RU2162855C2 - Новые пептиды - Google Patents

Новые пептиды Download PDF

Info

Publication number
RU2162855C2
RU2162855C2 RU97101169/04A RU97101169A RU2162855C2 RU 2162855 C2 RU2162855 C2 RU 2162855C2 RU 97101169/04 A RU97101169/04 A RU 97101169/04A RU 97101169 A RU97101169 A RU 97101169A RU 2162855 C2 RU2162855 C2 RU 2162855C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
oligopeptide
amino acids
bond
seq
antigen
Prior art date
Application number
RU97101169/04A
Other languages
English (en)
Other versions
RU97101169A (ru
Inventor
ДеФео-Джонс Дебора
Фенг Донг-Мей
М. ГАРСКИ Виктор
Е. ДЖОНС Раймонд
И. ОЛИФФ Аллен
Original Assignee
Мерк Энд Ко., Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/267,092 external-priority patent/US5599686A/en
Application filed by Мерк Энд Ко., Инк. filed Critical Мерк Энд Ко., Инк.
Publication of RU97101169A publication Critical patent/RU97101169A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2162855C2 publication Critical patent/RU2162855C2/ru

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K7/00Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K1/00General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K7/00Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Описываются олигопептиды, которые имеют аминокислотную последовательность от 6 до 100 аминокислот, распознаваемую и протеолитически расщепляемую свободным специфическим антигеном простаты (PSA) в ферментативно активной форме. Описаны также анализы, в которых указанные олигопептиды могут быть использованы для in vitro и in vivo-определения протеазной активности свободного PSA. Кроме того, раскрываются терапевтические агенты, содержащие конъюгаты указанных олигопептидов, представленные общей формулой I, и известных цитохимических агентов. 4 с. и 19 з.п.ф-лы, 7 ил., 2 табл.

