HU204855B - Process for activating heterologous eucaryotic proteins comprising disulfide bridges and produced by genetic engineering, after expressing them in procaryotes - Google Patents

Process for activating heterologous eucaryotic proteins comprising disulfide bridges and produced by genetic engineering, after expressing them in procaryotes Download PDF

Info

Publication number
HU204855B
HU204855B HU865290A HU528686A HU204855B HU 204855 B HU204855 B HU 204855B HU 865290 A HU865290 A HU 865290A HU 528686 A HU528686 A HU 528686A HU 204855 B HU204855 B HU 204855B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
tpa
gsh
concentration
denaturing
gssg
Prior art date
Application number
HU865290A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephan Fischer
Ralf Mattes
Rainer Rudolph
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HU204855B publication Critical patent/HU204855B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás géntechnológiai úton előállított heteroíóg, diszulfídhidakat tartalmazó eukariőtaproteinek aktiválására prokariótákban történő kifejezés után.
Heteroíóg proteineknek prokariótákban történő kife- 5 jezése során ezek a proteinek a gazdasejtben gyakran inaktív, nehezen oldható aggregátumként (úgynevezett „reflacíile bodies”, jelölése a továbbiakban RB) keletkeznek, melyek még a gazdasejtek proteinjeivel is szennyezettek. Az ilyen RB keletkezése a kifejezéskor 10 a sejtben keletkező proteinek nagy koncentrációjára vezethető vissza. Ismeretes, hogy ha a sejtben nagy mennyiségi enzim keletkezik, azok oldhatatlan, nagy molekulatőmegő, nagyrészt inaktív részecskékké aggregálódnak. Mielőtt ezeket a proteineket például terápi- 15 ás célokra alkalmaznák, azok tisztítására és aktív formájukká történő átalakítására van szükség. Ismeretesek olyan többlépéses eljárások, melyek az ilyen aggregátumként keletkezett proteinek reaktiválására szolgálnak, lásd például: R. Jaenicke, FEBS Federation of 20 European Biochemical Societies, 52. kötet (1979), 187-198; és R. Rudolph és munkatársai, Biochemistry, (1979), 5572-5575.
Ezen eljárások szerint az első lépésben oldatot készítenek, erős denaturálószer, például nagy koncentrá- 25 ciójú guanidin-hidroklorid vagy karbamid hozzáadásával, vagy erősen savas szerek, például glicin-foszforsav-elegy hozzáadásával. További adalékanyagként alkalmazhatók például a redukáló SH-reagensek (például ditio-eritrít, DTE) és az EDTA, például LDH (Iaktát- 30 dehidrogenáz) renaturálása esetén. Amennyiben a protein a gazdasejt proteinjeivel szennyezett, a kővetkező lépésben önmagukban ismert módszerrel, például gélvagy ioncserélő kromatográfiával történő tisztítást végeznek. Ezután az elegyet nagymértékben hígítják a 35 denaturálószer koncentrációjának csökkentésére. így például guanidin-hidroklorid alkalmazása esetén a hígítást 0,5 mól/1 érték alá viszik. Szabad SH-csoportokat tartalmazó enzimek esetén előnyösnek találták az SHcsoportokat védő szerek adagolását, lásd például R. 40 Jaenicke, Journal Polymer Science, C-rész, 16 (1967), 2143-2160.
Az EP-A0114506 Iajsfromszámúeurópai szabadalmi leírás eljárást ismertet egy baktériumíenyészetból nyert heteroíóg termék izolálására, tisztítására és reaktiválásá- 45 ra; areaktiválás céljából azRB erős denaturálószerrel készített oldatát
a) közvetlenül egy gyengébb denaturálószer oldatába vezetik, majd a diszulfídhidak visszalakítására oxidáló körülményeket alakítanak ki; 50
b) a proteint szulfonálják, majd egy gyengébb denaturálőszer oldatába vezetik, és az S-szulfonátcsoportokat redukált és oxidált formájúvá, szulfhidrilreagenssel történő kezeléssel például GSH/GSSG rendszerrel -S-S-csoportokká alakítják; vagy 55
c) a gyenge denaturálőszerrel készített oldatot közvetlenül a szulfhidrilreagenssel, például GSH/GSSG rendszerrel kezelik.
Az ilyen problémák fellépésének egy tipikus példája atPA. 60
Az alvadt vér proteinmátrixának főkomponense a polimer fíbrin. Ezt a proteinmátrixot a plazmin oldja, mely plazminogénből az ún. plazminogén-aktivátorokkal történő aktiválás következtében keletkezik, ilyen aktivátor például a tPA (szöveti plazminogén-aktivátor, tissue-type plasminogen activator). A természetes vagy eukariótákból géntechnológiai úton nyert tPA-enzim aktivitása (plazminogénnekplazminná történő katalitikus aktiválása) fibrin vagy fibrinhasítási termékek (FSP) távollétében igen alacsony, azonban ilyen stimulátorok jelenlétében lényegesen megnövelhető (a 10 szorzófaktomál is nagyobb mértékben). Aktivitásának ezen stimulálhatósága a tPA-t egyértelműen más ismert plazminogén-aktivátorok, például az urokináz vagy a streptokináz elé helyezi [lásd például M. Hoylaerts és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257 (1982), 2912-2919; és Nieuwenhiuzen és munkatársai, Biochemica et Biophysica Acta, 755 (1983), 531-533]. A BrCN-hasítási termékekkel történő stimulálhatóság faktorát az irodalom különbözőképpen adja meg, és azt 35-ig számozza.
Egy tPA jellegű, nem glikozílezett terméket a genetikailag módosított prokariőták is termelnek cDNS beépítése után (EP-A 0 382 174 lajstromszámú európai szabadalmi leírás). Egy ilyen tennék hatása azonban nem éri el az eukariótákból származó tPA aktivitás-strmuláló képességét. Ez arra vezethető vissza, hogy a prokariótasejtekben fellépő redoxkörülmények olyan mértékben különböznek a gént eredetileg tartalmazó eukariőtasejtben lévőktől, hogy kezdettől fogva egy nem aktív tennék képződik, mely viszont például arra vezethető vissza, hogy számos S-S-híd, melyet a természetes aktív molekula tartalmaz, hibás módon, vagy egyáltalán nem kapcsolódik. A tPA terápiás alkalmazása szempontjából azonban nemcsak önmagában az enzimatikus aktivitás szükséges, hanem annak stimulálhatósága is. Arra, hogy a prokariótasejtekben nem ideálisak a körülmények ahhoz, hogy az eukarióta-proteinek aktivitása megfelelően kialakuljon, rámutat például más anyagok esetén a The EMBO Journal 4, 3 (1985), 775-780 cikke.
Az EP-A 0 093 639 lajstromszámú európai szabadalmi leírás szerint a tPAreaktiválására az E.coli sejtekből származó sejtpelleteket 6 mól/1 koncentrációjú guanidin-hidrokloridban szuszpendálják, ultrahanggal kezelik, inkubálják, majd 4 órán át trisz-HCl (pH=8,0), nátrium-klorid, EDTA és Tween 80 oldatával szemben dializálják. A dializátumot centrifugálják, és a plazminogén-aktivátor aktivitás a felülúszőban található. Az ily módon renaturált tPA proteolitikusan aktív; a hibrinből származó BrCN-hasítási termékekkel (BrCN-FSP) azonban kimutatható mértékben nem stimulálható, mint azt J. H. Veiheijen, Thromb. Haemostas., 48, (3), 260-269 (1982) ismerteti.
