HUT52154A - Recombinant interleukin-2 hybrid proteins. - Google Patents
Recombinant interleukin-2 hybrid proteins. Download PDFInfo
- Publication number
- HUT52154A HUT52154A HU895908A HU590889A HUT52154A HU T52154 A HUT52154 A HU T52154A HU 895908 A HU895908 A HU 895908A HU 590889 A HU590889 A HU 590889A HU T52154 A HUT52154 A HU T52154A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hybrid protein
- protein
- hybrid
- purified
- expressing
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Description
Találmányunk humán interleukin-2 /11-2/ polipeptidből ás immunotaxin osoropét betöltő polipeptidből felépített hibrid fehérjékre vonatkozik· Az ilyen fúzión fehérjék különböző olyan betegségek kezelésére alkalmazhatók, amelyeknél XI—2 receptorokat /Xl-2 pozitív sejteket/ hordosó sejtek feltehetően ez iamunrosgálás aberráns szabályozásában szerepet játszanak /pl· autoimmun thyreidítis, 1. típusú diabetes, reumatóid arthritis és Grohn-félo betegség/· As ilyen immunotaxíkus fúzióm fehérjék továbbá allograftok és sservotlon tranesplsntátumok kilökése esetén as immunreagáláo visozaoseritáoára alkalmazhatók·
Lorborboum-Oeleki éa teái £>roo. Háti· Acad· Sci· USA, £2, 1922-1926 /1988/./ leírták as Asp2IL2-Pseudomonae oxatexin /Aop2XX2-PB40/ kimer fehérje klónozását ős kifejesátŐt 1· ooli-ban· Ibbsn a fúziós fehérjében as XX-2 helyettesíti a sejt felismerési tartományt a Pseudomonas «Katalinnál /P8/ vagy - más szóval - a fúziós fehérje as amine-végoseperton rokombináns humán intorloukin-2 szekvenciát tartalmas és a fenti fúziós fehérje karboxil-végoooportja X· tartomány-hiányes Pl molekula aminosav-asokvonciáját foglalja magában· Így olyan Pl molekula, amelyből az X· tartományt törölték, /«Pl 40/ teljes ABP-ribosilsső aktivitással rendelkezik, ugyanakkor azonban sejtölő aktivltáoa a sejtfalismerés! tartomány elvesztése miatt rendkívül alacsony· A fúziós fehérje amíno-végesoportján levő XI-2 molekula teljesen feltárt, biológiai aktivitását megtartja és a PB-ben jelenlevőtől eltérő sejtfelismerési tartományt mutat· A kimer fehérje előállítási eljárásának eredményeként az 11-2 molekula 1- és 2-helysetében levő alanin és prolin közé egy aszparaginsav-maradékot iktatnak be és ezáltal a Belaknia IL-2 részét az amino-végcsoporton *a természetestől eltérővé* teszik· A teáin molekula /azaz PB 40/ amlno-végcsoportjához /a PB 251-holysetében levő prolin/ az 11-2 131-helysetében levő troonint szintetikusan kódolt iseleuoin segítségével kapcsolják· Az Asp2IX2-PB fúziós fehérjét továbbá az 1988•március 30-án kinyomtatott 261 671 ez· európai közzétett szabadalmi bejelentésben Írták le· Az Aop2IL2-PB40 fúsiós fehérje az IZ>2 receptorokat hordozó sejtekre oitotomikus aktivitást fojt ki·
A Lorberboum-Galski és tsai által /lásd fent idésett irodalmi hely/ az Asp2IL2-PB fúziós fehérje kifejezésére használt pH1310 vektor Mot-Ala^Asp^ro^lhr^··· amlno terminális ssokvonoiát tartalmazó pepiidhez vezet, amely különbözik a természetes humán IL-2-ben talált szekvenciától, £&obb és tsaii Proc. Háti· Acad. Sói. VSA 6486-6490, /19844/. A pHX*310 vektor továbbá nem teszi lehetővé a fehérje magas szinten történő kifejezését· A fonti két probléma megoldása céljából az 1« ábrán feltüntetett stratégiát alkalmazzuk olyan kifejezési vektor előállítására, amely a fúziós fehérje szintézisét nagyon magas szinten programozna és a humán Xl-2 amlno végosoportjához /azaz Met-Ala^Pro^hr3···/ jobban hasonlító amino-végcsoportot tartalmazó fúziós fehérjét kódol· Találmányunk rekomblnáns humán Ι1-2-ΡΒ imnunotoxin hibrid fehérjére vonatkozik, amelynek jellemző sajátossága, hogy az irodalomban leírt Aap2IL2-PE40 fúziós fehérjével szemben amino-végosoportján természetes H>2 szekvenciát tartalmas· Az immunatoxin hibrid fehérje amino-végcsoportján rokombináns humán interleukin-2 ssokvonoiát tartalmas és a fenti hibrid fehérje karbexi-végcseportja Psoudomonas oxotoxln — 4 valamely tartományának saakvenciáját /előnyösen Paoudomonas oxotsxln 40/ tégláija algában ős a hibrid fehérjére az a jolloaső, hogy a fenti intorloukin-2 amino terminális esekvoneiája a teraéssetos humán interloukin-2 aalne terminális szekvenciájával azonos. Az ismunotsxin hibrid fehérje adott esetben as S-végGsoportoa további metienin-maradékot tartalmashat· As iamnnetexin hibrid fehérje legelőnyösebben lényegében homogén formában van jelen·
Találmányunk tárgye továbbá a fenti tamunotoxln hibrid fehérjét kódoló SMS és a fenti BVS-t tartalmasó rekoabináns vektor· Is a rekoabináns vektor legelőnyösebben valamely plasmid· A fenti rekssbináne vektorral vagy plasmiddal tranasférméit egysejtű gezdassorvosét egy normalisált huaán Xb2-M hibrid fehérje kifojeséséro képes· Kgysojtű gasdasservosstteént ol&yöaen valamely saokáses baktérium gasáaesorvosotot* kűlö* nöoon előnyösen S»eoli-t alkalmashatunk·
A példában leirt plasmld kialakítására kiválasztott ssttlő vektor aa ismert >R6233/Íl-2/delta tót· pizzáidból szár* más tatba tó lei es a mintegy 3 kilobaso-pár /kb/ plazmid tartalmassá s bakterofág laabds promoter sssbályosó saskvenoiája humán H-2 lefelé haladó /3'/ teljes cMS kódoló szekvenciáját· A pBC233/l»/áolta tót· plasmld a rokomblnáss humán XL-2 magas ssinten történő kifejezésére képes B«ooli gasdaczorvesetben· A plasmidot as 1985« júl· 10-én kinyomtatott 147 819 as· európai közzétett szabadalmi bejelentésben Írták le· A fonti plazmid előállítását és rokembináns humán IL-2 termelésére való folhassnáláaát továbbá Ju és teái közölték £~J· Bioi. Choa. 262· 5723-5731 /1987//.
