KR100379351B1 - 신규한펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본원에는 유리 전립선 특이 항원(PSA)에 의해 인식되고 단백질분해로 절단되는 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드가 기술되어 있다. 또한, 시험관내 및 생체내에서 유리 PSA 프로테아제를 측정하는데 유용한 올리고펩타이드를 포함하는 검정물이 기술된다. 또한, 이러한 올리고펩타이드와 공지된 세포 독성제의 결합체를 포함하는 치료제가 기술되어 있다.

Description

신규한 펩타이드
관련 출원
본 특허원은 1994년 6월 28일자로 출원된 공동 계류중인 특허원 제 08/267,092호의 부분연속출원인, 1995년 3월 15일자로 출원된 공동 계류중인 특허 원 제08/404,833호의 부분연속출원이다.
1994년에, 미국에서는 200,000명의 사람이 전립선암으로 진단되고, 38,000명의 미국 남성이 이 질병으로 사망할 것이다[참조: Garnick, M. B. (1994), The Dilemmas of Prostate Cancer. Scientific American, April.72-81]. 따라서, 전립선 암은 미국 남성에게서 피부암 이외에 가장 빈번히 진단되는 악성 종양이고, 폐암에 이어 미국 남성 그룹에서 암과 관련된 두번째 사망 원인이 되고 있다.
전립선 특이 항원(PSA)은 사람 전립선 상피에서만 대부분 생성되고 사람 정액에 0.5 내지 2.0mg/ml의 수준으로 존재하는 단일쇄 33kDa 당단백질이다[참조: Nadji, M., Taber, S.Z., Castro, A., et al. (1981) Cancer 48:1229; Papsidero, L., Kuriyama, M., Wang, M., et al. (1981), JNCI 66:37; Qui, S.D., Young, C.Y.F., Bihartz, D.L., et al. (1990), J. Urol. 144:1550; Wang, MC., Valenzuela, L.A., Murphy, G.P., et al. (1979). Invest, Urol. 17:159]. 단일 탄수화물 단위는 아스파라긴 잔기 45번에 부착되어 있고 총 분자량의 2 내지 3kDa인것으로 간주된다. PSA는 키모트립신-유사 특이성이 있는 프로테아제이다[참조: Christensson, A., Laurell, C.B., Lilja, H. (1990) Eur. J. Biochem. 194:755-763]. PSA는 주로 정자 포획 겔에서 주요 단백질인, 세메노겔린 I 및 세메노겔린 II, 및 피브로넥틴의 단백질 분해에 의해 사정시 형성된 겔 구조물의 분해에 관여하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lilja, H. (1985). J. Clin. Invest. 76:1899; Lilja, H., Oldbring, J. Rannevik, G., et al. (1987). J. Clin. Invest, 80:281; McGee, R.S., Herr, J.C. (1988). Biol. Reprod. 39:499]. 겔 형성 단백질의 PSA 매개된 단백질 분해는 몇몇 가용성 세메노겔린 I 및 세메노겔린 II 단편과 가용성 피브로넥틴 단편을 생성시키면서 점차적으로 운동성 정충의 사정물과 방출물을 액화시킨다[참조: Lilja, H., Laurell, C.B. (1984) Scand. J. Clin Lab. Invest, 44:447, McGee, R.S., Herr, J.C. (1987). Biol. Reprod. 37:431]. 또한, PSA는 IGFBP-3(인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3)을 단백질 분해적으로 분해시켜 IGF가 PSA 분비성 세포의 성장을 특이적으로 자극하도록 할수 있다[참조: Cohen et al., (1992) J. Clin, Endo. & Meta. 75:1046-1053].
알파 1-항키모트립신과 복합체를 형성한 PSA는 주로 존재하는 분자 형태의 혈청 PSA이고, 검출된 혈청 PSA의 95% 이하로 간주될 수 있다[참조: Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., et al. (1993). J. Urol. 150:100-105, Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625; Stenman, U.H., Leinoven, J., Alfthan, H., et al. (1991). Cancer Res. 51:222-226]. 전립선 조직(정상 조직, 양성의 과형성 조직 또는 악성 조직)은 성숙한 효소 활성 형태의PSA를 주로 방출하는데, 이는 당해 형태가 알파 1-항키모트립신과의 복합체 형성에 필요하기 때문인 것으로 생각된다[참조: Mast, A.E., Enghild, J.J., Pizzo, S.V., et al. (1991), Biochemistry 30:1723-1730; Perlmutter, D.H., Glover, G.I., Rivetna, M., et al. (1990). Proc Natl. Acad Sci USA 87:3753-3757] 따라서, 전립선 PSA 분비 세포의 미소환경하에서는, PSA가 어떠한 억제 분자와도 복합체를 형성하지 않는 이의 성숙한 효소 활성 형태로 가공되어 분비되는 것으로 생각된다. 또한, PSA는 알파 2-마크로글로불린과 안정한 복합체를 형성하지만, 그 결과 PSA가 캡슐화되고 PSA 에피토프가 완전히 손실되기 때문에 당해 복합체 형성의 생체내 중요성은 불투명하다. 복합체를 형성하지 않는 유리 형태의 PSA는 혈청 PSA의 소수 분획(minor)을 구성한다[참조: Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., et al. (1993), J. Urol. 150:100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625]. 당해 형태의 혈청 PSA의 크기는 정액중의 PSA 크기와 유사하지만[참조: Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991) Clin. Chem. 37:1618-1625], 유리 형태의 혈청 PSA가 지모겐(zymogen)인지, 내부적으로 절단된 불활성 형태의 성숙 PSA 또는 효소 활성을 나타내는 PSA일 수 있는지에 관해서는 아직까지 공지되어 있지 않다. 그러나, 유리 33kDa 형태의 PSA의 검출된 혈청 수준과 비교하여 혈청중에 상당한(100 내지 1000배) 몰 과량의 반응하지 않은 알파 1-항키모트립신 및 알파 2-마크로글로불린 모두가 존재하기 때문에, 유리 형태의 혈청 PSA가 효소 활성을 나타낼 것 같지는 않다[참조: Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., et al. (1993). J. Urol. 150:100-105; Lilja, H., Christensson,A., Dahlen, U. (1991) Clin, Chem, 37:1618-1625].