Description

Настоящая патентная заявка является частичным продолжением одновременно рассматриваемой заявки рег. N 08/404833, поданной 15 марта 1995, которая, в свою очередь, является частичным продолжением одновременно рассматриваемой заявки рег. N 08/267092, поданной 28 июня 1994.
Предпосылки создания изобретения
По предварительным данным, в 1994 г. в США, число диагностированных случаев заболеваний раком предстательной железы у мужчин составляет 200000, при этом, смертность от этого заболевания может составить 38000 человек (Garnick, М.В. (1994) The Dilemmas of Prostate Cancer. Scientific American, April: 72-81). Таким образом, рак предстательной железы является одним из наиболее часто диагностируемых раковых заболеваний (помимо рака кожи) у мужчин в США, и занимает второе место по смертности от рака (после рака легких).
Простатический антиген (PSA) представляет собой одноцепочечный гликопротеин в 33 кДа, который почти исключительно продуцируется эпителием предстательной железы человека, и присутствует в сперме человека в количестве от 0,5 до 2,0 мг/мл (Nadji, М., Taber, S.Z., Castro, A., et al. (1981) Cancer 48: 1229; Papsidero, L., Kuriyama, M., Wang, M. et al. (1981). JNCI 66:37; Qui, S.D., Young, C.Y.F., Bihartz, D.L., (1990), J. Urol. 144:1550; Wang, M. C. , Valenzuela, L.A., Murphy, G.P., et al. (1979), Invest. Urol. 17:159). В этом гликопротеине имеется одна углеводная единица, которая присоединена к остатку аспарагина 45, и которая составляет 2 - 3 кДа от общей молекулярной массы. PSA представляет собой протеазу с химотрипсинподобной специфичностью (Christensson, A. , Laurell, C.B., Lilja, Н. (1990). Eur. J. Biochem. 194: 755-763). Было показано, что PSA является ответственным, главным образом, за растворение гелевой структуры, образующейся при эякуляции, путем протеолиза основных (мажорных) белков, содержащихся в геле спермы, например, таких, как семеногелин I и семеногелин II, и фибронектин (Lilja, Н. (1985). J. Clin. Invest. 76: 1899; Lilja, H., Oldbring, J., Rannevik, G., et al. (1987). J. Clin. Invest. 80:281; McGee. R.S., Herr, J.C. (1988). Biol. Reprod. 39:499). PSA-опосредованный протеолиз гелеобразующих белков способствует образованию нескольких растворимых фрагментов семеногелина I и семеногелина II и растворимых фрагментов фибронектина с разжижением эякулята и высвобождением все более подвижных сперматозоидов (Lilja, Н., Laurell, C.B. (1984), Scand. J. Glin. Lab. Invest. 44: 447; McGee, R.S. Herr, J.C. (1987); Biol. Reprod. 37: 431). Кроме того, простатический антиген (PSA) обладает способностью к протеолитическому расщеплению IGFBP-3 (белка, связывающегося с инсулиноподобным фактором роста), что позволяет IGF (инсулиноподобному фактору роста) специфически стимулировать рост PSA-секретирующих клеток (Cohen et al., (1992) J. Clin. Endo. & Meta., 75: 1046-1053).
Преобладающей молекулярной формой сывороточного PSA является комплекс, образованный PSA с альфа 1-антихимотрипсином, и составляющий до 95% от всего обнаруживаемого сывороточного PSA (Christensson, A., Bjork, Т., Nilsson, 0., et. al. (1993). J. Uro. 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Danlen, U. (1991). Clin. Chem. 37: 1618-1625; Stenman, U.H., Leinoven, J., Alfthan, H. , et. al. (1991). Cancer Res. 51: 222-226). Ткань предстательной железы (нормальная ткань, доброкачественная гиперпластическая ткань и злокачественная ткань) высвобождает преимущественно зрелую ферментативно активную форму PSA, поскольку такая форма необходима для образования комплекса с альфа 1-антихимотрипсином (Mast, A. E., Enghild, T. J., Pizzo, S.V., et. al. (1991), Biochemistry 30: 1723-1730; Perlmutter, D.H., Glover, G.I., Rivetna, M. , et. al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3753-3757). Поэтому в микроокружении PSA-секретирующих клеток предстательной железы PSA, очевидно, процессируется и секретируется в своей зрелой ферментативно активной форме, не конъюгированной с какой-либо ингибирующей молекулой. PSA также образует стабильные комплексы с альфа 2-макроглобулином, но, поскольку это приводит к инкапсуляции PSA и полной потери PSA-эпитопов, то смысл in vivo-образования такого комплекса пока не ясен. Свободная неконъюгированная форма PSA составляет минорную фракцию сывороточного PSA (Christensson, A., Bjork, Т., Nilsson, 0., et. al. (1993). J. Urol. 150: 100-150; Lilja, H., Christensson, A. , Dahlen, U. (1991) Clin. Chem. 37: 1618-1625). Размер этой формы сывороточной PSA аналогичен размеру формы PSA, присутствующей в семенной жидкости (Lilja, H. , Christensson, A. , Dahlen, U. (1991) Clin. Chem. 37: 1618-1625), однако пока неизвестно, может ли свободная форма сывороточного PSA быть зимогеном; внутренне гидролизованной неактивной формой зрелого PSA; или PSA, обладающим ферментативной активностью. Однако представляется маловероятным, что свободная форма сывороточного PSA обладает ферментативной активностью, поскольку присутствующий в сыворотке молярный избыток обоих непрореагировавших альфа 1-антихимотрипсина и альфа 2-макроглобулина значительно превышает (в 100-1000) раз детектируемые сывороточные уровни свободной 33 кДа-формы PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., et. al. (1993). J. Urol. 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Danlen, U. (1991). Clin. Chem. 37: 1618-1625).
Измерение уровней PSA в сыворотке может оказаться полезным при наблюдении за развитием аденокарциномы предстательной железы (Duffy, M.S. (1989). Ann. Clin. Biochem. 26: 379-387; Brawer, M.K. & Lange, P.H. (1989), Urol. Suppl. 5: 11-16; Hara, М. & Kimura, Н. (1989), J. Lab. Clin. Med. 113: 541-548), хотя по имеющимся данным, повышение концентрации PSA в сыворотке наблюдается также при доброкачественной гиперплазии предстательной железы и после хирургической операции на предстательной железе (Lilja, Н., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37: 1617-1625). Кроме того, известно, что метастазы предстательной железы секретируют иммунореактивный PSA, так как у пациентов с удаленной предстательной железой и с распространенными метастазами рака предстательной железы обнаруживаются высокие уровни сывороточного PSA (Ford, T.F., Butcher, D.N., Masters, R.W., et. al. (1985). Brit. J. Urology 57: 50-55). Поэтому цитотоксическое соединение, которое активируется посредством протеолитической активности PSA, должно быть специфическим к клеткам предстательной железы, а также к PSA-секретирующим метастазам предстательной железы.
В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является получение новых олигопептидов, которые селективно и ферментативно расщепляются активным свободным простатическим антигеном (PSA).
Другой целью настоящего изобретения является разработка количественного анализа на ферментативную активность PSA с использованием новых олигопептидов.
Следующей целью настоящего изобретения является получение новой противораковой композиции, которая может быть использована для лечения рака предстательной железы, и которая включает в себя новые олигопептиды, конъюгированные с цитотоксическим агентом. Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа лечения рака предстательной железы, предусматривающего введение новой противораковой композиции.
Краткое описание изобретения
Было идентифицировано несколько сайтов расщепления, в которых семеногелин I селективно протеолитически гидролизуется свободным PSA. Описываются олигопептиды, имеющие аминокислотные последовательности, которые распознаются и протеолитически расщепляются свободным простатическим антигеном (PSA). Такие олигопептиды могут быть использованы в анализах in vivo и in vitro для определения протеазной активности свободного простатического антигена (PSA). Кроме того, указанные олигопептиды могут быть включены в терапевтические средства, которые содержат конъюгаты этих олигопептидов и известные цитотоксические агенты, и которые могут быть использованы для лечения рака предстательной железы.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1a и 1b. Первичная аминокислотная последовательность семеногелина I.
Показана первичная аминокислотная последовательность семеногелина I (SEQ ID N 1). Показаны также сайты протеолитического расщепления ("CS") простатическим антигеном (пронумерованные в соответствии с относительной аффинностью сайта по отношению к PSA-гидролизу), при этом фрагменты белка пронумерованы начиная от аминоконца.
Фиг. 2. Аффинность в отношении гидролиза синтетических олигопептидов.
Было получено гнездовое множество синтетических олигопептидов, и эти олигопептиды были подвергнуты гидролизу ферментативно активным свободным PSA в течение различных промежутков времени. Полученные результаты представлены в виде таблицы (ND = не определяли). Для обозначения аминокислот был использован однобуквенный код, где A=Ala, E=Glu, G=Gly, H=His, I=Ile, K=Lys, L= Leu, N=Asn, Q=Gln, P=pro, S=Ser, T=Thr, Y=Tyr.
Фиг. 3a и 3b. Аффинность в отношении гидролиза синтетических олигопептидов.
Получали синтетические олигопептиды, которые были подвергнуты гидролизу ферментативно активным PSA в течение четырех (4) часов. На фиг. 3 приводится процент олигопептида, гидролизованного за этот период времени.
Фиг. 4. Данные о цитотоксичности нерасщепляемых конъюгатов "олигопептид - доксорубицин".
Данные, представленные на фиг. 4, иллюстрируют сравнительную цитотоксичность доксорубицина и конъюгата доксорубицина, ковалентно связанного с олигопептидом (Соединение 12b), который не содержит сайта протеолитического расщепления простатическим агентом. IC50 для доксорубицина составляет 0,3 мкМ, тогда как доксорубицин, модифицированный ацетилированным олигопептидом, имеет более чем в 300 раз меньший IC50. Этот конъюгат не имеет ВЭЖХ-обнаруживаемых примесей немодифицированного доксорубицина. Олигопептид, взятый отдельно, не обладает заметной цитотоксической активностью.
Фиг. 5. Аффинность in vitro-расщепления свободным PSA олигопептидов, конъюгированных с доксорубицином.
Получали конъюгаты олигопептидов с доксорубицином и эти конъюгаты подвергали гидролизу ферментативно активным свободным PSA в течение четырех (4) часов. На рисунке приводится процент конъюгата, ферментативно расщепляемого в олигопептиде за этот период времени.
Фиг. 6. Аффинность расщепления олигопептидов, конъюгированных с доксорубицином, в кондиционированной клетками среде.
Конъюгаты олигопептидов с доксорубицином подвергали реакции в течение четырех (4) часов с культуральной средой, кондиционированной клетками LNCaP (которые, как известно, секретируют свободный PSA) или клетками DuPRO (которые не секретируют свободный PSA). На фиг. 6 приводится процент конъюгата, гидролизованного в олигопептиде за этот период времени.
Фиг. 7. Данные о цитотоксичности гидролизованных конъюгатов олигопептида и доксорубицина.
Данные, представленные на фиг. 7, иллюстрируют цитотоксичность (IC50) доксорубицина, ковалентно связанного с олигопептидом, содержащим сайт протеолитического расщепления свободным PSA, направленную против раковой клеточной линии, которая, как известно, секретирует свободный PSA. Для некоторых конъюгатов показано также, что они обладают цитотоксичностью против клеточной линии (DuPRO), которая не секретирует свободный PSA.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым олигопептидам, которые специфически распознаются свободным простатическим антигеном (PSA), и которые могут быть протеолитически гидролизованы благодаря ферментативной активности свободного про статического антигена. Такими олигопептидами являются олигомеры, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:
a) AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000003
Ser (SEQ ID N 13),
b) LysIleSerTyrGln
Figure 00000004
Ser (SEQ ID N 14),
c) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnXaaSerIleTyr
Figure 00000005
SerGln ThrGlu (SEQ ID N 15),
d) GlyLysGlyIleSerSerGlnTyr
Figure 00000006
SerAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID No 2),
e) AsnLysIleSerTyrTyr
Figure 00000007
Ser (SEQ ID N 127),
f) AsnLysAlaSerTyrGln
Figure 00000008
Ser (SEQ ID N 128),
g) SerTyrGln
Figure 00000009
SerSer (SEQ ID N 129),
h) LysTyrGln
Figure 00000010
SerSer (SEQ ID N 140),
i) hArgTyrGln
Figure 00000011
SerSer (SEQ ID N 141);
где hArg представляет собой гомоаргинин, a Xaa представляет собой любую натуральную аминокислоту.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения олигопептидами являются олигомеры, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:
a) AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000012
SerSer (SEQ ID N 16),
b) AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000013
SerAla (SEQ ID N 130),
c) AsnLyslleSerTyrGln
Figure 00000014
SerSerSer (SEQ ID N 17),
d) AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000015
SerSerSer (SEQ ID N 18),
e) LysIleSerTyrGln
Figure 00000016
SerSerSerThrGlu (SEQ ID N 19),
f) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerIleTyr
Figure 00000017
SerGln ThrGlu (SEQ ID N 4),
g) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerIleTyr
Figure 00000018
SerGln ThrGlu (SEQ ID N 5),
h) AlaAsnTysIleSerTyrTyr
Figure 00000019
Ser (SEQ ID N 131),
i) AlaAsnLysAlaSerTyrGln
Figure 00000020
Ser (SEQ ID No 132),
j) SerTyrGln
Figure 00000021
SerSerThr (SEQ ID N 133),
k) SerTyrGln
Figure 00000022
SerSerSer (SEQ ID N 134),
l) LysTyrGln
Figure 00000023
SerSerSer (SEQ ID N 142),
m) hArg TyrGln
Figure 00000024
SerSerSer (SEQ ID N 143),
n) SerTyrGln
Figure 00000025
SerSerLeu (SEQ ID N 135),
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения олигопептидами являются олигомеры, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:
a) AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000026
SerSerSerThr (SEQ ID N 10),
b) AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000027
SerAla (SEQ ID N 136),
с) AsnLysLleSerTyrGln
Figure 00000028
SerSerSerThrGlu (SEQ ID N 3),
d) AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000029
SerSerSerThrGlu (SEQ ID N 11),
e) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerIleTyr
Figure 00000030
SerGln ThrGlu (SEQ ID N 4),
f) AlaAsnLysIleSerTyrTyr
Figure 00000031
SerSer (SEQ ID N 137),
g) AlaAsnLysIleSerTyrTyr
Figure 00000032
SerAla (SEQ ID N 138),
h) AlaAsnLysAlaSerTyrGln
Figure 00000033
SerAla (SEQ ID N 139),
i) AlaSerTyrGln
Figure 00000034
SerSerLeu (SEQ ID N 94).
В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения олигопептидами являются олигомеры, имеющие следующую выбранную аминокислотную последовательность:
a) GlyArgLysAlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000035
SerSerSerThrGluGluArg ArgLeuHisTyrGlyGluAsnGly (SEQ ID N 6).
Используемая в настоящем подробном описании фраза "олигомеры, имеющие аминокислотную последовательность" относится к олигомерам, состоящим примерно из 6 - 100 аминокислотных остатков, и содержащим в своей аминокислотной последовательности описанную специфическую аминокислотную последовательность, которая протеолитически расщепляется свободным PSA. Так, например, олигомер GlnLeuAspAsnLysLleSerTyrGln
Figure 00000036
SerSerSerThrHisGlnSerSer (SEQ ID N 20) содержит аминокислотную последовательность AsnLysIleTyrGln
Figure 00000037
