応剤を使 用することができる。 更に、本発明の複合体は、ＰＳＡ切断部位と細胞毒性物質の非ペプチド結合に より形成することもできる。例えば、細胞毒性物質上のヒドロキシル部分を介し て細胞毒性物質をオリゴペプチドのカルボキシル末端に共有結合し、エステル結 合を形成すればよい。この目的には、ＨＢＴＵとＨＯＢＴの組み合わせ、ＢＯＰ とイミダゾールの組み合わせ、ＤＣＣとＤＭＡＰの組み合わせ等の反応剤を使用 することができる。ニトロフェニルエステル等を形成することによってカルボン 酸を活性化させ、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク−７ −エン）の存在下で反応させてもよい。 本発明の複合体は、リンカー単位を介してオリゴペプチドを細胞毒性物質に結 合することにより形成することもできる。このようなリンカー単位としては例え ばビスカルボニルアルキルジラジカルが挙げられ、細胞毒性物質上のアミン部分 をリンカー単位と結合してアミド結合を形成し、オリゴペプチドのアミノ末端を リンカー単位の他端と結合して同様にアミド結合を形成する。遊離ＰＳＡの不在 下では生理的環境に対しては安定で あるが、ＰＳＡタンパク分解切断部位の切断により切断可能な他のこのようなリ ンカー単位も予想される。更に、ＰＳＡタンパク分解切断部位を切断しても細胞 毒性物質に結合し続けるが、未修飾細胞毒性物質に比較するとこのような切断後 細胞毒性物質誘導体の細胞毒性活性を有意に低下しないようなリンカー単位も使 用できる。 本発明の化合物を合成するには、分子の他の部分で所望の反応が実施される間 に出発化合物及び中間体上の種々の反応性官能基を保護又はブロックする必要が あることが当業者に理解されよう。所望の反応の完了後、又は任意の所望時点で 、一般にこのような保護基は例えば加水分解又は水素添加分解手段により除去さ れる。このような保護及び脱保護段階は有機化学で慣用である。本発明の化合物 の製造に有用であり得る保護基の教示については、当業者はＰｒｏｔｅｃｔｉｖ ｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，ＭｃＯｍｉｅ 編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９７３）及びＰｒｏｔｅｃｔｉ ｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ，Ｇｒｅｅｎ ｅ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅy ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９８１）を参照さ れたい。 単なる例示として有用なアミノ保護基を挙げると、例えばＣ₁−Ｃ₁₀アルカノ イル基（例えばホルミル、アセチル、ジクロロアセチル、プロピオニル、ヘキサ ノイル、３，３−ジエチルヘキサノイル、γ−クロロブチル等）；Ｃ₁−Ｃ₁₀ア ルコキシルカルボニル及びＣ₅−Ｃ₁₅アリールオキシカルボニル基（例えば第３ ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、４ −ニトロベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメチルオキシオルボニル及び シンナモイルオキシカルボニル）；ハロ−（Ｃ₁−Ｃ₁₀）−アルコキシカルボニ ル（例えば２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）；並びにＣ₁−Ｃ₁₅ア リールアルキル及びアルケニル基（例えばベンジル、フェニチル、アリル、トリ チル）等である。他の一般に使用されるアミノ保護基は、β−ケトエステル類（ 例えばメチル又はエチルアセトアセテート）で調製したエナミン形態の基である 。 有用なカルボキシ保護基としては、例えばＣ₁−Ｃ₁₀アルキル基（例えばメチ ル、第３ブチル、デシル）；ハロ−Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル（例えば２，２，２−ト リクロロエチル及び２−ヨードエチル）；Ｃ₅−Ｃ₁₅アリールアルキル（例えば ベンジ ル、４−メトキシベンジル、４−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、ジフェ ニルメチル）；Ｃ₁−Ｃ₁₀アルカノイルオキシメチル（例えばアセトキシメチル 、プロピオンオキシメチル等）；並びにフェナシル、４−ハロフェナシル、アリ ル、ジメチルアリル、トリ（Ｃ₁−Ｃ₃アルキル）シリル（例えばトリメチルシリ ル）、β−ｐ−トルエンスルホニルエチル、β−ｐ−ニトロフェニルチオエチル 、２，４，６−トリメチルベンジル、β−メチルチオエチル、フタルイミドメチ ル、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル、２−ニトロベンズヒドリル及び関 連基等の基が挙げられる。 