비록 정상 혈청 농도의 PSA가 악성 전립선 과형성증 및 전립선의 외상에서도 보고되어 있을지라도[참조: Lilja, H., Christensson, A., Dohlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625], PSA의 혈청 측정치가 전립선암의 치료를 모니터하는데 유용하다[참조: Duffy, M. S. (1989) Ann. Clin Biochem, 26:379-387; Brawer, M.K and Lange, P.H. (1989), Urol. Suppl. 5:11-16; Hara, M. and Kimura, H. (1989). J. Lab. Clin. Med 113:541-548], 전립선 전이는 또한 혈청 PSA가 광범위하게 전이된 전립선암을 나타내는 전립선 절제 환자에서 높은 수준으로 검출될 수 있기 때문에 면역학적으로 반응성인 PSA를 분비하는 것으로 밝혀져 있다[참조: Ford, T. F., Butcher, D.N., Masters, R.W., et al. (1985). Brit, J. Urology 57:50-55]. 따라서, PSA의 단백질 분해 활성에 의해 활성화될 수 있는 세포독성 화합물은 전립선 세포에 특이적이어야 할 뿐만 아니라 PSA 분비성 전립선 전이에 대해서도 특이적이어야 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 활성 유리 전립선 특이 항원(PSA)에 의해 효소학적으로 선택 절단되는 신규한 올리고펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 이들 신규한 올리고펩타이드를 포함하는 효소학적 활성 PSA에 대한 정량 검정법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포독성제와 접합된 이들 신규한 올리고펩타이드를 포함하는, 전립선암의 치료에 유용한 신규한 항암 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 항암 조성물을 투여함을 포함하는 전립선암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
세메노겔린 I이 유리 PSA에 의해 선택적으로 단백질 분해적으로 절단되는 몇몇 절단점이 확인되었다. 유리 전립선 특이 항원(PSA)에 의해 인식되고 단백질 분해적으로 절단되는 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드가 기술되어 있다. 이러한 올리고펩타이드는 시험관내 및 생체내에서 유리 PSA 프로테아제 활성을 측정할 수 있는 검정법에 유용하다. 또한, 이러한 올리고펩타이드는 이러한 올리고 펩타이드와 공지된 세포독성제의 접합체를 포함하고 전립선암의 치료에 유용한 치료제에 포함될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 세메노겔린 I의 1차 아미노산 서열을 도시한다. 세메노겔린 I의 아미노산 1차 서열을 도시한다(서열 1). PSA 단백질 분해에 의한 절단 부위("CS") (PSA 가수분해에 대한 부위의 상대 친화성의 순서로 넘버링함)를 도시하고, 단백질 단편을 아미노산 말단에서 서열에 따라 시작하여 넘버링한다.
도 2는 합성 올리고펩타이드의 절단 친화성을 도시한다. 합성 올리고펩타이드의 포개진 세트를 제조하고, 올리고펩타이드를 다양한 시간동안 효소적으로 활성인 유리 PSA로 분해한다. 결과를 표2에 도시한다. ND : 측정되지 않음, 아미노 산에 대해 단일 문자 코드를 이용한다 : A=Ala, E=Glu, G=Gly, H=His, I-Ile, K=Lys, L=Leu, N=Asn, Q=Gln, R=Arg, S=Ser, T=Thr, Y=Tyr.
도 3a 내지 3b는 합성 올리고펩타이드의 절단 친화성을 도시한다. 합성 올리고펩타이드를 제조하고, 4시간 동안 올리고펩타이드를 효소적으로 활성인 유리 PSA로 절단한다. 이 시간내에 절단된 올리고펩타이드의 백분율을 기록한다. 그 결과는 표 4에 도시되어 있다.
도 4는 절단할 수 없는 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 세포독성 데이타를 도시한다. 도의 데이타는 독소루비신과 유리 PSA 단백질 분해 절단 부위를 함유하지 않는 올리고펩타이드(화합물 12d)에 공유 결합된 독소루비신의 접합체에 대한 상대 세포독성을 비교하여 도시한다. 독소루비신에 대한 IC50는 0.3μ M인 반면, 아세틸화된 올리고펩타이드 변형된 독소루비신에 대한 IC50은 300배 이상까지 감소되었다. 이 접합체는 변형되지 않은 독소루비신을 사용한 HPLC로 검출할 수 있는오염물을 전혀 갖지 않는다. 올리고펩타이드만으로는 어떠한 세포 사멸 활성도 검출되지 않는다.
도 5는 시험관내에서 유리 PSA에 의한 독소루비신과 접합된 올리고펩타이드의 절단 친화성을 도시한다. 올리고펩타이드-독소루비신 접합체를 제조하고, 접합체를 4시간 동안 효소적으로 활성인 유리 PSA로 절단한다. 이시간 동안에 올리고 펩타이드에서 효소적으로 절단된 접합체의 백분율을 기록한다. 그 결과가 표 5에 도시되어 있다.
도 6은 세포 조절된 배지에서 독소루비신과 접합된 올리고펩타이드의 절단 친화성을 도시한다. 올리고펩타이드-독소루비신 접합체를 LNCaP 세포(유리 PSA를 방출하는 것으로 공지됨) 또는 PuPRO 세포(유리 PSA를 방출하지 않음)에 노출시켜 조절한 세포 배양 배지에서 4시간 동안 반응시킨다. 이 기간동안 올리고펩타이드에서 효소적으로 절단된 접합체 백분율을 기록한다. 그 결과는 표 6에 도시되어 있다.
도 7은 절단가능한 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 세포독성 데이타를 도시한다. 표 7의 데이타는 유리 PSA를 방출하는 것으로 알려진 암 세포주에 대한 유리 PSA의 단백질 분해 절단 부위를 함유하는 올리고펩타이드에 공유 결합된 독소 루비신 접합체의 세포독성(IC50)을 도시한다. 또한, 유리 PSA를 방출하지 않는 세포주(DuPRO)에 대한 접합체의 세포독성을 선택된 접합체에 대하여 도시한다.
본 발명은 유리 전립선 특이 항원(PSA)에 의해 특이적으로 인식되고 유리 전립선 특이 항원의 효소 활성에 의해 단백질 분해적으로 절단될 수 있는 신규한 올리고펩타이드에 관한 것이다. 이러한 올리고펩타이드는 하기 서열중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 올리고머를 포함한다:
상기 서열에서 hArg는 호모아르기닌이고, Xaa는 임의의 천연 아미노산이다.
본 발명의 양태에 있어서, 올리고펩타이드는 하기 서열중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 올리고머를 포함한다:
본 발명의 더욱 바람직한 양태에 있어서, 올리고펩타이드는 하기 서열중에서선택된 아미노산 서열을 포함하는 올리고머를 포함한다:
본 발명의 추가의 양태에 있어서, 올리고펩타이드는 a)
(서열 6)의 아미노산 서열을 포함하는 올리고머를 포함한다:
상기 사용된 바와 같은 문구 "아미노산 서열을 포함하는 올리고머"는 본 발명의 상세한 설명에서 달리 언급하지 않으면, 이들의 아미노산 서열 중에 기술된특정 아미노산 서열을 포함하며, 기술된 아미노산 서열내에서 유리 PSA에 의해 단백질 분해적으로 절단되는 약 6 내지 약 100개의 아미노산 잔기의 올리고머를 나타
SerSerSerThr(서열 10)을 포함하므로, 본 발명내에 포함될 것이다. 이러한 올리고머는 세메노겔린 I 및 세메노겔린 II를 포함하지 않는 것으로 이해된다.