Denaturált proteinek reaktiválásra a technika eddigi állásából nem ismeretes általánosan alkalmazható eljárás, és ez különösen igaz a tPA esetén, mivel a natív protein igen komplex szerkezettel rendelkezik. A tPAmolekula egy szabad tiolcsoportot és 17 S-S-hidat tartalmaz, melyek elméletileg 2,2· 1020 módon kapcsolódhatnak egymással, ugyanakkor a natív állapothoz csak
HU 204 855 Β egyetlen szerkezet tartozik. Az eddig ismert tPA reaktiválási eljárások egy proteolitikusan aktív tPA-hoz vezetnek, mely azonban mérhetően nem stimulálható; olyan aktiválási eljárás, mely stimulálható tPA-hoz vezet, az eddigi irodalomból nem ismert.
A találmány célkitűzése ezért olyan eljárás kidolgozása, mely a géntechnológiai úton előállított heterológ diszulfidhidakat tartalmazó eukarióta-proteinek prokariótákban történő kifejezése után azok teljes aktiválásához vezet; ezt a célkitűzést a találmány szerinti eljárással megvalósítjuk.
A találmány tárgya tehát eljárás géntechnológiai úton előállított heterológ diszulfidhidakat tartalmazó eukarióta-proteinek aktiválására prokariótákban történő kifejezés után, melynek során a sejteket feltárjuk, denaturáló és redukáló körülmények között oldatba visszük, majd oxidáló körülmények között GSH/GSSG jelenlétében aktiváljuk (renaturáljuk); a találmány szerinti egyik megoldást az jellemzi, hogy az aktiválási lépésben 9 és 12 közötti pH-értéken, 0,1-20 mmól/l GSH-koncentráció és 0,01-3 mmól/l GSSG-koncentráció jelenlétében, és a denaturálószer nem denaturáló koncentrációja mellett dolgozunk.
Denaturálószefként általában egy oxidáló körülmények között általánosan alkalmazott denaturálószert vagy arginint alkalmazhatunk; az ismert denaturálószerek közül előnyös a guanidin-hidroklorid vág karbamid, vagy azok származékai. Alkalmazhatók ezenkívül ezen denaturálószerek elegyei is. Előnyösen az aktiválási lépést valamely idegen fehérje jelenlétében végezzük; ilyen fehérjeként általában minden olyan idegen fehérje alkalmazható, mely proteolitikusan nem aktív; előnyösen szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) alkalmazunk, például 1-3 mg/ml mennyiségben. A BSA adagolása kissé növeli a kitermelést, és javítja a protein stabilitását (valószínűleg a felületi denaturáció és/vagy proteolitikus lebontás gátlásával).
Az eljárás során egyébként célszerűen az irodalomból ismert reaktiválási eljárások során alkalmazott körülmények között dolgozunk. Az aktiválás (inkubáció) ideje előnyösen szobahőmérsékleten 20 és 48 óra között van. Az aktiválás felezési ideje 0,5 mmól/l redukáló (GSH) és oxidáló (GSSG) glutation jelenlétében 20 °C hőmérsékleten, körülbelül 10-15 óra. Hosszabb inkubálási idő (48 óra) esetén, reoxidációs körülmények között a CNBr-FSP általi stimulálhatóság általában csökken. Az aktiválási lépést előnyösen EDTA jelenlétében végezzük, ahol annak célszerű koncentrációja körülbelül 1 mmól/l.
Az aktiválási lépést (reoxidáció/aktiválás) megelőző és követő reakciólépéseket, például sejtfeltárást, szolubilizálást (szolubilizálás/redukció) és adott esetben egy vagy több, az aktiválási lépést megelőző és/vagy követő tisztítási eljárást az irodalomból jól ismert módszerekkel, például az EP-A 0 114 506 és EP-A 0 093 619 lajstromszámú európai szabadalmi leírások szerinti módszerekkel végezhetjük; azonban az optimális kitermelés és aktiválás érdekében célszerű az egyes eljáráslépéseket, vagy valamennyi eljáráslépést a későbbiekben megadott eljárások szerint végezni. Az is lehetséges, hogy a találmány szerinti aktiválási lépést a feltárás során kapott elegyben további denaturálás és/vagy redukció nélkül végezzük; ebben az esetben azonban alacsony a kitermelés. A kifejezést prokariótákban, előnyösen P. putida-ban, és főleg E.coli-ban végezzük. A találmány szerinti eljárás azonban hasonlóan alkalmazható, ha más prokariótákat, például Bacillust alkalmazunk.
A sejtfeltárást szokásos módszerekkel végezhetjük, például ultrahanggal, nagynyomású diszpergálással vagy lizozimmal; szuszpenziós közegként előnyösen semleges, illetve enyhén savas pH-érték beállítására szolgáló pufferoldatot, például 0,1 mól/1 koncentrációjú trisz-HCl-ot használunk. A sejtfeltárás után az oldhatatlan alkotórészeket (RB) tetszőleges módon elválasztjuk, előnyösen magas g-értéken történő centrifugálással, hosszú centrifugálási idővel vagy szűréssel. Az anyagot olyan szerekkel mossuk, melyek a tPA-t nem befolyásolják, azonban az idegen sejtproteineket lehetőség szerint oldják (például víz, foszfátpuffer-oldat), adott esetben enyhe detergenseket, például tritont adagolunk, majd a csapadékot (pellet) szolubilizáljuk (szolubilizálás/redukció). A szolubilizálást előnyösen alkalikus pH-tartományban végezzük, célszerűen 8,6+0,4 pH-értéken, egy merkaptáncsoportba tartozó redukálószer és egy denaturálószer jelenlétében.
A szolubilizálás során denaturálószerként az irodalomból, például az EP-A 0 114 506 lajstromszámú európai szabadalmi leírásból ismert, és általánosan alkalmazott denaturálószert alkalmazhatunk, főleg guanidin-hidrokloridot vagy karbamidot. A guanidin-hidroklorid koncentrációja célszerűen körülbelül 6 mól/1, a karbamidkoncentráció előnyösen körülbelül 8 mól/1. Ugyancsak alkalmazhatók R2-CO-NRR1 általános képletű vegyületek is; ezekben R és Rí hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport és R2 hidrogénatom vagy -NHRi általános képletű csoport vagy 1-3 szénatomos alkilcsoport.
Merkaptáncsoportba tartozó redukálószerként például redukált glutation (GSH) vagy 2-merkapto-etanol alkalmazható, például 50-400 mmól/l koncentrációban, és/vagy főleg DTE (ditio-eritritol), illetve DTT (ditio-treitol), például 80-400 mmól/l koncentrációban. A szolubilizálást célszerűen szobahőmérsékleten végezzük, 1 és néhány óra közötti időtartamig, előnyösen 2 óra hosszat. A redukálószemek a levegő oxigéntartalmától történő oxidálódásának gátlására célszerű a reakcióelegyhez EDTA-t adagolni. A szolubilizáció és redukció mellett a szolubilizáló lépésnek tisztító hatása is van, mivel a tPA-val immunológiásan keresztreakciót nem adó anyagok (idegen proteinek) jelentős része nem megy oldatba.
A szolubilizálás után és az aktiválási lépés előtt önmagában ismert tisztítási lépések iktathatók be; tisztítási módszerekként például a következők alkalmazhatók: sztérikus kizárásos kromatográfía (SEC) (guanidin-hidroklorid vagy karbamid jelenlétében), vagy ioncserélő kromatográfía (karbamid vagy származékai jelenlétében); a nem specifikus reoxidációt valamely redukálószer, például 2-merkapto-etanol hozzáadásával
HU 204 855 Β vagy 45 pH-értékkel akadályozhatjuk meg pásd például R. Rudolph, Biochem. Soc. Transactions, 13 (1985), 308-311]. Amennyiben az előző szolubilizációs lépésben DTE-t alkamaztunk, ezt egy tisztítási lépésben el kell választani. Ezt a tisztítást például SECcel Sephadex G-100 oszlopon, guanidin-hidroklorid és egy redukálőszer, például GSH jelenlétében, 1 és 4 közötti pH-értéken végezhetjük (ebben a lépésben az idegen proteinek nagy része is elválasztódik); végezhetjük azonban a denaturálőszer és/vagy redukálószer elválasztását Sephadex G-25 oszlopon, 0,01 mól/1 HCl, illetve 0,1 mól/I ecetsavoldattal történő sómentesítéssel is. A denaturálőszer/redukálószer elválasztása alternatív módon az azonos oldószerrel szemben végzett dialízissel is lehetséges.
