JPS62502895A - 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフィド結合を含有する真核蛋白質を原 核における発現後に活性化する方法 本発明は、遺伝子工学的に製造した、ジスルフィド結合を含有する真核蛋白質を 原核における発現後に活性化する方法に関する。

異種蛋白質を原核において発現する際に、しばしばこれらの蛋白質は宿主細胞中 で不活性難溶性凝集体（所謂１屈折小体：　ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｉｅ ｓ　”　）　ｆ形成し、更に該凝集体は宿主細胞の蛋白質により不純化されてい る。そのような１屈折小体“の形成は、発現の際に発生する細胞中の高い蛋白質 濃度の結果であると推測される。細胞中で大量の酵素を形成する際に、酵素の集 合により不溶性で高分子の、たいていの場合不活性な粒子になることは知られて いる。それ故、そのような蛋白質を例えば治療の目的に使用できるようにする前 に、それを精製しかつその活性形に変換しなげればならない。

公知方法によれば、凝集体として存在するこのような蛋白質の再活性化は数工程 で行なうことができる〔例えばＲ，、Ｔａｅｎｉｃｋｅ著、’　Ｆｅｄｅｒａｔ ｉｏｎ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ　’、ＶＯｌ、　５ ２　（１９７９）、５５７５参照〕： 第一工程では、可溶化を、強力な変性剤、例えばグアニジン−ヒドロクロリド又 は尿素を高濃度で添加するか又は強酸性因子、例えばグリシン／リン酸混合物の 添加により達成する。他の助剤として、還元性ＳＲ−試薬（例えばジチオエリト リトール、ＤＴｌｊ：　）及びＥＤＴＡが例えばＬＤＨの復元の際に有用である ことが判明した。蛋白質が宿主細胞の蛋白質により不純化されている場合、次の 工程として公知の常法で、例えばｒルー又はイオン交換クロマトグラフィにより 精製を行なう。引続いて、強く稀釈して、変性剤の濃度を低くする。その際に、 グアニジン−ヒドロクロリドを使用する場合には、０．５モル／ｌを下廻る数値 に稀釈する。

遊離ＳＲ−基を有する酵素の場合、８Ｈ−基を保護する因子の添加が有利である と明らかになった〔例えばＲ，Ｊａｅｎｉｃｋｅ　＋　’　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｐ ｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　’、Ｐａｒｔ　Ｏｉ　６　（１９６７）、２１ ４６〜２１６０参照〕。

ヨーロッパ公開特許第０１１４５０６号明細書には、細菌培養物からの数種の異 種発現産物を単離、精製及び再活性化する方法が記載され、再活性化に当っては 、強力な変性剤中の１屈折小体“の溶液をａ）直接弱い変性剤中の溶液に変換し 、その後ジスルフィド結合を再形成するための数比作用をする条件にもたらすか 、ｂ）蛋白質をスルホン化し、その後弱い変性剤中の溶液に変換しかつＳ−スル ホネート基をスルフヒドリル試薬でその還元型及び酸化型で、例えばＧＳＨ／Ｇ ５５Ｇ　ｔ−用いて−５−Ｓ−基に変換するかあるいはＣ）弱い変性剤中の溶液 を直接スルフヒドリル試薬、例えばＧ　ＳＨ／Ｇ５５Ｇを用いて処理する。前記 の問題が起る代表的な例はｔ−ＦＡである。

凝固した血液の蛋白質基質の主成分は重合体のフィブリンである。この蛋白質基 質は、所謂プラスミノデンアクチベーター、例えばｔ−ＦＡ　（組織プラスミノ ｒンアクチベーター）による活性化を介してダラスミノデンから形成されるプラ スミンにより溶解される。天然産又は真核から遺伝子工学的に得られるｔ−ＦＡ （プラスミノケ９ンをプラスミンに接触的に活性化する）の酵素活性は、フィシ リン又はフィブリン分解生成物ＣＦＳＰ　）の不存在では非常に低いが、これら の刺激物質の存在においては著しく高まり得る（１０倍以上）。

所謂この活性の刺激可能性は、ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼのような他 の公知のプラスミノデンアクチベーターに比べてｔ−ＰＡの決定的な利点である 〔例えばＭ、　Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ　ａｔ　ａｌ、　’　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ！ｈｅｍ、　’、２５７（１９８２）、２９１２〜２０１９；Ｎｉｅｕｗｅｎｈ ｉｕｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　’　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙ ｓｉｃａＡｃｔａ　“、７５５　（１９８３）、５３１〜５３３参照〕。

それ故、ＢｒｏＮ分解生成物による刺激可能性の係数は文献にいくつか挙げられ ており、３５倍までである。

糖付加されていないｔ−ＰＡ様生成物は、遺伝子操作した原核（ｃ−ＤＮＡの導 入後）でも形成されるが、そのような生成物には、真核かものｔ−ＦＡの活性の 刺激可能性は付与されない。このことは、原核細胞中のレドックス条件が遺伝子 が由来する真核細胞とは、初めから不活性生成物が形成される（このことは例え ば、天然活性分子が含有する多数のＳ−Ｓ結合が誤って結合しているかあるいは 全く形成されていないということに帰因し得るようである）というように異なっ ていることに帰因すると考えられる。しかしｔ−ＦＡ’に治療で使用するには酵 素活性それ自体が必要であるばかりでなく、その刺激可能性も必要である。真核 蛋白質の活性を正しく形成するように、原核細胞が好適な条件を調節しないので あろうという事実が他の物質に関して’　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ、Ｔｏｕｒｎａｌ　 ’、４、／ｌ６３（１９８５）７７５〜７８０で指摘されている。