また、有用なヒドロキシ保護基としては、例えばホルミル基、クロロアセチル 基、ベンジル基、ベンズヒドリル基、トリチル基、４−ニトロベンジル基、トリ メチルシリル基、フェナシル基、第３ブチル基、メトキシメチル基、テトラヒド ロピラニル基等が挙げられる。 アントラサイクリン系抗生物質ドキソルビシンと組み合わせたオリゴペプチド の好適態様に関して、下記反応図式により本発明の複合体の合成を説明する。 反応図式VIは本発明のオリゴペプチドとビンカアルカロイド細胞毒性物質ビン ブラスチンの複合体の製造を示す。図ではオリゴペプチドのＮ末端をビンブラス チンに結合している（Ｓ．Ｐ．Ｋａｎｄｕｋｕｒｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２８：１０７９−１０８８（１９８５））。しかし、オリゴペプチドを他の位置 でビンブラスチンの官能基と結合しても、オリゴペプチドのＣ末端で結合しても 、前立腺癌の治療に有用な化合物が得られると予想される。 本発明のオリゴペプチドのＮ末端を１種の細胞毒性物質（例えばビンブラスチ ン）と共有結合すると同時に、Ｃ末端を同一又は異なる細胞毒性物質である別の 細胞毒性物質（例えばドキソルビシン）と結合しても複合体を製造できることも 理解されよう。このような多細胞毒性複合体は、ただ１種の細胞毒性物質を含む 複合体よりも優れた利点を提供し得る。 細胞毒性物質が好適細胞毒性物質ドキソルビシンである本発明のオリゴペプチ ド−細胞毒性物質複合体は、下記一般式Ｉ： ［式中、 オリゴペプチドは遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）により特異的に認識され且つ遊 離前立腺特異抗原の酵素活性によりタンパク分解切断することが可能なオリゴペ プチドであり、 Ｘ_Lは不在であるか又は、 ａ）フェニルアラニン、 ｂ）ロイシン、 ｃ）バリン、 ｄ）イソロイシン、 ｅ）（２−ナフチル）アラニン、 ｆ）シクロヘキシルアラニン、 ｇ）ジフェニルアラニン、 ｈ）ノルバリン、及び ｊ）ノルロイシンから選択されるアミノ酸であり、 Ｒは水素又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ¹であり、 Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₆−アルキル又はアリールである］ により表すことができる。 オリゴペプチド−細胞毒性物質複合体の好適態様において、オリゴペプチドは （式中、Ｘａａは任意の天然アミノ酸である）から選択されるアミノ酸配列を含 むオリゴマーであり、 Ｘ_Lは不在であるか又は、 ａ）ロイシン、 ｂ）イソロイシン、 ｃ）ノルロイシン、及び ｄ）バリン から選択されるアミノ酸であり、 Ｒはアセチル、ピバロイル又はベンゾイルである。 以下の化合物は本発明のオリゴペプチド−細胞毒性物質複合体の具体例である 。 式中、Ｘは 本発明のオリゴペプチド−細胞毒性物質複合体のようなペプチド治療物質がア セチル、ベンゾイル、ピバロイル等の適切な保護基で保護された任意のオリゴペ プチド置換基の末端アミノ部分をもつのが好ましいことは当該技術分野で周知で あり、また、本発明でもそのように理解される。末端アミノ基をこのように保護 すると、温血動物の血漿中に存在する外来アミノペプチダーゼの作用によるこの ようなペプチド治療物質の酵素分解を低減又は阻止することができる。 本発明のオリゴペプチド−細胞毒性物質複合体は、式（Ｉ）の複合体と医薬的 に許容可能なそのキャリヤー、賦形剤もしくは希釈剤を含む医薬組成物として患 者に投与される。ここで「医薬的に許容可能な」という場合には、例えばヒト、 ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコもしくは他の哺乳動物、及び鳥類又は他 の温血動物を含む温血動物の治療又は診断に有用な物質を意味する。好適投与方 法は非経口経路であり、特に静脈内、筋肉内、皮下、腹膜組織内、又はリンパ管 内経路である。このような製剤は、当業者に周知のキャリヤー、希釈剤又は賦 形剤を用いて製造することができる。