SerSerSerThr (SEQ ID N 10), а поэтому входит в объем настоящего изобретения. При этом следует отметить, что такие олигомеры не являются семеногелином I и семеногелином II. Кроме того, следует отметить, что настоящее изобретение относится также к олигомерам, где N-концевая аминокислота или C-концевая аминокислота, или обе концевые аминокислоты являются модифицированными. Такими модификациями являются, но не ограничиваются ими, ацилирование аминогруппы у N-конца и образование амидной группы для замены карбоксильной группы у C-конца. Добавление указанных групп может быть осуществлено в процессе твердофазного синтеза олигомера. Так, например, присоединение C-концевой аминокислоты к твердофазной смоле может быть осуществлено с помощью амина, который приводит к образованию амидной группы после кислотного отщепления олигомера от смолы. Таким образом, используемый выше термин "олигомеры, имеющие аминокислотную последовательность" означает следующие соединения, но не ограничивается ими:
AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000038
SerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID N 11),
Ac-AlaAsnLysLleSerTyrGln
Figure 00000039
SerSerSerThrLeu (SEQ ID N 70),
Ac-AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000040
SerSerSerThrGlu-aмид (SEQ ID N 11),
Aс-AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000041
SerSerSerThrLeu-амид (SEQ ID N 70),
Ac-AlaAsnLуsIleSerTуrGln
Figure 00000042
SerAlaSerThrGlu-aмид (SEQ ID N 73),
Ac-AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000043
SerSerLysThrGlu-амид (SEQ ID N 74),
Ac-AlaAsnLуsIleSerTуrGln
Figure 00000044
SerSerThrGlu-aмид (SEQ ID N 75),
Ac-AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000045
SerSerGlnThrGlu-амид (SEQ ID N 78),
Ac-AlaAsnLysIleSerTyrGIn
Figure 00000046
SerAlaLysThrGlu-aмид (SEQ ID N 79),
Ac-AlaAsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000047
SerThrGlu-амид (SEQ ID N 81),
Ac-AlaAsnLysSerTyrGln
Figure 00000048
SerSerThrGlu-aмид (SEQ ID N 82),
Ac-AlaAsnLysAlaSerTyrGln
Figure 00000049
SerAlaSerThrGlu-амид (SEQ ID N 84),
Ac-AlaAsnGluIleSerTyrGln
Figure 00000050
SerAlaSerThrGlu-амид (SEQ ID N 85),
Ac-AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000051
SerSer-aмидa (SEQ ID N 16),
Ac-LysIleSerTyrGln
Figure 00000052
SerSer-амид (SEQ ID N 86),
Ac-SerTyrGln
Figure 00000053
SerSerThrGlu-амид (SEQ ID N 87),
Ac-AlaSerTyrGln
Figure 00000054
SerSerThrGlu-aмид (SEQ ID N 89),
Ac-AlaAsnLysIleSerTyrTyr
Figure 00000055
SerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID N 92),
Ac-AlaAsnLysIleSerTyrTyr
Figure 00000056
SerAlaSerThrGlu-aмид (SEQ ID N 93),
Ac-AlaSerTyrGln
Figure 00000057
SerSerLeu-aмид (SEQ ID N 94),
Ac-AlaAsnSerTyrGln
Figure 00000058
SerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID N 95),
Ac-AlaSerTуrGln
Figure 00000059
SerSerSerThгGlu-aмид (SEQ ID N 96).
Ac-SerTyrGln
Figure 00000060
SerSerSerThrGlu-амид (SEQ ID N 97),
Ac-AlaAsnLysAlaSerTyrGln
Figure 00000061
SerAlaSerCys-aмид (SEQ ID N 98).
Для каждого специалиста по пептидной химии совершенно очевидно, что некоторые аминокислоты в биологически активном олигопептиде могут быть заменены гомологичными, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, но при этом биологическая активность такого модифицированного олигопептида аналогична биологической активности исходного олигопептида. Нижеследующий список аминокислотных замещений носит чисто иллюстративный, а не ограничивающий характер:
Исходная аминокислота - Замещающая аминокислота
Ala - Gly
Arg - Lys Орнитин
Asn - Gln
Asp - Glu
Glu - Asp
Gln - Asn
Gly - Ala
Ile - Val, Leu, Met, Nle
Leu - Ile, Val, Met, Nle
Lys - Aro, Орнитин
Met - Leu, Ile, Nle, Val
Орнитин - Lys, Arg
Phe - Tyr, Trp
Ser - Thr
Thr - Ser
Trp - Phe, Tyr
Tyr - Phe, Trp
Val - Leu, Ile, Met, Nle
Так, например, нижеследующие олигопептиды могут быть синтезированы способами, хорошо известными любому специалисту, и должны, как предполагается, протеолитически расщепляться
свободным PSA:
AsnArgIleSerTyrGln
Figure 00000062
Ser (SEQ ID N 21)
AsnLysValSerTyrGln
Figure 00000063
Ser (SEQ ID N 22)
AsnLysMetSerTyrGln
Figure 00000064
SerSer (SEQ ID N 23)
AsnLysLeuSerTyrGln
Figure 00000065
SerSer (SEQ ID N 24)
AsnLysIleThrTyrGln
Figure 00000066
SerSerSer (SEQ ID N 25)
AsnLysIleSerPheGln
Figure 00000067
SerSerSer (SEQ ID N 26)
AsnLysIleSerTrpGln
Figure 00000068
SerSerSerThr (SEQ ID N 27)
AsnLysIleSerTyrAsn
Figure 00000069
SerSerSerThr (SEQ ID N 28)
AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000070
ThrSerSerThr (SEQ ID N 29)
AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000071
Ser (SEQ ID N 30)
GlnLysIleSerTyrGln
Figure 00000072
SerSer (SEQ ID N 31)
AsnArgIleThrTyrGln
Figure 00000073
SerSerSer (SEQ ID N 32)
AsnArgIleSerPheGln
Figure 00000074
SerSerSerThr (SEQ ID N 33)
AsnArgIleSerTrpGln
Figure 00000075
SerSerSerThr (SEQ ID N 35)
AsnArgIleSerTyrGln
Figure 00000076
ThrSerSerThr (SEQ ID N 36)
AsnLysIleThrTyrGln
Figure 00000077
ThrSerSerThr (SEQ ID N 37)
AsnLysLeuSerTyrGln
Figure 00000078
ThrSerSerThr (SEQ ID N 38)
GlnLysLeuSerTyrGln
Figure 00000079
SerSerSerThr (SEQ ID N 39)
AsnArgLeuSerTyrGln
Figure 00000080
ThrSerSerThr (SEQ ID N 40)
AsnLysValSerPheGln
Figure 00000081
SerSerSerThr (SEQ ID N 41)
AsnArgValSerTrpGln
Figure 00000082
SerSerSerThr (SEQ ID N 42)
GlnLysValSerTyrGln
Figure 00000083
SerSerSerThr (SEQ ID N 43)
GlnLysIleSerTyrGIn
Figure 00000084
ThrSerSerThr (SEQ ID N 34)
AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000085
SerSerSerThr (SEQ ID N 44)
Аналогично, нижеследующие олигопептиды могут быть синтезированы способами, хорошо известными любому специалисту, и должны, как предполагается, протеолитически расщепляться свободным PSA:
GlyGluGlnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerIleTyr
Figure 00000086
SerGlnThr Glu (SEQ ID N 45),
GlyGluAsuGlyLeuGlnLysAspValSerGlnSerSerIleTyr
Figure 00000087
SerGlnThr Glu (SEQ ID N 47),
GlyGluAsnGlyValAsnLysAspValSerGlnSerSerIleTyr
Figure 00000088
SerGlnThr Glu (SEQ ID N 48),
GlyGluAsnGlyValGlnArgAspValSerGlnArgSerIleTyr
Figure 00000089
SerGlnThr Glu (SEQ ID N 49),
GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnLysSerIleTyr
Figure 00000090
SerGlnThr Glu (SEQ ID N 50),
GlyGluAsnGlyValGlnLysAspLeuSerGlnThrSerIleTyr
Figure 00000091
SerGlnThr Glu (SEQ ID N 51),
GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerIlePhe
Figure 00000092
SerGlnThr Glu (SEQ ID N 52),
GlyGluAsnGlyValGlnLysAspMetSerGlnSerSerIleTyr
Figure 00000093
ThrGlnThr Glu (SEQ ID N 53),
GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerIleTyr
Figure 00000094
ThrGlnThr Glu (SEQ ID N 54),
GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnSerSerIleTyr
Figure 00000095
SerGlnSer Glu (SEQ ID N 55),
GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnArgSerIleTyr
Figure 00000096
SerAsnThr Glu (SEQ ID N 56),
GlyLysAlaIleSerSerGlnTyr
Figure 00000097
SerAsnThrGluGluArgeLeu (SEQ ID N 57),
GlyArgGlyIleSerSerGlnTyr
Figure 00000098
SerAsnThrGluGluArgLeu(SEQ ID N 59),
GlyLysGlyIleThrSerGlnTyr
Figure 00000099
SerAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID N 60),
GlyLysGlyIleSerThrGlnTyr
Figure 00000100
SerAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID N 61),
GlyLysGlyIleSerSerAsnTyr
Figure 00000101
SerAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID N 62),
AlaLysGlyIleSerSerGlnTyr
Figure 00000102
SerAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID N 63),
GlyLysGlyIleSerSerGlnPhe
Figure 00000103
SerAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID N 64),
GlyLysGlyIleSerSerGlnTyr
Figure 00000104
ThrAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID N 65),
GlyLysGlyIleSerSerGlnTyr
Figure 00000105
SerAsnSerGluGluArgLeu (SEQ ID N 58 и
GlyLysGlyIleSerSerGlnTyr
Figure 00000106
SerAsnThrAspGluArgLeu (SEQ ID N 46) и т.п.
Символ
Figure 00000107
, включенный в аминокислотную последовательность, указывает на точку протеолитического расщепления олигопептида свободным PSA.
Настоящее изобретение также относится к способу анализа на протеолитическую активность свободного PSA в композиции. Этот способ является одним из важных аспектов настоящего изобретения и заключается в использовании аналитической системы, которая позволяет количественно определить содержание свободного PSA, присутствующего в некоторых физиологических жидкостях и тканях. Кроме того, этот анализ не только позволяет контролировать выделение и очистку свободного PSA, но также может быть положен в основу метода скрининга для идентификации ингибиторов протеолитической активности свободного PSA. В общих чертах, этот метод заключается просто в определении способности композиции, которая, как предполагается, содержит ферментативно активный свободный PSA, протеолитически расщеплять олигопептид.
В основном процедуру анализа осуществляют с использованием одного из олигонуклеотидов, описанных выше. Однако может оказаться предпочтительным разработать такой анализ, в котором олигопептид, содержащий сайт расщепления, был бы помечен меткой, например, радиоактивной меткой, присутствие которой как в нерасщепленном олигопептиде, так и в части олигопептида, оставшегося после расщепления и содержащего эту метку, можно было бы измерить.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединений (называемых далее соединениями-кандидатами), которые ингибируют протеолитическую активность свободного PSA. При этом предусматривается, что такой способ скрининга может быть с успехом использован для идентификации любого соединения-кандидата, которое является ингибитором, независимо от того, имеет или не имеет данное соединение-кандидат белковую или пептидиловую структуру.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу определения способности испытуемого соединения ингибировать протеолитическую активность свободного PSA; причем указанный способ предусматривает:
(а) осуществление реакции субстрата, имеющего аминокислотную последовательность, распознаваемую и селективно протеолитически расщепляемую свободным простатическим антигеном, со свободным простатическим антигеном в присутствии испытуемого соединения; и
(b) установление факта расщепления субстрата, где на способность испытуемого соединения ингибировать протеолитическую активность указывает снижение уровня расщепления субстрата по сравнению с расщеплением субстрата в отсутствии испытуемого соединения.
По своей разработке и осуществлению анализ в целях скрининга соединений-кандидатов является довольно простым, и во многом похож на вышеописанный анализ для определения протеолитической активности. Так, например, после получения относительно очищенного препарата свободного PSA, желательно просто смешать испытуемое соединение с протеолитическим препаратом, предпочтительно в таких условиях, при которых PSA может осуществлять свою функцию расщепления, но в отсутствие ингибирующего соединения. Так, например, желательно включить в смесь определенное количество олигопептида, имеющего специфический сайт расщепления PSA, такого, как олигопептиды, описанные выше. Таким образом, можно измерить способность испытуемого соединения снижать относительный уровень расщепления олигопептида в присутствии испытуемого соединения.
В соответствии с этим, для оценки относительной ингибирующей способности испытуемого соединения желательно измерить или как-нибудь иначе определить активность свободного PSA в отсутствие добавляемого испытуемого соединения по сравнению с активностью в присутствии испытуемого соединения.
Настоящее изобретение также относится к противораковым композициям, которые могут быть использованы для лечения рака предстательной железы. Такие композиции содержат олигопептиды настоящего изобретения, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом либо непосредственно, либо с помощью химического линкера. Эта комбинация олигопептида и цитотоксического агента может быть определена как конъюгат. В идеальном случае, цитотоксическая активность цитотоксического агента является очень низкой или вообще отсутствует, если олигопептид, содержащий сайт протеолитического PSA-расщепления, связан непосредственно или с помощью химического линкера с цитотоксическим агентом и является интактным. Кроме того, в идеальном случае цитотоксическая активность цитотоксического агента значительно возрастает или возвращается до уровня активности немодифицированного цитотоксического агента после протеолитического гидролиза связанного олигопептида в сайте расщепления. Наиболее предпочтительным, хотя и необязательным, вариантом осуществления настоящего изобретения является получение конъюгата, где олигопептид и химический линкер, если он присутствует, отделяются от цитотоксического агента под действием протеолитически активного свободного PSA и любых других нативных протеолитических ферментов, присутствующих в окружающей ткани, высвобождая, тем самым, немодифицированный цитотоксический агент во внутреннюю среду организма в месте протеолитического расщепления.
При этом следует отметить, что олигопептид настоящего изобретения, конъюгированный с цитотоксическим агентом, независимо от того, является ли он ковалентно связанным с этим агентом непосредственно или с помощью химического линкера, необязательно должен быть олигопептидом, наиболее распознаваемым и наиболее легко расщепляемым свободным PSA. Так, например, выбор олигопептида для включения в противораковую композицию может быть осуществлен исходя из его селективности, протеолитической расщепляемости простатическим агентом и цитотоксической активности конъюгата цитотоксического агента и протеолитического остатка (или, в идеальном случае, немодифицированного цитотоксического агента), являющейся следствием такого расщепления.
Поскольку конъюгаты настоящего изобретения могут быть использованы для модификации данного биологического ответа, то цитотоксический агент не должен быть ограничен лишь классическими типами химических терапевтических агентов. Так, например, цитотоксический агент может быть белком или полипептидом, обладающим нужной биологической активностью. Такими белками могут быть, например, токсин, такой как абрин, рицин A, экзотоксин pseudomonas, или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли, альфа-интерферон, бета-интерферон, фактор роста нервной ткани, тромбоцитарный фактор роста, тканевый активатор плазминогена; или модификаторы биологического ответа, такие как лимфокины, интерлейкин-1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), фактор, стимулирующий образование колоний гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), фактор колониеобразования гранулоцитов (G-CSF) или другие факторы роста.
Предпочтительными цитотоксическими агентами являются, в основном, алкилирующие агенты, антипролиферативные агенты, тубулин-связывающие агенты и т. п. Предпочтительными классами цитотоксических агентов являются, например, семейство антрациклиновых лекарственных средств, лекарственные средства, относящиеся к винка-соединениям; митомицины; блеомицины; цитотоксические нуклеозиды; семейство птеридиновых лекарственных средств; диинены и подофиллотоксины. Особенно предпочтительными соединениями вышеуказанных классов являются, например, доксорубицин, карминомицин, даунорубицин, аминоптерин, метотрексат, метоптерин, дихлорометотрексат, митомицин C, порфиромицин, 5-фтороурацил, 6-меркаптопурин, цитозинарабинозид, подофиллотоксин или его производные, такие как этопозид или этопозидфосфат; мелфалан, винбластин, винкристин, лейрозидин, виндезин, лейрозин и т.п. Другими подходящими цитотоксическими агентами являются эстрамустин, цисплатин и циклофосфамид. При этом каждый специалист может осуществить соответствующие химические модификации с образованием нужного соединения, которое является более пригодным для проведения реакций в целях получения конъюгатов настоящего изобретения.
Особенно предпочтительной группой цитотоксических агентов настоящего изобретения являются лекарственные средства, имеющие следующие формулы:
Группа метотрексатов формулы (1)
Figure 00000108