• · ·
- 5 ·
A találmányónk szerinti hibrid fehérjókat rokombináns DNS technológiai módszerek alkalmazásával állítjuk elő· A fenti hibrid fehérjét kódoló DNS szekvenciát magábanfoglaló rekenbináne vektort tartalmazó egysejtű gazdaszervezetet fermentáljuk - azaz a fenti DNS ssokvonola kifejezésért alkalmas körülmények között tenyésztjük - és az egysejtű szerveset által termelt hibrid fehérjét a fermontléből izoláljuk·
Bgyssjtü gazdaszervezetként prokarióta vagy oukarióta sejteket alkalmazhatunk· A fonti egysejtű gazdaszervezetek ke* roskedolmi úton nagy számban szerezhetők be vagy különböző de* ponáló helyeken szabadon hozzáférhetők· A deponáló bolyok közül pl* az Aneriean Type Culturo Collesction /A£CC/ intézményt említjük meg /12301 Parkiamé Drivo, lookville, Maryland, USA/· Prokarióta sajtok példáiként az alábbi szervezeteket említjük taogt baktériumok, pl· B· coll £mint pl· 1« coli Μ15» mint DZ291 leírva lásd Villarojo és teáit J. Bacteriol. 120, 466-474 /1974/, B· coli 294 /ATCC Be· 31446/, 1· coli BB1 /ATCC No. 31343/ vagy B· coll W3110 /ATCC No. 27325/./, bacillusok, pl· B· subtilis ée enterobaktériumok, mint Salmenolla typhimurium és serratia marcescens· Különösen előnyösen alkalplazmidot mázható a pBK248cIte V tartalmazó MC1061 E. coli törzs /lásd példa/· gazdaszervezetként alternatív módon élesztő sejtek is felhasználhatók /pl· Saccharomyoos oorovisiae/· A szakember által nagyszámú olyan oukarióta aejt ismert, amelyek rekombináns vektorok gazdaszervezeteként alkalmazhatók· Blőnyösen alkalmazhatunk emlős sejteket /pl· ^0*1 /ATCC No· CCL 7QfJ és származékait, £~pl. COS-1 /ATCC No· CBL 1650/ vagy C08-7 /ATOC No· CRL 1651/./· Ezenkívül rovarsejtek is alkalmashátók £lásd
Saith <0 tsais Möl* Coll* Bioi. £, 2156-2165 /1983/J^·
Különböző módszerek Imitek rekenbináns vektoroknak egysejtű gasdassorvozotokbe tSrtdnŐ bővítőidre* 8 nődsserek pdldáikdnt a mikroinjoktálást· transsfakciót de transsdukoiót említjük meg· A szakember számára egy adott specifikus gasdssservozot ssámára logalkalnaoabb nódeser msgválasstása non okos Bohdoodgot*
A találmányunk szerinti élj áriánál felhasznált rokon» bináns vektorok a találmányunk szerinti immunotaxin hibrid fahdrjdt kódoló DHS-t tartalmazó vektorok lehetnek* As ilyen DXS szokásos kdniai módszerekkel szlntetisálhetó, >1* a foesfotridsstorec nódosorrel de tsaii Meth* Knzymol.
90-108 /1979!J a foszfodidostares módszerről £brovi>
ős teáit Meth. Snzymol* 6|* 109-151 /1979/JT* MMkót nódsaer során előbb hosesó oligonukleetidokat asintotisálunk· majd előre meghatározott módon kapóméinak* A 988 nukleotid esek» vonalija a tornászétos nukleotid esokvoncidkkal azonos lehet vagy azoktól róczlogeson vagy teljesen eltörhet* Bnnek eke, hogy a genetikus kód degenerálódik, azaz egy anlnosavat különböző kodonok kódolhatnak* A kiválasztott Mont as inranotaxin hibrid fehórje kifejezésére felhasznált gasdaszervoMt számára előnyös kodon használatnak megfelelően adaptálhatjuk /feresjean Óo teáit Gene 18, 199-209 /1982/JT. Ügyelnünk kell arra, hegy az ily módon kapott 988 nem tartalmaz paroiália szekvenciákat· amsly a rokonbindns vektor felópitésót megnőhoziti /pl* nemkívánatos restrikciós ensin hasítási hsly beiktatásával/ vagy a pollpoptld kifsj esdadt negaMdlyossa*
A fentenlitott rokonbindns vektorok kialakitdadra igen nagyssánú vektor folhassndlható· pl* a 200 986 ss*
- 7 — európai közzétett szabadalmi bejelentésben leírt vektorok. A felhasználható vektorok as ismunotoxin hibrid fehérjét kódoló DNS transzkripaiójához és tranazléclójához szükséges elemeket továbbá a vektornak a gasdaszorvesetbon való fenntartásához és roplikáoiójáhos szükséges elemeket tartalmasnak· A találmányunk szerinti rekombináns vektorok kialakításához szükséges vektorok megválasztása és a fantomlitott rekombináns vektorok* kai keepatibilia egysejtű gasdasservesotok kiválasztása a szakember kötelező tudásához tartozik·
A találmányunk szerinti rekombináns vektorokat előnyösen oly módén állíthatjuk elő, hogy valamely iamunotoxin hibrid fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns vektort oligonuklootid által irányított hely-speeiflkua wtagonésis módszerrel módosítunk· A módszert Morinaga és tsai Írták lei Bie/feohnology 2. 636-639 /1984/· A fenti, valamely in&unotoxin hibrid fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns vektorok példájaként a fontomlitott ρΏ.310 plasmidot említjük meg·
Az imaunotoxin hibrid fehérje találmányunk szerinti kifejezésének módja a felhasznált kifejezési vektorból és gazdaszervezettől függ· A kifajssési vektort tartalmazó gazdaszervezeteket optimális növekedési körülmények között tenyésztjük· Az exponenciális növekedés vége felé -amikor ez időegység alatti sejtszám-növekedés csökkenni kezd - az immunotoxin hibrid fehérje kifejezését indukáljuk, azaz a fehérje DI8 kódolását átírjuk és as átirt mBIS»t lefordítjuk· Az indukciót oly módon végezhetjük el, hogy a táptalajhoz valamely induktort vagy do-repreaazort adunk vagy egy fizikai paramétert /pl. hőmérsékletet/ megváltoztatunk·
- 8 A gazdaszervezetben termelt immunotcxin hibrid fehérjét a aejt speciális transzport Mechanizmusokkal választja ki vagy ez a fehérje a sejt feltörésével izolálható· A aejt mechanikai úton £Charm és teái: Meth· Bnzmol· 22» 476-556 /1971/enzimes kezeléssel /pl· lizoaimos kezelés/ vagy kémiai módszerekkel /pl· detergens kezelés vagy karbamiddal vagy guanidin-hidrokloriddal végzett kezelés atb·/ vagy ezek kombinációjával törhető fel.
