KR900009139B1 - 유전공학적으로 제조된, 다른 종류의, 이황화 결합을 갖는 진핵생물 단백질을 원핵생물에 있어서의 발현 후에 활성화시키는 방법 - Google Patents

유전공학적으로 제조된, 다른 종류의, 이황화 결합을 갖는 진핵생물 단백질을 원핵생물에 있어서의 발현 후에 활성화시키는 방법 Download PDF

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Description

유전공학적으로 제조된, 다른 종류의, 이황화 결합을 갖는 진핵생물 단백질을 원핵생물에 있어서의 발현 후에 활성화시키는 방법
본 발명은, 유전공학적으로 제조된, 이황화 결합을 가지는 진핵생물의 단백질을 원핵생물에 있어서의 발현 후에 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
원핵생물중에서 이종 단백질이 발현되는 경우, 이 단백질은 숙주 세포안에서 종종 용해되기 어려운 불활성 응집체(소위, "굴절체 : refractile bodies")를 만드는데, 이 응집체는 특히 숙주 세포의 단백질로 오염된다. 이와 같은 "굴절체"가 만들어지는 것은 발현시에 발생하는 세포중의 높은 단백질 농도의 결과라고 짐작된다. 세포안에서 많은 양의 효소가 만들어질 때, 효소의 집합에 의하여 결과적으로 불용성이고, 고분자이며 대부분의 경우 불활성인 입자가 생긴다는 것은 공지되어 있다. 따라서, 이와 같은 단백질을, 예를 들어, 치료 목적으로 사용할 수 있도록 하기 전에, 정제하고, 더욱 활성 형태로 변환시켜야만 한다.
기존의 방법에 의하면, 응집체로서 존재하는 이러한 단백질을 다시 활성화시키는 것은 몇개의 공정으로 이루어지고 있다(예를 들면, R. Jaenicke저, "FEBS ; Federation of European Biochemical Societies", Vol. 52(1979) 187-198 ; R. Rudolph et al., "Biochemistry", 18(1979) 5572-5575 참조) : 첫번째 공정에서는, 가용화를, 강력한 변성제, 예를 들어, 구아니딘-하이드로클로라이드나 요소를 고농도로 첨가하거나 또는 강산성인자, 예를 들어, 글리신/인산 혼합물의 첨가에 의해서 이루어진다. 다른 보조제로서는, 환원 작용이 있는 SH-시약(예를 들어, 디티오에리쓰리콜, DTE)와 HDTA가, 예를 들면, LDH를 복원할 경우에 유용한 것으로 판명되었다. 단백질이 숙주 세포의 단백질에 의해 오염되어 있는 경우, 다음 공정으로서의 정제는, 예를 들어, 겔이나 이온 교환 크로마토그래피와 같은 기존의 통상적인 방법으로 하는 것이 적절하다. 뒤이어, 변성화제의 농도가 감소되도록 하기 위해, 강하게 희석한다. 이때, 구아니딘-하이드로클로라이드를 이용하는 경우에는, 0.5mol/l 이하의 값으로 희석한다. 유리 SH-기를 가진 효소의 경우에는, SH-기를 보호해 주는 제제를 부가하는 것이 좋은 것으로 입증되었다(예를 들면, R. Jaenicke, "Journal Polyrmer Science", Part C 16(1967) 2143-2160 참조).
유럽 특허 공개 특허 제0114506호 명세서에는, 박테리아 배양물로부터의 수 종류의 이종 발현 생성물을 분리, 정제 및 재활성화하는 방법들이 기술되어 있다. 즉, 재활성화에 있어서는, 강한 변성제중의 "굴절체"용액을, a) 직접 보다 약한 변성제중의 용액으로 변환시키고, 그후 이황화 결합을 재형성시키기 위한 산화작용 조건으로 조절하거나, b) 단백질을 설폰화하고, 그후, 약한 변성제중의 용액으로 변환시키고, 더욱, S-설포네이트기를 환원형 및 산화형의 설프히드릴 시약으로 처리함으로써, 즉 예를 들어, GSH/GSSG로 처리함으로써 -S-S-기로 변환시키거나, 혹은, c) 약한 변성제중의 용액을 직접, 예를 들어, GSH/GSSG와 같은 설프히드릴 시약으로 처리한다. 앞에서 설명된 문제점들이 나타나는 전형적인 예는 t-PA이다.
응고된 혈액에 있는 단백질 기질의 주요 성분은 중합체의 섬유소이다. 이 단백질 기질은 플라스민에 의해 용해되는데, 플라스민은 예를 들어, t-PA(조직형 플라스미노겐 활성화 물질(activator))와 같은 소위 플라스미노겐 활성제에 의한 활성화를 통하여 플라스미노겐으로부터 만들어진다. 천연이나 혹은 진핵생물로부터 유전공학적으로 얻어진 t-PA의 효소 활성(플라스미노겐을 플라스민으로 접촉적으로 활성화)은 섬유소나 섬유소 분해 생성물(FSP)이 없으면 아주 작지만, 이들 자극 물질이 있게되면 근본적으로(계수 10 이상 정도로)증가될 수 있다. 소위, 활성에 대한 이러한 자극 가능성은 우로키나제나 스트렙토키나제와 같은 다른 기존의 플라스미노겐 활성물질에 비해서 t-PA가 지니는 결정적인 장점이 된다(예를 들면, M. Hoylaerts et al., "J. Biol. Chem.", 257(1982), 2912-2019 ; Nieuwenhiuzen et al., "Biochemica et Biophysica Acta", 755(1983), 531-533 참조). 따라서, BrCN 분해 생성물에 의한 자극 가능성의 계수는 문헌에 여러가지 거론되어 있으며, 35배까지이다.
