DK200001897A - Fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, heterologe, disulfidbroer indeholdende eukaryotiske proteiner - Google Patents

Description

PATENTKRAV 1. Fremgangsmåde til aktivering af heterologe, disulfidbro-holdige eukaryotiske proteiner, fremstillet genteknologisk ved ekspression i prokaryotiske celler ved a) oplukning af de prokaryotiske celler, b) opløsning af de eukaryotiske proteiner under denaturerende og reducerende betingelser, c) fraskillelse af de reducerende/denaturerende midler, d) reaktivering under oxiderende betingelser ved e) omdannelse af de solubiliserede proteiners thiol-grupper til de blandede disulfider af protein og glutation ved tilsætning af GSSG under denaturerende betingelser, f) dannelse af aktivt protein ud fra de blandede disulfider ved en GSH-koncentration på 0,5 til 5 mmol/1, en pH-værdi på 7 til 10,5 og i nærværelse af en ikke-dena-turerende koncentration af et denatueringsmiddel. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man gennemfører ekspressionen i E. coli eller P. putida. 3. Fremgangmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man i reaktiveringstrinnet som denatureringsmiddel anvender arginin, guanidin-hydrochlorid og/eller mindst en forbindelse med den almene formel R2-CO-NRRi (I), hvor R og R, er H eller alkyl med 1 til 4 C-atomer, og R2 er H eller NHR, eller alkyl med 1 til 3 C-atomer. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at koncentrationen af arginin og/eller guanidin-hydrochlorid andrager 0,1 til 1,0 mol/1, navnlig 0,25 til 0,8 mol/1. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at koncentrationen af forbindelsen med den almene formel I andrager 0,5 til 4 mol/1, navnlig 1 til 3,5 mol/1. 6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der ved reaktiveringstrinnet arbejdes ved tilstedeværelse af et ikke-proteolytisk virksomt protein, navnlig ved tilstedeværelse af okseserumalbumin. 7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører celleoplukningen ved hjælp af ultralyd, højttryksdispersion eller Iysozym. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at man gennemfører oplukningen i en fortyndet vandig pufferopløsning, navnlig i 0,1 mol/1 Tris, ved en neutral til svagt sur pH-værdi. 9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man efter celleoplukningen fraskiller de uopløselige bestanddele. 10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører solubiliseringstrinnet ved alkalisk pH-værdi i nærværelse af et reduktionsmiddel fra mercaptogruppen og i nærværelse af et denatureringsmiddel. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at man arbejder i nærværelse af guanidin-hydrochlorid og/eller forbindelser med den almene formel I som denatureringsmiddel. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at koncentrationen af guanidindhydrochlorid andrager 6 mol/1, koncentration af forbindelser med den almene formel I andrager 8 mol/I. 13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 10 til 12, kendetegnet ved, at man arbejder ved tilstedeværelse af DTE, β-mercaptoethanol, cystein eller GSH. 14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører rensning og fraskillelse af reduktions-, oxidations- eller denaturerings-midler ved hjælp af sterisk udelukkelseschromatografi eller dialyse. 15. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man efter reaktiveringstrinnet gennemfører et rensningstrin ved hjælp af dialyse. 16. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 15, k e n d e t e g n e t ved, at man som genteknologisk fremstillet eukaryotisk protein anvender t-PA. 17. Stimulerbar, ikke-glycosyleret tPA, opnået i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1 til 16. 18. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man ved hjælp af ionbyt-terbehandling fraskiller det blandede disulfid af protein og glutathion fra ik-ke-modificeret protein.