Bukarióták esetébe» a sejtekből kiválasztott polipeptidek prokurzor Molekula alakjában szintetÍzdiódnak· Az un· szignálpeptid hasításával jutunk az érett polipeptidhez* Minthogy prokarlóta gazdaszervezetek nem képesek az eukarióta szignálpoptidok lehaaitására a prekurzor molekulákból, az eukarióta polipeptideket prokarlóta gazdaszervezetekben közvetlenül érett formájukban kell kifejezni· Az AUG transzlációs atart szignál/·» a DBS szintjén az ATG kodónnak felel meg/ következtében a prokarlóta gazdaszervezetben szintetizált valamennyi polipoptid az B-végcsoporton motionln-maradékot tartalmaz· A felhasznált kifejezési rendszertől és feltehetően a kifejezendő polipeptidtől függően bizonyos esetekben ez a B-torminália metionin-maradék lehaaad·
A találmányunk szerinti immunotaxin hibrid fehérje ismert módszerekkel lényegében homogenitásig tisztítható· B célra pl· az alábbi tisztítási módszerek alkalmazhatók: különböző sebességekkel végzett centrifugáidéi ammónium-Bzulfátos kicaapáat dialízis /normál nyomáson vagy vákuumban/i preparativ izoelektremos fókuszálás> preparativ gól elektroferdői· vagy különböző kromatográfiás módszerek· pl· gélssüréa, nagy tel* jeaitőképeeségü folyadék-kromatográfla /HPLC/, ioncserélő krematográfia, fordított fázisú kromategráfia és affinitás kromatográfla /pl· Bluo CL-óB-n vagy hordozóhoz betett IIr»2R»o vagy XL-2 vagy Psoudomenas exotoóin ellen irényttott menoklonális antltoetok/·
A találmányunk szerinti tisztított imunotoxin hibrid fehérjét Omegában ismert sódon alkalmazhatjuk különböző botegoégok kezelésére, igy pl· autoismnn thyrolditis, 1· típusú diabetes, rauoatoid arthritis· Crohn-félo betegség ós az immunreagálás aberráns szabályosásával kapcsolatos máe betegségek esetében· Az isnuaetoxía hibrid fehérje továbbá allograftok és tsorves transsplantátumek kllBkése esetében az tamunreagálás visszaszorítására alkalmazható·
A találmányunk szerinti eljárással előállított isaaunotexln hibrid fehérjéket a fenti klinikai indikációk kezelése oéljóból adagolhatjuk melegvérű emlősöknek. A hatóanyag bármely megfelelő módszerrel beadható, igy pl· parenterália úton, előnyösen infravénásan, szubkutánsan vagy intramuezkuláriaan. A szükaégos dózis természetesen a kezelendő állapottól, annak súlyosságától, a kezelés időtartamától és az adagolás módjától függ· Slőnyösen alkalmazhatunk sterilre szűrt llofilizált fehérjét tartalmazó gyógyászati készítményeket, esélyekből a felhasználásra kész gyógyszörformát felhasználás előtt szokásos módon készítjük el· A találmányunk szerinti eljárással előállított immunotoxln hibrid fehérjét tartalmazó gyógyászati készítményeket önmagában ismert módon állíthatjuk elő oly módon, hogy az immunotox in hibrid fehérjét gyógyászatllag alkalmas kompatibilis hordozóanyagokkal összekeverjük· Hordozóanyagként pl* puffsrekot, stabilizáló szorskst, bakteriosztatikus anyagokat valamint a paronterália adagolásra alkalmas gyógyászati készítmények előállttémánál használatos exoipienaeket és adalékanyagokat alkalmashatunk·
- 10 Találmányunk · fenti gyógyászati készítmények előállítására is kiterjed·
Találmányunk részleteinek tüzetes imertetése céljából az ábrákra hivatkozunk·
Az 1* ábrán az IL2-PE40 fúziós fehérje kifejezésére felhasznált találmányunk szerinti plazmid felépítését vázlatosan /nem mérethüen/ ábrázoljuk· Ez a fúziós fehérje a hiteles humán IL-2 szekvenciájának megfelelő amino végcsoportot tartalmazó humán 11-2-t és kívánt PB taxin tartományt /azaz PE40/ foglal magában·
A 2· ábrán az Asp2IL2-PE hibrid fehérjének az irodalomból ismert pHL310 plazmid készítésénél felhasznált cDNS klón DKS szekvenciájából megjósolt szekvenciáját tüntetjük fel.
A 3· ábrán a találmányunk szerinti pRC233/IL-2/PE40//desAaP2 kifejezésével termelt IL2-PE40 hibrid fehérje szekvenciájának meghatározásakor kapott első 15 aminosav-maradékot mutatjuk be.
A 4. ábrán az IL2-PE40 tisztításának menetét ismertetjük*
Találmányunk további részleteit az alábbi példában ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat bármilyen formában e példára korlátoznánk* • 11 LÍLU nikrogrens pRC233/IL-2/dolta tat DNS-t Tth 111 I-el /New Bngland BiolBbs, Boverly, Mess·, 0·8·Α«/ feltárunk, majd Klenow DNS polinerás /Bothesda Researoh Laboratories, Bothssda, Maryland, U.S.A·/ felhasználásával 4 deoxiribonukleotid-trifoszfátot /dűl/ betöltőnk. Venoles extrakoló után a DNS-t Xba I-ol /Boehringer Mannhein, Xannhoin, VSaX/ teljesen fel* tárjuk· A betöltött 2,6 kb Xba X/Tth 111 x fragnenst olektre* férésié után, tikoson? olvadáspontú tisstitett agaróson karosa* tül történő oluálással Blutip oaalop /Sehloioher Ős Sohuoll, Kbono, Sav Hanspshiro, 0·3·Α./ felhessnálásával isoláljuk. Kb· 2 nikrogram DNS vektort nyerünk ki·
Aa insort /teiktatott/ fragnenst a pHX310 plasmidból ssárnastatjuk la /261 671 közzétételt szánú európai szabadalni bejelentés/· Ba a piacaid a bakteriofág f7 proletártól lefelé elhelyezkedő Aep22X2-PB40 szekvenciákat tartalmasa. 20 ^ug PB310 DNS-t Boa Rl-el /New Bngland Biolaba/ teljesen félté* runk, majd Honon DNS polimerázzal 4 dNT?-t betöltőnk· Vonalas axtrakció után a DHS-t Xba I-el teljesen feltárjuk· As 1,4 kb fragoenst a fenti siódon tisztítva voktor-fragnenst nyerünk· Kb· 1,2 ntkrogram beiktatott /insert/ DNS*t nyerünk ki·
A rskonbináns kifojosési vektor kialakítása céljából 320 nanograxx 1,4 kb fragnenst /pHL310, Xba X/Beo Rí betöltve/ 50 nanegras· DB8 vektorral £pR0233/Il*2/delta tat, Tth 111 X betöltvg7 összekeverünk, lseket a DBS-oket pufforben /6,5 «Iliinél Tris-HCl, pH 7,4 0,1 mól nátriusHklorid, 4,5 millinól magnézium-klórid, 100 nillinól 2-oarkapto-etanol/ 1,0 millimól ASB és T4 DNS ligás /New Bngland Blolaba/ jelen*
- 12 létében ligáljük· A ligáeióe roakoióelogyet 15 *0*on 2 órán át inkubáljuk. A reakcióolegyhez további T* 05 ligást adnak ás as elegyet 4 ®0~on 18 órán át inkubáljuk. A ligás inaktiválása báljából a ligáeióe «lágyát 65 ®C-cB 5 órán át nelogitjük, aajd az adott «estben jelenlevő OS Beülő vektor linearizáláea «Óljából Tht 111 I-el feltárjuk. A ligáeióe elegy egy ráesőt esután pBK248«Ite plasáidoí tartalaasó kompetens X. coli MC1061 sejtekké alakítjuk. As E. oall MC1061 tőrsa és a pBK248«Ite plasaid as Acarican fyp« Culturo Golleetion intőésénynél ATCC 53338 illetve AfCC 33766 szánén férhető hozzá. As E. «éli BC1061 gasdatörso ás a P^ proaoter hőmérsékletre érzékeny roprooozorát kódoló keapatibilie pRK248cIts piacaid a öcekeabor scáaára jóliaaert ás as alábbi irodai»! helyeken került laaortotéeroi Oaaadaban óe teáit J. Xol« Bioi. Jj&, 179-207 /1980/ óe Bemard és taaii Mothedo Bnsyaol. 68, 482*492 /1979/. As B. coll sejteket Ifaniatie és teái által leírt eljárással toeesük keopotenseéi Molooular Olening;
A habératory Jtaual··, Celd Spring Berber laboratery U.S.A., 249-255« oldal /1982/.
