PT92335A - Processo para a preparacao de proteinas hibridas da interleucemia -2 recombinante e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents
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Description
F. hoffmann-la roche ag "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS HÍBRIDAS DA IN-TERLEUCINA-2 RECOMBXNANTE E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTEM” A presente invenção refere-se a proteínas híbridas compostas por um polipeptido de interleucina-2 humana (IL-2) e por um polipeptido actuando como uma imunotoxina. Essas proteínas de fusão são úteis como agentes terapêuticos nara o tratamento de doenças tais como a tiroidite autoimune, dia betes do tipo 1, artrite reumatóide e doença de Crohn, admitindo-se que as células que suportam os receptores de IL-2 (células R positivas de IL-2) estejam envolvidas na regulação aberrante da resposta imunológica. Estas proteínas de fu são imunotóxicas são também úteis para a supressão da respo£ ta imunológica nos casos de rejeição de enxertos alopáticos e de transplantação de orgãos.
Lorberboum-Galski e outros, Proc. Natl. Acad. Sei.
Usa, 85_ (1988), 1922-1926 descreveram a clonagem e a expres- 2 são da proteína quimérica Asp IL2-exotoxina de Pseudomonas (Asp2IL2-PE40) em E_. coli. Nesta proteína de fusão, a IL-2 substitui o domínio de reconhecimento celular na exotoxina de Pseudomonas (PE) ou, por outras palavras, a oroteina de fusão possui uma sequência de interleucina-2 humana recom-binante na extremidade amino e a extremidade carboxilo dessa proteína de fusão é constituída pela sequência de aminoáci- -2- dos de um domínio I que falta na molécula de PE. Uma molécula de PE da qual foi suprimido o domínio I (= PE 40) pos sui completa actividade de ADP-ribosilaçao mas tem uma actividade extremamente fraca de aniquilação celular devido à perda do domínio de reconhecimento celular. A molécula de IL-2 na extremidade amino da proteína de fusão está com pletamente exposta e retem a sua actividade biológica e pro porciona um domínio de reconhecimento celular diferente do existente na PS. Como consequência do procedimento para a preparação da proteína quimérica, insere-se um residuo de ácido aspártico entre a alanina e a prolina nas posiçbes 1 e 2 da molécula da IL-2, tornando deste modo a parte da molécula da IL-2 "não natural" na extremidade amino. Utiliza--se uma isoleucina codificada sinteticamente para ligar a treonina da posição 131 da IL-2 à extremidade aminò da molé cuia de toxina, isto é, PE40 (prolina na posição 251 da PE). Na publicação do pedido de patente europeia N2 261 671 de 30 de Março de 1988 encontra-se uma descrição adicional da produção da proteína de fusão Asp2-IL2-PE. a proteína de fu são Asp -IL2-PE40 apresenta actividade citotóxica para as células que suportam os receptores de IL-2. 0 vector pHL310 utilizado por Lorberboum-Galski e outros (ver supra) para a expressão da proteína de fusão 2
Asp IL2-PE origina um péptido que possui no terminal amino 12 3 4 a sequência Met-Ala Asp Pro Thr ..., a qual difere da sequên cia encontrada na IL-2 humana natural ZTRobb et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81 1984, 6486-6490_7. Além disso, o
vector pHL310 não permite a expressão de níveis elevados de proteína. Para corrigir estes problemas utilizou-se a estratégia representada na Figura 1 para criar um vector de expressão que permita programar a síntese de níveis muito elevados de proteínas de fusão e que permita codificar uma proteína de fusão com uma extremidade amino oue seja mais semelhante à da IL-2 humana, isto é, Met-Ala·*·-2 3
Pro Thr ....
Deste modo, a presente invenção proporciona uma proteína hibrida imunotóxica de IL2-PE humana recombinante, caracterizada por possuir uma sequência da IL-2 natural na sua extremidade amino quando comparada com a proteí 2 na de fusão Asp IL2-PE40 descrita na especialidade. A proteína hibrida imunotóxica tem uma sequência de interleuci-na-2 humana recombinante na extremidade amino e a extremidade carboxilo da referida proteína hibrida comoreende a sequência de um domínio de exotoxina de Pseudomonas, preferencialmente exotoxina 40 de Pseudomonas, caracterizado pelo facto de a sequência do terminal amino da referida inter leucina-2 ser idêntica à sequência do terminal amino da in-terleucina-2 humana natural. A proteína hibrida imunotóxica pode conter opcionalmente um resíduo de metionina adicional na extremidade N. Mais preferencialmente, a proteína híbrida imunotóxica está numa forma essencialmente homogénea.
Além disso, a presente invenção proporciona um ADN que codi_ fica para essa proteína hibrida imunotóxica e um vector recombinante que contem esse ADN. Com maior oreferência, o vec tor recombinante é um plasmídeo. Um organismo hospedeiro uni^ celular transformado com esse vector recombinante ou com esse plasmídeo é susceptível de fazer a expressão de uma proteína híbrida de IL2-PE humana normalizada. De preferência/ o organismo hospedeiro unicelular é um hospedeiro bacteriano convencional, tal como e com maior oreferên cia, E. coli. O vector primitivo escolhido para a construção do plasmídeo descrito no Exemplo é derivado do plasmídeo conhecido pRC233/lL-2/delta tet, o qual é um plasmídeo de aproximadamente 3 mil pares de base (Xpb) e que contém a sequência codificadora cADN completa da IL-2 humana a juzan te (3') das sequências reguladoras do promotor PT do bacte-riófago lambda. 0 plasmídeo pRC233/IL-2/delta tet é susceptível de fazer a expressão da IL-2 humana recombinante num hospedeiro E. coli com níveis elevados. O plasmídeo encontrasse descrito na publicação do pedido de patente euroneia Ns 147 819 de 10 de Julho de 1985. Ju e outros, J. Biol. Chem, 262 (1987), 5723-5731 proporcionam uma descrição adicional Para a preparação e utilização deste plasmídeo para a produção da IL-2 humana recombinante.