ヨーロッパ公開特許第００９３６３９号明細書ではｔ−ＦＡの再活性化のために 、Ｅ、コ！Ｊ　（Ｃｏ１１　）から得られた細胞ペレットをグアニジン−ヒドロ クロリド６七ル／ｌ！中に懸濁させ、超音波で処理し、恒温保持し、引続いてト リス−Ｈａｌ　（ｐＨ＝　８．０　）　、塩化ナトリウム、ＢＤＴＡ及びツイー ン（Ｔｗｅｅｎ　）　８０からの溶液に対して４時間透析する。透析後に遠心分 離すると、その際に上澄み中にプラスミノケ９ンアクチベーター活性が認められ る。このように復元したｔ−ＦＡは蛋白質分解作用において活性であるが、Ｊ、 Ｈ，Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ著、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、’、４８、 （３）、２６０〜２６９（１９８２年）に記載の方法による、フィブリンのＢｒ ＣＮ−分解生成物（Ｂ１−０Ｎ−ＦＳＰ　）による測定可能な刺激可能性を示さ ない。

変性蛋白質の再活性化に関しては、技術水準から一般的に適用し得る方法は公知 ではなく、このことは特にｔ−ＰＡに該当する。それというのもこの天然蛋白質 は非常に複雑な構造を有するからであり、これは１個の遊離チオール基と１７個 のＳ−Ｓ結合を有し、これは理論的＋ｃ　２．２　Ｘ　１０”種類の異なる方法 で結合可能であり、その際にたった１個の構造が天然の状態に相当する。ｔ−Ｆ Ａを再活性化するための技術水準から公知の方法は蛋白質分解作用を有するｔ− ＦＡに案内するが、測定可能な刺激可能性はもたらさない。刺激可能なｔ−ＦＡ ’ｚ生ぜしめる活性法は公知ではない。

それ数本発明の課題は、遺伝子工学的に装造した、異種の、ジスルフィド結合を 有する真核蛋白質を原核において発現後に完全に活性化する方法を開示すること であり、この課題は本発明の目的により解決される。

本発明の目的は、請求の範囲第１項により、細胞を溶解し、変性及び還元条件下 に可溶化しかつＧＥａＪｂＢＥ３Ｇの存在において酸化条件下に活性化（復元） することにより、遺伝子工学的に構造した、異種の、ジスルフィド結合を含有す る真核蛋白質を原核において発現後に活性化する方法であり、活性化工程におい て一値９〜１２、ＧＰＪＨ濃度０．１〜２０ミリモル／　ｌ　、　ａｓｓａ濃度 ｏ、ｏｉ〜３ミリモル／ｌでかつ変性作用をしない濃度の変性剤を用いて作業す ることを特徴とする。

この方法の優れた実施形は請求の範囲の従属請求項の目的である。

一般に変性剤としては、酸化条件下に活性化するのに常用の変性剤又はアルギニ ンを使用することができ、公知の変性剤のうちグアニジン−ヒドロクロリド又は 尿素もしくはその誘導体を使用すると優れている。更に、アルギニンが好適であ ることが明らかになった。

更に、これらの変性剤の混合物を使用することができる。またこの活性化工程を 異種蛋白質の存在において実施すると有利であり、一般に、そのようなものとし ては蛋白質分解作用をしない各異種蛋白質が好適であり、殊に牛血清アルブミン （ＢＳＡ　）　を例えば１〜３■４１の量で使用する。ＢＳＡの添加は蛋白質の 収率及び安定性を僅かに高める（これは恐らく表面変性及び／又は蛋白質゛分解 から保護されることにより）。

ら公知のかつ常用の条件に相応してよい。活性化（恒温保持）時間は殊に室温で ２０〜４８時間である。活性の半減期は還元Ｗ　（ＧＳＨ）及び酸化型（Ｇ５５ Ｇ　）グルタチオン０．５ミリモル／ｌの存在において２０℃で約１０〜１５時 間である。一般に、再酸化条件下により長く恒温保持する際に（４８時間）、０ ＮＢｒ−ＦＳＰによる刺激可能性は低減する。活性化工程をＥＤＴＡの存在にお いて実施すると有利であり、その際に最も有利な濃度はＥＤＴＡ約１ミリモル／ ｌである。

活性化工程（再酸化／活性化）の前後の方法工程、例えば細胞の溶解、可溶化（ 可溶化／還元）及び場合により活性化工程に先立つ及び／又は後続の１回又は数 回の精製操作は技術水準、例えばヨーロッパ公開特許第０１１４５０６号明細書 、同第００９３６１９号明細番からこの種の方法に関して知られていて常用の方 法により実施することができるが、収率及び活性化につ込て最適である結果のた めには、本明糺書で詳説する方法実施形１個又は数個を考慮して個々のあるいは すべての方法工程を実施すると有利であり得る。特に、本発明による活性化工程 を溶解後に得られた混合物中で予め変性及び／又は還元をせずに実施することも 可能であるが、収率は低い。発現は原核中で、殊にＰ、プチダ（ｐｕｔｉｄａ　 ）　、特にＥ、コリ（ｃｏｌｉ　）中で実施する。しかし本発明方法は、他の原 核（例えばバチ！Ｊ　：　Ｂａｃｉｌｌｉ　）で発現する場合にも同様に好適で ある。