A kapott telepeket a helyse rekeabinána vektorra piacaid ΒΒ8 ainilicátua elkéacitéeével /faniatia Őa teáit lásd fant, 366-369 oldal/ és Bee BX-ol, Xba X-eí és Bgl ΣΧ-ol végzett restrikciós feltárással eoroenoljttk· A aagfölelő piacaidét tartalmazó két telepet £“jalükt pBC233/II^2/PB40/doaASP2jr fehérjoteraelésro tovább analisálunk. Á két telep tenyéssoteit /jolükt 4* 4 és 05/30 ®0-on 0Βδ<χ^»0,5 eléréséig tenyésztjük, aajd a fehérjeszintézis beindítása céljából 42 ®C-ob OBgOO -1,0 érték eléréséig tartjuk. As indukált sejtek • · pollotjoit Laommli minta pufforbon £Xaommli, Matúra 227· 680-685 /1970/^/, ás teái által lairt módon végnett liaison! extraháljuk· A pellotek poliakrilsmldgől olsktroforésis snaliziss ont mutatja, hogy mindkét tenyészet a várt 54 kilodaltonos fehérjét tormolli ez a fehérje az indukálatlan tényérzetekben nem volt jelén· Patkány /egér/ CTLL-ol és más Böjtökkel végzett maghatározás szerint a # 4 kiónból nyert cxtraktum is jelentős bioaktivitást mutat· Az alkalma zott meghatározási módszert és a kapott eredményeket az alábbiakban ismertetjük:
_ plazmidot
A pRC233/IL-2/PB40/ÓeaASP2Vtartalmazó #4 klón tonyéezetet használjuk fel 20 literes fermentációs saras beoltásá hoz· A formontlóből nyert sejtokot a leírt módon kezelve extraháljuk és tieztltjuk az XL2-PB40 fúziós fehérjét· Az IX2-PB40 teljes tisztítási eljárását vázlatosan a 4« ábrán tUntatjuk föl.
Ssolubilizálás és a ronaturálás céljából az öeozoo műveletet 2-8 °C-on végossUk el, feltéve, hogy máét nem közlünk· A megfagy«estott B· coll sejtokot felengedjük és 50 millimól trisz HCl-ben /pH 8,0, 1 millimól BOTA-t tartalmaz/ ssusspendáljuk· /4 ml/g nejt/· A sejt-szuazponsiót 6x30 másodpercen keresztül Sonifier Coll Disruptor 350 /Brassón Sonic fasor Co·, farmingdalo, Bem fark, USA/ készülék segítségével pulsáló ultrahangos kezelésnek vetjük alá· A feltört sejteket Sor vall RC-5 centrifugában /Púpont Vilmlngton Delavare, USA/ SS-34 forgórész felhasználásával 10000 g mellett 20 percen át centrifugáljuk ée a pollotot összegyűjtjük· A pollotot 5 ml/g eejt 7 mólos guanidin-hidroklorid /GuHCl/ — 14 • · *··· · · * ...
• · · · · · ·* ... ♦ « » • * · · · · oldatban, 0,1 mólos Trisz-HCl-ben £pH 8,0» 1-1 millimól BDtA-t és ditiotreitet /DDT/ tartalma^ szuszpendáljuk és a korábbiakban leirt «ódon ultrahanggal kezeljük. Az elegyet 60 percen át keverjük ón a folülúszót centrifugálással összogyűjtjük. Ezután 80-szoros mennyiségű PBS-el /foszfáttal puffereit só-oldat, pH 7,4· Whittaker M.A. Bioproducts, Valkersvilla, Maryland, USA/ hígítjuk Ős egy éjjelen át keverjük. A hígított extraktumot OSA forgórész segítségével 24000 g mellett 20 percen át végzett centrifugálissal derítjük vagy 0t8/0,2 yu szűrőn átszűrjük.
As IL2-PB40 receptor-affinitás tisztításához a derített extraktumot használjuk kiindulási anyagként, majd kation-cserét és méret-kizárásos folyadékkromatografálást alkalmasunk. Az B. coli oxtraktumban levő IB2-PB40 aktivitás a receptor oszlopon kvantitatívon megkötődik| ezt az igazolja, hogy az áthaladó anyag nőm sutát aktivitást* A receptor oszlopról a megkötött XL2-PK40 aktivitás kb. 98 %-át visszanyerjük. Oél áthatolási adatok, reduktív és nem-reduktiv körülmények között végzett SDS-PAOB analízis valamint bíolótisztitott glai meghatározások szerint a rocoptor-affinitásYanyagban redukálható és biológiailag inaktív IL2-PE40 aggregátumok” vannak jelen, as IL2-PB40 fő biológiailag aktív oldható monomer formája mellett. Ha a receptor-affinitás tisztított terméket pH 5,0 puffőrrel esőmben dialízáljuk, az inaktív anyagok nagyrésso kiválik. Kationcserélő kromatográfla segítségével a kátioncserélő oszlopon meg nőm kötődő, erősen UV adasorboáló / Λ ,^»260 υη/ nem-fohérjoszerkezetü szennyezést eltávolítjuk. Bs a lépés a fajlagos aktivitás növekedőmét • · · .