Egy további tisztítási lépést beiktathatunk a reaktiyálási lépésbe is; ezt a tisztítást általában dialízissel végezzük, vagy az aktivált tPA azt követő izolálásával, mely például affinitás-kromatográfíával, például LysSepharose oszlopon történhet.
A találmány szerinti eljárás egy másik foganatosítás! módja szerint a géntechnológiai úton előállított, hete-rolőg diszulfídhidakat tartalmazó eukariőta-proteinek és glutatíon között vegyes diszulfídot alakítunk ki (ezt a továbbiakban tPASSG-vel jelöljük). Ezt akár a denaturált állapotú, idegen proteinek elválasztásával, akár a natív proteinek további tisztításával megkőnnyíthetjük. A tíolcsoportok módosítását követő tisztításnak előnye, hogy a protein védett a levegőoxidációval szemben, így nagyobb pH-tartományban stabil, és így lehetővé teszi a tisztítás kitermelésének javítását. Különösen előnyösen végrehajtható - ioncserélővel végzett kezeléssel - a nem módosított proteinek elválasztása. A vegyes diszulfidok előállítására a dializált, redukált, denaturálószertől és redukálőszertől megtisztított proteint egy denaturálószert tartalmazó híg, például 0,2 mól/1 koncentrációjú GSSGoldatíal inkubáljuk. Az aktiválást a denaturálőszer és oxidálószer elválasztása után 7-10,5 pH-értéken, 0,5-5 mmől/l GSH-koncentrácíó mellett, és a denaturálószemek nem denaturáló koncentrációja jelenlétében végezzük.
A további reakciőlépésekben a GSSG-vel képzett vegyes diszulfíd-protein aktiválását az előzőekben leírtak szerint végezzük. Ezen kiviteli változatnál a pH optimuma 8,5, és a kitermelés mintegy kétszeres; továbbá az aktivált protein a renaturálőpufferban kétszer annyi ideig tartható el.
A találmány szerinti eljárással prokariótákkal termelt tPA úgy aktiválható, hogy nemcsak az eredeti biológiai aktivitás nyerhető vissza, hanem ezenkívül a fentiek értelmében vett stimulálhatóság is megnő anynyira, hogy a natív tPA stimulálhatóságát lényegesen felülmúlja és a 10 szorzőfaktomál nagyobb értékű lesz, elérheti akár az 50 szorzófaktort is.
A találmány szerinti eljárással prokariőtákból történő kifejezés után aktiválható eukariőta-protein a β-interferon.
Az alábbi példákban a találmány szerinti eljárást részletesen is ismertetjük, anélkül, hogy a találmány oltalmi körét a példákban megadottakra korlátoznánk.
Amennyiben másképp nem adjuk meg, a százalékos értékek tömegszázalékot jelentenek, és a hőmérsékleti értékek Celsius-fokban megadottak.
J.péWű
a) RB előállítása
1,5 I, 0,1 mól/1 koncentrációjú trisz-HCl (pH=6,5) pufferben és 20 mmől/l koncentrációjú EDTA-ban felvett 100 g E.coli [a K2P tPA-származékot kódoló régiót tartalmazó pA 27.3 plazmiddal (EP- AO 382 174) transzformált E.coli RM 82 törzs (DSM 3689)] nedves sejtmasszát Ulíra-Turrax homogenizátoiral 10 másodpercig homogenizáljuk, majd 0,25 mg/ml lizozimet adunk hozzá. Az elegyet 30 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd ismét homogenizáljuk és 3 ‘C hőmérsékletre hűtjük. A sejtfeltárást nagynyomású diszpergálással (550 kg/cm2) végezzük. Ezután 300 ml, 0,1 mől/1 trisz-HCI (pH=6,5) puffért és 20 mmól/l EDTA-t tartalmazó eleggyel öblítjük. Az elegyet 2 órán át 4 °C hőmésékleten 27 000 g-vel centrifugáljuk, majd a pelletet 1,3 1, 0,1 mól trisz-HCI (pH=6,5) puffért, 20 mmól/l EDTA-t és 2,5% Triton-x-100-at tartalmazó elegyben felvesszük és homogenizáljuk. Ismételt centrifugálást végzünk 30 percen át 4’C hőmérsékleten, 27 000 g-vel, majd a pelletet 1,3 1, 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH-6,5) puffért, 20 mmól/I EDTA-t és 0,5% Triton-x100-at tartalmazó elegyben felvesszük és homogenizáljuk. A centrifugálást (30 perc, 27 000 g, 4 ’C) és a pelletek homogenizálását [1 I, 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH-6,5) puffért és 20 mmól/l EDTA-t tartalmazó elegyben] még háromszor végezzük el.
Az RB tPA tartalmát SDS-PAGE módszerrel, a tPAsávok „Westem-blotting” eljárással történő azonosításával és denzítometriás analízissel határoztuk meg. Az RB az SDS-PAGE és „Westem-blotting” módszer alkalmazásával erős, kb. 60 kD molekulatömegű tPA-sávokat mutattak. Áz RB-összprotein tartalmának kb. 21 %-át képezi a tPA-rész.
b) AzRB szolubilizálása és redukciója
Az RB-t 1-5 mg/ml proteinkoncentráció mellett 0,1 mól/I trisz-HCl (pH=8,6) pufferben, 6 mól/1 guanidin-hidroklorid, 0,15-0,4 mól/1 DTE és 1 mmól/I EDTA-koncentrácíő mellett 2-3 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután az oldhatatlan anyagokat, például sejtfalfragmenseket stb., kicentrifugáljuk, például 30 percen át 35 000-50 000 g-vel, 4 ’C hőmérsékleten. A felülúszó pH-értékét tömény sósavval 3-ra állítjuk. Ezután a denaturálószert és redukálószert 4 ’C hőmérsékleten 0,01 mól/I sósavval szemben dializálva választjuk el.
c) Reoxidáciő/aktiválás
A reoxidációt és aktiválást 1:50-1:200 hígításban végezzük, közegként 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH-10,5) puffért alkalmazva, mely 1 mmól/l EDTA-t, 1 mg/ml BSA-t, 0,5 mől/1 L-arginint, 2 mmól/l GSH-t és 0,2 mmól/I GSSG-t tartalmaz. 17-24 órás, 20 ’C hőmérsékleten végzett aktiválás után az aktivitást az
HU 204 855 Β eukariótákból származó natív glikozilzett tPA-hoz viszonyítjuk és így határozzuk meg a kitermelést.
Kitermelés az RB-összprotein tartalmára vonatkozóan: 2,5±0,5%;
stimulálhatóság (szorzófaktor): 10+5.
Kitermelés az RB tPA-tartalmára vonatkoztatva: kb. 12%.
d) Reoxidáció/aktiválás a denaturálószer és redukálószer elválasztása nélkül
Az RB-t 1,25 mg/ml proteinkoncentráció mellett
0,1 mől/1 trisz-HCl (pH=8,6) pufferben, mely 6 mól/1 guanidin-hidrokloridot, 0,2 mól/1 DTE-t és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz, szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. Közvetlenül ezután megindítjuk a reoxidációt 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=10,5) puffer 1:100szoros hígításával, mely puffer 1 mmól/1 EDTA-t, 1 mg/ml DSA-t, 0,3 mól/1 L-argínint és a táblázatban megadott mennyiségű GSSG-t tartalmaz. Az aktiválási lépésben ezenkívül 0,06 mól/1 guanidin-hidroklorid és 2 mmól/1 DTE maradék koncentráció van jelen.
