HU220098B - Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok - Google Patents

Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok Download PDF

Info

Publication number
HU220098B
HU220098B HU9303244A HU324493A HU220098B HU 220098 B HU220098 B HU 220098B HU 9303244 A HU9303244 A HU 9303244A HU 324493 A HU324493 A HU 324493A HU 220098 B HU220098 B HU 220098B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
asp
pro
sequence
polypeptide
amino acid
Prior art date
Application number
HU9303244A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9303244D0 (en
HUT66057A (en
Inventor
Roy A. Black
Shirley R. Kronheim
Paul R. Sleath
Original Assignee
Vertex Pharmaceuticals Incorporated
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharmaceuticals Incorporated filed Critical Vertex Pharmaceuticals Incorporated
Publication of HU9303244D0 publication Critical patent/HU9303244D0/hu
Publication of HUT66057A publication Critical patent/HUT66057A/hu
Publication of HU220098B publication Critical patent/HU220098B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8142—Aspartate protease (E.C. 3.4.23) inhibitors, e.g. HIV protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/22—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

A találmány proteázaktivitással rendelkező izolált polipeptidre ésszármazékaira vonatkozik. Ismertetik a polipeptidek izolálását éselőállítását rekombináns DNS-eljárással, a polipeptideket kódoló DNS--szekvenciát és az azt tartalmazó expressziós vektort is. Ismertetiktovábbá a fenti IL–1? proteázaktivitást gátló vegyületeket, ezekettartalmazó gyógyászati készítményeket, amelyek az IL–1? pro aktivitásgátlására alkalmazhatók. Az inhibitorvegyületek 1–5 aminosavmaradékbólálló aminosavszekvenciát tartalmazó szubsztituált peptidek, amelyek N-terminális védőcsoporttal és egy elektronegatív kilépőcsoporthozkapcsolódó C-terminális Asp-- maradékkal rendelkezik, amelyaminosavszekvencia legalább részben az Ala-Tyr-Val-His-Aspszekvenciának felel meg. ŕ

