KR20110069618A

KR20110069618A - 전립선암 진단용 키트 및 진단방법

Info

Publication number: KR20110069618A
Application number: KR1020090126422A
Authority: KR
Inventors: 윤강준; 손영숙; 홍현숙; 최형원
Original assignee: 주식회사 셀앤바이오; 주식회사 스템싸이언스
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-06-23
Also published as: US20120252040A1; JP2013513815A; WO2011074802A3; WO2011074802A2; EP2515115A2; EP2515115A4; CN102656457A

Abstract

본 발명은 전립선-특이 항원(prostate specific antigen, PSA)에 대한 항체를 사용하여 인간 소변 중의 PSA를 검출하는 것을 포함하는 전립선암 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 PSA에 대한 항체를 포함하고 시료로서 인간 소변이 사용되는 전립선암 진단용 키트, 및 인간 소변 시료를 PSA에 대한 항체와 접촉시켜 PSA를 검출하는 것을 포함하는 전립선암 진단방법에 관한 것이다.

PSA, 전립선암, 소변, 키트, 진단방법

Description

전립선암 진단용 키트 및 진단방법{Kit and method for diagnosis of prostate cancer}

본 발명은 PSA에 대한 항체를 사용하여 인간 소변 중의 PSA를 검출하는 것을 포함하는 전립선암 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것이다.

전립선암은 미국 남성 사망률 2위의 암으로써 우리나라 역시 환자 수가 늘고 있는 실정이다. 1989년만 해도 한국 남성 암 환자 가운데 1.2%만을 차지했지만 현재는 남성 암 환자의 3%를 자치하고 있다. 사망률도 1990년대에는 0.2%에 불과했지만 2000년대 들어서는 1.6%에 접어들었다. 전립선암은 다른 암과는 달리 매우 천천히 증식하는 특징이 있다. 따라서 이 암을 조기에 진단할 수 있다면 치료의 가능성을 높일 수 있기 때문에 초기 진단의 중요성이 대두된다.

전립선-특이 항원(prostate specific antigen, PSA)은 분자량이 약 33 kDa로 전립선 표피에서 높은 수준으로 발현되는 세린 단백질 분해효소로 정액으로 분비되며, 그 농도는 1-3g/L이다. 정상인의 경우 정액으로 분비된 PSA는 정낭특이단백질을 분해하여 응결된 정액을 용해한다(Ulf-Hakan Stenman et al., Cancer Biology, 9: 83-93, 1999). 정상 전립선은 생성된 PSA 중 극히 일부만이 혈액으로 새어 나 간다. 그러나 전립선이 비대해지면 상당량이 누출되고 전립선암인 경우 다량의 PSA가 빠져나가 혈중 PSA 수치가 높아진다. 따라서 PSA는 전립선암뿐만 아니라 전립선비대증과 같은 전립선 이상 증상의 중요한 표지자가 될 수 있다. 현재까지 PSA 검사로 전립선암의 조기진단이 급증하였고, 조기 전립선암을 비롯하여 존재하던 암이 상당 수 제거된 이후 PSA는 급감하는 양상을 보인다(대한비뇨기과 학회지, 1999).

정상인의 혈중 PSA는 0-4 ng/ml이다. PSA가 1-1.5 ng/ml인 경우, 1.0 ng/ml 이하인 사람에 비해 2배, 2-3 ng/ml인 경우, 1.0 ng/ml 이하인 사람에 비해 5배 정도 전립선암 발병 위험이 높아진다. 나이가 들수록 전립선이 커지는 만큼 PSA 수치도 연령에 따라 조금씩 차이가 있는데 50대는 0-3.5 ng/ml, 60대인 경우 0-4.5 ng/ml, 70대는 0-6.5 ng/ml 정도이다.