·· · · · · · · * * · · · · • 9 · · . · . * * 15 orodaényozi· As IL-PE40 készítőén? nearoduktiv körülmények kösött végsott SDB-PA01 alapján nagy aolekulasúlyú ssennyesésektől aentea· Bár a tlastaság asáaettovően no* oaelkedik, a gél-áthatolás as alacsony aolekulasúlyú szennyezések ős ondotexin eltávolítása alatt hassnoanak bisonyul· Aaonnylbon a gélasüréaoa lépést asseptikus körUlaényok kösött végossük el, a végső késsitaény kiau tatható asnnyioégbon non tartalaaa ondotoxint. 1 lépés aegiteégévol aa X12-BB40 előnyöaen vihető ét a végső táraié pufferbo.
As XB-2B/p55/ /jelei IL-2»-0-Hae/ oldható formájának előállítási és tlastltáei eljárásait Haklal és tsai Írták le. £X Bioi. Oboa· 262, 17336-17341 /1987^ A tisstitott IL-2H-t 1,05 ag/al gél kapcsolási sűrűség aellett HuGol P-AP o poll-H-hidrcxi-szukoiniaidon /500 A, 50 /ua, separation Xndustrloo, Motuchen, Boa Jersey, V8A/ iaasbilisáljuk és as XX—2PB40 tisstitásáhos affinitás-edeserbonsként hassnáljuk fel, a Ballon éa tsai által leírt nődén £bio/Toohnology 1195-1198/ /1987/JT.
Két adapterrel folssorelt Anicon 0-22x250 osslepot /Anicon, Mv. V.R· Orace és Oo·, Danvers, Kasa·, USA/ 40 al iaaoblllsált IL-2B géllel neg tölt tok· As oszlopot foszfáttal pufforolt só-oldattal /PBS/ egyensúlyba hozzuk. As oszlopra 7 nl/pore sebességgel 7 liter extraktnaot viccünk fel /35 g sejtből nyert öess-extraktun fele/· As osslopon áthaladó folyadékot Ollóén 111B ÖV detektorral ollenőrlssűk és Xippon Zenen regisstráló borondosésen /Gilsen Medloal Bloctronioe» Inc., Mlddloton, Viccesein, USA/ regisstráljuk· As osslepot BBS-ol addig aossuk, nlg a 280 na elnyelés as alapvonalra • « • 16 * visszatér· Az oszlopról az X12-PB4O aktivitást 3 mólos kálium-rodanid oldattal 50 nillisólos foszfát-puff ősben /pH 6,0/ eluáljuk. A kálium-rodanid törzeoldatot folhaaználáe előtt aktlvszenos szűrőn való átszüréosol ezintolenitjük· Az sluált IX2-PB40-ot 2 liter 50 millimólos nátrium-acatáttal /pH 5,0/ szemben dializáljuk, 12-14,000 moUkulatömogU kizárásos dialízis csövekben· A diallzátumot az esetleg jelenlevő kivált anyagok eltávolítása céljából centrifugáljuk· A kapott átlátszó dialisátum a kationcsoréléses kromatografáláahoz felhasználható·
Az előző lépésnél kapott dializált I12-PS40-t 1,6*15 cm méretű gyorsfolyású CM oszlopra visszük fel /Pharmacia 1KB Biotechnology Inc·, Piacateway, Hsw Jersey, USA/ 3,3 millilitor/porc átfolyási sebességgeli az oszlopot 50 millimólos nátrium-ecetáttol egyensúlyóztuk Ki /pH 5,0/· Az oszlopot a kiegyensúlyozáshoz felhasznált pufforral a msgnem kötött anyagok teljes eltávolításáig mossuk· A megkötött IX2-PB40-t ez oszlopról 0,5 mólos nátrium-kloriddal 50 millinóloe kálium-foszfétben /pH 6,0/ eluáljuk, majd Hí 10 membránnal ellátott keskenycmtornáé kevorőoellás Amicon betöményitŐ berendezésben bepároljuk·
Pharmacia K25/100 oszlopot 90 cm magasságig sepharoso* 01-6B-01 /Pharmacia 1KB Biotochnology Inc·/ megtöltünk· Az oszlopot 50 millimólos kálium-foszfáttal /pH 6,0| 0,15 mól nátrium-kloridot tartalmaz/ egyensúlyozzuk ki| az átfolyási sebesség 0,7 ml/perc. A botöményitett I12-PB4O-et /20 ml/ az oszlopra folvieszük és a kiegyensúlyozáshoz felhasznált pufferral hívjuk elő· Az oszlopon lejátszódó folyamatokat az affinitáslépésnél leirt módon követjük nyomon· 1KB Ultra • · · · · · ·· ··· ·♦ · * 17 Rao-7000 frakció összegyűjtő berendezésben /XKB-Produktor, Brömmer, Svédország/ 6 perces frakciókat gyűjtünk össze· Az IL2-PB40 aktivitásnak /~ 54 kW megfelelő csúcsokat összegyűjt j ük, 0,5*1,0 mg fehórjo/ml konoontráoióra botömónyitjűk, 0,2 yu szűrőn átszűrjük Ős -20 °C«on fagyasztva tároljuk· A gél-áthatolásos lópőst aszeptikus körülmények között végezzük el,
A találmányunk szerinti IL2-PS40 bloektivltását in vigro határozzuk meg oly módon, hogy vizsgáljuk a nagy XL-2 affinltású llmfoid sejtekben lejátszódó fehérje-szintézisre kifejtett gátló hatását· A fenti vizsgálatoknál alábbi sejteket alkalmazunki patkány /egér/ CTLL vonalat tartalmazó sajtok /“a CTIú. hosszú Idejű, IL-2-dependens patkány /egér/ f-sejt* vonalg AfOC deponálási szánt KB 21^1 nagy XL-2 receptor /ID-2R/ affinitás kifejezése céljából oonoanavalln A-val /Con A/ történő inkubáláasal aktivált patkány /egér/ aplonooitáki és nagy XX-2B affinitás kifojoséao céljából vagy·* loukocita tonyóssotökben /KM blaast/ történő inkubáláasal aktivált humán perifériás vér limfeoiták· Bogativ kontrollként bármely olyan sejt felhasználható, amelyből az IL-2R hiányzik, pl· patkány /egér/ maetocitÓM vonal /ATCC Ho.