例えば、細胞の溶解は、常法で、例えば超音波、高圧分散又はリゾチームにより 実施することができ、殊に例えば０．１モル／ｌト＋）スーＨＣ６のような、懸 濁媒体５として中性乃至弱酸性の一値の調節に好適な緩衝液中で実施する。細胞 の溶解後に、不溶成分（１屈折小体“）を任意の方法で、殊により高いＩ値とよ り長い遠心時間で遠心分離するか又は濾過することにより分離する。ｔ−ＰＡを 妨害しないが、異種の細胞蛋白質をできる限り溶解する剤、例えば水、リン酸塩 緩衝液を化（可溶化／還元）にもたらす。殊に、可溶化はアルカリ性ＰＨ範囲で 、特にｐＨ８，６±０．４でかつメルカプタン基から成る還元剤と変性剤の存在 において行なう。

変性剤としては、可溶化に関して技術水準、例えばヨーロッパ公開特許第０１１ ４５０６号明細書から公知の常用の変性剤、特にグアニジン−ヒドロクロリド又 は尿素を使用することができる。グアニジン−ヒドロクロリドの濃度は有利に約 ６モル／ｌ、尿素のそれは約８モル／ｌである。一般式■の化合物も同様に使用 することができる。

メルカプタン基からの還元剤としては、例えば還元型グルタチオン（ＧＳＨ）又 は２−メルカゾトエタノールを例えば濃度約５０〜４００ミリモル／ｌで及び／ 又は特にＤＴＥ　（ジチオエリトリトール）もしくはＤＴＴ（ジチオトレイトー ル）を例えば濃度約８０〜４００ミリモル／ｌで使用することができる。可溶化 は室温で１〜３時間、殊に２時間（恒温保持）行なうと有利である。還元剤の空 中酸素による酸化を回避するためには、ＥＤＴＡ　’ｉ添加すると有利である。

可溶化／還元と共に、可溶化工程は精製化効果をも有している。そ　゛れという のもｔ−ＰＡと免疫学的に交叉反応をしない物質（異種蛋白質）の大部分は溶解 しないからである。

可溶化の後かつ活性化工程の前に゛、公知で常用の精製工程を導入することがで き、精製法としては、例えば滅菌溶離クロマトグラフィ（ＳＥＣ：　ｓｔθｒｉ ｓｃｈｅＡｕｓｓｃｈｌｕβｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ　）　（グアニジ ン−ヒドロクロリド又は尿素の存在において）又はイオン交換体（尿素又はその 誘導体の存在において）が該当し、非特異的な再酸化は還元剤（例えば２−メル カゾトエタノール）の添加により又はｐＨ４，５Ｐｃより回避することができる 〔例えばＲ，Ｒｕｄｏｌｐｈ、　’　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ。

Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　’、１３　（１９８５）、３０８〜３１１）。

先行する可溶化工程でＤＴＥ　’ｉ使用する場合には、ＤＴＥを精製工程で分離 しなげればならない。その精製は、例えばセファデックス（５ｅｐｈａｄθＸ） Ｇ１００ｔ−介してグアニジン−ヒドロクロリド及び還元剤、例えばＧＳＨの存 在においてＰＨ１〜４でＳＥＣにより行なうかあるいは０．０１モル／１ＨＯ１ ！又は０．１モル／ｌ酢酸中セファデックスＧ２５′ｊＦｃ介して脱塩して分離 することにより行なうことができる。変性剤／還元剤の分離は場合により同じ溶 液に対して透析することによっても可能である。

もう１つの精製工程は再挙性化工程に続いて行なうことができる。一般にそのよ うな精製は透析により行なうかあるいは活性化されたｔ−ＰＡの車離に引続いて 例えばＬ７θ−セファロースを介してアフィニティークロマトグラフィにより行 なう。

本発明の他の実施形は、遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフィド結合を 含有する真核蛋白質とグルタチオンとの混合ジスルフィド（以下ｔ−ＰＡＳＳＧ と略記）の形成をベースとする。これは、変性状態で異種蛋白質の分離も、また 天然蛋白質の精製も簡単にする。

チオール基を変性した後の精製は、蛋白質が空中酸化から保護され、それ故より 広い一範囲で安定であり、かつ実負荷（Ｎｅｔｔｏｌａｄｕｎｇ　）の変化が精 ｍを簡便化するという利１点を有する。特に、イオン交換体処理によ混合ジスル フィドの形成に当って、透析し、還元し、変性−及び還元剤から精製された蛋白 質を、変性剤を含有する、稀釈した（例えば０．２モル／ｌ　）　ａｓＳａの溶 液と一緒に恒温保持する。活性化は、変性−及び酸化剤の分離後、ＧＳＨ濃度０ ．５〜５ミリモル／ｌのｐＨ７〜１０．５でかつ変性作用をしない濃度の変性剤 を用いて行なう。

他のすべての反応工程では、Ｇ５５Ｇと一緒の混合ジスルフィドの形成を介して 行なう蛋白質の活性化は本発明の前記の部分の活性化に関する実施形に一致する 。

この実施形では至適ＰＨは８．５であり、収率は約２倍高くかつ活性化された蛋 白質は復元緩衝液中で長時間安定である。

本発明により、原核からのｔ−ＦＡを活性化することができ、通常の生物学的活 性の活性化ばかりでなく、更だ刺激可能性も前記の意味で達成され、この刺激可 能性は天然ｔ−ＦＡのそれを著しく上廻り、１０倍よりも高く、５０倍上土足こ ともある。

本発明により原核において発現後に活性化することのできる他の真核蛋白質はβ −インターフェロンテする。

次の実施例により本発明を詳説するが、これに限定されるものではない。特に記 載のない限り、パーセンａ）　ｓ屈折小体′の調製 ０．１モル／ｌトリス／　Ｈｃｌ（ｐＨ６，５）及び２０ミリモル／　ｌ　ＥＤ ＴＡ　１．５　ｌ中に取ったＥ、コリ細胞湿潤物質１００ｇを均質化しく　Ｕｌ ｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ、１０秒間）かつ０．２５　ｍｌ　／　ｍｌ　＋Ｊゾチー ムを添加した。３０分間室温で恒温保持後、再び均質化しかつ３°Ｃに冷却した 。細胞の溶解は高圧分散（５５０ｋｐ／α２）により達成した。

引続いて、０．１モル／ｌトリス／　ｍａｌ　（ｐＨ６，５）及び２０ミリモル ／　ｚ　［ｌＴＡ　３００　ｍｌで後洗浄した。遠心分離（２７０００９，４℃ で２時間）後、ペレットを０．１モル／ｌ　ト　リス／Ｈ（Ｊ　（ｐＨ６，５） 　、２０ミリモル／ｊＥＤＴＡ及び２．５％トリト”−Ｘ−１００１，３Ａ’中 ＩＣ取りかつ均質化した。再び遠心分離（２７０−００！ｉ、４℃で６０分間） した後で、ペレットを０．１モル／ｌトリス／　Ｈａｌ　（ｐＨ６，５）、２０ ミリモル／　ｌ　ＥＤＴＡ及び０．５％トリトン−！−１００１，、Ｍ中に取り かつ均質化した。ペレットの遠心分Ｍ（２７０００，ｐ、４℃で３０分間）と０ ．１　モル／ｌ　）リス／　Ｈｃｌ　（ｐＨ６，５）及び２０ミリモル／ＭＥＤ ＴＡｉｌ中で均質化を交互に３回を行なった。

１屈折小体“調製物ノｔ−ＰＡ含量は５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ｔ−ＰＡバンドｔ−１ ウェスタン・ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）　”忙よ り同定及びデンシトメータ分析により定量化した。１屈折小体“は５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ及び１ウエスタン・プロッティング′で分子量約（５Ｑ　ｋＤａの強力なｔ −ＰＡバンドを示す。１屈折小体“の全蛋白質含量に対するｔ−ＰＡの割合は約 ２１％である。

ｂ）　％屈折小体“の可溶化／還元 １屈折小体′を、０．１モル／ｌトリス／Ｈｃｌ（ＰＨ８，６）、６モル／ｌ！ グアニジンーヒドロクロリド、０．１５〜０．４モル／　Ｊ　ＤＴＫ及び１ミリ モル／　ｌ！ＥＤＴＡ中の蛋白質濃度１〜５ダ／ｌで２〜３時間室温で恒温保持 した。その後、不溶物質（細胞壁７ラグメント等）を遠心分離した（例えば３５ ０００〜５００００，９．４℃で３０分間）。上澄みのβ値を濃ＨＯＩＩでＰ） （３に調節した。変性−及び還元剤を０．０１モル／　ｌ　ＨＣＩに対して４℃ で透析することにより分離した。

Ｃ）再酸化／活性化 ・　再酸化／活性化は、０．１モル／ｌトリス／）（Ｏ／（ｐＨ１０，５）　、 １　ミ　リ　モ　ル／　ｌ　ＥＤＴＡ　、１　ｍ９／　ｌ　ＢＳＡ　。

０．５モル／ＩＬ−アルギニン、２ミリモル／　ｌ　ＧＳＨｌｏ、２ミリモル／ 　Ｊｉ’　Ｇ５５Ｇ中で１：５０〜１：２００に稀釈することにより行なった。

約２０℃で１７〜２４時間活性化後、活性と、真核からの天然グリコジル化ｔ− ＰＡの活性に比較して収率とを測定した。

１屈折小体“の全蛋白質含量に対する収率：２．５　＋　／　−０，５％ 刺激可能性：１０＋／−５ １屈折小体“のｔ−ＦＡに対する収率：約１２％ ｄ）変性−／還元剤を分離せずに再酸化／活性化１屈折小体″を０．１モル／ｌ ！トリス／　ＨＣｌ　（ｐＨ８，６）、６モル／ｌグアニジンーヒドロクロリド 、　０．２モジ１ＤＴＥ及び１ミリモル／　Ａ！　ＥＤＴＡ中で蛋白質濃度１． ２５　ｍｌ　／　ｒｎｔで室温で２時間恒温保持した。その後直ちに再酸化を、 ０．１モル／ｌトリス／　Ｈａｔ　（ｐＨ１０，５）、１ミリ％　ル／　ｌ　Ｅ ＤＴＡ　、　１　ｍ９／ｍｌ　ＢＳＡ　、　０．５モル／ＩＩＬ−アルギニン及 び表に記載した量のＧＢＦ３Ｇ中で１：１００に稀釈して開始した。付加的に、 活性化バッチ中に０．０６モル／ｌグアニジンーヒドロクロリド及び２ミリモル ／１ｌＤＴＥの残留濃度が存在した。

変性−／還元剤を分離せずに活性化す石際の、ａｓｓａ濃度に対する活性収出の 依存性ｏｓｓｏ　収　率′　刺激可能性 Ｃミリモル／ｌ）　（％）　（係数） ′：１屈折小体“の全蛋白質含量に対する活性ｔ−ＦＡの収率 例　２ ＲＢ（’屈折小体“）−調製物（約５Ｆｎｇ）ヲ０．１モル／ｌトリス／　ＨＯ ＡＩ　ＣｐＨ８，６）、６モル／ｌグアニジンーヒドロクロリド及び０．１５〜 ０．２モル／１ＤＴＥ　１ｍｌ中で２〜６時間室温で恒温保持した。その後、不 溶性物質（細胞壁フラグメント等）を遠心（１７０００，９で２０分間）により 分離した。変性−及び還元剤は０．０１モル１ＩＨＯＩ中のセファデックスＧ２ ５（超精密）を介してデル濾過を行なうことにより除去した。その際ｋ、試料は 約５〜１０倍稀釈した。

０．０１モル／　Ｊ　ＨＣＩＩ中の還元物質を一２０℃で貯蔵した。

例　３ 次表に種々の本発明によるパラメータの、ｔ−ＰＡの活性及び刺激可能性に対す る作用を総括した。これらの再酸化実験のために一例２により可溶化し、還元し た蛋白質を予備精製しなかった。

還元蛋白質（０，０１モル／　ｌ　ＨＣｌ中）を１再酸化緩衝剤”中で１＝１０ 〜１：５００に稀釈することにより活性化した。活性化は室温で２２〜４８時間 恒温保持した後で測定した。再酸化蛋白質の活性は、０．１モル／ｌＩ−リス／ ＨＣ６（ｐＨ＝　１０．５　）　＋１　ミ　リ　モル／　／　ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｌＬ−アルギニン ＋　１ｍｙ　／　ｍｌ　ＢＳＡ ＋０．５ミリモル／　１ＧＳＨ（還元型グルタチオン）＋０．５ミリモル／　Ｊ 　Ｇ１３８Ｇ　（グルタチオンジスルフィド）中の１標準再酸化“（＝１００％ ）に対する。

刺激可能性はＡＫ＋０ＮＢｒＦＳＰ　／△に−ＣＮＢｒＦＳＰから計算する（： 　Ｗ、　Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、’　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａ　ｅｔ５３６参照〕。活性（％）及び刺激可能性（係数）ＪｄＪ、　Ｈ，Ｖ ｅｒｈｅｉｊｅｎ　＋’　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　’、４８（ ３）、２６６〜２６９（１９８２）により測定した。

次の結果が得られた： １、Ｌ−アルギニン又はグアニジン−ヒドロクロリドの添加に対する活性収率の 依存性 再酸化：　０．１　％＃／　ｌ　）リス／　Ｈｃｌ　（ｐ）（１０，５）＋１ミ リモル／　Ａ’　ＥＤＴＡ ＋　ｉ　ｍ９／Ｉｌｌ　ＢＳＡ ＋０．５ミリモル／１ＧＳＨ Ｌ−アルギニン　活　性　刺激可能性 （モル／ｌ）　（％）　（係数） ０．２５　９８　７．５ ０．５　１００　２１．９ ０．７５　２７　１６．３ この実験では、ｔ−ＰＡがＬ−アルギニンにより阻害されると考えられる。それ 故、高いＬ−アルギニン濃度での活性収率の低下は阻害に関して補正すべきであ る。

ｂ）グアニジン−ヒドロクロリド（Ｇｄｎ／Ｈｅ／　）（Ｇｄｎ　／　Ｈ（Ｉｌ ）　活　性 ０モル／ｌ）　（％） ２、尿素及び尿素誘導体の添加に対する活性収率の依存性 再酸化：０．１モル／ｌｌトリス（ｐＨ１０，５）、１　ミ　リ　モル／　ｌ　 ＥＤＴＡ　、１　ｍｇ　／　ｍｌ　ＢＳＡ　、５ミリモル７７ＧＳＨ５０，２ミ リモル／ｌ尿　素　活　性 （モル／ｌ）　０％） ｂ）メチル尿素 メチル尿素　活　性 （モル／ｌ）　０％） Ｃ）エチル尿素 エチル尿素　活　性 （モル／ｌ）　（％） ｄ）ジメチル尿素 ジメチル尿素　活　性　刺激可能性 （モル／ｌ）　（％）　（係数） ０．５　１＋５７　８．８ １　２５６　８、９ １．５　２８３　９．４ ２　１７７　７．７ ２．５　７８　８．９ ３、脂肪酸アミド添加に対する活性収土の依存性：再酸化二０．１モル／ｌトリ ス（ｐＨ１０，５）、１ミリ％　ル／　ｌ　ＥＤＴＡ、ｌ　ｍｙ　／　ｍｌ　Ｂ ＳＡ、ホルムアミド　活　性 （モル／ｌ）　（％） ｂ）メチルホルムアミｒ メチルホルムアミド　活　性 アセタミド　活　性 （モル／ｌ）　（％） ｄ）プロピオナミド プロピオナミド　活　性 ｃモル／ｌ）　（％） ブチラミド　活　性 （モル／ｌ）　（％） ４　活性収率のｐＨ値に対する依存性 再酸化＝　０．１モル／ｌトリス／ＨＣＪ＋ｉミリモル／７１　ＫＤＴＡ十０． ５モル／ｌＬ−アルギニン中 ＋　１ｍ９７　ｍｌ　、ＢＳＡ ＋０．５ミリモル／ｌＧＳ′Ｈ ＋０．５ミリモル／　ｌ　Ｇ５５Ｇ −活　性　刺激可能性 （％）　（係数） ８　２２　３．０ ９　８９　１３．６ １０　’　１０５　２０．３ １１　９５　２１．３ ５、　活性収率のＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ　＠度に対する依存性再酸化二０．１モル／ ぎトリス／　ＨＣＩ　、　ｐＨ１０，５、＋１ミリモル／　／　ＢＤＴＡ ＋０．５モル／ｌＬ−アルギニン −１−ｌ　ｍｇ　／ｍｌ　ＢＳＡ　・ ａ）＋１　ミリモル／１ＧＳＨ （ＧＳＳＧ）　活　性　刺激可能性 （ミリモル／ｌ）　（％）　（係数） ０．１　２３９　１４．９ ０．２　２７３　１５．３ ０．５　１９３　１３．３ １　１９８　１２．５ ｂ）＋０．２ミリモ＃　／　ｌ　ａｓｓａ（ＧＳＨ）　活　性　刺激可能性 （ミリモル／ｌ）　ｃ％）　（係数） ０．０５　１５　２．２ ０．１　４０　３．８ ０．２　１１２　６．８ ０．５　１４２　７．４ １０　１４３　６．３ ６、再酸化する際に活性収率の蛋白質濃度（稀釈１：２０〜１　：５００）に対 する依存性再酸化：　０．１　％に／ｌ　）リス／Ｈｃｌ（Ｐ［１１０，５）＋ １ミリモル／　Ｊ　ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｉＬ−アルギニン ＋　１　ｍ９　／　ｍｌ　ＢＳＡ ＋　０．５　ミ　リ　モル／　ｌ　ＧｓＨ＋　０．５　ミ　リ　％　ル／　ｊ’ 　Ｇ５５Ｇ稀　釈　活　性　刺激可能性 （％）　（係数） １　：１０　２９　１５．３ １：２０　４５　２５．４ １　：５０　６９　３７．９ １　：　１ｔＪ０　１００　３７．９ １　：　２００　７９　５２．７ １　：　５００　２９　２８．７ 再酸化：　０．１　モル／ｌ　）リス／　ＨＣＩ　（ｐＨ１０，５）＋１　ミリ モル／　Ｊ　ＫＤＴＡ ＋Ｏ二５モルＬ−アルギニン ＋　０．５　ミ　リ　％　ル／　７　ＧＳＨ−＋　０．５　ミ　リ　％　ル／　 ｌ　Ｇ５５ＧＢＳＡ　活　性 （ｍ９／ｍｌ”）　（％） 第１図及び第２図は、標準試駄において０．１モル／ｌ）リス／　ＨＲ（１４＝ 　１０．５　）　＋１ミリモルフ　１ＥＤＴＡ　＋　０．５モルＬ−フルギニン ＋１　ｍｇ　／　ｍｌ　ＢＳＡ　＋　０．５ミリモル／１ＧＳＨ＋　３．５ミリ モル７７３　Ｇ５５Ｇ中、室温で１７時間再酸化した後の０ＮＢｒ−ＦＳＰを含 有する場合と含有しない場合の活性を図示したものである。第１図及び第２図に おいて、曲線（’Ａ）がＣＮＢｒ　ＦＳＰの存在における活性であり、曲線（Ｂ ）がＣＮＢｒ−ＦＳＰの不存在における活性である。

例　４ ｔ−ＦＡとグルタチオンとの混合ジスルフィドを介するｔ−ＦＡの活性 使用する１屈折ｌＪＳ体”は前記の例の１つにより得た。

“屈折小体“の還元は、０看モル／１）−Ｉ）ス／ＨＣＩ（ＰＨ８，６）、１ミ リモル／　ｌ！ＥＤＴＡ　、　６モル７１ＩＧｄｎ／ＨＣｌ、Ｑ、２％　ル／　 ７３　ＤＴＥ中、蛋白質濃度約１ｍｐ／ｍｌで室温で２時間恒温保持することに より行なった。

０．０１モル／１ＨＱｌに対して透析し、還元した蛋白質全０．１モル／ｌトリ ス（ｐＨ９，３）、９七ル／ｌ尿素及び０．２モル／　ｌ！Ｇ５５Ｇにより比１ ：１で稀釈しかつ室温で５時間恒温保持した。

！　）？（ＪでＰ）（乙の酸性にし゛だ後で、透析を０．０１モル／１ＨＣ１に 対して４°Ｃで行なった。透析後に全蛋白質濃度は０．５３ｍ９／Ｉｌｌであっ た。このように調製したｔ−ＰＡＳＳＧｉ用いて至適再活性化条件を測定した。

ａ）　ｔ−ＰＡＳ！９Ｇの活性化の至適８８次の最適化実験にあるように、（１ １Ｇ５５Ｇを使わすかつ（２）活性を室温で１７時間恒温保持した後で測定した 。

活性化は、０．１モル／ｌトリス、１ミリ七ル／ｌ　ＥＤＴＡ。

０．５モル／ＩＬ−アルギニン、１　ｍ９　／　ｍｌ　ＢＳＡ及び２ミＩＪ　％ に／　ｌ　ＧＳＨ中で１：１００に稀釈することに上りＰＨ値を変えて行なった 。

ＰＨ収　率（％）　刺激可能性 ６　０．０４　３．３ ６．５　０．３７　９．５ ７　１．３５　１１．４ ７．５　５．６６　７．１ ８　７．３２　８．２ ８．５　８．６５　７．０ ９　８．５９　８．７ ９．５　８．５２　１１．７ １０　６．１５　１２．５ １０．５　３．０７　１１．２ 収率は使用した蛋白質量に対する活性ｔ−ＦＡの％である。

ｂ）ｔ−ＰＡＳＳＧの活性化結果の再埃性同−の活性化条件では、測定列が異な ると、とりわけ積率ｔ−ＦＡの変動により惹起される種々の収率が認ル／ｌ　） リス／　ＩＯＡ’　（ｐＨ８，５）、１　ミリ−Ｔ：　ｋ／ｌ　ＢＤＴＡ、０． ５モル／ＩＬ−アルギニン、１１ｎｇ／　Ｔｌｌ　ＢＳＡ及び２ミリ％ｋｌｌａ ｓＨ中テ１　：　１００す１ｎＬＲ１：　２００１Ｃ稀釈した後のすべての活性 化データを総括した。

実験　収　率（％）　刺激可能性 Ｃ）活性化された蛋白質の安定性 活性化は、本例で０．１モル／ｌトリス／ＨＯＡ’、１ミリモル／　／　ＥＤＴ Ａ、０．５モル／ｌＬ−アルギニン、１ｍ９７　ｍｌ　ＢＳＡ及び２ミリモル１ ｌｊＧＢＨ中で１：２００に稀釈することにより行なった。

６　０．８９　１５．５ ２５　２．４３　２３．１ ４７　２．８３　２３．６ ７１　２．６２　２１．５ ２１５　２．２１　２２．６ ２３９　２．２８　１４．３ 例　５ 遺伝子工学的に製造したインターフェロン−βの活性化 １屈折小体″を前記の方法により生成した。１屈折小体“の還元／可溶化は次の ように行なった：ペレットをソ看モル／１３）　リス／　ＨＣＡ’　（ｐＨ８， ６）　、　６モル／１ＧｄｎＩＩＨＣ１１１ミリモル／　７　ＥＤＴＡ及び０． ２モル／ｌｌ　ＤＴＥ１Ｑｍｌ中２５℃で６時間恒温保持しかつ４℃、４８００ ０ｇで６０分間遠心した後で上澄みのｐＨを濃ＨＣＩで約３に調節した。引続い て、０．０１モルｌｌ　ＨＣＩ中セアセファデックス０２５Ｆしてデル濾過を行 なった。

溶出液を等へ、性、蛋白質濃度及び再活性能について試験した。

再酸化蛋白質の活性は、０．１モル／ｌト＋）ス／　ＨＯｌ（ｐＨ１０，５）　 、１　ミ　リ　モ＃　／　Ｊ　ＥＤＴＡ　、５　ミ　’Ｊ　モに／ＩＧＳＨ１０ ，５ミリモル／　ｌ　ａｓｓａ及び０．２５モル／ＩＬ−アルギニン中の１標準 活性化“（＝ｉｏｏ％）に対する。

ａ）活性収率のＬ−アルギニン添加に対する依存性溶出液を０．１モル／ｌ）リ ス／　Ｈｏ１（ｐＨ８，５）、１ミリモル／　Ｊ　ＫＤＴＡ、５ミリモル／　ｌ 　ＧＳＨｌｏ、５ミリモル／７１　ＧＳＦ３Ｃｋにより１：５０に稀釈しかつ０ ℃で２０時間活性化した。

活性のＬ−アルギニン−依存性 Ｌ−アルギニン（モル／ｌ）　活　性　（％）ｂ）活性成上の尿素添加に対する 依存性活性化溶液は前記のａ）に相当するが、０°Ｃで１７時間活性化した。

活性の尿素依存性 尿素（モル／ｌ＞　活性　（％） Ｃ）ホルムアミド添加に対する活性収率の依存性ａ）と同様に活性化し、試料を ０°Ｃで１７時間活性化した後で試験した。

活性化のホルムアミド依存性 ホルムアミド（モル／ｌ）　活　性 ｄ）レドックス緩衝剤に対する活性収率の依存性溶出液をｏ、ｉモル／ｌトリス ／Ｈｃｌ　（ｐ）（８，５）　、　１ミリモル／　ｌ　ＥＤＴＡ及び０．２５モ ル／！！Ｌ−アルギニン中で１＝５Ｕに稀釈しかつ試料をＯｏＣで１７時間活性 化後に試験した。

活性のＧＳＨ／Ｇ５５Ｇ依存性 ＧＳＨ（ミリモル、／Ａ）　ａｓｓＧ（ミリモル／／）　活性（％）１０　０． ５　２５ ２０　０．５　２５ θ）　ＢＳＡ添加に対する活性収率の依存性滓出液ｔ０．１モル／ｌ）リス／　 Ｈａｌ（ｐＨ８，５）、１ミリモル／　Ｊ　ＥＤＴＡ、５ミリモル／　Ｊ　Ｇ５ Ｒ５０，５ミリモル／　ｌ　Ｇ５５Ｇ及び０．２５モル／１１　Ｌ−アルギニン 中で１＝５０に稀釈しかつ０°Ｃで１７時間活性化後に試験した。

活性のＥＳＡ依存性 ＢＳＡ（ｍ９／ｍｌ　）　活　性（％）ｆ）ＰＨに対する活性収率の依存性 溶出液を０．１モル／Ｉ！トリス／ＨＣｌ、１ミリモル／Ｉ！ＥＤＴＡ、５　ミ 　リモル／　ｌ　ＧＳＨｌ　０．５　ミ　リモル／ｌ　Ｇ５５Ｇ及び０．２５モ ル／ＩＬ−アルギニン中で１：５０に稀釈しかつ０℃で１７時間活性化後に試験 した。