これについては、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏ ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ，第１６版，１９８ ０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｏｓｏｌら編を参照さ れたい。このような組成物は血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミン）等の タンパク質、緩衝液又は緩衝物質（例えばリン酸塩）、他の塩、電解質等を含み 得る。適切な希釈剤としては例えば無菌水、等張塩類、希デキストロース水溶液 、多価アルコール又は多価アルコール類の混合物（例えばグリセリン、プロピレ ングリコール、ポリエチレングリコール等）が挙げられる。組成物はフェネチル アルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、チメロサール等の保存剤を含 有し得る。所望に応じて組成物は約０．０５〜約０．２０重量％の酸化防止剤（ 例えばメタ亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸ナトリウム）を含有し得る。 静脈内投与では、患者に投与する量が複合体約０．０１〜約１ｇとなるように 組成物を調製するのが好ましい。好ましくは、投与量は複合体約０．２ｇ〜約１ ｇの範囲である。本発明の複合体は治療しようとする病状又は改変しようとする 生物学的作用、複合体の投与方法、患者の年齢、体重及び状態、並びに治療担当 医により決定される他の因子等の因子に応じて広い薬量 範囲にわたって有効である。従って、任意の所与の患者への投与量は個々に決定 しなければならない。 以下の実施例では特定反応剤及び反応条件を要約するが、本発明の精神及び範 囲に含まれるものであれば変更を加えてもよいことが当業者に理解されよう。従 って、以下の調製物及び実施例は本発明を具体的に説明するためのものであって 、これを制限するものではない。 実施例 実施例１ セメノジェリンＰＳＡに媒介される切断部位の同定： 精液ゲルの液化はセメノジェリンＩのタンパク分解分画に匹敵する［Ｌｉｌｊ ａ，Ｈ．，Ｌａｕｒｅｌｌ，Ｃ．Ｂ．，（１９８４）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓ．４４，４４７−４５２］。セメノジェリンのタンパク分 解分画は主に前立腺特異抗原のタンパク分解活性に起因すると考えられる［Ｌｉ ｌｊａ，Ｈ．，（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６，１８９９−１ ９０３］。セメノジェリンＩの公開配列［Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ａｂｒａｈａｍｓ ｓｏｎ，Ｐ．Ａ．，Ｌｕｎｄｗａｌｌ，Ａ．，（１９８９）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２６４，１８９４−１９００］（図１）を 使用し、市販前立腺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅ−ｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）からセメノジェリンｃＤＮＡをクローニングするためのポリメ ラーゼ連鎖反応プライマーを設計した。精製セメノジェリンｃＤＮＡを細菌発現 ベクターｐＴＡＣに挿入した［Ｌｉｎｅｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｌ ．Ｊ．，Ｍｉｎｋｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｇ．，Ｄｅ Ｓａｌｖｏ，Ｊ．及びＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ａ．，（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ５，９６０−９６５］。セメノジェリンｃＤＮＡは、チューブリ ンエピトープをセメノジェリンタンパク質のカルボキシル末端に配置するように 設計した。細菌によって発現されたセメノジェリンタンパク質を抗チューブリン 抗体カラムで精製した。精製したセメノジェリンＩタンパク質を１２ｍＭ Ｔｒ ｉｓ（ｐＨ８．