또한, 본 발명은 N-말단 아미노산 또는 C-말단 아미노산 또는 두 말단 아미노산 모두가 변형된 올리고머를 포함한다. 이러한 변형은 N-말단에서 아민 그룹을 아실화시키고 C-말단에서 카복실산을 대체하여 아미드를 형성하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 잔기의 부가는 올리고머의 고체-상 합성시에 수행될 수 있으며, 따라서 고체상 수지에 C-말단 아미노산의 부착은 수지로부터 올리고머를 산성적으로 절단시킴에 따라 아미드 잔기를 생성하는 아민을 통해 이루어질 수 있다. 따라서, 다음 화합물은 본원에 사용된 바와 같이 "아미노산 서열을 함유하는 올리고머"로서 간주되며, 예시적일 뿐 이에 한정되는 것은 아님을 의미한다 :
펩타이드 화학분야의 통상의 지식을 가진 사람은 생물학적으로 활성인 올리고펩타이드중의 특정 아미노산을 다른 동종의, 등배위성 및/또는 등전자성 아미노 산(여기서, 본래의 올리고펩타이드의 생물학적 활성은 변형된 올리고펩타이드에서 보존된다)으로 대체시킬 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 아미노산 대체물에 대한 하기 목록은 예시적인 것이며, 제한적인 것이 아니다:
따라서, 예를 들어 하기 올리고펩타이드는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 공지된 기술로 합성할 수 있으며, 유리 PSA에 의해 단백질 분해적으로 절단될 것으로 예상된다:
유사하게는, 하기 올리고펩타이드는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 공지된 기술로 합성할 수 있으며, 유리 PSA에 의해 단백질 분해적으로 절단될 것으로 예상된다:
아미노산 서열내의 심볼 "｜"의 의미는 올리고펩타이드가 유리 PSA에 의해 단백질 분해적으로 절단되는 서열내의 지점을 나타낸다.
또한, 본 발명은 조성물에서 단백질 분해성 유리 PSA 활성을 검정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 중요한 양태는 이러한 검정 시스템이 특정한 생리학적 유액 및 조직내에 존재하는 유리 PSA의 양을 정량적으로 측정하는 능력을 제공한다는 점이다. 또한, 이러한 검정은 유리 PSA의 분리 및 정제를 수행하는 능력뿐만 아니라, 유리 PSA의 단백질 분해 활성의 억제제에 대한 스크리닝 검정의 기초를 제공한다. 일반적으로, 이 검정 방법은 효소적으로 활성인 유리 PSA를 함유하는 것으로 생각되는 조성물이 올리고펩타이드를 단백질 분해적으로 절단하는 능력을 단순히 측정하는 것을 포함한다.
통상적으로, 검정 프로토콜은 상기된 올리고펩타이드 중 하나를 사용하여 수행한다. 그러나, 당업자는 절단 부위를 함유하는 올리고펩타이드를 표지함으로써 절단 후 표지를 함유하는 잔류하는 올리고펩타이드의 부분 및 절단되지 않은 올리고펩타이드 모두에서 예를 들어 방사 활성 표지와 같은 표지의 출현을 측정할 수 있는 검정법의 작제에서 특정한 잇점을 발견할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 유리 PSA의 단백질 분해 활성을 억제시킬 수 있는 화합물(이하 후보 화합물이라 한다)을 확인하는 방법에 관한 것이다. 당해 스크리닝 기술은 후보 화합물이 구조적으로 단백질성인지 또는 펩티드성인지에 상관없이, 억제용으로 그 자체를 사용할 수 있는 임의의 후보 화합물을 일반적으로 확인하는데 유용할 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명은 또한 (a) 유리 전립선 특이 항원에 의해 인식되고 선택적인 단백질 분해로 절단되는 아미노산 서열을 포함하는 기질과 유리 전립선 특이 항원을 시험물질의 존재하에 반응시키고, (b) 전립선 특이 항원의 단백질 분해 활성을 억제하는 시험 물질의 능력이 시험 물질의 부재하에서의 기질의 절단과 비교하여 기질 절단의 감소로 나타나는, 기질의 절단을 검출함을 포함하는, 유리 PSA의 단백질 분해 활성을 억제하는 시험 물질의 능력을 측정하는 방법에 관한 것이다.
후보 스크리닝 검정법은 구성하고 수행하기가 매우 단순하고, 여러 측면에서 단백질 분해 활성을 측정하기 위한 상기 언급된 검정법과 연관되어 있다. 따라서, 유리 PSA의 비교적 정제된 제제를 수득한 후, 바람직하게는 PSA가 이의 절단 기능을 수행하게 하고 억제 물질을 포함하는 조건하에 시험 물질을 단백질 분해 제제와 단순히 혼합하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 예를 들면 상기된 올리고펩타이드와 같은 PSA 특이 절단 부위를 포함하는 공지된 올리고펩타이드 일정양을 혼합물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 이러한 형식으로 당업자는 시험 물질의 존재하에 상대적으로 올리고펩타이드의 절단을 감소시키는 시험 물질의 능력을 측정할 수 있다.
따라서, 시험 물질의 상대적인 억제력을 평가하기 위해 시험 물질의 존재하에서의 활성과 비교하여 부가되는 시험물질의 부재하에 유리 PSA의 활성을 결정하거나 달리 측정하는 것이 바람직할 것이다.
또한, 본 발명은 전립선암의 치료에 유용한 신규한 항암 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 직접적으로 또는 화학적 링커를 통해 세포독성제에 공유 결합된 본 발명의 올리고펩타이드를 포함한다. 이러한 올리고펩타이드와 세포독성제와의 배합물은 접합체를 의미할 수도 있다. 이상적으로는, 세포독성제의 세포 독성 활성은, PSA 단백질 분해 절단 부위를 함유하는 올리고펩타이드를 직접적으로 또는 화학적 링커를 통해 세포독성제에 결합시켜 온전한 경우 크게 감소되거나 부재한다. 또한 이상적으로는, 세포독성제의 세포 독성 활성은, 절단 부위에 부착된 올리고펩타이드를 단백질 분해적으로 절단하는 경우 크게 증가하거나 변형되지 않은 세포독성제의 활성으로 되돌아간다. 본 발명의 이러한 양태를 실행할 필요가 없을지라도, 본 발명의 가장 바람직한 양태는, 올리고펩타이드 및 화학적 링커(존재한다면)가 유리 PSA의 단백질 분해 활성 및 인접 조직에 존재하는 임의의 기타 천연 단백질 분해 효소에 의해 세포독성제로부터 분리되어 단백질 분해에 의한 절단 부위에서 생리학적 환경내로 변형되지 않은 세포독성제가 방출되는 접합체이다.
직접적인 공유 결합이든 화학적 링커를 통해서든 세포독성제와 결합되는 본 발명의 올리고펩타이드는 유리 PSA에 의해 최대로 인식되고 유리 PSA에 의해 가장 용이하게 단백질 분해적으로 절단되는 올리고펩타이드일 필요는 없는 것으로 이해된다. 따라서, 이러한 항암 조성물중에 혼입시키기 위해 선택되는 올리고펩타이드는 유리 PSA에 의한 선택성의 단백질 분해적인 절단 및 이러한 절단으로부터 기인하는 세포독성제-단백질 분해 잔사 접합체(또는 이상적인 상황인 것으로 생각되는 것, 즉 변형되지 않은 세포독성제)의 세포 독성 활성 모두를 위해 선택될 것이다.