Az aktív tPA-ra számított kitermelés GSSG-koncentráció függősége a denaturálőszer és redukálószer elválasztása nélkül végzett aktiválás során.
GSSG (mmól/1) Kitermelés* (%) Stimulálhatóság (faktor)
0,2 0
1 0,13 4,0
5 1,49 7,4
6 1,28 5,4
7 1,04 5,8
9 0,98 5,2
10 1,77 10,0
15 0 -
20 0 -
*=Az aktív tPA kitermelése az RB-összprotein tartalmára számítva.
2. példa
RB-készítményt (kb. 5 mg), 1 ml 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=8,6) pufferban, mely 6 mól/1 guanidin-hidrokloridot és 0,15-02 mól/1 DTE-t tartalmaz, 2-3 órán át szobahőmérsékleten inkubálunk. Az oldhatatlan anyagot (sejtfalfragmensek stb.) ezután 20 percen át 17 000 g-vel végzett centrifugálással eltávolítjuk. A denaturálószert és redukálószert Sephadex G-25 (superfine) oszlopon végzett gélszűréssel, 0,01 mól/1 sósavat alkalmazva távolítjuk el. Erre a célra a mintát kb. 5-10 szoizófaktor eléréséig hígítjuk. A redukált anyagot 0,01 mól/1 sósavas oldatban 20 °C hőmérsékleten tároljuk.
3. példa
Az alábbi táblázatokban a találmány szerinti paramétereknek a tPA aktiválására és stimulálhatóságára mutatott befolyását foglaljuk össze. A reoxidációs kísérletekhez a 2. példa szerint szolubilizált, redukált proteint tovább nem tisztított alakjában alkalmazzuk.
A redukált proteint (0,01 mól/1 koncentrációjú sósavas oldatban) 1:10-1:500 hígításban a „reoxidációs puffer”ben aktiváljuk. Az aktiválást szobahőmérsékleten, 22-48 órás inkubációval végezzük. A reoxidált protein aktivitását egy „standard reoxidációhoz” (=100%) viszonyítva fejezzük ki, az alábbi rendszerben:
0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=10,5) puffer +1 mmól/1 EDTA +0,2 mól/1 L-arginin +1 mg/ml BSA +0,5 mmól/1 GSH (redukált glutation) +0,5 mmól/1 GSSG (glutation-diszulfid).
A stimulálhatóságot a AE+biot-fsp/AE.bicn-fsp hányados alapján számítjuk [lásd W. Nieuwenhuizen és munkatársai, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531-533]. Az aktivitást (%) és stimulálhatóságot (szorzófaktor) J. H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48 (3), 266-269 (1982) szerint határozzuk meg.
A kísérletekben az alábbi eredményeket kapjuk:
1. Az aktív tPA-ra számítót kitermelés függése L-arginin vagy guanidin-hidroklorid adagolása esetén.
A reoxidációt az alábbi elegyben végezzük:
0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=10,5) puffer +1 mmól/1 EDTA +1 mg/ml BSA +0,5 mmól/1 GSH +0,5 mmól/1 GSSG.
a) L-arginin
L-arginin (mól/1) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) Stimulálhatóság (szorzófaktor)
0 4 2,5
0,25 98 7,5
0,5 100 21,9
0,75 27 16,3
1,0 23 3,5
Megjegyezzük a fenti kísérlettel kapcsolatban, hogy az L-arginin gátolja a tPA-t. Ennek megfelelően a magasabb L-arginin koncentrációknál jelentkező aktív tPA-kitermeléscsökkenést a gátlásnak megfelelően korrigálni kell.
b) guanidin-hidroklorid (Gdn/HCl)
Gdn/HCl (mól/1) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%)
0 11
0,25 22
0,5 53
0,75 58
1,0 12
HU 204855 Β
2. Az aktív tPA-ra számított kitermelés függése kar- d) dimetil-karbamid
bamid és karbamidszármazékok alkalmazása esetén. -— ----——-
A reoxidációt az alábbi elegyben végezzük: Dimetil- Aktív tPA-ra számított Stimulálhatóság
0,1 mól/l írisz (pH«10,5) puffer -karbamíd kitermelés (%) (szorzófaktor)
+1 mmól/1 EDTA 5 (mól/l)
+1 mg/ml BSA
+5 mmól/1 GSH
+0,2 mmól/1 GSSG. 0,5 167 8,8
1 256 8,9
10 1,5 283 9,4
a) karbamíd 2 177 7,7
2,5 78 8,9
Karbamíd Akív tPA-ra számított 3 23 9,9
(mól/l) kitermelés (%) 4 4 8,6
- 15 5 2 3,5
0 1
0,5 20
1 59 3. Az aktív tPA-kitermelés függése különböző zsír-
1,5 126 20 savamidok adagolása esetén.
2 162 A reoxidációt az alábbi elegyben végezzük:
2,5 141 0,1 mól/l írisz (pH=10,5) puffer
3 72 +1,0 mmől/ϊ EDTA
4 12 +1 mg/ml BSA
5 0 25 +5 mmól/1 GSH
+0,2 mmól/1 GSSG.
b) metil-karbamid Metil-karbamid (mól/l) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) a) formamid Aktív tPA-ra számított kitermelés (%)
— 30 Formamid (mól/l)
0 42
0,5 22 35 0,5 59
1 174 1 175
1,5 313 1,5 245
2 375 2 325
23 332 2,5 423
3 215 40 3 444
4 12 4 416
5 0 5 341
c) etil-karbamid 45 b) metil-formamid
Metil-formamid Aktív tPA-ra számított
Etil-karbamid (mól/l) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) 50 (mól/l) kitermelés (%)
0,5 46 0,5 100
1 212 1 135
1,5 323 1,5 304
2 300 55 2 389
2,5 107 2,5 466
3 19 3 452
4 0 4 425
5 0 5 121
HU 204 855 Β
c) acetamid
Acetamid (mól/1) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%)
0,5 72
1 134
1,5 207
2 261
2,5 204
3 237
4 198
5 141
d) propion-amid
Propion-amid (mól/1) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%)
0,5 95
1 99
1,5 197
2 150
2,5 101
3 39
4 2
5 0
d) vajsav-amid
Vajsav-amid Aktív tPA-ra számított
(mól/1) kitermelés (%)
0,5 55
1 52
1,5 17
0
4. Az aktív tPA-ra számított kitermelés pH-fuggősége. A reoxídációt az alábbi elegyben végezzük:
0,1 mól/1 trisz-HCl puffer +1 mmól/l EDTA +0,5 mól/1 L-arginin +1 mg/1 BSA +0,5 mmól/l GSH +0,5 mmól/l GSSG.
PH Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) Stimulálhatóság (szorzófaktor)
7 1 —
8 22 3,0
9 89 13,6
10 105 20,3
11 95 21,3
5. Az aktív tPA-ra számított kitermelés függése a GSH/GSSG koncentrációtól.
A reoxídációt az alábbi elegyben végezzük:
0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=10,5) puffer +1 mmól/l EDTA +0,5 mól/1 L-arginin +1 mg/ml BSA.
a) +1 mmól/l GSH
GSSG Aktív tPA-ra számított Stimulálhatóság
(mmól/l) kitermelés (%) (szorzófaktor)
0,1 239 14,9
0,2 273 15,3
0,5 193 13,3
1 198 12,5
5 17 2,1
10 0 -
20 0 -
b) +0,2 mmól/l GSSG
GSH (mmól/l) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) Stimulálhatóság (szorzófaktor)
0,05 15 2,2
0,1 40 3,8
0,2 112 6,8
0,5 142 7,4
1 273 6,8
5 260 7,9
10 143 6,3
20 55 5,1
6. Az aktív tPA-kitermelés függése a reoxidáció során alkalmazott proteinkoncentrációtól (hígítás 1:201:500).
A reoxídációt az alábbi elegyben végezzük:
0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=10,5) puffer +1 mmól/l EDTA +0,5 mól/1 L-arginin +1 mg/ml BSA +0,5 mmól/l GSH +0,5 mmól/l GSSG.