０），２５ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂中で市販の 前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（Ｙｏｒｋ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌ，Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ，ＮＹ）と１００：１モル比（セメノ ジェリンＩ／ＰＳＡ）で混合し、種々の時間インキュベートした。消化産物をポ リアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ＣＡＰ Ｓ緩衝液［Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２５２，１００３５−１００３８］中で電気泳動によりＰｒｏＢｌｏｔｔ濾紙 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ，ＣＡ）に移した。ＰｒｏＢｌｏｔｔ濾紙をクーマシーブルーで染色してＰＳＡ により生成された新規セメノジェリンＩタンパク質フラグメントを同定した。新 規フラグメントを小刀で濾紙から切り離し、配列決定した。可変時間消化してタ ンパク分解フラグメントを同定した後、１０分間消化反応を行った。セメノジェ リンＩの５箇所の潜在切断部位に対するＰＳＡの親和性を測定した処、部位３４ ９／３５０＞部位３７５／３７６＞部位２８９／２９０＝部位３１５／３１６＞ 部位１５９／１６０であった。相対親和性は、ＰＳＡによって生成された各ペプ チドフラグメントのクーマシーブルー染色強度に基づいて決定した。これらの強 度は約３：１：０．６：０．３の比であった。 実施例２ ＰＳＡに媒介される切断部位を含むオリゴペプチドの調製： Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａ自動ペプチド合成装置 でアミノ酸導入用二重結合プロトコルを使用 して固相合成によりオリゴペプチドを調製した。液体フッ化水素酸で処理するこ とにより、脱保護と、樹脂支持体からのオリゴペプチドの分離を行った。０．１ ％トリフルオロ酢酸水溶液／アセトニトリル勾配を使用して逆相Ｃ１８シリカカ ラム上で分取高圧液体クロマトグラフィーによりオリゴペプチドを精製した。ア ミノ酸組成分析、高圧液体クロマトグラフィー及び高速原子衝撃質量スペクトル 分析によりオリゴペプチドの同一性及び等質性を確認した。この方法により調製 したオリゴペプチドを図２に示す。 実施例３ 遊離ＰＳＡによるオリゴペプチドの認識の評価： 実施例２に記載したように調製したオリゴペプチドをそれぞれＰＳＡ消化用緩 衝液（１２ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０），２５ ｍＭ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂）に溶解し、１００：１のモル比で溶 液をＰＳＡに加えた。種々の反応時間後にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃 度１％（ｖ／ｖ）まで加えて反応をクエンチした。クエンチした反応物を、０． １％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル勾配を用いて逆相Ｃ１８カラムでＨＰＬＣに より分析した。評 価の結果を図２に示す。実施例２に記載したように調製した他のオリゴペプチド は、４時間で反応をクエンチする以外は同一アッセイで試験した。これらの評価 の結果を図３に示す。オリゴペプチドのアミノ末端からアスパラギン残基を除去 すると、ＰＳＡに媒介されるペプチド加水分解の有意損失が生じ、他方、ＰＳＡ による認識にはペプチドのカルボキシル末端にグルタミン酸残基が必ずしも存在 する必要はないと思われる。 実施例４ 非切断性オリゴペプチド−ドキソルビシン複合体の調製： 以下の一般反応を使用して表３に示すドキソルビシン誘導体を調製した。ＤＭ ＳＯ中のドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）と対応するペプチド（固相合成により調 製するか又は市販品（Ｓｉｇｍａ））の混合物にＨＢＴＵ及びＨＯＢＴアナログ をジイソプロピルエチルアミンと共に加え、反応混合物を一晩撹拌した。アセト ニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水中０．