본 발명의 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키는데 사용될 수 있기 때문에, 세포독성제는 고전적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 생각해서는 안된다. 예를 들면, 세포독성제는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 독소(예: 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소); 단백질(예: 종양 괴사 인자, α -인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제), 또는 생물학적 반응 변형제(예: 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF") 또는 기타 성장 인자)를 포함할 수 있다.
일반적으로, 바람직한 세포독성제에는 알킬화제, 항증식제, 투불린 결합제 등이 포함된다. 세포독성제의 바람직한 부류에는 예를 들어 안트라사이클린계 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포 독성 뉴클레오사이드, 프테리딘계 약물, 디이넨스 및 포도필로톡신 등이 포함된다. 이들 부류중에서 특히 유용한 것은 예를 들면 독소루비신, 카미노마이신, 다우노루비신, 아미노프테린, 메토트렉세이트, 메토프테린, 디클로로메토트렉세이트, 미토마이신 C, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 6-머캅토푸린, 사이토신 아라비노사이드, 포도필로톡신 또는 포도필로톡신 유도체(예: 에토포사이드 또는 에토포사이드 포스페이트), 멜팔란, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 류로시딘, 빈데신, 류로신 등이 포함된다. 기타 유용한 세포독성제에는 에스트라무스틴, 시스플라틴 및 사이클로포스프아미드가 포함된다. 당업자는 본 발명의 접합체를 제조할 목적으로 화합물의 반응을 더욱 편리하게 하기 위해 목적하는 화합물로의 화학적 변형을 수행할 수 있다.
본 발명을 위해 매우 바람직한 세포 독성제의 그룹은 하기 화학식의 약물을 포함한다:
화학식 1의 메토트렉세이트 그룹:
[화학식 1]
상기식에서,
R12는 아미노 또는 하이드록시이고,
R7은 수소 또는 메틸이며,
R8은 수소, 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도이고,
R9는 하이드록시 또는 카복실산의 염을 형성하는 잔기이다.
화학식 2의 미토마이신 그룹:
[화학식 2]
상기식에서,
R10은 수소 또는 메틸이다.
화학식 3의 블레오마이신 그룹 :
[화학식 3]
상기식에서,
R11은 하이드록시, 아미노, C1-C3알킬아미노, 디(C1-C3알킬)아미노, C4-C6폴리메틸렌 아미노,
화학식 4의 멜팔란 :
[화학식 4]
화학식 5의 6-머캅토푸린 :
[화학식 5]
화학식 6의 사이토신 아라비노사이드 :
[화학식 6]
화학식 7의 포도필로톡신 또는 이의 인산염
[화학식 7]
상기식에서,
R13은 수소 또는 메틸이고,
R14는 메틸 또는 티에닐이다.
화학식 8의 약물의 빈카 알카로이드 그룹 :
[화학식 8]
상기식에서,
R15는 H, CH3또는 CHO이고;
R17및 R18을 단독으로 취할 경우, R18은 H이며, R16및 R17중의 하나는 에틸이고 다른 하나는 H 또는 OH이고, R17및 R18을 이들이 부착된 탄소와 함께 취할 경우, 이들은 옥시란 환을 형성하며 이때 R16은 에틸이고;
R19는 수소, (C1-C3알킬)-CO 또는 클로로 치환된 (C1-C3알킬)-CO이다.
화학식 9의 디플루오로뉴클레오사이드 :
[화학식 9]
상기식에서,
R21은 화학식
중의 하나의 염기이고,
R22는 수소, 메틸, 브로모, 플루오로, 클로로 또는 요오도이고,
R23은 -OH 또는 -NH2이며,
R24는 수소, 브로모, 클로로 또는 요오도이다.
화학식 10의 안트라사이클린 항생제 :
[화학식 10]
상기식에서,
R1은 -CH3, -CH2OH, -CH2OCO(CH2)3CH3또는 -CH2OCOCH(OC2H5)2이고,
R3은 -OCH3, -OH 또는 -H이며,
R4는 -NH2, -NHCOCF3, 4-모르폴리닐, 3-시아노-4-모르폴리닐, 1-피페리디닐, 4-메톡시-1-피페리디닐, 벤질아민, 디벤질아민, 시아노메틸아민 또는 1-시아노-2-메톡시에틸아민이고,
R5는 -OH, -OTHP 또는 H이며,
R6은 -OH 또는 -H이고,
단, R5가 -OH 또는 -OTHP인 경우 R6은 -OH가 아니다.
화학식 11의 에스트라무스틴 :
[화학식 11]
화학식 12의 사이클로포스프아미드 :
[화학식 12]
가장 바람직한 약물은 상술된 화학식 10의 안트라사이클린 항생제이다. 당 업자는 당해 구조식의 화합물이 본 기술분야에서 상이한 일반명 또는 통속명으로 알려져 있는 약물 또는 약물의 유도체인 화합물을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 하기 표 1은 많은 안트라사이클린 약물 및 이의 일반명 또는 통속명을 나타낸 것이며, 이는 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직하다.
[표 1]
표 1에 나타낸 화합물 중에서, 가장 바람직한 약제는 독소루비신이다. 독소 루비신(또한, 이후 "DOX"라 함)은 R1이 -CH2OH이고, R3이 -OCH3이고, R4가 -NH2이고, R5가 -OH이고, R6이 -H인 화학식 10의 안트라사이클린이다.
본 발명의 올리고펩타이드, 펩타이드 아단위 및 펩타이드 유도체(또한, "펩타이드"라 함)는 통상의 펩타이드 합성 기술, 바람직하게는 고체상 기술에 의해 이들의 구성 아미노산으로부터 합성할 수 있다. 펩타이드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제한다.
펩타이드 합성의 표준 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Schroeder et al., "The Peptides", Vol. I, Academic Press 1965; Bodansky et al., "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, 1966; McOmie (ed.) "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, 1973; Barany et al., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", 2, Chapter 1, Academic Press, 1980, and Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", Second Edition, Pierce Chemical Company, 1984]에 기술되어 있다. 이들 문헌의 교시는 본 명세서 내에서 참조문헌으로 인용된다.
PSA 절단 부위를 함유하는 올리고펩타이드 및 세포독성제를 포함하는 본 발명의 접합체는 의약 화학 분야에 널리 공지된 기술에 의해 유사하게 합성될 수 있다. 예를 들면, 세포독성제 상의 유리 아민 잔기는 올리고펩타이드의 카복실 말단에서 공유 결합되어 아미드 결합을 형성시킬 수 있다. 유사하게, 아미드 결합은 올리고펩타이드의 아민 잔기 및 세포독성제의 카복실 잔기를 공유적으로 커플링시켜 형성시킬 수 있다. 이러한 목적을 위해, 시약, 예를 들면, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU로서 공지됨) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT로서 공지됨), 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC), N-에틸-N-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDC), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로 포스페이트(BOP) 등의 배합물이 사용될 수 있다.