Description

A találmány az interleukin-ΐβ proteázenzimre (IL-Ιβ pro) vonatkozik, amely az inaktív prekurzor interleukin-ΐβ (IL-Ιβ) polipeptidet aktív, érett IL-Ιβ polipeptiddé hasítja. Közelebbről a találmány izolált IL-Ιβ pro polipeptidre és származékaira vonatkozik, amelyek egy meghatározott aminosavszekvencia, többek között a humán IL-Ιβ N-terminális aminosavszekvenciájának hasítására képesek. A találmány továbbá olyan vegyületekre is vonatkozik, amelyek az IL-Ιβ pro aktivitását gátolni képesek, ezáltal IL-l-antagonistaként funkcionálnak.
Roy A. Black és munkatársai [„Generation of Biologically active Interleukin-ΐβ by Proteolytic Cleavage of the Inactive Precursor”, J. Bioi. Chem., 263, 9437-9442 (1988)] ismertették a bakteriálisán termelt IL-Ιβ hasítását humán monocitákból vagy myeloid sejtvonalakból származó membránokkal történő inkubálással. Az IL-Ιβ prekurzor három fő termékre hasadt, amelyek mérete 17400 és 19000 D közötti. Leírták, hogy a prekurzor IL-Ιβ proteolízise biológiai aktivitást eredményez, és a hasításnak az érett NH2-terminális közelében kell végbemennie.
Roy A. Black és munkatársai [„Activation of Interleukin-ΐβ by a Co-Induced Protease”, FEBS, 247, 386-390 (1989)] azonosították a proteázaktivitást az IL-Ιβ inaktív prekurzorának hasítására képes THP-1 sejtekben. Leírták, hogy ez a proteáz (i) jód-acetáttal gátolható, (ii) csak egy helyen képes hasítani egy szintetikus pepiidet, és (iii) a prekurzort közvetlenül az Asp és Ala-Pro, illetve Asp és Gly-Pro között hasítja a köztitermékek nélkül. Ezt a proteázt 500-szorosra tisztították.
Roy A. Black és munkatársai [„A Pre-Aspartatespecific Protease from Humán Leukocytes That Cleaves Pro-Interleukin-Ιβ”, J. Bioi. Chem., 264(10), 5323-5326 (1989)] ismertették egy aktivitás tisztítását perifériás vér mononukleáris sejtkondicionált közegből, amely aktivitással biológiailag aktív interleukin-ΐβfragmens keletkezik egy inaktív prekurzorból. Ezt az aktivitást fémionokkal kelátot képező szerek gátolják, azonban a szerin-, cisztein- vagy aszpartátproteázok inhibitorai nem, és mind kalcium-, mind cinkionfiiggőnek bizonyult. NH2-terminális szekvenciaanalízissel kimutatták, hogy a prekurzor hasítása egy hisztidin- és egy aszpartátmaradék között megy végbe, és szintetikus peptidek emésztésével kimutatták, hogy a proteáz pre-aszpartát-hasításokra specifikus.
Suggs S. V. és munkatársai [„Use of Synthetic Oligonucleotides as Hybridization Probes: Isolation of Cloned cDNA Sequences fro Humán Béta 2-Microglobulin”, PNAS, 75(11), 6613-6617 (1981)] 15 bázis hosszúságú oligodezoxiribonukleotidok két sorozatát szintetizálták jelzett formában, amelyek a humán β2mikroglobulin egy kis szakaszát kódoló összes lehetséges szekvenciának feleltek meg. A jelzett oligonukleotidokat hibridizációs próbaként alkalmazták egy oligo(dT) kezdetű cDNS-könyvtár szűrésére. A vizsgált 535 bakteriális plazmidklónból egy cDNS-klón pozitív jelet adott. A kiónt Southern biot- és nukleotidszekvencia-analízis segítségével jellemezték. A klónozott β2-ΓηίΕπ^1οόη1ίη-8ζε^εηοί3 az mRNS 3’- nem transzlatált régiójából 217 bázispárt és a kódolórégióból 328 bázispárt (97%) tartalmazott.
Young R. A. és munkatársai [„Yeast RNA Polymerase II Genes: Isolation with Antibody Probes”, Science, 222(4625), 778-782 (1983)] élesztő-RNS-polimeráz II alegységeket kódoló géneket klónoztak. A fenti gének hatékony tisztítását egy lambda gtlll fágból származó rekombináns DNS-expressziós könyvtár tisztított élesztő-RNS-polimeráz II elleni polivalens antitestekkel történő szondázásával hajtották végre. A legnagyobb RNS-polimeráz II alegységeket, a 220 000 és 150 000 D polipeptideket kódoló géneket kompetitív radioimmunvizsgálattal azonosították. Kimutatták, hogy mindkét fenti gén egyetlen példányban van jelen a Saccharomyces cerevisiae élesztőben.
Lee C. C. és munkatársai [„Generation of cDNA Probes Directed by Amino Acid Sequence: Cloning of Urate Oxidase”, Science, 239(4845), 1288-1291 (1988)] a sertés-urát-oxidáz amino-terminális aminosavszekvenciát kódoló komplementer DNS (cDNS) előállítására. Az eljárásban a származtatott amino-terminális szekvencián alapuló vegyes oligonukleotid primereket alkalmazták PCR-reakcióban a celluláris mRNS reverz transzkripciójából származó DNS-sel. Úgy találták, hogy ez a cDNS-klónozó módszer általánosan alkalmazható, és csak egy részleges aminosavszekvenciára van szükség abból a proteinből, amelyhez a cDNS-t előállítani kívánják. A fenti eljárással kapott cDNS-próbát alkalmazták a teljes hosszúságú sertésurát-oxidáz-cDNS izolálására és homológ genomiális szekvenciák jelenlétének kimutatására az emberben.
Emlőssejtekben a heterológ génexpresszióra alkalmas rendszerek és eljárások jól ismertek. Az emlőssejtexpressziós rendszerek kutatásában „nincs semmi meglepő” [Goeddel D. V., Methods in Enzymology, 755, 3-7 (1990)]. Ha egy szakembernek sikerül egy emlőssejttípusban hatékonyan expresszáltatni egy aktív polipeptidet, sikeres expresszió várható egy másik emlőssejttípusban is, különösen, ha azonos fajról van szó, de eltérő fajok esetén is.
„Láthatólag nincs példa olyan proteinre, amelyet legalábbis detektálható mennyiségben ne lehessen előállítani emlőssejtekben.” Ezenkívül az emlőssejtek különösen alkalmasak humán proteinek rekombináns expressziójára, mivel ezek megbízhatóan helyesen módosított, teljesen aktív proteineket fognak termelni [Watson J. D. és munkatársai, Recombinant DNA, 2. kiadás, 458. oldal (1992)]. Szakember számára nyilvánvaló, hogy bármely proteinen, amely detektálható mennyiségben szintetizálódott, elvégezhetők a leírásban ismertetett aktivitásvizsgálatok; ezért az emlőssejtrendszerek megfelelő gazdaszervezetet jelentenek az IL-Ιβ proteázexpresszióhoz.
Az első gyógyszer, amelyet emlőssejttenyészetben ipari méretekben előállítottak, a szöveti plazminogénaktivátor vagy tPA volt. A tPA maga egy proteáz, amely az inaktív prekurzor plazminogént plazminná hasítja. A tPA-t ipari méretekben egy stabilan integrálódott, nagymértékben felerősített expressziós vektort hordozó
HU 220 098 Β emlőssejtvonalban termelik. Emlőssejtvonalak alkalmazása humán proteinek expresszáltatására szakember számára rutinfeladatot jelent. Ezért az emlőssejtvonalak alkalmazása IL-Ιβ proteáz termelésére rutinmódszerekkel megoldható.
A találmány tárgya tehát egy izolált polipeptid, amely egy specifikus proteázhasítási helyen proteolitikus aktivitással rendelkezik, amely proteázaktivitás egy
Rj—Asp—R2—R3 aminosavszekvenciával rendelkező szubsztrát pepiidre specifikus, a fenti képletben
Rj és R3 jelentése egymástól függetlenül valamely Dvagy L-izomer aminosav,
R2 jelentése Alá vagy Gly, és a specifikus proteázhasítási hely az Asp és az R2 között van. Ezt a polipeptidet egy olyan DNS-szekvencia kódolja, amely tartalmaz (a) az 1. számú szekvencia 1. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig, 374. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig vagy 374. nukleotidjától mintegy 851-962. nukleotidjáig tartó inszertált DNS-t;
(b) DNS-szekvenciákat, amelyek detektálhatóan hibridizálnak egy vagy több (a) pontban megadott inszertált DNS-sel, és olyan polipeptidet kódolnak, amely a humán prekurzor interleukin-ΐβ polipeptidet a 116-os helyzetű Asp- és a 117-es helyzetű Ala-maradék közötti hasítási helyen proteolitikusan hasító biológiai aktivitással rendelkezik; vagy (c) DNS-szekvenciákat, amelyek a genetikus kód degenerációja következtében a fenti inszertált DNS-ek és szekvenciák bármelyike által kódolt emlős-interleukin-ΐβ proteáz polipeptidet kódolnak.
A szubsztrát peptid előnyösen legalább nyolc aminosav hosszúságú. Az izolált polipeptidet interleukin-ΐβ proteáznak (IL-Ιβ pro) nevezzük, mivel a prekurzor IL-Ιβ polipeptidet hasítja a 116-os helyzetű Asp és a 117-es helyzetű Alá közötti hasítási helyen, amelynek eredményeként érett IL-Ιβ polipeptid keletkezik.
A találmány továbbá egy találmány szerinti, izolált DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns expressziós vektorra, valamint a fenti rekombináns expressziós vektort tartalmazó gazdasejtre is vonatkozik.
A találmány továbbá IL-Ιβ inhibitor hatású, 1-5 aminosavmaradékból álló aminosavszekvenciát tartalmazó szubsztituált peptidvegyületekre is vonatkozik, amelyek N-terminális védőcsoporttal és egy elektronegatív kilépőcsoporthoz kapcsolódó C-terminális Aspmaradékkal rendelkeznek. Az aminosavszekvencia legalább részben az Ala-Tyr-Val-His-Asp szekvenciának felel meg.
A találmány szerinti inhibitorvegyületek a Z-Q2-Asp-Qj általános képlettel írhatók le, a képletben
Z jelentése N-terminális védőcsoport,
Q2 0-4 aminosavmaradékot jelent, ezáltal a Q2-Asp aminosavszekvencia legalább részben megfelel az Ala-Tyr-Val-His-Asp szekvenciának, azaz a 3. számú szekvencia 112-116. helyzetű maradékainak; és
Qi jelentése elektronegatív kilépőcsoport.
Z jelentése előnyösen 1-6 szénatomos alkil-keton, benzil-, acetil-, alkoxi-karbonil-, benzil-oxi-karbonilvagy 1-6 szénatomos alkil-karbonil-csoport. Még előnyösebben Z jelentése terc-butoxi-karbonil-csoport (tBoc), acetilcsoport vagy benzil-oxi-karbonil-csoport (Cbz).
Qi jelentése előnyösen 1-3 szénatomos alkilcsoport, egy aldehid, diazo-metil-keton vagy halogén-metil-keton. Még előnyösebben Qj jelentése aldehid vagy fluor-metil-keton.
A találmány tárgyát képezik továbbá a reverzibilis és irreverzíbilis IL-Ιβ pro inhibitorok. Irreverzíbilis inhibitorok azok az inhibitorvegyületek, amelyek 1-5 aminosavmaradékból álló aminosavszekvenciát tartalmaznak, N-terminális védőcsoporttal és egy diazometil-keton- vagy halogén-metil-keton-csoporthoz kapcsolódó C-terminális Asp-maradékkal rendelkeznek, és az aminosavszekvencia legalább részben az Ala-Tyr-Val-His-Asp szekvenciának, azaz a 3. számú szekvencia 112-116. helyzetű maradékainak felel meg.
A reverzibilis IL-Ιβ inhibitorok olyan vegyületek, amelyek 1-5 aminosavból álló aminosavszekvenciát tartalmaznak, N-terminális védőcsoporttal és egy aldehidmaradékhoz kapcsolódó C-terminális Asp-maradékkal rendelkeznek, és az aminosavszekvencia legalább részben az Ala-Tyr-Val-His-Asp szekvenciának, azaz a
3. számú szekvencia 112-116. helyzetű maradékainak felel meg.
A találmány tárgya továbbá eljárás az interleukin- 1β fiziológiai aktivitásának gátlására az ilyen kezelést igénylő emlősökben, amelynek értelmében az emlősnek egy találmány szerinti inhibitorvegyületet adagolunk hatásos mennyiségben.
A találmány továbbá gyógyászati készítményekre is vonatkozik, amelyek fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot és egy találmány szerinti inhibitorvegyületet tartalmaznak.
A találmány tárgyát képezi továbbá az emlősök autoimmunbetegségével kapcsolatos gyulladások kezelésére szolgáló eljárás is, amelynek értelmében a fenti kezelést igénylő emlősnek egy találmány szerinti inhibitorvegyületet adagolunk gyulladásgátló hatást kifejtő mennyiségben.
A találmány tárgyát képezi továbbá az emlősökben artritisz kezelésére, érzékeny egyedekben autoimmunbetegségek kezelésére, sebek gyógyulásának elősegítésére és a besugárzásos kezelések káros mellékhatásainak csökkentésére szolgáló eljárások is. A fenti eljárások mindegyike abból áll, hogy egy megfelelő, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagban adagoljuk az izolált IL-Ιβ proteáznak vagy biológiailag aktív származékának gyógyászatilag hatásos mennyiségét.
A leíráshoz tartozó ábrákat az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábra mutatja az 1. számú DNS-szekvenciát és a megfelelő, 2. számú aminosavszekvenciát egy olyan polipeptidre, amely az IL-Ιβ pro biológiai aktivitásával rendelkezik és az érett, humán IL-Ιβ pro-nak vagy egy biológiailag aktív fragmensének felel meg.
HU 220 098 Β
A 2. ábra mutatja a preIL-Ιβ (3. számú szekvencia) aminosavszekvenciáját, amelyet March és munkatársai ismertettek [Natúré (London), 375(60021), 641-647 (1985)]. Az aminosavmaradékok számozása (a szekvencia alatt) az iniciátor metionintól kezdődik.
A 3. ábra mutatja az IL-Ιβ pro termékének Westem-blot-analízisét Boc-Asp-CH2F IL-Ιβ pro inhibitor jelenlétében, illetve anélkül. A termékeket SDSPAGE-eljárással választottuk szét, nitro-cellulózra vittük át, és az érett IL-Ιβ COOH-terminálisa elleni antitestet alkalmaztuk próbaként. 3. sáv: 25 pmol/l inhibitorral inkubált preIL-Ιβ; 4. sáv: 10 pmol/l inhibitorral inkubált preIL-Ιβ; 5. sáv: 5 pmol/l inhibitorral inkubált preIL-1; 6. sáv: 1 pmol/l inhibitorral inkubált preIL-Ιβ.
A találmányt részletesen az alábbiakban ismertetjük.
I. Interleukin-7βproteáz
Polimeráz-láncreakciót (PCR) és egyéb módszereket alkalmazva izoláltunk, tisztítottunk, jellemeztünk és expresszáltunk egy emlős-IL-Ιβ pro polipeptidet és annak aktív fragmenseit.
Mivel egy rekombináns IL-Ιβ pro enzim nagy mennyiségben rendelkezésünkre állt, lehetőségünk volt olyan inhibitorvegyületeket keresni, amelyek az IL-Ιβ pro aktivitást gátolják és ezáltal IL-l-antagonistaként funkcionálnak. Továbbá az IL-Ιβ pro alkalmazása IL-1-agonista aktivitással bír. Ennek megfelelően a találmány emlős-IL-Ιβ pro polipeptidekre és származékaikra, analógjaikra és alléi variánsaikra vonatkozik, amelyek egy
Rj-Asp-R2-R3 aminosavszekvenciájú szubsztrát pepiidre proteolitikus aktivitást fejtenek ki, a fenti képletben
Rj és R3 jelentése egymástól függetlenül valamely Dvagy L-izomer aminosav,
R2 jelentése Alá vagy Glu, és a specifikus proteázhasítási hely az Asp és az R2 között van.
A szubsztrát peptid előnyösen legalább 8 aminosav hosszúságú. Még előnyösebben R2 jelentése Gly. Az emlős-IL-Ιβ pro előnyösen egy humán IL-Ιβ pro és egy fent definiált aminosavszekvenciájú szubsztrát pepiidre mutat szubsztrátspecificitást. A humán IL-Ιβ pro polipeptid vagy származéka előnyösen olyan biológiai aktivitással rendelkezik, hogy a humán prekurzor IL-Ιβ polipeptidet humán érett IL-Ιβ polipeptiddé hasítja.
Az IL-Ιβ pro-t továbbá az 1. ábra szerinti cDNSszekvencia (1. számú szekvencia) és aminosavszekvencia (2. számú szekvencia) jellemzi. A teljes hosszúságú (prekurzor) IL-Ιβ pro 404 aminosavat tartalmaz. A tisztított IL-Ιβ pro a 120. aminosavmaradéktól indulva az Asn-Pro-Ala-Met-Pro szekvenciával kezdődik. A molekulatömeg vizsgálata alapján az érett IL-Ιβ pro C-terminális vége közelítőleg a 297. aminosav. Azonban a molekulatömeg vizsgálata arra utal, hogy az érett enzim C-terminálisa közelítőleg a 278. aminosavtól a 315. aminosavig tart. A találmány tárgyát képezi egy izolált IL-Ιβ pro polipeptid vagy származéka, analógja vagy alléi variánsa, amely a humán prekurzor IL-Ιβ polipeptidet a 116-os helyzetű Aspés a 117-es helyzetű Ala-maradék közötti hasítási helyen proteolitikusan hasító biológiai aktivitást mutat. A leírásban IL-Ιβ pro alatt az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciát, valamint a fenti szekvencia alléi variánsait, származékait, analógjait és fragmenseit értjük, amelyek IL-Ιβ pro biológiai aktivitást mutatnak.
Az IL-Ιβ protein biológiai aktivitását például úgy határozzuk meg, hogy egy prekurzor IL-Ιβ polipeptiddel vizsgáljuk az IL-l-aktivitást. A prekurzor IL-Ιβ inaktív, míg az érett IL-Ιβ aktív IL-1 polipeptid. Az IL-Ιβ pro aktivitásmeghatározását Black és munkatársai II. módszere szerint végezzük. Röviden, mintegy 5 μΐ prekurzor ΙΕ-Ιβ-et (pre-IL-Ιβ) (10-50 pg/ml, Black és munkatársai I. módszere szerint előállítva) 10 pl IL-Ιβ pro polipeptiddel vagy más, feltehetőleg IL-Ιβ pro biológiai aktivitással rendelkező anyaggal inkubálunk mintegy 1 órán keresztül, mintegy 37 °C-on, és a reakciót 15 μΐ 2xSDS mintapuffer hozzáadásával, majd 5 percen keresztüli forralással leállítjuk. A forralt mintát SDS-poliakrilamid gélen elektroforetizáljuk, majd Western blotra visszük, IL-Ιβ C-terminális-specifikus monoklonális antitestet, például a Black és munkatársai I. által ismertetett 16F5-öt alkalmazva.
Az 1. ábra mutatja az IL-Ιβ pro biológiai aktivitásával rendelkező, 404 aminosavból álló szekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát is. A találmány tárgyát képezik a humán prekurzor IL-Ιβ polipeptidet a 116-os helyzetű Asp- és a 117-es helyzetű Ala-maradék közötti hasítási helyen proteolitikusan hasító biológiai aktivitást mutató IL-Ιβ pro-t, annak származékát, analógját vagy alléi variánsát kódoló izolált DNS-szekvenciák is. Az izolált DNS-szekvencia az 1. ábrán látható nukleotidszekvencia 1. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig, 374. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig vagy 374. nukleotidjától mintegy 851-962. nukleotidjáig tartó szekvencia lehet, amely DNS-szekvenciák kimutathatóan hibridizálnak az 1. ábra szerinti 1. nukleotidtól az 1232. nukleotidig tartó szekvenciával és egy olyan polipeptidet kódolnak, amely a humán prekurzor IL-Ιβ polipeptidet a 116-os helyzetű Asp- és a 117-es helyzetű Ala-maradék közötti hasítási helyen proteolitikusan hasító biológiai aktivitással rendelkezik; valamint olyan DNS-szekvenciák, amelyek a genetikus kód degenerált volta következtében egy, a fenti DNS-inszertek és -szekvenciák által kódolt valamely emlős-IL-Ιβ pro polipeptidet kódolnak.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák, amelyek kimutatható módon hibridizálnak az 1. ábra szerinti nukleotidszekvencia 1. nukleotidjától 856. nukleotidjáig tartó szekvenciával, erős vagy súlyos szigorúságú feltételekkel hibridizálnak. Az erős vagy súlyos szigorúságú hibridizálási feltételek például egy éjszakán keresztüli hibridizálást jelentenek mintegy 60 °C-on 6 xSSColdatban, amelyet mintegy 68 °C-on 0,6 χ SSC-oldattal végzett mosás követ.
Antiszensz oligonukleotidok szintetizálhatok ismert foszfodiészter-módszerrel (például Synthecell, Rockville, MD), amelyek komplementerek egy legalább 18 bázisból álló egyedi szakasszal az iniciációs kodon4
HU 220 098 Β nál (TACCGGCTGTTCCAGGAC, 4. számú szekvencia) vagy komplementerek az 1. ábra szerinti 18-36., illetve 168-196. bázisokkal az érett IL—1 β pro N-terminálisánál (TACCTATTCTGGGCTCGA, 5. számú szekvencia) vagy komplementerek az 1. ábra szerinti 374-392. bázisokkal a proteázos hasítás utáni körülbelüli C-terminálisnál (TTGGTCGATACGGGTGT, 6. számú szekvencia) vagy komplementerek az 1. ábra szerinti 890-908. bázisokkal vagy a terminációs kodontól közvetlenül 5’-irányban lévő szakasszal (CACCACACCAAATTTCTA, 7. számú szekvencia) vagy komplementer az 1. ábra szerinti 1205-1229. bázisokkal (ATGGAGAGGGGTCCTGTA, 8. számú szekvencia).
Az IL—1 β pro vagy aktív ffagmense elsődleges aminosavszerkezetét egyéb kémiai maradékokkal - például glükozilcsoportokkal, lipidekkel, foszfátokkal, acetilcsoportokkal vagy hasonlókkal - kialakított kovalens vagy aggregációs konjugátumokkal vagy mutáns aminosavszekvenciák vagy -származékok kialakításával módosíthatjuk. Az IL-Ιβ pro kovalens származékait úgy állítjuk elő, hogy az IL-Ιβ pro aminosavoldalláncaihoz vagy az IL-Ιβ pro polipeptid N-terminálisához vagy C-terminálisához meghatározott funkciós csoportokat kapcsolunk.