Deste modo, as proteínas híbridas da presente inven Ção são produzidas utilizando métodos da tecnologia do ADN recombinante. Em consequência, utiliza-se um organismo hospedeiro unicelular que contenha um vector recombinante constituído por uma sequência de ADN que codifica para essa oro-teína híbrida, submetendo-o a fermentação, isto é, cultivando-o sob condições adéouadas nara a exoressão da referida se V, -5- quência de ADN e depois isola-se da cultura a ~>roteina hi-brida produzida pelo organismo unicelular.
Esse organismo hospedeiro unicelular pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Um grande número desses organismos hospedeiros unicelulares encontra-se comercialmente disponível ou é susceptivel de ser obtido livremente em instituições como a American Type Culture Collection (ATCC) cujo endereço é 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA. Os exemplos de células procarióticas são as bactérias tais como E. coli £~Por exemplo. E. colj M15 designada Dor DZ291 por Villarejo e outros em J. Bacteriol.. 120 (1974). 466-474, E. coli 294 (ATCC N2 31446), E^. coli RR1 (ATCC N2 31343) ou E. coli W3110 (ATCC Ne 27325)7/ bacilos tais como B. subtilis e enterobactérias entre as quais se pode referir como exemplos as Salmonella tvohimu-ríum e Serratia marcescens. E especialmente preferida a es. tirpe MC1061 de E. coli que contem o plasmídeo pRK248cIts (ver o exemplo). Em alternativa, é possível utilizar como organismos hospedeiros células de leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae. Existe ainda um grande número de células eucarióticas adequadas como organismos hospedeiros para os vectores recombinantes, as quais são conhecidas pe los especialistas na matéria. Preferencialmente, utiliza--se células de mamíferos tais como CV-1 (ATCC Ne CCL 70) e os seus derivados, por exemplo, COS-1 (ATCC Ne CRL 1650) ou COS-7 (ATCC ΝΞ CRL 1651). Além disso, é possível utilizar células de insectos tal como descrito por Smith e outros Mol. Cell. Biol., 2 (1983), 2156-2165. -6- São conhecidos diversos métodos para a introdução de vectores recombinantes em organismos hospedeiros unice_ lulares. Os exemplos desses métodos são a micro-injecção, transfecção ou transducção. Um especialista na matéria não terá qualquer dificuldade em seleccionar o método mais adequado para o organismo hospedeiro especifico utilizado.
Os vectores recombinantes utilizados na presente invenção são vectores que contêm um ADN que codifica para uma proteína híbrida imunotóxica da presente invenção. Esse ADN pode ser sintetizado por métodos químicos convencionais, por exemplo, pelo método do fosfotriester descrito por Narang e outros em Me th, Enzymol., 6f3 (1979), 90-108, ou pe lo método do fosfodiester (Brown et al., Meth, Enzymol., 68 (1979), 109-151), Em ambos os métodos sintetiza-se primeiro olingonucleótidos longos e depois juntam-se de uma forma pré-determinada. A sequência de nucleótidos do ADN pode ser idêntica às sequências de nucleotidos naturais ou pode ser parcial ou totalmente diferente. Isto deve-se ao facto de o código genético ser degenerado, significando isto que um aminoácido pode ser codificado por diversos codóes. Os co-dões seleccionados podem ser adaptados à utilização preferencial de cod3es do organismo hospedeiro utilizado para fazer a expressão da proteína hibrida imunotóxica (Grosjean e outros, Gene, 18 (1982), 199-209). Deve tomar-se cuidado para que o ADN obtido por este processo não contenha sequên cias parciais que tornem difícil a construção do vector re-combinante, por exemplo por introdução de um sitio de cliva gem enzimática de restricção indesejada, ou que impeçam a expressão do polipeptido.
Para a construção dos vectores recombinantes an-teriormente referidos é possível utilizar um grande núme ro de vectores tais como os descritos na publicação do pedido de patente europeia Ns 200 986. Estes vectores con têm elementos necessários para a transcrição e tradução do ADN que codifica para a proteína híbrida imunotóxica e bem assim os elementos necessários para a manutenção e para a replicação do vector no hospedeiro. A selecçlo de um vec-tor adequado para a construção dos vectores recombinantes da presente invenção e a selecção de um organismo hospedei, ro unicelular compatível com esses vectores recombinantes é da competência dos especialistas na matéria.
De preferência, os vectores recombinantes da presente invenção são preparados por modificação dos vectores recombinantes que contenham um ADN que codifique uma proteína híbrida imunotóxica utilizando o método da mutagéne-se especifica do sítio dirigido do oligonucleótido descrito por Morinaga e outros, Bio/Technoloav. 2 (1984), 636-639.
Um exemplo para esse vector recombinante que contem um ADN que codifica para uma proteína híbrida imunotóxica é o pias. mídeo pHL310 anteriormente referido. O processo segundo o qual se efectua a expressão da proteína hibrida imunotóxica de acordo com a presente inven ção depende do vector de expressão e do organismo hospedeiro utilizados. Normalmente, os organismos hospedeiros cue contêm o vector de expressão desenvolvem-se sob condiçóes que são óptimas para o desenvolvimento dos organismos hospe· deiros. Próximo do fim do desenvolvimento exponencial/ quando o acréscimo do número de células por unidades de tempo diminui, a expressão da proteina hibrida imunotó-xica é induzida/ isto é, o ADN que codifica para a proteina é transcrito e o mARN transcrito é traduzido. A indução pode ser efectuada adicionando um indutor ou um desrepressor ao meio de crescimento ou por alteração de um parâmetro fisico, por exemplo modificando a temperatu ra. A proteina hibrida imunotóxica produzida no organismo hospedeiro pode ser segregada pela célula por me canismos de transporte especiais ou pode ser isolada abrin do a célula por ruptura. A abertura da célula por ruptura pode ser efectuada por meios mecânicos ^T*Charm e outros.