또한, 본 접합체는 PSA 절단 부위와 세포독성제 사이의 비-펩타이드성 결합에 의해 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 세포독성제는 세포독성제 상의 하이드록실 잔기를 통해 올리고펩타이드의 카복실 말단에 공유 결합되어 에스테르 결합을 형성할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 시약, 예를 들면, HBTU와 HOBT와의 배합물, BOP 와 이미다졸과의 배합물, DCC와 DMAP와의 배합물 등이 사용될 수 있다. 카복실산은 니트로-페닐 에스테르 등을 형성시킴으로써 활성화되어 DBU(1.8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔)의 존재하에 반응할 수 있다.
본 접합체는 링커 단위를 통해 세포독성제에 올리고펩타이드를 부착시켜 형성시킬 수도 있다. 이러한 링커 단위는, 예를 들면, 비스카보닐 알킬 디라디칼을 포함하며, 이로 인해 세포독성제 상의 아민 잔기가 링커 단위와 결합하여 아미드 결합을 형성시키고, 올리고펩타이드의 아미노 말단은 링커 단위의 또 다른 말단과 결합하여 아미드 결합을 또한 형성시킨다. 유리 PSA의 존재하에서가 아닌 PSA 단백질 분해 절단 부위의 절단시 절단가능한 경우 생리적 환경에 안정한 기타의 링커 단위도 기대된다. 또한, PSA 단백질 분해 절단 부위의 절단시 세포독성제에 부착되어 있지만 변형되지 않은 세포독성제와 비교하는 경우 이러한 절단 후의 세포독성제 유도체의 세포 독성 활성을 현저하게 저하시키지는 않는 링커 단위를 사용할 수 있다.
당업자는 목적하는 반응을 분자의 기타 부분에서 수행하면서 본 발명의 화합물의 합성에서 출발 화합물 및 중간 생성물 상의 각종 반응성 작용기를 보호하거나차단시킬 필요가 있을 수 있다. 목적하는 반응을 완결시킨 후 또는 특정의 목적시기에, 통상적으로 이러한 보호 그룹을, 예를 들면, 가수분해 또는 가수소분해 방법에 의해 제거할 수 있다는 것을 이해하고 있다. 이러한 보호 및 탈보호 단계는 유기 화학 분야에는 통상적이다. 당업자는 본 발명의 화합물의 제조에 유용할 수 있는 보호 그룹의 교시에 대한 문헌[참조: Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed., Plenum Press, NY, NY (1973); and, Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, ed., John Wiley & Sons, NY, NY (1981)]을 참조한다.
예로서, 유용한 아미노-보호 그룹은, 예를 들면, C1-C10알카노일 그룹(예: 포르밀, 아세틸, 디클로로아세틸, 프로피오닐, 헥사노일, 3,3-디에틸헥사노일, γ - 클로로부트릴 등); C1-C10알콕시카보닐 및 C5-C15아릴옥시카보닐 그룹(예: 3급-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐, 알릴옥시카보닐, 4-니트로벤질옥시카보닐, 플루오레닐 메틸옥시카보닐 및 신나모일옥시카보닐); 할로-(C1-C10)-알콕시카보닐(예: 2,2,2,-트리클로로에톡시카보닐) 및 C1-C15아릴알킬 및 알케닐 그룹(예: 벤질, 펜에틸, 알릴, 트리틸 등)을 포함한다. 기타 통상적으로 사용되는 아미노-보호 그룹은 메틸 또는 에틸 아세토아세테이트와 같은 β -케토-에스테르로부터 제조된 엔아민의 형태의 그룹이다.
유용한 카복시-보호 그룹은, 예를 들면, C1-C10알킬 그룹(예: 메틸, 3급-부틸, 데실); 할로-C1-C10알킬(예: 2,2,2-트리클로로메틸 및 2-요오도에틸); C5-C15아릴알킬(예: 벤질, 4-메톡시벤질, 4-니트로벤질, 트리페닐메틸, 디페닐메틸); C1-C10알카노일옥시메틸(예: 아세톡시메틸, 프로피오녹시메틸 등) 및 그룹[예: 펜아실, 4-할로펜아실, 알릴, 디메틸알릴, 트리-(C1-C3알킬)실릴, 예를 들면, 트리메틸실릴, β -p-톨루엔설포닐에틸, β -p-니트로페닐-티오에틸, 2,4,6-트리메틸벤질, β -메틸티오에틸, 프탈이미도메틸, 2,4-디니트로페닐설페닐, 2-니트로벤즈하이드릴 및 관련 그룹]을 포함할 수 있다.
유사하게는, 유용한 하이드록시 보호 그룹은, 예를 들면, 포르밀 그룹, 클로로아세틸 그룹, 벤질 그룹, 벤즈하이드릴 그룹, 트리틸 그룹, 4-니트로벤질 그룹, 트리메틸실릴 그룹, 펜아실 그룹, 3급-부틸 그룹, 메톡시메틸 그룹, 테트라하이드로피라닐 그룹 등을 포함한다.
안트라사이클린 항생물질 독소루비신과 배합된 올리고펩타이드의 바람직한 양태와 관련하여, 다음의 반응식은 본 발명의 접합체의 합성법을 예시한다.
[반응식 I]
[반응식 II]
[반응식 III]
[반응식 IV]
[반응식 V]
반응식 VI는 본 발명의 올리고펩타이드 및 빈카 알칼로이드 세포독성제 빈블라스틴의 접합체의 제조를 예시한다. 빈블라스틴에 대한 올리고펩타이드의 N-말단의 부착을 예시한다[참조: S.P. Kandukuri et al., J. Med. Chem. 28:1079-1088(1985)]. 그러나, 빈블라스틴의 또 다른 위치 및 작용성 그룹 및 올리고펩타이드의 C-말단에서 올리고펩타이드의 접합체는 또한 전립선 암의 치료에 유용한 화합물을 제공하는 것으로 예기된다.
또한, 본 발명의 올리고펩타이드의 N-말단이 하나의 세포독성제, 예를 들면, 빈블라스틴에 공유 결합하면서, C-말단이 동일하거나 상이한 세포독성제, 예를 들면, 독소루비신인 또 다른 세포독성제에 결합된 접합체를 제조할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 다중 세포독성 접합체는 단지 하나의 세포독성제를 함유하는 접합체에 능가하는 이점을 제공할 수 있다.
[반응식 VI]
[반응식 VI]
본 발명의 올리고펩타이드-세포독성제 접합체(여기서, 세포독성제는 바람직한 세포독성제인 독소루비신이다)는 하기 화학식 I로 기술될 수 있다.
[화학식 I]
상기식에서,
올리고펩타이드는 유리 전립선 특이 항원(PSA)에 의해 특이적으로 인식되고 유리 전립선 특이 항원의 효소 활성에 의해 단백질 분해적으로 절단될 수 있는 올리고펩타이드이고;
XL은 존재하지 않거나 a) 페닐알라닌, b) 루이신, c) 발린, d) 이소루이신, e) (2-나프틸)알라닌, f) 사이클로헥실알라닌, g) 디페닐알라닌, h) 노르발린, 및 j) 노르루이신중에서 선택된 아미노산이고;
R은 수소 또는 -(C=O)R1이고;
R1은 C1-C6-알킬 또는 아릴이다.