t-PA 종류이지만 글리코실화 되지않은 생성물은, 유전자 조작된 원핵생물(C-DNA의 도입 후)에서도 형성되지만, 그와 같은 생성물에는, 진핵생물로부터의 t-PA의 활성의 자극 가능성은 부여되어 있지 않다. 이것은, 원핵 세포중에서의 산화 환원 조건이 유전자가 유래되는 진핵 세포와는 다르다고 하는 점에서 기인한다고 생각할 수 있으며, 여기서는, 처음부터 불활성 생성물이 만들어지는데, 이것은 예를 들어, 천연 활성 분자가 함유하고 있는 많은 S-S 결합이 잘못 결합되거나 전혀 만들어지지 않는데 기인한다고 할 수 있을 것이다. 그러나, t-PA를 치료에 사용하는 경우에는, 효소의 활성 그 자체 뿐만 아니라, 그 자극 가능성도 필요하다. 원핵 세포가, 진핵생물 단백질의 활성을 올바르게 형성하도록 하는데 맞는 조건들을 마련해주지 못한다는 사실이 다른 물질에 관하여 "The EMBO Journal", 4, No. 3(1985), 775-780에 언급되어 있다.
유럽 공개 특허 제0093639호 명세서에 의하면, t-PA의 재활성화를 위하여, 대장균(E. Coli)로부터 얻어진 세포 펠릿을 6mol/l의 구아니딘-하이드로클로라이드중에 현탁시키고, 초음파로 처리하고, 인큐베이션하고, 이어서 4시간 동안, 트리스-HCI(pH=8.0), 염화나트륨, EDTA 및 트윈 80으로 만들어진 용액에 대하여 투석한다. 투석 후에 원심분리하면, 이때, 상청액중에 플라스미노겐 활성물질의 활성이 인정된다. 이와 같이 복원된 t-PA는 단백질 분해 작용에 있어서 활성이 있지만, J. H. Verheijen저, "Thromb. Haemostas.", 48, (3), 260-269(1982)에 기술된 방법에 의한, 섬유소의 BrCN-분해 생성물(BrCN-FSP)에 의해 측정이 가능한 자극 가능성이 나타나지 않는다.
변성된 단백질의 재활성화에 대해서는, 기술 상태로 볼때 일반적으로 이용할 수 있는 방법이 공지되어 있지 않다. 이것은 특히, t-PA에 대해 해당되는데, 그 이유는 이 천연 단백질이 아주 복잡한 구조를 가지고있기 때문이다. 즉, 이 천연 단백질은 1개의 유리 티올기와, 17개의 S-S 결합을 가지고 있으며, 이것은 이론적으로 볼때 2.2×l020가지의 방법으로 결합될 수 있고, 여기서 단 한개의 구조만이 천연 상태에 해당된다. t-PA를 재활성화시키 위한 기술 상태로 볼때, 기존의 방법대로 하면 단백질 분해작용을 갖는 t-PA가 되지만, 이것은 측정이 가능한 자극 가능성을 나타내지 못한다. 자극 가능한 t-PA를 생성시키는 활성화 방법은 공지되어 있지 않다.
따라서, 본 발명의 과제는, 유전공학적으로 제조한, 이종의, 이황화 결합을 가지는 진핵생물 단백질을 원핵생물에서의 발현 후에 완전히 활성화시키는 방법을 제공하는데 있다. 이 과제는, 본 발명의 목적에 의해서 해결된다.
본 발명의 목적은, 특허청구의 범위 제1항에 따라, 세포를 용해시키고, 변성과 환원 조건하에 가용화시키며, 그리고 GSH/GSSG 존재하의 산화 조건하의 활성화(복원)에 의해서, 유전공학적으로 제조한, 이종의, 이황화 결합을 가지는 진핵생물 단백질을 원핵생물에서 발현시킨 후에 활성화시키는 방법이다. 그런데, 이 활성화 방법은 다음과 같은 특징이 있다. 활성화 단계는, 9-12의 pH 값에서, 0.1-20mmol/1의 GSH농도에서, 0.01-3mmol/1의 GSSG 농도에서, 그리고 변성제가 변성 작용을 하지 않을 정도의 농도에서 실시된다.
이 방법의 우수한 실시 형태는 청구범위 종속항의 목적이다.
일반적으로 변성제로서는, 산화 조건하에서 통상적으로 활성화를 위해 이용되는 변성제나 아르기닌이 투입될 수 있다. 기존의 변성제중에서, 주로 구아니딘-하이드로클로라이드 또는 요소나 그 유도체가 이용된다. 특히 아르기닌이 적합한 것으로 입증되었다. 더우기, 이들 변성제의 혼합물이 이용될 수 있다. 또한, 이런 활성화 단계는 이종 단백질의 존재하에 실시하면 유리하다. 이종 단백질은 어느 것이나 그것이 단백질분해 작용을 하지 않은 한 대체로 그 자체로서 적합하다. 특히, 소 혈청 알부민(BSA)를 예컨데, 1-3mg/m1의 양으로 사용한다. BSA의 첨가는 단백질의 수율 및 안정성을 현저히 증가시킨다(아마도 표면 변성 및/또는 단백질 분해를 방지함으로써).