Hígítás Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) Stimulálhatóság (szorzófaktor)
1:10 29 15,3
1:20 45 25,4
1:50 69 37,9
1:100 100 37,9
1:200 79 52,7
1:500 29 28,7
HU 204855 Β
7. Az aktív tPA-ra számított kitermelés függése a BSAmennyiségétőI.
A reoxidációt az alábbi elegyben végezzük:
0,1 mól/I trisz-HCl (pH-10,5) puffer +1 mmól/l EDTA +0,5 mól/1 L-arginin +0,5 mmól/l GSH +0,5 mmól/l GSSG.
BSA (mg/ml) Aktív tPA-ra számított kitermelés (%)
0 47
0,5 83
1 100
3 102
5 52
Az 1. és 2. ábra a standard vizsgálatban mért aktivitásokat szemlélteti BrCN-FSP alkalmazásával, illetve alkalmazása nélkül, 17 órás szobahőmérsékleten végzett reoxidációt kővetően. A reoxidációt az alábbi elegyben végezzük:
0,1 mól/I trisz-HCl (pH-10,5) puffer +1 mmól/l EDTA +0,5 mól/I L-arginin •+1 mg/ml BSA +0,5 mmól/l GSH +0,5 mmól/l GSSG.
Az 1. és 2, ábrán az A-gőrbe a BrCN-FSP jelenlétében, a B-görbe a BrCN-FSP nélkül mért aktivitást szemlélteti.
4. példa tPA aktiválása tPA és glutation vegyes diszulfídjának képzésével
Az alkalmazott RB-t az előző példák valamelyikében leírt eljárással állítjuk elő. Az RB redukcióját 2 órán át szobahőmérsékleten, kb. 1 mg/ml proteinkoncentráciő mellett történő inkubálással végezzük. Az inkubációs elegy összetétele a következő:
0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=8,6) puffer +1 mmól/l EDTA +6 mól/1 Gdn/HCl +0,2 mól/I DTE.
A 0,01 mől/1 koncentrációjú sósavval szemben dializált, redukált protein 1:1 arányban 0,1 mól/1 koncentrációjú (pH-9,3) pufferral, mely 9 mől/1 karbamidot és 0,2 mól/1 GSSG-t tartalmaz, hígítva 5 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk.
Az elegy pH-ját tömény sósavval 3 értékre állítjuk, majd 0,01 mól/I sósavval szemben 4 °C hőmérsékleten dializáljuk. A dialízist követően az összprotein-koncentráció 0,33 mg/ml. Az így előállított tPASSG-vel határozzuk meg az optimális reakíivációs körülményeket.
lást 17 órás, szobahőmérsékleten történő inkubálás után határozzukmeg. Az aktiválást 1:100 hígításban végezzük 0,1 mól/1 írisz pufferben, mely 1 mmól/I EDTA-t, 0,5 mól/1 L-arginint, 1 mg/ml BSA-t és 2 mmól/I GSH-t tartalmazott, a pH-érték változtatása mellett.
PH Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) Stimulálhatóság (szorzófaktor)
6 0,04 3,3
6,5 0,37 9,5
7 1,35 11,4
7,5 5,66 7,1
8 7,32 8,2
8,5 8,65 7,0
9 8,59 8,7
9,5 8,32 11,7
10 6,15 12,5
10,5 3,07 11,2
A kitermelést az aktív tPA-nak a bevitt proteinmennyiségre számított százalékában adjuk meg.
b) a íPASSG aktiválási eredmények reprodukálhatósága
Azonos aktiválási körülmények között különböző mérési sorozatokban különböző kitermelési értékeket figyeltünk meg, melyek többek között a standard tPA változásától függnek. A hibatartomány meghatározására valamennyi aktivitási értéket 1:100, illetve 1:200 hígításban adtunk meg. A hígításhoz az alábbi elegyet használjuk:
0,1 mól/1 trisz-HCl (pH-8,5) puffer +1 mmól/l EDTA +0,5 mól/I L-arginin +1 mg/ml BSA +2 mmól/I GSH.
Kísérlet Aktív tPA-ra számított kitermelés (%) Stimulálhatóság (szorzófaktor)
1 8,65 7,0
2 4,47 9,3
3 4,49 9,7
4 8,50 6,5
5 3,45 17,2
6 5,32 8,3
7 3,29 14,0
8 3,54 13,4
9 5,07 16,4
Átlag 5,1+1,9 11,3±3,8
a) a tPASSG aktiválásának pH-optimuma.
Itt, mint az ezt kővető opfimalizációs kísérletekben általában, (1), nem alkalmazunk GSSG-t és (2), az aktivá- 60
c) Az aktivált protein stabilitása
Az aktiválást 1:200 hígításban végezzük, a hígítás· hoz az alábbi elegyet használjuk:
HU 204 855 Β
0,1 mól/1 trisz-HClpuffer +1 mmól/1 EDTA +0,5 mól/1 L-arginin +1 mg/ml BSA +2 mmól/1 GSH.
b) Az aktív β-interferonra számított kitermelés függősége karbamid adagolásának hatására Az aktiváláshoz az a) pontban leírt oldatot használjuk, azonban az aktiválást 0 ’C hőmérsékleten, 17 órán át végezzük.
Idő (óra) pH 9,5
Aktív tPA-ra számított Stimulálhatóság kitermelés (%) (szorzófaktor)
1 0 —
6 0,89 15,5
23 2,43 23,1
47 2,83 23,6
71 2,62 21,5
215 2,21 22,6
239 2,28 14,3
Az aktiválás karbamid-függősége
Karbamid (mól/1) Aktív β-interferonra számított kitermelés (%)
0 13
0,5 100
1 200
1,5 100
5. példa
Géntechnológiai úton előállított β-interferon aktiválása
A β-interferon géntechnológiai előállítását az EP-A 0 032 134 lajstromszámú európai szabadalmi leírás ismerteti.
Az előzőekben ismertetett módszerekkel RB-t állítunk elő. Ezek redukcióját és szolubilizálását a következőképpen végezzük: a pelletet 3 órán át 25 ’C hőmérsékleten 10 ml 9,0 mól/1 koncentrációjú trisz-HCl (pH-8,6) pufferban, mely 6 mól/1 Gdn/HCl-ot, 1 mmól/1 EDTA-t és 0,2 mól/1 DTE-t tartalmaz, inkubáljuk, az elegyet 30 percen át 4 ’C hőmérsékleten és 48 000 g-n centrifugáljuk, majd a felülúszó pH-értékét tömény sósavval kb. 3ra állítjuk. Ezután Sepha-dex G-25 F oszlopon 0,01 mól/1 sósavoldat alkalmazásával gélszűrést végzünk.
Az eluátum vezetőképességét, proteinkoncentrációját és reaktiválhatóságát meghatározzuk.
A reoxidált proteinek aktivitását „standard aktiváláshoz” (=100%) viszonyítjuk, 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=10,5) pufferban, mely 1 mmól/1 EDTA-t, 5 mmól/1 GSH-t, 0,5 mmól/1 GSSG-t és 0,25 mól/1 L-arginint tartalmaz.
a) Az aktív β-interferon kitermelés függése
L-arginin adagolásának hatására
Az eluátumot 1:50 arányban 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=85) pufferban, mely 1 mmól/1 EDTA-t, 5 mmól/1 GSH-t, 0,5 mmól/1 GSSG-t tartalmaz, hígítjuk és 20 órán át 0 ’C hőmérsékleten aktiváljuk.
Az aktiválás L-arginin-függősége
L-arginin (mól/1) Aktív β-interferonra számított kitermelés (%)
0 8
0,25 8
0,5 15
0,75 15
c) Az aktív β-interferon kitermelés függősége formamid adagolásának hatására
Az aktiváláshoz az a) pontban leírt oldatot használjuk; a mintákat 17 órán át 0 ’C hőmérsékleten aktiváljuk.
Az aktiválás formamid-függősége
Formamid (mól/1) Aktív β-interferonra számított kitermelés (%)
13
13
13
0
0
d) Az aktív β-interferon kitermelés függése a redoxpuffertől
Az eluátumot 1:50 arányban 0,1 mól/1 trisz-HCl (pH=8,5) pufferral, mely 1 mmól/1 EDTA-t és 0,25 mől/1 L-aiginint tartalmaz, hígítjuk és a mintákat 17 órán át 0 ’C hőmérsékleten aktiváljuk.
Az aktiválás GSH/GSSG-függősége
GSH (mmól/1) GSSG (mmól/1) Aktív β-interferonra számított kitermelés (%)
1 0,5 6
5 0,5 13
10 0,5 25
20 0,5 25
5 0,1 13
5 0,5 13
5 1,0 13
5 5 6
HU 204855 Β
e) Az aktív β-interferon kitermelés függése BSA adagolásának hatására
Az eluátumot 1:50 arányban hígítjuk 0,1 mól/I trísz-HCl (pH=8,5) puffénál, mely 1 mmól/I EDTA-t, 5 mmól/I GSH-t, 0,5 mmól/I GSSG-t és 0,25 mól/l L-arginint tartalmaz és az aktiválást 0 ’C hőmérsékleten 17 órán át végezzük.
Az aktiválás BSA-függősége
BSA (mg/ml) Akív β-interferonra számított kitermelés (%)
0 13
1 13
2 25
5 13
f) Az aktív β-interferon kitermelés függése a pH-értéktől
Az eluátumot 1:50 arányban hígítjuk 0,1 móM triszHC1 puffénál, mely 1 mmól/1 EDTA-ζ 5 mmól/1 GSH-t, 0,5 mmól/1 GSSG-t és 0,25 mól/l L-aiginint tartalmaz és az aktiválást 17 órán át 0 ’C hőmérsékleten végezzük.
Az aktiválás pH-függősége
PH Aktív β-interferonra számított kitermelés (%)
6,5 0
7Ő 6
8,5 13
9,5 50
10,5 100
6. példa
Denaturált antitestek aktiválása 4
Egy a kreatin-kinázzal szemben antitestként ható és az
ECACC 88 091 404 számon deponált hibridőma-sejtvonalból előállítható monoklonális antitest [CK-MM; Gene 51, (1981), 13-19JFab-fragmeníumát0,lmóI/l trisz-HCI puffénál (pH-8,5), amely 6 mól/I guanidin-hidroklori- 41 dót, 2 mmől/1 EDTA-t és 0,3 mől/1 DTE-t tartalmaz, 2 órát inkubáljuk szobahőmérsékleten, 6 pg/ml koncentrációban, és így denaturáljuk.
Ezt a denaturált antitestet tartalmazó oldatot 1:100 arányban renaturálópufferral (0,1 mól/l trisz-HCl puf- 5C fér (pH-8,5), 0,5 mól/l L-argininnel, 10 mól/l GSSGvel, 2 mmól/I EDTA-val) hígítjuk és 200 órát inkubáljuk 20 ’C hőmérsékleten.
Arenaíurált antitesteket 20% kitermeléssel kapjuk.
A renaturálódást úgy ellenőrizzük, hogy meghatá- 55 rozzuk az antitest kötődési képességét CK-MM-hez.
A kreatin-kináz aktivitását a Boehringer Mannheim cég egy kapcsolt enzimes tesztjének segítségével [Bergmeyer, H. U., Meth. of Enzym. Analysis, 3. kiadás, III. kötet, 510-540. oldal] határozzuk meg. En- 60 nek során a kreatin-kináz a kreatin-foszfátot és az
ADP-t kreatinná és ATP-vé alakítja át. Hogy egy spektroszkópiailag követhető reakciót kapjunk, a keletkezett ATP-ta glükóznak hexokinázzal glükóz-6-foszfáttá való foszforilezéséhez használjuk fel. Aglükóz-6-foszfátot glükóz-6-foszfát-dehidrogenázzal glükonát-6foszfáttá oxidáljuk, miközben az NADP+-ból NADPH+H+ képződik. A percenkénti extinkciőváltozásból kiszámítható a kreatin-kináz aktivitása. A natív antitest - CK-MM kalibrációs görbéből meghatározható a natív anyag mennyisége, ami megfelel a gátlóhatásnak a renaturáló keverékben. A gátlás szempontjából aktív antitestek százalékos kitermelését a gátlás szempontjából aktív proteineknek a renaturáló keve15 rékben levő teljes proteinmennyiséghez viszonyított aránya adja.
7. példa
Aktív K2P előállítása E.coli-ból 20 [A K2P az emberi szöveti plazminogén-aktivátor származéka és a KringeI2- és proteázíeriileíeket foglalja magában (EP-A 0 382 174. lajstromszámú európai szabadalmi leírás)].
a) Sejtlízis és LB („inclusion bodies”) előállítása ’5 1,6 kg nedves sejttömeget (E.coli, DSM 3689) 4 ’C-on szuszpendálunk 1010,1 mól/l trisz-HCI pufferral, mely mmól/1 EDTA-t (pH=6,5) tartalmaz. A szuszpenzióhoz 2,5 g lizozimot adunk és 30 percig 4 ’C-on inkubáljuk; ezután nagynyomású diszpergálással teljes sejtfeltá10 rást végzünk. A feltárt oldathoz 5 10,1 mól/l trisz-HCl puffért, mely 20 mmól/1 EDTA-t, 6% Triton400-at és lő mől/1 nátrium-kloridot (pH-6,5) tartalmaz, keverünk, és további 30 percig inkubáljuk 4 ’C-on. Ezután elválasztjuk a fel nem oldódott alkotórészeket (az IB-t, ame5 Iyek lényegileg azonosak a korábban definiált RB-kel) Padberg-centrifügán végzett centrifugálással.
A kapott pelletet szuszpendáljuk 1010,1 mól/l triszHCl pufferral (pH=6,5), mely 20 mmól/1 EDTA-t tartalmaz, 30 percig inkubáljuk 4 ’C-on, és ezt követően centrifugálással elkülönítjük az IB-készítményt.
b) AzIB szolubilizálása
100 g IB-t (nedves tömeg) szuszpendálunk 450 ml 0,1 mól/l trisz-HCI pufferral (pH=8,6), mely 6 mól/I gua5 nidinium-hidrokloridot, 0,2 mől/í DTE-t, 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz, és 2,5 órát keverjük szobahőmérsékleten.
A pH-értéket 25%-os sósavval 3-ra állítjuk be, és az oldatot 10 mmól/1 sósavval szemben (3·50 I, 24 óra, 4 ’C) dializáljuk.
)
c) Deriváció
Annyi szilárd guanídimurn-hidrokloridot adagolunk, hogy a fenti dializátum 10 mmól/1 sósavval készített végső hígítása 6 mól/l guanidinium-hidrokloríd kon: cenírációjú legyen.
Az elegyet 25 ’C-on másfél órát előinkubáljuk, ezután oxidált glutationt (GSSG) adunk hozzá 0,1 mól/1ig és trisz-HCl-ot 0,05 mól/l-ig, és a pH-értéket 5 mól/l nátrium-hidroxiddal 9,3-ra állítjuk be titrálással. Az elegyet 3,5 órán át keverjük 25 ’C-on.
HU 204 855 Β
A pH-értéket 25%-os sósavoldattal 3-ra állítjuk be és az elegyet 10 mmól/1 sósavval szemben (3· 100 1, 48 óra, 4 ’C) dializáljuk, majd centrifugáljuk és a tiszta felülűszót továbbfeldolgozzuk.
d) Renaturálás
1-es reakcióedénybe 0,1 mól/1 trisz-HCl puffért (pH=8J) töltünk, mely 0,8 mól/1 L-axginint, 2 mmól/1 GSH-t, 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz. Arenaturálást 20 ’Con végezzük háromszor 100 ml származék (kevert diszulfid, lásd fent) hozzáadásával, 24 óráig.
A renaturálás után 1500—10 000 IU/mg specifikus aktivitású anyagot (mérés a Boehringer Mannheim GmbH cég tPA standard tesztjére vonatkozó előírások szerint) kapunk.
e) Arenaturálő keverék koncentrálása
Arenaturáló keveréket szükség szerint homodializátorral koncentrálhatjuk.

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás géntechnológiai úton előállított, heterológ, diszulfídhidakat tartalmazó eukarióta-proteineknek prokariótákban történő kifejezése utáni aktiválására a sejt feltárásával, denaturáló és redukáló körülmények között történő szolubilizálásával és oxidáló körülmények között, GSH/GSSG jelenlétében vagy GSH jelenlétében történő reaktiválással, azzal jellemezve, hogy
    a) a reaktiválási lépés során 9-12 pH-értéken, 0,1— 20 mmól/1 GSH-koncentráció és 0,01-3 mmól/1 GSSGkoncentráció mellett és a denaturálószer nem denaturáló mennyiségének jelenlétében dolgozunk; vagy
    b) a redukálószert és denaturálószert elválasztjuk, GSSG hozzáadásával denaturáló körülmények között a proteinek tiolcsoportjait a protein és glutation vegyes diszulfidjává alakítjuk, kívánt esetben ezt a vegyes diszulfídot elválasztjuk a nem módosított proteintől, és a reaktiválási lépésben 7 és 10,5 közötti pH-értéken, 0,5— 5 mmól/1 GSH-koncentráció és a denaturálószer nem denaturáló koncentrációja mellett dolgozunk, és kívánt esetben a fenti a) vagy b) eljárás reaktiválási lépése után egy tisztítási lépést végzünk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogy a reaktiválási lépés során 9,5 és 11 közötti pH-értéken dolgozunk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reaktiválási lépés során 0,2-10 mmól/1 GSH-koncentráció és/vagy 0,05-1 mmól/1 GSSG-koncentráció mellett dolgozunk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reaktiválási lépés során E.coli törzsben kifejezett proteinnel dolgozunk.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reaktiválási lépés során denaturálószerként arginint, guanidin-hidrokloridot és/vagy legalább egy R2- CO-NRRi általános képletű vegyületet alkalmazunk, melyekben R és Rj hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport és R2 hidrogénatom vagy NHRi általános képletű csoport vagy 1-3 szénatomos alkilcsoport
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az arginint és/vagy guanidin-hidrokloridot 0,11,0 mól/1, főleg 0,25-0,8 mól/1 koncentrációban alkalmazzuk.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az R2-CO-NRRi általános képletű vegyületet 0,5— 4 mól/1, főleg 1-3,5 mól/1 koncentrációban alkalmazzuk.
  8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reaktiválási lépés után egy dialízises tisztítási lépést végzünk.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás géntechnológiai úton előállított tPA aktiválására, azzal jellemezve, hogy a reaktiválási lépés során tPA-termelő prokariótákban termelt fehérjével dolgozunk.
  10. 10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás géntechnológiai úton előállított β-interferon aktiválására, azzal jellemezve, hogy a reaktiválási lépés során β-interferontermelő prokariótákban termelt fehérjével dolgozunk.
HU865290A 1985-10-23 1986-10-23 Process for activating heterologous eucaryotic proteins comprising disulfide bridges and produced by genetic engineering, after expressing them in procaryotes HU204855B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853537708 DE3537708A1 (de) 1985-10-23 1985-10-23 Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU204855B true HU204855B (en) 1992-02-28

Family

ID=6284269

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU865290A HUT43643A (en) 1985-10-23 1986-10-23 Process for activating heterologuous disulfide-bridge-containing eucariote proteines, produced with genetechnological methods, after expressing them in procariotes
HU865290A HU204855B (en) 1985-10-23 1986-10-23 Process for activating heterologous eucaryotic proteins comprising disulfide bridges and produced by genetic engineering, after expressing them in procaryotes

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU865290A HUT43643A (en) 1985-10-23 1986-10-23 Process for activating heterologuous disulfide-bridge-containing eucariote proteines, produced with genetechnological methods, after expressing them in procariotes

Country Status (26)

Country Link
EP (3) EP0219874B1 (hu)
JP (2) JPH0728745B2 (hu)
KR (1) KR900009139B1 (hu)
AT (2) ATE98648T1 (hu)
AU (2) AU590029B2 (hu)
CA (1) CA1329157C (hu)
CZ (1) CZ280727B6 (hu)
DD (1) DD260517A5 (hu)
DE (3) DE3537708A1 (hu)
DK (2) DK175091B1 (hu)
ES (2) ES2061434T3 (hu)
FI (2) FI94050C (hu)
GR (2) GR920300062T1 (hu)
HK (2) HK153596A (hu)
HR (1) HRP921075B1 (hu)
HU (2) HUT43643A (hu)
IE (1) IE62634B1 (hu)
IL (1) IL80325A (hu)
PT (1) PT83609B (hu)
SI (1) SI8611796B (hu)
SK (1) SK278317B6 (hu)
SU (1) SU1607689A3 (hu)
UA (1) UA6023A1 (hu)
WO (1) WO1987002673A2 (hu)
YU (1) YU47185B (hu)
ZA (1) ZA868012B (hu)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766205A (en) * 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
JP2581668B2 (ja) * 1985-11-27 1997-02-12 三井東圧化学株式会社 ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞
US4777043A (en) * 1985-12-17 1988-10-11 Genentech, Inc. Stabilized human tissue plasminogen activator compositions
AU621051B2 (en) * 1987-04-28 1992-03-05 Amgen, Inc. Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor
DE3722082A1 (de) * 1987-07-03 1989-01-12 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von serinproteasen oder serinproteaseinhibitoren
CA1340586C (en) * 1988-09-23 1999-06-08 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interferon-beta
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat
DE3942143A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh T-pa pro stabilisierung
EP0545999B1 (en) * 1990-08-20 1997-06-04 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of biologically active IGF-1 using IGF-1 having an amino-terminal extension
ES2119779T3 (es) * 1990-09-05 1998-10-16 Southern Cross Biotech Pty Ltd Solubilizacion de proteinas en formas activas.
DE4037196A1 (de) * 1990-11-22 1992-05-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur reaktivierung von denaturiertem protein
DE4113750A1 (de) 1991-04-26 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen
DE4139000A1 (de) * 1991-11-27 1993-06-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf
US5212091A (en) * 1992-03-02 1993-05-18 Monsanto Company Method of producing tissue factor pathway inhibitor
AU3812993A (en) * 1992-03-24 1993-10-21 Synergen, Inc. Refolding and purification of insulin-like growth factor I
DK0600372T3 (da) 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
FR2729972B1 (fr) * 1995-01-31 1997-04-18 Sanofi Sa Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine
US5714371A (en) * 1995-05-12 1998-02-03 Schering Corporation Method for refolding insoluble aggregates of hepatitis C virus protease
US5728804A (en) * 1995-06-02 1998-03-17 Research Corporation Technologies, Inc. Use of cyclodextrins for protein renaturation
EP0904355B1 (de) * 1996-06-11 2004-03-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur aktivierung von denaturiertem protein
US7153943B2 (en) 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
US6653098B1 (en) * 1998-02-23 2003-11-25 G. D. Searle & Co. Method of producing mouse and human endostatin
DE19850429A1 (de) * 1998-10-27 2000-05-04 Andre Schrattenholz Fragmente
EP1048732A1 (de) * 1999-04-26 2000-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen
EP1077263A1 (de) * 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
IL152804A0 (en) 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
DE10105911A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Expression der rekombinanten Proteinase K aus Tritirachium album in Hefe
DE10105912A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Proteinase K
DE102005033250A1 (de) 2005-07-15 2007-01-18 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von G-CSF
DE202006020194U1 (de) 2006-03-01 2007-12-06 Bioceuticals Arzneimittel Ag G-CSF-Flüssigformulierung
TWI476207B (zh) 2006-07-14 2015-03-11 Genentech Inc 重組蛋白之再摺疊
WO2008076933A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
WO2011113601A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Biogenerix Ag Method for obtaining biologically active recombinant human g-csf
US20130273607A1 (en) * 2010-10-20 2013-10-17 Medimmune, Llc Methods for processing inclusion bodies
HUP1200171A1 (hu) 2012-03-19 2013-09-30 Richter Gedeon Nyrt Módszerek polipeptidek elõállítására
HUP1200172A2 (en) 2012-03-19 2013-10-28 Richter Gedeon Nyrt Methods for refolding g-csf from inclusion bodies
CN103852527B (zh) * 2012-12-05 2015-05-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种高通量蛋白质样品预处理装置
US10457716B2 (en) 2014-08-06 2019-10-29 University Of Notre Dame Du Lac Protein folding and methods of using same
WO2018121703A1 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Biogend Therapeutics Co., Ltd. Recombinant polypeptides, compositions, and methods thereof
EP4263568A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Richter Gedeon Nyrt. Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5135481A (ja) * 1974-09-18 1976-03-25 Fujiwa Kako Kk Kojundohitorokinaaze no seiho
US4468633A (en) 1982-04-28 1984-08-28 The Bendix Corporation Adjustable microwave power combiner for a plurality of coaxially mounted impatt diodes
IL68561A (en) 1982-05-05 1991-01-31 Genentech Inc Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof
US4432895A (en) * 1982-11-24 1984-02-21 Hoffmann-La Roche Inc. Monomeric interferons
GR79124B (hu) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
GB2138004B (en) * 1983-03-25 1987-05-13 Celltech Ltd A process for the production of a protein
JPS6051119A (ja) * 1983-08-30 1985-03-22 Green Cross Corp:The ウロキナ−ゼ乾燥製剤
US4530787A (en) * 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
US4748234A (en) * 1985-06-26 1988-05-31 Cetus Corporation Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts
US4766205A (en) * 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
FR2596360B1 (fr) * 1986-04-01 1989-02-17 Sotralentz Sa Conteneur sur palette avec dispositif de protection en treillis plie et renforce
JPH0651119A (ja) * 1992-07-28 1994-02-25 Sekisui Chem Co Ltd 位相差板の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE131489T1 (de) 1995-12-15
DE3689404D1 (de) 1994-01-27
ZA868012B (en) 1987-06-24
WO1987002673A2 (en) 1987-05-07
DD260517A5 (de) 1988-09-28
HK153596A (en) 1996-08-16
GR920300062T1 (en) 1992-08-31
UA6023A1 (uk) 1994-12-29
FI872753A (fi) 1987-06-22
DK175091B1 (da) 2004-05-24
HK153496A (en) 1996-08-16
FI94050B (fi) 1995-03-31
CZ280727B6 (cs) 1996-04-17
IL80325A0 (en) 1987-01-30
HUT43643A (en) 1987-11-30
CZ752686A3 (en) 1996-01-17
IL80325A (en) 1992-06-21
JPH0824594B2 (ja) 1996-03-13
HRP921075B1 (en) 1999-02-28
DK200001897A (da) 2000-12-18
EP0393725B1 (de) 1995-12-13
PT83609B (pt) 1988-10-14
AU590029B2 (en) 1989-10-26
JPS62502895A (ja) 1987-11-19
YU179686A (en) 1988-06-30
IE62634B1 (en) 1995-02-22
FI95578B (fi) 1995-11-15
FI95578C (fi) 1996-02-26
JPH0728745B2 (ja) 1995-04-05
DE3537708A1 (de) 1987-04-23
WO1987002673A3 (fr) 1987-10-22
AU6599386A (en) 1987-05-19
DK320387D0 (da) 1987-06-23
ES2020498T3 (es) 1996-04-01
DE3650449D1 (de) 1996-01-25
FI933868A (fi) 1993-09-03
PT83609A (de) 1986-11-01
HRP921075A2 (en) 1995-06-30
AU4132189A (en) 1990-01-04
JPH04218387A (ja) 1992-08-07
DE3537708C2 (hu) 1993-07-08
EP0253823A1 (de) 1988-01-27
KR870700601A (ko) 1987-12-30
ES2020498A4 (es) 1991-08-16
EP0393725A1 (de) 1990-10-24
SI8611796B (sl) 1998-06-30
EP0219874A3 (en) 1988-02-10
FI933868A0 (fi) 1993-09-03
YU47185B (sh) 1995-01-31
DK175109B1 (da) 2004-06-07
EP0219874A2 (de) 1987-04-29
AU607083B2 (en) 1991-02-21
IE862683L (en) 1987-04-23
FI94050C (fi) 1995-07-10
GR3018410T3 (en) 1996-03-31
EP0219874B1 (de) 1993-12-15
CA1329157C (en) 1994-05-03
SI8611796A (sl) 1996-10-31
KR900009139B1 (ko) 1990-12-22
SU1607689A3 (ru) 1990-11-15
SK278317B6 (en) 1996-10-02
FI872753A0 (fi) 1987-06-22
SK752686A3 (en) 1996-10-01
ATE98648T1 (de) 1994-01-15
DK320387A (da) 1987-06-23
ES2061434T3 (es) 1994-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU204855B (en) Process for activating heterologous eucaryotic proteins comprising disulfide bridges and produced by genetic engineering, after expressing them in procaryotes
US5593865A (en) Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulphide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes
Vermilion et al. Highly purified detergent-solubilized NADPH-cytochrome P-450 reductase from phenobarbital-induced rat liver microsomes
Hillson et al. Formation and isomerization of disulfide bonds in proteins: protein disulfide-isomerase
Cheng et al. Purification and characterization of two constitutive forms of rat liver microsomal cytochrome P-450.
EP0364926B1 (de) Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in Prokaryonten exprimierten Antikörpern
Ulane et al. The activating system of chitin synthetase from Saccharomyces cerevisiae. Purification and properties of the activating factor.
Varandani et al. Purification and properties of pancreatic glutathione-insulin transhydrogenase
De Renzo et al. Interaction of Streptokinase and Human Plasminogen: IV. FURTHER GEL ELECTROPHORETIC STUDIES ON THE COMBINATION OF STREPTOKINASE WITH HUMAN PLASMINOGEN OR HUMAN PLASMIN
Barth et al. The use of free flow electrophoresis in the purification of recombinant human tissue plasminogen activator expressed in yeast
US4390629A (en) Polypeptide degrading enzymes
Koshiba et al. Calorimetric study of mutant human lysozymes with partially introduced Ca2+ binding sites and its efficient refolding system from inclusion bodies.
Yamagata Temperature-sensitive prolipoprotein signal peptidase in an Escherichia coli mutant: use of the mutant for an efficient and convenient assay system
CZ280848B6 (cs) Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech
Bergström et al. Large-scale production of intermediate-purity, soluble human plasminogen
TAMAKI et al. Mild Purification Procedure and Subunit Structure of Glucosephosphate Isomerase from Baker’s Yeast
JPH04144695A (ja) 分泌蛋白質のリフォールディング法
JPH01191683A (ja) 新規なプロテアーゼ
JPS6226298A (ja) ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法
JP2001514516A (ja) 活性化ビタミンｋ依存性血液因子およびその製造方法