где R12 представляет собой амино- или гидроксигруппу;
R7 представляет собой водород или метил;
R8 представляет собой водород, фтор, хлор, бром или йод;
R9 представляет собой гидроксигруппу, или группу, образующую соль карбоновой кислоты.
Группа митомицинов формулы (2)
Figure 00000109

где R10 представляет собой водород или метил.
Группа блеомицинов формулы (3)
Figure 00000110

где R11 представляет собой гидроксигруппу, аминогруппу;
C1-C3-алкиламиногруппу, ди(C1-C3алкил)аминогруппу, C4-C6-полиметиленаминогруппу;
Figure 00000111

Мелфалан формулы (4)
Figure 00000112

6-Меркаптопурин формулы (5)
Figure 00000113

Цитозинарабинозил формулы (6)
Figure 00000114

Подофиллотоксины формулы (7)
Figure 00000115

где R13 представляет собой водород или метил;
R14 представляет собой метил или тиенил; или их фосфатные соли.
Лекарственные средства группы винкаалкалоидов формулы (8)
Figure 00000116

где R15 представляет собой H, CH3 или OHO, в случае, когда
R17 и R18 взяты отдельно;
R18 представляет собой H, причем, один из R16Я и R17 является этилом, а другой является H или OH; а в том случае, когда R17 и R18 взяты вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, они образуют оксирановое кольцо, где R16 является этилом;
R19 представляет собой водород, (C1-C3алкил)-CO, или хлорзамещенную группу (C1-C3алкил)-CO;
Дифторонуклеозиды формулы (9)
Figure 00000117

где R21 представляет собой основание, имеющее одну из формул:
Figure 00000118

Figure 00000119

Figure 00000120

Figure 00000121

Figure 00000122

где, R22 представляет собой водород, метил, бром, фтор, хлор или иод
R23 представляет собой -OH или -NH2;
R24 представляет собой водород, бром, хлор или йод; или
Антрациклиновые антибиотики формулы (10)
Figure 00000123

где R1 представляет собой -CH3, CH2OH, -CH2OCO(CH2)3CH3 или -CH2OCOCH(OC2H5)2;
R3 представляет собой -OCH3, -OH или H;
R4 представляет собой -NH2, -NHCOCF3, 4-морфолинил, 3-циано-4-морфолинил, 1-пиперидинил, 4-метокси-1-пиперидинил, бензиламин, дибензиламин, цианометиламин или 1-циано-2-метоксиэтиламин;
R5 представляет собой -OH, -OTHP или -H и
R6 представляет собой -OH или -H, при условии, что:
R6 не является -OH, если R5 = -OH или -OTHP.
Эстрамустин (11)
Figure 00000124