Az IL-Ιβ pro egyéb, a találmány tárgykörébe tartozó származékai például az IL-Ιβ pro vagy fragmense egyéb proteinekkel vagy polipeptidekkel alkotott kovalens vagy aggregációs konjugátumai, például rekombináns tenyészetben N-terminális vagy C-terminális fúzióként szintetizált származékok. A konjugált polipeptid például szignál- (vagy leader-) peptidszekvencia lehet az IL-Ιβ pro polipeptid N-terminálisánál, amely kotranszlációsan vagy poszttranszlációsan irányítja az IL-Ιβ pro polipeptid transzferjét szintézise helyéről egy sejtmembránon vagy -falon belüli vagy azon kívüli helyig (például az élesztő-a-faktor leader). Az IL-Ιβ pro polipeptidfúziók olyan polipeptideket is tartalmazhatnak, amelyeket az IL - 1β pro tisztításának vagy azonosításának megkönnyítésére adunk az IL-Ιβ pro polipeptidhez (például poliHis). Ezenkívül az IL-Ιβ pro aminosavszekvenciáját egy Asp-Tyr-Lys-Asp-AspAsp-Asp-Lys peptiddel [Hopp és munkatársai, BioTechnology, 6, 1204 (1988)] is összekapcsolhatjuk, amely erősen antigén szekvencia és egy specifikus monoklonális antitesttel reverzibilisen kapcsolódó epitópot szolgáltat, ami lehetővé teszi az expresszált rekombináns polipeptid gyors vizsgálatát és megkönnyíti annak tisztítását. Ezt a specifikus leaderszekvenciát a marhanyálka-enterokináz közvetlenül az Asp-Lys párt követő maradéknál hasítja. Ezenkívül az N-terminálisukon a fenti leaderszekvenciát tartalmazó fúziós peptidek degradációval szemben rezisztensek lehetnek E. coli gazdasejtekben.
A találmány továbbá természetes módon glükozilezett vagy anélküli IL-Ιβ pro polipeptidekre vonatkozik. Az élesztősejtekben vagy emlősexpressziós rendszerekben (például COS-7 sejtekben) expresszált IL-Ιβ molekulatömege és glükozilezési módja a natív humán IL-Ιβ pro polipeptidhez hasonló vagy attól jelentősen eltérő lehet. Ez az expressziós rendszer megválasztásától függ. Az IL-Ιβ pro polipeptidek expreszsziója bakteriális expressziós rendszerekben, például
E. coliban nem glükozilezett molekulákat eredményez.
A humán IL-Ιβ pro működőképes mutáns analógjait szintetikus úton is előállíthatjuk, például inaktivált N-glükozilezési helyekkel oligonukleotid-szintézissel és ligálással vagy helyspecifikus mutagenezis módszerrel. Az IL-Ιβ pro származékokat homogén, csökkent szénhidráttartalmú formában expresszálhatjuk élesztőexpressziós rendszereket alkalmazva. Az N-glükozilezési helyeket eukarióta polipeptidekben egy Asn-Φ-Ω aminosavtriplett jellemzi, ahol Φ jelentése Pro kivételével bármely aminosav, és Ω jelentése Ser vagy Thr. Ebben a szekvenciában a szénhidrátmaradékok kovalensen kötődnek az Asn oldalláncához.
Az IL-Ιβ proteinanalógokat és -származékokat az IL-Ιβ pro DNS-szekvencia-mutációival is előállíthatjuk. A leírásban IL-Ιβ pro mutáns származék alatt egy olyan, az IL-Ιβ pro-val lényegében homológ polipeptidet értünk, amelynek aminosavszekvenciája a natív IL-Ιβ pro szekvenciájától egy deléció, inszerció vagy szubsztitúció miatt különbözik.
Az IL-Ιβ pro egy emlősgénből expresszálódik, valószínűleg egy vagy több multiexongén kódolja. A találmány tárgyát képezik az alternatív mRNS-szerkezetek is, amelyek a transzkripciót követő különböző mRNS splicing eseményeknek [exonszekvenciák összekapcsolása az intron(ok) kivágása után az RNS-transzkripciós termékekből] tulajdoníthatók, és amelyekben közös azonos vagy hasonló szakaszok vannak a fenti cDNS-ekkel.
Az IL-Ιβ pro polipeptid bioekvivalens analógjait (az IL-Ιβ pro biológiai aktivitásával rendelkező polipeptideket) például úgy állíthatjuk elő, hogy az aminosavmaradékokban vagy -szekvenciákban különféle szubsztitúciókat hajtunk végre, vagy töröljük a biológiai aktivitáshoz nem szükséges terminális vagy közbenső maradékokat vagy szekvenciákat. így például a Cys-maradékokat törölhetjük vagy más aminosavakkal felcserélhetjük, hogy a hibás intramolekuláris diszulfidhidak kialakulását megakadályozzuk a renaturálódás során. A mutagenezis további lehetőségei közé tartozik például a bázikus aminosavmaradékok módosítása az expresszió fokozására KEX2 proteázaktivitással rendelkező élesztőrendszerekben.
A szubsztitúciókat általában konzervatív módon hajtjuk végre úgy, hogy a helyettesített maradék fizikokémiai tulajdonságaira emlékeztető aminosawal hajtjuk végre a szubsztitúciót. Más szubsztitúciók kívül eshetnek az IL-Ιβ pro biológiai aktivitásához szükséges „mag”szekvencián. Az IL-Ιβ pro alegységeit terminális vagy intemális maradékok vagy szekvenciák törlésével állíthatjuk elő. A kapott polipeptidnek a leírásban definiált IL-Ιβ pro biológiai aktivitással kell rendelkeznie.
IL-Ιβ pro vagy humán IL-Ιβ proteáz alatt az IL-Ιβ pro analógjait és alegységeit is értjük, amelyek lényegében hasonlók a humán IL-Ιβ pro enzimhez és/vagy az IL-Ιβ pro leírásban ismertetett szubsztrátspecifikus proteolitikus aktivitásával rendelkeznek.
HU 220 098 Β
Lényegében hasonló alatt az aminosavszekvenciákkal kapcsolatban azt értjük, hogy egy adott szekvencia egy vagy több szubsztitúcióban, delécióban vagy addícióban eltérhet egy megadott referenciaszekvenciától. Azonban a mutatott hatás ugyanaz, mégpedig a referencia humán IL— 1 β pro polipeptidre jellemző proteáz biológiai aktivitása. Valamely származék például egy csonka szekvenciával rendelkezhet, amely egy „magrégiót” vagy egy, az IL-Ιβ pro-ra jellemző specifikus proteáz biológiai aktivitáshoz szükséges aminosavszekvenciát tartalmazhat. A lényegében hasonló IL-Ιβ pro származékok mintegy 30%-nál nagyobb mértékben hasonlóak a humán IL-Ιβ pro megfelelő szekvenciájához és az IL-Ιβ pro biológiai aktivitásával rendelkeznek. Azokat a polipeptideket, amelyek hasonlósága kisebb mértékű, de biológiai aktivitásuk (beleértve a szubsztrátspecificitást is) összemérhető, ekvivalenseknek nevezzük. A polipeptidszármazékok még előnyösebben 80%-nál nagyobb mértékű aminosavhomológiát mutatnak a humán IL-Ιβ pro polipeptiddel.
A %-os hasonlóságot például a szekvenciáról szerzett információk összehasonlításával határozhatjuk meg, például GAP computerprogram 6.0 verzió alkalmazásával (University of Wisconsin Genetics Computer Group). A GAP-program Needleman és Wuncsh [J. Mól. Bioi., 48, 443 (1970)] összehasonlító módszerén alapul, Smith és Waterman [Adv. Appl. Math., 2, 482 (1981)] módosításával. Röviden a GAP-program a hasonlóságot egy hányadossal adja meg, ami a sorba állított hasonló szimbólumok száma osztva az összes szimbólumok számával a két szekvencia közül a rövidebb szekvenciában. A GAP-programhoz az előnyös alapértelmezési paraméterek az alábbiak: (1) egy mért összehasonlító mátrix az aminosavakhoz [lásd Schwartz és Dayhoff, szerkesztők, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, 353-358. oldal (1979)]; (2) 3,0 büntetés minden egyes hézagra, további 0,10 büntetés minden egyes szimbólumra minden egyes hézagban; és (3) nincs büntetés a végső hézagokra.
Biológiai aktivitás alatt a leírásban az IL-Ιβ pro biológiai aktivitását értjük, amely egy speciális aminosavszekvenciát hasít egy Asp-maradék és egy Alavagy Gly-maradék közötti peptidkötésnél.
Rekombináns alatt a leírásban azt értjük, hogy egy polipeptid egy rekombináns (például mikrobiális vagy emlős) expressziós rendszerből származik. Mikrobiális alatt bakteriális vagy fungális (például élesztő) expressziós rendszert értünk. Rekombináns mikrobiális termék alatt egy mikrobiális expressziós rendszerben termelt polipeptidet értünk, amely lényegében natív endogén anyagoktól mentes. A legtöbb bakteriális expressziós rendszerben (például E. coliban) expresszált polipeptid glukántól mentes. Az élesztőben expresszált polipeptidek az emlőssejtekben expresszáltaktól eltérő glikozilezési mintával rendelkezhetnek.
Az IL-Ιβ pro erősen korlátozott szubsztrátspecificitással rendelkezik. A humán IL-Ιβ polipeptid egy His-Asp-Ala-Pro aminosavszekvenciát tartalmaz 115-118. maradékként. A humán IL-Ιβ pro ezt a szekvenciát hasítja a 116-os és 117-es helyzetű maradék (Asp-Ala) között, amelynek eredményeként érett, humán IL-Ιβ polipeptid keletkezik. A humán IL-Ιβ prekurzor polipeptidben a 116-os Asp-maradék cseréje Ala-maradékra helyirányított mutagenezissel megakadályozza a mutáns IL-Ιβ polipeptidszármazék hasítását.
Az izolált humán IL-Ιβ pro képes hasítani specifikus szubsztrátját akkor is, ha a szubsztrát prekurzor IL-Ιβ polipeptid tercier szerkezetét a szubsztrát polipeptid forró vízben való denaturálásával megváltoztatjuk. A humán prekurzor IL-Ιβ polipeptidet a prekurzor IL-Ιβ oldatának 15 percen keresztüli forralásával denaturáljuk. A denaturálás csak kevéssé befolyásolja a humán IL-Ιβ pro azon képességét, hogy a humán prekurzor IL-Ιβ polipeptidet érett IL-Ιβ polipeptiddé hasítsa. így a szubsztrát polipeptid tercier szerkezete nem befolyásolja jelentősen az IL-Ιβ pro enzim reakcióját.
Az IL-Ιβ pro biológiai aktivitását proteázvizsgálattal határozzuk meg. Mivel az IL-Ιβ pro enzim sóra érzékeny, az 50 mmol/l-nél nagyobb sókoncentrációjú mintákat először sómentesítjük. A mintákat például úgy sómentesíthetjük, hogy 100 μΐ mintát 10 mmol/1 Tris-HCl-t, 5 mmol/1 ditiotreitet tartalmazó pufferrel (pH 8,1) ekvilibrált, előzetesen centrifugált 1 ml-es Biogel P-6DG (Bio-Rad) oszlopra viszünk és 5 percen keresztül 1876 χ g-vel centrifugáljuk. A vizsgálatot úgy végezzük, hogy 5 μΐ (30 ng) tisztított, humán IL-Ιβ prekurzor és 10 μΐ, IL-Ιβ proteáz biológiai aktivitásra vizsgálandó minta elegyét 37 °C-on 60 percen keresztül inkubáljuk. A kontrollmintát hasonló körülmények között inkubálva ellenőrizzük az endogén IL-l-et. A kontrollminta 5 μΐ 10 mmol/1 koncentrációjú TrisHCl-t (pH 8,1) és 5 mmol/1 ditiotreitet tartalmaz IL-Ιβ prekurzor helyett. A kontrollminta inkubálását a mintapufferben SDS (nátrium-dodecil-szulfát) hozzáadásával fejezzük be, majd 5 percen keresztül forraljuk.
Az összes vizsgálatiminta-elegyet elektroforetizáljuk 0,75 mm vastag SDS-14% poliakrilamid géllemezen, megszakításos rendszert - például a Laemmli által ismertetett rendszert [Natúré, 277, 680 (1970)] - alkalmazva. Az elektroforézist követően Westem-blotot végzünk, a proteineket nitro-cellulózra (Sartorius) visszük át, próbaként tisztított IL-Ιβ COOH-terminális-specifikus monoklonális antitest (azaz 16F5) 20 pg/ml koncentrációjú oldatát alkalmazva. A foltot torma-peroxidáz színkifejlesztő reagenssel (Horseradish Peroxidase Color Developing Reagent, Bio-Rad) hívjuk elő. A Westem-bloton kontrollként 0,01 ng tisztított, érett IL-Ιβ polipeptidet alkalmazunk, amelynek molekulatömege 17 500 dalton.
A humán IL-Ιβ pro enzimet THP-1 sejtekből állítjuk elő és tisztítjuk, a sejtek az American Type Culture Collectiontől (ATCC) szerezhetők be. Mintegy 120 1 sejttenyészetet állítunk elő, majd 16 órán keresztül lipopoliszachariddal, hidroxi-karbamiddal és szilícium-dioxiddal stimuláljuk Matsushima módszere szerint [Biochemistry, 25, 3424 (1986)]. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük, Hanks-féle egyensúlyi sóoldattal mossuk, majd újracentrifugáljuk. A sejteket 10 mmol/1 Tris-HCl-t, 5 mmol/1 ditiotreitet tartalmazó pufferben
HU 220 098 Β (pH 8,1) szuszpendáljuk 108 sejt/ml sűrűségig. A szuszpendált sejteket háromszori fagyasztással és felolvasztással lizáljuk, és a lizátumot a felhasználásig -80 °Con tároljuk. A tisztítás előtt a lizátumot felolvasztjuk, majd 20 percen keresztül 47 800 χ g-vel 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszót elválasztjuk a további tisztítás céljára. A fagyasztás-felolvasztás műveletét négyszer megismételve az IL-Ιβ pro aktivitás mintegy 50%-a a felülúszóba kerül. További fagyasztás-felolvasztással nem lehet növelni az oldható anyag hozamát.
A humán IL-Ιβ pro polipeptidet az alább ismertetett hatlépéses eljárással tisztítjuk. Az összes kromatográfiás lépést 4 °C-on végezzük, Pharmacia FPLC rendszert alkalmazva. A DEAE-Sephacel-, hidroxi-apatités Blue Agarose géleket 0,1% Triton Χ-100-zal és 10% boíjúszérummal előkezeljük a proteinek a gélhez történő nemspecifikus adszorpciójának megakadályozására. Ezenkívül a Blue Agarose oszlopot 8 mol/1 koncentrációjú karbamidoldattal mossuk a nem kovalensen adszorbeált festék eltávolítása céljából.
1. Mintegy 500-600 ml lizátum-felülúszót 1:2 arányban hígítunk 10 mmol/1 Tris-HCl-t és 5 mmol/1 ditiotreitet tartalmazó pH 8,1 pufferrel [(A) puffer], ezzel a lizátum ionerősségét 20 mmol/l-nél kisebb értékre csökkentjük. A hígított lizátum-felülúszót (A) pufferrel ekvilibrált DEAE-Sephacel-oszlopra (20x4,4 cm, Pharmacia Fine Chemicals) visszük. Az átfolyási sebesség 120 ml/óra. Az oszlopot két oszloptérfogatnyi (A) pufferrel mossuk, majd lináris gradienssel eluáljuk 3 oszloptérfogatnyi (A) pufferrel, amelyben az NaClkoncentrációt O-tól 300 mmol/l-ig változtatjuk. 15 mles frakciókat szedünk, IL-Ιβ pro aktivitásra analizáljuk és további tisztításig tároljuk. Az IL-Ιβ pro aktivitás 0,07 és 0,13 mol/1 NaCl-koncentráció között eluálódik. Ezzel a lépéssel a szennyező proteinek 79%át eltávolítjuk. A szennyező proteinek fő tömege 0,15 és 0,25 mol/1 NaCl-koncentráció között eluálódik. Ez a lépés alkalmas továbbá az endogén érett IL-Ιβ eltávolítására is, amely 0,06 és 0,11 mol/1 NaClkoncentráció között eluálódik és az endogén prekurzor IL-Ιβ eltávolítására, amely 0,12 és 0,18 mol/1 NaClkoncentráció között eluálódik.
2. A DEAE-oszlopról összegyűjtött aktív frakciókat 5 mmol/1 ditiotreitet tartalmazó 50 mmol/1 koncentrációjú kálium-foszfát-pufferrel (pH 7,0) [(B) puffer] hígítjuk. Egy 14x3 cm-es hidroxi-apatit-oszlopot (HA Ultrogel, IBF Biotechnics) (B) pufferrel ekvilibrálunk. A hígított frakciókat 60 ml/óra átfolyási sebesség mellett az ekvilibrált hidroxi-apatit-oszlopra visszük. Az oszlopot két oszloptérfogatnyi (B) pufferrel mossuk, majd lineáris gradienssel eluáljuk 4 oszloptérfogatnyi (B) pufferrel, amelyben a kálium-foszfát koncentrációját 50 és 200 mmol/1 között változtatjuk. 10 ml-es frakciókat szedünk, IL-Ιβ pro aktivitásra analizáljuk és a további tisztításig tároljuk. Az IL-Ιβ pro 0,085 és 0,113 mol/1 kálium-foszfát-koncentráció között eluálódik. A szennyező polipeptidek 40%-a a proteáz előtt, 40%-a a proteáz után eluálódik. Ezenkívül az endogén, érett IL-Ιβ 0,05 és 0,08 mol/1 kálium-foszfát-koncentráció között eluálódik.
3. Egy 20x1,6 cm-es Blue Agarose oszlopot (Gibco-BRL) (A) pufferrel ekvilibrálunk. A hidroxiapatit-oszlopról összegyűjtött, biológiai aktivitást mutató frakciókat 1:3 arányban hígítjuk (A) pufferrel, ezzel az ionerősséget 30 mmol/l-re csökkentjük. Erre azért van szükség, hogy elősegítsük az IL-Ιβ pro kötődését az oszlophoz. A hígított frakciókat 30 ml/óra átfolyási sebességet alkalmazva visszük a Blue Agarose oszlopra. Az oszlopot három oszloptérfogatnyi (A) pufferrel mossuk. A proteineket lineáris gradienssel eluáljuk 5 oszloptérfogatnyi (A) pufferrel, amelyben az NaCl koncentrációját 0,1 és 1 mol/1 között változtatjuk. 10 ml-es frakciókat szedünk, IL-Ιβ pro aktivitásra analizáljuk és a további tisztításig tároljuk. Az IL-Ιβ pro 0,5 és 0,68 mol/1 NaCl-koncentráció között eluálódik. A szennyező proteinek 80%-át távolítjuk el ebben a lépésben, 20% a proteáz előtt eluálódik és 60% marad az oszlopon megkötve.
4. Egy 95x2,5 cm-es Sephadex G-75 oszlopot (Pharmacia Fine Chemicals) (A) pufferrel ekvilibrálunk és előzetesen ferritinnel (M=400 000), ovalbuminnal (M=43 000), szója-tripszin-inhibitorral (M=20 000) és DNP-aszparaginsawal (300) kalibráljuk. A Blue Agarose oszlopról összegyűjtött, biológiai aktivitást mutató frakciókat Centriprep-10 koncentrátorral (Amicon) mintegy 2 ml térfogatra koncentráljuk, majd a Sephadex G-75 oszlopra visszük. A proteineket (A) pufferrel eluáljuk 20 ml/óra átfolyási sebesség mellett. 4 ml-es frakciókat szedünk, IL-Ιβ pro aktivitásra analizáljuk és a további tisztításig tároljuk. Az IL-Ιβ pro aktivitás 196 és 200 ml között eluálódik. Ez a helyzet a szója-tripszin-inhibitor eluálódásának felel meg, amiből arra következtetünk, hogy a humán IL-Ιβ pro molekulatömege mintegy 20 000 dalton. A szennyező proteinek több mint 90%-át eltávolítjuk ebben a lépésben a preparátumból. így a Sephadex-kromatográfiás lépésig a kezdeti proteinszennyeződések több mint 99,8%-át elválasztjuk az IL-Ιβ pro enzimtől. Azonban a frakciók PAGE-(poliakrilamid-gélelektroforézis) analízise azt mutatja, hogy még mindig van néhány olyan proteinsáv, amely nem mutat IL-Ιβ pro aktivitást.
5. A Sephadex-oszlopról összegyűjtött, biológiai aktivitást mutató frakciókat előkezelt Centriprep-10 koncentrátorokkal 500 μΐ térfogatra koncentráljuk. Mivel a Sephadex-oszlopról nyert oldat proteinkoncentrációja alacsony (<30 pg/ml), a centriprep marha-szérumalbuminnal végzett előkezelése csökkenti az IL-Ιβ pro aktivitásveszteséget a koncentrálás során. A kezelt centriprep alapos mosásával annak alkalmazása előtt megakadályozzuk a minták albuminnal való szennyeződését. Az előkezelést úgy hajtjuk végre, hogy a centriprepben 15 ml 1%-os marha-szérumalbumint (BSA) 30 percen keresztül centrifugálunk, a visszamaradó oldatot dekantáljuk és 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-oldattal mossuk. Egy Mono P5/20 FPLC kromatofokuszáló oszlopot (Pharmacia Fine Chemicals) 25 mmol/1 koncentrációjú Tris-acetátot és 5 mmol/1 ditiotreitet tartalmazó pufferrel (pH 8,3) ekvilibrálunk. A koncentrált oldatot 1:1 térfogatarányban 500 μΐ 25 mmol/1 koncentrációjú Tris-acetátot és 5 mmol/1 ditiotreitet tartal7
HU 220 098 Β mazó pufferrel (pH 8,3) elegyítjük és a Mono P5/20 FPLC oszlopra visszük. A proteineket Polypuffer 96: Polypuffer 74=3:7 (pH 5,0) pufferrel (Pharmacia) eluáljuk 15 ml/óra átfolyási sebesség mellett. 1 ml-es frakciókat szedünk és meghatározzuk pH-jukat és bioló- 5 giai aktivitásukat. Ezzel a kromatofokuszálási lépéssel az IL— 1 β pro tisztasága újból 100-szorosra nő, és a minta vizsgálata során egyetlen proteinsávot találtunk, amely az IL-Ιβ pro biológiai aktivitását mutatta. Az IL-Ιβ pro pH 6,95 és 6,70 között eluálódik a kroma- 10 tofókuszáló oszlopról. A frakciókat BSA-val előkezelt Centricon-10 koncentrátorokkal (Amicon) 1 ml-ről 50 μΐ-re koncentráljuk.
6. A frakciókat poliakrilamid gélen elektroforetizáljuk (PAGE), majd poli(vinil-difluorid) membránpa- 15 pírra (PVDF, Millipore Immobilin-PR) elektroblotoljuk 300 mA alkalmazásával 30 percen keresztül.
A PVDF-membránt Coomassie Blue-val festjük. Öt fősávot kapunk, amelyek molekulatömege közelítőleg 45 000, 43 000, 36 000, 22 000 és 18 000 dalton. Az 20 IL-Ιβ pro aktivitásnak megfelelő 22 000 dalton molekulatömegű sávot szekvenáljuk.
A 22 000 dalton molekulatömegű sáv N-terminális szekvenciája a leírásban közölt aminosavszekvenciát mutatja. A fenti N-terminális aminosavszekvencia és egy háromlépéses polimeráz-láncreakció (PCR-)eljárás alkalmazásával klónozzuk az érett humán IL-Ιβ pro cDNS-t vagy annak aktív fragmensét. Az első PCRlépésben teljesen degenerált PCR primereket tervezünk és készítünk az N-terminális aminosavszekvenciából. A degenerált primereket alkalmazzuk az IL-Ιβ prospecifikus szekvenciák megsokszorozására THP-1 sejtmRNS-ből előállított cDNS-könyvtárból. Egy véletlenszerűen indított első szál THP-1 cDNS-könyvtárat szerkesztünk a gyártó (Amersham) előírásai szerint. Vegyes oligonukleotiddal indított sokszorozást hajtunk végre Lee és munkatársai módszere szerint [„cDNA Cloning Using Degenerate Primers”, PCR Protocols (Innis, Gelfand, Sninsky and White eds.) Academic Press, Inc. New York, 46-53. oldal (1990)].