Me th, Enzmol., 22, (1971), 476-556^_7, por tratamento enzi-mático (por exemplo por tratamento lisozímico) ou por meios quimicos (por exemplo, tratamento com detergentes, com ureia ou com clorídrato de guanidina, etc.) ou através de uma com binação desses tratamentos.
No caso das células eucariotas, os polipéptidos que são segregados pelas células são sintetizados sob a forma de uma molécula precursora. 0 polipéptido maduro resulta da clivagem dos chamados péptidos moduladores ("signal peptides") Uma vez que os organismos hospedeiros procarióticos não são capazes de clivar os péptidos moduladores eucarióticos a partir das moléculas precursoras, esses polipéptidos eucarió ticos devem ser expressos directamente na sua forma madura em organismos hospedeiros procarióticos. 0 sinal AUG de ini- cio da tradução, o qual corresponde ao codão ATG ao nivel do ADN, origina que todos os polipéptidos sejam sintetiza dos num organismo hospedeiro procariótico com um residuo de metionina no terminal N. Em alguns casos, consoante o sistema de expressão utilizado e possivelmente em função do polipéptido que se pretende expressar, este resíduo de metionina N-terminal é clivado. A proteína híbrida imunotóxica da presente invenção pode ser purificada até essencialmente à homogeneidade por métodos conhecidos tais como, por exemplo, centrifugação a diferentes velocidades, precipitação com sulfato de amónio, diálise (à pressão normal ou a pressão redu zida), a focagem isoeléctrica preparativa, electroforese em gel preparativa ou mediante diversos métodos cromatográ ficos tais. como a filtração em gel, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia de permuta iónica, a cromatografia de fase inversa e a cromatografia de afini dade (por exemplo, em Sepharosevi^ Blue CL-6B ou em IL-2R ligada a um veiculo ou em anticorpos monoclonais dirigidos contra IL-2 ou exotoxina de Pseudomonas). A proteína híbrida imunotóxica purificada da presente invenção pode ser utilizada de modo conhecido per se Para o tratamento de doenças tais como a tiroidite autoi-munológica, diabetes do tipo 1, artrite reumatóide, doença de Crohn e outras doenças em que se admite que esteja implicada a regulação aberrante da resposta imunológica. A proteína híbrida imunotóxica é também útil para suprimir a resposta imunológica nos casos de rejeição de enxertos alo páticos e no caso de transplantação de orgãos.
As proteínas híbridas imunotôxieas preparadas de acordo com a presente invenção podem ser administradas aos mamíferos de sangue quente para as utilizações clíni^ cas anteriormente referidas. A administração pode fazer-~se por qualquer método convencional tal como, por exemplo, por aplicação parenteral, cuer intravenosa, subcutânea ou intramuscularmente. Como é evidente, a dose necessária variará de acordo com o estado particular que se pretende tratar, a gravidade desse estado, a duração do tratamento e o método de administração. Pode obter-se uma forma de dosagem adequada Para utilização farmacêutica a Partir de proteína esterilizada# filtrada e liofilizada que é reconstituida antes da utilização por um processo convencional. E também da competência de um especialista na matéria a preparação de composições farmacêuticas que contenham uma proteína híbrida imunotóxica da presente in vençio, misturando essa proteína híbrida imunotóxica com veículos farmaceuticamente aceitáveis compativeis tais co mo tampões, estabilizantes, bacteriostatos e outros exci-pientes e aditivos utilizados convencionalmente nas formas farmacêuticas de dosagem parenteral. A presente inven ção refere-se também a essas composições farmacêuticas.
Tendo em consideração que se descreveu de forma genérica a presente invenção, a mesma será agora melhor compreendida tomando como referência o exemplo que se segue ao qual se deve associar os desenhos adiante apresentados, em que:
A Figura 1 representa esquematicamente (não está feita à escala) a construção do plasmídeo da presente in venção utilizado para a expressão de uma proteina de fusão designada por IL2-PE40, englobando uma IL-2 humana com uma extremidade amino correspondente à sequência da IL-2 humana autêntica e um domínio desejado de toxina de PE, isto é, PE40. A Figura 2 representa a sequência de aminoácidos 2 da proteína hibrida Asp IL2-PE prevista a partir da sequência de ADN do clone cADN utilizado para a preparação do plasmídeo pHL310 da técnica anterior. A Figura 3 representa os primeiros 15 resíduos de aminoácidos obtidos ao fazer-se a sequenciação da proteína híbrida IL2-PE40 produzida por expressão do plasmídeo pRC233/lL-2/PE40/deASP^ da presente invenção. A Figura 4 representa um esquema Para a purificação de IL2-PE40.
Deve notar-se que o exemplo seguinte tem apenas objectivos ilustrativos e de forma alguma deve ser considerado como limitativo da presente invenção, no que diz respeito aos aspectos específicos referidos.