현재 진단용 키트 제품들은 혈청 내 PSA의 양이 3 ng/ml 이상인 환자들을 전립선암으로 분류하고 있다. 그런데 이러한 기존 제품들은 채혈을 필요로 하고 병원에서 진행을 해야 한다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 기존 제품들의 문제점을 해결한 새로운 전립선암 진단용 키트 및 진단방법에 관하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 전립선암 환자의 소변 중 PSA의 양이 정상인의 소변 중 PSA의 양보다 현저하게 적다는 것을 발견하여, 시료로서 혈액 대신 소변을 이용한 전립선암 진단용 키트 및 진단방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 PSA에 대한 항체를 포함하고 시료로서 인간 소변이 사용되는 전립선암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 소변 시료를 PSA에 대한 항체와 접촉시켜 PSA를 검출하는 것을 포함하는 전립선암 진단방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 전립선암 진단용 키트 및 진단방법은 시료로서 인간 소변을 사용하므로 종래의 혈액을 사용한 경우와 비교하여 시료 채취가 용이하고, 소변 중 PSA의 양이 정상인의 것보다 적을 경우 전립선암으로 진단할 수 있어 병원에 가지 않고도 가정에서도 쉽게 전립선암 유무를 판정할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 PSA에 대한 항체를 포함하고 시료로서 인간 소변이 사용되는 전립선암 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 인간 소변 시료를 PSA에 대한 항체와 접촉시켜 PSA를 검출하는 것을 포함하는 전립선암 진단방법을 제공한다.

본 발명자들은 놀랍게도 전립선암 환자의 소변 중 PSA 양이 정상인의 소변 중 PSA 양보다 현저히 적은 것을 발견하였다. 이와 같이 전립선암 환자의 소변 중 PSA 양이 정상인의 것보다 감소하게 되는 구체적인 메카니즘은 밝혀지지 않았으나, 정상인의 경우 전립선에서 생성된 PSA가 요도로 정상적으로 분비되어 소변에서 검출되지만 전립선에 이상이 있는 경우 생성된 PSA의 요도로의 분비가 원활하지 못하기 때문이라고 추측된다.

따라서 본 발명의 전립선암 진단용 키트 및 진단방법은 시료로서 종래의 혈액 대신 소변을 사용하며, PSA에 대한 항체에 의해 검출된 인간 소변 중의 PSA의 양이 정상인의 것보다 적을 경우 전립선암으로 진단할 수 있다.

본 발명의 전립선암 진단용 키트 및 진단방법에 있어서, PSA에 대한 항체에 의해 검출된 인간 소변 중의 PSA의 양이 10 ng/ml 이하인 경우 전립선암으로 진단할 수 있다. 바람직하게는, PSA에 대한 항체에 의해 검출된 인간 소변 중의 PSA의 양이 7 ng/ml 이하인 경우 전립선암으로 진단할 수 있다.

후술하는 실시예에서는 정상인의 소변 중 PSA 양은 무려 50-80 ng/ml인 반면, 전립선암 환자의 소변 중 PSA 양은 불과 5 ng/ml 이하로 측정되었다. 또한 정상인의 혈액 중 PSA 평균값은 1.0615 pg/ml에 불과한 반면, 전립선암 환자의 PSA 양은 20 pg/ml에서 800 pg/ml까지 다양했고 그 평균값은 332.5 pg/ml에 달했다. 이러한 결과로부터 전립선암의 경우 혈중 PSA는 현저히 증가하는 반면, 소변으로의 PSA 분비는 오히려 감소하는 경향을 보이고, 따라서 소변 중의 PSA의 양이 정상인의 소변 중의 PSA의 양보다 현저하게 적다면 전립선암으로 추정할 수 있을 것이다.

본 발명의 전립선암 진단용 키트 및 진단방법에 있어서, PSA에 대한 항체는 그 종류에 제한이 없으며, 상업적으로 이용가능한 항-PSA 항체를 구입하여 그대로 사용하거나, 공지된 방법에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 HB-10494, HB-9119, HB-11426, HB-8051, HB-8525, HB-8527(American Type Culture Collection, VA, USA) 및 anti-PSA Ab(cat no: MO-C40081C: C-PSA1, Abazyme, Needham, MA, USA)로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 항체를 사용할 수 있다.