Циклофосфамид (12)
Figure 00000125

Самыми предпочтительными лекарственными средствами являются антрациклиновые антибиотики формулы (10), описанные ранее. При этом следует отметить, что указанные структурные формулы описывают соединения, которые являются лекарственными средствами или производными лекарственных средств, имеющими различные родовые или тривиальные названия. В таблице 1 представлены некоторые антрациклиновые лекарственные средства (и их родовые или тривиальные названия), которые являются особенно предпочтительными для использования в настоящем изобретении.
Из соединений, представленных в таблице 1, наиболее предпочтительным лекарственным средством является доксорубицин. Доксорубицин (обозначаемый также "DOX") представляет собой антрациклин формулы (10), где R1 является -CH2OH, R3 является -OCH3, R4 является -NH2, R5 является -OH, a R6 является -H.
Олигопептиды, пептидные субъединицы и производные пептидов (также называемые пептидами) настоящего изобретения могут быть синтезированы из составляющих их аминокислот методом стандартного пептидного синтеза, предпочтительно методом твердофазного синтеза. Затем пептиды очищают с помощью обращенно-фазовой высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Стандартные методы пептидного синтеза описаны, например, в следующих работах: Schroeder et al., "The Peptides", Vol. 1, Academic Press 1965; Bodansky et al., "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, 1966; McOmie (ed. ) "Protective Groups in Organic Chemystry", Plemim Press, 1973; Barany et al. , "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology" 2, Chapter 1, Academic Press, и Stewart et al., "Solid Phase Peptide Syntetic", Second Edition, Pierce Chemical Company, 1984. Содержание этих работ вводится в настоящее описание посредством ссылки.
Конъюгаты настоящего изобретения, содержащие олигопептид, имеющий сайт PSA-расщепления и цитотоксический агент, могут быть аналогичным образом синтезированы методами, хорошо известными специалистам по клинической биохимии. Так, например, свободная аминовая часть на цитотоксическом агенте может быть ковалентно присоединена к олигопептиду у карбоксильного конца, в результате чего образуется амид. Аналогичным образом, амидная связь может быть образована путем ковалентного связывания аминогруппы олигопептида с карбоксильной группой цитотоксического агента. Для этих целей может быть использован такой реагент, как комбинация гексафторофосфата 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,3,3- тетраметилурония (известного как HBTU) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (известного как HOBT), дициклогексилкарбодиимида (DCC), N-этил-N-(3-диметиламинопропил)- карбодиимида (EDC), дифенилфосфорилазида (DPPA), гексафторофосфата бензотриазол-1-ил-окси-трис- (диметиламино)фосфония (BOP), и т.п.
Кроме того, конъюгат настоящего изобретения может быть образован посредством непептидильной связи между сайтом расщепления PSA и цитотоксическим агентом. Так, например, цитотоксический агент может быть ковалентно присоединен к карбоксильному концу олигопептида посредством гидроксильной группы на цитотоксическом агенте, в результате чего образуется сложноэфирная связь. Для этих целей может быть использован такой реагент, как комбинация HBTU и HOBT, комбинация ВОР и имидазола, комбинация DCC и DMAP и т.п. Карбоновая кислота может быть также активирована путем образования нитрофенилового эфира или т.п., и подвергнута реакции в присутствии DBU (1,8-диазабицикло 5,4,0 ундек-7-ен).
Конъюгат настоящего изобретения может быть также образован путем присоединения олигопептида к цитотоксическому агенту посредством линкерной единицы. Такие линкерные единицы могут содержать, например, бикарбонилалкильный бирадикал, с помощью которого аминовую часть цитотоксического агента соединяют с линкерной единицей, в результате чего образуется амидная связь, а аминоконец олигопептида соединяют с другим концом линкерной единицы, в результате чего тоже образуется амидная связь. Могут быть также использованы другие линкерные единицы, которые являются стабильными в условиях физиологической среды при отсутствии свободного PSA, но которые могут расщепляться после гидролиза в соответствующем сайте протеолитического расщепления под действием PSA. Кроме того, могут быть использованы такие линкерные единицы, которые после PSA-гидролиза в сайте протеолитического расщепления остаются связанными с цитотоксическим агентом, но при этом активность такого производного цитотоксического агента, образовавшегося после расщепления, заметно не уменьшается по сравнению с немодифицированным цитотоксическим агентом.
При этом очевидно, что в процессе синтеза соединений настоящего изобретения может оказаться необходимым защитить или блокировать различные реактивные функциональные группы, присутствующие в исходных соединениях или в промежуточных соединениях, и в этом случае нужную реакцию осуществляют на других частях молекулы. После завершения нужных реакций или по истечении необходимого периода времени такие группы обычно удаляют, например, путем гидролиза или гидрогенолиза. Указанные стадии блокирования и деблокирования являются традиционными процедурами в органической химии. Для выбора подходящих защитных групп, которые могут быть использованы при получении соединений настоящего изобретения, специалисты могут обратиться к работам Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed. Plenum Press, NY, (1973); и Protective Groups In Organic Synthesis, Green, ed., John Wiley & Sons, NY, NY (1981).
Примерами подходящих аминозащитных групп могут служить C1-C10 алканоильные группы, такие как формил, ацетил, дихлорацетил, пропионил, гексаноил, 3,3-диэтилгексаноил, γ -хлор-бутрил и т.п.; C1-C10 алкоксикарбонильные и C5-C15арилоксикарбонильные группы, такие как трет-бутоксикарбонил, бензилоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 4-нитробензилоксикарбонил, флуоренилметилоксикарбонил и циннамоилоксикарбонил; галоген-(C1-C10)-алкоксикарбонильная группа, такая как 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил; и C1-C15 арилалкильные и алкенильные группы, такие как бензил, фенетил, аллил, тритил и т.п. Другими обычно используемыми аминозащитными группами являются группы в форме енаминов, полученных с помощью β-кетоэфиров, таких как метил- или этилацетоацетат.
Подходящими карбоксизащитными группами могут быть, например, C1-C10 алкильные группы, такие как метил, трет-бутил, децил; галоген-C1-C10 алкильные группы, такие как 2,2,2-трихлорэтил и 2-йодэтил; C5-C15 арилалкильные группы, такие как бензил, 4-метоксибензил, 4-нитробензил, трифенилметил, дифенилметил; C1-C10 алканоилоксиметильные группы, такие как ацетоксиметил, пропионоксиметил и т. п. ; и такие группы, как фенацил, 4-галогенфенацил, аллил, диметилаллил, три-(C1-C3алкил), силил, например, триметилсилил, β-п-толуолсульфонилэтил, β-п-нитрофенил-тиоэтил, 2,4,6-триметилбензил, β -метилтиоэтил, фталимидометил, 2,4-динитро-фенилсульфенил, 2-нитробензгидрил и родственные группы.
Аналогично, подходящими гидроксизащитными группами могут быть, например, формильная группа, хлорацетильная группа, бензильная группа, бензгидрильная группа, тритильная группа, 4-нитробензильная группа, триметилсилильная группа, фенацильная группа, трет-бутильная группа, метоксиметильная группа, тетрагидропиранильная группа и т.п.
Предпочтительный вариант получения олигопептида, конъюгированного с антрациклиновым антибиотиком дозоксорубицином, представлен в нижеследующих Реакционных схемах, где проиллюстрирован синтез конъюгатов настоящего изобретения.
Реакционная схема VI иллюстрирует получение конъюгатов олигопептидов настоящего изобретения с винкаалкалоидным цитотоксическим агентом винбластином. Показано присоединение N-конца олигопептида с винбластином (S.P. Kandukuri et al., J. Med. Chem. 28: 1079-1088 (1985)). Однако можно ожидать, что конъюгирование олигопептида в других положениях и функциональных группах винбластина и в C-конце олигопептида также приведет к получению соединений, которые могут быть использованы для лечения рака предстательной железы.
Кроме того, следует отметить, что могут быть также получены конъюгаты, где N-конец олигопептида настоящего изобретения ковалентно связан с одним цитотоксическим агентом, таким как винбластин, а C-конец этого олигопептида одновременно связан с другим цитотоксическим агентом, который может быть тоже винбластином, или другим цитотоксическим агентом, таким как доксорубицин. Такой полицитотоксический конъюгат может обладать большими преимуществами, чем конъюгат, содержащий лишь один цитотоксический агент.
Конъюгат "олигопептид - цитотоксический агент" настоящего изобретения, в котором цитотоксическим агентом является предпочтительный цитотоксический агент дозоксорубицин, может быть представлен общей формулой:
Figure 00000126

где "олигопептид" представляет собой олигопептид, который специфически распознается свободным простатическим антигеном (PSA), и который может быть протеолитически расщеплен под действием ферментативной активности свободного простатического антигена;
XL отсутствует или представляет собой аминокислоту, выбранную из:
а) фенилаланина,
b) лейцина,
с) валина,
d) изолейцина,
е) (2-нафтил)аланина,
f) дифенилаланина,
g) норвалина и
h) норлейцина;
R представляет собой водород или -(C=O)R1; и
R1 представляет собой C1-C6-алкил или арил.
В предпочтительном варианте конъюгата "олигопептид-цитотоксический агент":
"олигопептид" представляет собой олигомер, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из:
a) AsnLysIleSerTyrGln
Figure 00000127
Ser (SEQ ID N 13),
b) LysLleSerTyrGln
Figure 00000128
Ser (SEQ ID N 14),
c) GlyGluAsnGlyValGlnLysAspValSerGlnXaaSerIleTyr
Figure 00000129
SerGln ThrGlu (SEQ ID N 15),
d) GlyLysGlyIleSerSerGlnTyr
Figure 00000130
SerAsnThrGluGluArgLeu (SEQ ID N 2),
e) AsnLysIleSerTyrTyr
Figure 00000131
Ser (SEQ ID N 127),
f) AsnLysAlaSerTyrGln
Figure 00000132
Ser (SEQ ID N 128),
g) SerTyrGln
Figure 00000133
SerSer (SEQ ID N 129),
h) hArgTyrGln
Figure 00000134
SerSer (SEQ ID N 141);
где Xaa является любой натуральной аминокислотой;
X1 отсутствует или является аминокислотой, выбранной из:
а) лейцина,
b) изолейцина,
с) норлейцина и
d) валина; и
R представляет собой ацетил, пивалоил или бензоил.
Конкретными примерами конъюгата "олигопептид - цитотоксический агент" настоящего изобретения являются нижеследующие соединения.
Figure 00000135