Exemplo
Fez-se a digestão de 20 microgramas de ADN de pRC233/lL-2/delta tet com Tth 111 I (New England Biolabs, Beverly, Mass., U.S.A.), e depois completou-se com 4 desoxi-ribonucleótido-trifosfatos (dNTPs) utilizando a ADN polimerase de Klenow (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland, U.S.A.). Após extração com fenol fez--se a digestão completa do ADN com Xba I (Boehringer Mannheim, Mannheim, BRD). Procedeu-se ao isolamento do fragmento completo Xba I/Tth 111 I de 2,6 kb por eluição após electroforese através de agarose de baixo ponto de fusão purificada utilizando uma coluna Elutip (Schleicher and Schuell, Keene, New Hamspshire, U.S.A.). Recuperou-se cerca de 2 microgramas de ADN vector. 0 fragmento inserido derivou do plasmldeo pHL310 (publicação do pedido de patente europeia Ny'261 671). Es te plasmldeo contem as sequências Asp -IL2-PE40 localizadas a jusante do promotor bacteriófago T7. Procedeu-se à digestão completa de 20 microgramas de ADN de pHL310 com Eco RI (New England Biolabs) e depois completou-se com 4 dNTPs e ADN polimerase de Klenow. Após extracção com fenol procedeu-se à digestão completa do ADN com Xba I. Purificou-se o fragmento de 1,4 kb conforme anteriormente descrito para o fragmento vector. Recuperou-se cerca de 1,2 microgramas de ADN inserido.
Para se fazer a construção do vector de expressão recombinante misturou-se 320 nanogramas do fragmento de 1,4 kb (pHL310, Xba I/Sco RI completo) com 50 nanogramas do ADN do vector (pRC233/IL-2/delta tet, Tth 111 I comple to). Estes ADNs foram ligados em tampão PL (6,5 mM de Tris--HCL; pH 7,4, 0,1 M de NaCl; 4,5 mM de MgCl2; 100 mM de 2-mercapto-etanol) na presença de 1,0 mM de ATP e de T4 ADN ligase (New England Biolabs). A reacção de ligação foi in cubada a 15°C durante 2 horas. Introduziu-se na reacção mais ADN ligase e depois incubou-se a mistura à tempera tura de 4°C durante 18 noras. Aqueceu-se a mistura de ligação à temperatura de 65°C durante 5 minutos para desacti. var a ligase e depois digeriu-se com Tht 111 I para lineari zar qualquer ADN do vector primitivo remanescente. Uma porção da mistura de ligação foi depois transformada nas células competentes MC1061 de E. coli contendo o plasmídeo pRK248cIts. A estirpe MC1061 de E_. coli e o plasmídeo pRK-248clts encontram-se disponíveis na American Type Culture Collection sob os números de registo ATCC Ne 53338 e ATCC Ne 33766, respectivamente. A estirpe hospedeira de MC1061 E. coli e o plasmídeo compatível pRK248cIts, que codifica para o repressor do promotor PL sensível à temperatura são conhecidos pelos especialistas na matéria e foram descritos por Casadaban e outros em J. Mol. Biol.. 138 (1980), 179-207 e por Bernard e outros em Methods Enzymol., 68 (1979), 482-492, respectivamente. As células de E. coli fo ram tornadas competentes de acordo com o procedimento descrito por Maniatis e outros em Molecular Cloninq; A Labo-ratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory U.S.A., (1982), I ' PP. 249-255.
Nas colónias resultantes pesquisou-se o vector re-combinante correcto fazendo-se a preparação de um minilisa to de ADN do plasmideo (Maniatis e outras, supra, po. 366--369) e fazendo a digestão de restrição com Eco RI, Xba I, e Bgl II. Em duas colónias que continham o plamideo apro-priado (designadas por pRC233/IL-2/PE40/desASP ) fez-se ainda a análise da produção de proteína. Fez-se o desenvol. vimento à temperatura de 30°C de culturas das duas colónias (designadast^/4 βτ^5) até se obter o valor d°60q = 0,5 e depois aumentou-se a temperatura para 42°C até se obter o valor D0600 =1,0 para induzir a síntese proteica. Aglomerados das células induzidas foram extraídas por lise numa amostra de tampão Laemmli ^"Laemmli, Nature, 277,(1970), 680-685^7 conforme descrito por Ju e outros, sunra. A análise desses aglomerados por electroforese em gel de poli-acrilamida indicou que as duas culturas produziram a oroteí_ na esperada de 54 quilodalton, a qual não estava presente nas culturas não induzidas. Descobriu-se também que o ex-tracto do clone^4 possuia uma substancial bioactividade conforme determinado com CTLL murino e com outras células. Seguidamente, apresenta-se a descrição pormenorizada do en saio utilizado e faz-se a apresentação dos resultados obti dos.