그 외의 방법 조건들은, 재활성화 단계에 있어서의 기존의 기술 수준에 따른 통상적인 상용의 조건들에 상응한다. 활성화(인큐베이션) 시간은 주로 상온에서 20-48시간이다. 활성의 반감기는 환원형(GSH) 및 산화형(GSSG) 글루타티온 0.5mmo1/1의 존재하여 20℃에서 약 10-15시간이다. 일반적으로, 재산화 조건하에서, 보다 오래(48시간) 인큐베이션하는 경우에는, CNBr-FSP에 의한 자극 가능성은 감소된다. 활성화 단계는 주로 EDTA의 존재하에 실시되며, 이때 가장 적합한 EDTA의 농도는 약 1mmol/l이다.
활성화 단계(재산화/활성화)의 전후의 방법 공정, 예컨데, 세포의 용해, 가용화(가용화/환원) 및 경우에 따라, 활성화 단계에 선행 및/또는 후행하는 한가지 혹은 여러가지 정제 처리는, 예를 들어, EP-A-0114506, EP-A-0093619호 명세서에 이와 같은 종류의 방법에 대하여 공지된 통상적인 방법에 따라 실행될 수 있다. 그러나, 수율 및 활성화를 고려해 볼때 극대의 결과를 얻기 위해서는, 본 명세서에서 상설된 방법의 실시형의 하나 혹은 여러가지를 고려해서 개개의 방법 조치나 모든 방법 조치를 실행하는 것이 합리적이다. 특히, 본 발명에 의한 활성화 단계를 용해 후에 얻어진 혼합물중에서 미리 변성 및/또는 환원없이 실행하는 것도 가능하지만, 수율이 낮다. 발현은 원핵생물중에서, 주로 P. 푸리다(P. Putida), 특히 대장균(E. Coli)중에서 실시된다. 그러나, 본 발명에 의한 방법은 다른 원핵생물(예를 들면, 바실리(Bacilli))중에서 발현되는 경우에도 마찬가지로 적합하다.
세포의 용해는 이를 위해 이용되는 통상적인 방법으로 실행될 수 있으며, 예를 들면, 초음파나 고압 분산 또는 리소짐을 이용하여 실행될 수 있고, 특히 예를 들면, 0.lmol/l의 트리스-염산과 같은, 현탁매질로서 중성으로부터 약산성까지의 pH 값을 조절하는데 적합한 완충 용액중에서 실시된다. 세포의 용해 후에, 불용성 성분("굴절체")을 임의의 방법으로, 특히 보다 높은 g 값으로 보다 긴 원심분리 시간동안 원심분리하거나, 혹은 여과시키는 것에 의하여 제거한다. 예를 들어, 물이나 인산염 완충 용액처럼 t-PA를 방해하지는 않지만 다른 세포 단백질을 가능한한 용해시키는 제제를 이용하여, 경우에 따라서는 트리톤과 같은 온화한 계면활성제를 부가하여 세정한 뒤에, 침전물(펠릿)을 가용화(가용화/환원)시킨다. 이 가용화는, 주로 알칼리성 pH 범위에서, 특히 pH=8.6±0.4에서, 그리고 메르캅탄기로된 환원제와 변성제의 존재하에 수행된다.
변성제로서는, 가용화에 관한 기술 수준, 예를 들어, EP-A-0114506호 명세서로부터 공지인 상용의 변성제, 특히 구아니딘-하이드로클로라이드나 요소를 이용할 수 있다. 구아니딘-하이드로클로라이드는 약 6mol/l의 농도가 적합하고, 요소의 농도는 약 8mol/l가 적합하다. 마찬가지로, 일반식 I의 화합물도 사용될 수 있다.
메르캅칸기로 만들어진 환원제로는, 예를 들어, 환원형 글루타티온(GSH) 또는 2-메르캅토에탄올을, 예를 들어, 약 50-400mmol/l의 농도로 및/또는 특히, DTE(디티오에리쓰리톨) 또는 DTT(디티오쓰레이톨)를, 예를 들어, 약 80-400mmol/l의 농도로 사용할 수가 있다. 가용화는 상온에서 1-수시간, 특히 2시간(인큐베이션)동안 수행하는 것이 바람직하다. 대기중의 산소에 의해서 발생하는 환원제의 산화를 방지하기위해서는, EDTA를 부가시키는 것도 합리적이다. 가용화/환원 이외에 가용화 단계도 정제 효과를 가지는데, 그 이유는 t-PA와 면역학적으로 교차 반응을 일으키지 않는 물질(이종 단백질)의 대부분은 용해되지 않기 때문이다.