Az 1. prímért úgy tervezzük, hogy az IL-Ιβ pro DNS 1-17. nukleotidjaival kereszthibridizáljon és egy EcoRI restrikciós helyet tartalmazzon. Az 1. primer szekvenciája (9. számú szekvencia) az alábbi:
5’-GTCGAATTCAA(T/C)CCNGCNATGCCNAC- 3’
A 2. prímért úgy tervezzük, hogy kereszthibridi- zon. A 2. primer szekvenciája (10. számú szekvencia) záljon az IL-Ιβ pro DNS-sel (31-47. nukleotidokkal az alábbi:
komplementer) és egy Xbal restrikciós helyet tartalmaz5’-GTCTCTAGAAG(T/C)TTNAC(A/G)TTNCC(T/C)TC-3’
A PCR-sokszorozást thermus aquatius polimerázzal (Perkin-Elmer Cetus) hajtjuk végre 100 μΐ pufferben 30 ciklussal, Lee és munkatársai fent idézett módszere szerint. A PCR-sokszorozással egy 63 bp hosszúságú megsokszorozott fragmenst kapunk. Ezt a megsokszorozott fragmenst egy pGEM-4 vektorba (Promega) szubklónozzuk. 10 izolált klón DNS-szekvencia-analízise azt mutatja, hogy ez a fragmens az IL-Ιβ pro Nterminálisának első 16 aminosavját kódolja, amelyet tisztítással és az N-terminális szekvenciaanalízisével határoztunk meg.
A PCR-eljárás második lépését egy, az 1. ábra szerint 1-17. nukleotidokat és egy NotI restrikciós helyet tartalmazó 3. primerrel és egy 20 T maradékot és egy NotI restrikciós helyet tartalmazó 4. primerrel végezzük. A 3. és a 4. prímért a fenti THP-1 cDNS-könyvtárhoz adjuk, és PCR-sokszorozást végzünk 6 ciklusban, 94 °Con 1 percen, 50 °C-on 1 percen és 72 °C-on 1 percen keresztül. A PCR-rel sokszorozott kiónok Southem-analízisével egy, az 1. ábra szerinti 16-32. nukleotidokkal komplementer, 17 bázisból álló oligonukleotid-próbát alkalmazva egy mintegy 1000 bp méretű sávot találtunk, amely az IL-Ιβ pro biológiai aktivitásával is rendelkezik. Az 1000 bp méretű DNS-t gélen tisztítjuk, egy második, hasonló PCR-sorozatnak vetjük alá és pGem-5 vektorba szubklónozzuk szekvenálás céljából. A kapott klón nukleotidszekvenciáját az 1. ábra mutatja.
A PCR-eljárás 3. lépésében teljes hosszúságú IL-Ιβ pro kiónokat izolálunk egy perifériás vér neutrofil erede35 tű cDNS-könyvtárból. Azt találtuk, hogy a neutrofilek IL-Ιβ pro mRNS-t expresszálnak. Két kiónt izoláltunk (p48 és p214), amelyek IL-Ιβ pro-specifikus, 1367, illetve 1360 pb méretű inszerteket tartalmaznak. Az 1. ábrán látható DNS-szekvencia az összes IL-Ιβ pro kiónt tartalmazza. Az összes IL-Ιβ pro klón által kódolt aminosavszekvenciát azonosnak találtuk.
Az IL-Ιβ pro cDNS hossza mintegy 1373 bp, beleértve egy A nukleotidokból álló nyúlványt is, amely az mRNS poli(A) farkának felel meg. Ezeket az A maradékokat két poliadenilezési jel (AATAA) előzi meg az 1316. és 1335. bázispámál. A szekvencia egy 404 aminosavas nyílt leolvasási keretet tartalmaz, amely egy iniciátor Met-kodonnal kezdődik a 18. nukleotidnál és egy terminációs kodonnal végződik az 1230. nukleotidnál. A transzláció iniciálása egy kereten belüli Metkodonnal is kezdődhet a 66. nukleotidnál. Mindkét iniciátor Met-kodonnak vannak Kozak-transzlációs iniciációs szekvenciái. Az 51-es helyzetű Met-maradékkal iniciált polipeptidek is rendelkeznek biológiai aktivitással.
Az IL-Ιβ pro citoplazmatikus enzim. Minthogy a tisztított enzim N-terminális aminosavja egy Asn (120), a proteáz N-terminális átalakításon megy át, amelynek eredményeként 119 aminosav - vagy ha az alternatív kodon működött, 69 aminosav - hasad le. Deléciós analízissel megállapítható, hogy a C-terminálisról legalább 107 aminosav hasad le. Azonban úgy tűnik, hogy a teljes C-terminális szükséges a proteáz megfelelő csavarodottságának kialakulásához, mielőtt a mintegy 107 C8
HU 220 098 Β terminális aminosavat eltávolítanánk, hogy a proteáz biológiai aktivitását biztosítsuk.
Az 1. ábrán látható DNS-szekvenciát emlőssejtben (például COS-7 sejtekben) expresszáljuk. Az emlőssejtekben történő expresszióhoz szintetikus oligonukleotid primereket állítunk elő az IL-Ιβ pro teljes kódolódoménjének sokszorozására. Az 5’ primer (11. számú szekvencia) ’ -ATATCGGTACCGCCTCCAGCATGCCTCCGGCAATGCCCACATC- 3 ’ egy Asp 718 restrikciós helyet és egy Met-maradék A 3’primer (12. számú szekvencia) iniciátort tartalmazó az enzim N-terminálisához kötve (1 -20. nukleotid).
5’-CTGCTAGATCTGCCCGCAGACATTCATACAG-3’ egy BglII restrikciós helyet tartalmaz és az 1. ábra szerinti 883-902. nukleotidokkal komplementer. A PCReljárással kapott ffagmenst pDC303 emlősvektorba [Mosley és munkatársai, Cell, 59, 335-348 (1989)] ligáljuk.
A humán IL-Ιβ pro enzimet előnyösen rekombináns DNS-módszerekkel állítjuk elő. A rekombináns DNS-expressziós rendszerben egy humán IL-Ιβ pro polipeptidet vagy biológiai aktivitással rendelkező származékát kódoló kiónt inszertálunk egy expressziós vektorba. Az expressziós vektort egy gazdasejtbe inszertáljuk. A gazdasejt proteint szintetizáló mechanizmusa egy rekombináns humán IL-Ιβ pro polipeptidet szintetizál.
Az emlős-IL-Ιβ pro polipeptidek vagy származékaik expresszálására alkalmas gazdasejtek például prokarióta, élesztő- vagy magasabb rendű eukarióta sejtek lehetnek, megfelelő promoterek szabályozása alatt. A prokarióták Gram-negatív vagy Gram-pozitív organizmusok - például E. coli vagy bacilusok - lehetnek. A transzformálásra alkalmas prokarióta gazdasejtek közé tartozik például az E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium és számos egyéb fajták a Pseudomonas, Streptomyces és Staphylococcus nemzetségen belül. A magasabb rendű eukarióta sejtek például emlősökből származó sejtvonalak lehetnek, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. Sejtmentes expressziós rendszereket is alkalmazhatunk emlős-IL-Ιβ pro polipeptidek vagy származékaik expresszálására, a leírásban ismertetett DNS-szerkezetekből származó RNS-ek alkalmazásával. Bakteriális, fúngális, élesztő és emlősgazdasejtekben alkalmazható megfelelő klónozóvektorokat például Pouwels és munkatársai ismertetnek [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)].
Abban az esetben, ha az IL-Ιβ pro polipeptidet vagy származékát élesztő gazdasejtben expresszáljuk, az expresszió során az IL-1 β pro polipeptidet vagy származékát kódoló nukleotidszekvencia (például struktúrgén) egy szignálszekvenciát (leaderszekvenciát) is tartalmazhat. A szignálszekvencia lehetővé teszi az élesztő gazdasejtben transzlatált polipeptid jobb extracelluláris szekrécióját.
Ezzel szemben prokarióta sejtekben, például E. coliban az IL-Ιβ pro polipeptid vagy származéka egy Nterminális metioninmaradékot is tartalmazhat a rekombináns polipeptid prokarióta sejtekben való expressziójának elősegítésére. Az N-terminális Met-t az exp15 resszált IL-Ιβ pro polipeptidből vagy annak származékából lehasíthatjuk. Ezenkívül a prokarióta gazdasejtek expresszióra és a diszulfidkötések kialakítására is alkalmasak.
A rekombináns IL-Ιβ pro struktúrgén nukleotid20 szekvenciát vagy annak származékát kódoló rekombináns expressziós vektorokat egy megfelelő gazdamikroorganizmus vagy emlőssejtvonal lényegében homogén tenyészetébe transzfektáljuk vagy transzformáljuk. Megfelelő gazdasejtek például a baktériumok, mint pél25 dául az E. coli, az élesztők, mint például a Saccharomyces cerevisiae; vagy az emlőssejtvonalak, mint például az aranyhörcsög-ovárium-(CHO) sejtek.
A transzformált gazdasejtek olyan sejtek, amelyeket IL-Ιβ pro vagy származéka struktúrgén-nukleotid30 szekvenciákkal transzformáltunk vagy transzfektáltunk. Az expresszált IL-Ιβ pro polipeptidek a gazdasejtben lokalizálódnak és/vagy a tenyészet-felülúszóba választódnak ki, a gazdasejt természetétől és a gazdasejtbe inszertált génkonstrumtumtól függően. A proka35 rióta sejtekbe transzfektált expressziós vektorok általában egy vagy több fenotípusos szelektálható markert tartalmaznak. A szelektálható marker például egy olyan proteint kódoló gén, amely antibiotikumrezisztenciát vagy valamilyen autotróf igényt biztosít és egy, a gazdasejt által felismert replikációs origó, ami biztosítja a sokszorozódást a gazdasejtben.
A prokarióta gazdasejtekben alkalmazható egyéb expressziós vektorok egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető plazmidokból származó, bakteriális eredetű szelektálható markert tartalmaznak. Ez a szelektálható marker a pBR322 (ATCC 37017) klónozóvektor genetikus elemeit tartalmazhatja. A pBR322 ampicillin- és tetraciklin-rezisztenciagéneket tartalmaz, így egyszerűen azonosíthatók a transzformált sejtek. A pBR322 „váz”-at megfelelő promoterrel és egy IL-Ιβ pro struktúrgénszekvenciával kombináljuk. Egyéb, kereskedelmi forgalomból beszerezhető vektorok például a pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) és a pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
A rekombináns prokarióta gazdasejt expressziós vektorokban általában gyakran alkalmaznak promoterszekvenciákat. Gyakran alkalmazott promoterszekvencia például a β-laktamáz (penicillináz), a laktóz promoterrendszer [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615 (1978); és Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544
HU 220 098 Β (1979)], a triptofán (trp) promoterrendszer [Goeddel és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 8, 4057 (1980); és EPA 36,776] és a tac promoter [Maniatis: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 412. oldal (1982)]. Egy különösen előnyös prokarióta gazdasejt expressziós rendszerben egy fág PL promotert és egy cI875ts hőlabilis represszorszekvenciát alkalmazunk. A PL promoter származékait tartalmazó, az American Type Culture Collectiontől beszerezhető plazmidvektorok közé tartozik például a pHUB2 plazmid [E. coli JMB9 törzsben (ATCC 37092) fenntartva] és a pPLc28 [E. coli RR1 törzsben (ATCC 53082) fenntartva].
A humán IL-Ιβ pro polipeptidek és származékaik élesztő gazdasejtekben, előnyösen Saccharomyces nemzetségbe tartozó törzsekben (például Saccharomyces cerevisiaeben) is expresszálhatók. Egyéb élesztőnemzetségek, például a Pichia vagy Kluyveromyces is alkalmazhatók. Az élesztővektorok gyakran tartalmaznak egy 2 μ élesztőplazmidból eredő replikációs origószekvenciát, egy autonóm módon replikálódó szekvenciát (ARS), egy promoterrégiót, poliadenilezési szekvenciát és transzkripciós terminációs szekvenciákat. Az élesztővektorok előnyösen egy replikációs origószekvenciát és egy szelektálható markert tartalmaznak. Élesztővektorokhoz megfelelő promoterszekvencia például a metallotionein, 3-foszfo-glicerát-kináz [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980)] vagy egyéb glikolitikus enzimek [Hess és munkatársai, J. Adv. Enzyme Req., 7, 149 (1968); és Holland és munkatársai, Biochem., 17, 4900 (1978)], például enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfoffuktokináz, glükóz-6-foszfátizomeráz, 3-foszfoglicerát-mutáz, piruvátkináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz-promoterek. Az élesztő expressziós rendszerekben alkalmazható egyéb vektorokat és promotereket például Hitzeman ismerteti az EP-A-73,657 számú szabadalmi leírásban.
Az élesztővektorokat például pBR322-ből származó DNS-szekvenciákkal illeszthetjük össze E. coliban való szelekcióhoz és replikációhoz (Ampr gén és replikációs origó). Az élesztő expressziós rendszerekben jelen lévő egyéb élesztő-DNS-szekvenciák például a glükózzal represszálható ADH2 promoter és az α-faktor szekréciós szignálszekvencia. Az ADH2 promotert Russell és munkatársai [J. Bioi. Chem., 258,2674 (1982)] és Beier és munkatársai [Natúré, 300,724 (1982)] ismertetik. Az élesztő-a-faktor szignálszekvencia heterológ polipeptidek szekrécióját irányítja. Az α-faktor szignálszekvenciát gyakran a promoterszekvencia és a struktúrgénszekvencia közé inszertálják [lásd például Kurjan és munkatársai, Cell, 30, 933 (1982); és Bittér és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5330 (1984)]. A szignálszekvenciát 3’-végének közelében módosíthatjuk is, hogy egy vagy több restrikciós helyet tartalmazzon. Ez megkönnyíti a szignálszekvencia kapcsolását a struktúrgénhez.
Az élesztők transzformálására szolgáló eljárások szakemberek számára jól ismertek. Egy ilyen eljárást ismertetnek például Hinnen és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)]. A fenti eljárásban Trp+ transzformánsokat szelektálunk szelektív tápközegben, amely 0,67% élesztő-nitrogénbázist, 0,5% kazeinhidrolizátumot (cas-amino acids), 2% glükózt, 10 pg/ml adenint és 20 pg/ml uracilt tartalmaz.
Az ADH2 promoterszekvenciát tartalmazó vektorokkal transzformált élesztő gazdasejteket az expresszió indukálására „gazdag” tápközegben is tenyészthetjük. A „gazdag” tápközeg például 1% élesztőkivonatot, 2% peptont, 1% glükózt tartalmaz 80 pg/ml adeninnel és 80 pg/ml uracillal kiegészítve. Az ADH2 promoter derepressziója akkor megy végbe, amikor a tápközegből elfogy a glükóz.
Az IL-Ιβ pro polipeptid és származékai expreszszálására emlős- vagy rovargazdasejt-tenyészeteket is alkalmazhatunk. Megfelelő emlősgazdasejt-vonalak például a majomvesesejt eredetű COS-7 sejtvonalak [Gluzman, Cell, 23,175 (1981)], az L-sejtek, C127 sejtek, 3T3 sejtek, aranyhörcsög-ovárium-(CHO) sejtek, HeLa-sejtek és BHK sejtvonalak. A megfelelő emlős expressziós vektorok nem átíródó elemeket tartalmaznak, például replikációs origót, promoterszekvenciát, a struktúrgénhez kötött fokozót, egyéb 5’- vagy 3'-határoló, nem átíródó szekvenciákat, például riboszómakötő helyeket, poliadenilezési helyet, összevágó (splice) donor- és akceptorhelyeket és transzkripciós terminációs szekvenciákat.
Az emlősgazdasejt expressziós vektorokban a transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciák vírus eredetűek lehetnek. Például a gyakran használt emlőssejt promoterszekvenciák és fokozószekvenciák Polyoma, Adenovírus 2, Simian Vírus 40 (SV40) és humán citomegalovírus eredetűek. Az SV40 virális genomból származó DNS-szekvenciák, például az SV40 origó-, korai és késői promoter, fokozó-, összevágó és poliadenilezési helyek alkalmazhatók a struktúrgénszekvencia emlősgazdasejtben való expressziójához szükséges egyéb genetikus elemek biztosítására. A virális korai és késői promoter különösen hasznosak, mivel mindkettő egy virális replikációs origót is tartalmazó fragmensként könnyen kinyerhető egy virális genomból [Fiers és munkatársai, Natúré, 273, 113 (1978)]. A kisebb vagy nagyobb SV40 ffagmensek is alkalmazhatók, feltéve, hogy tartalmaznak egy mintegy 250 bp hosszúságú szekvenciát az SV40 virális replikációs origóban lokalizálva, amely a HindlII helytől a BglI helyig tart.
Ezenkívül emlős genomiális IL-Ιβ pro promoter-, szabályozó- és/vagy szignálszekvenciák alkalmazhatók, feltéve, hogy az ilyen szabályozószekvenciák kompatibilisek a választott gazdasejttel. A vektorokat például Okayama és Berg módszere szerint konstruálhatjuk meg [Mól. Cell. Bioi., 3, 280 (1983)].
A tisztított humán IL-Ιβ pro polipeptideket és származékaikat úgy állítjuk elő, hogy a transzformált gazdasejteket az IL-Ιβ pro polipeptidek vagy származékaik expresszálására szükséges feltételek között tenyésztjük. Az expresszált polipeptideket a tenyészközegből vagy sejtextraktumokból tisztítjuk. Például a tenyész10
HU 220 098 Β tett transzformált gazdasejtek a tenyészlé felülúszójába szekretálhatják a rekombináns IL-Ιβ pro polipeptidet. Az IL-Ιβ pro polipeptidet vagy származékát kereskedelmi forgalomból beszerezhető koncentrálószűrővel, például Amicon vagy Millipore Pellicon ultraszűrő egységgel koncentráljuk. A koncentrálás után a koncentrátumot tisztítómátrixra visszük fel. Tisztítómátrixként például egy IL-Ιβ pro inhibitort vagy egy IL-Ιβ pro polipeptidre vagy származékára specifikus antitestmolekulát alkalmazhatunk, megfelelő hordozóhoz kötve. Alternatív módon anioncserélő gyantát is alkalmazhatunk, például lelógó dietil-amino-etil-csoportokat (DEAE) tartalmazó mátrixot vagy szubsztrátot. A mátrix például akrilamid, agaróz, dextrán, cellulóz vagy egyéb típusú, proteinek tisztítására szokásosan alkalmazott mátrix lehet. Alternatív módon kationcserét is végezhetünk. Kationcserélőként például különféle, szulfo-propil- vagy karboxi-metil-csoportokat tartalmazó oldhatatlan mátrixokat alkalmazhatunk. Előnyösek a szulfo-propil-csoportok.
A prekurzor IL— Ιβ-ból a biológiailag aktív forma kialakulásáért felelős proteáz izolálása és jellemzése elősegíti az IL-Ιβ átalakulását gátló molekulák (inhibitorok) tervezését, mivel a nagy mennyiségben rendelkezésre álló IL-Ιβ pro az IL-1 antagonistaaktivitással rendelkező vegyületek kiszűrésére alkalmazható. Az ilyen IL-l-antagonisták vagy IL-Ιβ pro inhibitorok gyulladások és transzplantátumkilökődés kezelésére alkalmazhatók.
A találmány szerinti inhibitorok szubsztituált vegyületek, amelyek egy N-terminális védőcsoportot és egy elektronegatív kilépőcsoporthoz kapcsolódó C-terminális Asp-maradékot tartalmazó, 1-5 aminosavmaradékból álló aminosavszekvenciát tartalmaznak, mimellett az aminosavszekvencia az Ala-Tyr-Val-His-Asp szekvencia legalább egy részének felel meg, amely szekvencia a preIL-Ιβ 112-116. helyzetű aminosavmaradékaiból álló szekvenciát jelenti.
A preIL-Ιβ aminosavszekvenciáját a 3. számú szekvencia és a 2. ábra mutatja, amelyet March C. J. és munkatársai határoztak meg [Natura (London), 375(6021), 641-647 (1985)]. Az érett IL-Ιβ-ί a preIL-Ιβ C-terminális 153 aminosavmaradéka képviseli. így az IL-Ιβ N-terminálisa a 3. számú szekvencia 117-es helyzetű Ala-maradéka.
A leírásban az aminosavakat teljes nevük (például alanin) helyett hárombetűs kódjukkal (például Alá) jelöljük.
A természetes aminosavak L-izomerek, ezért ezeket az izomerek (L- vagy D-) megjelölése nélkül tüntetjük fel. Amennyiben D-izomerről van szó, ezt feltüntetjük.
A „megfelelő” kifejezés alatt azt értjük, hogy az inhibitorvegyület adott szekvenciája egy vagy több konzervatív szubsztitúcióban eltérhet a megadott szekvenciától, amennyiben ezek a szubsztitúciók alapvetően nem változtatják meg a találmány szerinti vegyületek inhibitoraktivitását.
Azokra a szubsztitúciókra, amelyek alapvetően nem változtatják meg a találmány szerinti vegyületek inhibitoraktivitását, példaként említjük a 3. számú szekvencia 112-es helyzetű Ala-maradékának cseréjét Ser-re vagy Gly-re; a 3. számú szekvencia 113-as helyzetű Tyr-maradékának cseréjét Phe-ra; a 3. számú szekvencia 114-es helyzetű Val-maradékának cseréjét Leu-ra, Ile-ra vagy Met-ra; és a 3. számú szekvencia 115-ös helyzetű His-maradékának cseréjét Phe-ra, Pro-ra, egy pozitív töltésű aminosavra, például Lys-re, Arg-re, Hisre vagy Tyr-ra; vagy a D-izomerek alkalmazását.
A találmány szerinti inhibitorvegyületek C-terminális aminosavmaradéka aszparaginsav (Asp). Az Asp egy -CH2-COOH oldallánccal rendelkezik. Az Asp oldalláncának -COOH csoportját előnyösen védjük a találmány szerinti vegyületek szintézisének megkönnyítése érdekében.