본 발명의 전립선암 진단용 키트 및 진단방법에 있어서, 소변 중의 PSA는 키트 내의 PSA에 대한 항체와 항원-항체 반응을 통해 면역학적 복합체를 형성하게 된다. 형성된 면역학적 복합체는 면역분석법을 사용하여 검출할 수 있다. 항원을 검출하고/하거나 정량하는데 사용되는 수많은 면역분석법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988, 556-612]을 참조한다. 면역분석법의 구체적인 예로는 면역크로마토그래피법(immunochromatography), 웨스턴 블롯(western blot), 효소-결합된 면역흡착분석(ELISA), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역세포화학법(immunocytochemistry) 등을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생 성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함된다. 검출 표지제가 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 전립선암 진단용 키트 및 진단방법에 있어서, PSA에 대한 항체에 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제가 결합될 수 있다. 검출 표지제의 예는 다양한 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사성 물질 등을 포함한다. 검출 표지제는 당해 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 PSA에 대한 항체에 직접적으로 커플링 또는 결합되거나, 중간체(예를 들면, 당해 분야에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링 또는 결합되거나, PSA 단백질을 인식하는 또 다른 다클론항체 또는 PSA 항체를 인식하는 항체인 2차 항체에 커플링 또는 결합될 수 있다. 적합한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 아세틸콜린 에스터라제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산 디하이드로게나아제, 인버타제 등을 포함하고; 적합한 보결분자족 복합체의 예는 스트렙트아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디 클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 피코에리트린 또는 피코빌리프로테인 등을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀, 이소루시놀, 루시제닌을 포함하고; 생물 발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하며; 적합한 방사선 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In, ⁹⁹Tc ¹⁴C, ³H 등을 포함한다. 적합한 발색 물질의 예로 골드(gold), 카본(carbon), 라텍스(latex)를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 전립선암 진단용 키트는 PSA에 대한 항체, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제를 포함하는 용기 및 사용설명서를 포함할 수 있다. 검출 표지제가 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있고, 검출 표지제는 PSA에 대한 항체에 직접적으로 또는 링커를 통해 커플링 또는 결합되거나, PSA 항체를 인식하는 항체인 2차 항체에 커플링 또는 결합될 수 있다.

본 발명의 전립선암 진단용 키트는 면역크로마토그래피법(immunochromatograpic assay)을 기초로 고안된 현재 시판되고 있는 전립선암 진단용 키트의 원리를 그대로 이용할 수 있다. 면역크로마토그래피법은 면역화학법(immunochemistry)과 크로마토그래피법(chromatogrphic assay)를 결합한 검사방법으로 항원에 대한 항체의 특이적인 면역반응성, 금입자(colloidal gold)의 발색 특성 및 유동성 막(porous membrane)의 모세관현상에 의한 분자의 이동을 응용한 검사방법이다. 면역크로마토그래피법은 기존의 멀티-스텝(multi-step) 면역측정법에서 요구되는 검체희석, 세정 및 효소 결합체와 기질의 반응을 통한 발색과정을 하나로 통합하여 원-스텝(one-step)으로 신속하게 검사할 수 있는 편리성이 있다. 또한 특정한 장비를 사용하지 않고 검사결과를 판정할 수 있는 용이성 및 경제성, 검사결과 판독의 신속성의 장점이 있다.

본 발명의 바람직한 일례에서, PSA에 대한 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 인간 소변 시료를 첨가하여 반응시키고, 효소-2차 항체 결합체를 반응시킨 후 상기 효소의 기질을 처리하여 흡광도를 측정하고, 상기 흡광도를 표준곡선과 비교하여 인간 소변 내에 존재하는 PSA를 정량할 수 있다. 상기 효소-2차 항체 결합체에 있어서 2차 항체에 바이오틴을 결합하여 사용할 수 있다. 또한 상기 효소는 호스래디쉬 퍼옥시다제일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, ELISA 분석법에 사용되는 효소 및 기질을 모두 본 발명에 적용할 수 있다.

ELISA 분석은 항체-항원 반응을 이용하여 시료 중에 존재하는 항원의 존재 유무 및 정량하는 분석 방법이다. 하나의 ELISA 키트에 필요한 항체는 2 또는 3개이다. PSA에 대한 항체를 이용한 ELISA 키트에서는 2개의 항체로 구성되며 그 구성과 원리는 다음과 같다.

먼저, 96-웰 플레이트에 PSA에 대한 항체(1차 항체)를 코팅하고, PSA를 포함하는 인간 소변 시료를 상기 웰에 첨가하여 반응시키고, 효소 표지된 다클론 항체(2차 항체)를 반응시키고, 상기 효소 표지와 반응 가능한 기질을 처리한 후에, 효소-기질 반응을 탐지하고, 표준곡선과 비교하여 시료 내에 존재하는 PSA를 정량할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일례에서, 효소와 기질로서 바이오틴과 스트렙트아비딘 컨쥬게이트된 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: PSA에 대한 항체를 이용한 인간 소변 중의 PSA 정량

정상인 20명과 전립선암 환자 10명의 소변을 각각 채취하고, 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 소변 시료 내 PSA를 ELISA(Abazyme cat no EL10005)를 이용하여 다음과 같이 정량하였다.

1) ELISA 키트 내에 있는 플레이트에 항-인간 PSA 단클론 항체(cat no: MO-C40081C: C-PSA1, Abazyme, Needham, MA, USA)를 코팅하고, 각 웰에 시료를 50㎕ 씩 넣었다.

2) 잘 퍼지도록 섞어준 후, 37℃에서 30분간 보관하였다.

3) 증류수로 각 웰을 5회 세척하였다.

4) 호스래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체(Abazyme, Needham, MA, USA) 100㎕를 처리하고 37℃에서 30분간 두었다.

5) 증류수로 각 웰을 5회 세척하였다.

6) 기질 용액 100㎕을 처리한 후 37℃에서 15분간 두었다.

7) 반응이 진행되면 정지액을 넣고 반응을 정지시켰다.

8) ELISA reader 450nm 파장에서 발색된 정도를 읽었다.

측정 결과, 정상인 20명의 평균값은 50-80 ng/ml이고, 전립선암 환자 10명의 평균값은 5 ng/ml 이하였다(도 1).

실시예 2: PSA에 대한 항체를 이용한 인간 혈액 중의 PSA 정량

정상인 20명과 전립선암 환자 10명의 혈액 3ml를 각각 채취하여 원심분리(10000rpm, 5분)를 통해 적혈구 덩어리(clot)을 침전시키고 상층의 혈청을 분리하였다. 혈청 내 PSA를 ELISA(Abazyme cat no EL10005)를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 정량하였다. 측정 결과, 정상인 20명의 평균값은 1.0615 pg/ml에 불과한 반면, 전립선암 환자 10명의 PSA 수치는 20 pg/ml에서 800 pg/ml까지 다양했고 그 평균값은 332.5 pg/ml에 달했다(도 2).

실시예 1 및 2의 결과, 전립선암의 경우 혈중 PSA는 현저히 증가하는 반면, 소변으로의 PSA 분비는 오히려 감소하는 경향을 보이는 것으로 관찰되었다. 따라서 소변 중의 PSA의 양이 정상인의 소변 중의 PSA의 양보다 현저하게 적다면 전립선암으로 추정할 수 있을 것이다.

도 1은 PSA에 대한 항체를 이용하여 인간 소변 중의 PSA를 정량한 결과이다.

도 2는 PSA에 대한 항체를 이용하여 인간 혈액 중의 PSA를 정량한 결과이다.

Claims

전립선-특이 항원(prostate specific antigen, PSA)에 대한 항체를 포함하고 시료로서 인간 소변이 사용되는 전립선암 진단용 키트.
제1항에 있어서, 항체에 의해 검출된 인간 소변 중의 PSA의 양이 정상인의 것보다 적을 경우 전립선암으로 진단하는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항에 있어서, 항체에 의해 검출된 인간 소변 중의 PSA의 양이 10 ng/ml 이하인 경우 전립선암으로 진단하는 것을 특징으로 하는 키트.
인간 소변 시료를 PSA에 대한 항체와 접촉시켜 PSA를 검출하는 것을 포함하는 전립선암 진단방법.
제4항에 있어서, 항체에 의해 검출된 인간 소변 중의 PSA의 양이 정상인의 것보다 적을 경우 전립선암으로 진단하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
제4항에 있어서, 항체에 의해 검출된 인간 소변 중의 PSA의 양이 10 ng/ml 이하인 경우 전립선암으로 진단하는 것을 특징으로 하는 진단방법.