１％ＴＦＡ勾配を使 用して逆相Ｃ−１８カラムで分取ＨＰＬＣにより粗反応混合物を直接精製した。 実施例５ ドキソルビシンのペプチド誘導体の細胞毒性の生体外アッセイ： 未修飾ドキソルビシンにより殺されることが知られている細胞系に対して、実 施例４に記載したように調製した非切断性オリゴペプチド−ドキソルビシン複合 体が示す細胞毒性をＡｌａ ｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイで評価した。具体的には、リンパ節の針生検から単離 したヒト転移前立腺癌であるＬＮＣａＰ前立腺腫瘍細胞（ＬＮＣａｐ．ＦＧＣ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣ Ｃ ＣＲＬ１７４０）又はＤｕＰＲＯ細胞の細胞培養物を９６穴プレートに入れ 、種々の濃度の所与の複合体を含む培地（最終プレートウェル容量２００μｌ） で希釈した。細胞を３７℃で３日間インキュベートした後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌ ｕｅ ２０μｌをアッセイウェルに加えた。細胞を更にインキュベートし、Ａｌ ａｍａｒ Ｂｌｕｅの添加から４及び７時間後にＥＬ−３１０ ＥＬＩＳＡリー ダーで５７０及び６００ｎｍの２種の波長でアッセイプレートを読み取った。次 に、試験した複合体の種々の濃度における相対生存率を対照（複合体なし）を含 む倍地培養物に対して計算した。未修飾ドキソルビシンと未修飾オリゴペプチド の細胞毒性も評価した。図３は代表的化合物（化合物１２ｄ）の細胞毒性データ を示す。 実施例６ ＬＮＣａＰ細胞からの酵素活性ＰＳＡの評価： ＬＮＣａＰ無血清培地（約２００倍に濃縮）を組換えセメノ ジェリンＩタンパク質と共にインキュベートすることにより酵素活性を立証した 。濃縮条件付け培地中約０．５μｇの免疫反応性ＰＳＡ［ＨＹＢＲＩＤＴＥＣＨ （タンデムＥ）ｅｌｉｓａにより決定］を組換えセメノジェリンＩ約３μｇと混 合し、４時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に消化混合物 をウェスタンブロット法により分析した。その結果、精液からの精製ＰＳＡとＬ ＮＣａＰ条件付け培地からのＰＳＡは組換えセメノジェリンＩタンパク質の同一 のタンパク分解マップを形成することが判明した。即ち、ＬＮＣａＰ細胞は酵素 活性ＰＳＡを産生する。ＬＮＣａＰはヌードマウスで腫瘍形成性であり、検出可 能なレベルの循環ＰＳＡを産生する。 実施例７ 切断可能なオリゴペプチド−ドキソルビシン複合体の調製： 遊離ＰＳＡによりタンパク分解切断されるオリゴペプチドをドキソルビシンの 糖部分のアミンに共有結合したドキソルビシン誘導体を以下の一般反応により調 製した。ＤＭＳＯ中のドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ）と対応するペプチド（実施 例２に記載したように固相合成により調製）の混合物にＨＢＴＵ及びＨＯＢＴを ジイソプロピルエチルアミンと共に加え、反応混合物 を一晩撹拌した。アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水中 ０．１％ＴＦＡ勾配を使用して逆相Ｃ−１８カラムで分取ＨＰＬＣにより粗反応 混合物を直接精製した。ペプチド上に反応性アミン部分が存在する場合には、一 般にはこのような官能基をフルオレニルメチルオキシカルボニル付加物として保 護し、ドキソルビシンと結合後にピペリジン等の第２アミンで処理して除去した 。本複合体は一般式： の構造をもち、用語「Ａｃ−ペプチド−ＤＯＸ（３’）」により表すことができ る。この方法により調製した複合体を図５の表５に示す。 実施例８ 遊離ＰＳＡによるオリゴペプチド−ドキソルビシン複合体の認識の評価： 実施例７に記載したように調製した複合体をそれぞれＰＳＡ消化用緩衝液（１ ２ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．０），２５ｍＭ Ｎ ａＣｌ，０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂）に溶解し、１００：１のモル比で溶液をＰＳ Ａに加えた。種々の反応時間後にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を最終濃度１％（ ｖ／ｖ）まで加えて反応をクエンチした。クエンチした反応物を、０．１％ＴＦ Ａ水溶液／アセトニトリル勾配を用いて逆相Ｃ１８カラムでＨＰＬＣにより分析 した。評価の結果を図５の表５に示す。 実施例９ 細胞条件付け培地におけるオリゴペプチド−ドキソルビシン複合体の切断の評価 ： 培地をＬＮＣａＰ又はＤｕｐｒｏ（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１４６：９１５−９ １９（１９９１）に記載されているように調製）細胞系に加えてから３日後に細 胞条件付け無血清ＭＥＭα培地（フェノールレッド^-）を収集した。Ａｍｉｃｏ ｎ（登録 商標）Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）濃縮器を使用して１０，０００分子量 カットオフで培地を２０倍に濃縮した。Ｔａｎｄｅｍ（登録商標）−Ｅ ＰＳＡ 免疫検出キット（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ（登録商標））により測定した処、ＬＮＣ ａｐ条件付け培地は平均約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で遊離ＰＳＡタンパク質を含 有していた。Ｄｕｐｒｏ細胞条件付け培地に検出可能な遊離ＰＳＡは認められな かった。 濃縮条件付け培地１００μＬ部を実施例７に記載したように調製したオリゴペ プチド−ドキソルビシン複合体３５μｇと混合し、混合物を３７℃で０、４及び ２４時間インキュベートした。ＺｎＣｌ₂を最終濃度０．０１Ｍまで加えること により反応を停止し、０．１％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル勾配を使用して逆 相Ｃ１８カラムでＨＰＬＣにより分析し、消化されたペプチド−細胞毒性物質複 合体の百分率を決定した。評価の結果を図６の表６に示す。 実施例１０ ドキソルビシンのペプチド誘導体の細胞毒性の生体外アッセイ： 未修飾ドキソルビシンにより殺さることが知られている細胞系に対して、実施 例７に記載したように調製した切断可能なオ リゴペプチド−ドキソルビシン複合体が示す細胞毒性を実施例５に記載したよう なＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイで評価した。具体的には、ＬＮＣａｐ前立腺 腫瘍細胞又はＤｕＰＲＯ細胞の細胞培養物を９６穴プレートに入れ、種々の濃度 の所与の複合体を含有する培地で希釈した（最終プレートウェル容量２００μｌ ）。細胞を３日間３７℃でインキュベートし、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ２０μ ｌをアッセイウェルに加える。細胞を更にインキュベートし、Ａｌａｍａｒ Ｂ ｌｕｅの添加から４及び７時間後にＥＬ−３１０ ＥＬＩＳＡリーダーで５７０ 及び６００ｎｍの２種の波長でアッセイプレートを読み取った。次に、試験した 複合体の種々の濃度における相対生存率を対照（複合体なし）培養物に対して計 算した。更に、複合体の細胞毒性を未修飾ドキソルビシンの細胞毒性と比較し、 同一アッセイで未修飾オリゴペプチドを評価した。このアッセイの結果を図７の 表７に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/37 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/566 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 33/574 9051−4Ｃ ＡＥＤ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者 フエン，ドン−メイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ガースキー，ビクター・エム アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ジヨーンズ，レイモンド・イー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 オリフ，アレン・アイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遊離前立腺特異抗原により認識され且つ選択的にタンパク分解切断されるア ミノ酸配列を含むオリゴペプチド。 ２．アミノ酸配列が、 （式中、ｈＡｒｇはホモアルギニンであり、Ｘａａは任意の天然アミノ酸である ）である請求項１に記載のオリゴペプチド。 ３．アミノ酸配列が、 である請求項２に記載のオリゴペプチド。 ４．アミノ酸配列が、 である請求項２に記載のオリゴペプチド。 ５．アミノ酸配列が、 である請求項２に記載のオリゴペプチド。 ６． から選択される請求項１に記載のオリゴペプチド。 ７． である請求項１に記載のオリゴペプチド。 ８．試料中の遊離前立腺特異抗原のタンパク分解活性の定量方法であって、 （ａ）遊離前立腺特異抗原により認識され且つ選択的にタンパク分解切断される アミノ酸配列を含むオリゴペプチドである基質を試料と反応させる段階と、 （ｂ）基質が切断されたか否かを検出する段階とを含む前記方法。 ９．基質が切断されたか否かを検出する段階が、高性能液体クロマトグラフィー によりアッセイ混合物を分析する段階を含む請求項８に記載の方法。 １０．前立腺特異抗原のタンパク分解活性を阻害する化合物の同定方法であって 、 （ａ）遊離前立腺特異抗原により認識され且つ選択的にタンパ ク分解切断されるアミノ酸配列を含む基質を試験物質の存在下で遊離前立腺特異 抗原と反応させる段階と、 （ｂ）試験物質の不在下の基質の切断に比較した基質の切断の減少により、試験 物質が前立腺特異抗原のタンパク分解活性を阻害する能力を測定することにより 、基質が切断されたか否かを検出する段階とを含む前記方法。 １１．基質が切断されたか否かを検出する段階が、高性能液体クロマトグラフィ ーによりアッセイ混合物を分析する段階を含む請求項１０に記載の方法。 １２．オリゴペプチドに結合した細胞毒性物質を含む前立腺癌の治療に有用な複 合体であって、オリゴペプチドが遊離前立腺特異抗原により認識され且つ選択的 にタンパク分解切断されるアミノ酸配列を含み、結合手段が共有結合又は化学的 リンカーである前記複合体。 １３．細胞毒性物質が以下の類： ａ）アントラサイクリンファミリーの薬剤、 ｂ）ビンカアルカロイド薬剤、 ｃ）マイトマイシン、 ｄ）ブレオマイシン、 ｅ）細胞毒性ヌクレオシド、 ｆ）プテリジンファミリーの薬剤、 ｇ）ジイネン、 ｈ）エストラムスチン、 ｉ）シクロホスファミド、及び ｊ）ポドフィロトキシン から選択される類の細胞毒性物質の１員である請求項１２に記載の複合体。 １４．細胞毒性物質が以下の細胞毒性物質： ａ）ドキソルビシン、 ｂ）カルミノマイシン、 ｃ）ダウノルビシン、 ｄ）アミノプテリン、 ｅ）メトトレキセート、 ｆ）メトプテリン、 ｇ）ジクロロメトトレキセート、 ｈ）マイトマイシンＣ、 ｉ）ポルフィロマイシン、 ｊ）５−フルオロウラシル、 ｋ）６−メルカプトプリン、 ｌ）シトシンアラビノシド、 ｍ）ポドフィロトキシン、 ｎ）エトポシド、 ｏ）リン酸エトポシド、 ｐ）メルファラン、 ｑ）ビンブラスチン、 ｒ）ビンクリスチン、 ｓ）ルーロシジン、 ｔ）ビンデシン、 ｕ）エストラムスチン、 ｖ）シスプラチン、 ｗ）シクロホスファミド、及び ｘ）ルーロシン から選択される請求項１２に記載の複合体。 １５．細胞毒性物質がドキソルビシン及びビンブラスチン又はその細胞毒性誘導 体から選択される請求項１２に記載の複合体。 １６．細胞毒性物質がドキソルビシン又はその細胞毒性誘導体である請求項１２ に記載の複合体。 １７．式Ｉ： ［式中、 オリゴペプチドは遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）により特異的に認識され且つ遊 離前立腺特異抗原の酵素活性によりタンバク分解切断することが可能なオリゴペ プチドであり、 Ｘ_Lは不在であるか又は、 ａ）フェニルアラニン、 ｂ）ロイシン、 ｃ）バリン、 ｄ）イソロイシン、 ｅ）（２−ナフチル）アラニン、 ｆ）シクロヘキシルアラニン、 ｇ）ジフェニルアラニン、 ｈ）ノルバリン、及び ｊ）ノルロイシンから選択されるアミノ酸であり、 Ｒは水素又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ¹であり、 Ｒ¹はＣ₁−Ｃ₆−アルキル又はアリールである］ で表される請求項１６に記載の複合体。 １８．オリゴペプチドが （式中、ｈＡｒｇはホモアルギニンであり、Ｘａａは任意の天然アミノ酸である ）から選択されるアミノ酸配列を含むオリゴマーであり、 Ｘ_Lが不在であるか又は、 ａ）ロイシン、 ｂ）イソロイシン、及び ｄ）バリンから選択されるアミノ酸であり、 Ｒがアセチル、ピバロイル又はベンゾイルである請求項１７に記載の複合体。 １９． ［式中、Ｘは である］から選択される請求項１６に記載の複合体。 ２０．式II： ［式中、オリゴペプチドは遊離前立腺特異抗原（ＰＳＡ）により特異的に認識さ れ且つ遊離前立腺特異抗原の酵素活性によりタンパク分解切断することが可能な オリゴペプチドである］により表される請求項１５に記載の複合体。