Az Asp oldalláncának védésére például benzilcsoportot, szubsztituált benzilcsoportot, formil-metil-csoportot vagy terc-butil-csoportot alkalmazhatunk. A benzilcsoport szubsztituensei növelik az Asp oldallánc védőcsoportjának savval szembeni labilitását. A szubsztituált benzilcsoport például 2,4,6-trimetil-benzil-csoport vagy 4-metoxi-benzil-csoport lehet.
Egy előnyös kiviteli alakban az Asp oldallánc védőcsoportja az Asp oldallánchoz egy észterkötésen keresztül kapcsolódik, amely kötést a természetes intracelluláris észterázenzimek hasítják. Ily módon a nagy lipidoldékonyságú védett Asp bejut a sejtbe és ott egy észterázenzim elhasítja, miáltal töltéssel rendelkező, vízoldékony, védőcsoport nélküli Asp keletkezik, ami a citoplazmában marad, ahol az IL-Ιβ pro elsődlegesen lokalizálódik.
N-terminális védőcsoport alatt a találmány szerinti szekvenciák N-terminális aminosavmaradékának aminocsoportjához kapcsolt kémiai csoportokat értjük. Az ilyen csoportok szakemberek számára jól ismertek [lásd például The Peptides, szerkesztők Gross és Meienhofer, Academic Press, New York, 3-81. oldal (1981)]. Az N-terminális védőcsoportokat egyéb típusú proteázinhibitorokban is alkalmazták (lásd például a 4,652,552 és 4,636,492 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).
Elektronegatív kilépőcsoport alatt olyan kémiai csoportokat értünk, amelyek az enzim aktív helyén egy aminosavmaradék általi nukleofil támadásra érzékenyek, ezáltal az IL-Ιβ pro-t úgy módosítják, hogy az IL-Ιβ pro nem tud kölcsönhatásba lépni a preIL-Ιβ polipeptiddel, és azt nem tudja elhasítani.
A találmány szerinti vegyületek irreverzíbilisen vagy reverzibilisen gátolják az IL-Ιβ pro katalitikus aktivitását. Irreverzíbilis alatt kovalens kötés kialakulását értjük az enzim és az inhibitor között.
Az IL-Ιβ pro aktivitás reverzibilitása az elektronegatív kilépőcsoporttól függ. Ha az elektronegatív kilépőcsoport egy diazo-alkil-keton, az IL-Ιβ pro gátlása irreverzíbilis és a vegyület egy irreverzíbilis inhibitor. Ha az elektronegatív kilépőcsoport egy aldehid, az IL-Ιβ pro gátlása reverzibilis, és a vegyület egy reverzibilis inhibitor.
A találmány szerinti vegyületek
Z-Q2-Asp-Qj (I) általános képletében
HU 220 098 Β
Z jelentése N-terminális védőcsoport;
Q2 egy 0-4 aminosavmaradékból álló aminosavszekvenciát jelent, miáltal a Q2-Asp a 3. számú szekvencia 112-116. helyzetű Ala-Tyr-Val-His-Asp maradékainak legalább részben megfelel; és
Qi jelentése elektronegatív kilépőcsoport.
Egy előnyös kiviteli alakban Z jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, benzilcsoport, acetilcsoport, 1-6 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, benzil-oxi-karbonil-csoport vagy 1-6 szénatomos alkil-karbonil-csoport. Alkilcsoport alatt egyenes vagy elágazó szénláncú, 1-6 szénatomot tartalmazó, adott esetben a megadott módon szubsztituált csoportokat értünk. Példaként említjük a metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, pentil-, hexilcsoportot és a hasonló csoportokat. Egy még előnyösebb kiviteli alakban Z jelentése tercbutoxi-karbonil-csoport (t-Boc), acetilcsoport vagy benzil-oxi-karbonil-csoport (Cbz).
Q2 előnyösen egy aminosavat jelent. Q2 jelentése előnyösen His, Phe, Pro vagy Tyr. Még előnyösebben Q2 jelentése His vagy Phe.
Qi előnyösen egy aldehidet, diazo-alkil-ketont vagy halogén-alkil-ketont jelent. Az elektronegatív kilépőcsoportban megadott alkilcsoport egyenes vagy elágazó szénláncú, 1 -3 szénatomos csoportokat értünk, amelyek adott esetben szubsztituáltak lehetnek. Példaként említjük a metil-, etil-, propilcsoportot és a hasonló csoportokat. Qj jelentése még előnyösebben aldehidcsoport vagy fluor-metil- (CH2F) keton.
A találmány szerinti vegyületeket ismert eljárásokkal állítjuk elő [lásd például Kettner C. A. és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 162, 56 (1964); 4,582,821 és 4,644,055 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; Kettner C. A. és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 165, 739 (1974); Dakin H. D. és West R., J. Bioi. Chem., 78, 91 (1928); Rasnick D., Anal. Biochem., 149,461 (1985)].
Az elektronegatív kilépőcsoportként fluor-metilcsoportot tartalmazó vegyületeket előnyösen Rasnick eljárása szerint állítjuk elő.
A fluoratomtól eltérő halogén-alkil-keton elektronegatív kilépőcsoportot tartalmazó vegyületeket Kettner eljárása szerint állítjuk elő. Egy N-védett aminosavat vagy peptidet N-metil-morfolinnal és egy alkil-(nem fluor)-halogén-formiáttal reagáltatjuk, majd az így kapott peptidsavanhidridet inért, aprotikus oldószerben diazo-alkánnal reagáltatva kialakítjuk a peptid-diazometán-ketont. A diazo-metán-ketont ezután vízmentes hidrogén-kloriddal, hidrogén-bromiddal vagy hidrogénjodiddal reagáltatva kapjuk a kívánt N-védett, C-terminális halogén-alkil-keton-peptidet vagy -aminosavat.
A fluor-alkil-keton elektronegatív kilépőcsoportot tartalmazó vegyületeket Rasnick eljárása szerint szintetizáljuk. Egy N-védett peptidet fluor-ecetsavanhidriddel és egy trialkil-aminnal reagáltatunk szerves oldószerben a peptidanhidrid kialakítása céljából. Az anhidridet ezután katalizátorral, például 4-(dimetil-amino)piridinnel reagáltatjuk, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül mintegy 25 °C-on tartva elősegítjük a CO2-fejlődést. A reakcióelegyet ezután szerves oldószerrel extraháljuk, a szerves fázist mossuk és szárítjuk. A szerves fázist eltávolítva olajat kapunk, amelyet szilikagéloszlopra viszünk. Az N-védett fluor-alkil-keton-peptidet a gélről eluáljuk és tisztítjuk.
A fluor-alkil-keton elektronegatív kilépőcsoportot tartalmazó vegyületeket N-terminális irányban úgy hosszabbíthatjuk meg, hogy az N-terminális védőcsoportot eltávolítjuk, és a védőcsoport nélküli vegyületet további védett aminosavakkal kapcsoljuk [Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1984)]. Alternatív módon a védőcsoporttól megfosztott vegyületeket acetilezhetjük, így N-terminális acetil-védőcsoportot tartalmazó vegyületeket kapunk [Stewart és munkatársai, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. (1984)].
A találmány az IL-Ιβ pro polipeptideket vagy azok származékait adott esetben megfelelő hígítóanyaggal vagy hordozóanyaggal összekeverve gyógyászati célokra alkalmazzuk. A fenti célokra a tisztított IL-Ιβ pro polipeptidet vagy biológiailag aktív származékát az adott gyógyászati indikációnak megfelelő módon adagoljuk a kezelendő betegnek, előnyösen embernek. így például az autoimmuntünetek szupresszálására az IL-Ιβ pro készítményeket boluszinjekció, folyamatos infúzió, implantátumokból nyújtott felszabadulást biztosító készítmények formájában vagy egyéb arra alkalmas módszenei adagoljuk a betegnek. Az IL-Ιβ pro hatóanyagot tipikusan olyan gyógyászati készítmény formájában adagoljuk, amely a tisztított polipeptidet fiziológiásán elfogadható hordozóanyaggal, hígítóanyaggal vagy egyéb segédanyaggal együtt tartalmazza. A fenti hordozóanyagok a betegre nézve nem toxikusak az alkalmazott dózisokban és koncentrációkban, és egy vagy több segédanyagot is alkalmazhatnak a gyógyászati készítmények előállításához.
A találmány szerinti inhibitorvegyületek az interleukin-ΐβ fiziológiai hatásainak gátlására alkalmazhatók azáltal, hogy megakadályozzák a biológiailag aktív IL-Ιβ képződését. Az IL-Ιβ pro gátlása az aktív IL-Ιβ koncentrációjának csökkenését eredményezi, és ezzel egyidejűleg növekszik a preIL-Ιβ koncentrációja, amely utóbbi vegyület biológiailag inaktív.
A találmány szerinti inhibitorvegyületek különféle működési zavarok, például a gyakran a megnövekedett IL-l-aktivitás által médiáit autoimmunbetegséggel kapcsolatos gyulladás kezelésére alkalmazhatók.
A gyulladásos betegség kezelését vagy az autoimmunállapot kialakulásának megakadályozását igénylő emlősöknek a találmány szerinti inhibitorvegyületek hatásos mennyiségét önmagukban vagy gyógyászati készítmények formájában adagoljuk.
A találmány szerinti gyógyászati készítmények egy vagy több találmány szerinti vegyületet tartalmaznak egy vagy több nemtoxikus, fiziológiailag elfogadható hordozóanyaggal, adjuvánssal vagy hígítóanyaggal továbbiakban összefoglalóan hordozóanyaggal - összekeverve és parenterális injektálásra, orális adagolásra vagy szilárd vagy cseppfolyós formában, rektális vagy helyi adagolásra stb. alkalmas gyógyászati készítménynyé formálva.
HU 220 098 Β
A találmány szerinti inhibitorvegyületek teljes napi dózisa - amelyet a kezelendő betegnek egyszeri vagy több részre osztott adagban adunk - mintegy 0,1 mg-mintegy 160,0 mg lehet 1 testtömeg-kg-ra vonatkoztatva. A dózisegység-készítmények a fenti menynyiségeket vagy azok hányadát tartalmazhatják, amelyekből a napi dózis biztosítható. Magától értetődik azonban, hogy az adott esetben alkalmazandó dózis nagyságát minden egyes beteg esetében a kezelést végző orvos határozza meg, a különféle faktoroktól, például a beteg testtömegétől, általános egészségi állapotától, nemétől, diétájától, az adagolás módjától és időpontjától, a felszívódás és kiürülés sebességétől, az egyéb gyógyszerekkel való együttes alkalmazástól és a kezelendő betegség súlyosságától függően.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.
1. példa
IL-1$ szubsztrátspecificitása
A tisztított humán IL-Ιβ pro enzim szubsztrátspecificitását az aminosavszekvenciák bizonyos csoportjának hasításában az alábbiakban szemléltetjük. Különböző peptidszubsztrátokat állítottunk elő, amelyekben változtattuk a humán prekurzor ΙΕ-Ιβ-ban lévő hasítási helynek megfelelő régióban (115-ös helyzetű His-118as helyzetű Pro) az egyes aminosavakat. A peptidszubsztrátok reakcióképességét a prekurzor IL-^-szekvenciában a 112-es helyzetű Ala-tól a 121-es helyzetű Ser-ig tartó szekvenciának megfelelő peptid reakcióképességéhez viszonyítottuk.
A szubsztrát peptideket szilárd fázisú módszerrel szintetizáljuk [Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 86, 304-305 (1964)], Applied Biosystems 430A peptidszintetizátort vagy Houghten-féle manuális T-bag módszert alkalmazva [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 5131-5135 (1985)]. 4-metil-benzhidril-amin-gyantát alkalmazunk. A szubsztrát peptideket a gyantáról való lehasítás előtt acetilezzük cseppfolyós HF-dal 0 °C-on 1 órán keresztül anizol mint savmegkötő szer jelenlétében (HF:anizol=9:l). A HF elpárologtatósa után a szubsztrát peptid és gyanta elegyét dietil-éterrel mossuk és 15 vegyes%-os ecetsavoldattal extraháljuk, liofilizáljuk és fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (RP-HPLC) tisztítjuk Vydac
2,2 cmx25 cm-es oszlopon. (A) oldószerként
0,1 %-os vizes trifluor-ecetsav-oldatot, (B) oldószerként 0,1 %-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldatot alkalmazunk mozgó fázisként.
A tisztított szubsztrát peptideket aminosavanalízissel azonosítjuk Beckman 6300 rendszert, RP-HPLC-t és tömegspektrometriát alkalmazva. A tömegspektrumokat vagy gyors atommal való bombázással mérjük VG Trio-2 rendszerben, xenonnal mint ionizáló gázzal és glicerin/tioglicerin (1:1) mintamátrixszal vagy 252Cf plazmadeszorpciós tömegspektrometriával, Bio-Ion 20 tömegspektrométerrel [lásd Tsarbopoulos, Peptide Rés., 2, 258-266 (1989)]. A peptidszubsztrát mért tömegspektruma mindkét esetben megfelel az elméleti értékeknek.
A standard koncentrációjú peptidoldatokat úgy állítjuk elő, hogy mintegy 2-3 mg peptidszubsztrátot oldunk vízben, az oldatot Waters Sep-Pak C18-oszlopra visszük és háromszor 5 ml vízzel mossuk. A peptidszubsztrátokat acetonitrillel eluáljuk, majd szárazra pároljuk. Minden egyes szubsztrátot 1 mmol/1 koncentrációra állítunk be aminosavanalízis segítségével az alkalmazás előtt.
μΐ tisztított humán IL-Ιβ pro enzimet, 10 μΐ vizes peptidszubsztrátoldatot és 25 térfogat% glicerint tartalmazó 10 μΐ 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-puffert (pH 8,0) összekeverünk, és az elegyet 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáljuk. A reakciót 10 μΐ 1 mol/1 glicin/HCl-puffer (pH 2,0) hozzáadásával leállítjuk. A mintákat ezután RP-HPLC-eljárással analizáljuk Vydac C18-oszlop (0,46 cmx25 cm) alkalmazásával és 100% (A) oldószer-»70% (A) oldószer/30% (B) oldószer lineáris gradiensével eluáljuk 30 perc alatt, 1 ml/perc átfolyási sebességet alkalmazva. Az effluensben 280 nm-en mérjük az abszorbeáló terméket. A peptidtermék csúcs alatti területét a szubsztrát és a termék együttes csúcs alatti területével összehasonlítva kapjuk a peptid hasításának mértékét, mivel a szubsztrát- és termékcsúcsok alatti területek összege állandó és független az IL-Ιβ pro enzim által hasított mennyiségtől. A peptidtermékcsúcsokat aminosavanalízissel és tömegspektrometriával azonosítjuk.
Az 1. táblázat mutatja a tisztított IL-Ιβ pro enzimmel emésztett nyolc peptidszusztrát relatív reakcióképességét.
7. táblázat
Peptid száma Szekvencia 1. pepiidhez viszonyított relatív reakcióképesség
1. Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (13. számú szekvencia) 1,00
2. Ala-Tyr-Val-His-Asn-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (14. számú szekvencia) <0,01
3. Ala-Tyr-Val-His-Glu-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (15. számú szekvencia) <0,05
4. Ala-Tyr-Val-His-(D-Asp)-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (16. számú szekvencia) <0,01
5. Ala-Tyr-Val-His-Asp-Gly-Pro-Val-Arg-Ser (17. számú szekvencia) 3,40
6. Ala-Tyr-Val-His-Asp-Val-Pro-Val-Arg-Ser (18. számú szekvencia) <0,05
7. Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (19. számú szekvencia) 0,50
8. Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Ala-Val-Arg-Ser (20. számú szekvencia) 0,47
HU 220 098 Β
A hasítási helyet a megfelelő humán prekurzor IL-Ιβ aminosavmaradékokkal jellemezhetjük az alábbiak szerint:
Ρ2Ρ1ΡΓΡ2’
His-Asp-Ala-Pro
Az 1. peptidben az L-aszparaginsav-maradék cseréje aszparaginra (2. peptid) vagy glutaminsavra (3. peptid) vagy D-aszparaginsavra (4. peptid) erősen befolyásolta az IL—1 β pro szubsztrátot hasító képességét. Ezen adatok szerint Pl-helyzetben egy aszparaginsavmaradékra van szükség ahhoz, hogy az enzim képes legyen a szubsztrátot hasítani.
Az 5. és 6. peptidekben a humán prekurzor IL-Ιβ hasítási hely Pl ’-helyzetét változtattuk meg. Az alanint glicinre cserélve (5. peptid) olyan szubsztrátot kapunk, amely 3,4-szer reakcióképesebb, mint az 1. peptid. Azonban ugyanezen maradék cseréje valinra (6. peptid) hatékonyan gátolja a proteolitikus hasítást. Az a tény, hogy egy glicinmaradékkal Pl’-helyzetben a peptid gyorsabban hasítódik, arra következtethetünk, hogy a humán prekurzor IL-Ιβ polipeptidben az alaninmaradék nem kritikus a szubsztrát kötődése szempontjából, míg a ΡΓ-helyzetben a valinmaradékkal kapott eredmény kis szterikus toleranciára utal a ΡΓ-helyzetben. Ezért nem valószínű, hogy az IL-Ιβ pro enzim vagy származéka bármely más helyen fog hasítani, mint az Asp-Gly és az Asp-Ala maradékok között.
A 7. és a 8. peptid a P2-, illetve P2’-helyzetben jelent változtatást. Az 1. peptid prolinját alaninra cserélve olyan szubsztrátot kapunk, amelyet a humán IL-Ιβ pro még képes hasítani, de csak fele akkora hatékonysággal, mint a humán IL-Ιβ natív szekvenciájával rendelkező peptidet. Hasonló eredményt kapunk akkor is, ha az 1. peptidben a hisztidint cseréljük fenil-alaninra. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a humán IL-Ιβ pro enzim mindkét maradék konzervatív cseréjét tolerálja, és hogy a P2- és P2’-helyzet nem olyan létfontosságú az aktivitás szempontjából, mint a Pl- és Pl’-helyeztű aminosavak.
2. példa
A szubsztrát hosszának hatása
Ebben a példában a szubsztrát peptidek hosszának hatását vizsgáljuk a humán IL-Ιβ pro enzim peptidszubsztrátokat hasító képességére. A vizsgálatot az 1. példában leírtak szerint végezzük. Öt peptidet állítunk elő a humán prekurzor IL-Ιβ polipeptid IL-Ιβ pro enzim általi hasítási helye aminosavszekvenciájának megfelelően. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
Peptid száma Szekvencia 1. pepiidhez viszonyított relatív reakcióképesség
1. Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser (13. számú szekvencia) 1,00
9. Glu-Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu (21. számú szekvencia) 0,74
10. Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg (22. számú szekvencia) 2,40
11. Val-His-Asp-Ala-Pro-Val (23. számú szekvencia) nem hasad
12. His-Asp-Ala-Pro (24. számú szekvencia) nem hasad
A nyolc aminosavmaradékból álló peptid (AcTyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-NH2) hasítódik leghatékonyabban, míg a négy és hat aminosavmaradékból álló peptidek nem hasadnak. így az IL-Ιβ pro enzimnek egy minimális számú aminosavmaradékra van szüksége ahhoz, hogy a szubsztrát peptidet hasítani tudja.
3. példa
IL-1$ proteázinhibitorok szintézise
A) Boc-Asp-CH2F előállítása
8,11 mmol Boc-Asp-OH és 16,2 mmol trifluorecetsavanhidrid 30 ml benzollal készült szuszpenzióját szobahőmérsékleten 16,2 mmol trietil-aminnal kezeljük. 0,41 mmol 4-(dimetil-amino)-piridin-katalizátor hozzáadása után a reakcióelegyet szobahőmérsékleten mintegy 2 órán keresztül keverjük. A reakcióelegyhez körülbelül 100 ml benzolt adunk. A szerves oldatot kétszer 50 ml 1 n sósavoldattal és kétszer 50 ml telített nátriumklorid-oldattal mossuk, majd vízmentes magnéziumszulfát felett szárítjuk. Az oldószert ezután vákuumban elpárologtatjuk. A kapott olajat 2,5 cmx80 cm-es szilikagéloszlopra (60-200 mesh) visszük. A cím szerinti vegyületet 2% metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk.
B) Boc-His-Asp-CH2F, Boc-Pro-Asp-CH2F, BocTyr-Asp-CH2F és Boc-Phe-Asp-CH2F szintézise A 3. példa A) lépése szerint előállított Boc-AspCH2F-ot trifluor-ecetsavban (TFA) oldjuk, és az elegyet 23 °C-on mintegy 5 percen keresztül keveijük. Az elegyhez ezután hideg dietil-étert adunk. Az étert elpárologtatjuk és maradék trifluor-ecetsav elpárologtatósa céljából toluolt adunk hozzá. A védőcsoport nélküli peptidet (H-Asp-CH2F) trifluor-ecetsavas só formájában kapjuk. A védőcsoport nélküli peptidet standard szimmetrikus anhidrid módszer alkalmazásával, kapcsolószerként diciklohexil-karbodiimidet alkalmazva kapcsolhatjuk egy védett aminosavhoz (azaz BocHis-OH-hez, Boc-Pro-OH-hoz, Boc-Tyr-OH-hoz vagy Boc- Phe-OH-hoz), Bodanszky fent idézett eljárása szerint.
C) Ac-His-Asp-CH2F, Ac-Pro-Asp-CH2F, Ac-TyrAsp-CH2F és Ac-Phe-Asp-CH2F előállítása
HU 220 098 Β
A 3. példa B) lépése szerint előállított vegyületekből a Boc védőcsoportot trifluor-ecetsavas kezeléssel távolíthatjuk el a fent ismertetett módon. A védőcsoport nélküli vegyületeket ezután ecetsavanhidriddel és diizopropil-aminnal (DIAE) ismert módon acetilezhetjük, Stuart és munkatársai fent idézett eljárása szerint.
D) Cbz-His-Asp-CH2F, Cbz-Pro-Asp-CH2F, CbzTyr-Asp-CH2F és Cbz-Phe-Asp-CH2F előállítása
