JPH02500640A - 所定のポリペプチドと糖に対して親和性のタンパク質とをコードする核酸配列を含む組換体dnaにより形質転換された宿主生物中で該ポリペプチドを製造する方法。応用、特にワクチン組成物の製造への応用 - Google Patents
所定のポリペプチドと糖に対して親和性のタンパク質とをコードする核酸配列を含む組換体dnaにより形質転換された宿主生物中で該ポリペプチドを製造する方法。応用、特にワクチン組成物の製造への応用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
所定のポリペプチドと糖に対して親和性のタンパク質とをコードする核酸配列を
含む組換体DNAにより形質転換された宿主生物中で該ポリペプチドを製造する
方法、応用、特にワクチン組成物の製造への応用。
本発明は、所定の選択された特性を有するポリペプチド又はタンパク質の製造方
法に係り、該方法は該ポリペプチドをコードする′配列及び糖に対して親和性の
タンパク質をコードする配列を含む組換体DNAにより予め形質転換された宿主
生物を培養することにより実施される1本発明の方法の好適態様は、該ポリペ7
チドを不溶化(固定化)II!と接触させることにより該ポリペプチドを精製す
る付加段階を含む。
本発明は更に、上記組換体DNAを含むベクター、これらのベクターにより形質
転換された細胞培養物、並びに特にワクチン組成物の製造用としてのその使用に
も係る。
適当なベクターにより予め形質転換された宿主生物によりポリペプチド又はタン
パク質を産生させるための方法として複数のものが既に記載されており、該ベク
ターはそれ自体、この酵素又はタンパク質をコードする核酸を含み且つ形質転換
宿主生物中における該核酸の発現を司る調節要素、特にプロモーターの制御下に
適宜おかれた挿入配列により修飾されている。遺伝子(又は遺伝子き含むベクタ
ー)は一旦取得されると、ポリペプチドの永久的なソースになる。
新規ポリペプチドに関するこの遺伝子工学的アプローチにはいくつかの欠点があ
る。即ち、ポリペプチドはin viv。
で分解したり、宿主細胞に対して毒性であったり、あるいは細菌抽出物から精製
することが困難であったりする可能性がある。特に大腸菌を細胞宿主として選択
する場合、外来ポリペプチドをベクター(媒介体)の役割を果たす安定なタンパ
ク質、例えばβ−ガラクトシダーゼに触合することにより分解の問題を回避する
ことが既に提案されている。
ベクタータンパク質がハイブリッド中でその活性を維持し、例えばアフイニテイ
クロマトグラフイにより容易に精製されるならば、コーディング遺伝子を介して
ポリペプチドをベクタータンパク質に融合することにより、該ポリペ1チドの精
製を助長することもできる。このために、β−ガラクトシダーゼ、5.1ure
usのプロティン^及びイムノグロブリンが使用された。2つの核酸配列の開の
結合部に特異的配列を導入すると、ハイブリッドタンパク質の精製後、詰合(グ
ラフト)したポリペプチドを開裂することができる。
別の解決方法も提案されている。ある方法では、外来ポリペプチドが宿主細胞に
対して及ぼし得る毒性作用を避けるために、外来ポリペプチドを宿主細胞の細胞
質の外に運搬することを目的として、外来ポリペプチドをコードする配列をシグ
ナル配列に融合した。一般に抑制されたプロモーターの制御下にコーディング遺
伝子を1き、その後、細胞培養の最終増殖相で該プロモーターを抑制解除して外
来ポリペプチドの合成を誘導することにより、外来ポリペプチドの毒性効果の危
険を防止することも提案されている。
しばしば遭遇する別の問題は、例えば外来ポリペプチドが酵素から精成される場
合、こうして製造された外来ポリペプチドの活性を維持し難いことである。この
点では、外来ポリペプチドをコードする配列をシグナル配列に触合することから
成る上記方法は、特に使用される宿主細胞が細菌種に属する場合、細胞質よりも
還元性の低い媒体中で外来ポリペプチドの正常な折り畳み(repliment
)を得るためにも提案されている。しかしながら現状ではこれらの問題を解消す
ることはしばしば不可能であり、特に外来ポリペプチドが非常に大きい寸法であ
ることが明らかな場合は一層困難であった。結局、細胞質タンパク質を上記条件
下で形質転換細菌のm脂質からペリプラズム領域に運搬する試みは御飯に失敗し
ており、細胞質タンパク質は細菌の膜中に留まったままである。
また、現状では最終精製を実施することは困難である。
例えば、ハイブリッドタンパク質の場合、同一の宿主生物により同時に産生され
得たハイブリッドタンパク質のうちで正確に折り畳まれていない不活性なハイブ
リ・7ドタンバク質から正確に折り畳まれた活性なハイブリッドタンパク質を分
離することは現状では容易ではない。
更に、精製すべきタンパク質に対して親和性の分子を適当な固体支持体に固定す
るクロマトグラフィ法又は同様の方法により製造されたタンパク質を精製する揚
台、最終溶離操作中にこれらの親和性分子の一部が選択的に保持されたタンパク
質と同時に分離されないこともあり得る。こうして分離された親和性分子の割合
は非常に徴lであっても最終製品を「汚染」し、精製されたタンパク質の用途を
考慮すると有害である。また、該精製用のアフイニテイ力ラム自体の作成もしば
しば困難且つ費用がかかり、特に上記欠点を最小限にすることが不可欠であるこ
とが明白な場合はこの問題が一層深刻になることは自明である。
本発明の目的は、製造後に完全に発現され得る選択された特性を有するペプチド
鎖を含むポリペプチドを製造するために、簡単で、比較的廉価で且つ非常に有効
な用法でありながら、上記に明証したような問題を従来のどの方法よりも有効に
解消できる遺伝子工学的方法を提供することである。
従って本発明は、選択された特性を有する所定のペプチド鎖を含むポリペプチド
の製造及び精製方法に係り、該方法は、形質転換され培養された適当な宿主生物
中で、該ペプチド鎖をコードする配列と、ベクター(媒介体)ポリペプチドの1
又は複数の部分をコードするニスは複数のノ別の配列とを含むオーブンリーディ
ング相(A phase de 1ectureOυνerte)の組換体核酸
を発現させる段階と、該組換体核酸により発現されたハイブリッドポリペプチド
を該宿主細胞から抽出物として回収する段階と、精製段階とを含んでおり、該ベ
クターポリペプチドが少なくとも1種の所定の糖に対して親和性のタンパク質で
あり、該[ベクターポリペプチドの1又は複数の部分をコードする1又は複数の
配列」は、元の(完全な)ベクターポリペプチドの細胞質外への運搬(輸送)特
性及び前記所定の糖に対する親和性が該ハイブリッドポリペプチド中で維持され
るようなものであり、精製段階が前記ハイブリ・ンドボリベブチド抽出物を前記
親和性タンパク質と前記糖との相互親和性と適合可能な(eom−patibl
e)不溶化形態の対応する糖、特に重合糖と接触させる段階を含んでおり、糖に
固定されない物質を分N後、該所定のペプチド鎖を含むハイブリッドポリペプチ
ドを回収することを特徴とする。
有利には、本発明の方法は更に、ハイブリッドポリペプチドから該所定のペプチ
ド鎖を回収する付加段階を含んでおり、これについては追って説明する。
本発明の方法の−5様によると、組換体核酸に含まれるベクターポリペプチドを
コードする核酸配列は、その全体が、所定のペプチド鎖をコードする核酸配列の
下流又は上流に配置されている。
有利には組換体核酸は、所定のペプチド鎖をコードする核酸配列の上流に配置さ
れた、ベクターポリペプチドの第1の部分をコードする第1の核酸配列と、該配
列の下流に配置された、ベクターポリペプチドの第2の部分をコードする第2の
核酸配列と含んでおり、該第1及び第2の部分が再結合するとベクターポリペプ
チドの全体を表す、所定のペプチド鎖をコードする核酸配列が、このように修飾
(変性)されたベクターポリペプチドの細胞質外への運搬機能も所定の糖に対す
る親和性も変えることなく、ベクターポリペプチドをコードする核酸配列の2部
分の間に導入される条件は、1987年3月6日付はヨーロッパ特許出願第87
゜400504.4号又はその対応外国特許出願及び(11)により詳細に記載
されている。ベクターポリペプチドをコードする核酸配列上に位置する部位であ
って、上記ベクターポリペプチドの特徴的な機能を変えることなく所定のペプチ
ド類をコートする核酸配列を挿入することかて′きるような部位を、以下の文中
では「許容部位」と呼称する。
特に好適なベクターポリペプチドはタンパク質MalEがら構成される。
タンパク質MalEは大腸凹の遺伝子malEによりコードされる370個のア
ミノ酸がら成るタンパク質である。そのプロモーターである駐」上は、インデニ
ーサマルトースの存在下でタンパク質MalTにより活性化され且つグルコース
により抑制される強力なプロモーターである。このような調節機能は、malE
及びそのプロモーターがpPDl <その製造方法については(1)に記載され
ている)のような多重コピープラスミドにより担持されている場合にも得られる
。
MalEは!富なタンパク質である。このタンパク質はN末端シグナルペプチド
を介して細菌のペリプラズムに運搬(搬出)され、該シグナルペプチドは運搬中
に開裂される(2)。
MalEは!8菌のエンベロープを通ってマルトース及びマルトデキストリンを
運搬するのに必要なこれらの糖に親和性のタンパク質である。 MalEはその
前駆物質と同様に、エビクロロヒドリン処理により架橋されたアミロースを支持
体とするアフィニテイクロマトグラフイにより1段階で精製され得る。タンパク
質は競合により10w1Mのマルトースで溶離されるり3)。
所定の活性を失わずにこのタンパク質の所定の部位を修飾(変性)できることも
明示されている。特にDUPLAY他の論文(4)を参照することができる。こ
の論文及び明細書の末尾に列挙した他の全文献は、夫々の内容が本発明の製造原
料の性質及び構造を補うものである限り、明細書の一部をなすと見なされる。
これに関連して、DLIPLAY他は遺伝子吐lを含むプラスミドpPD1の該
遺伝子malEにB、a+mHIアダプター(リンカ−)をランダムに挿入した
。これらの挿入により修飾されたプラスミドのうちの2つ+nalE91及びm
alE140では、読取枠が変わり、MalEの362(及び369)個のN末
端アミノ酸と12(及び27)個のアミノ酸かろ成る口末端延長部とを有する修
飾タンパク質が合成される。第3に、シグナル配列中に挿入(walE127)
すると、ペリプラズムl\のタンパクiiMalEの運搬が阻止される(4)。
従って、本発明は所定の全ペプチド鎖又はタンパク質を遺伝子工学により製造及
び精製するために特に有効な方法を提供するものであり、該方法は、それ自体有
効なプロモーターの制御下におかれたベクターポリペプチド、特にタンパク質M
a I Eをコードする配列の下流に該タンパク質をコードする核酸配列が配
置された組換体ベクターを構築することにより実現される。
本発明の上記方法で使用される組換体ベクターの構築は、所定のタンパク質をコ
ードする核酸配列が、ベクターポリペプチド、特にタンパク質MalEをコード
するDNA配列の上流で且つMalEをコードする配列にgする該タンパク質を
コードするDNA配列の有効な発現プロモーターの下流に配置されるように実施
することもできる。
本発明の方法の−U様によると、この製造に使用される宿主生物は大腸菌から構
成され、その場合、同様に対応する内因性プロモータージ土h−を含む遺伝子駐
」」体を使用すると有利である。このような仮定では、精製段階はタンパク質M
alEに対応する不溶化糖、有利には上述の条件下で得られる不溶化マルトデキ
ストリンスは架橋アミロースと接触させる段階を含む、1組の特徴、即ち1.遺
伝子malEに数台されたコーディング配列を含むベクターを介して所望のタン
パク質を製造する段階、及び2、重合状態にしたマルトース又はグルコースと接
触させることにより精製する段階を使用すると多くの面で有利である8製遺レベ
ルでは、遺伝子malEが大腸菌中に豊富に発現され得ること、及び不溶化した
グルコース又はでルトースが天然即ち「野生」のタンパクiMalEf)親和性
を維持しているハイブリッドタンパク質のみを分離し得ることと同時に利用する
。注目すべきことに、これらのベクターを利用すると、所望のタンパク質に対応
する部分が該タンパク質の活性を維持するようなハイブリッドタンパク質を得る
こともでき、この活性は直接現れるか又は、後述する実施例に示すように、実験
モデルとして使用されるヌクレアーゼ(150個のアミノ酸)及びポリメラーゼ
のフレノウフラグメント(650個のアミノ酸)のような大きい寸法の所定のタ
ンパク質で復元後に現れる。
当然のことながら、タンパク質MalEのマルトースに対する親和性及び合成す
べき所定のタンパク質に対する所望の活性を遺伝子5ilHの適当な領域の構造
中に維持するためには、所望のタンパク質をコードする核酸配列を該領域に挿入
することが重要である。このためには、所定のタンパク質をコードする核酸配列
を、組換体遺伝子の転写方向に対してタンパク質MalEをコードする配列の下
流又は上流に配置すると有利である。もっとも、この条件は全く強制的ではない
。遺伝子+nalE中に所望のタンパク質をコードする配列を挿入する最も有利
な位置の決定は、特に上記ヨーロッパ特許出願に記載されているように、所定の
ペプチド鎖とコードする配列に従う挿入方法により決定され得る。
本発明のシステムは精製能力が非常に優れているばかりでなく、作成されたハイ
ブリ・ソドタンバク質が運搬される細菌の領域と選択することができ、即ち細胞
質中にもペリプラズム中(少なくとらハイブリッドタンパク質の性質自体がこの
領域への運搬を妨げない場合)にも運搬できるという点で、上記好適ベクターに
最大限の柔軟性がある。使用者は、−iに遺伝子+mtlE中でコーディング配
列とプロモーターとの間に挿入されたシグナル配列のこの点から見て特異的な特
性を利用することにより(この運搬が上記理由で可能な限り)形成されたハイブ
リッドクンバク質をペリプラズム中に運搬することができるし、あるいは明確に
ハイブリッドタンパク質をペリプラズム中に運搬させない効果を有する突然変異
なこのシグナル配列に導入することにより、ハイブリッドタンパク質がいずれに
しても細胞質領域から外に運搬されないようにすることもでき、どちらの操作も
使用者の随意であるのて゛、この選択は使用者に任される。前者の場合、ハイブ
リッドタンパク質は特に例えば(4)に記載されている条件下で形質転換細菌に
浸透圧ショックと加えることによりペリプラズムから容易に回収することができ
る。後者の場合、ハイブリッドクンバク質は例えば洗剤で処理後に又は当業者に
周知の機械的もしくは酵素手段を介して、細胞型の完全な破壊後に+1!1m質
から回収される。後者の方法は確かにあまり実用的ではないが、変異を導入され
ていないシグナル配列の作用下でハイブリッドタンパク質がペリプラズム中に運
搬されるという自然の傾向の結果として生じ得る「ストレス」から細菌を保護す
ることが望ましいので、この運搬がハイブリッド構造から見て困難であることが
明白な場合でも、この方法のほうが好適である。
注目すべきことに、本発明の方法は、宿主生物の細胞質領域とペリプラズム領域
とを分離する細菌膜を通って有効に運搬可能なタンパク質の場合、不溶化糖との
全接触又は他の全付加的精製操作の実施以前に高い精製率で一般に細胞質のタン
パク質をへり1ラズム中に運搬することが可能である。
この点で本発明は、より特定的には、変形例として、不溶化糖との接触による接
触段階を省略した上記製造及び精製方法に係り、このような変形例は、特に所望
のペプチド鎖の全部又は一部が細胞質タンパク質、即ちその天然の宿主により分
泌されないタンパク質がら構成される場合、より特定的には宿主生物が細菌であ
る場合に適用される。
上記好適システムの別の利点は、プロモーターu」上を随意に誘導又は抑制でき
ることにあり、インデューサマルトースの存在下の活性化能力及びグルコースの
存在下の抑制能力については既に記載した通りである。培養物の増殖能力を妨げ
ず且つ組換体遺伝子の発現を阻止するに十分な用量のグルコースの存在下で予め
形質転換された細菌培養物を増殖させた後、培養物が所望の増殖段階に達し、組
換体遺伝子の発現、及びその結果としてハイブリ・ンドタンバク質の製造が望ま
しいレベルに達したら、培養物をグルコースで処理すると特に有利である。この
ような条件下では、形成されたハイブリッドタンパク質の毒性効果から増殖中の
紀菌培簑物を保護することができ、ハイブリッドタンパク質が大量に製造される
のは、培養物の最初にめられる増殖段階の期間に限られる。
一方、全操作は37℃未満の温度、特に28℃〜35℃、例えば約30℃て゛実
施すると有利て゛ある。こうして、ハイブリッドタンパク質の毒性効果は弱めら
れる。
組換体DNAの31築には天然の遺伝子malEを使用すると有利であるが、こ
れら′の条件が限定的でないことは当業者に自明である。特に、プロモーターu
」直を使用せずに、細菌により認識される有効なあろゆる他のプロモーターて゛
構築により置き換えることが可能である。特に、その構成活性を抑制可能なあら
ゆる強力なプロモーター、あるいは形質転換細菌の培簑条件の適当な調節により
誘導可能なあらゆる強力なプロモーターを使用することができる。大腸菌中で発
現させるためにプロモーターu」工の代用として構築により使用可能なプロモー
ターの例として、ファージλのプロモーターPL及びPR,IPTG(イソプロ
ピル−β−チオガラクトシド)により誘導可能なプロモーターロ!、ラクトース
オペロン、トリプトファンオペロンのプロモーター、これらのプロモーターから
誘導される混合プロモーター等を挙げることができる。
当然のことながら、「タンパク質MalEをコードする配列」なる表現は、対応
する糖に対する特徴的な親和性が維持さt′しるという条件で、野生のタンパク
質及び修飾タンパク質MalEをコートする配列であると見なされるべきである
。また、この表現は対応するタンパク質の精造を変えないヌクトオチトのI換に
より、上記以外の核酸の配列にも及ぶことは自明である。この観点て゛は、本発
明は遺伝子コードの変質により、部分的又は完全に合成的に製造された核酸配列
の使用にも係る。
形質転換に使用可能なベクターは入手可能又は予想可能であるので、上l己大腸
菌のようなグラム陰性細菌の他に、遺伝子工学で使用可能な他のあらゆる宿主と
使用することができる。タンパク質を精製するための担体としてMalEを使用
することが可能な他の細菌型の例としては、グラム陰性菌、例えばB、5ubt
ilis、コリネバクテリウムあるいは酵母あるいは高等真核生物、特に哺乳動
物のamを挙げることができる。当然のことながら、タンパク質MalEをコー
ドする配列はいずれの場合も宿主生物中で発現するのに適当なプロモーターの制
御下で構築により配置されなければならない、いずれの場合も、その後の精製操
作は対応する不溶化糖に対する親和性により所望のハイブリッドタンパク質を有
効に分離することができる。
グラム陰性菌でのMalEの発現に関して、本発明者らは実際にタンパク質Ma
iEが江二皿=二工旺一旦!!+iaeノ9ンハク質MalXとの開に強い相同
性を示すことを証明した。このタンパク質MalXはマルトースにより誘導可能
であり、グラム陰性菌でマルトテトラオースのようなマルトデキストリンの捕獲
において役割を果たすと予想される(12.13)。MalXはグラム陽性菌の
膜に結合されたタンパク質であり、一方、HalEはグラム陰性菌のペリプラズ
ム中に配置されている。
タンパク質MalXは前駆物質として合成され、細胞質の外に運搬されるが、M
alXがグラム陰性菌の細胞質巻くの外側に結合するのは、アミン末端システィ
ンの親脂性アミノ酸への形質転換に起因するものと考えられる。タンパク質Ha
!E及びMalXの比較検討については後述の実施例により詳細に説明する。
真核生物細胞におけるタンパク質MalEの発現については後述する実施例でよ
り詳細に説明する。真植生物細胞を使用すると特に、その機能によりグリコジル
化される必要があるかもしくはジスルフィド結合を有する必要があるタンパク質
、又は細菌中で運搬することが困難なタンパク質を製造できるという利点がある
。
以上の説明では、特にタンパク質MalEをコードする核酸配列に関して本発明
を説明した。しかしながら、本発明はこのタンパク質をコードする核酸配列を含
む組換体ベクターの使用に限定されない。本発明は糖に対してま著な親和性を有
するものであれば、他のあらゆるタンパク質−ベクターも使用することができる
。例えば、所望の所定のタンパク質を製造するために必要な組換体DNAを製造
する場合、グラム陰性菌でマルトースに対して親和性のタンパク質MalXをコ
ードする核酸配列、アラビノース、ガラクトース、リボース等のM相性タンパク
質をコードする核酸配列を挙げることができ、この場合、対応する精製操作はこ
うして製造されたハイブリッドタンパク質を特に重合により不溶化状態にされた
糖と夫々後で接触させる段階を含んでおり、該重合は、場合によっては該重合の
英雄と糖及び該糖に対して親和性のタンパク質の相互親和性の維持とを同時に実
現するエビクロルヒトリンスは他の任Zの物質のような網状化剤を用いて行われ
る。
この点については、アフィニティクロマトグラフイ力ラムとして機能し、該カラ
ムに予め選択的に固定された後に通常の溶離方法により分離され得る物質のその
後の無害のレベルで使用される不溶化糖のカラムにより得られる本質的な利点な
特許すべきである。これらのカラムの構成物質は一般に毒性を全く欠いており、
このようなカラムの使用は医療又は獣医学に適用されるタンパク質又はポリペプ
チドを製造するために特に有利である。
更に、従来のアフィニティクロマトグラフィ力ラムはカラムの構成材料が一般に
単離すべきタンパク質又はポリペプチドに対して不活性な支持体材料から形成さ
れており、分離すべき物質に対して必要な親和性を有する分子又は物質が予め該
支持体に固定されているが、このような従来のアフィニティクロマトグラフィ力
ラムとは異なり、本発明では使用される不溶化物質のマトリックス自体が所望の
物質に選択的に結合されたベクターポリペプチドに対して親和性を有しているの
で、これらのカラムの選択的保持能力が非常に大きい。
ハイブリッドポリペプチド又はタンパク質はその後、特に該ポリペプチド又はタ
ンパク質の移動を可能にする成分を組み合わせた溶液を使用して溶離することに
より不溶化糖から回収され得る。この溶液は、マルトースの場合、即ちベクター
ポリペプチドがタンパク質MalEスはMalXから誘導される場合、好ましく
は対応する可溶性糖き含有している。
ハイブリッドタンパク質を糖カラム上て゛精製する段階に先立って、該タンパク
質は(MaiEを使用する場合について上述したように)ダラム陽性菌のベリブ
ラズムカ)ら回収され、あるいは適当な溶液による洗浄後に宿主細胞の膜のレベ
ルで、即ちこれらの宿主細胞の膜の破壊後に該宿主細胞の細胞質から回収され得
る。ダラム陽性菌の膜の表面に結合しているタンパク質Malχのようなベクタ
ーポリペプチドを含むハイブリッドタンパク質では、タンパクii M a l
)、’のアミノ末端レベル(特に該アミノ末端システィンの下流)に、所定の
酵素又は化学的プロセスにより特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードする核
酸サブ配列を挿入すると特に有利であることを明記すべきである。上記アミノ酸
配列を特異的に開裂する酵素又は化学的プロセスにより細胞膜を処理すると、ハ
イブリッドタンパク質が遊離する。グラム陽性菌中にMalXを含むハイブリッ
ドタンパク質も同様に、ハイブリッドタンパク質が細菌の膜の表面に固定しない
ようにMalXをコードする核酸配列の7ミノ末端部分を修飾することにより!
接待られる。
上記説明では、所望のポリペプチド又はタンパク質を含むハイブリッドタンパク
質の精製の場合についてのみ説明した。
しかしながら、ベクターポリペプチドの固有の特性の維持の恩恵を得ることが望
ましい場合、あるいは免疫性ポリペプチド又はタンパク質の場合は糖に対して親
和性のタンパク質、特にMaiE又はMalXが及ぼし得る免疫アジュバント効
果の恩恵を得ることが望ましい場合はいつでもハイブリッドタンパク質はそれ自
体で所望のポリペプチドを形成し得ることを明記すべきである。所望のポリペプ
チドが該所望のポリペプチドの十分なin vivo免疫原免疫原遺合な比較的
小さい分子lを有する場合、この特徴は特に有利である。
この点については、ヨーロッパ特許出願第87.4005044号又は(11)
に記載されている方法をこの場合も使用することができ、不溶化糖に対するタン
パク質MalE又はMalXの親和性をハイブリッドタンパク質中に維持すると
同時に、ハイブリッドタンパク質がポリペプチドの所望の免疫性を有するべくハ
イブリッドタンパク質中に所望のポリペプチドの適当な呈示を確保するように、
違伝子malE又は駐止のコーディング配列中に所望のポリペプチドをコードす
る配列を導入する適当な導入部位(又は許容部位)を決定することができる。
この関連では、本発明は抗原(特に抗体により中和され得る病原抗原)に対して
指向された免疫性組成物に係り、該組成物は糖に対して親和性のポリペプチド、
特にMalE又はMalXをコードし且つ許容部位の1つのレベルに所定のエピ
トープをコードするDNA配列を含む核酸配列から構成されるffl換体核体核
酸して、本発明の方法に従ってグラム陰性菌、又はダラム陽性菌、又は真核生物
細胞の形質転換により得られるハイブリッドポリペプチドを、ワクチン組成物の
製造に適当なビヒクルと組み合わせることを特徴とする。
本発明は、より特定的にはAIDSに対して指向された免疫性組成物に係り、該
組成物を構成するハイブリッドポリペプチドはMalHに挿入された抗111V
ペプチド、特にレセプター74の活性フラグメントを含んでおり、該ハイブリ・
ソドポリペプチドはワクチン組成物の製造に適当なビヒクルと組み合わせられる
ことを特徴とする。
MalEと、リンパ球T4に配置されたレセプターT4のように免疫特徴を有し
ており且つAIDSの特徴的H1′V型ウィルスの鋳型を構成するポリペプチド
とのハイブリ・ノドタンパク質、及びポリオウィルスのタンパク質〜P1のエピ
トープC1については、後述する本発明の実施例中でより詳紀に説明する。
本発明はハイブリッドタンパク質又はポリペプチドの精製に限定されない。特に
、翻訳方向に対してハイブリッドタンパク質中の上流又は下流に配置されたベク
ターポリペプチドから所定のペプチド鎖(あるいは所望のタンパク質)を分離す
ることが可能な条件下、更には所望のタンパク質のみを回収することが可能な条
件下で精製を実施することかでき、これは、所定の酵素又は化学的プロセスによ
う特異的に開裂可能なアミノ酸配列をコードする短い核酸配列(スはサブ配列)
が組換体核酸中て゛ベクターポリペプチドをコードする配列と所望の配列をコー
ドする配列との間に構築により予め挿入されている限り、該所定のペプチド鎖又
は所望のタンパク質はベクターポリペプチドの完全に下流又は上流に配置される
からである。場合によっては、所定のペプチド鎖を更に十分に単離するために、
上記サブ配列と類似の他のサブ配列を組換体核酸に挿入し、特に所定のペプチド
鎖がこれらのサブ配列の2つの開に挿入されるように配置してもよい。
この場合、所望のタンパク質の溶離操作は、アミノ酸配列を特異的に開裂する処
理により、ハイブリッドタンパク質が予め固定された不溶化糖を処理する段階を
含んでおり、ベクターポリペプチドは糖に固定され続ける。
変形例では、不溶化糖からハイブリッドポリペプチドを回収後、特異的酵素又は
特異的化学的処理により溶液中のハイブリッドポリペプチドを処理し、ハイブリ
ッドタンパク質の開裂物を不溶化糖と再び接触させ、本質的に所望のアミノ酸銀
から構成される非固定状態のポリペプチドを回収する。
上述のようにハイブリッド中のベクターポリペプチドの2つのフラグメントの間
に挿入されている場合でも、所望のポリペプチドをハイブリッドタンパク質から
分離できることは自明である0図例では、本発明の方法で使用される組換体核酸
は、特異的酵素により選択的に開裂可能なアミノ酸配列をコードし且つ所定のペ
プチド類をコードする核酸配列の夫々上流及び下流に配置された2つのサブ配列
を含むように構築される。
特にコーディング配列の第1及び第2の部分の開に挿入され得る核酸配列の例と
して、例えば配列:八TCCAにに(、TAGに
1ieCIu(、lyArg
を挙げることができ、該配列は血液凝固への介入により周知の■因子により選択
的に開裂可能である。自明のことであるが、この特定の配列は、所望のタンパク
質が別のテトラペプチド配列を含まないという条件でしか使用することができな
い、このように選択的に開裂可能なアミノ酸配列の別の例として、下記第1表に
示すような配列を挙げることができ、この表には特徴的配列と鉛直方向の小さい
矢印で示したアミノ酸のレベルでこれらの配列を開裂し得る酵素とを列挙した。
LL
アミノHc末端側
; 1
クロストリジオペブチダーゼBArg (Lys)j
ブドウ球菌プロテアーゼ Asp及びC1u: 1 1 ↓
サーモリシン Leu、 lie、 Phe及びVal(他)同様に、下記アミ
ノ酸又はジペプチドのレベルにおける特異的な化学的開裂を使用することもでき
る。
晟JLL
アミノ酸C末端側
臭化シアン Net
蟻酸 ^sp Pr。
↓
ヒドロキシルアミン 八sn C1y
使用される配列の選択は、この精製操作後にその完全性を維持すべきポリペプチ
ドの構造自体に依存する。
本発明は更に、IiE!胞が導入され得る生物の免疫系により認識可能な特徴的
エピトープを特に外側表面のレベルに有する細胞培養物にも係り、M″;、細胞
は糖に対して親和性のタンパク質をコードする核酸配列の許容部位のレベルに挿
入された、該エピトープをコードする核酸配列を含むオープンリーディング相の
組換体核酸を介して形質転換されることを特徴とする。
有利には、上記糖に対して親和性のタンパク質はタンパク質MalE又はMil
Xである。
外側表面のレベルにエピトープを有する上記M3胞の例としては、特にグラム陽
性菌(例えばE、eoli)、グラム陽性菌(例えばB、5ubtilis)、
及び真核生物細胞が挙げられる。
細胞質の外l\の運搬特性及びマルトースに対する親和性を維持しながら、タン
パク質MalEをコードする配列の許容部位のレベルに該エピトープをコードす
る配列を挿入することにより、グラム陽性菌と宿主細胞として使用する場合には
、エピトープを含み且つ上記核酸によりコードされるハイブリッドタンパクX=
グラム陰性菌のペリプラズムのレベルに局にすることかて゛き、これらの細菌細
胞を、該細胞が導入さi″L得る生物中に特徴的エピトープを呈示するための選
択的試薬にすることができる。
−Fに、エピトープの呈示用ベクターポリペプチドとしてのタンパク質MalE
及びMalXの使用は、グラム陽性菌、グラム陽性菌又は真核生物細胞中におけ
る使用が予想され得る。
本発明は更に、抗原(特に所定のエピトープに対して指向された抗体により中和
可能な病原抗原)に対して指向された免疫組成物に係り、該組成物は外側表面の
レベルに該エピトープを有する上記綿I!!(生存細胞又は細菌の場合は特に熱
により殺された細胞)を医薬上見地からワクチン組成物の製造に適当なビークル
と組み合わせることを特徴とする。
本発明は更に、所定のペプチド鎖をコードする核酸配列と、ベクターポリペプチ
ドの1又は複数の部分をコードする1又は別々の複数の配列とを含むオープンリ
ーディング相の組換体核酸にも係り、該「ベクターポリペプチドの1又は複数の
部分をコードする1又はW数の配列」は、元のベクターポリペプチドの細胞質中
への運搬特性及び所定の糖に対する親和性が組換体核酸により発現されるハイブ
リッドポリペプチド中で維持されるように決定され、該核酸配列がグラム陽性菌
又は真核生物細胞により認識される転写調節要素、特に転写促進及び終結要素の
制御下におかれることを特徴とする。
有利には、該「ベクターポリペプチドの1又は複数の部分をコードする1又は別
々複数の配列」は、タンパク質MalE又はMalXの全部又は一部をコードす
る核酸配列である。
本発明は更に、ベクターポリペプチドがタンパク質MalXであり、該調節要素
がグラム陽性菌により認識されることを特徴とする上記組換体核酸にも係る。
本発明の各種の態様によると、上記組換体核酸は、−MalE及びMalXをコ
ードする核酸配列が所定のペプチド鎖をコードするDNA配列の完全に上流に配
置され、MalE及びMalXをコードする核酸配列が所定のペプチド鎖をコー
ドするDNA配列の完全に下流に配置され、−所定のペプチド鎖をコードする核
酸配列がMJIIE及びMalXをコードする核酸配列の許容部位のレベルに挿
入されるように構築される。
既述したように、特異的酵素又は化学処理により開裂可能なアミノ酸配列をコー
ドするサブ配列も、MalEスはMalX及び所定のペプチド鎖を夫々コードす
る上記組換体核酸の部分の間に挿入され得る。
本発明は更に、グラム陽性菌、又はグラム陽性菌、又は真核生物細胞中で複製す
ることが可能な特にプラスミド型のベクターとしての上記組換体核酸にも係る。
本発明の好適特徴は、第1.2.3及び5図に概略的に示した本発明の非限定的
な好適構築例に関する以下の記載から明らかになろう。
以下の記載は更に、大腸菌における福築物MalE−T4及びT4−MalHの
発現を示す第4図、真核生物細胞におけるMilEの発現を示す第6図〜第8図
、MalE及びMilXの相同性を示す第9図も参考にしている。
これらの構築物で使用したプラスミドは既に従来の文献に記載されている。特に
、
−7ラスミ) pLc9c:l: ツイテハVIERA及びMESSINに、
1982、−DNAポリメラセーゼIのフレノウフラグメントをコードするフラ
グメントBa+eHl −23シJJ!3l−Bas+HIについては−ILL
IAMS及びNEtiBERf:ER,1986、−S、aureusのヌクレ
アーゼの遺伝子nue f含む組換体ファージM13MpSにつ(ユてはNEt
!BERCER他、 1984の論文、−以下に言及するプラスミドpPD9i
、pPD127及びpPD140についてはP 、 D L; P L F、
Y他、 J、Mo1.Eiiol、、 194,663−673.1987を参
照されたい。
1)MalEの活性及びフレノウ酵素の活性を同時に発現するか一イブ1ツド
ンバ −MalE9i−フレノウをコード るブー、c6Hへ1え
シ1」−及び肚七区のハイブリッドを次のように構築した。
得られた組換体プラスミドptIC9からNEUBERCER1986に記載の
フラグメントBamH1−LL1部−を取り出し、プラスミドpPD9:lに挿
入し、より特定的にはそれ自体遺伝子11JIIHに含まれるリンカ−Bawl
l中でMalHの362番目のアミノ酸をコードするトリブレットのレベルに
挿入した。即ち、この挿入によって遺伝子m+ilEの最大部分の下流に遺伝子
肚セ凶を配置した。得られる組換体プラスミドにおけるとjバの配向は、Bεl
i −5ac lの二重の消化により決定した。プラスミドのうちで凹IAK
が正しく配向されているものをpHB11と命名した。該プラスミドはタンパク
質MalE91−クレノウをコードする。
プラスミドp)iB11″!:第1図に概略的に示す。図面の右側に示したBa
m81部位は、MalEF+1の遠位部分なコードする遺伝子の部分とフレノウ
酵素をコードする遺伝子り肱の近位部分とを分離する。
p)iBllから、遺伝子1alEのシグナル配列中に突然変異部を有するプラ
スミドpH812を得た。このために、突然変異部ともたない該配列を含むpH
B11のフラグメントPst l −Bgl■を、このような突然変異部な含む
(4)に記載のプラスミドpPDi27に由来する対応する配列Pst l −
136i 71と遺伝子組換により交換した。 p’1iB12はハイブリッド
タンパク質malE127/91−フレノウをコードする。
2)MalEの活性及びヌクレアーゼの活性を同時に発現する公−イブト・ド
ンバ MalE140−Nuc’>コード るブースミニへ1L
S、aureusのヌクレアーゼをコードするフラグメント(BaIaB 1−
nuc−Sal 1 )をN E 1! B E Rf、E P、他、 198
4に記載されている組換体ファージMP8から切り出し、 pHB322に連結
することにより該ファージに最初に含まれているフラグメントBa+m)l 1
−5il Iに置換した。得られたプラスミドをp)IB13と命名した。
フラグメント(BamHl −nue−Sal l >のすぐ上流のpHB13
のフラグメントEcoP、 1−Bam)l 1を、プラスミドpDP)40の
フラグメント(EeoRI −(懸」ニー+nalヱ)−Eam)i I )と
交換することにより、遺伝子■ニカ(遺伝子malEの下流に配置されているプ
ラスミドpHB14を得た。4つのデオキシヌクレオチド及びフレノウポリメラ
ーゼの存在下で、pi(Ba4に含まれる独自の部位Bawl lと付着端に充
填することにより、これらの2つの遺伝子を同相にした。
このとき、pliB15はハイブリッドクンバクiiMalE140−ヌクレア
ーゼをコードする。
第2図はプラスミドpHB15を概略的に示す8図面の右側部分の部位(Baw
l I )Cla lは、MalEの遠位部分をコードする遺伝子の部分と、上
記ヌクレアーゼをコードする遺伝子肚!の近位部分とを分離する。
3)夫々プラスミドpHB11、p)iD12及びp+HB15により予め形質
転換された大Mtfi培貢物によるバイブ1ツド ンバ 声MalE91− レ
ノウ びMaiEi40−ヌクレアーゼの び制
這S−
ハイブリッド、遺伝子を発現させるための宿主として、大腸菌のMC4100の
誘導体ΔmalE444. malに1.recA::tnlOである株pDz
smt使用した。オペロン1UユE−ma土F−リ土Gの遠位遺伝子の発現に対
して非極性である遺伝子ジ土Eの欠失部ΔmalE444は、細苗染色体から野
生タンパク質MalEが発現できないようにし、且つMalE上でハイブリッド
と同時に精製できないようにする。ΔmalE444は株PD28がマルトース
を運搬できないようにする。突然変異部懸月二はインデューサマルトースの不在
下でプロモーター駐」上の構成的活性化を可能にする。細胞に対するハイブリッ
ドタンパク質の構成的発現の致死率の危険を回避するために、0.4〜2%のグ
ルコースと加えた完全培地でPD2Sの全誘導体を増殖させた。これらの条件下
で、プロモーター駐」上は完全培地上での培養物の増殖を妨害されずに、強く抑
制される。細胞を洗浄し、グルコースを含まず、場合によってはマルトースを加
えられた完全培地で培養することにより、第1世代のこれらのプラスミドからM
aiEスはハイブリッドタンパク質を発現させることができる。全増殖は30°
で実施する。
対照実験の結果、プラスミドからのMalHの大量発現又は運搬は、42°で停
止することが判明した。
プラスミドp、 P D 1、pPD91、pPD140及びpHB15を株P
D28に導入すると、タンパク質MalE、MalE91、MalE140及び
ハイブリッドMalE14C−ヌクレアーゼが大量に発現される。浸透圧ショッ
クを生じるように作成日iを処理すると、ペリプラズムから遊離された細胞フラ
クション中にこれらの4種のタンパク質が認められる。
プラスミドpPDi27、pi(ε11及びpHB12はタンパク質MalEi
27並びにハイブリッドMaiE91−クレノウ及びMalE127/91−フ
レノウを可溶性細胞フラクション中に大量に発現させる。
注目すべき点として、所定の割合のMalE9i−フレノウ(遺伝子malEの
シグナル配列中に突然変異部をもたないプラスミドpHB11により産生される
ハイブリッド)もペリプラズム中に運搬された。
夫々対応する細菌培i!¥@がち得られる野生タンパク質MiIE、タンパク質
MalE91、MalE140及びMalE127(対照タンパク質)並びにハ
イブリッドタンパク質MalE140−ヌクレアーゼ、MalE91−フレノウ
及びMalE127/9i−フレノウを(4)に記載の条件で架橋アミロース上
でアフィニティクロマトグラフィにより精製した。野生MalE、MalE−ヌ
クレアーゼ及びMalE91−フレノウの場合、この精製は細胞質抽出物がら行
った。 MalEi27及びMalE127−フレノウの場合、精製は完全細胞
の可溶性抽出物から行った。
いずれの場合も、600nmて測定した光学密度が0.1で播種し且つ1に等し
い密度で採取した500ifの培養物を処理した。
抽出物の各々(完全細菌から得られる可溶性抽出物では約14ozgのタンパク
質、及びペリプラズム抽出物では約14■)を251 (の緩衝液(例えば50
mM Tris−CI pH7,5; 2.5+nMβ−メルカブトニタノール
; O,iPMSF)にとり、6*iの樹脂のカラム上に堆積させ、カラムを約
5倍の容量の緩衝液で洗浄後、10mMのマルトースによりタンパク質を溶電さ
せた。
保持及び溶離量は野生MalEでは1.76H、ハイブリッドMalE140−
ヌクレアーゼでは1.64zIi、 MalE127では1.1611gであっ
た。MaiE及びハイブリッドMalE140−ヌクレアーゼは、保持されたカ
ラムを通過したフラクション中に見いだされなかったので、カラムは飽和してい
なかったと見なされる。
一方、低い比率(98μg)ではあるがハイブリッドMalE127/91−フ
レノウは同一条件でカラムに保持され、これは、このハイブリッドタンパク質の
場合にはフレノウのポリメラーゼ部分が該タンパク質のmalE部分の正確な折
り畳みを妨げることを意味する。
上記条件下でアフィニテイクロマトグラフイ後、ペリプラズム抽出物から精製さ
れた172upのハイブリッドタンパク質MalE91−フレノウを得た。
ハイブリッドMalE140−ヌクレアーゼの活性はハイブリッドzg当たり2
100単位のヌクレアーゼ、即ちハイブリッドのヌクレアーゼ部分xg当たり8
942uに等しいことが確認された。比較として、ヌクレアーゼの市販訳製物(
Boehringer)の活性は25SOu/zyであった。従って、ヌクレア
ーゼはハイブリッド中に十分な活性を有することが判明した。株PD2S(pH
B15)は30°でマツコンキーマルトース培地上に表現型Mal”を有する。
従って、ハイブリッド遺伝子malE140−nucはマルトースの発酵のため
に欠失部Δ吐144を補うことが可能であり、ハイブリッドMalE140−ヌ
クレアーゼはマルトースの運搬に関して少なくとも部分的に活性である。要約す
ると、ハイブリッドMaiE140−ヌクレアーゼはべりブラズム中に運搬され
、その2つのパートナ−の活性を維持する。
ハイブリッドMaiE1277’91−フレノウの活性はハイブリッドtg当た
り4514単位のポリメラーゼ、即ちハイブリッドのフレノウフラグメント部分
12当たり7431uに等しいことが判明した9二tしに対して、フレノウのフ
ラグメントの市販調製物(Boehringer)の活性は9445u/Hであ
った。従って、フレノウのフラグメントはハイブリッド中に十分な活性を有する
。要約すると、ハイブリッドMalE127/91−フレノウはポリメラーゼ活
性とMajEの特性の少なくとも一部とを有する細胞質タン、バク質である。
ハイブリッドMalE91−クレノウの活性はハイブリッドxg当たり3100
単位のポリメラーゼ、即ちハイブリッドのフレノウフラグメント部分13当たり
5100に等しいことが判明した。従って、フレノウのフラグメントは同様にハ
イブリッドMalE91−クレノウ中にその活性を維持する。
要約すると、ハイブリッドMilE91−クレノウはポリメラーゼ活性及びma
lEの特性の一部を維持しながらペリプラズム中に運搬され得る。
ポリアクリルアミド−5DSのゲルで電気泳動により分析した処、タンパク質調
製物は95%の純度であった。これらのタンパク質を従来手段、例えば透析によ
り更に精製することも可能であることは当業者に理解されよう。
4)ハイブト・ド ンバ ′MaIE−T4 びT4〜MaIE1コード謙″ア
ースミドの
遺伝子T4のアクセプタ一部位は一方では(MalE−74の融合に使用される
)プラスミドpPD140中でmaiEのC末端に挿入されるBamH1部位で
あり、他方て゛は(74−MalEの融合に使用される)プラスミドpPD12
7中でシリ」−のN末端に挿入されるBa+*H■部位である。
合成ポリヌクレオチドとまず第1段階で上記アクセプタ部位に挿入し、挿入すべ
きフラグメントT4に対して連合性の新しい部位を導入し、2つの遺伝子のτ−
ブンリーディング相を一致させ、必要に応じて欠失部分を再構成し、あるいは構
築終止コドン3導入するようにした。こうしてプラスミドpPD140及びpP
D127がら夫々プラスミドpMEc及びpMEN E得た。
MalE−丁4の融合を実現するためには、MADDON他、 Ce1l(19
85) 4fi 93−104に記載されているフラグメントFnu4H1(遺
伝子T4を含むがシグナル配列(ss)並びにC末端のトランスメンブラン及び
細胞質部分を含まないフラグメント)をプラスミドpMEC1より特定的には第
1段階時に該プラスミドに導入したXba部位のレベルに挿入した。こうして得
られT、−MalHの融合を実現するためには、上記参考文献中に記載されてい
るフラグメント)ipan(3ji伝子丁4及びシグナル配列のほぼ全体を含む
が、C末端のトランスメンブラン(mb)及び細胞質(cyt)部分を含まない
フラグメント)3プラスミドルMEN、より特定的には前の段階時に該プラスミ
ドに導入したEeoR1部位のレベルに挿入した9こうして得られたプラスミド
pTME中の遺伝子MalEの上流に遺伝子T4と配置した。
上記プラスミドpD140、pPD127、pMEc、 pMEN、 pMET
、pTMEはmalEの天然プロモーター(Pr mal、マルトースにより誘
導可能であり、代謝抑制に5受性のプロモーター)を含んでおり、第3図に示さ
れる9
プラスミドpTE356 (DUPLAY他、(1937)J、Mo1.Bio
l、 194゜663−673に記載されているプラスミドpPD356中にP
liARM^C1^社から市販されているプラスミドpDR340のプロモータ
ーtacを含むフラグメントEeoRl −BamHlを挿入することにより構
築されるプラスミド)、同じ原理に従って同じくプラスミドpPD356かち得
られるプラスミドpTNET及びpTTMEは。
(IPTCにより誘導可能であり代謝抑制に非怒受性の)プロモーターtaeの
制御下の遺伝子夫々malE、malE−T4及びT4−malEを含んでおり
、同様に第3図に示される。
免疫沈降実験(第4図)の結果、2つの構築物MalE−T4及びT4−Mal
Eが大B蔀で発現されること、これらの福@物は使用される株に従って多かれ少
なかれ劣化されること分観察することができる。
1〜10の番号を付けたカラムは次のように分配された構築物MalE−T4、
T4−MalEを含む大賜菌の株に対応する9株:
構築物:
MalE−丁4: 1,4.5
T4−w+alE: 6,7.S、9
対照:
MalE: 2.3.i。
カラム1〜3及び6〜10は、抗MalE抗体により顕現される狙抽出物の免疫
沈降に対応する。
カラム4及び5はiT4抗体(OKT4八)(カラム4)及びVLM a l
E抗体(カラム5)によつ顕現される放射活性抽出物の免疫沈降に対応する。
ヨーロッパ特許出H第87.400.504.4号に記載の方法に従って、ポリ
オウィルスのタンパク質vp1のエピトープC1をタンパク質MalEの2つの
部位に遺伝子技術により挿入した。
組換体タンパク質は野生タンパク質の特徴的原理、即ちペリプラズムの運搬、ア
ミロースカラム上の保持、遺伝子の染色体欠失の補充といった特徴を維持する。
これらのタンパク質の免疫原性試験をBa1b/cマウスで行った。
生存している細菌、熱で殺した細菌、音波処理により得られる細菌溶解物及び手
積製調製物(浸透圧ショック;タンパク質純度50〜70%)でマウスに5作し
た。5作経路は静脈内及び皮下経路の2種類と試験した。
静脈内経路では、全調製物とも抗ペプチド力価非常に高(,10’〜1吋以上で
あった。皮下経路では、熱により殺したMA菌調製物のみが抗ペプチド応答(1
0’より大)を示した。
血清が天然及び熱変性ウィルス粒子を免疫沈降させる能力を試験した処、10’
より高い力価を生じる全血清は100%変性した粒子を沈降させる。血清のin
vitroのおける中和を試験した処、抗ペプチド応答及び免疫沈降結果に相
関される1/8〜1/64の力価を示した。
6>m にお(” ンパク”MaIEのベクターpsuTK )toβ<NIC
0LAS及びBEP、C<1983)、 ColdSpring Harbor
、 Symposium Quantitative BIology、 46
9−455に記tりをBglIl〒Nru 1で処理することにより、上記プラ
スミドpTE356の遺伝子malEを含むフラグメントBa+oHl −^C
CIを該ベクターに挿入した。
こうして得られたプラスミドpS〜・MEを第5図に示す、このプラスミドは遺
伝子+nalE及び該遺伝子を真核生物細胞中に発現可能にする遺伝的要素(ウ
ィルスS V 40及びヘルペスウィルスのチミジンキナーゼの遺伝子のプロモ
ーター、5V4OのT遺伝子及びウサギβ−グロブリンのイントロン領域、SV
40の前駆体RNAのポリアデニル化部位)を含んて゛いる。これらの構築物を
トランスフェクション(リン酸カルシウム沈澱方法)により培養細胞(SV40
又はマウスのしLi5胞により形質転換されたチャイニーズハムスターの胎児性
フィブロブラスト)に導入した。MalEに対して指向された抗体により免疫沈
降可能な物質の大量の合成は、イムノブロッティング(ウェスタンプロット)に
より立証された(第6区)、こうして合成されたMalEは2つの形Sで共存す
る。一方は細菌中で合成されたタンパク質MaiEと同一寸法を有する(成熟型
)、他方はくシグナル配列の切断以前に)MalEの前駆物質と連合可能なやや
大きい寸法を有する。タンパク質MalEは培地に運搬されると、主に成熟型で
見いだされる。これに対して、細胞から抽出されるフラクションは主により大き
い種により構成される。
MalEを安定的に発現する細胞系を樹立した(第7図)。この結果は、細胞を
f!築物MalE及び細胞にジニネチシン(geneticine)耐性を与え
る構築物(に418)により同時にトランスフェクトすることにより得た。耐性
クローンのほぼ全部は、正常な増殖特性を維持しながらクローンに応じて可変量
の?La1Eを発現する。 MalEは暫時発現実験によると培地に運搬される
。
真核生物kA胞中に発現されるタンパク質MaiEが1段階でアミロースのカラ
ム上で精製可能であることも判明したく第8図)。
タンパク質MalEは真核生物細胞中に発現及び運搬されるので、ハイブリッド
タンパク質を1段階で精製するために該ハイブリッドタンパク質の発現を可能に
する構築物、特に遺伝子malEとリンパ球T4のレセプター遺伝子との融合物
を真核生物細胞に導入すると、以下に述べるような複数の利点と有する型の方法
が得られる。
a)細菌により必ずしも首尾よく運搬されない真核生物タンパク質を正確に折り
畳むことができる。実際に、ある種の真核生物タンパク質の生物活性に不可欠な
翻訳後修飾(グリコジル化、ジスルフィド結合の正確な形成等)は細菌中で行わ
れない(Ferenei、 T、他、 (1978) F、E、B、S、 Le
tters旺、 213−217)。
b)ハイブリッドタンパク質を産生ずる安定なりローンを得ることが可能である
。
C)&a胞に組換体DNAを導入する際に完全構造の遺伝子増幅を可能にする構
築物(例えばメトトレキセート耐性により増幅を選択することが可能な遺伝子止
匡)を加えることにより、ハイブリッドタンパク質の発現を増加することが可能
である。
d)タンパク質は、アミロースカラム上の固定及びマルトースにより溶離により
細胞培貢物の上清から1段階で精製される。
e)MalE及び所望のタンパク質の結合レベルに開裂部位、例えばコラゲナー
ゼに対して特異的な部位を人為的に形成することができる°(GERMINOJ
、他、 <1984)、 Proc、Natl、^aid 。
Sci、、 Li5A、 81.4692−4696)。非開裂物をアミロース
カラムに保持することによりMa l E (及び非開裂物)を含むフラクショ
ンを氷解物から除去することができる。
上記第6.7及び8図に示した実験方法及び結果を以下に説明する。
愚IL
方法:ハムスターのcasoa胞に1ラスミドpSVMEをトランスフェクトし
た。
5日後、これらの細胞により合成したタンパク質を分析した(ウェスタンプロッ
ト)(レーン3〜5)、トランスフェクトしなかった細胞を対照(レーン1及び
2)として使用した。
細胞(レーン1.3及び4)及び細胞上清(レーン2及び5)を分析した。レー
ン2.4.5及び6では、抽出物を5DS−PA[;Eゲルに堆積させる前に抗
MilE抗体により免疫沈降させた(これらの条件では免疫グロブリンをiεと
する)、レーン1及び3では細胞抽出物を直接堆積させた。プロッティングの結
果は抗MalE抗体によりま現される。レーン6は細菌抽出物から精製したタン
パク質MalEである。
結果: C060細胞はmalEに対する抗体により認識されるタンパク質を発
現しない(細胞:レーンl又は上清:レーン2)。
psVMEe)ランスフエクトした細胞はMalE(レーン3及び4)を3形慧
で合成する。即ちその1形態はMalEの寸法であり(レーン6)、別の形感は
MalEよりも大きい寸法である。 MalEは成熟型(レーン6)で培地(レ
ーン5)に運搬される。
従って、MalEは細胞中で前駆体形(大きい寸法の形)として合成され、培地
に運搬されるものと思われる。
に1
方法: C060i胞に、プラスミドRSVneoと混合したプラスミドpSV
MEをトランスフェクトした。 0418に耐性のクローンを選択し、培養物上
清を分析した(免疫沈降、5DS−PAGE、ニトロセルロースブロッティング
、抗MalE抗体による諷現、+2Jで標識したプロティンA)、レーン1〜1
2はC418に耐性のクローンである。レーン13及び14は細菌抽出物からF
#製されたMmlEである。
結果:クローンのほぼ全体は培地にMalEを運搬し、発現レベルは可変である
(検出限界:クローン2.4及び5又は多量:クローン3及び12)。
従って、MalEを発現及び運搬する安定なりローンを得ることが可能である。
l影1
方法:細胞培養物の上清(先: C060及びに:第7図のクローン12−cf
)をアミロースカラム上に堆積させた。カラムを滉浄し、1100IIIのマル
トースにより溶離さぜた。L(再精成夷験)では、カラムに充填する前に細菌抽
出物から精製した11IgのMalEをcoaos胞の上清と混合した。いずれ
の埒合も溶離後に8個のフラクションを収集した。
結果:L:再構成実験によると、使用した実験条件下でマルトースによりタンパ
ク質MalEが溶離することが判明した。 MalEは最初のフラクションから
検出されるので、カラムは恐らくオーバーロードであると思われる9更に長く洗
浄すると通常の結果により合致するような溶離プロフィルに達するものと思われ
る。F: クローン12により合成されるタンパク質MalEはアミロースカラ
ム上に保持され、マルトースにより溶離される(フラクション8)。
このように、ハムスター細胞により合成されたタンパク11M1lEをアミロー
スカラム上で精製することが可能である。
真核生物細胞により合成されるMalHに融合されるタンパク質もこの方法によ
り精製可能である。
従って、MalEは既存の他のシステムにおけるベクタータンパク質と同様に複
数の利点を有する。即ち該タンパク質は細菌タンパク質であり、中位の寸法であ
り、単量体であり、随意にペリプラズム又は細胞質タンパク質であり、真核生物
細胞により発現され、非常に廉価なアフィニティ支持体上でのアフィニティクロ
マトグラフィにより容易に精製可能であり、合成ポリペプチド又はタンパク質の
十分な活性の維持に適合可能な生理的条件で樹脂から溶離させることができる。
更に該タンパク質は、−最に細胞質のタンパク質をペリプラズム空間に運搬する
ことが可能である。
細胞質タンパク質をペリプラズム領域に運搬する能力はその都度実験により予測
できよう、この領域I\の運搬能力はそのためのタンパクiiMalEの効力が
非常に大きいこと及びタンパク質の正確な折り畳みが得られるより以前であって
もこの運搬を実施可能なことに起因すると解釈できるという事実にも着目するこ
とができる。
7)Stre tococcus neumoniaeの ンバク′Ma1χ
び−l′+のタンパク声MalHの
この試験の結果を第9図に示す、尚、第9図中、MalE及びMalXの同一残
基はグレーの領域により示し、2種のタンパク質の間の相同残基は鉛直線により
示し、黒い矢印はMalEの前駆物質の開裂部位を示し、グレーの矢印はMal
Xの予想される開裂部位を示し、約60〜80個のアミノ酸がMalXのC末端
部分を精成している。
MalE及びMalXの相同度は非常に高い(334個のアミノ酸の同一残基が
31%であり、同−及び相同残基を区別しなければ相同度は約75%に達する)
。
プラスミドpHB11及びpHB15は1987年5月18日付けでパリ、パス
ツール研究所のCo11ection Nationale des Cu1t
uresde Micro−OrganisIPes (CNCM)に夫々寄託
番号1−662及び1−663として寄託した。プラスミドpSVME、pTM
E、 pTMET、pTTMEは1988年5月10日イ寸けでC0LLECT
ION NATIONALE DESCLLTURES DE MICRO−O
RGANISMESに夫々寄託番号[759,1−760,l−761,1−7
62として寄託し、pMETは1988年5月16日付けて寄託番号1−763
として寄託した。
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13、 LAOs、 S、A、、 Genetics、 60.685−706
. (196B)。
国際調査報告
、 KT/F’R8B10024B
国際調査報告
FRB800248
SA 22507