TIB 64/,
Patkány /egér/ Con A-aktivált aplenooiták oly módon állíthatók elő, hogy C57B1/6 egerek splenooitáit 5 % hővel in.ttlvílt «..« <. 2 /UK/al 0·. A-t tartalmazó táptalajban 1 · 10b oejt/al sűrűség «ellett inkabálunk· Három napon át 37 ®C-on végzett inkubálás után a splonooitákat a tenyészetből Összegyűjtjük és friss, Con A-t nem tartalmazó táptalajjal háromszor mossuk· A humán MLC * 18 • · · · · ·· ··· ** .
blaeztok előállítása Góljából lát normális bnkőntes donorból vett perifériás vár menonukleáris sejteket Gately ás teái által leírt módcserrel izolálunk /~J. Háti. Can. inat· 6£, 1245-1254 /1982/JT. ás egyik donortól származó leukooitákat /«atimulátor sejtek*/ a második donor loukocitával /«reagáló sejtek*/ való üsssekeverés előtt rbntgeneugárzásnak /1500 rád/ vetjük alá· A stímulátor sejteket /1 · IO6/«1/ és a reagáló sejteket /1 · 106/ml/ ősssesen 6 napon át 37 °C-on együtt tenyésztjük· A tényásatás 4. napján minden tenyészethez 50 ogység/ml végső koncentrációban rekembináns humán Uf-2-t /rIlr-2/ adunk· A 6· napon a sejteket őessegyüjtjük és a vissgálat elvégzése előtt friss közeggel háromezer mossuk· A meghatárosást oly módon végezzük el, hogy a sejtek, rIL-2 ás IL2-PE40 50 yul-es aliguot részleteit lapostenokü mikrolemoskők /pl· Oostar 3596/ mélyedéaoiben öaesskeverjük·
A meghatározásnál közegként 5 % hővel inaktivált magzati azarvasmariiasséruMmal, 0,1 millimól nom-eaazenoiália aminősalakkal, 1 millimól nátrium-piruváttal, 2 millimól L-glutaminnal, 5 · 10$ mól 2-merkapto-etanollal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 ^ug/ml streptomicinpel és 50 /Ug/ml gentamicinnol kisgéazitett loucinmentas Saglo-félo minimális esszenciális tápkösegst alkslassunk· Bsután 2 · 10* sojt/mélyodéo koncentrációban humán és patkány /egér/ límfoblasztokát adunk hozzá ős a patkány /egér/ sejtvonalakat 5 · 103 eojt/mőlyedáa koncentrációban alkalmazzuk. A tenyészeteket 24 órán át /Cfü Ős P815/ vagy 48 órán keresztül apumén Ős patkány /egér/ limfeblasztej^ 37 ®(M>n inkubáljuk· Ezután minden mélyedéshez ^B-leucin /^B»leu/ 25 ml*es aliquot részeit adjuk ·· *··· • 4 • · 4 ·
- 19 /20 yuOi/nl/· A tenyészeteket további 6 órán át 37 °0-on in* kubáljuk, najd üvegszálas szűrőn összegyűjtjük# A sejtfehérjóbe való ^H-leucin beépülést folyadék szcintilláciÓs számlálással «érjük· Az összes értéket 3 «ints átlagaként & 1 sm adjuk nsg·
Az IL2-PE40 inkubáció eredményeit nagy U>2B affinitásé. /IL-2B*/ patkány /egér/ CTIiL sejteken ás IL-2R hiányos /IL-2R*/ patkány /egér/ P815 nasstooitóma sajtokon az 1· táblázatban foglaljuk össze· Az IL2-PE40 az IL-2R-tartalmú CILI sejtek fehérje-szintézisének nagyon erőteljes inhibitora· A kísérletek szerint az IL2-PE40 0,03 ng/nl ás 0,16 ng/nl közötti koncentrációban a CTLL sejtek fehérjeszintézisét 50 %-ban gátolja· Ezzel szemben az Ur-2R Hiányos ΡΘ15 sejtek fehérjeszintézisének 50 £-os gátlásához kb. 5-6 /ug/ml IL2-PE40 szükséges· így tehát az ZX^SR-tartalmú patkány /agár/ sojtvonalakkal és Xb-2R-negativ sejtvonalakkal szemben toxikus XI2-PB40 koncentrációk különbség: a kísérletek szerint több «int 10*000· Ez azt Kutatja, hogy az 1&-PB40 a nagy IIr-2a affinitásé sejtekkel szemben szelektíven toxikus.
·· ·*·· • · · · · * ·· ··· ·· · • · · · · · ·· *·· · · ·
- 20 ι.
I12-M40 < Α8ρ2ΙΙ£-ΡΜ0 K<tló h»tá»a m W-ffl* patkto, /«<»/ cm, «» IL-2a~ /»»<»/ MIS Mlntfaffa.
»IL-2 IL2-PS4O Aen .
/,ug/nl/ /ng/al/ Ιώ-ΪΜΟ JH-Leu tmdnméa ' /n»W nu,u pBij-b.
1. kísérlet
| 0 10 | 0 0 | 0 0 | 233 t 58 67,965 + 2241 |
| 10 | 4 | 0 | 197 i 117 |
| 10 | 0.00 | 0 | 2,103 x 562 |
| 10 | 0.16 | 0 | 11,841 t 700 |
| 10 | 0,03 | 0 | 23,712 $ 2829 |
| 10 | 0 | 4 | 312 $ 337 |
| 10 | 0 | 0.80 | 2,225 t 544 |
| 10 | 0 | 0,16 | 26,560 J 1467 |
| 10 | 0 | 0,03 | 60,218 t 5415 |
| 0 | 0 | 0 | 52,338 $ 3890 |
| 0 | 50,000 | 0 | 600 $ 183 |
| 0 | 10,000 | 0 | 16,860 ± 1919 |
| 0 | 2,000 | 0 | 36,849 t 1062 |
| 0 | 400 | 0 | 50,784 t 4038 |
| 0 | 0 | 50,000 | 990 t 181 |
| 0 | 0 | 10,000 | 17,314 i 420 |
| 0 | 0 | 2.000 | 40,219 t 1884 |
| 0 | 0 | 400 | 53,087 jt 1813 |
2· kimérlak
| 0 | 0 | 0 | 5 £ 51 |
| 10 | 0 | 0 | 48,626 t 3643 |
| 10 | 4 | 0 | 419 t 355 |
| 10 | 0,80 | 0 | 3,666 + 295 |
| 10 | 0,16 | 0 | 23,775 t 1312 |
- 21 /folytatás/
CTLX-bs
P815-be
3. kisáriét
| ó | 0 | 0 | 1,223 $ 219 |
| 10 | 0 | 0 | 47,873 ♦ 2150 |
| 10 | 4 | 0 | 94 t W |
| 10 | 0,80 | 0 | 2,962 $ 126 |
| 10 | 0,16 | 0 | 21,903 ♦ 25 |
| 10 | 0,03 | 0 | 32,825 i 2307 |
| 0 | 0 | 0 | 31,987 t 3009 |
| 0 | 10,000 | 0 | 6,089 t 409 |
| 0 | 2,000 | 0 | 21,409 3 844 |
| 0 | 400 | 0 | 28,730 $ 1022 |
A 2» táblásat szerint as Z12-2M0 primer patkány /egér/ vagy humán llmfoblasstokra kifejtett hatását további vizsgálatokkal határozzuk meg. As IL2-PE40 kb· 4 ng/ml IL2-P840 kenoontráoióban 50 $-kal gátolja a Gon A««ktivált patkány /egér/ splenositák fehérjeszintézisét· Hasonlóképpen, az XX2-PB40 kb· 11 ng/ml kenőéntráoióban 50 %-ben gátolja a humán KW blaostok fohérjoasintésisét· ·· ·· ···· • · · · · < ·· · «· tt « ιι. tftifaat lia-MMO adtld batdaa O«n S^ctiMlt Mtkto /«»<r/ anlanaalttt
| és vsoea leukooita-tsnréssetsktNin aktivált busán llafsblass- | ||||
| tok fehfaiaesintfaiefae | ||||
| rlb-2 | IL2-PB40 | Asp2 II2-PP40 /ng/sl/ | 3H-Lsu beépülés | |
| //Ug/sl/ | Zng/al/ | patkány /egér/ Oon A blass* tokba | busán MLC biankókba | |
| 1. ki-e MiÜlli | ||||
| 0 | 0 | 0 | 763 J 273 | |
| 10 | 0 | 0 | 19,135 + 936 | |
| 10 | 500 | 0 | 1,521 i 96 | |
| 10 | 100 | 0 | 2,765 + 50 | |
| 10 | 20 | 0 | 4,579 t *54 | |
| 10 | 4 | 0 | 0,977 + 352 | |
| 10 | 0,8 | 0 | 14,703 χ 892 | |
| 10 | 0 | 500 | 1,900 ♦ 191 | |
| 10 | 0 | 100 | 2,533 ♦ 04 | |
| 10 | 0 | 20 | 4,386 x 70 | |
| 10 | 0 | 4 | 10,030 + 570 | |
| 10 | 0 | 0,8 | 14,761 , 1364 | |
| 2· ki-a •tolat* | ||||
| 0 | 0 | 0 | 1,037 + 19Θ | |
| 10 | 0 | 0 | 18,744 i 511 | |
| 10 | 500 | 0 | 1,740 ♦ 199 | |
| 10 | 100 | 0 | 4,384 t 180 | |
| 10 | 20 | 0 | 7,450 t 624 | |
| 10 | 4 | 0 | 12,106 822 | |
| 10 | 0,8 | 0 | 17,198 j 859 |
• A fenti tdkldsatban as 1. 4a 2. kisfalat adatait as 1· táblásat 1. ás 2· kísérletével eaonee kísérletből nyertük· ·· ···· ·· »··· • · · « · «
A fenti kísérletek során az IX2-PE40 ás a technika állásához tartozó ismert Asp^Xia-PBAO biológiai aktivitását patkány /egér/ CTUr-en, P815*ön és Con A-aktivált splenocitáken végzett vizsgálatok segítségével hasonlítottuk össze· A vizsgálatok szerint az IL2-PB40 és Asp2IL2-PB40 biológiai aktivitása nagyon hasonlónak bizonyult·
A fentiek szerint elkészített IL2-PK40 mintát az oszlop után fluoresscamin származékot képező műszer segítségével aminosav-elemsésnek vetjük alá ^Pan és steins Amlno aold analysis with postcclumn fluorescamine dérivatizetion» ttMethods of protein miorocharactorization, Shivoly, J-K· /kiadó/, The Humana Bross Inc·, Clifton, HOw Jersey, U.S.A. /1986/J7· Az elemzés előtt a fehérjét 4 % tioglikolsavat tartalmazó 6 n sósavval 110 °C-on 20-24 órán át vákuumban hidrolizáljuk· Az eredményeket a 3« táblázatban foglaljuk össze·
A mintával szekvencia-analízist is végrehajtunk· A 3· ábrán feltüntetett kát szekvenciát kapjuk· A mintában levő rekombináns fehérje 25 %-a az B-végosoporton további motinnin-maradékot tartalmaz· Azt találtuk, hegy az B-végállású amincsav-szekvencia /az első 15 aminosav, az egyik szekvencia B-terminális metionin-marad ókétól eltekintve/ a természetes humán IL-2 M-terminális aminosav szekvenciájának felel meg· Megjegyezzük azonban, hogy a 3· táblázat eredményei a minta előzetes analízisén alapulnak· Kontrollként vakpuffert nem elemeztünk és BHO, CYS és TBP meghatározást sem végeztünk /Oraem határoztuk meg/· *> 24 *
IU-?Mí MOBB—V bmUiIm
| Anlnoaav | Sa ámított | Maghatározott |
| ASP /0/ | 40 | 40,0 |
| THR /T/ | 29 | 27,6 |
| SBR /S/ | 27 | 25» 5 |
| aiAJ /B/ | 65 | 64,2 |
| PRO /P/ | 32 | BD |
| OLY /0/ | 41 | 40,7 |
| Λ11 /1/ | 51 | 51,6 |
| CYS /0/ | 7 | KD |
| YAL /Y/ | 24 | 23,1 |
| MBf /MZ | 4 | 4,0 |
| ILB /1/ | 23 | 21,1 |
| ZBU /W | 60 | 63,3 |
| TYR /Y/ | 14 | 16,2 |
| PHB /P/ | 15 | 16,0 |
| KIS /K/ | 9 | 9,1 |
| LYS /K/ | 14 | 15,5 |
| ARO /R/ | 34 | 33»3 |
| w M | 6 | BB |
VB » n·* határoztuk Mg·
Claims (5)
1« 21járás immunotoxin hibrid fehérje előállítására, amely az aminovégosoparton rokombináno humán lnterleukin-2 szekvenciát tartalmaz ás a fenti hibrid fehérje karbexi-végcsoportja Pseudomonas exetoxin valamely tartományának szekvenciáját tartalmazza ée amelyre az jellemző, hogy a fenti interleukln-2 emino terminális szekvenciája a természetes humán intorleukin-2 amino terminális szekvenciájával azonos és amely adott esetben az B-végcsoporton további metionin-maradékot tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a/ a fenti immunetext?hibrid fehérje kifejezésére képes kifejezési pizzáiddal transzformált egysejtű gazdaszervezeteket fermentálunk) és b/ a fonti imaunotoxic hibrid fehérjét az irodalomból ismert módszerekkel tisztítjuk*
2« Az 1« igénypont szerinti eljárás olyan immunotoxin hibrid fehérje előállítására, amelyben e karbexil végosoperton levő fonti Psoudomcnas exotaxin a Psoudomonas exotoxin 40, aszal jellemezve, hogy a/ a fenti immunotaxin hibrid fehérje kifejezésére képes kifejezési plazmiddal transzformált egysejtű gazdaszervezeteket fermentálunk) és b/ a fonti immunotaxin hibrid fehérjét az irodalomból ismert módszerekkel tisztítjuk·
3. Síjárás az 1· vagy 2« igénypont szerinti immunotaxin hibrid fehérje kifejezésére képes egysejtű gazdaszervezet előállítására· aszal jellemezve, hegy valamely egyfajta gazdaszervezetet a fenti iamnnotoxin hibrid fehérjét kódoló D»S-t tartalmazd rekoabináns vektorral önmagában lenért mőden tranazformálunk·
4« Kijárás az 1· vagy 2· igénypontban meghatározott lamunotaxin hibrid fehérjét tartalmazd gyógyászati kőszitmónyok előállítására, azzal jellemezve, hogy a fonti immmotosin hibrid fehérjét megfelelő, gydgyáazatilag alkalmas hordozóanyagokkal összekeverjük·
5· Az 1· vagy 2· igénypontben meghatározott iamunotoxin hibrid fehérje felhasználáoa gyógyászati készítmények előállítására·
A bejelentő helyett a meghatalmazotti
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27235688A | 1988-11-17 | 1988-11-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU895908D0 HU895908D0 (en) | 1990-02-28 |
| HUT52154A true HUT52154A (en) | 1990-06-28 |
Family
ID=23039446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU895908A HUT52154A (en) | 1988-11-17 | 1989-11-15 | Recombinant interleukin-2 hybrid proteins. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0369316A3 (hu) |