A 3. példa A) lépése szerint előállított Boc-AspCH2F Boc védőcsoportját trifluor-ecetsavas kezeléssel távolíthatjuk el a fent ismertetett módon. A kereskedelmi forgalomban kapható benzil-oxi-karbonilcsoporttal védett aminosavakat (azaz Cbz-His-OH-t, Cbz-Phe-OH-t, Cbz-Tyr-OH-t és Cbz-Pro-OH-t) (Bachem, Philadelphia, PA) ezután a védőcsoport nélküli Asp-hoz kapcsolhatjuk, szimmetrikus anhidrides kapcsolással Bodanszky fent idézett eljárása szerint.
4. példa
IL-lfi pro aktivitásának gátlása
A Boc-Asp-CH2FpreIL-Ιβ IL-Ιβ pro által katalizált degradálódását gátló képességét in vitro vizsgálati módszerrel határoztuk meg [Black és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263(19), 9437 (1988)]. Az eredményeket a 3. ábra mutatja. A Boc-Asp-CH2F-ot a 3. példa A) lépése szerint állítjuk elő.
A) prelL-1$ előállítása
A preIL-Ιβ prekurzor polipeptidet E. coliból állítjuk elő standard rekombináns DNS-módszerrel, Black és munkatársai fent idézett eljárása szerint. A rekombináns prelL- 1β polipeptidet E. coliban expresszáljuk a fág PL-promoter és a οΙ857Β hőstabilis represszor szabályozása alatt. A pLNIL-ΙβΡ plazmidot standard rekombináns DNS-módszerrel szerkesztjük meg az alábbi DNS-szekvenciák ligálásával: (1) NcoI/HindlII-emésztett pLNIL-Ιβ (12) 6160 bázispáija, amely az (ampicillinrezisztenciát biztosító) vektort, a 134-269. kodonokat és a HuIL-Ιβ 3’ nem kódoló régióit tartalmazza; (2) az IL-Ιβ 1-6. maradékait és az Ncol és SstI komplementer végeket kódoló komplementer szintetikus oligonukleotidok; és (3) az IL- 1β-6(1) plazmidból származó, 380 bp hosszúságú Sstl/HindlII restrikciós fragmens, amely a 7-133. maradékokat kódolja. A ligációs elegyet tetraciklinrezisztens RRI:pRK248cIte (12) gazdasejtbe transzformáljuk, és a helyesen kapcsolódott plazmidokat a mind ampicillinre, mind tetraciklinre rezisztens transzformánsokból izolált DNS restrikciós analízisével azonosítjuk. A pLNIL-ΙβΡ plazmidot tartalmazó transzformánsokat prelL-Ιβ-termelés szempontjából vizsgáljuk szuperindukciós tápközegben A6OO=0,5 értékig tenyésztett és 1-20 órán keresztül a hőmérséklet 30 °C-ról 42 °C-ra való emelésével derepesszált tenyészetek SDS-PAGE-analízisével. Egy mintegy 31 000 dalton molekulatömegű proteint találtunk a pLNIL-ΙβΡ plazmidot tartalmazó tenyészetekből származó mintákban, azonban az IL-Ιβ kódolórégiót nem tartalmazó kontrolltenyészetekben nem. Antil-IL-Ιβ monoklonális antitesttel (MAb) és standardként tisztított rekombináns érett IL-Ιβ-val végzett immunblot-analízis szerint a tenyészetek mintegy 2,5-5,0 pg/ml prelL-1β polipeptidet tartalmaznak.
B) prelL-7β extrahálása E. coliból
A transzformált E. coli sejtek 2,5 1 tenyészetéből származó sejtüledéket 20 ml, 5 mmol/1 etilén-diamintetraecetsavat (EDTA), 500 pg/ml lizozimet és 1 mmol/1 fenil-metánszulfonilt (PMSF) tartalmazó 30 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 9,5) újraszuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót Polytron-homogenizátorral (Brinkmann Instruments) homogenizáljuk, szárazjég/aceton fürdőn gyorsan megfagyasztjuk, majd felolvasztjuk. Ezután 200 ml, 250 mmol/1 NaCl-ot és 1 mmol/1 PMSF-t tartalmazó 30 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-puffert (pH 8,0) adunk a szuszpenzióhoz, amelyet azután addig homogenizálunk, amíg egységes homogenizátumot kapunk. A szuszpenziókat 4 °C-on 30 percen keresztül inkubáljuk, majd 4 °C-on 60 percen keresztül 3800 χ g-vel centrifügáljuk. A felülúszó frakciókat óvatosan dekantáljuk, és az esetleges szemcsés anyagot szűréssel eltávolítjuk. Az üledéket 200 ml, 150 mmol/1 NaCl-ot, 8 mol/1 karbamidot és 1 mmol/1 PMSF-et tartalmazó 30 mmol/1 koncentrációjú TrisHCl-pufferrel (pH 8,0) újraextraháljuk. Mivel mind a Tris-sel, mind a karbamiddal kapott extraktumok jelentős mennyiségű preIL-Ιβ-Ι tartalmaznak, mindkettőt tisztítjuk az alábbiak szerint.
C) prelL-1$ tisztítása
Az összes kromatográfiás eljárást 4 °C-on hajtjuk végre. Minden frakcióban meghatározzuk a proteinkoncentrációt és méijük a vezetőképességet, amennyiben erre mód van. Az egyes kromatográfiás lépések után a frakciókat nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) analizáljuk (10-20% poliakrilamid-gradienssel), majd ezüsttel festjük, és Westem-blotot végzünk tisztított, érett IL-Ιβ ellen termelt monoklonális antitest (MAb) alkalmazásával.
Az extraktumot vízzel 1:4 arányban hígítjuk, a pH-t 8,1-re beállítjuk, és az anyagot 100 ml/óra átfolyási sebességgel 25x2,5 cm-es Q-Sepharose-oszlopra visszük. A Tris-es extraktum esetén az oszlopot 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 8,1) ekvilibráljuk. A karbamidos extraktum esetén az oszlopot 2 mol/1 karbamidot tartalmazó 10 mmol/1 koncentrációjú TrisHCl-pufferrel (pH 8,1) ekvilibráljuk, és a kötött proteineket három oszloptérfogatnyi 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,1) 0-»l,5 mol/1 NaCl lineáris gradienssel eluáljuk. 7,5 ml-es frakciókat szedünk és 4 °C-on tároljuk a soron következő tisztítási lépés elvégzéséig.
A Westem-blot-analízis szerint prelL-Ιβ-tartalmú Q-Sepharose-frakciókat egyesítjük és 1:10 arányban hígítjuk 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 8,1). Az oszlopot 4 oszloptérfogatnyi kiindulási pufferrel mossuk.
A Tris-HCl-os oldatot 20x5 cm-es phenyl-Sepharose CL-4B oszlopra visszük, amelyet 0,2 mol/1 ammónium-szulfátot tartalmazó 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 8,1) ekvilibráltunk. Az oszlopot 3 oszloptérfogatnyi kiindulási pufferrel mossuk, majd az anyagot 4 oszloptérfogatnyi lineárisan csökke15
HU 220 098 Β nő ammónium-szulfát-graidenssel eluáljuk, amelyet 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben (pH 8,1)
0,2 mol/l és 0 mol/l koncentrációjú oldatokkal állítunk elő. Végül az anyagot 2 oszloptérfogatnyi 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel (pH 8,1) eluáljuk. 5 A részlegesen tisztított preIL-lp-tartalmú frakciókat egyesítjük, PBS-sel szemben dializáljuk és felhasználásig -70 °C-on tároljuk.
D) preIL-Ιβproteolitikus kezelése μΐ preIL-Ιβ-ί (mintegy 50 pg/ml, PBS-ben) 10 10 μΐ tisztított IL-Ιβ pro-val (15-75 μg/ml, PBS-ben) elegyítünk és 37 °C-on 30 percen keresztül inkubáljuk.
Az inkubálást úgy fejezzük be, hogy a mintát szárazjégbe helyezzük vagy SDS-mintapuffert adunk hozzá. Ezután 1 mmol/1 koncentrációban PMSF-t adunk hozzá, 15 és a mintákat vízzel szemben dializáljuk. A dialízis befejezése után a mintákat Speed-Vac-koncentrátorban szárazra pároljuk és SDS-mintapufferben oldjuk.
E) Proteolitikus termékek Western-blot-analízise
Az SDS-PAGE-eljárást 12%-os poliakrilamidgé- 20 lekben hajtjuk végre. A géleket transzferpufferbe [0,192 mol/l glicin, 0,025 mol/l Tris-HCl (pH 8,3), 20 térfogat% metanol] helyezzük, majd a proteint nitro-cellulózra (Sartorius) elektroforetizáljuk Hoeffer-transzferkészülékben (1 óra, maximális feszültség mellett). A nitro- 25 cellulózt ezután 3% marha-szérumalbumint tartalmazó 20 mmol/1 koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,4) (PBS) tartjuk legalább 15 percen keresztül, szobahőmérsékleten. A biot szondázására érett ΙΕ-Ιβ-ra specifikus MAb-et alkalmazunk. A MAb-et 9 pg/ml koncentrációban alkalmazzuk, és az inkubálást 30 percen keresztül folytatjuk. A blotot ezután háromszor öblítjük PBS-tal, majd 2 ml metanolban oldott 6 mg tormaperoxidáz előhívó reagens (Bio-Rad) és Tris-pufferolt sóoldattal 10 ml-re hígított 60 μΐ hidrogén-peroxid elegyítésével kapott oldattal előhívjuk.
Az adatok azt mutatják, hogy a Boc-Asp-CH2F 5 pmol/l koncentrációban teljesen gátolja az érett IL-Ιβ képződését preIL-^-ból és 1 pmol/l koncentrációban részlegesen gátolja az érett IL-Ιβ képződését.
5. példa
IL-Ιβ biológiai aktivitása COS-7 sejtekbe való transzfektálás esetén
A 120-404. aminosavaknak megfelelő cDNS-t emlőssejt expressziós vektorba (pDC303) illesztjük. A kapott plazmidot COS-7 sejtekbe (majomvesesejt) kotranszfektáljuk egy második emlős expressziós vektorral, amely prekurzor IL— 1 β-t kódoló cDNS-t tartalmaz. Két nap elteltével a sejteket 35S-nel radioaktívan jelezzük, és az IL-^-specifikus proteineket a sejtek lizátumából immunprecipitáljuk. Az immunprecipitátumokat SDS-PAGE- és autoradiográfiás módszerrel analizáljuk.
Azt találtuk, hogy a transzfektált COS-7 sejtek csak akkor képesek átalakítani a prekurzor IL-Ιβ-ί érett Ιί-ΐβ-vá, ha a sejteket egy IL-Ιβ pro-t kódoló plazmiddal kotranszfektáltuk. A kontrollplazmáddal kotranszfektált sejtek vagy az álkotranszfektált sejtek nem képesek átalakítani a prekurzor IL-Ιβ-ί. Tehát IL-Ιβ pro-t - amelyből az N-terminális 119 30 aminosavmaradék hiányzik - tartalmazó sejtek képesek a prekurzor IL-1 β-t átalakítani e protein érett formájává.
Szekvenciajegyzék 1. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 1659 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (xi) Szekvencia leírása:
AAAAGGAGAG AAAAGCCTAA AAGAGAGTGG GTAGATGGCC GACAAGGTCC TGAAGGAGAA 60
GAGAAAGCTG TTTATCCGTT CCATGGGTGA AGGTACAATA AATGGCTTAA GGTAGAAGGT 120
GAAGGAAATA CTGGATGAAT TATTACAGAC AAGGGTGCTG AACAAGGAAG AGATGGAGAA 180
AGTAAAACGT GAAAATGCTA CAGTTTATAG AAAAGAAGAA CGCTTATGGA TAAGACCCGA 240
GCTTTGATTG ACTCCGTTAT TCCGAAAGGG GCACAGGCAT GCCAAATTTG CATCACATAC 300
CGGATAAGTG AAAGTGATAA TTTGTGAAGA AGACAGTTAC CTGGCAGGGA CGCTGGGACT 360
CTCAGCAGAT CAAACATCTG GAAATTACCT TAATTGAGGA AAGAAAGAAA ATTATGCAAG 420
ACTCTCAAGG AGTACTTTCT TCCTTTCCAG CTCCTCAGGC AGTGCAGGAC AACCCAGCTA 480
TGCCCACAGG GAACGGAAGA GTGAATCCTC AGGCTCAGAA GGGAATGTCA AGCTTTGCTC 540
HU 220 098 Β
CCTAGAAGAA GCTCAAAGGA TATGGAAACA AAAGTCGGCA GTTAAGTAGA ACAGGAGAGA 600
TTTATCCAAT AATGGACAAG TCAAGCCGCA CACGTCTTGC TCTCATTATC TGCAATGAAG 660
AATTTGACAG TAGAGTGAAG AATGTTTGAG TAATTCCTAG AAGAACTGGA GCTGAGGTTG 720
ACATCACAGG CATGACAATG CTGCTACAAA ATCTGGGGTA CAGCGTAAAA TAAATTTGGA 780
AAAAGGGATG TGAAAAAAAA TCTCACTGCT TCGGACATGA CTACAGAGCT GGAGGCATTT 840
GCACACCGCC CAGAGCACAA GTATATGAGG GCGGACCTCT GACAGCACGT TCCTGGTGTT 900
CATGTCTCAT GGTATTCGGG AAGGCATTTG TGGGAAGAAA CACTCTGAGG AAGAAAATAT 960
ACACAAGTCC CAGATATACT ACAACTCAAT GCAATCTTTA ACATGTTGAA TACCAAGAAC 1020
TGCCCAAGTT TGAAGGACAG AACAGGAGAA TAAGAAACCG AAGGTGATCA TCATCCAGGC 1080
CTGCCGTGGT GACAGCCCTG GTGTGGTGTG GTTTAAAGAT TCAGTAGGAA GATTGGGAAA 1140
AAAGGTTTCT GGAAACCTAT CTTTACCAAC TACAGAAGAG TTTGAGGATG ATGCTATTAA 1200
GAAAGCCCAC ATAGAGAAGA AACTAAATAG TTGAGATTTT ATCGCTTTCT GCTCTTCCAC 1260
ACCAGATAAT GTTTCTTGGA GACATCCCAC AATGGGCTCT GTTTTTATTG AGGTGGTAAC 1320
CAAGGAGAAG GGAAGACTCA TTGAACATAT GCAAGAATAT GCCTGTTCCT GTGATGTGGA 1380
GGAAATTTTC CGCAAGGTTC GATTTGGAGA GAAGTTTGAG ATTAGCTTCA TTTGAGCAGC 1440
CAGATGGTAG AGCGCAGATG CCCACCACTG AAAGAGTGAC TTTGACAAGA TGTTTCTACC 1500
TCGTTCCCAG GACATTAAAA TAAGGAAACT GTATGAATGT CTGCGGGCAG GAAGTGAAGA 1560
GATCGTTCTG TAAAAGGTTT TTGGAATTAT GTCTGCTGAA TAATAAACTT TTTTTGAAAT 1620
AATAAATCTG GTAGAAAAAT GAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1659
2. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 404 aminosav
(B) Szekvencia típusa (D) Topológia: (ii) Molekula típusa: (xi) Szekvencia leírása: aminosav lineáris peptid
Met Alá Asp Lys 1 Va 1 5 Leu Lys Glu Ly s Arg 10 Ly s Leu Phe Ile Arg 15 Ser
Me t Gly Glu Gly 20 Thr Ile Asn Gly Leu 25 Leu As p Glu Leu Leu 30 Gin Thr
Arg Val Leu Asn 35 Ly s Glu Glu Me t 40 Glu Ly s Val Lys Arg 45 Glu Asn Al a
Thr Val Me t Asp 50 Ly s Thr Arg 55 Al a Leu Ile As p Ser 60 Val Ile Pro Ly s
Gly Alá Gin Alá 65 Cys Gin 70 Ile Cy s Ile Thr Tyr 75 Ile Cy s Glu Glu Asp 80
HU 220 098 Β
Ser Tyr Leu Al a Gly 85 Thr Leu Gly Leu Ser 90 Al a As p Gin Thr Ser 95 Gly
Asn Tyr Leu Asn 100 Me t Gin Asp Ser Gin 105 Gly Val Leu Ser Ser 110 Phe Pro
Al a Pro Gin 115 Al a Val Gin Asp Asn 120 Pro Al a Me t Pro Thr 125 Ser Ser Gly
Ser Glu 130 Gly Asn Va 1 Lys Leu 135 Cy s Ser Leu Glu Glu 140 Al a Gin Arg Ile
Trp 145 Lys Gin Ly s Ser Al a 150 Glu Ile Tyr Pro Ile 155 Me t Asp Ly s Ser Ser 160
Arg Thr Arg Leu Al a 165 Leu Ile Ile Cys Asn 170 Gl u Glu Phe As p Ser 175 Ile
Pro Arg Arg Thr 180 Gly Al a Glu Va 1 As p 185 Ile Thr Gly Me t Thr 190 Me t Leu
Leu Gin Asn 195 Leu Gly Tyr Ser Va 1 200 Asp Val Ly s Ly s As n 205 Leu Thr Al a
Ser As p 210 Me t Thr Thr Glu Leu 215 Gl u Al a Phe Al a Hi s 220 Arg Pro Glu Hi s
Lys 225 Thr Ser As p Ser Thr 230 Phe Leu Va 1 Phe Me t 235 Ser Hi s Gly Ile Arg 240
Glu Gly Ile Cy s Gl y 245 Ly s Ly s Hi s Ser Glu 250 Gin Va 1 Pro As p Ile 255 Leu
Gin Leu Asn Al a 260 Ile Phe Asn Me t Leu 265 Asn Thr Ly s Asn Cy s 270 Pro Ser
Leu Ly s Asp 275 Ly s Pro Ly s Val Ile 280 Ile Ile Gin Al a Cy s 285 Arg Gly As p
Ser Pro 290 Gly Val Val Trp Phe 295 Ly s Asp Ser Va 1 Gly 300 Val Ser Gly Asn
Leu 305 Ser Leu Pro Thr Thr 310 Glu Glu Phe Glu As p 315 Asp Al a Ile Ly s Lys 320
Al a Hi s Ile Glu Lys 325 Asp Phe Ile Al a Phe 330 Cy s Ser Ser Thr Pro 335 As p
Asn Va 1 Ser Trp 340 Arg Hi s Pro Thr Me t 345 Gly Ser Val Phe Ile 350 Gly Arg
Leu Ile Glu 355 Hi s Me t Gin Glu Tyr 360 Al a Cys Ser Cys As p 365 Va 1 Glu Glu
Ile Phe Arg Ly s Va 1 Arg Phe Ser Phe Glu Gin Pro Asp Gly Arg Al a
370 375 380
HU 220 098 Β
Gin Met Pro Thr Thr Glu Arg Val 385 390
Phe Pro Gly His
3. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 269 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (xi) Szekvencia leírása:
Thr Leu Thr Arg Cys Phe Tyr Leu 395 400
Me t 1 Al a Glu Val Pro 5 Glu Leu Al a
Gly Asn Glu Asp 20 Asp Leu Phe Phe
Lys Cys Ser 35 Phe Gin Asp Leu As p 40
Gin Leu 50 Arg Ile Ser Asp Hi s 55 Hi s
Al a 65 Ser Val Val Va 1 Al a 70 Me t As p
Cys Pro Gin Thr Phe 85 Gin Glu As n
Ile Phe Glu Glu 100 Glu Pro Ile Phe
Tyr Val Hi s 115 As p Al a Pro Va 1 Arg 120
Ser Gin 130 Gin Ly s Ser Leu Val 135 Me t
Leu 145 Hi s Leu Gin Gly Gin 150 As p Me t
Ser Phe Va 1 Gin Gly 165 Glu Glu Ser
Gly Le u Lys Glu 180 Ly s Asn Leu Tyr
Lys Pro Thr 195 Leu Gin Leu Glu Ser 200
Ly s Ly s 210 Me t Glu Ly s Arg Phe 215 Val
Lys 225 Leu Glu Phe Glu Ser 230 Alá Gin
Se r Gin Al a Glu Asn Me t Pro Val
Ser Glu 10 Me t Me t Al a Tyr Tyr 15 Ser
Glu 25 Al a As p Gly Pro Ly s 30 Gin Me t
Leu Cys Pro Leu As p 45 Gly Gly Ile
Tyr Ser Lys Gly 60 Phe Arg Gin Alá
Lys Leu Arg 75 Ly s Me t Leu Va 1 Pro 80
Asp Leu 90 Ser Thr Phe Phe Pro 95 Phe
Phe 105 Asp Thr Trp Asp Asn 110 Glu Al a
Ser Leu Asn Cys Thr 125 Leu Arg Asp
Ser Gly Pro Tyr 140 Glu Leu Lys Alá
Glu Gin Gin 155 Val Val Phe Ser Me t 160
Asn Asp 170 Ly s Ile Pro Val Al a 175 Leu
Leu 185 Ser Cy s Val Leu Ly s 190 As p Asp
Val Asp Pro Lys Asn 205 Tyr Pro Lys
Phe Asn Ly s Ile 220 Glu Ile Asn Asn
Phe Pro As n 235 Trp Tyr Ile Ser Thr 240
Phe Leu 250 Gly Gly Thr Ly s Gly 255 Gly
245
HU 220 098 Β
Gin Asp lle Thr Asp Phe Thr Met Gin Phe Val Ser Ser 260 265
4. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 18 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (xi) Szekvencia leírása:
TACCGGCTGT TCCAGGAC
5. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 18 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (xi) Szekvencia leírása:
TACCTATTCT GGGCTCGA
6. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 17 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (xi) Szekvencia leírása:
TTGGTCGATA CGGGTGT
7. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 18 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (xi) Szekvencia leírása:
CACCACACCA AATTTCTA
8. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 18 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DN S (xi) Szekvencia leírása:
ATGGAGAGGG GTCCTGTA
HU 220 098 Β
9. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 26 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DN S (xi) Szekvencia leírása:
GTCGAATTCA AYCCNGCNAT GCCNAC
10. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 26 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (xi) Szekvencia leírása:
GTCTCTAGAA GYTTNACYTT NCCYTC
11. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 43 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (xi) Szekvencia leírása:
ATATCGGTAC CGCCTCCAGC ATGCCTCCGG CAATGCCCAC ATC
12. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 31 bázispár (B) Szekvencia típusa: nukleinsav (C) Szál típusa: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: DNS (xi) Szekvencia leírása:
CTGCTAGATC TGCCCGCAGA CATTCATACA G
13. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 10 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (xi) Szekvencia leírása:
Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser 1 5 10
14. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 10 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris
HU 220 098 Β (ii) Molekula típusa: peptid (xi) Szekvencia leírása:
Ala-Tyr-Val-His-Asn-Ala-Pro-Val-Arg-Ser 1 5 10
15. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 10 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (xi) Szekvencia leírása:
Ala-Tyr-Val-His-Glu-Ala-Pro-Val-Arg-Ser 1 5 10
16. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 10 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (ix) Jellegzetesség:
(B) Helyzet: 4 (C) Azonosítási módszer: Xaa=D-Asp (xi) Szekvencia leírása:
Ala-Tyr-Val-His-Xaa-Ala-Pro-Val-Arg-Ser 1 5 10
17. számú szekvencia (i) Szekvencia j ellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 10 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (xi) Szekvencia leírása:
Ala-Tyr-Val-His-Asp-Gly-Pro-Val-Arg-Ser 1 5 10
18. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 10 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (xi) Szekvencia leírása:
Ala-Tyr-Val-Hi s-Asp-Val-Pro-Val-Arg-Ser 1 5 10
19. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) Szekvencia hossza: 10 aminosav (B) Szekvencia típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid
HU 220 098 Β (xi) Szekvencia leírása:
Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser 1 5 10
20. számú szekvencia
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Szekvencia hossza: (B) Szekvencia típusa: (D) Topológia: (ii) Molekula típusa: (xi) Szekvencia leírása: 10 aminosav aminosav lineáris peptid
Ala-Tyr-Val-Hi s-Asp-Ala-Ala-Val-Arg-Ser 1 5 10
21. számú szekvencia
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Szekvencia hossza: (B) Szekvencia típusa: (D) Topológia: (ii) Molekula típusa: (xi) Szekvencia leírása: 12 aminosav aminosav lineáris peptid
Glu-Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu 1 5 10
22. számú szekvencia
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Szekvencia hossza: (B) Szekvencia típusa: (D) Topológia: (ii) Molekula típusa: (xi) Szekvencia leírása: 8 aminosav aminosav lineáris peptid
Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg 1 5
23. számú szekvencia
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Szekvencia hossza: (B) Szekvencia típusa: (D) Topológia: (ii) Molekula típusa: (xi) Szekvencia leírása: 6 aminosav aminosav lineáris peptid
Val-Hi s-Asp-Ala-Pro-Val 1 5
24. számú szekvencia
(i) Szekvencia jellemzői: (A) Szekvencia hossza: (B) Szekvencia típusa: (D) Topológia: (ii) Molekula típusa: (xi) Szekvencia leírása: 4 aminosav aminosav lineáris peptid
Hi s -Asp-Ala - Pro
HU 220 098 Β