가용화 후와 활성화 단계 전에, 기존의 통상적인 정제 단계가 도입될 수 있다. 정제 수단으로는, 예를 들어, 입체 구조 배제 크로마토그래피(SEC : steric exclusion chromatography), (구아니딘-하이드로클로라이드이나 요소의 존재하에) 또는 이온 교환체(요소나 그 유도체의 존재하에)기 이용된다. 비특이적인 재산화는 환원제(예를 들어, 2-메르캅트에탄올 같은)에 의하거나 또는 pH 값이 4.5가 되게 함으로써 방지될 수있다(예를 들면, R. Rudolph, "Biochem. soc. Transactions", 13(1985) 308-311 참조). 선행된 가용화 단계에서 DTE가 이용된 경우에는, 이것을 정제 단계에서 분리시켜야 한다. 정제는, 예컨데, 세파덱스 G100을 통하여 구아니딘-하이드로클로라이드 및 환원제, 예를 들어, GSH의 존재하에 pH l-4로 SEC에 의하여 수행(이 조치에서 많은 이종 단백질이 분리될 수 있다)되거나, 혹은 0.01mol/l의 염산 내지 0.1mol/l의 초산중의 세파덱스 G25를 통하여 탈염시켜 변성화제/환원제를 분리함으로써 수행될 수 있다. 변성제/환원제의 분리는 선택적으로 동일한 용액에 대해 투석함으로써 가능하기도 하다.
다른 정제 방법은 재활성화 단계에 이어서 수행될 수 있다. 일반적으로 이러한 정제는 투석에 의해 이루어지거나 혹은 활성화된 t-PA의 분리에 이어서, 예를 들어, 리스-세파트스를 통한 친화 크로마토그라피에 의하여 이루어진다.
본 발명의 다른 실행 형태는, 유전공학적으로 제조된, 이종의, 이황화 결합을 가지는 진핵생물의 단백질과 글루타티온과의 혼합된 이황화물(이하에서는 약칭으로 t-PASSG라 한다.)의 형성을 베이스로 한다. 이것은, 변성된 상태에서 이종 단백질을 제거하는 것뿐만 아니라 천연 단백질을 더 정제시키는 것도 쉽게 해준다. 티올기가 변형된 후에 정제하면, 단백질이 대기에 의한 산화로부터 보호되어 보다 넓은 pH 범위내에서 안정되고 또 순수 부하(Nettoladung)의 변화에 의해 정제가 쉬워지는 장점이 있다. 특히, 이온 교환체의 처리에 의해 변성되지 않은 단백질이 유리하게 분리될 수 있다.
혼합된 이황화물을 만들기 위해, 투석시키고 환원시켜 변성제와 환원제로 정제된 단백질을, 변성제를 함유하는, 희석된 가령 0.2mol/l의 GSSG 용액과 함께 인큐베이션시킨다. 활성화는, 변성제와 산화제의 분리후에 pH 값이 7-10.5인 0.5-5mmol/l의 GSH 농도로, 또한 변성 작용을 하지 않는 농도의 변성제를 사용하여 수행된다.
모든 다른 반응 방법에서는, GSSG와의 혼합 이황화물의 형성을 통하여 수행되는 단백질의 활성화가 본 발명의 전술한 활성화의 실행 형태와 일치한다. 이런 실행 형태에서는 최적 pH 값이 8.5이고, 수율은 대략 배가 되며, 활성화된 단백질은 복원 완충 용액중에서 보다 오랜 시간동안 안정된다.
본 발명에 의하면, 원핵생물로부터 만들어진 t-PA를 활성화시켜 정상적인 생물학적 활성의 활성화가 이루어질 수 있을 뿐만 아니라, 그 이외에 자극 가능성도 위에서 언급된 의미로 이루어질 수 있는데, 이 자극가능성은 천연 t-PA의 자극 가능성을 현저히 상회하며, 계수 10보다 더 높게, 심지어는 계수 50보다 더 높게 상회할 수 있다.
발명에 의해 원핵생물에서 발현된 후에 활성화될 수 있는 다른 진핵생물 단백질은 β-인터페론이다.
다음의 실시예에 의하여 본 발명을 보다 자세하게 설명하지만, 이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 별도의 설명이 없으면, 퍼센트는 중량 퍼센트를 나타내고, 온도는 섭씨를 나타낸다.
a) "굴절체"의 제조
E. Coli의 습윤한 세포 덩어리 100g을 0.1mol/l의 트리스/연산(pH 6.5) 및 20mmol/l의 EDTA 1.5ℓ안에 넣어서 균질화하고(Ultra-Turrax, 10초) 0.25mg/ml의 리소짐을 첨가하였다. 상온에서 30분간 인큐베이션한 뒤에 다시 균질화하고 3℃까지 냉각하였다. 세포의 용해는 고압 분산(550kg/㎠)에 의해 이루어졌다. 이어서, 0.1mol/l의 트리스/염산(pH 6.5) 및 20mol/l의 EDTA 300ml로 세정하였다. 원심분리한 후에(4℃, 27,000g일 경우 2시간) 펠릿을 0.1mol/l의 트리스/염산(pH 6.5)과 20mmol/l의 EDTA와 2.5% 트리톤-x-100 1.3ℓ중에 넣어 균질화하였다. 다시 원심분리한 후에(4℃, 27,000g인 경우에 30분), 0.1mol/l의 트리스/염산(pH 6.5)와 20mmol/l EDTA와 0.5% 트리톤-x-100 1.3ℓ중에 넣어 균질화하였다. 펠릿의 원심분리(4℃, 27,000g인 경우에 30분)와 0.1mol/l의 트리스/염산(pH 6.5)과 20mmol/l EDTA 1ℓ중에서의 균질화를 교대로 3번씩 실시하였다.