올리고펩타이드-세포독성제 접합체의 바람직한 양태에서 올리고펩타이드는
중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 올리고머(여기서, Xaa는 임의의 천연 아미노산이다)이고, XL은 존재하지 않거나 a) 루이신, b) 이소루이신, c) 노르루이신 및 d) 발린중에서 선택된 아미노산이고, R은 아세틸, 피발로일 또는 벤조일이다.
다음의 화합물은 본 발명의 올리고펩타이드-세포독성제 접합체의 특정예이다:
상기식에서,
펩타이드성 치료제, 예를 들면, 본 올리고펩타이드-세포독성제 접합체가 바람직하게는 적합한 보호 그룹, 예를 들면, 아세틸, 벤조일, 피발로일 등으로 보호된 특정의 올리고펩타이드 치환기의 말단 아미노 잔기를 갖는다는 것은 당해 분야에 공지되어 있고 본 발명으로 이해될 것이다. 이러한 말단 아미노 그룹의 보호는 온혈 동물의 혈장에 존재하는 외인성 아미노 펩티다제의 작용에 의한 펩타이드성 치료제의 효소 분해를 저하시키거나 제거시킨다.
본 발명의 올리고펩타이드-세포독성제 접합체는 화학식 I의 접합체 및 이에 대한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 환자에게 투여한다. 본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용되는" 이란 예를 들면, 사람, 말, 돼지, 소, 쥐, 개, 고양이 또는 기타 포유동물을 포함하는 온혈 동물 뿐만 아니라 조류 또는 기타 온혈 동물의 치료 또는 진단에 유용한 제제를 뜻한다. 바람직한 투여 형태는, 특히 정맥내, 근육내, 피하, 복막내 또는 림프내 경로에 의한 비경구 투여이다, 이러한 제형은 당업자에게 친숙한 담체, 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다[참조: Remington's Pharnaceutical Science. 16th ed., 1980, Mack Publishing Company, edited by Osol et al.]. 이러한 조성물은 단백질, 예를 들면, 혈청 단백질(예: 사람의 혈청 알부민), 완충액 또는 완충 물질, 예를 들면, 포스페이트, 기타 염 또는 전해질 등을 포함할 수 있다. 적합한 희석제는 예를 들면, 멸균수, 등장염수, 묽은 수성 덱스트로즈, 다가 알콜 또는 이러한 알콜(예: 글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)의 혼합물을 포함한다. 조성물은 방부제, 예를 들면, 펜에틸 알콜, 메틸 및 프로필 파라벤, 티메로잘 등을 함유할 수 있다. 경우에 따라, 조성물은 산화방지제, 예를 들면, 나트륨 메타비설파이트 또는 나트륨 비설파이트 약 0.05 내지 약 0.20중량%를 포함할 수 있다.
정맥내 투여의 경우, 조성물은 바람직하게는 환자에게 투여될 양이 접합체 약 0.01 내지 약 1g이 되도록 제조된다. 바람직하게는 투여량은 접합체 약 0.2 내지 약 1g의 범위내이다. 본 발명의 접합체는 인자, 예를 들면, 치료할 질환 상태 또는 변화시키고자 하는 생물학적 효과, 접합체 투여 방법, 환자의 연령, 체중 및 상태 뿐만 아니라 주치의에 의해 결정되는 기타 인자에 따라 폭 넓은 투여량 범위 내에서 효과적이다. 따라서, 특정 환자에 대한 투여량은 개체별 기준에 따라 결정되어야만 한다.
당업자는 특정 시제 및 반응 조건이 하기 실시예에 설명되었지만, 본 발명의 정신 및 범위에 포함되는 변형이 행해질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서 하기 제조 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되며 한정하려는 것은 아니다.
실시예 1
세메노겔린 PSA 매개된 절단 부위의 확인 :
정액 겔의 액화는 세메노겔린 I의 단백질 분해 단편화에 필적한다[참조: Lilja, H., Laurell, C.B., (1984) Scand. J. Clin. Lab. Inves, 44, 447-452]. 세메노겔린의 단백질 분해 단편화는 주로 전립선-특이 항원의 단백질 분해 활성에 기인한 것으로 여겨진다[참조: Lilja, H., (1985) J. Clin. Invest, 76, 1899-1903]. 세메노겔린 I의 공개 서열[참조: Lilja, H., Abrahamsson, P.A., Lundwall., A., (1989) J. of Biol. Chem. 214, 1894-1900] (도 1)을 사용하여 시판되는 전립선 cDNA 라이브러리(제조원: Clonetech, Palo Alto, CA.)로부터 세메노겔린 cDNA를 클로닝하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응 프라이머를 고안한다. 정제된 세메노겔린 cDNA를 세균 발현 벡터 pTAC에 넣는다[참조: Linemeyer, D.L., Kelly, L.J., Minke, J.G., Gimenez-Callego, G., DeSalvo, J. and Thamas, K.A., (1987) Bio/Technolagy 5, 960-965]. 세메노겔린 cDNA는 투불린 에피토프를 세메노겔린 단백질의 카복실 말단에 위치하도록 고안한다. 세균 발현된 세메노겔린 단백질을 항-투불린 항체 컬럼 상에서 정제한다. 정제된 세메노겔린 I 단백질을 상업적으로 제조된 전립선-특이 항원(PSA) (제조원: York Biologicals International, Stony Brook, NY)와 12mM 트리스 pH 8.0, 25mM NaCl, 0.5mM CaCl2중에서 100:1의 몰비(세메노겔린 I/PSA)로 혼합하고 다양한 시간 동안 항온처리한다. 절단물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분획화하고 CAPS 완충액 중에서 ProBlott 여과지(제조원: Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA.)에 전기 영동에 의해 옮긴다[참조: Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 252, 10035-10038]. ProBlott 여과지를 쿠마시 블루로 염색하여 신규한 PSA 생성 세메노겔린 I 단백질 분획을 확인한다. 신규한 단편을 외과용 메스로 필터로부터 절단하여 서열 측정용으로 제출한다. 단백질 분해 단편을 다양한 시간의 절단에 의해 확인한 후, 10분 절단 반응을 수행한다. 세메노겔린 I 중 5개의 가능한 절단 부위에 대한 PSA의 친화도를 다음과 같이 측정한다: 부위 349/350>부위 375/376>부위 289/290 = 부위 315/316>부위 159/160. 상대 친화도는 각각의 PSA 생성 펩타이드 단편의 쿠마시 블루 염색 강도로부터 획득한다. 강도는 3:1:0.6:0.3의 근사치 비율을 갖는다.
실시예 2
PSA 매개 절단 부위를 포함하는 올리고펩타이드의 제조 :
올리고펩타이드를 합성기(Applied Biosystens model 430A antomated peptide synthesizer)상에서 아미노산 도입용 이중 커플링 프로토콜을 사용하여 고체상 합성에 의해 제조한다. 수지 지지체로부터 올리고펩타이드의 탈보호 및 제거는 액체 플루오르화수소산으로 처리하여 달성한다. 올리고펩타이드를 수성 0.1% 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 구배를 사용하여 역상 C18 실리카 컬럼 상에서 예비 고압 액체 크로마토그래피로 정제한다. 올리고펩타이드의 확인 및 균질성을 아미노산 조성 분석, 고압 액체 크로마토그래피 및 고속 원자 충격 질량 스펙트럼 분석으로 확인한다. 본 발명에 의해 제조된 올리고펩타이드를 도 2에 나타낸다.