где X представляет собой:
Figure 00000136

Figure 00000137

Figure 00000138

Figure 00000139

Figure 00000140

Figure 00000141

Figure 00000142

Figure 00000143

Figure 00000144

Figure 00000145

Figure 00000146

Figure 00000147

Figure 00000148

Figure 00000149

Figure 00000150

Figure 00000151

Как хорошо известно специалистам, и как очевидно из настоящего изобретения, пептидиловые терапевтические агенты, такие как конъюгаты "олигопептид-цитотоксический агент" настоящего изобретения предпочтительно имеют концевые аминогруппы любого олигопептидного заместителя, которые защищены соответствующей защитной группой, такой как ацетил, бензоил, пивалоил и т. п. Такая защита концевых аминогрупп снижает или устраняет возможность ферментативной деградации указанных пептидиловых терапевтических агентов под действием экзогенных аминопептидаз, присутствующих в плазме крови теплокровных животных.
В соответствии с настоящим изобретением, конъюгаты олигопептида и цитотоксического агента вводят пациенту в виде фармацевтической композиции, содержащей конъюгат формулы (1) и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. Используемый в настоящем описании термин "фармацевтически приемлемый" относится к тем агентам, которые могут быть использованы при лечении или диагностики теплокровных животных, например человека, лошади, свиньи, коровы, мыши, собаки, кошки или других млекопитающих, а также птиц или других теплокровных животных. При этом предпочтительным является парентеральный способ введения, а в частности внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрибрюшинное или внутрилимфатическое введение. Указанные препараты могут быть получены с использованием носителей, разбавителей или наполнителей, которые обычно используются в этих целях. В этой связи, см. , например. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Company, edited by Osol et al. Эти композиции могут включать в себя белки, например сывороточные белки, такие как альбумин сыворотки человека; буферы или забуферивающие соединения, такие как фосфаты, другие соли или электролиты и т.п. Подходящими разбавителями являются, например, стерильная вода, изотонический раствор, водный раствор декстрозы, многоатомный спирт или смеси таких спиртов, например глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п. Указанные композиции могут содержать консерванты, такие как фенетиловый спирт, метил- и пропилпарабены, тимеросал и т.п. Если необходимо, то в композицию может быть включено от около 0,05 до около 0,20 мас.% антиоксиданта, такого как метасульфит натрия или бисульфит натрия.
Композицию для внутривенного введения изготавливают предпочтительно так, чтобы количество вводимого пациенту конъюгата составляло от около 0,01 до около 1 г. Предпочтительное количество вводимого конъюгата составляет в пределах от около 0,2 до около 1 г. Конъюгаты настоящего изобретения могут быть эффективными в широком диапазоне доз в зависимости от таких факторов, как тяжесть заболевания, на которое направлено лечение, модифицируемый биологический эффект, который желательно достигнуть, способ введения конъюгата, возраст, вес и состояние пациента, а также другие факторы, которые должны быть учтены лечащим врачом. Таким образом, количество конъюгата, необходимое для введения данному пациенту, должно быть определено индивидуально для каждого пациента.
При этом следует отметить, что хотя в примерах, приведенных ниже, описаны конкретные реагенты и реакционные условия, однако очевидно, что существо и объем настоящего изобретения также охватывают и различные их модификации. Поэтому нижеследующие процедуры и примеры носят лишь иллюстративный характер и не должны рассматриваться как некое ограничение изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Идентификация сайта PSA-опосредованного расщепления семеногелина
Разжижение семенного геля соответствует протеолитической фрагментации семеногелина (Lilja, Н., Laurell, C.B., (1984) Scand. J. Clin. Clab. Invest. 44, 447-452). Полагают, что протеолитическая фрагментация обусловлена, главным образом, активностью простатического антигена (Lilja, Н., (1985) J. Clin. Invest. 76, 1899-1903). Используя опубликованную последовательность семеногелина I (Lilja, Н., Abrahamsson, P.A., Lundwall, A., (1989)). Biol. Chem. 264, 1894-1900) (рис. 1), мы сконструировали PCR-праймеры (PCR - полимеразная цепная реакция) для клонирования кДНК семеногелина из коммерчески доступной кДНК-библиотеки, кодирующей белки предстательной железы (Clonetech, Palo Alto, CA.). Очищенную кДНК семеногелина встраивали в бактериальный экспрессирующий вектор pTAC (Linemeyer, D.L., Kelli, I.J., Minke, J. G. , Gimenez-Gallego, G., DeSalvo, J. & Thomas, K.A., (1987) Bio/ Technology 5, 960-965). кДНК семеногелина конструировали таким образом, что эпитоп тубулина находился у карбоксильного конца белка семеногелина. Семеногелин, экспрессированный с помощью бактериального вектора, очищали на колонке с антителом против тубулина. Очищенный белок семеногелин I смешивали с простатическим антигеном (PSA) (изготовленным промышленным путем (York Biologicals International, Stony Brook, NY)), в молярном отношении 100/1 (семеногелин 1/PSA) в 12 мМ Трис, pH 8,0, 25 мМ NaCl, 0,5 мМ CaCl2, а затем инкубировали в течение различных промежутков времени. Гидролизат фракционировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносили путем электрофореза на фильтровальную бумагу ProBlott (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA.) в буфере CAPs (Matsudaira, P. , (1987) J. Biol. Chem. 252, 10035-10038). Фильтровальную бумагу ProBlott окрашивали кумасси синим для идентификации новых PSA-продуцированных фрагментов семеногелина I. Новые фрагменты вырезали из фильтра скальпелем и определяли их последовательности. После идентификации протеолитических фрагментов посредством гидролиза в различные периоды времени проводили реакцию гидролиза в течение 10 минут. Затем определяли относительную аффинность PSA для 5 потенциальных сайтов расщепления в последовательности семеногелина I, а именно: сайт 349/350 > сайт 375/376 > сайт 289/290 > сайт 315/316 > сайт 159/160. Относительные аффинности были получены исходя из интенсивности окраски кумасси синим каждого PSA-продуцированного пептидного фрагмента. Эти интенсивности имели приблизительные отношения 3:1:0,6:0,3.
Пример 2
Получение олигопептидов, содержащих сайт PSA-опосредованного расщепления
Олигопептиды получали путем твердофазного синтеза, где введение аминокислот осуществляли по схеме двойного присоединения на автоматическом пептидном синтезаторе Applied Biosystems модели 430A. Деблокирование и отделение олигопептида от полимерного носителя осуществляли путем обработки жидкой фтористоводородной кислотой. Олигопептиды очищали с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления на обращение-фазовой колонке с двуокисью кремния C18 с использованием градиента водной 0,1% трифторуксусной кислоты/ацетонитрила. Идентичность и гомогенность олигопептидов были подтверждены с помощью анализа аминокислотного состава жидкостной хроматографией высокого давления и масс-спектрометрического анализа путем бомбардировки быстрыми атомами. Олигопептиды, полученные этим методом, представлены на фиг. 2.
Пример 3
Оценка распознавания олигопептидов свободным PSA
Олигопептиды, полученные, как описано в примере 2, отдельно растворяли в буфере для PSA-гидролиза (12 мМ трис (гидроксиметил)аминометан, pH 8,0. 25 мМ NaCl, 0,5 мМ CaCl2) и полученный раствор добавляли к PSA в молярном отношении 100:1. Реакцию прекращали через различные промежутки времени путем добавления трифторуксусной кислоты (TFA) до конечного объема 1% (объем/объем). Погашенную реакцию анализировали с помощью ЖХВД на обращенно-фазовой колонке C18 с использованием градиента 0,1%, TFA/ацетонитрила. Результаты оценки представлены на фиг. 2. Другие олигопептиды, полученные, как описано в примере 2, были проанализированы тем же способом, за исключением того, что реакцию гасили через 4 часа. Результаты оценки показаны на фиг. 3. Удаление аспарагинового остатка из амино-конца олигопептида приводит к значительному ослаблению PSA-опосредованного гидролиза пептида, а присутствие остатка глутаминовой кислоты в карбоксильном конце пептида, очевидно, не играет решающей роли в распознавании простатическим антигеном.
Пример 4
Получение нерасщепляемых конъюгатов олигопептида и доксорубицина
Производные доксорубицина, показанные в таблице 2, были получены в соответствии со следующей общей реакцией:
К смеси доксорубицина (Sigma) и соответствующего пептида (полученного путем твердофазного синтеза или закупленного в готовом виде (Sigma)) в ДМСО добавляли HBTS и HOBT вместе с диизопропилэтиламином и реакционную смесь размешивали в течение ночи. Затем неочищенную реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с C-18, используя градиент 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) в ацетонитриле/ 0,1% TFA в воде.
Пример 5
In vitro-анализ цитотоксичности пептидиловых производных доксорубицина
Цитотоксичности нерасщепляемых конъюгатов олигопептида и доксорубицина (полученных, как описано в примере 4) против линии клеток, которые, как известно, подвергаются цитолизу под действием немодифицированного доксорубицина, оценивали посредством анализа с использованием аламарового синего. Для этого клеточные культуры клеток опухоли предстательной железы LNCaP, которые представляют собой метастатические клетки аденокарциомы предстательной железы, выделенные из пункционной биопсии лимфатического узла (LNCaP. FGC: Американская коллекция типовых культур, АТСС CRL 1740), или клеток DuPRO в 96-луночных планшетах разводили средой, содержащей различные концентрации данного конъюгата (конечный объем лунки планшета составляет 200 мкл). Затем клетки инкубировали в течение 3 дней при 37oC, после чего в лунку добавляли 20 мкл аламарового синего. После этого клетки снова инкубировали и аналитические планшеты прочитывали на ELISA-ридере ЕI-310 при двух длинах волн 570 и 600 нм через 4 и 7 часов после добавления аламарового синего. Затем вычисляли относительный процент жизнеспособности клеток при различных концентрациях испытуемых конъюгатов по сравнению с контрольными культурами (в отсутствие конъюгата). Оценивали также цитотоксичности немодифицированного дозоксорубицина и немодифицированного олигопептида. На фиг. 3 представлены данные цитотоксичности для характерного соединения (Соединения 12d).
Пример 6
Оценка ферментативной активности простатического антигена, происходящего из клеток LNCaP
Ферментативная активность была продемонстрирована путем инкубирования кондиционированной клетками LNCaP бессывороточной среды (примерно 200-кратно концентрированной) с рекомбинантным белком семеногелином I. Затем приблизительно 0,5 мкг иммунореактивного PSA в концентрированной кондиционированной среде (определенной с помощью ELISA HYBPIDTECH (Tandem Е)) смешивали приблизительно с 3 мкг рекомбинантного семеногелина I и инкубировали в течение 4 часов при 37oC. По окончании инкубирования гидролизованную смесь анализировали с помощью Вестерн-блот-анализа. Результаты показали, что очищенный PSA из спермы и PSA из LNCaP-кондиционированной среды давали идентичные протеолитические карты рекомбинантного белка семеногелина I. Таким образом клетки LNCaP продуцируют ферментативно активный PSA. Клетки LNCaP являются онкогенными у "голых" (бестимусных) мышей и продуцируют детектируемые уровни циркулирующего PSA.
Пример 7
Получение расщепляемых конъюгатов олигопептида-доксорубицина
Производные доксорубицина, в которых олигопептид, протеолитически расщепляемый свободным PSA, ковалентно связан с амином углеводной части доксорубицина, были получены в соответствии со следующей общей реакцией: к смеси дозоксорубицина (Sigma) и соответствующего пептида (полученного путем твердофазного синтеза, как описано в примере 2) в ДМСО добавляли HBTS и HOBT вместе с диизопропилэтиламином и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Неочищенную реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с C-18, используя градиент 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) в ацетонитриле /0,1% TFA в воде. В случае, если на пептиде присутствовали реакционноспособные аминогруппы, то эти функциональные группы обычно блокировали флуоренилметилоксикарбонильной защитной группой, которую затем удаляли путем обработки вторичным амином, таким как пиперидин и т.п., а затем конъюгировали с доксорубицином. Конъюгаты настоящего изобретения имеют структуру общей формулы:
Figure 00000152