Claims (17)

1. Izolált interleukin-ΐβ proteáz polipeptid, amely interleukin-ΐβ proteázaktivitással rendelkezik, és amelyet olyan DNS-szekvencia kódol, amely tartalmaz (a) az 1. számú szekvencia 1. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig; 374. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig; vagy 374. nukleotidjától mintegy 851-962. nukleotidjáig tartó inszertált DNS-t;
(b) DNS-szekvenciákat, amelyek szigorú körülmények között hibridizálnak egy vagy több (a) pontban megadott inszertált DNS-sel és olyan polipeptidet kódolnak, amely a humán prekurzor interleukin-ΐβ polipeptidet a 116-os helyzetű Asp- és a 117-es helyzetű Ala-maradék közötti hasítási helyen proteolitikusan hasító biológiai aktivitással rendelkezik; vagy (c) DNS-szekvenciákat, amelyek a genetikus kód degenerációja következtében a fenti inszertált DNS-ek és szekvenciák bármelyike által kódolt emlősinterleukin-ΐβ proteáz polipeptidet kódolnak.
2. Izolált DNS-szekvencia, amely egy emlős-interleukin-ΐβ proteázenzimet kódol, amely DNS-szekvencia tartalmaz:
(a) az 1. számú szekvencia 1. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig; 374. nukleotidjától 1232. nukleotidjáig; vagy 374. nukleotidjától mintegy 851-962. nukleotidjáig tartó inszertált DNS-t;
(b) DNS-szekvenciákat, amelyek szigorú körülmények között hibridizálnak egy vagy több (a) pontban megadott inszertált DNS-sel és olyan polipeptidet kódolnak, amely a humán prekurzor interleukin-ΐβ polipeptidet a 116-os helyzetű Asp- és a 117-es helyzetű Ala-maradék közötti hasítási helyen proteolitikusan hasító biológiai aktivitással rendelkezik; vagy (c) DNS-szekvenciákat, amelyek a genetikus kód degenerációja következtében a fenti inszertált DNS-ek és szekvenciák bármelyike által kódolt emlős-interleukin-ΐβ proteáz polipeptidet kódolnak.
3. Rekombináns expressziós vektor, amely egy 2. igénypont szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz.
4. Eljárás egy emlős-interleukin-ΐβ proteázenzim vagy analógja vagy származéka előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 3. igénypont szerinti vektort tartalmazó gazdasejtet az expressziót elősegítő körülmények között tenyésztünk.
5. Gyógyászati készítmény sebgyógyulás elősegítésére egy sérült helyen, artritisz kezelésére, autoimmunbetegségek kezelésére vagy sugárkezelés káros hatásainak kezelésére, amely legalább egy 1. igénypont szerinti izolált interleukin-ΐβ proteáz polipeptidet és megfelelő gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
6. Antiszensz oligonukleotid, amely a 2. igénypont szerinti interleukin-ΐβ proteáz cDNS-sel komplementer, legalább 15 nukleotidból álló szekvenciát tartalmaz, amely antiszensz oligonukleotid gátolja az interleukin-ΐβ proteáz mRNS-transzlációját.
7. Vegyület, amelynek
Z-Q2-Asp-Qj általános képletében
Z jelentése N-terminális védőcsoport,
Q2 0-4 aminosavmaradékot jelent, ezáltal a Q2-Asp aminosavszekvencia a 3. számú szekvencia 112-116. számú maradékát képviselő Ala-TyrVal-His-Asp szekvencia legalább egy részének felel meg; és
Q] jelentése elektronegatív kilépőcsoport.
8. Gyógyászati készítmény, amely egy 7. igénypont szerinti vegyületet és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
9. Gyógyászati készítmény, amely IL-Ιβ proteázaktivitás gátlására alkalmas ilyen kezelést igénylő emlősben, amely egy 7. igénypont szerinti vegyület gátlóhatást kifejtő mennyiségét és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
10. Gyógyászati készítmény, amely gyulladás kezelésére vagy autoimmunbetegség kezelésére alkalmas ilyen kezelést igénylő emlősben, amely egy 7. igénypont szerinti vegyület hatásos mennyiségét és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
11. Vegyület, amelyet az alábbi csoportból választunk: Boc-Asp-CH2F, Boc-His-Asp-CH2F, Boc-Phe-Asp-CH2F, Boc-Pro-Asp-CH2F, Boc-Tyr-Asp-CH2F, Ac-His-Asp-CH2F, Ac-Phe-Asp-CH2F, Ac-Pro-Asp-CH2F, Ac-Tyr-Asp-CH2F, Cbz-His-Asp-CH2F, Cbz-Phe-Asp-CH2F, Cbz-Pro-Asp-CH2F és CbzTyr-Asp-CH2F, ahol Boc terc-butoxi-karbonil-csoport, Ac acetilcsoportot és Cbz benzil-oxi-karbonil-csoportot jelent.
12. Eljárás az 1. igénypont szerinti peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) egy, a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-ffagmenst expresszáltatunk, és az expresszálódott polipeptidet kinyeijük, vagy
b) a polipeptid aminosavszekvenciájának megfelelő aminosavakat a megfelelő sorrendben összekapcsoljuk.
13. Eljárás a 2. igénypont szerinti DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciát
a) enzimatikus vagy
b) szintetikus úton előállítjuk.
14. Eljárás a 3. igénypont szerinti rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti DNS-szekvenciát egy vektorba építjük.
15. Eljárás a 6. igénypont szerinti antiszensz oligonukleotid előállítására, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotidot
a) enzimatikus vagy
b) szintetikus úton előállítjuk.
16. Eljárás a 7. vagy 11. igénypont szerinti vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a vegyületeket szintetikus eljárásokkal állítjuk elő.
17. Eljárás a 8-10. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) előállítjuk a 7. igénypont szerinti vegyületet, és
b) a vegyületet gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy vivőanyaggal összekeverjük.
HU9303244A 1991-08-30 1991-09-12 Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok HU220098B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75064491A 1991-08-30 1991-08-30
PCT/US1991/006595 WO1993005071A1 (en) 1991-08-30 1991-09-12 INTERLEUKIN 1β PROTEASE AND INTERLEUKIN 1β PROTEASE INHIBITORS