活性の一依存性 ＰＨ活性（％） １０．５１００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフイド結合を含有する真核蛋白質 を原核における発現後に、細胞を溶解し、変性及び還元条件下に可溶化しかつＧ ＳＨ／ＧＳＳＧの存在における酸化条件下に再活性化することにより活性化する 方法において、再活性化工程においてｐＨ値９〜１２、ＧＳＨ濃度０．１〜２０ ミリモル／ｌ、ＧＳＳＧ濃度０．０１〜３ミリモル／ｌでかつ変性作用をしない 濃度の変性剤を用いて作業することを特徴とする方法。 ２．再活性化工程においてｐＨ値が９．５〜１１であることを特徴とする請求の 範囲第１項記載の方法。 ３．再活性化工程において、ＧＳＨ濃度は０．２〜１０ミリモル／ｌ及び／又は ＧＳＳＧ濃度は０．０５〜１ミリモル／ｌであることを特徴とする請求の範囲第 １項又は第２項記載の方法。 ４．可溶化後及び再活性化前に精製を行なうことを特徴とする請求の範囲第１項 から第５項までのいずれか１項記載の方法。 ５．再活性化を変性剤／還元剤を予め分離することなく行ない、その除に変性／ 還元後の反応溶液を再活性化緩衝剤で稀釈しかつ次の再活性化の際にＧＳＳＧ濃 度がＤｍの残留四度を上廻ることを特徴とする請求の範囲第１項から第５項まて のいずれか１項記載の方法。 ６．遺伝子エ学的に製造した、異種の、ジスルフィド結合を含有する；核蛋白質 を原核において発現後に、細胞を溶解し、変性剤及び還元条件下に可溶化しかつ σＳＨの存在における酸化条件下に再活性化することにより活性化する変形法に おいて、遺元一／変性剤を分離し、変性条件下にＧＳＳＧの添加により蛋白質の チオール基を蛋白質とグルタチオンとの混合ジスルフィドに変換し、再活性化工 程ではｐＨ値７〜１０．５、ＧＳＨ皿度０．５〜５ミリモル／‘でかつ変性作用 をしたい濃度の変性剤を用いて作業することを特徴とする方法。 ７．発現をＥ．コリ又はＰ．プチダで行なうことを特徴とする請求の範囲第１項 から第６項までのいずれか１項記載の方法。 ８．再活性化工程において変性剤としてアルギニン、グアニジンーヒドロクロリ ド及び／又は一般式：Ｒ２−ＣＯ−ＮＲＲ１（Ｉ）〔式中Ｒ及びＲ１はＨ又はＣ 原子１〜４個を有するアルキルを表わしかつＲ２はＨ又はＮＨＲ１又はＣ原子１ 〜３個を有するアルキルを表わす〕の化合物少なくとも１種を使用することを特 徴とする請求の範囲第１項から第７項までのいずれか１項記載の方法。 ９アルギニン及び／又はグアニジンヒドロクロリドの濃度が０．１〜１．０モル ／ｌ、特に０．２５〜０．８モル／ｌであることを特徴とする請求の範囲第８項 記載の方法。 １０．一般式Ｉの化合物の濃度が０．５〜４モル／ｌ、特に１〜３．５モル／ｌ であることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。 １１．再活性化工程において蛋白質分解作用を蛋白質の存在において、特に牛血 清アルブミンの存在において作業することを特徴とする請求の範囲第１項から第 １０項までのいずれか１項記載の方法。 １２．細胞の溶解を超音波、高圧分散又はリゾチームを用いて行なうことを特徴 とする請求の範囲第１項から第１１項までのいずれか１項記載の方法。 １３．溶解を稀水性緩衝液、特に０．１モル／ｌトリス中、中性乃至弱酸性のｐ Ｈ値で行なうことを特徴とする請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．細胞の溶解後に不溶性成分を分離することを特徴とする請求の範囲第１項 から第１３項までのいずれか１項記載の方法。 １５．可溶化工程において、アルカリ性ｐＨ値でメルカプ。 ト基から成る還元剤の存在において及び変性剤の存在において作業することを特 徴とする請求の範囲第１項から第１４項までのいずれか１項記載の方法。 １６．変性剤としてグアニジンヒドロクロリド及び／又は一般式Ｉの化合物の存 在において作業することを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．グアニジンヒドロクロリドの濃度が６モル／ｌであり、一般式Ｉの化合物 の濃度が８モル／ｌであることを特徴とする請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．ＤＴＥ、β−メルカプトエタノール、システイン又はＧＳＨの存在におい て作業することを特徴とする請求の範囲第１５項から第１７項までのいずれか１ 項記載の方法。 １９．精製及び還元剤、酸化剤又は変性剤の分離は滅菌溶離クロマトグラフイ又 は透析により行なうことを特徴とする請求の範囲第１項から第１８項までのいず れか１項記載の方法。 ２０．再活性化工程の後で透析による精製工程を行なうことを特徴とする請求の 範囲第１項から第１９項までのいずれか１項記載の方法。 ２１．遺伝子工学的に製造した真核蛋白質としてｔ−ＰＡを使用することを特徴 とする請求の範囲第１項から第２０項までのいずれか１項記載の方法。 ２２．請求の範囲第１項から第２１項までのいずれか１項記載の方法により得ら れたグリコシル化されていない刺激可能なｔ−ＰＡ。 ２３．遺伝子工学的に製造した真核蛋白質としてインターフェロンβを使用する ことを特徴とする請求の範囲第１項から第２０項までのいずれか１項記載の方法 。 ２４．蛋白質とグルタチオンとの混合ジスルフィドをイオン交換体処理により変 性されていない蛋白質から分離することを特徴とする請求の範囲第６項記載の方 法。