и могут быть обозначены как "Ас-пептид-DOX (3')". Конъюгаты, полученные этим способом, представлены на фиг. 5 (в таблице)/
Пример 8
Оценка распознавания конъюгатов "олигопептид-доксорубицин" свободным PSA
Конъюгаты, полученные, как описано в примере 7, отдельно растворяли в буфере для PSA-гидролиза (12 мМ трис(гидроксиметил)аминометан, pH 8,0; 0,25 мМ NaCl, 0,5 мМ CaCl2), и полученный раствор добавляли к PSA в молярном отношении 100: 1. Реакцию гасили через различные промежутки времени путем добавления трифторуксусной кислоты (TFA) до конечной концентрации 1% (объем/объем). После гашения реакции реакционную смесь анализировали с помощью ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с C-18 с использованием градиента водной 0,1% TFA/ацетонитрила. Результаты оценки показаны на фиг. 5 (в таблице).
Пример 9
Оценка расщепления конъюгатов "олигопептид-доксорубицин" в кондиционированной клетками среде
Кондиционированные клетками бессывороточные среды MEMα (не содержащие фенолового красного) собирали через 3 дня после их добавления либо к клеточной линии LNCaP, либо к клеточной линии Dupro (полученных, как описано в J. Urology, 146: 915-919 (1991)). Эти среды 20-кратно концентрировали с использованием концентратора Amicon®
Figure 00000153
с молекулярно-массовой отсечкой 10000. LNCaP-кондиционированная среда содержала свободный PSA-белок в средней концентрации приблизительно 100 нг/мл, как было определено с помощью набора для иммунодетекции Tandem®-E PSA (Hybritech®) . При этом в кондиционированной клетками Dupro среде свободного простатического антигена обнаружено не было.
100 мкл - порции концентрированной кондиционированной среды смешивали с 35 мкг конъюгата олигопептида-доксорубицина, полученного, как описано в примере 7, и смесь инкубировали при 37oC в течение периодов времени 0, 4 и 24 часа. Затем реакции прекращали путем добавления ZnCl2 (до конечной концентрации 0,01 М) и анализировали с помощью ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке с CD18 и с использованием градиента водной 1% TFA/ацетонитрила в целях определения процента гидролизованного конъюгата пептида-цитотоксического агента. Результаты оценки представлены на фиг. 6 (в таблице).
Пример 10
In vitro-анализ цитотоксичности пептидиловых производных доксорубицина
Цитотоксичность расщепляемых конъюгатов олигопептида-доксорубицина (полученных, как описано в примере 7) против линии клеток, которые, как известно, подвержены цитолизу под действием немодифицированного доксорубицина, оценивали с помощью анализа с использованием аламарового синего, как описано в примере 5. Для этого клеточные культуры опухолевых клеток предстательной железы LNCaP или клеток Dupro в 96-луночных планшетах разводили средой, содержащей различные концентрации данного конъюгата (конечный объем лунки планшета составлял 200 мкл). Затем клетки инкубировали в течение 3 дней при 37oC, и в аналитическую лунку добавляли 20 мкл аламарового синего. После этого клетки снова инкубировали и аналитические планшеты прочитывали на ELISA-ридере EL-310 при двух длинах волн: 570 и 600 нм через 4 и 7 часов после добавления аламарового синего. Затем вычисляли относительный процент жизнеспособности клеток при различных концентрациях испытуемых конъюгатов по сравнению с контрольными культурами (в отсутствие конъюгата). В этом же самом анализе оценивали также цитотоксичность конъюгатов по сравнению с цитотоксичностью немодифицированного доксорубицина и немодифицированного олигопептида. Результаты анализа представлены на фиг. 7 (в таблице). Т

Claims (23)

1. Олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser, либо связь Tyr-Gln, либо связь между гомологичными им, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты.
2. Олигопептид по п.1, содержащий от 6 до 12 аминокислот.
3. Олигопептид по п.1, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в графической части,
где hArg представляет собой гомоаргинин;
Хаа представляет собой любую натуральную аминокислоту.
4. Олигопептид по п.3, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в графической части.
5. Олигопептид по п.3, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в графической части.
6. Олигопептид по п.3, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в графической части.
7. Олигопептид по п.1, который выбирают из (см. графическую часть).
8. Олигопептид по п.1, который представляет собой (см. графическую часть).
9. Способ определения протеолитической активности свободного специфического антигена простаты в образце, включающий в себя следующие стадии: (а) осуществление реакции субстрата, где субстрат представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser, либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты; и (б) регистрацию расщепления субстрата.
10. Способ по п.9, при котором олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот.
11. Способ по п.9, в котором стадия регистрации расщепления субстрата включает в себя анализ реакционной смеси с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения.
12. Способ идентификации соединений, ингибирующих протеолитическую активность специфического антигена простаты, включающий в себя следующие стадии: (а) осуществление реакции субстрата, где субстрат представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser, либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты, со свободным специфическим антигеном простаты в присутствии испытуемого соединения; и (б) регистрацию расщепления субстрата, при которой на способность испытуемого соединения ингибировать протеолитическую активность специфического антигена простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, указывает снижение уровня расщепления субстрата по сравнению с расщеплением субстрата в отсутствие испытуемого соединения.
13. Способ по п.12, при котором олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот.
14. Способ по п.12, при котором стадия регистрации расщепления субстрата предусматривает анализ аналитической смеси с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения.
15. Конъюгат, который может быть использован для лечения рака предстательной железы и который содержит цитотоксический агент, связанный с олигопептидом, содержащим от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser, либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты, причем указанный цитотоксический агент связан с указанным олигопептидом посредством ковалентной связи или химического линкера и цитотоксический агент выбирают из доксорубицина и винбластина или их цитотоксических производных.
16. Конъюгат по п.15, в котором олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот.
17. Конъюгат по п.15, в котором цитотоксическим агентом является доксорубицин или его цитотоксическое производное.
18. Конъюгат по п.17, имеющий формулу I
Figure 00000154

в которой "олигопептид" представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты в ферментативно активной форме, не образующей комплекс с какой-либо ингибирующей молекулой, и который содержит связь Gln-Ser, либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты;
XL отсутствует или представляет собой аминокислоту, выбранную из следующих аминокислот: а) фенилаланина, b) лейцина, с) валина, d) изолейцина, е) (2-нафтил)аланина, f) циклогексилаланина, g) дифенилаланина, h) норвалина и j) норлейцина;
R представляет собой водород или -(C=O)R1;
R1 представляет собой C1 - C6-алкил или арил.
19. Конъюгат по п.18, в котором олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот.
20. Конъюгат по п.18, в котором олигопептид является олигомером, содержащим аминокислотную последовательность, выбираемую из (см. графическую часть),
где hArg представляет собой гомоаргинин;
Хаа представляет собой любую натуральную аминокислоту;
XL отсутствует или представляет собой аминокислоту, выбранную из: а) лейцина, b) изолейцина и с) валина;
R представляет собой ацетил, пивалоил или бензоил.
21. Конъюгат по п.17, который выбирают из
Figure 00000155

где Х представляет собой (см. графическую часть).
22. Конъюгат по п.15, имеющий формулу II
Figure 00000156

в которой "олигопептид" представляет собой олигопептид, содержащий от 6 до 100 аминокислот, который распознается и протеолитически селективно расщепляется свободным специфическим антигеном простаты и который содержит связь Gln-Ser, либо связь Tyr-Ser, либо связь между гомологичными им, изостерными и/или изоэлектронными аминокислотами, расщепляемую специфическим антигеном простаты.
23. Конъюгат по п.21, в котором олигопептид содержит от 6 до 12 аминокислот.
Приоритеты по пунктам:
28.06.1994 по пп.6, 7, 11, 14 и 17;
15.03.1995 по пп.1, 2, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18 и 19;
07.06.1995 по пп.3, 4, 20, 21 и 22.
RU97101169/04A 1994-06-28 1995-06-07 Новые пептиды RU2162855C2 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/267,092 US5599686A (en) 1994-06-28 1994-06-28 Peptides
US267092 1994-06-28
US40483395A 1995-03-15 1995-03-15
US404833 1995-03-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU97101169A RU97101169A (ru) 1999-02-20
RU2162855C2 true RU2162855C2 (ru) 2001-02-10

Family

ID=26952210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU97101169/04A RU2162855C2 (ru) 1994-06-28 1995-06-07 Новые пептиды

Country Status (27)