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.それ自体選択された特性を有する所定のペプチド鎖を含むポリペプチドの製 造及び精製方性であって、該方法は、そのために形質転換され培養された適当な 宿主生物中で、該ペプチド鎮をコードする配列とベクターポリペプチドの1又は 複数の部分をコードする1又は複数の別の配列とを含むオーブンリーディング相 の組換体核酸を発現させる段階と、組換体核酸により発現されるハイブリッドポ リペプチドを該宿主細胞からの抽出物として回収する段階と、精製段階とを含ん でおり、ベクターポリペプチドが少なくとも1種の所定の糖に対して親和性のタ ンパク質であり、該「ベクターポリペプチドの1又は複数の部分をコードする1 スは複数の配列」は、元のベクターポリペプチドの細胞質外への運搬特性及び所 定の糖に対する親和性が該ハイブリッドポリペプチド中で保持されるようになっ ており、精製段階が、ハイブリッドポリペプチド抽出物を、親和性タンパク質と 糖との相互親和性に適合往で不溶化形態の対応する糖、特に重合糖と接触させる 段階を含んでおり、糖に固定されない生成物の分離後、該所定のペプチド鎖を含 むハイブリッドポリペプチドを回収することを特徴とする前記方法。 2.ハイブリッドポリペプチドから分離することにより、該選択された特性を有 する所定のペプチド鎖を回収する付加段階を含んでいることを特徴とする請求項 1に記載の方法。 3.組換体核酸が、所定のペプチド鎖をコードする核酸配列の完全に下流に配置 された、ベクターポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいることを特徴と する請求項1又は2に記載の方法。 4.組換体核酸が、所定のペプチド鎖をコードする核酸配列の完全に上流に配置 された、ベクターポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいることを特徴と する請求項1又は2に記載の方法。 5.組換体核酸が、所定のペプチド鎖をコードし且つベクターポリペプチドをコ ードする核酸配列の許容部位のレベルに挿入された核酸配列を含んでいることを 特徴とする請求項1又は2に記載の方法。 6.組換体核酸が、特異的酵素又は特異的化学処理により選択的に開裂可能なア ミノ酸配列をコードし且つ夫々該ベクターポリペプチド及び該ペプチド鎖をコー ドする組換体核酸の部分の間に配置されたサブ配列、及び場合によっては、ベク ターポリペプチドをコードする配列の下流に配置された類似の配列を含んでいる ことを特徴とする請求項2及び3に記載の方法。 7.組換体核酸が、特異的酵素により選択的に開裂可能なアミノ酸配列をコード し且つ夫々該ベククーポリペプチド及び該ペプチド鎖をコードする組換体核酸の 部分の間に配置されたサブ配列、及び場合によっては、該ペプチド鎖をコードす る配列の下流に配置された類似の配列を含んでいることを特徴とする請求項2及 び4に記載の方法。 8.組換体核酸が.特異的酵素又は特異的化学処理により選択的に開裂可能なア ミノ酸配列をコードし且つ夫々該所定のペプチド鎖をコードする核酸配列の上流 及び下流に配置された2つのサブ配列を含んでいることを特徴とする請求項2及 び5に記載の方法。 9.糖に固定された生産物を特異的酵素スは特異的化学処理で処理することによ り、該生産物から該選択された特性を有する所定のペプチド鎖を回収することを 特徴とする請求項2から8のいずれかに記載の方法。 10.不溶化糖からハイブリッドポリペプチドを回収後、特異的酵素又は特異的 化学処理により溶液状態のハイブリッドポリペプチドを処理し、ハイブリツドク ンバク質の開裂生成物を不溶化糖と再度接触させ、主に所望のペプチド鎖から構 成される非固定状態のポリペプチドを回収することを特徴とする請求項2から8 のいずれかに記載の方法。 11.組換体核酸が特に培地中において、宿主生物の外側から供給され得る化合 物により抑制可能なプロモーターの制御下におかれ、まず第1段階として予め該 核酸配列で形質転換された宿主生物を該化合物の存在下で培養し、その後、該核 酸配列の発現を可能にする条件下で該培養物に対する該化合物の作用を除くこと を特徴とする請求項1から10のいずれかに記載の方法。 12.ベクターポリペプチドがマルトースに対して親和性のタンパク質から構成 されており、不溶化糖がα(1−4)グルコースの不溶性ポリマーすなわちアミ ロースであることを特徴とする請求項1から11のいずれかに記載の方法。 13.ベクターポリペプチドがグラム陰性菌中でマルトースに対して親和性のタ ンパク質であることを特徴とする請求項12に記載の方法。 14.ベクターポリペプチドが大腸菌のマルトースに対して親和性のタンパク質 (MalE)であることを特徴7する請求項13に記載の方法。 15.ベクターポリペプチドがグラム陽性菌中でマルトースに対して親和性のタ ンパク質であることを特徴とする請求項12に記載の方法。 16ベクターポリペプチドがStreptococcus pneumonia e中でマルトースに対して親和性のタンパク質(MalX)であることを特徴と する請求項15に記載の方法。 17.ハイブリッドポリペプチドの製造に使用される宿主生物がグラム陰性菌、 特に大腸菌であることを特徴とする請求項12から16のいずれかに記載の方法 。 18.ハイブリッドポリペプチドの製造に使用される宿主生物がグラム陽性菌、 特にBsubtilisであることを特徴とする請求項12から16のいずれか に記載の方法。 19.ハイブリッドポリペプチドの製造に使用される宿主生物が真核生物細胞で あることを特徴とする請求項12から16のいずれかに記載の方法。 20.所定のポリペプチドがエビトープであり、該エビトープをコードする核酸 配列がマルトースに対して親和性のタンパク質をコードする配列の許容部位のレ ベルに挿入されていることを特徴とする請求項17から19のいずれかに記載の 方法。 21.抗原、特に所定のエビトープに対して指向された抗体により中和可能な病 原抗原に対して指向された免疫性組成物であって、請求項20に記載の方法によ り得られ且つ所定のエビトープを含むハイブリッドポリペプチドを、ワクチン組 成物の製造に適当なビヒクルと組み合わせることを特徴とする前記組成物。 22.該当細胞を導入することが可能な生物の免疫系により認識可能な特徴的エ ビトープをその外側表面レベルに有する細胞培養物であって、該細胞が、糖に対 して親和性のタンパク質をコードする核酸配列の許容部位のレベルに挿入された 該エビトープをコードする核酸配列を含むオーブンリーディング相の組換体核酸 によって形質転換されていることを特徴とする前記細胞培養物。 23.糖に対して親和性のタンパク質がタンパク質MalE又はタンパク質Ma lEであり、該細胞がグラム陰性菌、又はグラム陽性歯、又は真核生物細胞の株 であることを特徴とする請求項22に記載の細胞培養物。 24.抗原、特に所定のエビトープに対して指向された抗体により中和可能な病 原抗原に対して指向された免疫性組成物であって、請求項22又は23に記載の 細胞を、医薬上の見地からワクチン組成物の製造に適当なビヒクルと組み合わせ ることを特徴とする前記組成物。 25.所定のペプチド鎖をコードする核酸配列及びベクターポリペプチドの1又 は複数の部分をコードする1又は複数の別の配列を含むオーブンリーディング相 の組換体核酸であって、該「ベクターポリペプチドの1又は複数の部分をコード する1又は複数の配列」は、元のベクターポリペプチドの細胞質外への運搬特性 及び所定の糖に対する親和性が該組換体核酸により発現されるハイブリッドポリ ペプチド中で保持されるようになっており、該核酸配列がグラム陽性菌により認 識される調節要素、特に転写促進及び終結要素の制御下におかれることを特徴と する前記組換体核酸。 26.所定のペプチド鎖をコードする核酸配列及びベクターポリペプチドの1又 は複数の部分をコードする1スは複数の別の配列を含むオーブンリーディング相 の組換体核酸であつて、該「ベクターポリペプチドの1又は複数の部分をコード する1又は複数の配列」は、元のベクターポリペプチドの細胞質外への運搬特性 及び所定の糖に対する親和性が該ハイブリッドポリペプチド中で保持されるよう になっており、該核酸配列が真核生物細胞により認識される調節要素、特に転写 促進及び終結要素の制御下におかれることを特徴とする前記組換体核酸。 27.該「ベクターポリペプチドの1スは複数の部分をコードする1又は複数の 配列」が、タンパク質MaHlE又はHMalXの全部又は一部をコードする核 酸配列であることを特徴とする請求項25又は26に記載の組換体核酸。 28.所定のペプチド鎖をコードする核酸及びタンパク質MalXの1又は複数 の部分をコードする1又は複数の別のペプチド配列を含むオーブンリーディング 相の組換体核酸であって、該「MalXの1又は複数の部分をコードする1又は 複数の配列」は、タンパク質Malxの細胞質外への運搬特性及びマルトースに 対する親和性が該粗換体核酸により発現されるハイブリッドポリペプチド中で保 持されるようになっており、該核酸配列がグラム陰性菌により認識される調節要 素、特に転写促進及び終結要素の制御下におかれることを特徴とする前記組換体 核酸。 29.MalE及びMalXをコードする核酸配列全体が、所定のペプチド鎖を コードするDHA配列の上流に配置されていることを特徴とする請求項27又は 28に記載の組換体核酸。 30.MalE及びMaiXをコードする核酸配列全体が、所定のペプチド鎖を コードするDNA配列の下流に配置されていることを特徴とする請求項27又は 28に記載の組換体核酸。 31.所定のペプチド鎖をコードする核酸配列が、MalE及びMalXをコー ドする核酸配列の許容部位のレベルに挿入されることを特徴とする請求項27又 は28に記載の組検体核酸。 32.ベクター、特にプラスミド型のベクターに関することを特徴とする請求項 25から31のいずれかに記載の組換体核酸。
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