Utilizou-se a cultura do clone^é contendo o plas-mídeo pRC233/IL-2/PE40/desASP^ para semear um grande lote de fermentação de 20 litros. Procedeu-se ao tratamento das células desta fermentação conforme descrito nara a extrac- 15- ção e purificação da proteina de fusão IL2-PE40. Na Figura 4 representa-se o esquema de purificação global para a IL2-PE40,
Para os passos de solubilização e de renaturação todas as operaçQes foram efectuadas a uma temperatura com preendida entre 2° e 8°C, salvo quando especificado de ou tro modo. As células de E. coli congeladas foram desconge ladas e colocadas em suspensão em Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo EDTa 1 mM (4 ml/g de células) . A suspensão celular foi tratada com impulsos de ultra-sons durante 6 x 30 segundos com um equipamento Sonifier Cell Disruptor 350 (Branson Sonic Power Co., Farmingdale, New York, U.S.A.). As células rompidas foram centrifugadas a 10 000 x g duran te 20 minutos numa centrifugadora Sorvall RC-5 (Dupont, Wilmington, Delaware, U.S.A.) com um rotor SS-34 e deoois procedeu-se à recolha dos aglomerados. Esses agomerados fo ram colocados em suspensão na proporção de 5 ml/g de células, numa solução de cloridrato de guanidina 7 M (GuHCl) em Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, contendo EDTA 1 mM e ditio-trei. tol (DTT) 1 mM e submeteu-se à acção de ultra-sons conforme referido antes. Agitou-se a mistura durante 60 minutos e recolheu-se o sobrenadante por centrifugação. Diluiu-se 80 vezes com PBS (solução salina tamponada com fosfato; pH 7,4; Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, Maryland, U.S.A.) e agitou-se durante a noite. O extracto diluído foi clarificado por centrifugação a 24 000 x g durante 20 minutos utilizando-se um rotor GSA ou submeteu-se a filtra, ção através de um filtro de 0,8/0,2 μ. 0 extracto clarificado foi utilizado como material de partida para a purificação de IL2-PE40 por afinidade do receptor, seguindo-se a permuta catiônica e a cromatogra-fia líquida de exclusão de tamanho, A actividade de 11*2--PE40 no extracto de E_. coli liga-se quantitativamente à coluna receptora conforme indicado pela ausência de activi. dade no fluxo através dos materiais. A partir da coluna re ceptora recupera-se aproximadamente 98% da actividade de IL2-PE40 ligada. Os dados da permeação em gel, a análise SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras e bem assim os resultados dos ensaios biológicos indicaram a presença de "agregados" de IL2-PE40 redutíveis e biologicamen te inactivos no material purificado por afinidade com o re_ ceptor, em conjunto com a forma principal de IL2-PE40 mono mérica, solúvel e biologicamente activa. Quando o produto purificado por afinidade com o receptor é submetido a dia-lise em tampão de pH 5,0, observa-se a precipitação da maior Parte dos materiais inactivos. A cromatografia de permuta catiônica remove um contaminante não proteico fortemente absorvente em UV (3^^=260 nm), o qual não consegue ligar--se à coluna de permuta catiônica. Este passo origina um acréscimo de actividade específica. A preparação de IL2-PE40 está isenta de contaminantes de alto peso molecular conforme determinado por análise SDS-PaGE, sob condições não redu toras. Embora não se tenha observado um acréscimo significa, tivo de pureza, a permeação de gel é útil para fazer a remo ção de contaminantes de baixo peso molecular e de endotoxi-na. A preparação final não contem qualquer nível detectável de endotoxina, quando o passo de filtração em gel é realiza. do sob condições assépticas. Este passo constitui também uma via conveniente para permutar a IL2-PE40 para o tampão de armazenamento final.
Os procedimentos para a produção e para a purifi cação de uma forma solúvel de IL-2R(p55), designada por IL-2R-^—Nae, foram descritos por Hakimi et al., J. Biol, Chem. 262, (1987), 17336-17341. A IL-2R purificada foi imobilizada por NuGel P-AF poli-N-hidroxi-succinimida (500 A, 50 Separation Industries, Metuchen, New Jersey, U.S.A.) para valores de densidade de acoplamento de 1,05 mg/ml de gel e utilizou-se para adsorvente por afinidade Para a purificação de IL2-PE40 conforme descrito por Bailon e outros, Bio/Technoloqy, 5 (1987), 1195-1198.
Quarenta mililitros de IL-2R imobilizada em gel fo ram carregados numa coluna Amicon G-22 x 250 equipada com dois adaptadores (Amicon, Div. W.R. Grace & Co., Danvers, Mass., U.S.A.). Equilibrou-se a coluna com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS). Aplicou-se à coluna 7 li tros de extracto (1/2 do extracto total derivou de 35 g de células), com um caudal de 7 ml/minuto. Efectuou-se o controlo dos efluentes da coluna utilizando um detector de UV Gilson 111B e fez-se o registo num registador Kippen Zonen (Gilson Medicai Electronics, Inc#, Middletown, Wisconsin, U.S.A.). Lavou-se a coluna com PBS até a absorvância a 280 nm regressar à linha base. Fez-se a eluição da actividade de IL2-PE40 a partir da coluna com KSCN 3 M em fosfato de potássio 50 mM; pH 6,0. A solução de reserva de KSCN foi descolorada por filtração através de um filtro de carvão activado, antes da utilização. A IL2-PE40 eluida foi submetida a dialise em 2 litros de acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, em tubagens de diálise de corte para P.M, 12-14000. Fez-se a centrifugação do dialisado para remover quaisquer materiais precipitados. 0 dialisado límpido ficou assim preparado para a cromatografia de permuta catiónica. A IL2-PE40 submetida a diálise no passo anterior foi aplicada a uma coluna CM de fluxo rápido de 1,6 x 15 cm (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, New Jersey, U.S.A.), equilibrada com acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, a um caudal de 3,3 ml/minuto. Lavou-se a coluna cora o tampão de equilíbrio até se fazer a remoção dos materiais não ad-sorvidos. A IL2-PE40 adsorvida foi eluida a partir da colu na com NaCl 0,5 M em fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0. De pois fez-se a concentração num concentrador Amicon celular agitado de canal estreito, equipado com uma membrana YM 10.
Carregou-se uma coluna Pharmacia K25/100 com Seoha- (tm) rose'—y CL—6B (Pharmacia LKB Biotechnology Xnc.) até à altura de 90 cm. Equilibrou-se a coluna com fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0, contendo NaCl 0,15 M, a um caudal de 0,7 ml/ /minuto. A IL2-PE40 concentrada (20 ml) foi aplicada a uma coluna e desenvolveu-se com o tampão de equilíbrio. As ope-raçóes na coluna foram controladas conforme descrito no paJ>. so de afinidade. Recolheram-se fracções com intervalos de seis minutos num equipamento para recolher fracções LKB Ultra Rac-7000 (LKB-Produkter, Brommer, Suécia). Recolheu--se o pico correspondente à actividade da IL2-PE40 (aProxi-madamente 54 KDa) e concentrou-se até 0,5 a 1,0 mg de pro- -19-s teína por ml, filtrou-se através de um filtro de 0,2 y. e armazenou-se sob congelamento a -20°C. Efectuou-se a per meação em gel sob condiçóes assépticas. E possível examinar in vitro a bioactividade da IL2-PE40 da presente invenção estudando a sua capacidade para inibir a síntese proteica em células linfóides que suportam receptores de alta afinidade para IL-2. As célu las que é possível utilizar nestes estudos englobam as células da linha CTLL murinas (CTLL é uma linha de células T murinas dependentes de IL-2, de longa duração, disponíveis na ATCC sob o número de registo TIB 214), espie nócitos murinos previamente activados para fazer a expres. são dos receptores de IL-2 de alta afinidade (IL-2R), por incpbação com concanavalina A (Con A), e linfócitos do sangue periférico humano previamente activados para fazer a expressão de IL-2R de alta afinidade, por incubação em culturas de leucócitos mistas (blastos MLC). Como elementos de controlo negativo é possível utilizar quaisquer cé lulas às quais falte IL-2R, tais como as da linha mastoci toma P815 murina CaTCC N2 TIB 64).