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9303244D0 HU9303244D0 (en) 1994-03-28
HUT66057A HUT66057A (en) 1994-09-28
HU220098B true HU220098B (hu) 2001-10-28

Family

ID=25018683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303244A HU220098B (hu) 1991-08-30 1991-09-12 Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok

Country Status (22)

Country Link
US (2) US5756465A (hu)
EP (2) EP1378573A1 (hu)
JP (3) JP2759895B2 (hu)
KR (1) KR100226296B1 (hu)
AT (1) ATE257517T1 (hu)
AU (1) AU657701B2 (hu)
CA (1) CA2111100C (hu)
DE (1) DE69133354T2 (hu)
DK (1) DK0600880T3 (hu)
ES (1) ES2213138T3 (hu)
FI (1) FI935020A (hu)
HK (1) HK1014013A1 (hu)
HU (1) HU220098B (hu)
IE (1) IE913268A1 (hu)
IL (2) IL99598A (hu)
MX (1) MX9101346A (hu)
MY (1) MY131144A (hu)
NO (1) NO317129B1 (hu)
NZ (3) NZ335312A (hu)
PT (1) PT99118B (hu)
RU (2) RU2206611C2 (hu)
WO (1) WO1993005071A1 (hu)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6008217A (en) * 1995-12-20 1999-12-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US6204261B1 (en) 1995-12-20 2001-03-20 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β Converting enzyme inhibitors
US5874424A (en) * 1995-12-20 1999-02-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US6995141B1 (en) 1990-04-04 2006-02-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Interleukin 1β protease and interleukin 1β protease inhibitors
EP1378573A1 (en) * 1991-08-30 2004-01-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Interleukin 1 beta protease and interleukin 1 beta protease inhibitors
IL105741A0 (en) * 1992-05-22 1993-09-22 Genta Inc Pharmaceutical compositions for treating cellular hyperproliferation using interleukin-1 inhibitory compounds
US5462939A (en) * 1993-05-07 1995-10-31 Sterling Winthrop Inc. Peptidic ketones as interleukin-1β-converting enzyme inhibitors
JPH0789951A (ja) * 1993-06-03 1995-04-04 Sterling Winthrop Inc インターロイキン−１β転換酵素阻害剤
US5843905A (en) * 1993-06-04 1998-12-01 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Peptidic phosphinyloxymethyl ketones as interleukin-1β-converting enzyme inhibitors
DK0644197T3 (da) * 1993-06-04 1999-06-07 Vertex Pharma Peptidphosphinyloxymethylketoner som inhibitorer af interleukin-1beta-konverterende enzymer
JPH08511690A (ja) * 1993-06-24 1996-12-10 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション プログラムされた細胞死遺伝子及びタンパク質
US6087160A (en) * 1993-06-24 2000-07-11 The General Hospital Corporation Programmed cell death genes and proteins
US5716929A (en) * 1994-06-17 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US6420522B1 (en) 1995-06-05 2002-07-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5756466A (en) * 1994-06-17 1998-05-26 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5847135A (en) * 1994-06-17 1998-12-08 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme
US5955072A (en) * 1994-07-13 1999-09-21 Sankyo Company, Limited Expression systems utilizing autolyzing fusion proteins and a reducing polypeptide
WO1996012025A1 (en) * 1994-10-14 1996-04-25 Basf Aktiengesellschaft TRANSGENIC NONHUMAN ANIMAL HAVING FUNCTIONALLY DISRUPTED INTERLEUKIN-1β CONVERTING ENZYME GENE
CA2215211A1 (en) * 1995-03-31 1996-10-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Cysteine protease inhibitor
US5869315A (en) 1995-12-18 1999-02-09 Basf Aktiengesellschaft Modified interleukin-1β converting enzyme with increased stability
US5843904A (en) * 1995-12-20 1998-12-01 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of interleukin-1βconverting enzyme
US6288037B1 (en) 1996-01-29 2001-09-11 Basf Aktiengesellschaft Substrates and inhibitors for cysteine protease ICH-1
US6416753B1 (en) 1996-03-15 2002-07-09 The General Hospital Corporation Method for modulating apoptosis
US6610683B2 (en) * 1996-09-12 2003-08-26 Idun Pharmaceuticals, Inc. Treatment of infectious disease using interleukin-1β-converting enzyme (ICE)/CED-3 family inhibitors
US6200969B1 (en) 1996-09-12 2001-03-13 Idun Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of apoptosis using interleukin-1β-converting enzyme (ICE)/CED-3 family inhibitors
US6531467B2 (en) 1996-09-12 2003-03-11 Idun Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of inflammation using interleukin-1β-converting enzyme (ICE)/CED-3 family inhibitors
US6184244B1 (en) 1996-12-16 2001-02-06 Idun Pharmaceuticals, Inc. C-terminal modified (N-substituted)-2-indolyl dipeptides as inhibitors of the ICE/ced-3 family of cysteine proteases
US6054487A (en) * 1997-03-18 2000-04-25 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
KR100580333B1 (ko) * 1997-10-10 2006-05-16 시토비아 인크. 디펩티드 고사 억제제 및 그의 용도
US6184210B1 (en) * 1997-10-10 2001-02-06 Cytovia, Inc. Dipeptide apoptosis inhibitors and the use thereof
ATE296812T1 (de) 1998-03-09 2005-06-15 Vertex Pharma 1,2-diazepanderivate als inhibitoren des interleukin-1beta umwandelnden enzyms
AU755273B2 (en) * 1998-03-16 2002-12-05 Cytovia, Inc. Dipeptide caspase inhibitors and the use thereof
EP1064298B1 (en) 1998-03-19 2008-10-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of caspases
WO2000055114A1 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Cytovia, Inc. Substituted 2-aminobenzamide caspase inhibitors and the use thereof
DE19915465A1 (de) * 1999-04-06 2000-10-19 Apotech Res & Dev Ltd Verwendung eines Caspase-Inhibitors zur Proliferationshemmung von Zellen und Verwendung eines oder mehrerer Caspase-Inhibitors/en zur Behandlung von Erkrankungen beruhend auf Lymphozyten-Hyperproliferation oder zur Suppression einer Immunantwort durch Lymphozyten
CN1176941C (zh) 1999-04-09 2004-11-24 西托维亚公司 Caspase抑制剂及其应用
MXPA01013006A (es) * 1999-06-14 2002-07-30 Wisconsin Alumni Res Found Oligomeros y polimeros de acidos imino-carboxilicos ciclicos.
MXPA02002038A (es) 1999-08-27 2002-10-31 Cytovia Inc Acidos alfa-hidroxi substituidores inhibidores de la caspasa y uso de los mismos.
US6566338B1 (en) 1999-10-12 2003-05-20 Cytovia, Inc. Caspase inhibitors for the treatment and prevention of chemotherapy and radiation therapy induced cell death
SI1268425T1 (sl) 2000-03-29 2008-04-30 Vertex Pharma Zaviralci karbamat kaspaze in uporaba le-teh
EP1268425B1 (en) 2000-03-29 2008-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Carbamate caspase inhibitors and uses thereof
US20010053764A1 (en) * 2000-05-12 2001-12-20 Sims John E. Interleukin-1 inhibitors in the treatment of diseases
PE20011350A1 (es) 2000-05-19 2002-01-15 Vertex Pharma PROFARMACO DE UN INHIBIDOR DE ENZIMA CONVERTIDORA DE INTERLEUCINA-1ß (ICE)
EP1469875A1 (en) * 2002-01-29 2004-10-27 Wyeth Compositions and methods for modulating connexin hemichannels
AU2003224482A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Korea Research Institute Of Chemical Technology Quinoline derivatives as caspase-3 inhibitor, preparation for producing the same and pharmaceutical composition comprising the same
US20050192348A1 (en) * 2003-09-25 2005-09-01 David Bar-Or Methods and products which utilize N-acyl-L-aspartic acid
CA2566362C (en) 2004-05-15 2013-09-10 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Treating seizures using ice inhibitors
GB0411056D0 (en) 2004-05-18 2004-06-23 Novartis Ag Organic compounds
CN1980658A (zh) 2004-05-27 2007-06-13 沃泰克斯药物股份有限公司 治疗自身炎性疾病的ice抑制剂
US7618801B2 (en) * 2007-10-30 2009-11-17 Danison US Inc. Streptomyces protease
US20140309172A1 (en) 2010-11-05 2014-10-16 Dagmar Ringe Ice inhibiting compounds and uses thereof
US9956260B1 (en) 2011-07-22 2018-05-01 The J. David Gladstone Institutes Treatment of HIV-1 infection and AIDS

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984000365A1 (en) * 1982-07-19 1984-02-02 Nat Res Dev Synthetic peptides and their preparation
US4636492A (en) * 1984-08-29 1987-01-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Inhibition of viral protease activity by peptide halomethyl ketones
US5104853A (en) * 1984-12-11 1992-04-14 California Biotechnology Inc. Alveolar surfactant proteins having cys to ser mutations
JPS63145300A (ja) * 1984-12-17 1988-06-17 イ−・アイ・デユポン・デ・ニモアス・アンド・カンパニ− ウイルスにより特定されているプロテア−ゼの特異的阻害剤を製造する方法
US4644055A (en) * 1984-12-17 1987-02-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for preparing specific inhibitors of virus-specified proteases
US5225354A (en) * 1986-08-22 1993-07-06 Molecular Diagnostics, Inc. Monoclonal antibodies specific for human glycoalbumin
WO1991000912A1 (en) * 1989-07-07 1991-01-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of hybrid protease inhibitors
AU7775991A (en) * 1990-04-04 1991-10-30 Immunex Corporation Interleukin 1beta protease
US5298421A (en) * 1990-04-26 1994-03-29 Calgene, Inc. Plant medium-chain-preferring acyl-ACP thioesterases and related methods
DE69229252T2 (de) * 1991-08-16 1999-12-16 Merck & Co Inc DNS, welche das Interleukin-1B-Vorläufer-Converting-Enzym kodiert
EP1378573A1 (en) * 1991-08-30 2004-01-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Interleukin 1 beta protease and interleukin 1 beta protease inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
PT99118A (pt) 1993-02-26
IL99598A (en) 2005-06-19
US6136787A (en) 2000-10-24
EP0600880A1 (en) 1994-06-15
DK0600880T3 (da) 2004-04-13
FI935020A0 (fi) 1993-11-12
WO1993005071A1 (en) 1993-03-18
CA2111100C (en) 2004-11-02
MX9101346A (es) 1993-02-01
JPH08505280A (ja) 1996-06-11
NZ239895A (en) 1996-01-26
HU9303244D0 (en) 1994-03-28
AU8537391A (en) 1993-04-05
CA2111100A1 (en) 1993-03-18
JP3445572B2 (ja) 2003-09-08
KR100226296B1 (ko) 1999-10-15
JPH1028588A (ja) 1998-02-03
EP0600880A4 (en) 1994-12-21
IE913268A1 (en) 1993-03-10
HK1014013A1 (en) 1999-09-17
IL99598A0 (en) 1992-08-18
DE69133354T2 (de) 2004-11-11
JP2001192397A (ja) 2001-07-17
EP0600880B1 (en) 2004-01-07
FI935020A (fi) 1993-12-03
IL166791A0 (en) 2006-01-15
NO934335L (no) 1993-11-30
JP2759895B2 (ja) 1998-05-28
RU94028712A (ru) 1997-03-10
MY131144A (en) 2007-07-31
PT99118B (pt) 1999-02-26
NZ248377A (en) 2000-01-28
AU657701B2 (en) 1995-03-23
ATE257517T1 (de) 2004-01-15
NZ335312A (en) 2005-08-26
RU2002128757A (ru) 2004-07-27
NO934335D0 (no) 1993-11-30
NO317129B1 (no) 2004-08-23
US5756465A (en) 1998-05-26
ES2213138T3 (es) 2004-08-16
RU2206611C2 (ru) 2003-06-20
DE69133354D1 (de) 2004-02-12
HUT66057A (en) 1994-09-28
EP1378573A1 (en) 2004-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220098B (hu) Interleukin-1 béta proteáz enzim, és interleukin-1 béta proteáz inhibitorok
US5416013A (en) Interleukin 1β protease and interleukin 1β protease inhibitors
WO1991015577A1 (en) INTERLEUKIN 1&#39;beta&#39; PROTEASE
DK171531B1 (da) Isoleret biologisk aktivt humant lymphotoxinderiv at og antistof som neutraliserer den cytolytiske aktivitet af dette, nucleinsyre som koder for lymphotoxinderivatet, replikerbar vektor omfattende nucleinsyren, heterolog celle transformeret med nucleinsyren og fremgangsmåde som omfatter fremstilling af lymphotoxinderivatet.
US6399053B1 (en) Methods of enhancing bioactivity of chemokines
HU202921B (en) Process for producing coding dns for human tumor necrosis factor the corresponding polypeptide with utilizing them and pharmaceutical compositions containing this polypeptide as active component
HU215241B (hu) Eljárás telepstimuláló faktor-1 új formáinak előállítására, valamint az eljárásban alkalmazható expressziós kazetta, vektor és rekombináns gazdasejtek előállítására
DK172763B1 (da) Isoleret interleukin-1 (IL-1) inhibitor eller forstadiepolypeptid dertil, isoleret DNA-molekyle, som koder derfor, vektor o
JPH07508650A (ja) タンパク質ホルモン形成の阻害のための組成物およびその使用
JPH10504441A (ja) Ｔｎｆ形成阻害のための組成物およびその使用
US20060188474A1 (en) Interleukin 1beta protease and interleukin 1beta protease inhibitors
Rock et al. Overexpression and structure-function analysis of a bioengineered IL-2/IL-6 chimeric lymphokine
EP0499162A2 (en) GM-CSF inhibiting oligopeptides
DK172382B1 (da) Rekombinante lymphotoxinderivater
AU687751C (en) Compositions for the inhibition of protein hormone formation and uses therof

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: SANOFI, FR

DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: VERTEX PHARMACEUTICALS INCORPORATED, US

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees