CN111333733B - 一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组融合蛋白和多糖结合疫苗。更具体地，本发明涉及包含五聚体的底物蛋白与可形成三聚体的肽序列的融合蛋白，包含所述融合蛋白的免疫原性组合物，所述融合蛋白在免疫中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。

Description

一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

疫苗在病原细菌感染预防方面发挥着重要的作用。新一代疫苗产品(亚单位疫苗)由于成分更加单一明确，使其产品安全性更高，但这些疫苗常常具有较低的免疫原性，注射后在体内会被体液快速稀释以及被迅速降解，因此往往需要一些佐剂和合适的输送系统来促进最大的免疫应答。近年来研究不断的发现，通过将疫苗纳米级能后明显的提高免疫效果，尤其是以纳米为载体的疫苗，已得到了不断地应用，其最主要的特点是能够替代佐剂，能够同时激发细胞免疫和体液免疫，尤其是针对较弱抗原表位，能够产生理想的免疫效果，这对未来疫苗发展提供了一个很好的方向。

多糖结合疫苗是指将具有免疫原性的多糖与适当的底物蛋白共价连接，使多糖抗原由T细胞非依赖抗原转变成了T细胞依赖抗原，使机体能够产生持久的保护效果，尤其是对老人和婴幼儿能够产生有效的抗体。因此，由于同时激发了T细胞依赖和非依赖免疫应答，多糖结合疫苗被认为是目前最成功的疫苗形式之一。然而，当前的技术制备的多糖结合疫苗依然针对某些细菌中免疫应答能力较弱，应答水平需要进一步提高。

因此在目前疫苗基础上，如果能够将多糖结合疫苗中载体蛋白变为蛋白纳米颗粒，将会进一步提高免疫效果。

发明内容

本发明人将已知的原核生物中天然存在的载体蛋白与一段可形成三聚体的肽段进行融合表达，进一步利用糖基化系统将细菌的多糖连入其中，成功得到了纳米级的糖蛋白，动物实验表明抗体水平、杀菌活性以及保护效果较单独的多糖和只有五聚体蛋白的多糖结合疫苗明显提高。表明利用生物法制可制备更具潜力的纳米级多糖结合疫苗，为下一步多糖结合疫苗的发展提供了方向。

融合蛋白

因此，在第一方面，本发明提供了一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白，所述融合蛋白包含能够形成五聚体的AB5毒素B亚基(在本文中，也称为B5或B5蛋白)和可形成三聚体结构的三聚化结构域序列(在本文中，也称为Tri或Tri序列)。

为了方便，上述融合蛋白命名为B5Tri，其中B5是来自细菌的AB5毒素中的B亚单位，能够形成五聚体。在某些实施方案中，B5蛋白选自霍乱毒素B亚单位(CTB)，志贺毒素B亚单位(StxB),大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)，枯草杆菌毒素B亚单位(SubB)。在某些实施方案中，所述CTB氨基酸序列为SEQ ID No.1，核苷酸序列为SEQ ID No.2；StxB氨基酸序列为SEQ ID No.3，核苷酸序列为SEQ ID No.4；LTB氨基酸序列为SEQ ID No.5，核苷酸序列为SEQ ID No.6；SubB氨基酸序列为SEQ ID No.7，核苷酸序列为SEQ ID No.8。

AB5毒素是自然界常见的微生物毒素组成形式，主要由一个A亚单位和B亚单位组成，其中5个B亚单位组成一个环状五聚体，负责与宿主细胞表面结合，催化A亚单位破坏宿主的细胞。

CTB是霍乱毒素的B亚基，能够与大多数哺乳动物细胞表面的神经节苷脂GM1特异性结合,可促进与其连接抗原蛋白通过黏膜屏障，同时增强抗原被DC等抗原提呈细胞的提呈作用，因此CTB是一个良好的载体蛋白。

StxB是志贺毒素的B亚单位，具有强大的免疫调节特性，能够将外源性抗原在抗原提呈细胞中被MHC-I识别，从介导细胞免疫反应，因此，StxB作为一种非活的无毒疫苗载体具有巨大的潜力，已被证明在小鼠体内具有抗肿瘤保护性免疫，其诱导细胞介导免疫的能力也表明其在传染病的免疫预防和治疗中的潜在用途。

LTB为大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位，其结构与功能与CTB类似，均能够通过GM1受体促进免疫应答，此外LTB还能够与细胞表面一些糖脂或者糖蛋白结合，从而促进抗原的识别与提呈。

SubB为枯草杆菌毒素B亚单位，类似于霍乱毒素及不耐热性肠毒素，SubB同样能够激发免疫应答，促进T细胞活化以及炎症因子的释放。

B5Tri融合蛋白中的Tri是指可形成三聚体结构的多肽序列。在某些实施方案中，Tri的氨基酸序列为SEQ ID No.9，核苷酸序列为SEQ ID No.10。该序列为人工设计，且与人类蛋白序列无同源，可在天然条件下形成三聚体。

本发明人惊奇地发现，AB5毒素中的五聚体蛋白如霍乱毒素B亚单位(CTB)，志贺毒素B亚单位(StxB),大肠杆菌不耐热性肠毒素(LTB)，枯草杆菌毒素B亚单位(SubB)，与Tri序列融合表达时，能够自组装为10-20nm的融合蛋白颗粒。该融合蛋白颗粒由B5载体蛋白的五聚体和Tri的三聚体组成，由于同时具备聚集为五聚和三聚的特征，因此多个单体蛋白在空间上可自组装为更高的聚体形式，形成10-20nm的球形颗粒。

在某些实施方案中，所述融合蛋白从N端至C端包含所述AB5毒素B亚基和三聚化结构域序列。

在某些示例性实施方案中，所述融合蛋白包含选自下列的氨基酸序列：

(1)由SEQ ID NO.21所示序列的从N端起第20位至第172位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(2)由SEQ ID NO.23所示序列的从N端起第20位至第157位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(3)由SEQ ID NO.25所示序列的从N端起第20位至第172位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(4)由SEQ ID NO.27所示序列的从N端起第20位至第209位氨基酸残基构成的氨基酸序列。

利用生物法制备多糖结合疫苗主要是利用糖基转移酶宽松的底物特异性，将其与细菌表面多糖和底物蛋白在细菌(通常是大肠杆菌)中共表达，从而使多糖在糖基转移酶的催化下转移到底物蛋白，只需一步纯化即可得到糖蛋白。其中脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL由于具有宽松的底物特异性，几乎可以识别所有的聚糖，而被广泛应用。因此，本发明的融合蛋白可进一步融合包含糖基化位点的序列，从而通过与糖基转移酶共表达，即可将细菌多糖连到本发明的融合蛋白上，制备纳米级的多糖结合疫苗。

因此，在第二方面，本发明还提供了一种融合蛋白，其包含第一方面所述的融合蛋白以及含有O-糖基化位点的糖基化序列。所述糖基化序列能够作为O糖基化修饰系统中的糖基转移酶(例如PglL)的底物蛋白，并在所述糖基转移酶的作用下，细菌O多糖可转移至所述糖基化序列所包含的糖基化位点上。

在某些实施方案中，所述糖基化序列选自脑膜炎奈瑟球菌的菌毛蛋白PilE的包含O-糖基化位点的肽段。在某些实施方案中，所述O-糖基化位点为PilE的自N端起第63位的丝氨酸。在某些实施方案中，所述脑膜炎奈瑟球菌的菌毛蛋白PilE的包含O-糖基化位点的肽段至少包含PilE的自N端起第63位的丝氨酸。在某些实施方案中，所述脑膜炎奈瑟球菌的菌毛蛋白PilE的包含O-糖基化位点的肽段为至少包含自N端起第45位至第73位氨基酸残基的肽段。

在某些实施方案中，所述糖基化序列包含由PilE的自N端起第45位至第73位的氨基酸残基构成的肽段。

在某些实施方案中，所述糖基化序列包含如SEQ ID NO.29所示的序列。

在某些实施方案中，所述融合蛋白从N端至C端包含所述AB5毒素B亚基、三聚化结构域序列和糖基化序列。

在某些示例性实施方案中，所述融合蛋白包含选自下列的氨基酸序列：

(1)由SEQ ID NO.21所示序列的从N端起第20位至第205位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(2)由SEQ ID NO.23所示序列的从N端起第20位至第190位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(3)由SEQ ID NO.25所示序列的从N端起第20位至第205位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(4)由SEQ ID NO.27所示序列的从N端起第20位至第242位氨基酸残基构成的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一方面或第二方面的融合蛋白所包含的任何两个相邻结构域(例如，AB5毒素B亚基与三聚化结构域序列，三聚化结构域序列与糖基化序列)之间任选地通过肽接头连接。在某些实施方案中，所述肽接头包括但不限于KK(赖氨酸-赖氨酸)、GP(甘氨酸-脯氨酸)、GPGP(甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸)、GGS(甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)、GGGS、GGGGS、它们的重复、和它们的各种组合。在某些实施方案中，所述肽接头为包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的柔性氨基酸接头。在某些实施方案中，所述肽接头由1～20个氨基酸(例如，1～15个氨基酸，1～8个氨基酸，2～6个氨基酸，或约4个)组成。在某些示例性实施方案中，所述肽接头具有SEQ ID NO.30所示的序列。

在某些实施方案中，第一方面或第二方面的融合蛋白可进一步包含信号肽，从而有助于本发明的融合蛋白在宿主细胞中的分泌表达。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白在其N端包含信号肽。

AB5毒素B亚基本来具有的信号肽可以完整地融合至本发明的融合蛋白中。或者也可以将其除去，并替换为原核细胞来源的蛋白质的信号肽，例如来自大肠杆菌的分泌蛋白(例如，外膜蛋白或周质蛋白(如DsbA))的信号肽。

在某些示例性实施方案中，所述信号肽具有SEQ ID NO.31所示的序列。

在某些示例性实施方案中，所述融合蛋白包含选自下列的氨基酸序列：

(1)由SEQ ID NO.21所示序列的从N端起第1位至第205位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(2)由SEQ ID NO.23所示序列的从N端起第1位至第190位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(3)由SEQ ID NO.25所示序列的从N端起第1位至第205位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(4)由SEQ ID NO.27所示序列的从N端起第1位至第242位氨基酸残基构成的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一方面或第二方面的融合蛋白可进一步包含蛋白标签(protein tag)。这类蛋白标签是本领域熟知的，其实例包括但不限于His、Flag、GST、MBP、HA、Myc等，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。在某些示例性实施方案中，本发明的融合蛋白包含His标签。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白在其C端包含蛋白标签。

在某些示例性实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQID NO.25或SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列。

蛋白纳米颗粒及其制备

本发明的融合蛋白在细胞中表达后可自组装为纳米颗粒。该蛋白纳米颗粒具有约10-20nm的平均粒径，并且所述蛋白纳米颗粒包含B5蛋白的五聚体和Tri序列的三聚体，或由其组成。

因此，在另一方面，本发明还涉及一种蛋白纳米颗粒，其通过在包含编码第一方面所述的融合蛋白的核苷酸序列的宿主细胞中表达该融合蛋白获得。

在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码第一方面所述的融合蛋白的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。

在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞(例如细菌细胞，如大肠杆菌细胞)。

在另一方面，提供了制备第一方面所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述融合蛋白，其中所述融合蛋白以纳米颗粒的形式存在。

在另一方面，提供了制备蛋白纳米颗粒的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米颗粒。

糖蛋白纳米颗粒

当本发明的融合蛋白包含糖基化序列时，通过在细菌细胞中与糖基转移酶共表达，糖基转移酶可将细菌多糖转移至本发明的融合蛋白，从而可获得糖蛋白纳米颗粒。

因此，在第三方面，本发明提供了制备糖蛋白纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

(1)提供O-抗原连接酶缺失的细菌宿主细胞(bacterial host cell)，通过内源性O-抗原连接酶的缺失，可避免O抗原多糖被O抗原连接酶催化转移到脂质A核心多糖形成脂多糖，从而可产生游离的O抗原多糖；

(2)在所述细菌宿主细胞中表达第二方面所述的融合蛋白和糖基转移酶PglL，从而产生目标糖蛋白纳米颗粒。

在某些实施方案中，所述方法还包括：(3)对目标糖蛋白纳米颗粒进行纯化。在某些实施方案中，通过亲和层析和/或分子筛对目标糖蛋白纳米颗粒进行纯化。在某些实施方案中，当所述融合蛋白包含蛋白标签时，所述方法还可以包括通过使用对该蛋白标签特异性的抗体对目标糖蛋白纳米颗粒进行检测的步骤。

在某些实施方案中，步骤(1)中通过敲除细菌宿主细胞中的内源性O-抗原连接酶基因来提供O-抗原连接酶缺失的细菌宿主细胞。在本文中，在基因的背景下“敲除”意味着携带敲除的宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物。敲除可以以多种方式由去除全部或部分编码序列、引入移码突变使得不产生功能性蛋白质(截短的或无义的序列)、去除或改变调节组分(例如启动子)使得基因不被转录、通过与mRNA的结合阻止翻译等来产生。通常，敲除在基因组DNA水平上进行，使得细胞的后代也永久地携带敲除。

在某些实施方案中，所述O-抗原连接酶基因为waaL基因。

在某些实施方案中，所述细菌宿主细胞为病原性细菌细胞。在某些实施方案中，所述细菌宿主细胞为病原性革兰氏阴性菌(革兰氏阴性病原菌)细胞。在某些实施方案中，所述细菌宿主细胞选自志贺氏菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌。

在某些实施方案中，第二方面的融合蛋白和PglL在同一细菌宿主细胞中共表达。共表达可选地通过在相同或不同表达载体上表达各个蛋白而进行。细菌宿主细胞可以被两种表达载体所共转染，第一种载体编码融合蛋白以及第二种载体编码PglL。或者，可以使用编码并能表达融合蛋白和PglL的单个载体。

在某些实施方案中，步骤(2)包括以下步骤：

(2a)将编码第二方面的融合蛋白的第一核苷酸序列和编码PglL的第二核苷酸序列引入所述细菌宿主细胞中，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的表达载体(例如，原核表达载体)上；

(2b)培养所述细菌宿主细胞(例如在允许蛋白表达的条件下)；

(2c)从细胞培养物(例如细胞裂解物)中回收目标纳米糖蛋白颗粒。

在第四方面，本发明提供了一种糖蛋白纳米颗粒，其包含蛋白与多糖的偶联物，所述偶联物由细菌O多糖和第二方面所述的融合蛋白偶联而成，所述细菌O多糖通过所述融合蛋白中的糖基化序列中的O-糖基化位点偶联到第二方面所述的融合蛋白上。

在某些实施方案中，所述细菌O多糖选自病原性细菌的O多糖。

在某些实施方案中，所述细菌O抗原多糖选自志贺氏菌O多糖、大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖、甲型副伤寒沙门氏菌O多糖、霍乱弧菌O多糖。

在某些实施方案中，在所述糖蛋白纳米颗粒中，所述融合蛋白中的AB5毒素B亚基以五聚体形式存在，所述融合蛋白中的三聚化结构域序列以三聚体形式存在。

在某些实施方案中，所述糖蛋白纳米颗粒的平均粒径为约25-50nm。

在某些实施方案中，所述糖蛋白纳米颗粒通过第三方面所述的方法制备。

糖蛋白纳米颗粒的应用

在第五方面，本发明提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含：(i)免疫学有效量的第四方面所述的糖蛋白纳米颗粒，或者(ii)免疫学有效量的混合物，所述混合物包含第一或第二方面所述的融合蛋白或由所述融合蛋白所形成的蛋白纳米颗粒、以及细菌多糖(例如细菌O多糖)。优选地，所述免疫原性组合物或疫苗不包含佐剂。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗用于在受试者中诱导针对细菌O多糖的免疫应答(例如抗体应答)，和/或用于预防和/或治疗细菌感染(例如由表达O多糖的细菌所导致的感染)。

在某些实施方案中，所述细菌是病原性细菌。在某些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性菌。在某些实施方案中，所述细菌是病原性革兰氏阴性菌(革兰氏阴性病原菌)。在某些实施方案中，所述细菌选自志贺氏菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌。

在某些实施方案中，所述细菌O多糖选自病原性细菌的O多糖。在某些实施方案中，所述细菌O抗原多糖选自志贺氏菌O多糖、大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖、甲型副伤寒沙门氏菌O多糖、霍乱弧菌O多糖。

在某些实施方案中，所述免疫原性组合物或疫苗还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明的糖蛋白纳米颗粒、或免疫原性组合物或疫苗可以为医学领域已知的任何形式，例如，可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)、吸入剂、喷雾剂等形式。技术人员应理解，优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。在某些实施方案中，本发明的糖蛋白纳米颗粒、或免疫原性组合物或疫苗是注射制剂，例如注射液、注射用无菌粉末或注射用浓溶液。

本发明的糖蛋白纳米颗粒、或免疫原性组合物或疫苗可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、直肠、肠胃外或局部给药。在某些实施方案中，本发明的糖蛋白纳米颗粒、或免疫原性组合物或疫苗通过肠胃外给药，例如，皮下注射、静脉注射、腹膜内注射、肌肉注射、胸骨内注射和注入。用于肠道外给药的剂型可以为注射制剂，包括注射液、注射用无菌粉末或注射用浓溶液。除活性成分以外，注射剂型可含有药学上可接受的载体例如无菌水、林格氏液和等渗氯化钠溶液，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。

此外，还可以使用药学领域已知的其它载体材料和给药方式。本发明的糖蛋白纳米颗粒、或免疫原性组合物或疫苗可以通过任何公知的制药工艺制备，例如有效的制剂和给药方法。

在第六方面，本发明提供了第四方面所述的糖蛋白纳米颗粒或第五方面所述的免疫原性组合物或疫苗在制备用于在受试者中诱导针对细菌O多糖的特异性免疫应答(例如抗体应答)和/或用于预防和/或治疗细菌感染(例如由表达O多糖的细菌所导致的感染)的产品中的应用。在某些实施方案中，所述产品为疫苗。

在某些实施方案中，所述细菌是病原性细菌。在某些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性菌。在某些实施方案中，所述细菌是病原性革兰氏阴性菌(革兰氏阴性病原菌)。在某些实施方案中，所述细菌选自志贺氏菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌。

在某些实施方案中，所述细菌O多糖选自病原性细菌的O多糖。在某些实施方案中，所述细菌O抗原多糖选自志贺氏菌O多糖、大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖、甲型副伤寒沙门氏菌O多糖、霍乱弧菌O多糖。

在第七方面，本发明还提供了一种用于在受试者中诱导针对细菌O多糖的特异性免疫应答(例如抗体应答)和/或用于预防和/或治疗细菌感染(例如由表达O多糖的细菌所导致的感染)的方法，其包括：向有此需要的受试者施用免疫学有效量的第四方面所述的糖蛋白纳米颗粒或第五方面所述的免疫原性组合物或疫苗。

在某些实施方案中，所述细菌是病原性细菌。在某些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性菌。在某些实施方案中，所述细菌是病原性革兰氏阴性菌(革兰氏阴性病原菌)。在某些实施方案中，所述细菌选自志贺氏菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌。

在某些实施方案中，所述细菌O多糖选自病原性细菌的O多糖。在某些实施方案中，所述细菌O抗原多糖选自志贺氏菌O多糖、大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖、甲型副伤寒沙门氏菌O多糖、霍乱弧菌O多糖。

在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

本发明还包括以下示例性实施方案：

项目1、一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白，所述融合蛋白包含：能够形成五聚体的来自细菌的载体蛋白B5和能够形成三聚体结构的多肽序列Tri。

项目2、根据项目1所述的融合蛋白，其中所述B5蛋白选自霍乱毒素B亚单位(CTB)，志贺毒素B亚单位(StxB),大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(LTB)或枯草杆菌毒素B亚单位(SubB)，优选地，所述CTB氨基酸序列为SEQ ID No.1，核苷酸序列为SEQ ID No.2；StxB氨基酸序列为SEQ ID No.3，核苷酸序列为SEQ ID No.4；LTB氨基酸序列为SEQ ID No.5，核苷酸序列为SEQ ID No.6；SubB氨基酸序列为SEQ ID No.7，核苷酸序列为SEQ ID No.8。

项目3、根据项目1或2所述的融合蛋白，其中所述Tri是能够形成三聚体结构的多肽序列，优选地，Tri的氨基酸序列为SEQ ID No.9，核苷酸序列为SEQ ID No.10。

项目4、根据项目1-3任一项所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12的第20-172位所示，或如SEQ ID NO.14的第20-157位所示，或如SEQ ID NO.16的第20-172位所示，或如SEQ ID NO.18的第20-209位所示。

项目5、根据项目1-4任一项所述的融合蛋白，其在表达后能够自组装为10-20nm的纳米颗粒，其由B5蛋白的五聚体和Tri的三聚体组成。

项目6、根据项目1-4任一项所述的融合蛋白，其进一步包含：脑膜炎奈瑟球菌的菌毛蛋白PilE的包含O-糖基化位点的肽段，优选地，所述肽段是PilE从N端的第45位的丝氨酸(S45)起始至第73位赖氨酸(K73)的肽段，优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.15，17，19或21。

项目7、一种糖蛋白纳米颗粒，其包含蛋白与多糖的偶联物，所述偶联物由细菌O多糖和项目6所述的融合蛋白偶联而成，所述细菌多糖通过糖基化位点4573偶联到项目6所述的融合蛋白上，优选地，所述细菌O抗原多糖选自志贺氏菌O多糖、大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖、甲型副伤寒沙门氏菌O多糖、霍乱弧菌O多糖。

项目8、根据项目7所述的糖蛋白纳米颗粒，其为尺寸为25-50nm左右。

项目9、制备项目7或8所述的糖蛋白纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

1)构建O-抗原连接酶缺失的宿主菌；

2)构建项目6所述的融合蛋白和糖基转移酶PglL的共表达载体，并转入上述宿主菌中诱导表达；

3)对目标纳米糖蛋白颗粒进行纯化，优选地，通过亲和层析和分子筛对目标纳米糖蛋白颗粒进行纯化。

项目10、根据项目7或8所述的糖蛋白纳米颗粒用于在动物体内产生抗细菌多糖的特异性抗体的产品中的应用，优选地，所述产品为疫苗。

项目11、一种免疫原性组合物，其用于诱导对细菌多糖的免疫应答，所述免疫原性组合物包含免疫学有效量的项目7或8所述的糖蛋白纳米颗粒，优选地，所述免疫原性组合物不包含佐剂。

项目12、一种疫苗，其用于诱导对细菌多糖的免疫应答，所述疫苗包含免疫学有效量的项目1-6任一项所述的融合蛋白和细菌多糖，或者项目7或8所述的糖蛋白纳米颗粒，优选地，所述疫苗不包含佐剂。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的微生物学、免疫学、生物化学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“O多糖”是指脂多糖的最外层部分，由数十个相同的寡糖单位组成。O多糖具有抗原性质，所以也称为O-抗原。O抗原是革兰阴性菌特异多糖的菌体抗原。

如本文中所使用的，术语“AB5毒素B亚基”可与“B5”或“B5蛋白”互换使用。由细菌产生的AB5毒素是由产毒素细菌产生并分泌至细菌细胞之外的蛋白质性外毒素。AB5毒素由一个具有毒性的活性亚基(A亚基)和五个具有细胞结合活性的结合亚基(B亚基)组成。AB5毒素B亚基可自组装为五聚体。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，防腐剂，稳定剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。

如本文中所使用的，术语“免疫学有效量”是足以提供针对细菌感染(例如由革兰氏阴性病原菌所导致的感染)的保护性免疫应答或诱导机体产生针对免疫原(例如，细菌多糖抗原)的保护性免疫应答的量。在某些实施方案中，所述量应足以显著阻止细菌感染(例如由革兰氏阴性病原菌所导致的感染)的可能性或严重程度。本发明的糖蛋白纳米颗粒、或免疫原性组合物或疫苗的免疫学有效量可根据患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况(例如年龄、体重和性别)、药物的施用方式、以及同时施用的其他治疗等等因素发生变化。

有益效果

本发明人首次发现，将B5毒素B亚基与一段可形成三聚体的肽段进行融合表达，并利用糖基化系统将细菌的多糖连入其中，可获得纳米级的糖蛋白。该纳米级糖蛋白在诱导抗体水平、杀菌活性以及保护效果等方面均显著优于单独的多糖抗原和仅结合B5毒素B亚基载体蛋白的多糖结合疫苗。因此本发明的纳米级糖蛋白特别适用于诱导针对细菌O多糖的特异性免疫应答、以及用于预防和/或治疗细菌感染，具备重大临床价值。

附图说明

图1显示了CTBTri纯化后单体大小及形成颗粒的尺寸的检测结果。A：考马斯亮蓝染色分析及western blot检测结果；B：动态光散射检测结果；C：透射电镜检测结果。

图2显示了StxBTri表达纯化后单体大小及形成颗粒的尺寸的检测结果。A：考马斯亮蓝染色分析及western blot检测结果；B：动态光散射检测结果；C：透射电镜检测结果。

图3显示了LTBTri表达纯化后单体大小及形成颗粒的尺寸的检测结果。A：考马斯亮蓝染色分析及western blot检测结果；B：动态光散射检测结果；C：透射电镜检测结果。

图4显示了SubBTri表达纯化后单体大小及形成颗粒的尺寸的检测结果。A：考马斯亮蓝染色分析及western blot检测结果；B：动态光散射检测结果；C：透射电镜检测结果。

图5显示了四种糖蛋白CTBTri4573-OPS、StxBTri4573-OPS、LTBTri4573-OPS和SubBTri4573-OPS的表达检测结果。

图6显示了四种糖蛋白CTBTri4573-OPS、StxBTri4573-OPS、LTBTri4573-OPS、SubBTri4573-OPS过分子筛后的考马斯亮蓝染色分析。

图7显示了四种糖蛋白CTBTri4573-OPS、StxBTri4573-OPS、LTBTri4573-OPS、SubBTri4573-OPS的颗粒动态光散射检测粒径大小及透射电镜分析。A：动态光散射；B：透射电镜。

图8显示了B5Tri4573-OPS(CTBTri4573-OPS、StxBTri4573-OPS、LTBTri573-OPS、SubBTri4573-OPS)免疫小鼠后的抗体效价测定结果。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。

图9显示了B5Tri4573-OPS(CTBTri4573-OPS、StxBTri4573-OPS、LTBTri573-OPS、SubBTri4573-OPS)小鼠免疫后的攻毒试验结果。

图10显示了CTBTri4573-OPS免疫小鼠后的不同IgG亚型抗体效价的测定结果。****p<0.0001。

图11显示了CTBTri4573-OPS加与不加佐剂免疫小鼠后的不同IgG亚型抗体效价比较。*p<0.05，**p<0.01。

图12显示了CTBTri4573-OPS所诱导产生的抗血清的体外杀菌活性检测。

图13显示了CTBTri4573-OPS小鼠免疫后的攻毒试验结果。

序列信息

表1：本发明涉及的序列的信息提供于下面的表中。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的缺失O-抗原连接酶基因waaI的无毒福氏志贺氏菌301DWP由福氏志贺氏菌2a 301野生株(S.flexneri 2a 301)(Jin Q等人.Nucleic Acids Res.2002Oct15；30(20):4432-41)改造而来，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生物工程研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pET28a(+)购自Novagen。

下述实施例中的HRP标记的Anti-His抗体为Abmart产品，货号为M20020。

下述实施例中的兔源福氏II型血清为日本生研株式会社产品，编号为210227。

下述实施例中的HRP标记的山羊抗兔为TransGen公司产品，编号为HS-101-01。

下述实施例中的HRP标记的驴抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3购自Abcam公司，编号分别为ab6820，ab97240，ab97245，ab97250，ab97260。

下述实施例中氢氧化铝佐剂Rehydragel LV购自General Chemical公司，编号为203120070602。

下述实施例中补体购自Pel-Freez公司，编号为31061-3。

实施例1.纳米颗粒载体的构建与表达

1)B5Tri融合蛋白表达载体的构建

本实施例构建表达B5蛋白与Tri序列融合蛋白(B5Tri)的载体，其中，B5蛋白包括霍乱毒素B亚单位(CTB)、志贺毒素B亚单位(StxB)、大肠杆菌不耐热性肠毒素(LTB)、枯草杆菌毒素B亚单位(SubB)，Tri序列为SEQ ID NO.9。构建方法如下：

CTBTri表达载体构建：根据GeneBack公布的霍乱毒素B亚单位(X76390.1)氨基酸序列，将其信号肽(前21位氨基酸)替换为DsbA信号肽(SEQ ID NO.31)，在CTB的C端融合Tri序列，从而构建CTB融合蛋白CTBTri。CTBTri表达盒中，CTBTri的表达由tac启动子启动，将该表达盒命名为tacCTBTri，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，其中第103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-729位核苷酸为CTBTri的编码序列(CTBTri蛋白从N端至C端依次为DsbA信号肽、CTB、Tri和His标签)，其中自5’末端起第178位至第234位为信号肽序列，235位至第543位为CTB编码序列，556至693位为Tri序列。CTBTri蛋白的氨基酸序列如SEQID No.12所示，自N端起第1位至第19位为DsbA信号肽序列，第20至第122位CTB氨基酸序列，第123至第126位为柔性linker，第127至第172位为Tri序列。

StxBTri表达载体构建:StxBTri表达盒中，StxBTri的表达由tac启动子启动，将该表达盒命名为tacStxBTri，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，其中第103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-684位核苷酸为StxBTri的编码序列(StxBTri蛋白从N端至C端依次为DsbA信号肽、StxB、Tri和His标签)，其中自5’末端起第178位至第234位为信号肽序列，235位至第498位为StxB编码序列，511至648位为Tri序列。StxBTri蛋白的氨基酸序列如SEQID No.14所示，自N端起第1位至第19位为DsbA信号肽序列，第20至第107位StxB氨基酸序列，第108至第111位为柔性linker，第112至第157位为Tri序列。

LTBTri表达载体构建:LTBTri表达盒中，LTBTri的表达由tac启动子启动，将该表达盒命名为tacLTBTri，其核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，其中第103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-729位核苷酸为LTBTri的编码序列(LTBTri蛋白从N端至C端依次为DsbA信号肽、LTB、Tri和His标签)，其中自5’末端起第178位至第234位为信号肽序列，235位至第543位为LTB编码序列，556至693位为Tri序列。LTBTri蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.16所示，自N端起第1位至第19位为DsbA信号肽序列，第20至第122位LTB氨基酸序列，第123至第126位为柔性linker，第127至第172位为Tri序列。

SubBTri表达载体构建:SubBTri表达盒中，SubBTri的表达由tac启动子启动，将该表达盒命名为tacSubBTri，其核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，其中第103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-840位核苷酸为SubBTri的编码序列(SubBTri蛋白从N端至C端依次为DsbA信号肽、SubB、Tri和His标签)，其中自5’末端起第178位至第234位为信号肽序列，235位至第654位为SubB编码序列，667至804位为Tri序列。SubBTri蛋白的氨基酸序列如SEQID No.18所示，自N端起第1位至第19位为DsbA信号肽序列，第20至第159位为SubB氨基酸序列，第160至第163位为柔性linker，第164至第209位为Tri序列。

用XbaI和XhoI分别酶切SEQ ID No.11，13，15，17所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，分别得到含有SEQ ID No.11，13，15，17所示的DNA分子的重组载体，将该重组载体命名为pET28-tacB5Tri(B5分别为CTB，StxB，LTB以及SubB)。

2)B5Tri表达菌株的构建及表达

将pET28-tacB5Tri载体分别化转入BL21感受态，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，阳性克隆即BL21/pET28-tacB5Tri。挑取BL21/pET28-tacB5Tri，接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃，220转/分钟培养10小时后转接于5mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃，220转/分钟培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至30℃诱导10h。

取上述30℃诱导10h的各菌液1mL，离心取菌体，用1X还原缓冲液(50mM pH6.8Tris-HCl,1.6％SDS,0.02％溴酚蓝，8％甘油，20mM DTT)悬起，沸水浴10min，用12％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用鼠源HRP-Anti-His tag单克隆抗体检测蛋白表达条带。

实施例2.纳米颗粒纯化及检测

将BL21/pET28-tacB5Tri接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃，220转/分钟培养10小时后转接于5L LB培养基37℃，220转/分钟培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至30℃诱导10h。

样品处理：取上述30℃诱导10h的菌体，加入400mL上样缓冲液(20mM pH7.5 Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑)，超声破菌(超声3s暂停5s，累计超声时间30min)，12000g离心，收集上清。

样品纯化：首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO₄的水溶液平衡至少3个柱床体积，再用B1液(20mMpH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)平衡至少一个柱床体积，最后用A1液(20mM pH7.5Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)平衡至少3个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道上样，再用A1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)洗去未结合蛋白，冲洗至紫外吸收(280nm)接近于0mAU，最后用100％B1(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液30mL，得到纯化的样品，之后再过分子筛(superdex 200)流动相为1×PBS，pH7.4。

四种融合蛋白(CTBTri、StxBTri、LTBTri、SubBTri)过分子筛后考马斯亮蓝染色分析(图1A-4A)，可得到纯度大于90％的蛋白样品。利用His标签抗体进行western blot验证，四种融合蛋白的检测结果分别如图1A-4A所示。利用动态光散射和透射电镜对样品尺寸进行检测，四种融合蛋白的动态光散射检测结果分别如图1B-4B所示，四种融合蛋白的透射电镜检测结果分别如图1C-4C所示。可以看到尽管蛋白单体只有约20kDa，但在天然状态下可形成约10-20nm的蛋白颗粒。

实施例3.生物法制备纳米级细菌多糖结合疫苗

3.1B5Tri(B5分别为CTB，StxB，LTB以及SubB)糖基化表达载体的构建

3.1.1脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL表达载体的构建：脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL(GeneBank：JN200826.1)的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，其编码序列如SEQID No.20的第180-1994位核苷酸所示。SEQ ID No.20的第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，第105-2240位核苷酸为PglL表达盒的序列，PglL表达盒中，PglL的表达由tac启动子启动，将该表达盒命名为tacpglL。其中，SEQ ID No.20的第105-133位核苷酸为tac启动子的序列，第180-1994位核苷酸为脑膜炎奈瑟球菌糖基转移酶PglL的编码序列，第2475-2480位核苷酸为SacI识别序列，第2486-2491位核苷酸为XhoI识别位点。

用XbaI和XhoI酶切SEQ ID No.20所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到含有SEQ ID No.20所示的DNA分子的重组载体，将该重组载体命名为pET28-tacpglL。

3.1.2B5Tri序列融合O糖基化位点(B5Tri4573)：PilE为脑膜炎奈瑟球菌的菌毛蛋白，在脑膜炎奈瑟球菌中，在糖基转移酶PglL催化下可被O-糖基化，糖基化位点是PilE的第63位丝氨酸，为了获得糖基化修饰序列，我们将PilE从N端的第45位的丝氨酸(S45)起始，至第73位赖氨酸(K73)结束，截取S45～K73的29个氨基酸，将其融合至B5Tri的C端；同时，为了避免B5与Tri肽段之间有空间位阻效应，B5和Tri肽段由4个柔性氨基酸连接。

CTBTri4573的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示，基因序列如SEQ ID No.22的第178-816所示，SEQ ID No.22的第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，第103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-792位核苷酸为CTBTri4573的编码序列，第793-798位核苷酸为XhoI识别序列，第799-816位核苷酸为His标签。

StxBTri4573的氨基酸序列如SEQ ID No.23所示，基因序列如SEQ ID No.24的第178-771所示，SEQ ID No.24的第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-747位核苷酸为StxBTri4573的编码序列，第748-753位核苷酸为XhoI识别序列，第754-771位核苷酸为His标签。

LTBTri4573的氨基酸序列如SEQ ID No.25所示，基因序列如SEQ ID No.26的第178-816所示，SEQ ID No.26的第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-792位核苷酸为LTBTri4573的编码序列，第793-798位核苷酸为XhoI识别序列，第799-816位核苷酸为His标签。

SubBTri4573的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示，基因序列如SEQ ID No.28的第178-927所示，SEQ ID No.28的第1-6位核苷酸为XbaI识别位点，103-131位核苷酸为tac启动子的序列，第178-903位核苷酸为SubBTri4573的编码序列，第904-909位核苷酸为XhoI识别序列，第910-927位核苷酸为His标签。

用XbaI和XhoI酶切SEQ ID No.22，24，26，28所示的DNA分子，得到基因片段；用XbaI和XhoI酶切pET28a(+)，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组载体，将该重组载体命名为pET28-tacB5Tri4573(B5分别为CTB，StxB，LTB以及SubB)。

构建B5Tri4573糖基化表达载体具体方法为：

利用引物：SacI-UP(SEQ ID NO.32)/XhoI-Down(SEQ ID NO.33)分别扩增pET28-tacB5Tri4573(B5分别为CTB、StxB、LTB、SubB)，得到对应的扩增产物，用SacI和XhoI分别双酶切扩增产物得到DNA片段；用SacI和XhoI双酶切pET28-tacpglL，得到载体大片段；将各基因片段分别与载体大片段连接，得到重组质粒，命名为pET28-tacpglL-tacB5Tri4573(B5分别为CTB、StxB、LTB、SubB),其中，B5Tri4573的编码基因组成的表达盒(即tacB5Tri4573)位于pglL表达盒(tacpglL)下游，将重组质粒送测序，结果均正确。

3.2 301DWP感受态细胞的制备

将敲除O-抗原连接酶的减毒志贺氏菌301DWP接种于LB液体培养基中，由于细菌缺失了O-抗原连接酶，因此可以产生游离的O抗原，经30℃过夜培养后，将1ml培养液转接到100mL低盐LB液体培养基中，30℃培养至OD600达到0.6，离心收集菌体，用灭菌的体积百分含量为10％甘油的水溶液洗涤四次，最后用400uL灭菌的体积百分含量为10％甘油的水溶液重悬细菌，即可获得电击转化用的301DWP感受态细胞，分装待用。

3.3表达菌株的构建

将质粒pET28-tacpglL-tacB5Tri4573(B5分别为CTB、StxB、LTB、SubB)分别电击转化入上述3.2所获得的301DWP感受态细胞中，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，阳性克隆即301DWP/pET28-tacpglL-tacB5Tri4573(B5分别为CTB、StxB、LTB、SubB)。

3.4蛋白表达与检测

分别挑取301DWP/pET28-tacpglL-tacB5Tri4573(B5分别为CTB、StxB、LTB、SubB)单克隆，接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至30℃诱导10h。

次日取上述30℃诱导10h的各菌液1mL，离心取菌体，用1X还原缓冲液(50mM pH6.8Tris-HCl,1.6％SDS,0.02％溴酚蓝，8％甘油，20mM DTT)悬起，沸水浴10min，用12％的SDS-PAGE电泳，电泳完毕后用Bio-Lab半干转转印仪将蛋白转至PVDF膜上，20V恒压转印1h，用鼠源HRP-Anti-His tag单克隆抗体检测，结果如图5所示，全菌样品经SDS-PAGE后进行WB检测，在共表达PglL和B5Tri4573时，由于细菌本身的O-抗原多糖在糖基转移酶催化下转移到载体蛋白，因此WB条带可以看到分子量大小的向上迁移；同时，由于细菌多糖为串联重复结构，因此呈现出典型的糖基化ladder条带，表明四种载体蛋白均糖基化(CTBTri4573-OPS、StxBTri4573-OPS、LTBTri4573-OPS、SubBTri4573-OPS)，连入了细菌多糖，而对照组无PglL的载体(B5Tri4573)只有载体蛋白表达。

3.5蛋白纯化

将301DWP/pET28-tacpglL-tacB5Tri4573(B5分别为CTB、StxB、LTB、SubB)接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃，220转/分钟培养10小时后转接于5L LB培养基37℃，220转/分钟培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至30℃诱导10h。

样品处理：取上述30℃诱导10h的菌体，加入400mL上样缓冲液(20mM pH7.5 Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑)，超声破菌(超声3s暂停5s，累计超声时间30min)，12000g离心，收集上清。

样品纯化：首先用0.5M的NaOH的水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO4的水溶液平衡至少3个柱床体积，再用B1液(20mMpH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)平衡至少一个柱床体积，最后用A1液(20mM pH7.5Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)平衡至少3个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道上样，再用A1液(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑)洗去未结合蛋白，冲洗至紫外吸收(280nm)接近于0mAU，最后用100％B1(20mM pH7.5 Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑)洗脱，收集洗脱液30mL，得到纯化的样品，之后再过分子筛(superdex 200)流动相为1×PBS，pH7.4。

四种糖蛋白(CTBTri4573-OPS、StxBTri4573-OPS、LTBTri4573-OPS、SubBTri4573-OPS)过分子筛后考马斯亮蓝染色分析，结果如图6所示，可得到纯度大于90％的糖蛋白样品。利用动态光散射检测样品粒径，结果如图7A所示，四种糖蛋白均可形成25-50nm的糖蛋白颗粒。进一步对CTBTri4573-OPS进行透射电镜观察，结果尺寸与动态光散射结果一致(图7B)。

实施例4.动物免疫评价

4.1B5Tri4573-OPS用于免疫小鼠的效果评价

本实施例对B5Tri4573-OPS的免疫效果进行评价，其中，B5Tri4573-OPS是指经实施例3制备获得的糖基化蛋白(B5分别为CTB、StxB、LTB、SubB)。取40只6周龄大的雌性Balb/c小鼠，随机分为6组(PBS组，OPS组(单独多糖)、CTBTri4573-OPS组、StxBTri4573-OPS组、LTBTri573-OPS组和SubBTri4573-OPS组)。每组小鼠皮下分别注射，以多糖含量计量，均注射2.5μg的多糖；分别在第1、15、29天免疫，末次免疫后10天取尾血，用间接ELISA法测各组小鼠血清中福氏抗志贺氏菌2a型O抗原多糖的抗体滴度。用提取的福氏抗志贺氏菌2a型301株的LPS包被酶联板，每孔包被10μg的LPS，其他操作步骤参见《精编分子生物学实验指南》。结果如图8，四种糖蛋白均可在小鼠体内诱导产生特异性抗体，有效的激发了机体免疫应答，并且其所诱导的抗体滴度显著优于单独施用多糖的OPS组。进一步为了确定上述效果，末次免疫后两周，小鼠按照5倍半数致死量(4.35×10⁷个菌落形成单位(Colony-FormingUnits，CFU))腹腔注射福氏志贺氏菌301野生株，剂量为200μl，观察小鼠死亡情况，结果如图9所示，B5Tri4573-OPS的各组小鼠在5倍半数致死剂量下可产生保护效果，其中CTBTri573-OPS和LTBTri573-OPS保护率可达到100％。

4.2CTBTri4573-OPS免疫效果进一步评价

4.2.1CTBTri4573-OPS与CTB4573-OPS的免疫效果比较

取40只6周龄大的雌性Balb/c小鼠，随机分为4组(PBS组(Control)，OPS组、CTB4573-OPS、CTBTri4573-OPS组)。其中CTB4573-OPS为以CTB(不包含Tri序列)为底物蛋白所制备的糖蛋白，其制备方法可参见Pan C等人,mBio.2016Apr 26；7(2):e00443-16。每组小鼠皮下分别注射，以多糖含量计量，均注射2.5μg的多糖；分别在第1、15、29天免疫，末次免疫后10天取尾血，用间接ELISA法测各组小鼠血清中福氏抗志贺氏菌2a型O抗原多糖的抗体滴度。用提取的福氏抗志贺氏菌2a型301株的LPS包被酶联板，每孔包被10μg的LPS，其他操作步骤参见《精编分子生物学实验指南》。

结果如图10，相比于OPS组以及CTB4573-OPS组，达到纳米级的CTBTri4573-OPS总IgG明显升高，且主要激发了以IgG1为主的体液免疫，同时IgG2a和IgG3水平也明显提升表明细胞免疫同样被激活。

进一步，我们比较了纳米级的CTBTri4573-OPS在加入与不加入铝佐剂(Adj)的情况下的免疫效果，免疫方案同前所述，铝佐剂的剂量为总体积的10％。结果发现不加佐剂IgG效价明显高于佐剂组(图11)。

4.2.2CTBTri4573-OPS的抗体血清杀菌活性评价

针对免疫后血清中的抗体是否具有杀菌活性，我们进一步进行了体外杀菌实验，将志贺氏菌301野生株培养于LB液体培养基中，37℃摇床220r/m培养至OD600为2.0时用生理盐水稀释，达到100-200CFU/10μL稀释液，取10μL稀释的菌液与倍比稀释的10μL小鼠免疫后血清(预先56℃水浴30分钟，以灭活其中的补体成分)混合，37℃孵育1小时。孵育结束后，每管加入20μL补体，充分混匀后37℃孵育1小时。全部涂LB平板，37℃温箱过夜培养，次日平板菌落计数，计算杀菌率。

结果如图12所示，CTBTri4573-OPS所诱导产生的抗血清的杀菌活性远远高于单独多糖、CTB4573-OPS所诱导产生的抗血清，表明纳米级多糖结合疫苗保护效果大大提升，且不加佐剂效果更优，从而避免佐剂带来的不良反应。

4.2.3CTBTri4573-OPS的免疫后保护性评价

为了进一步确定上述效果，末次免疫后两周，小鼠按照5倍半数致死量(4.35×10⁷CFU)腹腔注射福氏志贺氏菌301野生株，剂量为200μl，观察小鼠死亡情况。结果如图13所示，纳米颗粒组在5倍半数致死剂量下依然可保持100％保护，效果最好(图13A)，同时不加佐剂的保护效果优于加入佐剂后效果(图13B)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白及其应用

<130> IDC190369

<150> 201910352203.X

<151> 2019-04-29

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTB的氨基酸序列

<400> 1

Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr Gln

1 5 10 15

Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala

20 25 30

Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe

35 40 45

Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala

50 55 60

Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala

65 70 75 80

Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala Ile

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100

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTB的核苷酸序列

<400> 2

accccgcaga acatcaccga cctgtgcgcc gagtaccaca acacccaaat ttataccctg 60

aacgacaaaa tttttagcta caccgagagc ctggcaggca agcgcgagat ggccatcatc 120

accttcaaga acggcgccat tttccaggtg gaggtgccgg gcagccagca catcgacagt 180

cagaagaagg ccatcgagcg catgaaggac accctgcgca tcgcctacct gaccgaggcc 240

aaggtggaga agctgtgcgt gtggaacaac aagaccccgc acgccatcgc cgcaatcagc 300

atggccaac 309

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> StxB的氨基酸序列

<400> 3

Lys Lys Thr Leu Leu Ile Ala Ala Ser Leu Ser Phe Phe Ser Ala Ser

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Ala Leu Ala Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr Lys

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Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp Lys Glu Leu

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65 70 75 80

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gttaaagtgg gtgataaaga attatttacc aacagatgga atcttcagtc tcttcttctc 180

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ggattcagcg aagttatttt tcgt 264

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<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LTB的氨基酸序列

<400> 5

Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln

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Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala

20 25 30

Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe

35 40 45

Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala

50 55 60

Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr

65 70 75 80

Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile

85 90 95

Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn

100

<210> 6

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LTB的核苷酸序列

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aatgataaga ttctgagcta caccgaaagt atggccggta aacgcgaaat ggttattatt 120

acctttaaga gtggcgaaac ctttcaggtt gaagttccgg gtagccagca tattgatagt 180

cagaaaaaag caattgagcg catgaaagat accctgcgca ttacctatct gaccgaaacc 240

aaaattgata aactgtgcgt ttggaataac aaaaccccga atagcattgc agcaattagt 300

atgaaaaac 309

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SubB的氨基酸序列

<400> 7

Thr Ile Lys Arg Phe Phe Val Cys Ala Gly Ile Met Gly Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Asn Pro Ala Met Ala Glu Trp Thr Gly Asp Ala Arg Asp Gly Met

20 25 30

Phe Ser Gly Val Val Ile Thr Gln Phe His Thr Gly Gln Ile Asp Asn

35 40 45

Lys Pro Tyr Phe Cys Ile Glu Gly Lys Gln Ser Ala Gly Ser Ser Ile

50 55 60

Ser Ala Cys Ser Met Lys Asn Ser Ser Val Trp Gly Ala Ser Phe Ser

65 70 75 80

Thr Leu Tyr Asn Gln Ala Leu Tyr Phe Tyr Thr Thr Gly Gln Pro Val

85 90 95

Arg Ile Tyr Tyr Glu Pro Gly Val Trp Thr Tyr Pro Pro Phe Val Lys

100 105 110

Ala Leu Thr Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Ser Thr Cys Thr Thr Ser

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130 135 140

<210> 8

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SubB的核苷酸序列

<400> 8

accattaagc gctttttcgt gtgtgcaggc attatgggtt gtctgagcct gaatccggca 60

atggccgaat ggaccggcga tgcacgtgat ggcatgttta gcggtgttgt gattacccag 120

tttcataccg gtcagattga taataagccg tatttttgta tcgagggcaa acagagtgcc 180

ggtagtagca ttagtgcatg tagcatgaaa aatagcagtg tgtggggcgc cagctttagt 240

accctgtata atcaggcact gtatttttat accaccggtc agccggtgcg catctattat 300

gaaccgggcg tgtggaccta tccgccgttt gtgaaagcac tgaccagtaa tgccctggtt 360

ggcctgagca cctgcaccac cagcaccgaa tgttttggtc cggatcgtaa aaagaatagt 420

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tri的氨基酸序列

<400> 9

Arg Leu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu

1 5 10 15

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu

20 25 30

Glu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg

35 40 45

<210> 10

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Tri的核苷酸序列

<400> 10

Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys

1 5 10 15

Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly

20 25 30

Thr Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly

35 40 45

Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Thr Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly

50 55 60

Cys Ala Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys

65 70 75 80

Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly

85 90 95

Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys

100 105 110

Gly Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala

115 120 125

Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Gly Thr

130 135

<210> 11

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tacCTBTri表达盒的核苷酸序列

<400> 11

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccccg 240

cagaacatca ccgacctgtg cgccgagtac cacaacaccc aaatttatac cctgaacgac 300

aaaattttta gctacaccga gagcctggca ggcaagcgcg agatggccat catcaccttc 360

aagaacggcg ccattttcca ggtggaggtg ccgggcagcc agcacatcga cagtcagaag 420

aaggccatcg agcgcatgaa ggacaccctg cgcatcgcct acctgaccga ggccaaggtg 480

gagaagctgt gcgtgtggaa caacaagacc ccgcacgcca tcgccgcaat cagcatggcc 540

aacggcggat ccggccgcct gctgctgcgt ctggaagaac tggaacgtcg cctggaagag 600

ctggcaaagt tcgtggcagc atggaccctg aaagcggctg cggttgacct ggaactggct 660

gctctgcgtc gtcgtctgga ggagctggct cgtggcggtt ctggtctcga gcaccaccac 720

caccaccac 729

<210> 12

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTBTri蛋白的氨基酸序列

<400> 12

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His

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Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu

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Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly

50 55 60

Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Gly Ser Gly Arg Leu

115 120 125

Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Lys

130 135 140

Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu Leu

145 150 155 160

Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Leu Glu His His His His His His

180

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tacStxBTri表达盒的核苷酸序列

<400> 13

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaaaaaa 240

acattattaa tagctgcatc gctttcattt ttttcagcaa gtgcgctggc gacgcctgat 300

tgtgtaactg gaaaggtgga gtatacaaaa tataatgatg acgatacctt tacagttaaa 360

gtgggtgata aagaattatt taccaacaga tggaatcttc agtctcttct tctcagtgcg 420

caaattacgg ggatgactgt aaccattaaa actaatgcct gtcataatgg agggggattc 480

agcgaagtta tttttcgtgg cggatccggc cgcctgctgc tgcgtctgga agaactggaa 540

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<210> 14

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> StxBTri蛋白的氨基酸序列

<400> 14

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Lys Lys Thr Leu Leu Ile Ala Ala Ser Leu Ser Phe Phe

20 25 30

Ser Ala Ser Ala Leu Ala Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu

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Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp

50 55 60

Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Ser Leu Leu Leu Ser

65 70 75 80

Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys His

85 90 95

Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg Gly Gly Ser Gly Arg

100 105 110

Leu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala

115 120 125

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu

130 135 140

Leu Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Leu Glu His His His His His His

165

<210> 15

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tacLTBTri表达盒的核苷酸序列

<400> 15

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cagaccatta ccgaactgtg cagtgaatat cgcaataccc agatctatac cattaatgat 300

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aacggcggat ccggccgcct gctgctgcgt ctggaagaac tggaacgtcg cctggaagag 600

ctggcaaagt tcgtggcagc atggaccctg aaagcggctg cggttgacct ggaactggct 660

gctctgcgtc gtcgtctgga ggagctggct cgtggcggtt ctggtctcga gcaccaccac 720

caccaccac 729

<210> 16

<211> 184

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LTBTri蛋白的氨基酸序列

<400> 16

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg

20 25 30

Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu

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Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly

50 55 60

Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Gly Gly Ser Gly Arg Leu

115 120 125

Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Lys

130 135 140

Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu Leu

145 150 155 160

Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Leu Glu His His His His His His

180

<210> 17

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tacSubBTri表达盒的核苷酸序列

<400> 17

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccatt 240

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gaatggaccg gcgatgcacg tgatggcatg tttagcggtg ttgtgattac ccagtttcat 360

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SubBTri蛋白的氨基酸序列

<400> 18

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Ile Lys Arg Phe Phe Val Cys Ala Gly Ile Met Gly

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Cys Leu Ser Leu Asn Pro Ala Met Ala Glu Trp Thr Gly Asp Ala Arg

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Gly Ser Gly Arg Leu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu

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<210> 19

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<212> PRT

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<220>

<223> PglL的氨基酸序列

<400> 19

Met Pro Ala Glu Thr Thr Val Ser Gly Ala His Pro Ala Ala Lys Leu

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50 55 60

Lys Leu Phe Asp Val Lys Ile Pro Ala Ile Ser Phe Leu Leu Phe Ala

65 70 75 80

Met Ala Ala Phe Trp Tyr Leu Gln Ala Arg Leu Met Asn Leu Ile Tyr

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Pro Gly Met Asn Asp Ile Val Ser Trp Ile Phe Ile Leu Leu Ala Val

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Ser Cys Ile Val Val Ile Gln Phe Ala Gly Trp Glu Asp Thr Pro Leu

145 150 155 160

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165 170 175

Gly Gln Arg Asn Asn Leu Gly His Tyr Leu Met Trp Gly Ile Leu Ala

180 185 190

Ala Ala Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Lys Ile Pro Ala Ala Leu Gly Val

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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260 265 270

Leu Glu Thr Phe Thr Gly Ile Arg Tyr Glu Thr Ala Val Glu Arg Val

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Ala Leu Ala Ala Phe Gln Ser Ala Pro Ile Phe Gly His Gly Trp Asn

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325 330 335

Tyr Asp Asn Leu Leu Ser Asn Leu Phe Thr His Ser His Asn Ile Val

340 345 350

Leu Gln Leu Leu Ala Glu Met Gly Ile Ser Gly Thr Leu Leu Val Ala

355 360 365

Ala Thr Leu Leu Thr Gly Ile Ala Gly Leu Leu Lys Arg Pro Leu Thr

370 375 380

Pro Ala Ser Leu Phe Leu Ile Cys Thr Leu Ala Val Ser Met Cys His

385 390 395 400

Ser Met Leu Glu Tyr Pro Leu Trp Tyr Val Tyr Phe Leu Ile Pro Phe

405 410 415

Gly Leu Met Leu Phe Leu Ser Pro Ala Glu Ala Ser Asp Gly Ile Ala

420 425 430

Phe Lys Lys Ala Ala Asn Leu Gly Ile Leu Thr Ala Ser Ala Ala Ile

435 440 445

Phe Ala Gly Leu Leu His Leu Asp Trp Thr Tyr Thr Arg Leu Val Asn

450 455 460

Ala Phe Ser Pro Ala Thr Asp Asp Ser Ala Lys Thr Leu Asn Arg Lys

465 470 475 480

Ile Asn Glu Leu Arg Tyr Ile Ser Ala Asn Ser Pro Met Leu Ser Phe

485 490 495

Tyr Ala Asp Phe Ser Leu Val Asn Phe Ala Leu Pro Glu Tyr Pro Glu

500 505 510

Thr Gln Thr Trp Ala Glu Glu Ala Thr Leu Lys Ser Leu Lys Tyr Arg

515 520 525

Pro His Ser Ala Thr Tyr Arg Ile Ala Leu Tyr Leu Met Arg Gln Gly

530 535 540

Lys Val Ala Glu Ala Lys Gln Trp Met Arg Ala Thr Gln Ser Tyr Tyr

545 550 555 560

Pro Tyr Leu Met Pro Arg Tyr Ala Asp Glu Ile Arg Lys Leu Pro Val

565 570 575

Trp Ala Pro Leu Leu Pro Glu Leu Leu Lys Asp Cys Lys Ala Phe Ala

580 585 590

Ala Ala Pro Gly His Pro Glu Ala Lys Pro Cys Lys

595 600

<210> 20

<211> 2491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PglL表达盒的核苷酸序列

<400> 20

tctagaactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg 60

cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc 120

ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaattca 180

tgcccgctga aacgaccgta tccggcgcgc accccgccgc caaactgccg atttacatcc 240

tgccctgctt cctttggata ggcatcgtcc cctttacctt cgcgctcaaa ctgaaaccgt 300

cgcccgactt ttaccacgat gccgccgccg cagccggcct gattgtcctg ttgttcctca 360

cggcaggaaa aaaactgttt gatgtcaaaa tccccgccat cagcttcctt ctgtttgcaa 420

tggcggcgtt ttggtatctt caggcacgcc tgatgaacct gatttacccc ggtatgaacg 480

acatcgtctc ttggattttc atcttgctcg ccgtcagcgc gtgggcctgc cggagcttgg 540

tcgcacactt cggacaagaa cgcatcgtga ccctgtttgc ctggtcgctg cttatcggct 600

ccctgcttca atcctgcatc gtcgtcatcc agtttgccgg ctgggaagac acccctctgt 660

ttcaaaacat catcgtttac agcgggcaag gcgtaatcgg acacatcggg cagcgcaaca 720

acctcggaca ctacctcatg tggggcatac tcgccgccgc ctacctcaac ggacaacgaa 780

aaatccccgc cgccctcggc gtaatctgcc tgattatgca gaccgccgtt ttaggtttgg 840

tcaactcgcg caccatcttg acctacatag ccgccatcgc cctcatcctt cccttctggt 900

atttccgttc ggacaaatcc aacaggcgga cgatgctcgg catagccgca gccgtattcc 960

ttaccgcgct gttccaattt tccatgaaca ccattctgga aacctttact ggcatccgct 1020

acgaaactgc cgtcgaacgc gtcgccaacg gcggtttcac agacttgccg cgccaaatcg 1080

aatggaataa agcccttgcc gccttccagt ccgccccgat attcgggcac ggctggaaca 1140

gttttgccca acaaaccttc ctcatcaatg ccgaacagca caacatatac gacaacctcc 1200

tcagcaactt gttcacccat tcccacaaca tcgtcctcca actccttgca gagatgggaa 1260

tcagcggcac gcttctggtt gccgcaaccc tgctgacggg cattgccggg ctgcttaaac 1320

gccccctgac ccccgcatcg cttttcctaa tctgcacgct tgccgtcagt atgtgccaca 1380

gtatgctcga atatcctttg tggtatgtct atttcctcat ccctttcgga ctgatgctct 1440

tcctgtcccc cgcagaggct tcagacggca tcgccttcaa aaaagccgcc aatctcggca 1500

tactgaccgc ctccgccgcc atattcgcag gattgctgca cttggactgg acatacaccc 1560

ggctggttaa cgccttttcc cccgccactg acgacagtgc caaaaccctc aaccggaaaa 1620

tcaacgagtt gcgctatatt tccgcaaaca gtccgatgct gtccttttat gccgacttct 1680

ccctcgtaaa cttcgccctg ccggaatacc ccgaaaccca gacttgggcg gaagaagcaa 1740

ccctcaaatc actaaaatac cgcccccact ccgccaccta ccgcatcgcc ctctacctga 1800

tgcggcaagg caaagttgca gaagcaaaac aatggatgcg ggcgacacag tcctattacc 1860

cctacctgat gccccgatac gccgacgaaa tccgcaaact gcccgtatgg gcgccgctgc 1920

tacccgaact gctcaaagac tgcaaagcct tcgccgccgc gcccggtcat ccggaagcaa 1980

aaccctgcaa atgaaagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac 2040

agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg 2100

cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta 2160

gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct 2220

cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 2280

aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg 2340

gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat 2400

ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 2460

tccgctcatg agacgagctc ggccgctcga g 2491

<210> 21

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTBTri4573的氨基酸序列

<400> 21

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His

20 25 30

Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu

35 40 45

Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly

50 55 60

Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Gly Ser Gly Arg Leu

115 120 125

Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Lys

130 135 140

Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu Leu

145 150 155 160

Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn

180 185 190

Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys Leu Glu His

195 200 205

His His His His His

210

<210> 22

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTBTri4573表达盒的核苷酸序列

<400> 22

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccccg 240

cagaacatca ccgacctgtg cgccgagtac cacaacaccc aaatttatac cctgaacgac 300

aaaattttta gctacaccga gagcctggca ggcaagcgcg agatggccat catcaccttc 360

aagaacggcg ccattttcca ggtggaggtg ccgggcagcc agcacatcga cagtcagaag 420

aaggccatcg agcgcatgaa ggacaccctg cgcatcgcct acctgaccga ggccaaggtg 480

gagaagctgt gcgtgtggaa caacaagacc ccgcacgcca tcgccgcaat cagcatggcc 540

aacggcggat ccggccgcct gctgctgcgt ctggaagaac tggaacgtcg cctggaagag 600

ctggcaaagt tcgtggcagc atggaccctg aaagcggctg cggttgacct ggaactggct 660

gctctgcgtc gtcgtctgga ggagctggct cgtggcggtt ctggtagcgc cgtgaccgag 720

tactatctga accatggcga gtggccgggt aataacacca gcgccggcgt ggccacaagc 780

agtgagatca agctcgagca ccaccaccac caccac 816

<210> 23

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> StxBTri4573的氨基酸序列

<400> 23

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Lys Lys Thr Leu Leu Ile Ala Ala Ser Leu Ser Phe Phe

20 25 30

Ser Ala Ser Ala Leu Ala Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu

35 40 45

Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp

50 55 60

Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Ser Leu Leu Leu Ser

65 70 75 80

Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys His

85 90 95

Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg Gly Gly Ser Gly Arg

100 105 110

Leu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala

115 120 125

Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu

130 135 140

Leu Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly

165 170 175

Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys Leu Glu

180 185 190

His His His His His His

195

<210> 24

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> StxBTri4573表达盒的核苷酸序列

<400> 24

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaaaaaa 240

acattattaa tagctgcatc gctttcattt ttttcagcaa gtgcgctggc gacgcctgat 300

tgtgtaactg gaaaggtgga gtatacaaaa tataatgatg acgatacctt tacagttaaa 360

gtgggtgata aagaattatt taccaacaga tggaatcttc agtctcttct tctcagtgcg 420

caaattacgg ggatgactgt aaccattaaa actaatgcct gtcataatgg agggggattc 480

agcgaagtta tttttcgtgg cggatccggc cgcctgctgc tgcgtctgga agaactggaa 540

cgtcgcctgg aagagctggc aaagttcgtg gcagcatgga ccctgaaagc ggctgcggtt 600

gacctggaac tggctgctct gcgtcgtcgt ctggaggagc tggctcgtgg cggttctggt 660

agcgccgtga ccgagtacta tctgaaccat ggcgagtggc cgggtaataa caccagcgcc 720

ggcgtggcca caagcagtga gatcaagctc gagcaccacc accaccacca c 771

<210> 25

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LTBTri4573的氨基酸序列

<400> 25

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg

20 25 30

Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu

35 40 45

Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly

50 55 60

Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln

65 70 75 80

Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu

85 90 95

Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro

100 105 110

Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Gly Gly Ser Gly Arg Leu

115 120 125

Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Lys

130 135 140

Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu Leu

145 150 155 160

Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser Gly

165 170 175

Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn

180 185 190

Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys Leu Glu His

195 200 205

His His His His His

210

<210> 26

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LTBTri4573表达盒的核苷酸序列

<400> 26

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcagcacct 240

cagaccatta ccgaactgtg cagtgaatat cgcaataccc agatctatac cattaatgat 300

aagattctga gctacaccga aagtatggcc ggtaaacgcg aaatggttat tattaccttt 360

aagagtggcg aaacctttca ggttgaagtt ccgggtagcc agcatattga tagtcagaaa 420

aaagcaattg agcgcatgaa agataccctg cgcattacct atctgaccga aaccaaaatt 480

gataaactgt gcgtttggaa taacaaaacc ccgaatagca ttgcagcaat tagtatgaaa 540

aacggcggat ccggccgcct gctgctgcgt ctggaagaac tggaacgtcg cctggaagag 600

ctggcaaagt tcgtggcagc atggaccctg aaagcggctg cggttgacct ggaactggct 660

gctctgcgtc gtcgtctgga ggagctggct cgtggcggtt ctggtagcgc cgtgaccgag 720

tactatctga accatggcga gtggccgggt aataacacca gcgccggcgt ggccacaagc 780

agtgagatca agctcgagca ccaccaccac caccac 816

<210> 27

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SubBTri4573的氨基酸序列

<400> 27

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Thr Ile Lys Arg Phe Phe Val Cys Ala Gly Ile Met Gly

20 25 30

Cys Leu Ser Leu Asn Pro Ala Met Ala Glu Trp Thr Gly Asp Ala Arg

35 40 45

Asp Gly Met Phe Ser Gly Val Val Ile Thr Gln Phe His Thr Gly Gln

50 55 60

Ile Asp Asn Lys Pro Tyr Phe Cys Ile Glu Gly Lys Gln Ser Ala Gly

65 70 75 80

Ser Ser Ile Ser Ala Cys Ser Met Lys Asn Ser Ser Val Trp Gly Ala

85 90 95

Ser Phe Ser Thr Leu Tyr Asn Gln Ala Leu Tyr Phe Tyr Thr Thr Gly

100 105 110

Gln Pro Val Arg Ile Tyr Tyr Glu Pro Gly Val Trp Thr Tyr Pro Pro

115 120 125

Phe Val Lys Ala Leu Thr Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Ser Thr Cys

130 135 140

Thr Thr Ser Thr Glu Cys Phe Gly Pro Asp Arg Lys Lys Asn Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Arg Leu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu

165 170 175

Glu Glu Leu Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

180 185 190

Val Asp Leu Glu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala

195 200 205

Arg Gly Gly Ser Gly Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly

210 215 220

Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu

225 230 235 240

Ile Lys Leu Glu His His His His His His

245 250

<210> 28

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SubBTri4573表达盒的核苷酸序列

<400> 28

tctagatgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 60

ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 120

ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaattcatg 180

aagaaaattt ggctggcctt agccggcctg gttctggcat tcagcgccag cgcaaccatt 240

aagcgctttt tcgtgtgtgc aggcattatg ggttgtctga gcctgaatcc ggcaatggcc 300

gaatggaccg gcgatgcacg tgatggcatg tttagcggtg ttgtgattac ccagtttcat 360

accggtcaga ttgataataa gccgtatttt tgtatcgagg gcaaacagag tgccggtagt 420

agcattagtg catgtagcat gaaaaatagc agtgtgtggg gcgccagctt tagtaccctg 480

tataatcagg cactgtattt ttataccacc ggtcagccgg tgcgcatcta ttatgaaccg 540

ggcgtgtgga cctatccgcc gtttgtgaaa gcactgacca gtaatgccct ggttggcctg 600

agcacctgca ccaccagcac cgaatgtttt ggtccggatc gtaaaaagaa tagtggcgga 660

tccggccgcc tgctgctgcg tctggaagaa ctggaacgtc gcctggaaga gctggcaaag 720

ttcgtggcag catggaccct gaaagcggct gcggttgacc tggaactggc tgctctgcgt 780

cgtcgtctgg aggagctggc tcgtggcggt tctggtagcg ccgtgaccga gtactatctg 840

aaccatggcg agtggccggg taataacacc agcgccggcg tggccacaag cagtgagatc 900

aagctcgagc accaccacca ccaccac 927

<210> 29

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 糖基化序列（PilE S45~K73）

<400> 29

Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn

1 5 10 15

Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys

20 25

<210> 30

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Linker

<400> 30

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 31

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DsbA信号肽

<400> 31

Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala

<210> 32

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物SacI-UP

<400> 32

cgagctctgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactc 37

<210> 33

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物XhoI-Down

<400> 33

ccgctcgagc ttgatctctc actgcttgtg gccacg 36

Claims (29)

1.融合蛋白，其中所述融合蛋白从N端至C端包含相邻的AB5毒素B亚基和三聚化结构域序列，所述融合蛋白进一步包含含有O-糖基化位点的糖基化序列，并且，所述融合蛋白中所包含的任何两个相邻结构域之间通过肽接头连接；其中，所述三聚化结构域序列如SEQ IDNo.9所示，所述糖基化序列如SEQ ID NO.29所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述AB5毒素B亚基选自霍乱毒素B亚单位CTB，志贺毒素B亚单位StxB，大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位LTB或枯草杆菌毒素B亚单位SubB。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述CTB由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成；所述StxB由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成；所述LTB由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成；所述SubB由SEQ ID No.7所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白从N端至C端包含所述AB5毒素B亚基、三聚化结构域序列和糖基化序列。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自下列的氨基酸序列：

(1)由SEQ ID NO.21所示序列的第20位至第205位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(2)由SEQ ID NO.23所示序列的第20位至第190位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(3)由SEQ ID NO.25所示序列的第20位至第205位氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(4)由SEQ ID NO.27所示序列的第20位至第242位氨基酸残基构成的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其进一步包含信号肽和/或蛋白标签。

7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的融合蛋白。

8.载体，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子。

9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子或权利要求8所述的载体。

10.制备糖蛋白纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

(1)提供O-抗原连接酶缺失的细菌宿主细胞；

(2)在所述细菌宿主细胞中表达权利要求1-6任一项所述的融合蛋白和糖基转移酶PglL，从而产生目标糖蛋白纳米颗粒。

11.权利要求10所述的方法，其中，所述细菌宿主细胞是病原性细菌细胞。

12.权利要求10所述的方法，其中，所述方法还包括：(3)对目标糖蛋白纳米颗粒进行纯化。

13.权利要求12所述的方法，其中，通过亲和层析和/或分子筛对目标糖蛋白纳米颗粒进行纯化。

14.权利要求10所述的方法，其中，步骤(2)包括以下步骤：

(2a)将编码权利要求1-6任一项所述的融合蛋白的第一核苷酸序列和编码PglL的第二核苷酸序列引入所述细菌宿主细胞中，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的表达载体上；

(2b)培养所述细菌宿主细胞；

(2c)从细胞培养物中回收目标纳米糖蛋白颗粒。

15.糖蛋白纳米颗粒，其包含蛋白与多糖的偶联物，所述偶联物由细菌O多糖和权利要求1-6任一项所述的融合蛋白偶联而成，所述细菌O多糖通过所述融合蛋白中的糖基化序列中的O-糖基化位点偶联到所述融合蛋白上。

16.根据权利要求15所述的糖蛋白纳米颗粒，其中，所述细菌O多糖选自病原性细菌的O多糖。

17.根据权利要求15所述的糖蛋白纳米颗粒，其中，所述细菌O多糖选自志贺氏菌O多糖、大肠杆菌O157O多糖、痢疾杆菌O多糖、甲型副伤寒沙门氏菌O多糖、霍乱弧菌O多糖。

18.根据权利要求15所述的糖蛋白纳米颗粒，其中，在所述糖蛋白纳米颗粒中，所述融合蛋白中的AB5毒素B亚基以五聚体形式存在，所述融合蛋白中的三聚化结构域序列以三聚体形式存在。

19.根据权利要求15所述的糖蛋白纳米颗粒，其中，所述糖蛋白纳米颗粒的平均直径为25-50nm。

20.根据权利要求15所述的糖蛋白纳米颗粒，其中，所述糖蛋白纳米颗粒通过权利要求10-14任一项所述的方法制备。

21.免疫原性组合物，其包含：(i)免疫学有效量的权利要求15-20任一项所述的糖蛋白纳米颗粒，或者(ii)免疫学有效量的权利要求1-6任一项所述的融合蛋白或由其形成的蛋白纳米颗粒、与细菌O多糖的混合物。

22.根据权利要求21所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物不包含佐剂。

23.根据权利要求21所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

24.根据权利要求21-23任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述免疫原性组合物是疫苗。

25.根据权利要求15-20任一项所述的糖蛋白纳米颗粒或根据权利要求21-24任一项所述的免疫原性组合物，在制备用于在受试者中诱导针对细菌O多糖的特异性免疫应答和/或用于在受试者中预防和/或治疗细菌感染的产品中的应用。

26.根据权利要求25所述的应用，其中，所述产品为疫苗。

27.根据权利要求25所述的应用，其中，所述特异性免疫应答包括抗体应答。

28.根据权利要求25所述的应用，其中，所述受试者是哺乳动物。

29.根据权利要求25所述的应用，其中，所述受试者是人。

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