Os esplenôcitos activados por incubação com Con A murino podem ser preparados por incubação de esplenôcitos de murganhos C57BL/6 a uma densidade de 1 x 106 células/ml num meio de cultura contendo 5% de soro de bovino fetal des^ activado pelo calor e Con A na oroporção de 2 ^ig/ml. Após incubação durante 3 dias à temperatura de 37°C orocedeu-se à recolha dos esplenôcitos das culturas e fez-se a lavagem 3 vezes em meio recente sem Con A entes da sua utilização no ensaio. Para se fazer a preparação dos blastos MLC humanos procedeu-se ao isolamento de células mononucleares de sangue periférico de 2 dadores voluntários normais, conforme descrito por Gately e outros, J. Natl. Can. Inst.. 69. (1982), 1245-1254. Os leucócitos de outro dador ("cé lulas do estimulador") foram tratados com 1500 rads por irradiação com raios X antes de se fazer a mistura com os leucócitos do segundo dador ("células do respondedor"). Fez-se uma cultura conjunta de células do estimulador (1 x x 10^/ml) e de células do respondedor (l x 10^/ml), duran te um período total de 6 dias à temperatura de 37°C. No 4 2 ãia de cultura adicionou-se IL-2 humana recombinante (rlL-~2) a cada cultura até se obter uma concentração final de 50 unidades/ml. No 62 dia procedeu-se à recolha das células e lavou-se 3 vezes com meio recente antes do ensaio.
Os ensaios foram efectuados misturando alíquotas de 50 jíl de células, rIL-2 e IL2-PE40 nas cavidades das mi_ croplacas de fundo plano (e.g. Costar 3596). 0 meio utilizado nos ensaios foi meio essencial mínimo de Eagle livre de leucina enriquecido com 5% de soro de bovino fetal des activado a quente, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, piru vato de sódio 1 mM, L-glutamina 2 mM, 2-mercapto-etanol _5 5 x 10 M, penicilina na prooorção de 100 unidades/ml, es-treptomicina na proporção de 100 jag/ml e gentamicina na proporção de 50^ig/ml. Fez-se a adição dos linfoblastos hu manos e de murino até uma concentração de 2 x 104 células/ /cavidade tendo-se utilizado as linhas de células de bovino
3 na concentração de 5 x 10 células/cavidade. Fez-se a incubação das culturas durante 24 horas (CTLL e P815) ou du rante 48 horas (linfoblastos humanos e de murino) à tempe ratura de 37°C. Depois adicionou-se a cada cavidade aliquo 3 3 tas de 25 jxl de H-leucina ( H-leu), na dose de 20^jCi/ml. As culturas foram incubadas durante mais 6 horas à tempera tura de 37°C e a seguir procedeu-se à recolha sobre filtros de fibra de vidro, a incorporação de 3H-leucina na proteína celular foi medida pela contagem de cintilação liquida. To dos os valores apresentados são as médias + 1 DMP (desvio médio padrão) de amostras em triplicado. 0 resultado da incubação de IL2-PE40 com células CTLL de murino, as quais suportam IL-2R de alta afinidade ClL-2r+) e com células de mastocitoma P815 de murino, às quais falta IL-2R (IL-2R ), são apresentados no Quadro 1. A IL2-PE40 foi um inibidor muito poderoso da síntese proteica efectuada pelas células CTLL que suportam IL-2R. Observou-se uma inibição de 50% da síntese proteica efectuada pelas células CTLL para concentrações de IL2-PE40 compreendidas entre 0,03 ng/ml e 0,16 ng/ml, nessas experiên cias. Por outro lado, foi necessário aproximadamente entre 5 e 6 jig/ml de IL2-PE40 para provocar a inibição de 50% da síntese proteica efectuada pelas células P815 às quais fai ta IL-2R. Em consequência, existe uma diferença suoerior a 10 000 vezes nas concentrações de IL2-PE40 em relação as quais se constatou serem tóxicas para uma linha de células de murino suportando IL-2R e uma linha celular negativa de IL-2R, nestas experiências. Isto demonstra que a IL2-PE40 foi selectivamente tóxica para as células que suportam IL-2R de alta afinidade. 2 QUADRO 1
Capacidade da IL2-PE40 e capacidade da Asp IL2-PE40 para inibir a síntese proteica originada pela CTLL de murino IL-2R+ e pelas P815 de murino IL-2R~ A 2 Asp 3 rIL-2 IL2-PE40 IL2-PE40 Incorporação de H-leu em: (pg/ml) (ng/ml) ( ng/ml) CTLL P815 Exp. 1 0 0 0 233 + 58 10 0 0 67,965 + 2241 10 4 0 197 + 117 10 0,80 0 2,103 + 582 10 0,16 0 11,841 + 700 10 0,03 0 23,712 + 2829 10 0 4 312 + 337 10 0 0,80 2,225 + 544 10 0 0,16 26,560 + 1467 10 0 0,03 60,218 + 5415 0 0 0 0 50 000 0 52 338 + 3890 0 10 000 0 600 + 183 0 2 000 0 16 860 + 1919 0 400 0 36 849 + 1862 0 0 50 000 50 784 + 4038 0 0 10 000 990 + 181 0 0 2 000 • 17 314 + 420 0 0 400 40 219 + 1264 53 087 + 1813 Exp. 2 0 0 0 5 + 51 10 0 0 48 626 + 3643 10 4 0 419 + 355 10 0,80 0 3 666 + 295 10 0,16 0 23 775 + 1312 219 Εχρ. 3 0 0 10 0 10 4 10 0,80 10 0,16 10 0,03 0 0 0 10 000 0 2 000 0 400 0 1 223 + 0 47 873 + 0 94 + 0 2 962 + 0 21 903 + 0 32 825 + Ο Ο Ο Ο 2150 17 126 25 2307 31 987 + 3009 6 089 + 409 21 409 + 844 28 730 + 1022 Ο Quadro 2 apresenta os resultados de estudo adicionais tendo-se efectuado -a observação dos efeitos de IL2-PE40 em linfoblastos humanos e de murino primários. A IL2-PE40 inibiu a sintese proteica originada pelos esplenó eitos de murino activados por Con A, tendo-se observado uma inibição de 50% para uma concentração de 1L2-PE40 de aproximadamente 4 ng/ml. De modo idêntico, a IL2-PE40 inibiu a sintese proteica originada pelos blastos MLC humanos tendo-se observado uma inibição de 50% para uma concentração de aproximadamente 11 ng/ml.