"굴절체" 제제의 t-PA 함량은 SDS-PAGE에 의해, 즉, t-PA 밴드를 "웨스터 블롯팅(Western-blotting)"에 의한 동정 및 덴시토메타 분석에 의하여 정량하였다. "굴절체"는 SDS-PAGE 및 "Western-blotting"으로 분자량 약 60KDa의 강력한 t-PA 밴드를 나타낸다. "굴절체"에 있는 전체 단백질 함량에 대한 t-PA의 비율은 약 21%이다.
b) "굴절체"의 가용화/환원
0.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.6), 6mol/l의 구아니딘-하이드로클로라이드, 0.15-0.4mol/l의 DTE 및 1mmol/l의 EDTA중의 1-5mg/ml의 단백질 농도에서 굴절체를 상온에서 2-3시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 용해될 수 없는 물질(세포벽 조각 등등)을 원심분리하였다(예를 들어, 35,000-50,000g일때 4℃에서 30분간). 상청액의 pH 값을 진한 염산으로 pH 3으로 조절하였다. 그리고 나서, 변성제와 환원제를 4℃에서 0.01mol/l의 염산에 대해 투석하여 분리하였다.
c) 재산화/활성화
재산화/활성화는 0.1mol/l의 트리스/염산(pH 10.5), 1mol/l의 EDTA, 1mg/ml의 BSA, 0.5mol/l의 L-아르기닌, 2mmol/l의 GSH, 0.2mmol/l의 GSSG중에서 1 : 50-1 : 200으로 희석하여 이루어졌다. 약 20℃에서 17-24시간 동안 활성화한 후에, 이 활성과, 진핵생물로부터의 천연 글리코실화 t-PA의 활성을 비교해서 수율을 측정하였다.
"굴절체"의 전체 단백질 함량에 대한 수율 : 2.5+/-0.5%
자극 가능성 : 10+/-5
"굴절체"의 t-PA에 대한 수율 : 약 12%
d) 변성제/환원제를 분리시키지 않을때의 재산화/활성화
0.1mol/l의 트리스/염산(pH 8.6), 6mol/l의 구아니딘-하이드로클로라이드, 0.2mol/l의 DTE 및 1mmol/l의 EDTA중의 1.25mg/ml의 단백질 농도에서 "굴절체"를 상온에서 2시간동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 0.1mol/l의 트리스/염산(pH 10.5), 1mmol/l의 EDTA, 1mg/ml의 BSA, 0.3mol/l의 L-아르기닌 및 표에 제시된 양의 GSSG중에서 1:100으로 희석하여 재산화를 개시하였다. 활성화 뱃치중에 0.06mol/l의 구아니딘-하이드로클로라이드 및 2mmol/l의 DTE의 잔류 농도가 존재하였다.
[변성제/환원제 분리없이 활성화할때, GSSG 농도에 대한 활성 수율의 의존성]
Figure kpo00001
*="굴절체"의 전체 단백질 함량에 대한 활성 t-PA의 수율.
[실시예 2]
RB("굴절체") 제제(약 5mg)를 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.6)과 6mol/l의 구아니딘-하이드로클로라이드와 0.15-0.2mol/l의 DTE 1ml중에서 상온에서 2-3시간동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 용해될 수 없는 물질(세포벽 조각 등등)을 원심분리에 의해(17,000g일때 20분간) 분리하였다. 변성제 및 환원제를 0.01mol/l의 염산중의 세라덱스 G 25(초미세한)를 통하여 겔 여과하여 제거하였다. 이때, 시료를 약 5-10배 정도로 희석하였다. 0.01mol/l의 염산중의 환원 물질을 -20℃에서 보존하였다.
[실시예 3]
다음 표에는, 발명에 의한 변수의, t-PA의 활성 및 자극 가능성에 대한 작용을 총괄하였다. 이 재산화실험을 위해서, 실시예 2에 따라 가용화되고 환원된 단백질을 예비 정제하지 않았다.
환원된 단백질 (0.01mol/l의 염산중)을 "재산화 완충제"중에서 1: 10-1: 500으로 희석시킴으로써 활성화시켰다. 활성화는 상온에서 22-48시간동안 인큐베이션한 뒤에 측정하였다. 재산화된 단백질의 활성은, 다음 용액중에서의 "표준 재산화" (=100%)에 대한 것이다.
0.1mol/l의 트리스/염산(pH=10.5)
+1mmol/l의 EDTA
+0.5mol/l의 L-아르기닌
+1mg/ml의 BSA
+0.5mmol/l의 GSH(환원형 글루타티온)
+0.5mmol/l의 GSSG(글루타티온 이황화물)
자극 가능성은 △H+CNBrFSP/△E-CNBrFSP로부터 계산된다(참조, W, Nieuwenhuizen et al., "Bio-chimica et Biophysica Acta", 755(1983), 531-533). 활성(%)과 자극 가능성(계수)은 J. H. Verheijen, "Thromb. Haemostas", 48(3), 266-269, (1982)에 따라 측정되었다.
다음과 같은 결과가 얻어졌다.
1. L-아르기닌 또는 구아니딘-하이드로클로라이드의 첨가에 대한 활성 수율의 의존성.
0.1mol/l의 트리스/염산(pH=10.5)
+1mmol/l의 EDTA
+1mg/m1의 BSA
+0.5mmol/l의 GSH
+0.5mmol/l의 GSSG중에서의 재산화
a) L- 아르기닌
Figure kpo00002
이 실험에서는, t-PA가 L-아르기닌에 의해 억제되었다고 생각할 수 있다. 따라서, 높은 L-아르기닌 농도에서의 활성 수율의 저하는 이 억제를 고려해서 보정될 수 있다.
b) 구아니딘-하이드로클로라이드(Gdn/HCl)
Figure kpo00003
2. 요소 및 요소 유도체의 첨가에 대한 활성 수율의 의존성 0.1mol/l의 트리스(pH=10.5), 1mmol/l의 EDTA, 1mg/ml의 BSA, 5mmol/l의 GSH 및 0.2mmol/l의 GSSG 중에서의 재산화.
a) 요소
Figure kpo00004
b) 메틸요소
Figure kpo00005
c) 에틸요소
Figure kpo00006
d) 디메틸요소
Figure kpo00007
Figure kpo00008
3. 지방산 아미드의 첨가에 대한 수율의 의존성
0.1mol/l의 트리스(pH=10.5ℓ, 1mmol/l의 EDTA, 1mg/ml의 BSA, 5mmol/l의 GSH 및 0.2mmol/l의 GSSG 중에서의 재산화.
a)포름아미드
Figure kpo00009
b)메틸포름아미드
Figure kpo00010
c)아세트아미드
Figure kpo00011
Figure kpo00012
4. 활성 수율의 pH 값에 대한 의존성
0.1mol/l의 트리스/염산
+1mmol/l의 EDTA
+0.5mol/l의 L-아르기닌
+1mg/ml의 BSA
+0.5mmol/l의 GSH
+0.5mmol/l의 GSSG 중에서의 재산화.
Figure kpo00013
5. 활성 수율의 GSH/GSSG 농도에 대한 의존성
0.1mol/l의 트리스/염산(pH=10.5)
+1mmol/l의 EDTA
+0.5mol/l의 L-아르기닌
+1mg/ml의 BSA 중에서의 재산화
a) +1mmol/l의 GSH
Figure kpo00014
b) +0.2mmol/l의 GSSG
Figure kpo00015
6. 재산화시의 활성 수율의 단백질 농도(1: 20-1: 500의 희석)에 대한 의존성
0.1mol/l의 트리스/염산(pH=10.5)
+1mmol/l의 EDTA
+0.5mol/l의 L-아르기닌
+1mg/ml의 BSA
+0.5mmol/l의 GSH
0.5mmol/l의 GSSG 중에서의 재산화
Figure kpo00016
7. 활성 수율의 BSA 첨가에 대한 의존성
0.1mol/l의 트리스/염산(pH=10.5)
+1mmol/l의 EDTA
+0.5mol/l의 L-아르기닌
+0.5mmol/l의 GSH
+0.5mmol/l의 GSSG 중에서의 재산화
Figure kpo00017
제1도 및 제 2도는 표준시험에 있어서, 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=10.5)+1mmol/l의 EDTA+0.5mol/l의 L-아르기닌+1mg/ml의 BSA+0.5mmol/l의 GSH+0.5mmol/l의 GSSG 중에서, 상온으로 17시간 동안 재산화한 후의 CNBr-FSP가 있을 경우와 없을 경우의 활성이 도시되어 있다. 제1도 및 제2도에 있어서, 곡선(A)는 CNBr-FSP가 존재하는 경우의 활성을 나타내고, 곡선(B)는 CNBr-FSP가 존재하지 않는 경우의 활성을 나타낸다.
[실시예 4]
t-PA와 글루타티온의 혼합 이황화물을 통한 t-PA의 활성, 사용된 "굴절체"는 앞의 실시예들에 의해 얻어졌다. "굴절체"의 환원은, 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.6), 1mmol/l의 EDTA, 6mol/l의 Gdn. HCl, 0.2mol/l의 DTE 중에서 약 1mg/ml의 단백질 농도에서 상온으로 2시간 동안 인큐베이션하여 수행되었다.
0.01mol/l의 염산으로 투석시키고, 환원된 단백질을 0.1mol/l의 트리스(pH=9.3), 9mol/l의 요소 및 0.2mol/l의 GSSG에 의하여 1: 1의 비율로 희석하고 상온에서 5시간 동안 인큐베이션하였다.
진한 염산으로 pH 3가지 산성화한 후에 4℃에서 0.01mol/l의 염산으로 투석시켰다. 투석후에 전체 단백질 농도는 0.33mg/ml이 되었다. 이렇게 조제된 t-PASSG를 사용하여 최적 재활성화 조건을 측정하였다.
a) t-PASSG 활성화의 최적 pH 값
다음의 최적화 실험에서처럼, 본원에서는 (1) 어떤 GSSG도 사용하지 않았고, (2) 활성을 상온에서 17시간 동안 인큐베이션 후에 측정하였다. 0.1mol/l의 트리스, 1mmol/l의 EDTA, 0.5mol/l의 L-아르기닌, 1mg/ml의 BSA 및 2mmol/l의 GSH 중에서 1: 100으로 희석시키는 것에 의하여 pH 값을 변화시켜 수행하였다.
Figure kpo00018
수율은 사용된 단백질 양에 대한 활성 t-PA의 %이다.
b) t-PASSG 활성화 결과의 재현성
활성화 조건들이 동일할때 여러가지 순서로 측정해보면, 여러가지 수율이 측정되는데, 이 수율은 무엇보다도 표준 t-PA의 변동에 의해 제약을 받는다. 이러한 오차 범위를 밝히기 위해, 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.5), 1mmol/l EDTA, 0.5mol/l L-아르기닌, 1mg/ml의 BSA 및 2mmol/l의 GSH 중에서 1: 100 내지 1: 200으로 희석한 후의 모든 활성화 데이타를 정리하였다.
Figure kpo00019
c) 활성화된 단백질의 안정성
활성화는, 본 실시예에서, 0.1mol/l의 트리스/염산, 1mmol/l의 EDTA, 0.5mol/l의 L-아르기닌, 1mg/ml의 BSA 및 2mmol/l의 GSH 중에서 1: 200으로 희석하여 수행하였다.
Figure kpo00020
[실시예 5]
유전공학적으로 제조된 β-인터페론의 활성화 "굴절체"를 앞에서 언급된 방법대로 생성하였다. "굴절체"의 환원/가용화를 다음과 같이 실시하였다 : 펠릿을 9.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.6), 6mol/l의 Gdn. HCl, 1mmol/l의 EDTA 및 0.2mol/l의 DTE 중에서 25℃로 3시간 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 48,000g로 30분 동안 원심분리한 후에, 상청액의 pH를 진한 염산으로 약 3이 되도록 조절하였다. 이어서, 0.01mol/l의 염산 중의 세파덱스 G25F를 통하여 겔여과시켰다.
용출액을 도전성, 단백질 농도 및 재활성화능에 대해 시험하였다.
재산화 단백질의 활성은, 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=10.5), 1mmol/l의 EDTA, 5mmol/l의 GSH, 0.5mmol/l의 GSSG 및 0.25mol/l의 L-아르기닌 중의 "표준 활성화"(=100%)를 기준으로 한 것이다.
a) 활성 수율의 L-아르기닌 첨가에 대한 의존성
용출액을 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.5), 1mmol/l EDTA, 5mmol/l의 GSH, 0.5mmol/l의 GSSG 중에서 1: 50으로 희석하여 0℃에서 20시간 동안 활성화시켰다.
[활성의 L-아르기닌 의존성]
Figure kpo00021
b) 활성 수율의 요소 첨가에 대한 의존성
활성화 용액은 a)의 그것과 상응하나, 0℃에서 17시간 동안 활성화시켰다.
[활성의 요소 의존성]
Figure kpo00022
c) 활성 수율의 포름아미드 첨가에 대한 의존성
a) 에서와 같이 활성화시키고, 시료를 0℃에서 17시간 동안 활성화시킨 후에 시험하였다.
[활성의 포름아미드 의존성]
Figure kpo00023
d) 활성 수율의 산화·환원 완충제에 대한 의존성
용출액을 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.5), 1mmol/l의 EDTA 및 0.25mol/l의 L-아르기닌 중에서 1: 50으로 희석하였고, 시료를 0℃에서 17시간 동안 활성화한 후에 시험하였다.
[활성화의 GSH/GSSG 의존성]
Figure kpo00024
e) 활성 수율의 BSA 첨가에 대한 의존성
용출액을 0.1mol/l의 트리스/염산(pH=8.5), 1mmol/l의 EDTA, 5mmol/l의 GSH, 0.5mmol/l의 GSSG 및 0.25mol/l의 L-아르기닌 중에서 1: 50으로 희석하여, 0℃로 17시간 동안 활성화한 후에 시험하였다.
[활성의 BSA 의존성]
Figure kpo00025
f) 활성 수율의 pH 의존성
용출액을 0.1mol/l의 트리스/염산, 1mmol/l의 EDTA, 5mmol/l의 GSH, 0.5mmol/l의 GSSG 및 0.25mol/l의 L-아르기닌 중에서 1: 50으로 희석하고 0℃로 17시간 동안 활성화한 후에 시험하였다.
[활성의 pH 의존성]
Figure kpo00026

Claims (34)

  1. 세포를 용해(digestion)시키고, 변성 및 환원 조건하에 가용화시키며, 환원제를 분리시키고, 아르기닌, 구아니딘 하이드로클로라이드 및, 일반식 R2-CO-NRR1(I) (식중, R 및 R은 H 또는 C1-4알킬기를 나타내며, R2는 H 또는 NHR1또는 C1-3알킬기를 나타낸다)의 적어도 하나의 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비변성 농도의 변성제와 함께 9-12의 pH 값에서, 0.01-20mmol/l 농도의 GSH 및 0.01-3mmol/l 농도의 GSSG의 GSH/GSSG 존재하의 산화 조건에서 단백질을 활성화시키는 것으로 구성되는, 원핵 생물중에서의 재조합 유전자 발현후에 생성된, 이종의, 이황화 결합을 갖는 진핵생물 단백질의 활성화 방법.
  2. 제1항에 있어서, GSH/GSSG 존재하의 산화를 위한 pH 값이 9.5-11인 방법.
  3. 제1항에 있어서, GSH의 농도가 0.2-10mmol/l이고, GSSG의 농도가 0.05-1mmol/l인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단백질을 GSH/GSSG로 처리하기 전, 가용화 후에 단백질을 정제하는 것을 또한 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 변성제/환원제의 사전 분리없이 재활성화를 수행하는 것을 또한 포함하며, 이때 변성/환원후의 반응 용액을 재활성화 완충 용액을 희석시키고, 후속하는 재활성화시에 GSSG 농도가 가용화로부터의 환원제의 잔류 농도를 상회하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 세포를 용해(digestion)시키고, 변성 및 환원제를 사용하여 변성 및 환원 조건하에 가용화시키며, 환원제를 분리시키고, 변성 조건하에 GSSG를 첨가하는 것에 의하여, 단백질의 티올기를 단백질과 글루타티온과의 혼합된 이황화물로 변환시키며, 잔류하는 GSSG를 제거시키고, 아르기닌, 구아니딘 하이드로클로라이드 및, 일반식 R2-CO-NRR1(I) (식중, R 및 R1은 H 또는 C1-4알킬기를 나타내며, R2는 H 또는 NHR1또는 C1-3알킬기를 나타낸다)의 적어도 하나의 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비변성농도의 변성제와 함께, 0.5-5mmole/l 농도의 GSH를 사용하여, 7-10.5의 pH 값에서 단백질을 활성화시키는 것으로 구성되는, 원핵 생성물중에서의 재조합 유전자 발현후에 생성된, 이종의, 이황화 결합을 갖는 진핵 생물 단백질의 변형된 활성화 방법.
  7. 제1항에 있어서, 재활성화 단계에 있어서의 아르기닌 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도가 0.1-1.0mole/l인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 재활성화 단계에 있어서의 일반식(I)의 화합물의 농도가 0.5-4mole/l인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단백질 분해 작용을 갖지 않는 단백질의 존재하에 재활성화시키는 것으로 구성되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 메르캅토기로된 환원제 및 변성제의 존재하에, 알칼리성 pH 값에서 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 변성제로서, 일반식(I)의 적어도 하나의 화합물 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 존재하에 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 6mole/l의 구아니딘 하이드로클로라이드 농도, 또는 8mole/l의 일반식(1)의 화합물 농도로 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  13. 제11항에 있어서, DTE, DTT, β-메르캅토-에탄올, 시스테인 또는 GSH의 적어도 하나의 기의 존재하에 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 입체 구조 배제(steric exclusion) 크로마토그라피 또는 투석에 의하여 환원제, 산화제 및 변성제를 분리해내고 정제하는 것을 또한 포함하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 단백질의 재활성화후에 투석에 의하여 단백질을 정제하는 것을 또한 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 재조합 유전자 기술로 생성된 진핵 생물 단백질이 t-PA인 방법.
  17. 제1항의 활성화 방법에 의하여 얻어진, 자극 가능한, 비글리코실화 t-PA.
  18. 제1항에 있어서, 재활성화 단계에 있어서 아르기닌 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도가 0.25-0.8mole/l인 방법.
  19. 제1항 또는 제9항에 있어서, GSH/GSSG의 존재하의 산화 조건하에, 소혈청 알부민의 존재하에 재활성화시키는 것으로 구성되는 방법.
  20. 제6항에 있어서, 재활성화 단계에 있어서의 아르기닌 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도가 0.1-1.0mole/l인 방법.
  21. 제6항에 있어서, 재활성화 단계에 있어서의 일반식(I)의 화합물의 농도가 0.5-4mole/l인 방법.
  22. 제6항에 있어서, 단백질 분해 작용을 갖지 않는 단백질의 존재하에 재활성화시키는 것으로 구성되는 방법.
  23. 제6항에 있어서, 메르캅토기로된 환원제 및 변성제의 존재하에, 알칼리성 pH 값에서 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 변성제로서, 일반식(I)의 적어도 하나의 화합물 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 존재하에 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 6mole/l의 구아니딘 하이드로클로라이드 농도, 또는 8mole/l인 일반식(I)의 화합물 농도로 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  26. 제24항에 있어서, DTE, DTT, β-메르캅토-에탄올, 시스테인 또는 GSH의 적어도 하나의 기의 존재하에 가용화시키는 것으로 구성되는 방법.
  27. 제6항에 있어서, 입체 구조 배제(steric exclusion) 크로마토그라피 또는 투석에 의하여 환원제, 산화제 및 변성제를 분리해내고 정제하는 것을 또한 포함하는 방법.
  28. 제6항에 있어서, 단백질의 재활성화후에 투석에 의하여 단백질을 정제하는 것을 또한 포함하는 방법.
  29. 제6항에 있어서, 재조합 유전자 기술로 생성된 진핵 생성 단백질이 t-PA인 방법.
  30. 제6항의 활성화 방법에 의하여 얻어진, 자극 가능한, 비글리코실화 t-PA.
  31. 제6항에 있어서, 재조합 유전자 기술로 생성된 진핵 생성 단백질이 β-인터페론인 방법·
  32. 제6항에 있어서, 재활성화 단계에 있어서 아르기닌 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도가 0.25-0.8mole/l인 방법.
  33. 제1항에 있어서, GSH/GSSG의 존재하의 산화 조건하에, EDTA의 존재하에 단백질을 재활성화시키는 것으로 구성되는 방법.
  34. 제22항에 있어서, G53H/GSSG의 존재하의 산화 조건하에, 소 혈청 알부민의 존재하에 재활성화시키는 것으로 구성되는 방법.
KR1019870700536A 1985-10-23 1986-10-23 유전공학적으로 제조된, 다른 종류의, 이황화 결합을 갖는 진핵생물 단백질을 원핵생물에 있어서의 발현 후에 활성화시키는 방법 KR900009139B1 (ko)

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