| JP (1) | JPH02273193A (hu) |
| AU (1) | AU4474589A (hu) |
| CA (1) | CA2002854A1 (hu) |
| DK (1) | DK570589A (hu) |
| FI (1) | FI895456A0 (hu) |
| HU (1) | HUT52154A (hu) |
| IL (1) | IL92316A0 (hu) |
| MC (1) | MC2072A1 (hu) |
| NO (1) | NO894573L (hu) |
| PT (1) | PT92335A (hu) |
| YU (1) | YU219289A (hu) |
| ZA (1) | ZA898139B (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69019609T2 (de) * | 1989-07-07 | 1995-11-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Proteine und deren Herstellung. |
| FR2653020B1 (fr) * | 1989-10-17 | 1993-03-26 | Roussel Uclaf | Utilisation d'un polypeptide ayant l'activite de l'interleukine 2 humaine pour la preparation de compositions pharmaceutiques destinees au traitement des leucemies. |
| US5594107A (en) * | 1990-08-22 | 1997-01-14 | University Of Saskatchewan | Chimeric protein comprising an RTX-family cytotoxin and interferon-2 or interferon |
| US5273889A (en) * | 1990-08-22 | 1993-12-28 | University Of Saskatchewan | Gamma-iterferon-leukotoxin gene fusions and uses thereof |
| US5238823A (en) * | 1990-08-22 | 1993-08-24 | Veterinary Infectious Disease Organization | Interleukin-2-leukotoxin gene fusions and uses thereof |
| DE69132925T2 (de) * | 1990-08-29 | 2002-10-10 | Ct Hospitalier Regional De Nan | An stabile proteinkernstruktur gebundene proteinpolyliganden |
| US5571507A (en) * | 1992-02-25 | 1996-11-05 | Seragen, Inc. | Methods of treating diabetes |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
| DE3537461A1 (de) * | 1985-10-22 | 1987-04-23 | Hoechst Ag | Derivat des interleukin-2, seine herstellung und verwendung |
| US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
-
1989
- 1989-10-26 ZA ZA898139A patent/ZA898139B/xx unknown
- 1989-11-09 EP EP19890120754 patent/EP0369316A3/en not_active Withdrawn
- 1989-11-14 DK DK570589A patent/DK570589A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-11-14 CA CA002002854A patent/CA2002854A1/en not_active Abandoned
- 1989-11-15 HU HU895908A patent/HUT52154A/hu unknown
- 1989-11-15 MC MC892075A patent/MC2072A1/xx unknown
- 1989-11-15 IL IL92316A patent/IL92316A0/xx unknown
- 1989-11-16 NO NO89894573A patent/NO894573L/no unknown
- 1989-11-16 AU AU44745/89A patent/AU4474589A/en not_active Abandoned
- 1989-11-16 FI FI895456A patent/FI895456A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-11-16 PT PT92335A patent/PT92335A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-11-17 YU YU02192/89A patent/YU219289A/xx unknown
- 1989-11-17 JP JP1297759A patent/JPH02273193A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL92316A0 (en) | 1990-07-26 |
| YU219289A (en) | 1991-10-31 |
| DK570589A (da) | 1990-05-18 |
| AU4474589A (en) | 1990-05-24 |
| EP0369316A2 (en) | 1990-05-23 |
| CA2002854A1 (en) | 1990-05-17 |
| DK570589D0 (da) | 1989-11-14 |
| HU895908D0 (en) | 1990-02-28 |
| MC2072A1 (fr) | 1990-10-03 |
| FI895456A0 (fi) | 1989-11-16 |
| NO894573L (no) | 1990-05-18 |
| JPH02273193A (ja) | 1990-11-07 |
| EP0369316A3 (en) | 1990-11-22 |
| NO894573D0 (no) | 1989-11-16 |
| ZA898139B (en) | 1990-08-29 |
| PT92335A (pt) | 1990-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU764571B2 (en) | 5' ESTs and encoded human proteins | |
| Suzuki et al. | Isolation and characterization of mutations in the human holocarboxylase synthetase cDNA | |
| KR100219970B1 (ko) | 재조합 비만 단백질 | |
| JP2515308B2 (ja) | ヒト免疫インタ−フエロン | |
| KR920006879B1 (ko) | 고정제 단백질의 제조방법 | |
| KR20160067219A (ko) | 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 | |
| TW575581B (en) | Pharmaceutical composition for neutralizing interleukin-18 (IL-18) | |
| CN113637068B (zh) | 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l5t及其制备方法和用途 | |
| US5302701A (en) | Polypeptide having human fibronectin-like cell adhesive activity | |
| US5432261A (en) | Motlin-like polypeptide and use thereof | |
| HUT52154A (en) | Recombinant interleukin-2 hybrid proteins. | |
| WO1994000463A2 (en) | Production of hyaluronic acid by transeformed microorganisms | |
| JPH03503596A (ja) | 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 | |
| CN107530407A (zh) | 丙酰辅酶a羧化酶组合物及其用途 | |
| WO1993010233A1 (en) | Synthesis and purification of truncated and mutein forms of human ciliary neuronotrophic factor | |
| TW400384B (en) | A new cephalosporin C acylase | |
| JP2012511309A (ja) | Ｅｃ−ｓｏｄのカルボキシル末端のアポプチンタンパク質導入ドメインの融合蛋白質 | |
| JPH04502260A (ja) | Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ | |
| JP3104178B2 (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| US20190338001A1 (en) | Composition Containing SMAD Protein for Treatment of Autoimmune Diseases, a Fusion Protein Comprising SMAD Protein, an Expression Vector and a Method for Preparing the Same | |
| EP2650304B1 (en) | Antimicrobial peptide multiblock copolymer to be expressed on surface of cells | |
| JPH02500640A (ja) | 所定のポリペプチドと糖に対して親和性のタンパク質とをコードする核酸配列を含む組換体ｄｎａにより形質転換された宿主生物中で該ポリペプチドを製造する方法。応用、特にワクチン組成物の製造への応用 | |
| Chakraborty et al. | Overexpression, purification and characterization of recombinant salmon calcitonin, a therapeutic protein, in streptomyces avermitilis | |
| JPS6322190A (ja) | ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 |