QUADRO 2
Capacidade da IL2-PE40 para inibir a síntese proteica originada por esplenócitos de murino activados por Con A e originada por linfoblastos humanos activados em culturas de leucócitos mistas. Λ 2 Asp Incorporação de ^H-Leu em: rIL-2 IL2-PE40 IL2-PE40 Blastos com Blastos ^g/ml) (ng/ml) (ng/ml) A de murino MLC humanos Exp. Ia^ 0 0 0 763 + 273 10 0 0 18 135 + 936 10 500 0 1 521 + 96 10 100 0 2 765 + 50 10 20 0 4 579 + 154 10 4 0 8 977 + 352 10 0,8 0 14 703 + 892 10 0 500 1 900 + 191 10 0 100 2 533 + 84 10 0 20 4 386 + 70 10 0 4 10 030 + 570 10 0 0,8 14 761 + 1364 Exp. 2a^ 0 0 0 1 837 + 198 10 0 0 18 744 + 511 10 500 0 1 740 + 199 10 100 0 4 384 + 180 10 20 0 7 450 + 624 10 4 0 12 186 + 822 10 0,8 0 17 198 + 859 a) Os dados apresentados neste quadro relativos às experiências 1 e 2 proveem respectivamente das experiências 1 e 2 a que se refere o Quadro 1.
Nas experiências anteriormente referidas fez-se a comparação da actividade biológica da IL2-PE40 com a • . 2 actividacie da Asp XL2-PE40 da técnica anterior, em ensai os com CTLL de murino, P815, e esplenócitos activados com
Con A (Quadros 1 e 2), As actividades biológicas de IL2-2 -PE40 e de Asp IL2-PE40 apresentaram-se bastante idênticas nestes estudos.
Fez-se uma análise de aminoácidos de uma amostra de IL2-PE40 preparada conforme anteriormente descrito, utilizando um instrumento com tratamento ("derivatization") com fluorescamina pos-coluna (ver Pan e Stein, "Amino acid analysis With postcolúran fluorescamine derivatization", em: Methods of protein microcharacterization, Shively, J.E.
The.Humana Press Inc., Ced.), Clifton, New Jersey, U.S.A., 1986), Antes da análise fez-se a hidrólise da proteína em ácido clorídrico 6 N contendo 4% de ácido tioglicólico à temperatura de 110 C durante 20 a 24 horas, sob vazio. Os resultados encontram-se resumidos no Quadro 3.
Submeteu—se também a amostra a uma análise de sequência. Foram obtidas as duas sequências representadas na Figura 3. Verificou-se que 25% da proteína recombinante da amostra continha um resíduo de metionina adicional na extre midade N. Verificou-se que a sequência de aminoácidos N-ter minai (os primeiros 15 aminoácidos, desprezando o resíduo fc-/ s de metionina N-terminal da sequência) se ajusta à sequência dos aminoácidos N-terminal da IL2-humana natural. Deve notar--se que os resultados apresentados no Quadro 3 se baseiam nu ma análise preliminar da amostra. Não se analisou nenhum bran co tampão como controlo e não se determinou (ND) os resultados de PRO, CYS e TRP. QUADRO 3
Análise de aminoácidos de IL2-PE40
AMINOÁCIDO calculado DETERMINADO ASP (D) 40 40,0 THR (T) 29 27,6 SER (s) 27 25,5 glu Ce) 65 64,2 PRO (P) 32 ND gly (g) 41 40,7 ala (a) 51 51,6 cys Cc) 7 ND VaL (V) 24 23,1 MET (M) 4 4,0 ILE (I) 23 21,1 leu Cl) 60 63,3 TYR CY) 14 16,2 PHE CP) 15 16,0 HIS CH) 9 9,1 LYS Ck) 14 15,5 ARG Cr) 34 33,3 TRP (w) 6 ND F1G. 1
VECTOR pRC233/IL*2/delta tet Eco RI INSERÇÃO pHL310
Tth IIII
Xba I
Xba I
Isolar
Fragmento de 2/6 kb
I I
Xba I Isolar Fragmento de 1,4 kb
Eco Ri Xba I
pRC233/IL-2/PE40/desASP 2
EcoRl
Fig. 2 1 10 20 f^N-Ala-Asp-Pro-Thr-Ser-Sep-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gln-Leu-Glu-His-Leu-Leu-Leu- 30 40
Asp-Leu-GIn-Het-Ile-leu-Asn-Gly-Ile-Asn-Asn-Tyr-Lys-Asn-Pro-Lys-Leu-Thr-Arg-Met 50 60
Leu-Thr-Phe-Lys-Phe-Tyr-Het-Pro-Lys-Lys-Ala-Thr-Glu-Leu-Lys-His-Leu-Gln-Cys-Leu 70 80 61 u-Gl u-Gl u-Leu-Lys-Pro-Leu-Gl u-Gl u-Va 1-Leu-Asn-Leu-Al a-Gl n-Ser-Lys-Asn-Phe-H í s 90 100
Leu-Arg-Pro-Arg-Asp-Leu-Ile-Ser-Asn-Ile-Asn-Val-Ile-Val-Leu-Glu-Leu-Lys-Gly-Ser 110 120
Glu-Thr-Thr-Phe-Met-Cys-Glu-Tyr-Ala-Asp-Glu-Thr-Ala-Thr-Ile-Val-Glu-Phe-Leu-Asn 130 140
Arg-Trp-Ile-Thr-Phe-Cys-Gln-Ser-Ile-I1e-Ser-Thr-Ile-Pro-Glu-Glu-Gly-Ser-Leu-Ala 150 160
Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln 170 180
Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu 190 200
Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala 210 220
Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg 230 240
Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-G1u-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn 250 260
Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-6ly 270 280
Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Sep-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly 290 300
Ala-Glu-Phe-Leu-61y-Asp-Gly-Gly-Asp-Va1-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp 310 320
Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val 330 340
Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Qlu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala 350 360
Arg-Ser-Gl n-Asp-Leu-Asp-Al a-11 e-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-11e-Ala-6ly-Asp-Pro-Ala-Leu 370 380
Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala 390 400
Leu-Leu-Apg-Val-Typ-Val-Ppo-Apg-Sep-Sep-Leu-Ppo-Gly-Phe-Typ-Apg-Thp-Sep-Léu-Thp 410 420
Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-leu 430 440
Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thp-Gly-Pro-Glu-Glu-01u-Gly-Gly-Apg-Leu-Glu-Thp-Ile-Leu-6ly 450 460
Tpp-Pro-Leu -Al a-6l u-Apg-Thp-val -Vai -11 e-PPO-Ser-Al a-11 e-PPO-Thp-Asp-PPO-Apg-Asn 470 480
Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Ppo-Sep-Sep-Ile-Ppo-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Sep-Ala-Leu 490 496
Pro-Asp-Tyr-Ala-Sep-Gln-Ppo-Gly-Iys-Ppo-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys-COOH.
Fig.3 (75%)
Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu-Gin-Leu-Glu (25%)
Met-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-GIn-Leu-Gin-Leu-GIu [-31-
Fig. 4 “Ί Z3
ZI
Pasta de células E. coli
Tratamento com ultra-sons^ Aglomerado . .
Extração
Sobrenadante· Sobrenadante .
Cromatografia por afinidade com o receptor Permuta catiônica CM - fluxo rãpido « Coluna de aferição
Sepharose CL-6B Concentração/·— Diafiltração —— 4xvol de Tris-HCl 50 mM, EDTA lmM, pH 8/0 5xvol GuHCl 7M, Tris-HCl 0,1M, pH 8,0, EDTA e DTT lmM cada
diluição 1-80 com PBS
Agitar durante a noite, clarificar.
Tampão de lavagem. Eluição com PBS em tampão KSCN em fosfato de potássio 50mM, pH 6,0 Acetato 50mM, pH5,0. Eluição com
Nacl 0,5M em fosfato de potássio 50mM, pH 6,0.
Fase móvel: fosfato de potássio 50mlY pH 6,0? NaC10,15M
Armazenado congelado a -20°C
Claims (3)
- R Ε I V I ND ICAÇOES 1.- Processo para a preparação de uma imunotoxina a par tir de uma proteína híbrida possuindo uma sequência da interleu-cina-2 humana recombinante na extremidade amino e na extremidade carboxilo da referida proteína híbrida compreendendo a sequência de um domínio de exotoxina de Pseudomonas em que a sequência do terminal amino da referida interieucina-2 é idêntica à sequência do terminal amino da interleucina-2 humana natural, e englobando opcionalmente um resíduo de metionina adicional no terminal N, caracterizado pelo facto: a) de se fermentar organismos hospedeiros unicelulares transformados, com um plasmídeo de expressão susceptível de exprimir a referida imunotoxina de proteína híbrida; e b) de se purificar a referida imunotoxina de proteína híbrida 2.- Processo para a preparação de uma imunotoxina de -33-a proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1, em que o referido domínio da exotoxina de Pseudomonas no terminal carboxilo é a exotoxina 40 de Pseudomonas, caracterizado pelo facto: a) de se fermentar organismos hospedeiros unicelulares transformados com um plasmídeo de expressão susceptível de exprimir a referida imunotoxina de proteína híbrida; e b) de se purificar a referida imunotoxina de proteína híbrida.
- 3.- Processo para a preparação de um organismo hospedeiro unicelular susceptível de exprimir uma imunotoxina de proteína híbrida conforme definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se transformar um organismo hospedeiro unicelular com um vector recombinante contendo um ADN que codifica a referida imunotoxina de proteína hibrida.
- 4.- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica contendo uma imunotoxina de proteína híbrida conforme definida nas reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se incorporar a referida imunotoxina de proteína híbrida num material veicular farmaceuticamente aceitável e compatível, Lisboa, 16 de Novembro de 1989 O Agente Oficial da Propriedade Industriai
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