Country Link
US (1) US6143864A (ru)
EP (1) EP0771209B1 (ru)
JP (1) JPH10502619A (ru)
KR (1) KR100379351B1 (ru)
CN (1) CN1156964A (ru)
AT (1) ATE223224T1 (ru)
AU (1) AU689934B2 (ru)
BG (1) BG63453B1 (ru)
BR (1) BR9508151A (ru)
CA (1) CA2192957A1 (ru)
CZ (1) CZ381096A3 (ru)
DE (1) DE69528064T2 (ru)
DK (1) DK0771209T3 (ru)
ES (1) ES2182908T3 (ru)
FI (1) FI965225A (ru)
HK (1) HK1009038A1 (ru)
HU (1) HU220877B1 (ru)
MX (1) MX9700043A (ru)
NO (1) NO965592L (ru)
NZ (1) NZ290239A (ru)
PL (1) PL186341B1 (ru)
PT (1) PT771209E (ru)
RO (1) RO116198B1 (ru)
RU (1) RU2162855C2 (ru)
SK (1) SK164096A3 (ru)
UA (1) UA55371C2 (ru)
WO (1) WO1996000503A1 (ru)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5502037A (en) * 1993-07-09 1996-03-26 Neuromed Technologies, Inc. Pro-cytotoxic drug conjugates for anticancer therapy
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
DK0769967T3 (da) * 1994-08-19 2008-03-31 Wallone Region Konjugater der omfatter et antitumormiddel, og anvendelse heraf
WO1997014416A1 (en) * 1995-10-18 1997-04-24 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US5952294A (en) * 1996-07-31 1999-09-14 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptidyl prodrugs and methods of making and using the same
US5998362A (en) * 1996-09-12 1999-12-07 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US6177404B1 (en) 1996-10-15 2001-01-23 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
HRP970566A2 (en) * 1996-10-30 1998-08-31 Jones Deborah Defeo Conjugates useful in the treatment of prostate canser
US5948750A (en) * 1996-10-30 1999-09-07 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
DE69729389D1 (de) * 1996-11-06 2004-07-08 Nasa Protease-aktivierbare pseudomonas exotoxin-a-ähnliche proproteine
AU7582298A (en) 1997-05-19 1998-12-11 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Tissue specific prodrug
US6504014B1 (en) 1997-05-19 2003-01-07 The John Hopkins University Tissue specific prodrug
US6545131B1 (en) 1997-05-19 2003-04-08 The Johns Hopkins University Tissue specific prodrug
US6391305B1 (en) * 1997-09-10 2002-05-21 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
KR100580137B1 (ko) * 1997-12-02 2006-05-16 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드 전립선 암 치료에 유용한 접합체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
EP1069906A1 (en) * 1998-03-05 2001-01-24 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostrate cancer
US6174858B1 (en) 1998-11-17 2001-01-16 Merck & Co., Inc. Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US7425541B2 (en) 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
US6649587B1 (en) 1999-04-30 2003-11-18 Slil Biomedical Corporation Polyamine analog conjugates and quinone conjugates as therapies for cancers and prostate diseases
US6482943B1 (en) 1999-04-30 2002-11-19 Slil Biomedical Corporation Quinones as disease therapies
AU4678300A (en) * 1999-04-30 2000-11-17 Slil Biomedical Corporation Novel polyamine analog conjugates and quinone conjugates as therapies for cancers and prostate diseases
DE60032784T2 (de) * 1999-10-07 2007-11-08 Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont Markerproteine für prostatakrebs
GB9924759D0 (en) 1999-10-19 1999-12-22 Merck Sharp & Dohme Process for preparing peptide intermediates
PL360826A1 (en) 2000-03-15 2004-09-20 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Peptidase-cleavable, targeted antineoplastic drugs and their therapeutic use
AU2001266853B2 (en) 2000-06-14 2005-02-17 Medarex, Inc. Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue
EP1219634A1 (en) * 2000-12-27 2002-07-03 Bayer Aktiengesellschaft Cytostatic-glycoconjugates having specifically cleavable peptidic linking units
WO2002081630A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of semenogelin in the diagnosis, prognosis and treatment of cancer
DK1567641T3 (da) * 2001-08-24 2012-08-27 Uvic Industry Partnerships Inc Proaerolysin indeholdende proteaseaktiveringssekvenser og fremgangsmåder til anvendelse til behandling af prostatacancer.
WO2003046180A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Genset S.A. Human cdnas and proteins and uses thereof
US7108976B2 (en) * 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
CA2503730C (en) * 2002-10-31 2011-10-18 Metabasis Therapeutics, Inc. Cytarabine monophosphate prodrugs
WO2005041981A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Kurume University Combination therapy of peptide vaccination and estramustine treatment
DE602006020867D1 (de) 2005-06-14 2011-05-05 Protox Therapeutics Inc Verfahren zur behandlung oder prävention gutartiger prostatahyperplasie unter verwendung modifizierter porenbildender proteine
JP5278873B2 (ja) * 2008-05-14 2013-09-04 国立大学法人九州工業大学 癌診断用試薬
US9046529B2 (en) 2009-04-10 2015-06-02 The Regents Of The University Of California Prostatitis-associated antigens and methods of use thereof
KR20110069618A (ko) * 2009-12-17 2011-06-23 주식회사 셀앤바이오 전립선암 진단용 키트 및 진단방법
CN106061984A (zh) 2014-02-13 2016-10-26 配体药物公司 前药化合物及其用途
EP3164136A4 (en) 2014-07-02 2018-04-04 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Prodrug compounds and uses therof
CA3087932A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Ligand Pharmaceuticals, Inc. Acetal compounds and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4296105A (en) * 1978-08-03 1981-10-20 Institut International De Pathologie Cellulaire Et Moleculaire Derivatives of doxorubicine, their preparation and use
US4277466A (en) * 1978-08-29 1981-07-07 Institut International De Pathologie Cellulaire Et Moleculaire Complexes of DNA and esters derived from daunorubicine, their preparation and use
US4446122A (en) * 1979-12-28 1984-05-01 Research Corporation Purified human prostate antigen
OA06421A (fr) * 1980-06-10 1981-09-30 Omnium Chimique Sa Procédé de préparation de dérivés N-(vinblastinoyl-23) d'acides aminés et de peptides.
HUT34212A (en) * 1983-04-29 1985-02-28 Omnichem Sa Process for the production of new vindblastin conjugates
FR2546163B1 (fr) * 1983-05-16 1987-10-09 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives acyles hydrosolubles de peptides ou d'amino-acides, leur preparation et leur application
EP0126344A2 (en) * 1983-05-20 1984-11-28 Abbott Laboratories Tripeptide esters of therapeutic agents
FR2583983B1 (fr) * 1985-06-07 1988-05-27 Centre Nat Rech Scient Nouvelles prodrogues macromoleculaires hydrosolubles, leur preparation et leur utilisation comme medicaments notamment antitumoraux et antiparasitaires
EP0232693A3 (fr) * 1985-12-16 1988-04-06 La Region Wallonne Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2626882B1 (fr) * 1988-02-08 1991-11-08 Ire Celltarg Sa Conjugues de derives de vinca comportant une chaine detergente en position c-3
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5220001A (en) * 1989-10-25 1993-06-15 Zaidan Hojim Biseibutsu Dong-A Pharm Co. Anthracycline glycoside derivatives
US5137877B1 (en) * 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
SE9002480D0 (sv) * 1990-07-23 1990-07-23 Hans Lilja Assay of free and complexed prostate-specific antigen
FR2678274A1 (fr) * 1991-06-25 1992-12-31 Medgenix Group Sa N-leucyl epirubicine application a titre de medicament antitumoral et procede de preparation.
US5288612A (en) * 1991-07-03 1994-02-22 The Scripps Research Institute Assay methods for detecting serum proteases, particularly activated protein C
US5622929A (en) * 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
DE4233152A1 (de) * 1992-10-02 1994-04-07 Behringwerke Ag Antikörper-Enzym-Konjugate zur Prodrug-Aktivierung
JPH08502889A (ja) * 1992-10-29 1996-04-02 トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティ 前立腺癌の微小転移を検出する方法
AU6364094A (en) * 1993-03-12 1994-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Anthracyclines with unusually high activity against cells resistant to doxorubicin and its analogs
EP0804593A1 (en) * 1994-05-10 1997-11-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Recombinant hk2 polypeptide
US5866679A (en) * 1994-06-28 1999-02-02 Merck & Co., Inc. Peptides
US5599686A (en) * 1994-06-28 1997-02-04 Merck & Co., Inc. Peptides
DK0769967T3 (da) * 1994-08-19 2008-03-31 Wallone Region Konjugater der omfatter et antitumormiddel, og anvendelse heraf
AUPM769394A0 (en) * 1994-08-25 1994-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Assay for the detection of proteases

Also Published As

Publication number Publication date
EP0771209A4 (en) 2000-04-26
PT771209E (pt) 2002-12-31
JPH10502619A (ja) 1998-03-10
US6143864A (en) 2000-11-07
HU9603564D0 (en) 1997-02-28
NO965592D0 (no) 1996-12-27
NO965592L (no) 1997-02-28
KR970703780A (ko) 1997-08-09
ATE223224T1 (de) 2002-09-15
ES2182908T3 (es) 2003-03-16
WO1996000503A1 (en) 1996-01-11
AU689934B2 (en) 1998-04-09
BG63453B1 (bg) 2002-02-28
AU3092295A (en) 1996-01-25
PL317872A1 (en) 1997-04-28
MX9700043A (es) 1997-04-30
EP0771209A2 (en) 1997-05-07
NZ290239A (en) 1998-11-25
DE69528064D1 (de) 2002-10-10
HK1009038A1 (en) 1999-07-02
KR100379351B1 (ko) 2003-10-30
FI965225A (fi) 1997-02-26
HUT76350A (en) 1997-08-28
CA2192957A1 (en) 1996-01-11
BR9508151A (pt) 1999-03-30
RO116198B1 (ro) 2000-11-30
SK164096A3 (en) 1997-06-04
FI965225A0 (fi) 1996-12-27
EP0771209B1 (en) 2002-09-04
UA55371C2 (ru) 2003-04-15
DK0771209T3 (da) 2002-10-07
DE69528064T2 (de) 2003-08-07
CZ381096A3 (en) 1997-04-16
CN1156964A (zh) 1997-08-13
PL186341B1 (pl) 2003-12-31
HU220877B1 (en) 2002-06-29
BG101077A (en) 1998-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2162855C2 (ru) Новые пептиды
US5866679A (en) Peptides
US5599686A (en) Peptides
US6177404B1 (en) Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US5948750A (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US6391305B1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU715632B2 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
EP0942754B1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
US5998362A (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU708475B2 (en) Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia
US20030232760A1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
KR100580137B1 (ko) 전립선 암 치료에 유용한 접합체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
US20020115596A1 (en) Conjugates useful in the treatment of prostate cancer
AU714288B2 (en) Novel peptides
CA2234763A1 (en) Conjugates useful in the treatment of benign prostatic hyperplasia

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20090608