실시예 3
유리 PSA에 의한 올리고펩타이드의 인지 평가 :
실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 올리고펩타이드를 PSA 절단 완충액(12mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 pH 8.0, 25mM NaCl, 0.5mM CaCl2)에 개별 용해시키고 용액을 PSA에 100:1의 몰비로 가한다. 반응물을 다양한 반응 시간후에 트리플루오로아세트산(TFA)를 최종 1% (용적/용적)로 가해 급냉시킨다. 급냉시킨 반응물은 수성 0.1% TFA/아세토니트릴 구배를 사용하여 역상 C18 컬럼 상에서 HPLC에 의해 분석한다. 평가 결과를 도 2에 나타낸다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 기타 올리고펩타이드를 반응물을 4시간 후에 급냉시키는 동일 분석으로 시험한다. 이들 평가 결과는 도 3에 나타낸다. 올리고펩타이드의 아미노 말단으로 부터 아스파라긴 잔기를 제거하면 PSA 매개 펩타이드 가수분해의 유의한 손실을 초래하는 반면, 펩타이드의 카복실 말단에서 글루탐산 잔기의 존재는 PSA에 의한 인지에 필수적이지 않다는 것을 보여준다.
실시예 4
비-절단가능한 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 제조 :
표 3에 나타낸 독소루비신의 유도체는 하기의 일반적인 반응을 사용하여 제조한다; DMSO 중의 독소루비신(제조원: Sigma) 및 상응하는 펩타이드(고체상 합성으로 제조되거나 시판(Sigma)됨)의 혼합물에 디이소프로필에틸아민과 함께 HBTU 및 HOBT를 가하고 반응 혼합물은 밤새 교반한다. 조 반응 혼합물을 물 중 아세토니트릴/0.1% TFA중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 구배를 사용하여 역상 C-18 컬럼상에서 예비 HPLC에 의해 직접 정제한다.
[표 3]
실시예 5
독소루비신의 펩타이드성 유도체의 세포독성의 시험관내 검정 :
비변형 독소루비신에 의해 치사되는 것으로 공지된 세포주에 대한 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조된 비-절단가능한 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 세포독성도를 알라마 블루(Alamar Blue) 분석으로 평가한다. 구체적으로, 96웰 플레이트내에 림프절의 바늘 생검으로부터 분리된 사람 전이 전립선 선암종인 LNCaP 전립선암 세포(LNCaP.FGC: American Type Culture Collection, ATCC CRL 17401) 또는 DuPRO 세포의 세포 배양액을 주어진 접합체의 각종 농도를 함유하는 배지(최종 플레이트 웰 용적 200μl)로 희석한다. 세포를 3일 동안 37℃에서 항온처리하고, 알라마 블루 20μl를 분석 웰에 가한다. 세포를 추가로 항온처리하고 분석 플레이트를 570 및 600nm의 이중 파장에서 알라마 블루의 첨가 4 및 7시간 후에 EL-310 ELISA 판독기 상에서 판독한다. 시험되는 접합체의 각종 농도에서 대조군(접합체 비함유) 배양액에 대한 상대 생존율 %를 계산한다. 비변형 독소루비신 및 비변형 올리고펩타이드의 세포독성도 평가한다. 도 3은 대표적인 화합물(화합물 12d)에 대한 세포독성 데이타를 나타낸다.
실시예 6
LNCaP 세포로부터의 효소적으로 활성인 PSA의 평가
효소 활성도를 LNCaP 혈청 비함유 배지(약 200배 농축)를 재조합 세네모겔린 I 단백질과 항온처리하여 측정한다. 농축된 컨디셔닝 배지중의 면역학적 반응성 PSA 약 0.5μg[HYBRIDTECH(Tandem E) ELISA에 의해 측정]을 재조합 세메노겔린 I 약 3μg과 혼합하고 4시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 항온처리 끝무렵, 절단 혼합물을 웨스턴 블롯 방법으로 분석한다. 결과는 정액으로부터 정제된 PSA 및 LNCaP 컨디셔닝 배지로부터의 PSA가 재조합 세메노겔린 I 단백질의 동일한 단백질 분해 지도를 생성시킴을 나타낸다. 따라서, LNCaP 세포는 효소적으로 활성인 PSA를 생성시킨다. LNCaP는 누드 마우스에서 발암성이며 검출가능한 수준의 순환성 PSA를 생성시킨다.
실시예 7
절단가능한 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 제조 :
유리 PSA에 의해 단백질 분해적으로 절단되는 올리고펩타이드가 독소루비신의 당 잔기의 아민에 공유 결합되는 독소루비신의 유도체를 다음의 일반적인 반응을 사용하여 제조한다: DMSO 중의 독소루비신(제조원: Sigma) 및 상응하는 펩타이드(실시예 2에 기술된 바와 같이 고체상 합성에 의해 제조)의 혼합물에 디이소프로필에틸아민과 함께 HBTU 및 HOBT를 가하고 반응 혼합물을 밤새 교반한다. 조 반응 혼합물을 물 중 아세토니트릴/0.1% TFA 중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 구배를 사용하여 역상 C-18 컬럼 상에서 예비 HPLC에 의해 직접 정제한다. 반응성 아민 잔기가 펩타이드에 존재하는 경우, 이러한 작용기는 통상 2급 아민, 예를 들면, 피페리딘 등으로 처리하여 제거되는 플루오레닐메틸옥시카보닐 부가물로 보호한 다음, 독소루비신과 결합시킨다. 본 접합체는 하기 화학식
의 구조를 가지며, "Ac-펩타이드-DOX(3')"으로 나타낼 수 있다. 본 방법에의해 제조된 접합체는 도 5중 표 5에 나타낸다.
실시예 8
유리 PSA에 의한 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 인식 평가 :
실시예 7에 기술된 바와 같이 제조된 접합체를 PSA 절단 완충액(12mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 pH 8.0, 25mM NaCl, 0.5mM CaCl2)에 개별 용해시키고 용액을 100:1의 몰비로 PSA에 가한다. 반응물은 다양한 반응시간 후 최종 1%(용적/용적)로 트리플루오로아세트산(TFA)를 가하여 급냉시킨다. 급냉시킨 반응물은 수성 0.1% TFA/아세토니트릴 구배를 사용하여 역상 C18 컬럼상에서 HPLC에 의해 분석한다. 평가 결과를 도 5의 표 5에 나타낸다.
실시예 9
세포 조절 배지에서 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 절단 평가:
세포 조절 혈청 비함유 MEMα 배지(페놀 레드 음성)를 LNCap 또는 DuPro(J. Urology, 146:915-919(1991)에 기술된 바와 같이 제조) 세포주에 배지 부가 3일 후에 수집한다. 배지는 분자량 10000의 컷오프로 농축기(Amicon?CentriprepTM농축기)를 사용하여 20배 농축시킨다. LNCap 조절 배지는 면역검출 키트(Tandem?-EPSA immunodetection kit, Hybritech?)에 의해 측정된 평균적으로, 약 100ng/ml 농도에서 유리 PSA 단백질을 함유한다. DuPro 세포 조절 배지에서 유리 PSA도 검출불가능하다.
농축 조절 배지의 100μl 분액을 실시예 7에서 기술한 바와 같이 제조된 올리고펩타이드-독소루비신 접합체 35μg과 혼합하고 혼합물을 37℃에서 0, 4 및 24시간 동안 항온처리한다. 반응을 ZnCl2(0.01M 최종 농도로) 가하여 중단시키고 수성 0.1% TFA/아세토니트릴 구배를 사용하여 역상 C18 컬럼 상에서 HPLC에 의해 분석하여 절단된 펩타이드-세포독성제 접합체의 %를 측정한다. 평가 결과를 도 6의 표 6에 나타낸다.
실시예 10
독소루비신의 펩타이드성 유도체의 세포독성도의 시험관내 검정 :
비변형 독소루비신에 의해 치사되는 것으로 공지된 세포주에 대한 실시예 7에서 기술한 바와 같이 제조된 절단가능한 올리고펩타이드-독소루비신 접합체의 세포독성도를 실시예 5에서 기술한 알라마 블루 분석으로 평가한다. 구체적으로, 96 웰 플레이트 중의 LNCap 전립선암 세포 또는 DuPRO 세포의 세포 배양액을 주어진 접합체의 다양한 농도를 함유하는 배지(최종 플레이트 웰 용적 200μl)로 희석한다. 세포를 3일 동안 37℃에서 항온처리하고 알라마 블루 20μl를 분석 웰에 가한다. 세포를 추가로 항온처리하고, 검정 플레이트를 알라마 블루 첨가 4 및 7시간 후 570 및 600nm의 이중 파장에서 EL-310 ELISA 판독기상에서 판독한다. 대조군(접합체 비함유) 배양액에 대한 시험되는 접합체의 각종 농도에서 상대 생존율 %를 계산한다. 접합체의 세포독성은 동일한 분석으로 평가된 비변형 독소루비신 및 비변형 올리고펩타이드의 세포독성과도 비교한다. 이러한 분석의 결과를 도 7의 표 7에나타낸다.

Claims (19)

  1. 유리 전립선 특이 항원에 의해 인식되어 선택적인 단백질 분해로 절단되고
    hArg는 호모아르기닌이고, Xaa는 임의의 천연아미노산이다)로부터 선택되는 아미노 산 서열을 포함하며, 세메노겔린 I 또는 세메노겔린 II가 아닌 올리고펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
  4. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이
  5. 유리 전립선 특이 항원에 의해 인식되어 선택적인 단백질 분해로 절단되고
    선택되는 올리고펩타이드.
  6. 유리 전립선 특이 항원에 의해 인식되어 선택적인 단백질 분해로 절단되고
  7. (a) 제1항 및 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 올리고펩타이드로부터 선택된 올리고펩타이드인 기질을 샘플과 반응시키는 단계 및 (b) 기질이 절단되었는지를 검출하는 단계를 포함하여, 샘플에서 유리 전립선 특이 항원의 단백질 분해 활성을 측정하기 위한 검정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 기질이 절단되었는지를 검출하는 단계가 고성능 액체 크로마토그래피로 검정 혼합물을 분석하는 단계를 포함하는 검정 방법.
  9. (a) 제1항 및 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 올리고펩타이드로부터 선택된 올리고펩타이드인 기질을 유리 전립선 특이 항원과 시험 물질의 존재하에 반응시키는 단계 및 (b) 전립선 특이 항원의 단백질 분해 활성을 억제하는 시험물질의 능력이 시험 물질의 부재하에서의 기질의 절단과 비교하여 기질 절단의 감소로 나타나게 되는, 기질이 절단되었는지를 검출하는 단계를 포함하여, 전립선 특이 항원의 단백질 분해 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 검정 방법.
  10. 제9항에 있어서, 기질이 절단되었는지를 검출하는 단계가 고성능 액체 크로마토그래피로 검정 혼합물을 분석하는 단계를 포함하는 검정 방법.
  11. 제1항 및 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 올리고펩타이드로부터 선택된 올리고펩타이드에 공유 결합 또는 화학적 링커에 의해 부착된 세포독성제를 포함하는, 전립선암의 치료에 유용한 접합체.
  12. 제11항에 있어서, 세포독성제가 a) 안트라사이클린계 약물, b) 빈카 알칼로이드 약물, c) 미토마이신, d) 블레오마이신, e) 세포 독성 뉴클레오사이드, f) 프테리딘계 약물, g) 디이넨, h) 에스트라무스틴, i) 사이클로포스프아미드 및 j) 포도필로톡신 부류중에서 선택되는 세포독성제 부류중 일원인 접합체.
  13. 제11항에 있어서, 세포독성제가 a) 독소루비신, b) 카미노마이신, c) 다우노루비신, d) 아미노프테린, e) 메토트렉세이트, f) 메토프테린, g) 디클로로-메토트렉세이트, h) 미토마이신 C, i) 포피로마이신, j) 5-플루오로우라실, k) 6-머캅토 푸린, l) 시토신 아라비노사이드, m) 포도필로톡신, n) 에토포사이드, o) 에토포사이드 포스페이트, p) 멜팔란, q) 빈블라스틴, r) 빈크리스틴, s) 류로시딘, t) 빈데신, u) 에스트라무스틴, v) 시스플라틴, w) 사이클로포스프아미드 및 x) 류로신 중에서 선택되는 접합체.
  14. 제11항에 있어서, 세포독성제가 독소루비신 및 빈블라스틴 또는 이의 세포독성 유도체중에서 선택되는 접합체.
  15. 제11항에 있어서, 세포독성제가 독소루비신 또는 이의 세포독성 유도체인 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 화학식 I인 접합체.
    화학식 I
    상기식에서,
    올리고펩타이드는 제1항 및 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 올리고펩타이드로부터 선택된 올리고펩타이드이고,
    XL은 부재하거나, a) 페닐알라닌, b) 루이신, c) 발린, d) 이소루이신, e) (2-나프틸)알라닌, f) 사이클로헥실알라닌, g) 디페닐알라닌, h)노르발린 및 j) 노르루이신중에서 선택되는 아미노산이며,
    R은 수소 또는 -(C=O)R1이고,
    R1은 C1-C6-알킬 또는 아릴이다.
  17. 제16항에 있어서,
    XL은 부재하거나, a) 루이신, b) 이소루이신 및 d) 발린중에서 선택되는 아미노산이며,
    R이 아세틸, 피발로일 또는 벤조일인 접합체.
  18. 제15항에 있어서, 화학식
    로부터 선택되는 접합체.
    상기식에서,
    X는
  19. 제14항에 있어서, 화학식 II인 접합체.
    [화학식 II]
    상기식에서,
    올리고펩타이드는 제1항 및 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항의 올리고펩타이드로부터 선택된 올리고펩타이드이다.
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